dissertação - juliana mota de borborema

UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO

PROGRAMA DE MESTRADO EM FISIOTERAPIA

JULIANA MOTA DE BORBOREMA

NEUROPLASTICIDADE FRENTE ATIVIDADE FÍSICA

EM RATOS IDOSOS: EXERCÍCIO EM ESTEIRA E

EXERCÍCIO ACROBÁTICO

SÃO PAULO

2013

JULIANA MOTA DE BORBOREMA

NEUROPLASTICIDADE FRENTE ATIVIDADE FÍSICA

EM RATOS IDOSOS: EXERCÍCIO EM ESTEIRA E

EXERCÍCIO ACROBÁTICO

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Fisioterapia da Universidade Cidade de São Paulo, como exigência para obtenção do Título de Mestre, sob a orientação da Profa. Drª. Raquel Simoni Pires .

SÃO PAULO

2013

Ficha Elaborada pela Biblioteca Prof. Lúcio de Souza. UNICID

B726n

Borborema, Juliana Mota de.

Neuroplasticidade frente atividade física em ratos idosos: exercício em esteira e exercício acrobático. / Juliana Mota de Borborema. --- São Paulo, 2013.

73 p.

Bibliografia

Dissertação (Mestrado) – Universidade Cidade de São Paulo - Orientador: Prof. Dr.

1. Plasticidade neural. 2. Exercícios. 3. Envelhecimento. I. Título.

CDD 615.82

JULIANA DA MOTA BORBOREMA

NEUROPLASTICIDADE FRENTE ATIVIDADE FÍSICA EM RATOS

IDOSOS: EXERCÍCIO EM ESTEIRA E EXERCÍCIO ACROBÁTICO

Dissertação apresentada ao Programa de

Mestrado em Fisioterapia da Universidade

Cidade de São Paulo, como requisito para

obtenção do título de Mestre

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Mestrado, em sessão

pública realizada a ......../........../............., considerou

( ) Aprovada ( ) Reprovada

Examinadora:.........................................................................................................

Profª.Drª Renata Hydee Hasue Vilibor

Universidade de São Paulo

Examinadora:.........................................................................................................

Profª.Drª Mônica Rodrigues Perraccini

Universidade Cidade de São Paulo

Presidente:.............................................................................................................

Profª.Drª Raquel Simoni Pires

Universidade Cidade de São Paulo

Aos meus pais, ao meu irmão Vasco, e meu namorado Carlos, pelo apoio e incentivo e por estarem presentes em

todos os momentos da minha vida.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por ter me dado a benção de conquistar mais um objetivo, e por colocar pessoas maravilhosas em meu caminho, que contribuíram para que isto se concretizasse.

Aos meus pais, que sempre me apoiaram nas escolhas, e mesmo de longe incentivam com suas palavras e atitudes de amor e compaixão.

Ao meu namorado, pelo companheirismo e amor, sempre esteve do meu lado, ajudando no que fosse preciso.

À minha orientadora Profª. Raquel, que proporcionou um grande conhecimento sempre com muita paciência e dedicação.

Ao Prof. Britto, por abrir as portas do seu laboratório para nos receber e adquirir muito aprendizado.

À minha amiga Samira, parceira de mestrado, por estar sempre comigo, pelos vários momentos de alegria, pelo companheirismo.

À Carol, por contribuir com este trabalho, pelos ensinamentos no laboratório, por todo apoio e paciência.

À Priscilla, pela contribuição neste trabalho, pelos ensinamentos, apoio e companheirismo.

À Quilza, pelo apoio, companheirismo, conversas e amizade.

Ao Adilson, com seu jeito alegre, sempre ajudando no que fosse preciso, e transmitindo conhecimento.

À todas as pessoas do laboratório da USP, tornando ambiente muito agradável, sempre todos muito prestativos.

À turma de mestrado da UNICID, que fizeram um ano de mestrado ser muito proveitoso e agradável, pude conhecer pessoas maravilhosas

À todos meus amigos e familiares que direta ou indiretamente contribuíram para este aprendizado.

À FAPESP pelo apoio financeiro.

Obrigada!

RESUMO

O declínio da função do sistema nervoso causado pelo envelhecimento pode

acarretar déficits cognitivos e motores, tais como redução de memória, aprendizado,

equilíbrio e perda de habilidades motoras complexas que podem ser amenizados

com a prática de exercícios físico. Entretanto, até o momento pouco se sabe sobre

os mecanismos neuroplásticos do efeito do exercício sobre o sistema nervoso. O

objetivo deste estudo foi analisar a expressão de proteínas estruturais MAP2 e

neurofilamentos (NFs), e proteínas sinápticas sinapsina I (SYS) e sinaptofisina (SYP)

nas áreas motoras do córtex cerebral, estriado e cerebelo de ratos envelhecidos

submetidos a exercício em esteira (EE) e acrobático (AC). Foram utilizados 39 ratos

idosos machos com 18 meses de idade, Wistar, separados em 3 grupos: controle-

sedentário (SED, N=11), exercício em esteira (EE, N=13) e exercício acrobático (AC,

N=15). No grupo EE, os ratos treinaram em uma esteira com velocidade máxima de

0,5 Km/h por 40 minutos, 3 vezes por semana, durante 4 semanas. No grupo AC, os

ratos passaram por um circuito composto por diversos obstáculos, durante o mesmo

período que o EE. Após 4 semanas de treinamento as análises da expressão das

proteínas foram realizadas pelas técnicas de “immunoblotting" e imuno-histoquímica,

e os dados submetidos à análise estatística, utilizando-se ANOVA e pós-teste de

Tukey quando apropriado. O nível de significância adotado foi p<0,05. Os dados de

“immunoblotting" e imuno-histoquímica revelaram que animais treinados,

independente do tipo de exercício, apresentaram mudanças na expressão de

proteínas estruturais e sinápticas distintas nas áreas estudadas. Os grupos AC e EE

induziram aumento significante de MAP2, NF68 e SYS e diminuição de SYP no

córtex motor, e um aumento de NFs e SYP, com diminuição significativa de MAP2 e

SYS no estriado. Já o cerebelo respondeu com aumento significante de MAP2 e

diminuição de NFs, SYS e SYP. Estes dados parecem sugerir que o córtex motor de

ratos idosos apresenta respostas plásticas distintas das outras estruturas estudadas,

independente da atividade motora, sugerindo maior participação do córtex no

controle motor.

Palavras-Chave: Envelhecimento, marcadores plásticos, neuroplasticidade,

exercício acrobático, exercício em esteira.

ABSTRACT

Age related changes in the nervous system of the individual, may generate cognitive

and motor damage, such as reduction of memory, learning, balance and complex

motor skill can be mitigated with physical exercises. However, so far little is known

about the mechanisms involved in this neuroplastic improves. The objective of this

study was to analyze the expression of structural protein MAP2 and neurofilaments

(NFs), and synaptic proteins synapsin I (SYS) and synaptophysin (SYP) in the motor

areas of the cerebral cortex, cerebellum and striatum of aged rats submitted to

treadmill exercise (TE) and acrobatic exercise (AE). We used 39 elderly male rats

were used with 18-month-old, Wistar, divided into 3 groups: control-sedentary (SED,

N = 11), treadmill exercise (TE, N = 13) and acrobatic exercise (AE, N = 15). In

Group TE, the rats trained on a treadmill with maximum speed of 0.5 Km/h by 40

minutes, 3 times per week for 4 weeks. In the group AE, the rats went through

circuits composed of various obstacles during the same period that the TE. After 4

weeks of training analyses of protein expression were carried out by techniques of

"immunoblotting” and Immunohistochemistry, and data submitted to statistical

analysis using ANOVA and Tukey post-test when appropriate. The level of

significance was p<0,05. The "immunoblotting” and Immunohistochemistry revealed

that trained animals, regardless of the type of exercise, showed changes in structural

protein expression and distinct synaptic in the areas studied. AE and TE groups

induced significant increase of MAP2, NF68 and SYS and SYP in the motor cortex,

and an increase of NFs and SYP, with significant decrease of MAP2 and SYS in

striatum. Already the cerebellum responded with significant increase of MAP2 and

decrease of NFs, SYS and SYP. These data suggest that the motor cortex of aged

rats presents larger plastic responses than compared with other structures studied,

independent of motor activity, suggesting greater participation of the motor cortex in

neuroplaticity.

Keywords: Aging, plastic markers, neuroplasticity, exercise acrobatic, exercise

treadmill.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Imagem da esteira ergométrica adaptada para ratos..........................22

Figura 2 - Imagens digitais dos obstáculos que compõem o circuito para as

atividades acrobáticas.......................................................................................23

Figura 3 - Desempenho dos ratos em diferentes períodos de treinamento acrobático

avaliado pela média do tempo gasto para realização das seis tarefas presentes no

circuito por semana........................................................................................28

Tabela 1 – Níveis de proteínas estruturais e sinápticas nos diferentes tipos de

exercício.............................................................................................................30

Figura 4 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína

associada ao microtúbulo (MAP2) no córtex motor (MI e

M2)...............................................................................................................31


NF no córtex motor (MI e M2).........................................................................32


SYP no córtex motor (MI e M2).......................................................................34


SYS no córtex motor (MI e M2).......................................................................35

Figura 8 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína da

proteína associada ao microtúbulo (MAP2) no

estriado..............................................................................................................36


NF no estriado................................................................................................38


SYP no estriado..............................................................................................39


SYS no estriado..............................................................................................40


associada ao microtúbulo (MAP2) no

cerebelo.............................................................................................................43


NF no cerebelo...............................................................................................44


SYP no cerebelo.............................................................................................45


SYS no cerebelo............................................................................................46

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

- AC: Exercício Acrobático

- EE: Exercício em esteira

- AE: Ambiente Enriquecido

- BDNF: Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo

-GDNF: Fator Neurotrófico Derivado de células Gliais

- Cb: Cerebelo

- CG: Camada Granular

- CM: Camada Molecular

- EG: Externamente Guiado

- GluR: Receptor de Glutamato

- IG: Internamente Guiado

- LTP: Potenciação a Longo Prazo

- MAP: Proteína Associado ao Microtúbulo

- NF: Neurofilamento

- NT: Neurotransmissor

- SED: Sedentário

- SNC: Sistema Nervoso Central

- SYP: Sinaptofisina

- SYS: Sinapsina

- NMDAR1: Subunidade 1 do Receptor de Glutamato do tipo Ácido gama-amino-

butírico

SUMÁRIO

RESUMO...................................................................... Erro! Indicador não definido.

ABSTRACT .................................................................. Erro! Indicador não definido.

