Universidade Nova de Lisboa

Faculdade de Ciências e Tecnologia

Departamento de Informática

Determinação da Estrutura de Proteínas através de Programação por Restrições

Por: Ludwig Krippahl

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Inteligência Artificial Aplicada. Orientador Científico: Professor Doutor Pedro Barahona

Lisboa, 1999

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3

à Lena, pelas restrições que lhe impus durante este trabalho.

4

5

Agradecimentos

Agradeço antes de mais a ajuda do meu professor e orientador Pedro Barahona, e a sua paciência em

ensinar informática a um químico. Ao Brian Goodfellow e à Anjos Macedo agradeço a ajuda com os

dados e a técnica de RMN, e ao Nuno Palma o seu apoio e as indicações que me permitiram traduzir

para Português alguns termos que normalmente uso em Inglês. Pelas traduções eventualmente menos

felizes, assumo plena responsabilidade.

Este trabalho foi financiado em parte pela bolsa BM / 17904 / 98 do programa PRAXIS da Fundação

para a Ciência e Tecnologia

A figura 1.12 foi cedida por Brian Goodfellow.

A figura 1.8 foi criada com o programa RasMol, por R.Sayle

As imagens na figura 2.6 são propriedade de Land of Marbles, e foram usadas com autorização dos

proprietários.

As figuras 1.2, 1.3, 1.5, 1.6, 1.7, 1.9, 1.10, 2.1, 3.1, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18, 3.19 e 3.20 foram criadas

com o programa CyberMol por Ludwig Krippahl e Nuno Palma.

6

7

Sumário

Nesta dissertação proponho uma abordagem baseada em técnicas de programação por restrições para

determinar estruturas de proteínas a partir de restrições de distância obtidas por Ressonância Magnéti-

ca Nuclear (RMN). O primeiro capítulo é uma breve introdução à estrutura de proteínas. No segundo

capítulo descrevo o método proposto, que consiste essencialmente numa redução do espaço de possibi-

lidades por técnicas de processamento de restrições, seguido por uma minimização. No terceiro capítu-

lo mostro os resultados obtidos e um teste de comparação do desempenho do método com DYANA

("Dynamics algorithm for NMR applications” [17]), uma aplicação comercial baseada em técnicas de

minimização. Neste teste o tempo de cálculo para o DYANA foi de mais de seis horas, enquanto

método aqui proposto obteve resultados semelhantes em 8 minutos. Neste trabalho concluo que a apli-

cação de técnicas de Programação por Restrições podem reduzir significativamente o tempo de cálculo

para estes problemas

8

9

Abstract

In this dissertation I propose a constraint-based approach to determining protein structures compatible

with distance constraints obtained from Nuclear Magnetic Resonance (NMR) data. In the first chapter

I give a brief introduction to protein structure. The second chapter describes the method proposed,

which consists essentially of a constraint based reduction of the possibilities, followed by a local

search with an optimisation algorithm. In the third chapter, I show the results obtained, and compare

the performance of the algorithm with DYANA ("Dynamics algorithm for NMR applications” [17]) an

existing commercial application based on simulated annealing. In this test case, computation time for

DYANA was more than six hours, whereas the method proposed here produced similar results in 8

minutes. I conclude that the application of Constraint Programming techniques can greatly reduce

computation time in solving these distance constraint systems.

10

11

Índice Introdução ...............................................................................................................................13 1. Estrutura de Proteínas ....................................................................................................15

1.1 Ligação Covalente........................................................................................................................15 1.2 Estrutura Primária ........................................................................................................................16 1.3 Estrutura Secundária. ...................................................................................................................20 1.4 Estrutura Terciária........................................................................................................................22 1.5 Estrutura Quaternária ...................................................................................................................23 1.6 Outros Elementos Estruturais.......................................................................................................24 1.7 Quiralidade...................................................................................................................................25 1.8 Ressonância Magnética Nuclear ..................................................................................................25

2. Método .................................................................................................................................30 2.1 Modelação do Problema...............................................................................................................30 2.2 Técnicas de Consistência .............................................................................................................32 2.3 Adaptação do Modelo ..................................................................................................................40 2.4 Enumeração..................................................................................................................................46 2.5 Retrocesso ....................................................................................................................................48 2.6 Minimização.................................................................................................................................49 2.7 Verificação da Quiralidade...........................................................................................................49 2.8 Discussão do Método ...................................................................................................................50