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 6

1.1. Envelhecimento e repercussões sobre o SNC .................................................. 6

1.1.1 Alterações Morfológicas ................................................................................. 6

1.1.2. Alterações Funcionais e Neuroquímicas ........................................................... 7

1.2. Neuroplasticidade e Exercício Físico ................................................................. 8

1.2.1. Ambiente Enriquecido ....................................................................................... 9

1.2.2. Exercício Acrobático ........................................................................................ 10

1.2.3. Exercício em Esteira........................................................................................ 12

1.3. Circuitos funcionais ......................................................................................... 13

1.3.1. Aquisição de novas habilidades X Automatizado/rítmico ................................ 13

1.4. Mecanismos neuroplásticos no envelhecimento ............................................. 14

1.4.1. Mecanismo de De-diferenciação ..................................................................... 14

1.4.2. Mecanismo da Compensação ......................................................................... 14

1.5. Estruturas Anatômicas .................................................................................... 15

1.5.1 Córtex Motor ..................................................................................................... 15

1.5.2. Estriado ........................................................................................................... 16

1.5.3. Cerebelo .......................................................................................................... 17

1.6. Marcadores de Plasticidade Sináptica ............................................................... 19

2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 20

3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 20

4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 21

4.1. Animais ........................................................................................................... 21

4.2. Desenho do estudo ......................................................................................... 21

4.3. Protocolo de Exercício em Esteira (EE) .......................................................... 22

4.4. Protocolo de Exercício Acrobático (AC) .......................................................... 22

4.5. Protocolo de Imuno-histoquímica .................................................................... 23

4.6. Protocolo de “Immunoblotting” ........................................................................ 26

4.7. Análise Estatística .............................................................................................. 27

5. RESULTADOS ...................................................................................................... 28

5.1. DESEMPENHO MOTOR .................................................................................... 28

5.2. EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS .................................................................... 29

5.2.1. Córtex Motor .................................................................................................... 29

5.2.2. Estriado ........................................................................................................... 33

5.2.3. Cerebelo .......................................................................................................... 37

6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 47

6.1. Desempenho Motor ............................................................................................ 47

6.2. Córtex Motor ....................................................................................................... 48

6.3. Estriado .............................................................................................................. 51

6.4. Cerebelo ............................................................................................................. 55

7. CONCLUSÕES .................................................................................................. 58

8. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 59

ANEXO I .................................................................................................................... 65

6

1. INTRODUÇÃO

Uma das maiores conquistas da humanidade foi o incremento na

quantidade de anos vividos, propiciando um aumento da longievidade do

mundo inteiro, ou seja, estes estão vivendo cada vez mais1.

Com o envelhecimento há um declínio nas funções do controle

sensóriomotor, déficit cognitivo, o que pode acarretar diminuição do

desempenho funcional. Esse declínio no controle motor fino, na marcha e

equilíbrio, e um aumento da variabilidade e lentidão dos movimentos, favorece

o risco de quedas atenuando a capacidade dos idosos em exercerem suas

atividades de vida diária (AVD’s) e manter a independência. A causa disto é

multifatorial, e vem com o declínio do sistema nervoso central2, 3.

No entanto, estudos tem descrito que a prática de atividade física é

capaz de promover neuroplasticidade no encéfalo de humanos e animais

amenizando os efeitos do envelhecimento. Várias atividades são descritas por

promover neurogênese no hipocampo, como é o caso da atividade voluntária e

o ambiente enriquecido4, 5 e sinaptogênese frente a exercício em esteira6, entre

outros. Porém essas atividades e seus efeitos serão discutidos em uma sessão

seguinte. Cabe primeiro, destacar algumas mudanças que ocorrem no cérebro

durante o processo do envelhecimento, que incluem alterações morfológicas,

funcionais e bioquímicas7.

1.1. Envelhecimento e repercussões sobre o SNC

1.1.1 Alterações Morfológicas

O envelhecimento é um processo fisiológico normal caracterizado como

um declínio de aspectos estruturais de regiões encefálicas específicas, como o

volume da substância cinzenta, espessura cortical, entre outros 8. Porém ao

contrário do que se imagina o declínio estrutural não reflete apenas a perda

neuronal, como demonstrado por estudos estereológicos em ratos, macacos e

seres humanos visto que esta é mínima em regiões do neocórtex e hipocampo,

podendo ser mais evidente no cerebelo e substância negra9-13.

7

Apesar da perda neuronal não ser de grande relevância, outras

estruturas não menos importantes se encontram reduzidas podendo acarretar

déficits importantes Estudos realizados com a ressonância magnética em

humanos mostram uma redução significativa do volume de massa cinzenta e

branca no córtex cerebral relacionados com o envelhecimento 14, 15. A redução

deste volume não é uniforme em todo o córtex cerebral e parece ser decorrente

de uma redução de espinhos dendríticos, densidade sináptica e também

arborização dendrítica principalmente no córtex pré-frontal, córtex motor e

temporal superior de humanos e primatas idosos 15-17. Vale ressaltar, que os

dendritos neuronais são fundamentais para a formação e manutenção de redes

neurais, regulação da plasticidade sináptica, assim como a integração de

entradas elétricas18. E mais, a extensão da arborização dendrítica de um

neurônio é um determinante para as propriedades sinápticas das células

afetando o processamento e integração da informação 19.

O cerebelo é bastante enfatizado quando se trata das alterações

produzidas pelo envelhecimento. Huang e colaboradores20, relatam que há um

declínio no número de fibras paralelas até 23 meses de idade dos animais, e

consequentemente, diminuição no número de sinapses gerando degeneração

neuronal. Isto reflete funcionalmente na coordenação motora e equilíbrio que

são essenciais na estabilização postural 20.

1.1.2. Alterações Funcionais e Neuroquímicas

As mudanças estruturais que ocorrem nos neurônios durante o

envelhecimento, podem afetar as propriedades eletrofisiológicas9. Há

evidências de que a transmissão sináptica excitatória no córtex pré-frontal de

macacos pode estar atenuada com a idade avançada, o que pode induzir uma

diminuição de espinhos dendríticos, e consequentemente a redução no número

de neurônios que expressam os receptores glutamatérgicos do tipo GluR2 e

NMDAR121, 22. O glutamato e seus receptores estão presentes na maioria das

sinapses excitatórias e são responsáveis pelas funções motoras e cognitivas

que se encontram alteradas com o envelhecimento 23.

8

O processo de envelhecimento normal desencadeia uma série de

mudanças neuroquímicas, tais como: redução das enzimas que sintetizam os

neurotransmissores dopamina, acetilcolina e glutamato, que são responsáveis

pela comunicação neuronal, podendo levar a um comprometimento na

transmissão sináptica e na potenciação e depressão de longa duração

(LTP/LTD), responsáveis pelas disfunções cognitivas e motoras no indivíduo

idoso 7, 24, 25.

Outro aspecto importante durante o envelhecimento é a diminuição dos

fatores neurotróficos tais como, fator neurotrófico derivado de células gliais

(GDNF) e fator de crescimento nervoso (NGF) que desempenham um papel

importante no encéfalo durante o envelhecimento, pois já foi visto que a infusão

desses fatores em encéfalos de animais envelhecidos atenuam os déficits

cognitivos e motores produzidos por alterações nos sistemas colinérgico e

dopaminérgico, respectivamente15.

Outro fator neurotrófico que vem sendo muito estudado é o fator

neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), que tem uma redução significativa

principalmente no hipocampo, podendo levar a disfunções cognitivas 15, 25. Este

tem um papel importante na sobrevivência e/ou crescimento de muitos subtipos

neuronais, incluindo os neurônios glutamatérgicos. Além disso, é um

importante mediador da eficácia sináptica e conectividade 26.

Diante de todas as evidências, que elucidam os motivos pelos quais

indivíduos idosos apresentam uma série de perdas tanto cognitivas quanto

motoras, alguns estudos têm sido realizados na tentativa de mostrar que as

perdas causadas pelo envelhecimento podem ser atenuadas com terapias

medicamentosas no combate ao efeito oxidante nas células27 e também, com a

realização da atividade física para amenizar tais limitações funcionais que o

envelhecimento promove15, 28.

1.2. Neuroplasticidade e Exercício Físico

A neuroplasticidade pode ser definida como uma mudança na estrutura

e função do sistema nervoso, em resposta à ação dos ambientes interno e

externo, ou como resultado de lesões de nível neural7.

9

O exercício físico é considerado uma importante ferramenta capaz de

gerar efeito neuroprotetor, prevenir e proteger as funções do cérebro

principalmente durante o envelhecimento 29. Estudos com animais e humanos

tem evidenciado que o exercício tem um impacto positivo sobre aspectos

cognitivos, emocionais e comportamentais 26, 30, 31. A partir disso, vários

modelos de exercício físico têm sido desenvolvidos em estudos com animais, a

fim de simular atividade física dos humanos. Esses modelos incluem exercícios

de alta e baixa intensidade, intermitente ou contínuo, de curta ou longa duração

além dos diferentes modos de exercício 32.

Antes de citar quais modelos de exercício são mais recentemente

usados em animais para aproximar da atividade em humanos, cabe deixar

claro, os diferentes conceitos de atividade física e exercício físico. Atividade

física é qualquer movimento corporal produzido por músculos esqueléticos

gerando um gasto energético. O exercício físico é um subconjunto da atividade

física, definido como um movimento corporal repetitivo e programado, com o

intuito de melhorar o nível de aptidão física 32.

Diferentes estudos têm utilizado diversas modalidades de exercícios em

animais, tais como: natação, exercício acrobático, exercício voluntário, corrida

forçada em esteira, ambiente enriquecido, entre outros 33.

Estudos que utilizam animais idosos vêm mostrando os benefícios do

exercício físico, tais como as respostas dos animais idosos expostos a um

ambiente enriquecido, comprovando que estes são capazes de manter sua

plasticidade cerebral, assim como, reduzir déficits comportamentais e celulares

associados ao processo normal do envelhecimento 15, 34, 35. A seguir, estão

alguns desses modelos de exercício explicados mais detalhadamente.

1.2.1. Ambiente Enriquecido

No ambiente enriquecido, os animais permanecem numa gaiola que

contém uma variedade de objetos, incluindo brinquedos, túneis, rodas gigantes

para correr, que podem ser substituídos ou reposicionados todos os dias, além

do convívio com outros animais no mesmo ambiente 28, 33. Pelo fato do

ambiente enriquecido oferecer uma série de informações sensório-motoras ao

10

animal, as quais contribuem para o desempenho cognitivo, torna difícil afirmar

o principal fator desse ambiente que leva a essas alterações. Mas acredita-se

que existam múltiplos fatores dentro do ambiente que são responsáveis por

essas mudanças plásticas 36.

O estudo de Leggio e colaboradores37 revelaram que ratos neonatos

expostos ao ambiente enriquecido, demonstraram aumento da densidade de

espinhos em neurônios parietais, sugerindo um maior número de contatos com

outros neurônios e podendo estar relacionado com melhora no desempenho

espacial desses animais37. E ainda, outros estudos revelaram que o ambiente

enriquecido foi capaz de induzir a potenciação de longo prazo (LTP), a

neurogênese e níveis aumentados de neurotrofina e sinaptofisina, entre outros

no hipocampo 38, 39.

Estudos morfológicos indicam que regiões do córtex cerebral se

mostraram mais densas e grossas em ratos expostos a esse tipo de estímulo,

sugerindo a presença de neurogênese de forma acentuada a ponto de exceder

a morte celular por apoptose, ou ainda, que as células aumentaram o contato

com outros neurônios 28. O cerebelo de ratos idosos (24-26 meses de idade)

expostos ao ambiente enriquecido mostraram áreas de arborização dendrítica

mais extensas quando comparado ao controle, e um outro estudo relatou haver

proliferação de novas células no giro denteado de ratos idosos após 4-5

semanas de exposição 31, 40.

1.2.2. Exercício Acrobático

Kleim e colaboradores41 utilizaram o treinamento acrobático como

modelo de exercício para induzir aprendizado motor em animais ao invés de

outros modelos de exercício repetitivo e rítmicos. Este treinamento acrobático

consiste em passar várias vezes por um mesmo percurso composto por vários

obstáculos com diferente tamanhos e graus de dificuldade, estimulando a

resolução de problemas, coordenação e equilíbrio. Segundo Kleim e

colaboradores41 , este tipo de treinamento, ao contrário do exercício em esteira

e exercício voluntário induz um aumento de sinapses em regiões do córtex

11

cerebelar 41. Além disso, o animal precisa iniciar o movimento voluntariamente

para que haja um planejamento motor antes de passar pelos obstáculos 42.

Recentemente um estudo envolvendo exercício acrobático por quatro

semanas de treinamento com ratos adultos jovens revelou aumentos em

proteínas do citoesqueleto (MAP2 e neurofilamentos) e sinápticas (sinapsina I e

sinaptofisina), em regiões do córtex motor e estriado 42. Segundo Churchill e

colaboradores28, o aspecto da atividade acrobática está relacionado à

aquisição de novas habilidades, capaz de induzir modificação sináptica,

podendo ocorrer o fenômeno de sinaptogênese em todo o cérebro 28. No

entanto, aprender novas habilidades não é uma característica exclusiva de

adultos jovens.

É o que mostrou Barnes e colaboradores43, ao relatarem que animais

idosos podem facilmente aprender novas tarefas e tentar usar outras

estratégias de aprendizado que às vezes não são tão eficientes, mas que

podem ser interpretadas de maneira compensatória43. Desta forma, terapias

comportamentais podem ser usadas para atenuar a deterioração neuronal

relacionada com o envelhecimento28.

Em uma abordagem mais atual, vários estudos sobre os mapas de

representação cortical, tanto sensorial quanto motor tem sido abordado com

frequência. O estudo realizado por Tennant e colaboradores44 com dois grupos

de camundongos, adultos jovens e adultos idosos submetidos a treinamento

que requer aprendizado de novas habilidades com as patas anteriores por um

curto e um longo período de treinamento revelou que o grupo dos adultos

jovens foi capaz de aumentar a área de representação cortical da porção distal

(dedos) das patas anteriores utilizada no movimento após curto período de

treinamento. No entanto, após um longo período de treinamento essas áreas

corticais representantes das partes mais distais das patas retornaram a linha

de base. Já nos camundongos idosos, áreas de representação cortical tanto

das partes proximais com as distais envolvidas com o movimento não se

alteraram após qualquer período de treinamento. Além disso, foi observada

uma diminuição das alterações nas representações de dígitos (dedos) e testes

de desempenho sensório-motor. Apesar disso, os animais idosos foram

12

capazes de aprender a executar a tarefa, assim como, os animais adultos

jovens e a reorganização topográfica no córtex motor variou com a idade44.

No entanto, raros são os estudos que utilizaram a atividade acrobática

para analisar quais seriam as repercussões no comportamento e no encéfalo

de ratos idosos. Em contrapartida, vários estudos têm utilizado o exercício

forçado como modelos de pesquisas.

1.2.3. Exercício em Esteira

O exercício em esteira ou exercício rítmico/cíclico é um método comum

utilizado pelos pesquisadores que analisam as adaptações fisiológicas

promovidas pelo exercício45, 46. O uso frequente deste modelo de exercício se

deve a simplicidade e baixo custo, sendo possível treinar vários animais ao

mesmo tempo, definir a duração e intensidade de treinamento, aumentando

progressivamente esses parâmetros de acordo com o protocolo do estudo32.

Diversos estudos tem relatado que o exercício em esteira é capaz de

promover mudanças no sistema nervoso. Uma pesquisa recente envolvendo

este tipo de atividade durante quatro semanas de treinamento mostrou que o

exercício em esteira é capaz de promover mudanças em proteínas sinápticas e

estruturais no córtex motor, estriado e cerebelo42, outros ainda relatam que

promove neurogênese em regiões do hipocampo de ratos envelhecidos47.

O exercício forçado de intensidade moderada por curto período de

tempo demonstrou mudanças na expressão de receptores ionotrópicos de

glutamato em regiões do cerebelo, estriado, córtex motor e hipocampo de ratos

jovens 48. Entretanto, exercícios rítmicos em ratos idosos não foram capazes de

promover efeitos sobre a memória espacial, talvez devido ao alto nível de

estresse causado pela rotina extenuante do exercício49.

O estudo de Albeck e colaboradores50, utilizaram treinamento em esteira

com ratos idosos de intensidade leve para analisar as alterações das

neurotrofinas no prosencéfalo basal. Os autores relataram que não houve

alterações nos níveis de BDNF do grupo treinado comparado ao controle, mas

13

que houve respostas cognitivas de animais que realizaram exercício em esteira

de intensidade leve durante 7 dias de treinamento 50.

Kim e colaboradores36, relataram que o exercício em esteira induziu

aumento da proliferação celular no giro denteado dos ratos idosos, juntamente

com a melhora na memória espacial de curto prazo36. Outros estudos

demonstraram aumento da neurogênese do hipocampo e consequentemente

nas funções cognitivas, potenciação de longa duração e plasticidade

sináptica51-53.

Em resumo, várias terminologias têm sido utilizadas para descrever

esses diferentes tipos de exercício, e levam em consideração a forma como a

tarefa precisa ser executada, algumas requerem maior atenção, outras como é

o caso do exercício em esteira podem ser realizadas de forma mais

automatizada, gerando padrões de ativação nas diferentes áreas cerebrais

compondo circuitos distintos 54, 55.

1.3. Circuitos funcionais

1.3.1. Aquisição de novas habilidades X Automatizado/rítmico

Lewis e colaboradores56, classificaram diferentes tipos de treinamento

em internamente e externamente guiado, tendo como base o recrutamento de

dois principais circuitos motores. Nas tarefas que são internamente guiadas é

necessário um planejamento do movimento, podendo citar como exemplo as

tarefas que requerem a aquisição de novas habilidades, como é o caso do

exercício acrobático, prevalecendo o circuito núcleos da base-tálamo-cortical 56.

Tarefas como o exercício em esteira que não necessitam de muita

atenção e são ajustadas por estímulos externos, pode ser considerado um

exercício aprendido ou automatizado, sendo classificado como externamente

guiado e envolve predominantemente circuito cerebelo-tálamo-cortical.

Segundo alguns autores, uma tarefa externamente guiada por informações

visual ou auditivo são bastante eficientes no treino da marcha e equilíbrio,

especialmente em pacientes com Parkinson 56-58.

14

1.4. Mecanismos neuroplásticos no envelhecimento

O desempenho de tarefas motoras em idosos tem se mostrado

resultante do recrutamento de muito mais áreas encefálicas comparado ao de

jovens. Atualmente, existem duas teorias para explicar os mecanismos

envolvidos no recrutamento dessas várias áreas encefálicas decorrente do

envelhecimento.

1.4.1. Mecanismo de De-diferenciação

Estudos de caráter cognitivo tem demonstrado que indivíduos idosos

revelam um recrutamento não seletivo de regiões encefálica, tornando a

relação estrutura-função do encéfalo menos precisa podendo refletir um

recrutamento ineficiente de áreas adicionais comparado a adultos jovens59.

Uma possível explicação para essa maior ativação cerebral vista em idosos

pode ser pelo fato destes utilizam estratégias diferentes dos adultos jovens,

ocorrendo uma maior ativação ipisilateral no córtex motor como resultado da

diminuição da inibição inter-hemisférica através do corpo caloso, a chamada

hipótese da de-diferenciação60.

A diminuição dessa inibição resulta em movimentos não intencionais do

membro oposto à realização de uma tarefa, o chamado movimento espelho.

Portanto, idosos que mantêm a capacidade de inibir o córtex motor ipsilateral,

podem realizar uma tarefa de maneira eficiente e refinada, evitando

movimentos indesejados do membro oposto 61, 62.

1.4.2. Mecanismo da Compensação

A compensação ou “over-activation” como é também frequentemente

interpretada, vem sendo descrita por autores que demonstram que isto

acontece no cérebro de indivíduos idosos durante realização de tarefas. Mattay

e colaboradores63, observaram que indivíduos idosos recrutam áreas corticais e

subcorticais adicionais quando comparado com indivíduos adultos jovens para

realização de uma tarefa simples com tempo de reação similar, o contrário

15

também foi visto, ou seja, indivíduos idosos com desempenho prejudicado não

apresentaram áreas de ativação diferente dos adultos jovens63.

Indivíduos idosos mostram uma maior ativação das áreas que são as

mesmas usadas por adultos jovens, são elas: lobo anterior bilateral do

cerebelo, córtex pré-motor, córtex parietal, córtex pré-frontal esquerdo e córtex

cingulado anterior. Porém os idosos recrutam regiões que não são utilizadas

pelos adultos jovens como área pré-motora suplementar e lobo parietal

posterior bilateral64.

Heuninckx e colaboradores65 utilizaram movimentos isolados ou

associados da mão/pé no mesmo sentido e em sentidos opostos para

demonstrar que os idosos ativam áreas envolvidas com cognição além

daquelas associadas com a tarefa proposta, enquanto que os adultos jovens o

fizeram como um processo automatizado65. Essa diferença estratégica que

indivíduos idosos utilizam, está associada com um maior recrutamento da

região pré-frontal, pré-motora e área motora suplementar. Idosos promovem

um maior engajamento neural durante a tarefa motora do que adulto jovem,

com recrutamento de áreas não especifica tanto cognitiva quanto motora que

pode ser explicado pela dificuldade durante a realização da tarefa 66.

1.5. Estruturas Anatômicas

1.5.1 Córtex Motor

Como descrito por Lorente Nó66, o córtex cerebral está organizado em

camadas numeradas de I a VI. Em sua composição consta três tipos celulares,

que incluem as células granulares ou estreladas (interneurônios); células

fusiformes e células piramidais (células eferentes corticais). Nas camadas I a III

encontram-se fibras de associação, na IV as fibras aferentes e na camada V as

fibras eferentes que saem em direção ao tronco encefálico, medula espinal,

núcleos da base entre outras.

Há uma subdivisão das áreas motoras do córtex cerebral, em área

motora primária e área motora secundária. A primeira é responsável por

executar o movimento e as áreas motoras secundárias por planejar esses

16

movimentos, incluindo aqueles padrões de movimento mais complexos67. Vale

ressaltar que existe uma representação somatotópica do córtex motor primário,

representando cada região corpórea, isso está presente em qualquer espécie

de animal, inclusive o rato68, variando o tamanho e localização de cada

estrutura de acordo com a importância das ações motoras e grau de

complexidade.

Os neurônios presentes no córtex motor primário recebem aferências do

córtex somatosensorial primário, córtex parietal posterior, envolvida com

modalidades sensoriais utilizada no planejamento motor, além do cerebelo,

núcleos da base, entre outros. As fibras eferentes originadas das células

piramidais da camada V formam o trato corticoespinal que chega até a medula

ativando grupos musculares que participam da execução do movimento67, 69. As

conexões do córtex cerebral são mediadas por impulsos glutamatérgicos

vindos das vias sensoriais, tornando a informação periférica consciente para

ser interpretada e promover uma resposta motora eficiente.

Com intuito de avaliar sinaptogênese e a reorganização cortical, frente a

diferentes períodos de treinamento (3, 7 e 10 dias) de novas habilidades

motoras, Kleim e colaboradores70 revelaram que animais treinados por 7 e 10

dias tiveram um número significativamente maior de formação de sinapses do

que o grupo que não realizou treinamento. Propondo que a formação de

sinapse e reorganização do mapa motor não estão presentes na fase inicial de

aquisição de habilidades motoras, mas que representa a consolidação dessa

habilidade ocorrendo na fase mais tardia do aprendizado 70.

1.5.2. Estriado

Os gânglios da base consistem em uma variedade de grupos celulares

subcorticais envolvidos principalmente no controle motor, além de outras

inúmeras funções, como aprendizado, funções comportamentais e emocionais.