3. Resultados ...........................................................................................................................52 3.1 Estrutura de Teste.........................................................................................................................52 3.2 Representação dos Domínios .......................................................................................................54 3.3 Heurística de Enumeração............................................................................................................55 3.4 Sobreposição de Átomos..............................................................................................................59 3.5 Dependência das Restrições.........................................................................................................61 3.6 Dimensão Final dos Domínios .....................................................................................................64 3.6 Desempenho.................................................................................................................................66 3.7 Comparação com DYANA ..........................................................................................................67 3.7 Outras Estruturas Testadas...........................................................................................................70

4. Conclusão ............................................................................................................................76 Glossário ..................................................................................................................................78 Bibliografia..............................................................................................................................80 Apêndice A: Quadros .............................................................................................................84

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13

Introdução

“A programação por restrições representa uma das melhores aproximações que a informática já fez ao Cálice Sagrado da programação: o utilizador expõe o problema, o computador resolve-o”

Eugene C. Freuder, CONSTRAINTS, Abril 1997

A Programação por Restrições (Constraint Programming) é um dos campos mais promissores na

informática moderna. A combinação de uma filosofia declarativa, eficiência e uma vasta aplicabilida-

de tornam estas técnicas uma ferramenta poderosa para a resolução de inúmeros problemas.

Com origem nos anos sessenta (6), as técnicas de Programação por Restrições evoluíram de soluções

para problemas específicos para um paradigma geral sobre a forma de resolver uma grande classe de

problemas. Determinantes para a concepção moderna de Programação por Restrições foram os traba-

lhos de Gallaire, Jaffar e Lassez (13, 22 em 6) em meados dos anos oitenta, que salientaram os muitos

elementos comuns entre a Programação em Lógica e a Programação por Restrições. Desde então a

formalização dos problemas de uma forma declarativa tem sido uma das ideias chave da Programação

por Restrições.

Esta noção não impede, no entanto, que as restrições sejam resolvidas de uma forma imperativa. O

recurso a linguagens imperativas, mesmo que apenas a baixo nível, é evidentemente inevitável. O im-

portante neste conceito é que o utilizador possa expor o problema de forma declarativa. No trabalho

aqui descrito, como veremos adiante, foi precisamente esta a abordagem: a resolução das restrições foi

escrita numa linguagem imperativa (Object Pascal) mas a definição do problema a resolver consiste

apenas numa lista que declara as restrições a respeitar.

Outra noção fundamental na Programação por Restrições é a consistência entre valores de variáveis.

Uma restrição pode ser vista como um conjunto de combinações admissíveis para os valores das vari-

áveis envolvidas. Os valores possíveis para cada variável dependem assim dos valores que outras

variáveis tomem. Garantindo a consistência entre os valores de grupos de variáveis consegue-se redu-

zir muito o espaço de pesquisa a percorrer para encontrar soluções admissíveis.

Nesta dissertação irei descrever o estudo de aplicabilidade destas técnicas à determinação de estruturas

de proteínas por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). A motivação base para a procura de uma

forma mais eficiente de determinar a estrutura de proteínas não é apenas a curiosidade científica (ex-

cepto na opinião muito pessoal do autor). O campo da bioquímica estrutural tem muitas aplicações

práticas, em que qualquer melhoria no desempenho pode trazer muitas vantagens concretas e imedia-

tas.

14

A industria farmacêutica moderna está cada vez mais dependente do conhecimento detalhado da

estrutura das macro-moléculas que formam os sistemas biológicos, entre as quais as proteínas se desta-

cam pela sua importância. Em muitos campos da indústria proteínas desempenham papeis de grande

importância, desde os “glutões” do detergente, às enzimas que dão às “jeans” o “azul que a gente gos-

ta” ou que catalisam a transformação de glicose em frutose na industria alimentar. Os recentes

desenvolvimentos na bioquímica e biologia molecular criaram uma nova indústria com um grande

crescimento económico, em que o conhecimento tem o potencial de se converter rapidamente em

dinheiro. Em muitos casos a determinação estrutural de proteínas é o factor limitante na elucidação destes sis-

temas, pois é um processo demorado e muito exigente.

A tese que aqui defendo, suportada pelos resultados obtidos ao longo do trabalho, é que a aplicação de

técnicas de Programação por Restrições resulta num aumento significativo na eficiência, em relação

aos métodos até agora usados. Os métodos presentemente disponíveis assentam principalmente em

algoritmos de minimização. Um exemplo é a aplicação DYANA (17), neste momento a mais usada

para a resolução destes problemas na Faculdade de Ciências e Tecnologia. O algoritmo base desta

aplicação é o método de minimização simuilated annealing, partindo de uma estrutura gerada aleato-

riamente. Desta forma são reduzidas progressivamente as violações às restrições impostas. As

desvantagens deste algoritmo são o enorme espaço de pesquisa que percorre e a propensão para ficar

preso em mínimos locais. Esta última torna necessário o cálculo de um número considerável de

estruturas (tipicamente 500) pois apenas uma pequena fracção destas é aceitável.

Nesta dissertação começarei por introduzir, no primeiro capítulo, as noções básicas de estrutura de

proteínas que são relevantes a este trabalho. No segundo capítulo o problema será formalizado como

um problema de processamento de restrições, e serão expostos os algoritmos usados para o resolver.

Os resultados obtidos e a parametrização do programa serão apresentados no terceiro capítulo. No

quarto e último capítulo serão discutidas as vantagens e limitações do presente método, bem como al-

guns desenvolvimentos já planeados para o futuro.

15

1. Estrutura de Proteínas

Staudinger salientou que “as macro-moléculas possuem propriedades que não podem ser previstas a partir das propriedades das suas unidades constituintes”... Aparentemente o único obstáculo para compreender a natureza da vida é a sua fantástica complexidade. A Informática dá nos a esperança que um dia possamos vencer também esta dificuldade

H.A. Krebs, Persp. Biol. Med., 1971

Desde muito cedo na história da química que as proteínas têm atraído a atenção dos investigadores (3).

Em algumas substancias orgânicas observaram a intrigante propriedade de solidificar com o calor,

algo contrário à maioria, que normalmente derrete quando aquecida. Em 1777 Pierre Maquer chamou-

lhes substâncias albuminosas, de albumen, o nome em latim para a clara do ovo, que partilha esta pro-

priedade com outras então conhecidas (caseína do leite, globulina do sangue, etc...).

Em 1839 o químico holandês Gerardus Mulder determinou a fórmula química C40H62O12N10 como

sendo comum a todas as substâncias albuminosas. Ele propôs que todas estas substâncias se formavam

a partir de moléculas com esta composição, e chamou a este grupo proteína.

A palavra proteína deriva da palavra grega protos, significando “primeiro” ou “mais importante”.

Apesar de mais tarde se descobrir que a hipótese de Mulder não era correcta, o nome persistiu e é de

certa forma apropriado, pois apesar de constituírem apenas cerca de 20% da massa orgânica nos seres

vivos (15), são a mais versátil classe de compostos orgânicos. Os papéis que desempenham nos siste-

mas biológicos são muito diversos; catálise de reacções, transporte, suporte e movimento, resposta

imunitária, entre outros (33).

Neste capítulo irei descrever os elementos estruturais das proteínas, e a forma como a Ressonância

Magnética Nuclear nos permite elucidar estas estruturas. As técnicas de análise estrutural por Resso-

nância Magnética Nuclear podem ser aplicadas ao estudo de uma vasta gama de compostos orgânicos,

mas irei focar apenas o caso das proteínas, por ser o relevante para este trabalho.

1.1 Ligação Covalente

Uma molécula é um conjunto de átomos unidos por ligações covalentes. A ligação covalente é forma-

da, numa descrição muito simplificada, quando dois átomos partilham electrões. Os electrões deixam

de ocupar orbitais atómicas (centradas no núcleo de um único átomo) para ocupar orbitais moleculares

(dispersas por vários átomos), ligando assim os átomos envolvidos. Estas orbitais moleculares têm

mínimos de energia em geometrias bem definidas, tendendo a forçar os átomos da molécula a formar

estruturas semi-rígidas. No entanto as ligações podem sofrer algumas distorções, sendo estas:

16

• Compressão e Extensão quando varia o comprimento da ligação química.

• Flexão quando varia o ângulo formado por duas ligações com um átomo em comum.