O termo gânglios da base se refere a núcleos que estão presentes nos

hemisférios cerebrais 71.

Esses núcleos podem ser classificados como: núcleos de entrada,

núcleos de saída e núcleos intrínsecos. Os núcleos de entrada recebem

17

informações de diferentes lugares, mas principalmente de origem cortical,

talâmica e nigral e incluem o núcleo caudado, putâmen e núcleo acumbens. Os

núcleos de saída enviam informações do globo pálido ao tálamo e são eles,

globo pálido interno e substância negra parte reticulada. E por fim, os núcleos

intrínsecos (globo pálido externo e substância negra parte compacta) que

situam-se entre a entrada e retransmissão de informações de saída. As

eferências corticais e talâmicas entram no estriado (núcleos de entrada), sendo

processadas dentro do sistema dos gânglios da base, os núcleos de saída se

projetam ao tálamo que por sua vez projeta de volta ao córtex cerebral71.

Para que haja um funcionamento correto dos gânglios da base se faz

necessária a ação da dopamina nos núcleos de entrada. Ou seja, situações

onde há alteração dessa substância estão frequentemente associadas com

distúrbios do movimento, como a doença de Parkinson, coréia, hemibalismo

entre outros 71.

Olhando mais detalhadamente nas funções estriatais, estudos sugerem

que processos envolvidos durante as fases de aprendizado de novas

habilidades podem ser diferentes. No estriado dorsomedial (homólogo ao

caudado nos primatas), por exemplo, que recebe aferências principalmente da

área motora suplementar e córtex pré-frontal, vem sendo descrito que está

envolvido nas fases iniciais de aprendizado visuomotor ou de habilidades

motoras complexas. Enquanto que, o estriado dorsolateral (homólogo ao

putâmen nos primatas) recebe aferências do córtex sensório-motor e é está

envolvido nas aquisições de comportamento habituais e automatizadas 72.

1.5.3. Cerebelo

O cerebelo se localiza posteriormente ao tronco encefálico e se conecta

com este através de três pares de tratos simétricos: pedúnculo cerebelar

inferior, médio e superior. As funções desempenhadas pelo cerebelo incluem

coordenação motora, controle do equilíbrio e funções autonômicas, além de

articulação verbal e controle dos movimentos oculares. Recentes estudos têm

enfatizado o papel do cerebelo no controle de funções cognitivas 67, 73.

18

O envolvimento do cerebelo nessas inúmeras funções se deve as suas

conexões não apenas com áreas corticais motoras, mas também com regiões

do córtex pré-frontal, córtex parietal posterior, temporal superior e regiões

occipto-temporal, que são áreas de associação envolvidas na organização

visuo-espacial, controle do comportamento, além de funções executivas como

memória de trabalho e atenção 73, 74.

O córtex cerebelar é constituído por três camadas nomeadas de

molecular, células de Purkinje e granular. Na camada molecular (mais externa)

é onde ocorrem inúmeras sinapses, estando presentes os dendritos das células

de Purkinje, dendritos das células de Golgi, as células em cesto e células

estreladas, todas essas células fazem sinapses com as fibras paralelas. Na

camada das células de Purkinje se encontram células com grandes corpos

celulares, e constitui a principal eferência (inibitória) do córtex cerebelar tendo

como mediador o neurotransmissor ácido gamaaminobutírico (GABA) 75. Na

camada granular, podemos encontrar em grande número as células granulares

e seus axônios se dirigem para a camada molecular se ramificando e formando

as fibras paralelas que por sua vez, fazem sinapses excitatórias com as células

de Purkinje67, 76.

É importante dizer que o cerebelo recebe duas principais aferências,

fibras musgosas e trepadeiras. As fibras musgosas levam informações

sensoriais da periferia e as provenientes do córtex cerebral, finalizando o

percurso com sinapses excitatórias nos dendritos das células granulares que

estão na camada granular. Já as fibras trepadeiras enviam informações

somatossensoriais, visuais ou do córtex cerebral, fazendo sinapses com as

células de Purkinje. As células de Purkinje sofrem inibição através dos

interneurônios estrelados, em cesto e de Golgi, sendo que os dois primeiros

têm suas atividades facilitadas pelas fibras paralelas67.

Durante o processo do envelhecimento, todo esse funcionamento

complexo do cerebelo pode sofrer alterações que irão refletir no desempenho

motor e cognitivo do indivíduo idoso. Já foi comprovado em pesquisas, que

adultos jovens ao realizarem tarefas consideradas externamente guiadas, ou

seja, que utilizam estímulos visuais ou auditivos, envolvem o circuito cerebelo-

tálamo-cortical, como descrito anteriormente 58. Porém indivíduos idosos ao

19

realizarem esse tipo de tarefa, apresentam pouco envolvimento desse circuito,

ao passo que, aumentam a conectividade cortical inter-hemisférica 77.

1.6. Marcadores de Plasticidade Sináptica

Estudos têm investigado os efeitos do exercício através de marcadores

de densidade sináptica, como proteínas sinápticas, sinapsina I e sinaptofisina,

além de marcadores do citoesqueleto neuronal, tais como os neurofilamentos

(NF’s) e microtúbulos (MAP2) 6, 42.

As sinapsinas representam uma família de quatro fosfoproteínas, que

estão presentes nos neurônios, e desempenham múltiplos papeis na

transmissão sináptica e plasticidade. Essas proteínas estão associadas a

vesículas sinápticas nos terminais nervosos do sistema nervoso central e

periférico. A sinapsina I é a mais abundante delas em neurônios maduros, e em

consequência da entrada de Ca+ na célula através de canais de Ca+ voltagem-

dependente, as vesículas se fundem com a membrana plasmática liberando

neurotransmissores na fenda sináptica 78-80.

A sinaptofisina é uma glicoproteína que está presente nos terminais pré-

sinápticos e é responsável pela biogênese e por ancorar as vesículas

sinápticas ao terminal nervoso assim como recuperar essas vesículas por

endocitose, possibilitando uma neurotransmissão rápida e eficiente. O aumento

da sinaptofisina significa aumento de vesículas nos terminais já existentes ou

formação de novos terminais nervosos, podendo ser consideradas como

marcador de densidade sináptica, sabendo que a densidade sináptica é um

importante preditor da estrutua e função do cérebro 81-83.

Os neurofilamentos compõem o citoesqueleto neuronal, estando

presentes principalmente nos axônios de células neuronais sendo os

responsáveis pela estabilidade do citoesqueleto axonal. Estes são compostos

por três tipos de proteínas: NF-L ou NF68, NF-M ou NF160 e NF-H ou NF200

(polipeptídeos com massas moleculares baixa, média e alta, respectivamente),

que irão formar heteropolímeros, onde o NF68 precisa co-polimerizar com pelo

menos uma das outras proteínas de maior massa molecular 84, 85.

20

A síntese desses neurofilamentos tem um papel importante no controle

do calibre axonal das fibras nervosas mielinizadas, lembrando que o tamanho

do calibre axonal implica na velocidade de condução nervosa. Além disso,

essas proteínas contribuem na diferenciação, crescimento, regeneração e

orientação axonal 86.

Os microtúbulos e proteínas associadas (MAPs) desempenham um

papel no desenvolvimento de axônios e dendritos. A MAP2 está mais

especificamente nos dendritos e apresentam funções de nucleação e

estabilização dos microtúbulos e transporte de organelas dentro de axônios e

dentritos. Em suma, as MAPs participam do processo de crescimento e

arborização dendrítica, manutenção e produção de sinaptogênese 87, 88.

2. JUSTIFICATIVA

O envelhecimento causa alterações estruturais e funcionais do sistema

nervoso induzindo a um declínio na coordenação motora, equilíbrio e

lentificação de movimentos, que são atenuados pelo exercício físico.

Entretanto, até o momento não está claro quais são as respostas plásticas

induzidas por exercício rítmico e por exercícios que requerem uma atividade

motora complexa em animais idosos.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Analisar respostas plásticas do sistema nervoso de animais idosos frente

a dois tipos de atividade física, exercício em esteira e exercício acrobático.

3.2. Objetivo Específico

- Analisar a expressão de proteínas estruturais do citoesqueleto (MAP2 e

neurofilamentos) e proteínas sinápticas (sinapsina I e sinaptofisina) de animais

idosos submetidos a diferentes treinamentos, exercício em esteira e exercício

acrobático e compará-los ao controle.

21

- Analisar as respostas plásticas nas áreas envolvidas com controle

motor: córtex motor, estriado e cerebelo.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Animais

Foram utilizados nesse estudo 39 ratos idosos jovens machos da

linhagem Wistar com 18 meses de idade fornecidos pelo Biotério Central do

Instituto de Ciências Biomédicas da USP. O trabalho foi aprovado pelo CEUA

do ICB/USP (processo n° 186/2011).

Os animais foram mantidos numa sala com ciclo invertido artificialmente

claro/escuro (12/12h), com alimentação e água ad libitum e numa temperatura

constante de 22ºC. Os mesmos foram colocados nesta sala cerca de quinze

dias antes do início do treinamento para adaptação ao ciclo invertido 89, 90.

4.2. Desenho do estudo

O estudo é do tipo experimental longitudinal. Os ratos foram inicialmente

submetidos à adaptação ao exercício na esteira por 10 minutos durante dois

dias na semana, iniciando com uma velocidade de 0,2 km/h, nos primeiros dois

minutos, 0,3km/h nos 3 minutos seguintes e 0,4km/h nos últimos 5 minutos, a

fim de selecionarmos os animais corredores, que então foram divididos

aleatoriamente entre os grupos exercício em esteira (EE, n=13), exercício

acrobático (AC, n=15) e grupo sedentário (SED, n=11) (controle). Os animais

do grupo controle também foram mantidos na sala com ciclo invertido, onde

aconteciam os treinamentos.

22

4.3. Protocolo de Exercício em Esteira (EE)

Os animais deste grupo foram treinados em uma esteira ergométrica

programável (KT 3000 – IMBRAMED) adaptada para ratos. A esteira é

constituída de 8 raias de acrílico transparente pintadas de preto em sua parte

anterior atraindo os animais para essa região da esteira, evitando o uso de

choque elétrico.

O treinamento de corrida na esteira de intensidade leve foi realizado três

vezes por semana durante quatro semanas consecutivas, começando numa

velocidade de 0,3km/h no primeiro minuto, incrementando a velocidade para

0,4km/h no segundo minuto, e a partir disso 0,5km/h nos 38 minutos restantes

com 0º de inclinação. Sendo realizado no período ativo do animal 89. O uso

desta intensidade no exercício foi baseado em Albeck e colaboradores (2006)

que demonstrou que esta intensidade foi capaz de induzir respostas no

encéfalo de ratos idosos 50.

Figura 1: Esteira Ergométrica adaptada para ratos (Garcia et al., 2012)

4.4. Protocolo de Exercício Acrobático (AC)

O treinamento acrobático consistiu em atravessar um circuito constituído

por 6 obstáculos, começando com gangorra, seguido das barreiras, depois as

escada de cordas, trave de madeira roliça, pontes de madeira e por fim, uma

ponte de corda (Figura 2). O circuito foi baseado no utilizado por Kleim e

23

colaboradores, colocados a 1,50m do chão. Os ratos realizaram um período de

adaptação no circuito, passando duas vezes por dia durante dois dias em uma

semana. Feito isso, iniciou-se o treinamento e os ratos passavam cinco vezes

consecutivas pelo circuito a cada dia de treinamento, três vezes por semana

durante quatro semanas. A cada passagem pelo circuito foi registrado o tempo

e quando um animal terminava de treinar foi passado álcool 5% com a

finalidade de remover o odor deixado por ele, o que poderia estressar o

próximo animal que fosse treinar.

Figura 2: Circuito acrobático (Garcia et al., 2012)

É sabido que a intensidade dos dois tipos de exercício não é a mesma,

mas o que levamos em conta foi a escolha de tipos de exercícios com

exigências motoras distintas e capaz de produzir alterações de origem

neurofuncional já relatadas pela literatura.

4.5. Protocolo de Imuno-histoquímica

No último dia de treinamento, em média 45 minutos após terem treinado,

os animais dos 3 grupos foram anestesiados com quetamina (0,15ml/100g) e

xilazina (0,1ml/100g) por via intramuscular e submetidos à perfusão

transcardíaca, com solução salina 0,9%, seguida de solução fixadora

constituída de paraformaldeído 2% dissolvido em tampão fosfato 0,1 M (PB, pH

7,4). Após a perfusão, os encéfalos foram coletados e armazenados em

24

paraformaldeído 2%, durante 4 horas. Após este período, o material foi

transferido para uma solução crioprotetora de sacarose a 30% em PB. Após 36

horas de crioproteção, os tecidos foram cortados em uma espessura de 30 µm

em um micrótomo deslizante de congelamento (CM3050, Leica).

Os cortes histológicos foram colocados em placa de cultivo, em solução

anti-freezer, e mantidos a -20ºC até o momento do procedimento de imuno-

histoquímica. Os cortes contendo as seguintes áreas: córtex motor, estriado e

cerebelo foram selecionados e submetidos à metodologia de imuno-

histoquímica com anticorpos específicos para detecção de sinapsina I

(anticorpo policlonal de coelho dirigido contra proteína SYS – Chemicon,

Temecula, CA, EUA), sinaptofisina (anticorpo policlonal de coelho contra

proteína SYP – DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), MAP2 (anticorpo

monoclonal de camundongo dirigido contra a proteína MAP2 – Chemicon,

Temecula, CA, EUA) e neurofilamentos (NFs) (anticorpo monoclonal de

camundongo dirigido contra NFs – Zymed Labarotories, San Francisco, CA,

EUA). Como o anticorpo dirigido contra NF reconhece região homóloga dos

três neurofilamentos (NF68, NF160 e NF200), não foi possível diferencia-los

com o método de imuno-histoquímica, apenas quando analisados pelo

“immunoblotting”.

No processamento de imuno-histoquímica os cortes selecionados foram

lavados em tampão fosfato (PB 0,1M) por três vezes de 10 minutos, e depois

incubados com anticorpos primários específicos para os anticorpos citados

acima, em diferentes concentrações (1:250-1:1000), em PB com 0,3% de Triton

X-100 por um período de 14 a 18 horas à temperatura ambiente (24ºC).

Na sequência, os cortes foram novamente lavados em PB 0,1M à

temperatura ambiente e incubados por duas horas com anticorpo secundário

biotinilado anti-coelho feito em cabra para anti-SYS, anti-coelho feito em

jumento para anti-SYP, anti-camundongo feito em cabra para anti-NF e anti-

camundongo feito em burro para anti-MAP2 na concentração de 1:200 com PB

com 0,3% de Triton X-100 por duas horas à temperatura ambiente. Após nova

série de lavagens à temperatura ambiente, os cortes foram colocados por duas

horas numa solução, contendo o complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC

ELITE kit, Vector Labs.). Após uma série de lavagens, os cortes foram imersos

25

num meio contendo 3-3’diaminobenzidina (DAB- Sigma-Aldrich) 0,05% em

tampão fosfato 0,1M por cerca de 5 minutos. Foram acrescentados a seguir 3

ml de solução de H2O2 a 0,3% em água destilada, mantendo os cortes neste

banho até que a reação fosse evidenciada. Atingida a imunorreatividade

desejada com o desenvolvimento de coloração marrom clara, os cortes foram

removidos da solução com DAB e imersas em tampão PB 0,1M. Depois de

nova série de lavagens em tampão fosfato 0,1M com o objetivo de remoção do

excesso de reagente, os cortes foram colocados sobre lâminas de vidro

gelatinizadas e colocadas em placa quente. Posteriormente, foram hidratadas

em água destilada por 1 minuto, banhadas em solução de tetróxido de ósmio

0,1% por 15 – 30 segundos com intuito de realçar a coloração dos cortes,

desidratadas por uma série de álcoois em concentrações crescentes, banhadas

com Hemo-De (Fisher) e cobertas com lamínulas, tendo como meio de

montagem o Permount (Sigma). A imunorreatividade foi analisada ao

microscópio óptico (E1000,Nikon) acoplado a câmera digital e programa Nikon

Imaging Software ACT-U e as quantificações foram realizadas com o programa

Image J (National Institutes of Health/USA - NIH).

A análise da densidade integrada foi realizada com 4 animais de cada

grupo. Em cada animal foi analisado 5 cortes de cada área estudada, onde

foram coletados vários campos. No córtex motor foram capturados 8 campos

em cada corte, 12 campos no estriado (sendo 8 na região dorsomedial e 4 na

região dorsolateral) e 4 campos no cerebelo (2 na camada molecular e 2 na

camada granular). No córtex motor a região analisada foi M1 e M2 na camada

V e suas imediações 91. No estriado as regiões dorsomedial e dorsolateral

foram analisadas 91. E no cerebelo, a região paramediana, mais

especificamente as camadas molecular e granular 91. No programa Image J

preconizamos áreas em forma de quadrado para demarcar no corte o que iria

ser quantificado, e para cada estrutura foi utilizado uma determinada área. No

córtex utilizamos um quadrado com área de 150µm², realizando 3 medidas de

analise no mesmo campo com este quadrado, os valores foram transferidos

para o programa Excel onde era feita a média dessas 4 medidas. No estriado a

área do quadrado foi de 50µm², sendo realizadas 5 medidas de analise em

regiões diferentes do mesmo corte, e no final feita a média dos valores no

26

programa Excel. E por fim, no cerebelo a área utilizada foi de 125x50µm²

fazendo duas analises de medida na camada molecular e duas na camada

granular e no final feita a média de cada camada.

4.6. Protocolo de “Immunoblotting”

Os animais dos três grupos foram decapitados e as áreas do encéfalo a

serem estudadas foram rapidamente coletadas, congeladas em nitrogênio

líquido e armazenadas no freezer a -80ºC até o uso. As amostras foram

homogeneizadas a 4ºC em tampão de extração (Tris pH 7,4 100mM, EDTA

10mM, PMSF 2nM e aprotinina 0,01mg/ml). Em seguida, foram centrifugados

por 20 minutos a 12.000 rpm em uma centrifuga refrigerada a 4ºC. O

sobrenadante foi separado do “pellet”, sendo utilizada uma pequena amostra

para determinação do conteúdo proteico, e o resto da amostra tratado com

tampão Laemmli contendo DTT 100mM (Laemmi, 1970), fervido em banho-

maria por 5 minutos e armazenado

O conteúdo protéico do material isolado dos diferentes grupos de

animais foi dosado pelo método de Bradford (Amresco, U.S.A) (Bradford,

1976). Quantidades equivalentes a 100 microgramas de proteínas das

amostras previamente armazenadas no Laemmli foram submetidas a

separação por eletroforese com corrente constante de 25mA em géis de

acrilamida de 6,5% e 8% contendo dodecil sulfato de sódio SDS (Bio-rad,

EUA), para as proteínas MAP2 e NF’s, sinapsina I e sinaptofisina,

respectivamente. Após a separação eletroforética, as proteínas foram

transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Millipore, 0,2um de

diâmetro) de acordo com a técnica descrita por Towbin et al. (1979). Os

antígenos presentes na membrana de nitrocelulose foram submetidos à

caracterização imunoenzimática. Após bloqueio com leite desnatado (Molico)

5% em tampão Tris-Salina (Tris 10mM e NaCl 0,15M, pH 7,5), por 2 horas, com

intuito de evitar ligações proteicas indesejadas, as membranas foram

incubadas com os mesmos anticorpos utilizados na imuno-histoquímica por 18

horas a 4ºC, porém em concentrações mais baixas (1:2000), além do anticorpo

27

contra β-actina (Sigma, St. Louis, MO, EUA), estando na concentração de

1:10.000. Em seguida, as membranas foram lavadas com Tris-Salina e

incubadas por 2 horas com um anticorpo secundário marcado com peroxidase

(Amersham Biosciences) diluído em concentração de 1:10.000 em solução

bloqueadora. O excesso de conjugado foi removido com mais um ciclo de

lavagens de solução basal e as membranas foram reveladas utilizando o Kit

ECL (Amersham Biosciences) de quimioluminescência. Depois de ter revelado,

as membranas foram então incubadas com solução de “stripping” por 10

minutos à temperatura ambiente, a fim de remover o anticorpo que havia sido

revelado e a partir disso, incubar com outro anticorpo. Os filmes contendo as

bandas foram escaneados e analisados quanto à densidade óptica da

imunorreatividade utilizando o programa Image J (National Institutes of

Health/USA). A partir do resultado da quantificação, foi feita uma razão entre a

densidade óptica das proteínas estruturais (MAP2 e NFs) e das proteínas

sinápticas (sinapsina I e sinaptofisina) com a β-actina, pois esta não se altera

nessas condições experimentais, funcionando portanto como um controle de

pipetagem. Esses dados foram submetidos às análises estatísticas. Os dados

representados nos gráficos foram normalizados pelo grupo controle

(sedentário) que assumimos valor 1, ou seja, 100%.

4.7. Análise Estatística

Os dados obtidos de densidade óptica relativa e níveis relativos de

proteína foram submetidos à análise estatística utilizando o software GraphPad

Prism5. Sendo utilizado o teste de ANOVA para medidas repetidas e

comparação entre os grupos, seguida do pós-teste de Tukey quando a análise

de variância apresentou diferença estatisticamente significante. Os dados estão

apresentados pela média e erro padrão. Para todos os testes, o nível de

significância estatística adotado foi de p<0,05.

28

5. RESULTADOS

5.1. Desempenho Motor

O desempenho motor dos ratos idosos submetidos a quatro semanas de

treinamento acrobático está demonstrado pelo tempo gasto para executar as

cinco passagens por todo o circuito (Figura 3).

O treinamento acrobático realizado durante um mês revelou que o tempo

gasto na primeira e quarta semanas (98,33±2,96; 102,59±4,45;

respectivamente) foi estatisticamente menor comparado aos da segunda e

terceira semanas (117,92±4,14; 113,03±3,85; respectivamente). Comparando a

primeira semana com as três semanas seguintes, podemos observar que

houve um aumento no tempo gasto para realização das tarefas em relação a

segunda (p<0,01) e terceira semanas (p<0,05). Na quarta semana de

treinamento houve uma diminuição significativa do tempo comparado com a

média de tempo gasto na segunda semana, mas semelhante ao da primeira

semana.

Figura 3. O gráfico demonstra o desempenho motor dos ratos ao longo de quatro semanas de

treinamento do grupo acrobático avaliado pela média do tempo gasto para executar o circuito.

*p<0,05; **p<0,01

29

5.2. Expressão das Proteínas

A expressão das proteínas estruturais e sinápticas avaliadas por

diferentes métodos revelaram que nem todos os dados de “immunoblotting”

foram semelhantes aos revelados pela técnica de imuno-histoquímica (Tabela

1). Essas diferenças são aceitáveis, pois a técnica de “immunoblotting” analisa

o conteúdo proteico de toda a estrutura removida do encéfalo, enquanto a

técnica de imuno-histoquímica permite analisar regiões imunorreativas

especifica do córtex, estriado e cerebelo.