• Torção quando varia o ângulo entre uma ligação e o plano definido pelas duas ligações consecuti-

vas (ângulo diedro)

A Figura 1.1 ilustra estas variações na geometria duma molécula.

Figura 1.1

Possíveis distorções à geometria de ligações covalentes.

As ligações covalentes são resistentes a distorções de Compressão, Extensão e Flexão, e por isso a

amplitude destas é, em geral, pequena. Muitas ligações têm uma liberdade significativa de Torção. As

ligações Carbono-Carbono e Carbono-Azoto em cada aminoácido (ver 1.2 Estrutura Primária adiante)

são um exemplo de ligações com grande liberdade de Torção, o que permite uma enorme diversidade

nas estruturas de proteínas.

1.2 Estrutura Primária

Cada proteína é formada por uma ou mais cadeias de aminoácidos, que são pequenas moléculas orgâ-

nicas contendo um grupo ácido (ácido carboxilico: COOH) e um grupo amina (NH2). Estes dois gru-

pos estão ligados a um átomo de carbono que é designado como Cα (Carbono alfa). Esta região for-

mada pelo grupo amina, o grupo carboxilico e Carbono alfa é comum a todos os aminoácidos que par-

ticipam na formação de proteínas. Aminoácidos diferentes distingem-se pelo grupo de átomos ligado

ao Cα. Este grupo, formando a restante estrutura do aminoácido é designado por cadeia lateral.

Em solução aquosa, em condições fisiológicas, os grupos amina e ácido carboxilico encontram-se

normalmente na forma ionizada. O grupo ácido carboxilico (COOH) tende a ceder um ião H+ para a

água. Assim em solução este grupo encontra-se tipicamente na forma de carboxilato (COO-). O grupo

amina tende a ligar-se a um ião H+ em solução, e por isso em solução estará tipicamente na forma

Compressão/Extensão

Flexão

Torção

17

NH3+. A associação/dissociação de iões H+ está dependente da concentração destes em solução, ou

seja, do pH da solução1, mas esta descrição é correcta na maioria dos casos em condições fisiológicas.

A Figura 1.2 mostra a estrutura de três aminoácidos (Glicina, Leucina e Tirosina) nestas condições,

salientando os grupos amina e ácido carboxilico aqui referidos. Como se pode ver nesta figura, uma

parte da estrutura é comum a todos os aminoácidos, e apenas as cadeias laterais distinguem os ami-

noácidos.

Figura 1.2

Estrutura de três aminoácidos em solução. Os grupos ácido carboxilico e amina estão marcados em cada aminoá-cido, bem como o Carbono alfa. Estes formam a estrutura comum a todos os aminoácidos e compõem a cadeia principal da proteína. Na região inferior estão representadas as cadeias laterais que distinguem os diferentes aminoácidos.

Em sistemas biológicos já foram encontrados mais de 300 aminoácidos, mas regra geral as proteínas

contém apenas 20 aminoácidos diferentes (15). Por isso iremos apenas considerar estes 20 aminoáci-

dos mais comuns. No entanto todos os algoritmos aqui descritos (ver 2. Método, página 30) podem ser

aplicados a proteínas com aminoácidos menos comuns ou mesmo outras moléculas (ver 1.6 Outros

Elementos Estruturais, página 24).

A Tabela 1.1 mostra os nomes destes aminoácidos, bem como as abreviaturas e os símbolos normal-

mente usados para os identificar. Neste documento serão utilizadas as abreviaturas de três letras para

referir os aminoácidos específicos.

A importância dos aminoácidos nos sistemas biológicos vem da capacidade que os grupos amina e

ácido carboxilico têm de formar uma ligação entre o Carbono do grupo carboxilico e o Azoto do grupo

amina.. Esta ligação é chamada ligação peptídica.

1 O valor de pH é o simétrico do logaritmo da concentração de iões H+.

C

N

O

H

CCαα CCαα CCαα AAmmiinnaa AAmmiinnaa

AAmmiinnaa CCaarrbbooxxiilloo CCaarrbbooxxiilloo CCaarrbbooxxiilloo

Cadeias Laterais

Glicina Leucina Tirosina

18

Nome Abreviatura Símbolo

Ácido Aspártico Asp D

Ácido Glutâmico Glu E

Alanina Ala A

Arginina Arg R

Aspargina Asn N

Cisteína Cys C

Fenilalanina Phe F

Glicina Gly G

Glutamina Gln Q

Histidina His H

Isoleucina Ile I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M

Prolina Pro P

Serina Ser S

Tirosina Tyr Y

Treonina Thr T

Triptofano Trp W

Valina Val V

Tabela 1.1

Nomes, abreviaturas e símbolos para os 20 aminoácidos mais comuns (15,33).