5.2.1. Córtex Motor

As proteínas estruturais MAP2 e neurofilamentos mostraram um padrão

citoplasmático de imunorreatividade em todos os grupos estudados (Figuras 4

e 5). A proteína MAP2 se apresenta expressa ao longo das neurópilas de forma

difusa por toda a camada V do córtex motor primário e secundário do encéfalo

dos animais idosos (Figura 4). Os grupos AC e EE induziram um aumento

significativo da densidade óptica relativa de MAP2 comparado ao grupo

controle (35%, p<0,05 e 56%, p<0,001, respectivamente). Os dados de

“immunoblotting” mostraram aumento de 83% do nível proteico de MAP2 no

grupo AC comparado aos grupos controle e EE (p<0,001) (Figura 4).

Os neurofilamentos (NFs) foram expressos em processos e corpos

celulares em toda a extensão da camada V do córtex motor (Figura 5), sendo

observado um aumento significativo da densidade óptica relativa dessa

proteína no grupo AC comparado ao grupo controle (151%, p<0,001) e grupo

EE (106%, p<0,001). Os dados de “immunoblotting” revelaram que tanto o

grupo AC quanto o grupo EE induziram aumento significativo dos níveis

proteicos de NF68 comparado ao controle (96%, p<0,01 e 243%, p<0,001,

respectivamente). No entanto, os demais subtipos de NFs (NFs 160 e 200)

não sofreram mudanças significativas nos seus níveis proteicos frente aos

treinamentos acrobáticos e em esteira (Figura 5).

31

Figura 4. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína MAP2 no

córtex motor (M1 e M2). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato idoso

ilustrando a expressão de MAP2 no córtex motor. B: Análise semi-quantitativa da densidade

integrada de MAP2 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da

expressão de MAP2 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo

acrobático EE: grupo treinado em esteira. *p<0,05; ***p<0,001.

32

Figura 5. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína NF no córtex

motor (M1 e M2). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato idoso ilustrando a

expressão de NF no córtex motor. B: Análise semi-quantitativa da densidade integrada de NF

pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de NF

analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo acrobático EE: grupo

treinado em esteira. **p<0,01; ***p<0,001.

33

A sinaptofisina (SYP) e sinapsina (SYS) são expressas de forma difusa

por toda extensão da camada V do córtex motor primário e secundário

revelando uma marcação citoplasmática nos corpos celulares (Figuras 6 e 7). A

análise da densidade óptica relativa de SYP nessa região revelou que o grupo

AC induziu diminuição significativa (44%, p<0,001) comparada ao grupo

controle (Figura 6). Já os dados de “immunoblotting” revelaram que os dois

tipos de treinamentos não foram capaz de induzir mudanças significativas na

expressão de SYP em relação ao controle, apesar do gráfico seguir na mesma

direção dos dados de imuno-histoquímica, houve aumento significativo apenas

do grupo EE em relação ao grupo AC (38%, p<0,05) (Figura 6).

A densidade óptica relativa de SYS revelou um aumento significativo

induzido tanto pelo treinamento acrobático (65%, p<0,001) quanto pelo

treinamento em esteira (72%, p<0,001) comparado ao controle, corroborando

com os dados de “immunoblotting” onde o grupo AC induziu um aumento

significativo dos níveis dessa proteína comparado ao controle (30% p<0,05) e

grupo EE (Figura 7).

5.2.2. Estriado

A imunorreatividade contra a proteína MAP2 esta presente ao longo da

neurópila de forma difusa por toda região rostro-caudal e médio-lateral do

estriado dos animais idosos (Figura 8). A análise da densidade óptica relativa

revelou que o exercício AC induziu diminuição significativa na região

dorsomedial e dorsolateral da proteína MAP2 em relação ao controle (44%,

p<0,05 e 58%, p<0,001, respectivamente) e ao EE (67%, p<0,01 e 39%,

p<0,01, respectivamente). Já os dados de “immunoblotting” mostraram que o

exercício em esteira induziu diminuição significativa dos níveis proteicos de

MAP2 comparado ao controle e ao grupo AC (35%, p<0,01) (Figura 8).

A proteína neurofilamento apresenta uma marcação de forma puntiforme

e aglomerada em todo o estriado, onde possivelmente passam feixes nervosos

(Figura 9). A análise da expressão de neurofilamento (NF) revelou um aumento

34

Figura 6. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYP no córtex


expressão de SYP no córtex motor. B: Análise semi-quantitativa da densidade integrada de

SYP pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de NF


treinado em esteira ***p<0,001; *p<0,05.

35

Figura 7. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYS no córtex


expressão de SYS no córtex motor. B: Análise semi-quantitativa da densidade integrada de

SYS pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de NF


treinado em esteira *p<0,05; **p<0,01;***p<0,001.

36


estriado (dorsomedial e dorsolateral). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato

idoso ilustrando a expressão de MAP2 no estriado. B: Análise semi-quantitativa da densidade

integrada de MAP2 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da

expressão de MAP2 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo

acrobático EE: grupo treinado em esteira. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

37

significativo da densidade óptica relativa na região dorsomedial e dorsolateral

induzido pelo exercício acrobático em relação ao controle (128%, p<0,001 e

44%, p<0,01, respectivamente). Aumento da expressão de NF na região

dorsomedial foi observado no grupo exercício em esteira comparado ao

controle (49% p<0,001). Entretanto, com a técnica de “immunoblotting” não

foram observadas mudanças significativas (Figura 9).

No estriado SYP e SYS mostram um padrão de marcação puntiforme, de

maneira arredondada e difusa em toda região (Figuras 10 e 11). O treinamento

acrobático e o exercício em esteira induziram um aumento significativo na

densidade óptica relativa de SYP tanto na região dorsomedial (55% p<0,001 e

64% p<0,001, respectivamente) como na região dorsolateral (78% p<0,01 e

47% p<0,05, respectivamente) (Figura 10). Os dados de “immunoblotting” não

revelaram alterações significativas nos níveis de expressão de SYP no estriado

nos grupos treinados (Figura 10).

Os dados de expressão da proteína SYS revelados pela técnica de

imuno-histoquímica mostraram que tanto o exercício acrobático como o

exercício em esteira induziram uma diminuição significativa na densidade

óptica relativa tanto na área dorsomedial (32%, p<0,001 e 20%, p<0,001,

respectivamente), quanto na área dorsolateral do estriado (34%, p<0,001 e

23%, p<0,01, respectivamente) (Figura 11). A técnica de “immunoblotting” não

demonstrou mudanças significativas na expressão de SYS frente aos

diferentes treinamentos (Figura 11).

5.2.3. Cerebelo

Nesta estrutura observamos que tanto MAP2 quanto NF apresentam um

padrão citoplasmático de marcação nas células de Purkinje. Imunorreatividade

contra MAP2 foi observada ao longo dos processos axonais da camada

granular e dos dendritos na camada molecular, enquanto que NF foi expresso

nos processos axonais da camada granular e molecular (Figuras 12 e 13).

38

Figura 9. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína NF no


idoso ilustrando a expressão de NF no estriado. B: Análise semi-quantitativa da densidade

integrada de NF pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da

expressão de NF analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo

acrobático EE: grupo treinado em esteira **p<0,01;***p<0,001.

39

Figura 10. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYP no


idoso ilustrando a expressão de SYP no estriado. B: Análise semi-quantitativa da densidade

integrada de SYP pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da

expressão de SYP analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo

acrobático EE: grupo treinado em esteira *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

40

Figura 11. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYS no


idoso ilustrando a expressão de SYS no estriado. B: Análise semi-quantitativa da densidade

integrada de SYS pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da

expressão de SYS analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo

acrobático EE: grupo treinado em esteira **p<0,01; ***p<0,001.

41

Os dados de imuno-histoquímica revelaram que o exercício em esteira

induziu um aumento significativo da densidade óptica relativa de MAP2 na

camada granular do cerebelo em relação ao controle (54%, p<0,001), e na

camada molecular tanto o exercício em esteira quanto o exercício acrobático

promoveram aumento significativo dessa proteína (48%, p<0,05 e 77%,

p<0,001, respectivamente) (Figura 12). Dados de “Immunoblotting” não

revelaram mudanças significativas dessa proteína no cerebelo de ratos

treinados (Figura 12).

O exercício acrobático e o exercício em esteira induziram diminuição

significativa da densidade óptica relativa de NF na camada granular (55%,

p<0,01 e 55%, p<0,01, respectivamente) e molecular do cerebelo (17%, p<0,05

e 17%, p<0,05, respectivamente) comparado ao controle (Figura 13). Os dados

de “immunoblotting” revelaram que o exercício em esteira promoveu diminuição

significativa dos níveis proteicos de NF68 (56%, p<0,05) comparado ao

controle, enquanto o exercício acrobático induziu diminuição significativa da

expressão de NF200 (21%, p<0,05) em relação ao controle, e não houve

alteração significativa no NF160 (Figura 13).

Por toda a extensão do cerebelo, tanto SYP quanto SYS revelam um

padrão puntiforme de imunoreatividade nas células de Purkinje, aglomerados

difusos na camada molecular e esparsos na camada granular (Figura 14 e 15).

Os dados da “imuno-histoquímica” revelaram que tanto o exercício

acrobático como o exercício em esteira induziram diminuição da densidade

óptica relativa de SYP na camada molecular cerebelar comparado ao controle

(85%, p<0,001 e 71%, p<0,001, respectivamente), e não houve alteração

significativa na camada granular (Figura 14). Os dados de “immunoblotting” não

revelaram mudanças significativas.

Os dados da densidade óptica relativa de SYS revelaram que o exercício

acrobático induziu diminuição significativa na camada granular e molecular

comparado ao controle (35%, p<0,05 e 89%, p<0,001, respectivamente) e EE

(55%, p<0,01) (Figura 15). O EE induziu diminuição significativa dessa proteína

na camada molecular em relação ao controle (44%, p<0,001). Esses dados

contrastam com os de “immunoblotting” que revelam que o AC induziu aumento

42

significativo na expressão de SYS em relação ao controle (59%, p<0,05)

(Figura 15).

43


cerebelo (camada molecular e camada granular). A: Imagens digitais de cortes frontais de

encéfalo de rato idoso ilustrando a expressão de MAP2 no cerebelo. B: Análise semi-

quantitativa da densidade integrada de MAP2 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da

densidade óptica da expressão de MAP2 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED:

sedentário; AC: grupo acrobático EE: grupo treinado em esteira *p<0,05; ***p<0,001.

44

Figura 13. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína NF no


encéfalo de rato idoso ilustrando a expressão de NF no cerebelo. B: Análise semi-quantitativa

da densidade integrada de NF pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade

óptica da expressão de NF analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC:

grupo acrobático EE: grupo treinado em esteira *p<0,05; **p<0,001

45

Figura 14. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYP no


encéfalo de rato idoso ilustrando a expressão de SYP no cerebelo. B: Análise semi-quantitativa

da densidade integrada de SYP pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade

óptica da expressão de SYP analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC:

grupo acrobático EE: grupo treinado em esteira **p<0,01;***p<0,001.

46

Figura 15. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYS no


encéfalo de rato idoso ilustrando a expressão de SYS no cerebelo. B: Análise semi-quantitativa

da densidade integrada de SYS pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade

óptica da expressão de SYS analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC:

grupo acrobático EE: grupo treinado em esteira *p<0,05;**p<0,01;***p<0,001.

47

6. DISCUSSÃO

Os nossos dados revelaram que tanto o exercício acrobático como

exercício em esteira promoveram mudanças distintas tanto em relação às

proteínas quanto em relação às estruturas encefálicas estudadas revelando

uma capacidade plástica do sistema nervoso de animais idosos frente a

demandas motoras diferentes.

6.1. Desempenho Motor

O desempenho motor durante 4 semanas de treinamento acrobático

demonstrou uma média de tempo na primeira semana estatisticamente menor

em relação a segunda e a terceira semana de treinamento. Nós podemos

seguramente afirmar que este dado não representa o desempenho motor do

rato idoso na primeira semana, pelo fato da dificuldade de se adaptar ao

circuito, sendo conduzido na maior parte do tempo. Já na segunda semana os

animais apresentaram melhor posicionamento das patas, assim como uma

menor condução por parte do treinador sugerindo uma melhora no

desempenho motor dos ratos idosos na realização das tarefas acrobáticas. Nós

percebemos a partir de então uma redução significativa da curva do

desempenho motor, no entanto, não podemos afirmar que o animal aprendeu a

tarefa proposta, mas que seu desempenho apresentou melhora ao final de 4

semanas.

Trabalhos com ratos jovens mostraram que há uma melhora significativa

do desempenho motor ao final de um treinamento que requer aquisição de

novas habilidades, seja a curto prazo ou a longo prazo de treinamento41, 42, 92.

De um modo geral, os nossos dados demonstraram que os ratos idosos

conseguem aprender a mesma tarefa que ratos adultos jovens, porém o tempo

para aquisição ou até consolidação de uma atividade motora é acrescido em

ratos idosos, ou seja, o período de treinamento desse animais idosos precisa

ser prolongado visto que o processo de aprendizado é mais lentificado.

48

6.2. Córtex Motor

De uma maneira geral, nossos dados do córtex motor demonstraram

que ambos os tipos de exercício promoveram aumento das proteínas

estruturais, MAP2 e NF, comparadas ao controle. E mais, que a expressão

dessas proteínas revelada pelas técnicas de “immunoblotting” e imuno-

histoquímica são complementares.

O exercício acrobático foi capaz de gerar maiores mudanças das

proteínas estruturais comparadas ao exercício em esteira, pelo fato do

exercício acrobático induzir aumento de MAP2 e NF em ambas as técnicas

utilizadas, “immunobloting” e imuno-histoquímica, demonstrando que esse

aumento ocorreu tanto no córtex motor como um todo quanto na camada V

dessa região (localização das células piramidais eferentes).

É sabido que a proteína estrutural MAP2 está presente principalmente

nos dendritos de células neuronais participando do crescimento da arborização

dendrítica, estabelecimento e manutenção da sinaptogênese. A partir disso,

podemos sugerir que esse aumento da proteína MAP2 induzida pelo AC

promoveu um aumento de arborização dendrítica, aumentando área de contato

sináptico e gerando um remodelamento estrutural e sinaptogênese envolvida

com planejamento e execução de movimentos mais complexos. Apesar disso,

o estudo de Tennant e colaboradores44, mostrou que camundongos idosos

submetidos ao treinamento de tarefas de alcance refinadas não revelaram

alterações significativas na representação do mapa cortical comparado aos

animais idosos controle apesar de aprenderem a tarefa proposta e realizarem

tão bem quanto os animais jovens.

Portanto, nossos dados não concordam totalmente com os de Tennant e

colaboradores44 já que o aumento de proteínas do citoesqueleto (MAP2 e NF)

descrito por nós pode indicar um aumento da área cortical envolvida no

controle da atividade acrobática com consequente reorganização topográfica.

Mas vale lembrar que uma das formas do encéfalo do idoso compensar a

capacidade de processamento lentificado da área motora primária é recrutar

áreas corticais adicionais ipsilateral e contralateral permitindo que os idosos

realizem as tarefas como os jovens o fazem93. Desta forma, os nossos dados

de aumento de expressão de MAP2 e NF produzidos pelo treinamento

49

acrobático podem estar mais ligados a maior participação das áreas motoras

primárias e secundárias de ambos hemisférios do que um aumento da

representação cortical das partes corporais envolvidas na atividade motora.

Outra possível explicação para essa diferença é que essas duas tarefas tem

exigências motoras distintas, onde uma requer coordenação e equilíbrio dos

quatro membros e a outra requer uma coordenação mais refinada somente dos

membros anteriores. No entanto, a diminuição do limiar para eliciar os

movimentos presente após longos períodos de treinamento nos animais idosos

revelada por Tennant e colaboradores44 parece concordar com a

sinaptogênese decorrente do crescimento da árvore dendritica e

estabelecimento de novas sinapses por nós observada.

Os animais idosos do grupo exercício em esteira apresentaram aumento

significativo dos níveis proteicos de NF68 no córtex motor e da expressão de

MAP2 somente na camada V desse córtex sugerindo um remodelamento

axonal e sinaptogênese nessa área cortical estudada. Trabalhos recentes do

nosso grupo e de nossos colaboradores6, 42 revelaram uma redução nos níveis

de NFs e manutenção da expressão de MAP2 em encéfalos de ratos adultos

jovens submetidos ao exercício em esteira por um curto e longo períodos de

treinamento, possivelmente decorrente de uma menor ativação cortical

decorrente da habituação por se tratar de um exercício automatizado/rítmico94.

Porém, o mesmo não se aplica aos encéfalos de animais idosos, pois a

elevação dos níveis de NFs e MAP2 no córtex motor sugere que esses animais

necessitam da ativação e recrutamento tanto da área motora primária como da

secundária para realizar tarefas motoras simples e rítmicas.

Essa maior ativação cortical induzida pelo treinamento de ratos idosos

em esteira corrobora com os achados de Huang e colaboradores95, que

demonstraram um aumento da densidade de capilares do córtex motor com

consequentemente aumento do fluxo sanguíneo no cérebro de ratas de meia

idade submetidas ao exercício em esteira.

Já foi descrito pela literatura que neurônios piramidais do neocórtex que

contém processos apicais e basais extensos, sofrem mudanças significativas

com o envelhecimento apresentando uma redução progressiva da arborização

dendrítica e espinhos dendríticos refletindo prejuízos na transmissão sináptica

50

glutamatérgica e na plasticidade sináptica, mesmo em condições não

patológicas17, 96. Além disso, alguns estudos tem demonstrado alterações na

integridade de múltiplos feixes de fibras corticais relacionados ao

envelhecimento, reduzindo tanto a quantidade como a qualidade da substância

branca cortical97, 98. Considerando os nossos achados de crescimento da

árvore dendrítica, estabelecimento de novas sinapses decorrente do aumento

de MAP2 e remodelamento axonal com possível aumento do axônio devido

expressão aumentada de NF no córtex, é possível dizer que a prática de

exercício acrobático pode atenuar tais déficits decorrentes do envelhecimento,

que muitas vezes podem trazer consequências nas funções cognitivas e

motoras.

A expressão das proteínas sinápticas SYS e SYP no córtex motor de

ratos idosos submetidos tanto ao exercício acrobático como ao em esteira

revelaram alterações em relação ao grupo sedentário. Porém, novamente o

exercício acrobático induziu mudanças mais expressivas que o EE.

O AC induziu um aumento dos níveis proteicos de SYS no córtex motor

e redução dos níveis relativos da proteína SYP na camada V dessa mesma

região. Considerando que a SYS está envolvida com a formação de sinapses e

liberação de neurotransmissores, o aumento de SYS no córtex motor de ratos

do grupo AC sugere sinaptogênese com aumento da eficiência sináptica.

Nossos dados corroboram com outros estudos, que utilizaram ratos adultos

jovens para realizar exercício acrobático, e encontraram um aumento de

sinaptogênese na camada V do córtex motor após 12 e 28 dias de

treinamento99, 100. Devido a escassez na literatura de dados envolvendo este

tipo de análise com proteína sinápticas em animais idosos realizando algum

tipo de exercício, ainda não é possível comparar os dados do presente estudo.

Inúmeros estudos com ressonância magnética funcional têm sido

realizados com humanos idosos. Taniwaki e col101 utilizaram tarefas

internamente e externamente guiada, e revelaram que os idosos aumentam a

atividade cortical inter-hemisférica ao realizar o movimento solicitado, como

resultado de uma possível resposta compensatória a fim de atender a demanda

da tarefa solicitada, diferentemente dos indivíduos adultos jovens63. Esses

dados estão de acordo com nossos resultados, visto que as maiores alterações

51

induzidas por ambos os exercícios quando comparado ao controle, foram a

nível cortical, ou seja, os animais idosos recrutaram área motora primária e

secundária, ao realizar o exercício acrobático, necessitando de planejamento e

execução motora quando envolve esta habilidade complexa. Por outro lado, o

exercício em esteira também induziu mudanças no córtex motor, sendo mais

evidente na camada V com aumento da arborização dendrítica e o

favorecimento da sinaptogênese na execução da tarefa.

Em resumo, os nossos dados demonstraram que ambos tipos de

treinamento físico promoveram um remodelamento dendrítico e axonal,

juntamente com sinaptogênese e eficiência sináptica no córtex motor de ratos

idosos. Entretanto, os nossos dados revelam que o AC induziu mudanças mais

robustas gerando um crescimento da árvore dendrítica e do axônio, juntamente

com a sinaptogênes e eficiência sináptica em todo o córtex motor envolvido

tanto no planejamento como na execução dos atos motores e não numa

camada cortical específica.

6.3. Estriado

No estriado tanto o EE quanto o AC induziram mudanças na expressão

das proteínas estruturais e sinápticas quando comparadas ao controle que

foram evidenciadas pela técnica de imuno-histoquímica, portanto, foram

mudanças restritas a determinadas porções do estriado. Por outro lado, quando

analisamos a expressão dessas proteínas estruturais e sinápticas na estrutura

como um todo não observamos mudanças.

Inúmeros estudos de ressonância magnética funcional demonstraram

que indivíduos idosos ao executarem uma tarefa motora, de coordenação

manual por exemplo, deixam de recrutar regiões dos gânglios da base, e

ativam bem mais as regiões do córtex motor101, 102. Taniwaki e col.101, relatam

que a ativação dos gânglios da base durante a realização de uma atividade

motora desempenha um papel importante no tempo e execução desta

atividade, e que indivíduos idosos mostram uma diminuição desta ativação

quando realizaram tarefas consideradas internamente guiadas. Portanto, a não

identificação de mudanças na expressão das proteínas por nós estudadas no

52

estriado como um todo pode ser decorrente da singela ativação desta estrutura

ao realizarem o exercício acrobático, mesmo sendo uma tarefa internamente

guiada como descrito anteriormente.

O exercício acrobático não induziu mudanças significativas nas

proteínas estudadas quando analisados seus níveis relativos das proteínas, as

alterações puderam ser encontradas apenas na técnica de imuno-histoquímica,

fornecendo uma análise de áreas especificas do estriado. Dados da imuno-

histoquímica revelaram uma redução da expressão de MAP2 na região

dorsomedial e dorsolateral comparado ao controle, sugerindo uma diminuição

da árvore dendritica nas células dessas duas áreas dorsais do estriado. Por

outro lado, nós observamos um aumento na expressão de NFs, tanto na região

dorsomedial quanto na região dorsolateral induzido pelo AC comparado ao

controle.

Já no grupo EE, a única mudança encontrada com a análise de

“immuno-blotting” foi a diminuição na expressão de MAP2, levando a uma

diminuição de densidade da arborização dendrítica sugerindo uma poda

dendrítica. E a análise da densidade óptica relativa mostrou que o EE induziu

um aumento da expressão do NF na região dorsomedial. Considerando que a

proteína NF está presente no citoesqueleto dos axônios neuronais podemos

sugerir que tanto o AC quanto o EE induziu um remodelamento axonal com

aumento do seu calibre e provavelmente na velocidade de condução do

impulso nervoso no estriado que pode estar associado a uma pequena mas

crescente melhora no desempenho motor observado na realização das tarefas

acrobáticas ao final da quarta semana de treinamento observado por nós.

Autores já haviam descrito que o envelhecimento está associado com

alterações no gânglios da base, ocasionados pela redução do seu volume e

diminuição da neurotransmissão dopaminérgica103, 104, com consequente

redução de ativação desta área possivelmente desencadeando déficits motores

descritos no processo do envelhecimento normal2, 101. Segundo Marchand e

col.105, mecanismos de compensação podem ser uma resposta para poupar o

recrutamento dos gânglios da base durante uma realização da tarefa motora,

porém esse autores concluíram que quando os indivíduos idosos continuam a

recrutar os glânglios da base ao realizarem uma tarefa motora, ou seja,

53

apresentam os núcleos subcorticais (caudado e putamen) fortemente ligados

ao córtex motor primário (M1) e somatossensorial primário (S1), isto vem

associado a um maior número de erros desses idosos, não sendo considerado

portanto um mecanismo de compensação e segundo os autores está ligado

diretamente com a perda de função motora desses idosos105.

A expressão das proteínas sinápticas no estriado dos grupos AC e EE,

revelado pela técnica de imuno-histoquímica mostraram o mesmo perfil

proteico tanto na região dorsomedial como na dorsolateral. O exercício

acrobático e o exercício em esteira induziram um aumento de SYP e redução

de SYP em ambas áreas dorsais do estriado.

O aumento de SYP resultante dos treinamentos acrobáticos e em esteira

revelam um aumento da formação e recaptação de vesículas sinápticas

sugerindo sinaptogênese. Além disso, esse aumento de SYP pode ser

resultante do aumento da liberação de glutamato que mostra-se relacionado à

fosforilação da SYP, sugerindo a indução do mecanismo de potenciação de

longo prazo (LTP). E por fim, os nossos dados de AC e EE estão de acordo

com estudos que expuseram ratos idosos ao ambiente enriquecido e viram que

foi capaz de induzir formação de sinapses nos gânglios da base106.

Autores tem descrito que durante o envelhecimento ocorre uma

diminuição da neurotransmissão dopaminérgica no estriado, decorrente da

perda neuronal observada na substância negra parte compacta107, juntamente

com uma redução de receptores do tipo D1 e D2 proporcionado um aumento

da oscilação postural antero-posterior em indivíduos idosos108, 109. Já os nossos

dados revelaram que ambos os exercício foram capazes de aumentar os níveis

de SYP, sabidamente conhecida como proteína responsável pela formação e

recuperação das vesículas que liberam os neurotransmissores, nós podemos

sugerir que os diferentes tipos de exercício poderiam ser úteis para atenuar tais

déficits induzidos pelo envelhecimento. Por outro lado, ainda nos falta pouco

mais de conhecimento, assim como a realização de novas pesquisas para

elucidar os motivos de ambos os exercícios terem induzidos uma diminuição da

proteína SYS.

Quando tratamos de aprendizado motor ou aprendizagem de novas

habilidades, vários autores relacionam as diferentes fases envolvidas nesse

54

aprendizado com áreas distintas do estriado110, chamadas de fase inicial ou de

aquisição, e fase tardia, também chamada de fase de consolidação. Em

animais jovens, estudos tem mostrado que a região dorsomedial do estriado

está preferencialmente envolvida com a fase inicial (aquisição) do aprendizado

e a região dorsolateral participa da fase tardia (consolidação) do

aprendizado110. Foi o que mostrou o estudo de Garcia e col.42, ao utilizar o

exercício em esteira e exercício acrobático em animais adultos jovens, e

concluí que os animais que realizaram o AC, atividade que requer aquisição de

habilidades motoras mais complexas, induziram mudanças de proteínas

sinápticas e estruturais, claramente na região dorsomedial. Enquanto que o EE,

que é considerada uma atividade automatizada/rítmica, induziram alterações

na região dorsolateral42.

Os nossos dados de ratos idosos mostram uma perda desta

especificidade regional relacionada as diferentes exigências motoras e a fase

de aprendizagem dessa habilidade motora encontrada em animais jovens, ou

seja, não houve distinção entre estas regiões do estriado, já que ambos os

exercícios produziram alterações das proteínas de maneira concomitante nas

regiões dorsomedial e dorsolateral sugerindo que as mudanças plásticas na

fase de aquisição de habilidades motoras complexas em animais idosos parece

se prolongar adentrando na fase de consolidação, recrutando as duas regiões

do estriado simultaneamente tanto para exercícios rítmicos e automatizados

como para os exercícios envolvendo tarefas motoras complexas. Nossos dados

corroboram com o estudo de Robertson e colaboradores111 que observaram

que indivíduos idosos podem facilmente aprender tarefas como os jovens o

fazem na fase inicial do aprendizado, podendo haver ganhos adicionais nesta

habilidade durante a fase de consolidação.

E mais, esse aumento do recrutamento de áreas adjacentes induzido

pelo AC e EE sugere o envolvimento do mecanismo neural de compensação e

não de de-diferenciação, já que o desempenho motor apresentou uma melhora

ao longo de 4 semanas de treinamento.

55

6.4. Cerebelo

Ambos os exercícios foram capazes de induzir mudanças proteicas

nesta estrutura quando comparados ao controle, porém estas mudanças

sugerem um remodelamento plástico pouco satisfatório.

Os exercícios acrobático e em esteira promoveram uma diminuição do

NF200 e NF68 no cerebelo como um todo quando analisamos com a técnica

de “immunoblotting”, corroborando com os dados de imuno-histoquímica, que

demonstraram uma diminuição de NFs tanto na camada granular como na

camada molecular do córtex cerebelar do lóbulo paramediano, sugerindo uma

diminuição do calibre axonal com prejuízos na velocidade de condução por

esses axônios.

Em contrapartida, esses mesmos tipos de exercícios foram capazes de

gerar um aumento da proteína MAP2 na camada molecular, sugerindo um

aumento da arborização dendrítica das células de Purkinje, células em cesto e

estreladas, com consequente aumento do contato sináptico com as fibras

trepadeiras e paralelas. Estes achados corroboram com o estudo feito por

Heuninckx e colaboradores, que através de neuroimagem funcional puderam

ver que indivíduos idosos ao realizarem movimentos coordenados de mão/pé,

recrutam regiões anterior e posterior do cerebelo, bilateralmente65. Esse

aumento de área sináptica decorrente de uma maior expressão de MAP2 pode

ser um dos substratos estruturais responsáveis por essa maior ativação.

O AC revelou através da técnica de “immunoblotting” um aumento nos

níveis da expressão de SYS em relação ao controle. Já os dados de imuno-

histoquímica revelaram uma diminuição de SYS tanto na camada granular

quanto na molecular e de SYP na camada molecular do córtex cerebelar do

lóbulo paramediano. Portanto, esses nossos dados sugerem que os exercícios

acrobáticos e em esteira promoveram um aumento da arborização dendrítica

na camada molecular do córtex cerebelar mas com prejuízo na eficiência

sináptica, e talvez essa fragilidade de respostas plásticas cerebelares dificultam

mas não impedem o aprendizado de novas habilidades motoras, mas com um

desempenho motor aquém do observado nos animais jovens.

É sabido que o cerebelo está envolvido na execução de habilidades

motoras, que se encontram prejudicados no envelhecimento112. Olhando o

56

cerebelo anatomicamente, as maiores mudanças decorrentes do processo de

senescência incluem uma perda no lobo anterior, região envolvida no controle

motor, de aproximadamente 30% do seu volume associada a perda de 40%

nas células de Purkinje e células granulares12. Considerando essas

informações Taniwaki e colaboradores98 sugerem que o circuito cérebro-

cerebelar se encontram comprometidos em indivíduos idosos ao realizarem

uma tarefa externamente guiada, corroborando com nossos dados que indicam

uma reorganização plástica insuficiente comprometendo o recrutamento desta

região após 4 semanas de treinamento, em ambas as atividades envolvidas.

Vale ressaltar que em ratos idosos exercitados em esteira ao longo da

vida, como demonstrado pelo estudo de Larsen e colaboradores109, revelaram

uma reduzida perda de células de Purkinje e ainda que esses ratos ao final de

um longo período de treinamento, tinham o mesmo número de células de

Purkinje de ratos jovens que não realizaram treinamento113. Esses dados

diferem dos nossos, visto que os nossos ratos quando iniciaram o treinamento

já apresentavam perda neuronal no cerebelo. E mais, que o treinamento

proposto pelos autores acima citado foram realizados a partir do 5º ao 23º mês

de vida do animal, o que revela mais uma vez que o sistema nervoso de ratos

idosos apresentaram respostas plásticas distintas das dos jovens.

Autores já haviam descrito que indivíduos jovens ao realizarem tarefas

consideradas como externamente guiadas envolvem predominantemente o

circuito cérebro-cerebelar77, 94. Foi o que mostrou o estudo de Garcia e

colaboradores ao utilizar ratos jovens para realizar um exercício em esteira

considerado uma tarefa externamente guiada. Os dados desse estudo mostrou

que esta atividade induziu grande ativação do cerebelo, mostrada através do

aumento de sinaptogênese, assim como, de proteínas estruturais. Tudo isso

nos faz pensar que ratos idosos, ao realizarem este tipo de atividade, mostram

um padrão de ativação diferente daqueles encontrados em ratos adultos

jovens, visto que demonstraram uma reorganização plástica distinta decorrente

de um menor recrutamento do cerebelo, porém com uma ativação bem maior

de outras áreas promovendo mecanismo de compensação como vimos no

córtex motor.

57

Entretanto, se considerarmos somente as respostas cerebelares frente

as exigências motoras rítmicas e as motoras complexas reveladas por um

aumento da área de arborização dendrítica para estabelecimento de novas

sinapses mas sem a respectiva eficiência sináptica, leva-nos a pensar na

ocorrência de um mecanismo de di-diferenciação no cerebelo frente a um

treinamento por quatro semanas.

58

7. CONCLUSÕES

- As duas modalidades de atividade física empregadas no estudo foram

capazes de gerar mudanças plásticas distintas no córtex motor, estriado e

cerebelo.

- Independente do tipo de treinamento, acrobático ou em esteira, as

maiores mudanças plásticas ocorreram no córtex motor, decorrente de

aumento das proteínas estruturais MAP2 e NF, e da proteína sináptica SYS. O

estriado respondeu aos diferentes treinamentos com aumento de NF e SYP e

redução da expressão de MAP2 e SYS. Já o cerebelo respondeu somente com

aumento de MAP2 e diminuição de NF, SYS e SYP.

Em resumo, estes dados parecem sugerir que o córtex motor de ratos

idosos apresenta respostas plásticas distintas das outras estruturas estudadas,

independente da atividade motora, sugerindo maior participação do córtex no

controle motor.

59

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ANEXO I

dissertação - juliana mota de borborema

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