O nome deriva de peptós, palavra grega para digestão, pois esta é a ligação quebrada na digestão de

proteínas. A Figura 1.3 ilustra a formação duma ligação peptídica entre uma Cisteina e uma Histidina.

Em condições fisiológicas a reacção é mais complexa do que a Figura 1.3 indica, não só pelo estado

ionizado dos grupos que reagem (ver acima) mas também porque estas reacções são catalisadas por

outras proteínas.

A Figura 1.3 mostra também (ilustração inferior) os dois aminoácidos ligados pela ligação peptídica.

Pode-se notar aqui uma sequência contínua formada pelos átomos Carbono do grupo ácido carboxili-

co, Carbono alfa e Azoto do grupo amina de cada aminoácido. Este padrão ...-C-Cα-N-C-Cα-N-...

repete-se por toda a cadeia de aminoácidos, e é designado como cadeia principal da proteína (backbo-

ne). Estes átomos estão marcados na Figura 1.3 (ilustração inferior). Esta propriedade permite a

agregação de aminoácidos em longas cadeias, contendo centenas ou milhares de átomos.

19

Figura 1.3

Formação da ligação peptídica entre Cisteína e Histidina. No topo está esquematizada a reacção de ligação entre os dois aminoácidos. A figura abaixo representa a estrutura molecular formada pelos dois aminoácidos ligados pela ligação peptídica.

A estrutura primária é a sequência de aminoácidos nas cadeias que formam a proteína. Na estrutura

primária incluí-se tipicamente também a informação sobre pontes de dissulfureto, mas estes elementos

estruturais serão focados mais adiante (ver 1.6 Outros Elementos Estruturais, página 24).

A assimetria da ligação peptídica e dos aminoácidos faz com que um dos extremos da cadeia contenha

sempre um grupo amina, e o outro um grupo ácido carboxilico. Por convenção, o aminoácido no ex-

tremo com o grupo amina livre é considerado o primeiro aminoácido. Esta convenção reflecte a ordem

pela qual os aminoácidos são adicionados na síntese das cadeias em sistemas biológicos.

A informação sobre a sequência primária das proteínas está contida no ADN (Ácido Desoxirribonu-

cleico), que constitui o material genético dos seres vivos2.

A síntese de proteínas nas células processa-se em duas fases. Em primeiro lugar a sequência da zona

do ADN que codifica a proteína é replicada em ARN (Ácido Ribonucleico), num processo chamado

transcrição. Na segunda fase, a tradução, as cadeias de aminoácidos que formam a proteína são sinteti-

zadas a partir do ARN. O ADN contém apenas 4 bases diferentes: Adenina, Guanina, Citosina, e

Timina. O ARN contém também Adenina, Guanina, e Citosina., mas contém Uracilo em vez de Timi-

2 O genoma de alguns vírus é composto por Ácido Ribonucleico (ARN)

CCaarrbbooxxiilloo

Água

AAmmiinnaa

Histidina Cisteina

Ligação Peptídica

CCαα CCαα CC CC

NN NN

C

N

O

H

S

20

Timina.. Como as proteínas contém 20 aminoácidos diferentes, cada aminoácido é codificado por

uma sequência de três bases, como se mostra na Tabela 1.2 (24).

Hoje em dia existem assim duas abordagens possíveis para determinar a estrutura primária de uma

proteína:

• A degradação química controlada das cadeias de aminoácidos permite a determinação directa da

sequência (degradação de Edman, 33).

• A sequenciação do ADN/ARN que codifica a proteína permite determinar indirectamente a se-

quência desta.

A combinação destes dois métodos permitiu a determinação das estrutura primárias de muitas proteí-

nas. Presentemente o número de estruturas primárias conhecidas aproxima-se de 100.000.

1.3 Estrutura Secundária.

O termo estrutura secundária refere-se ao conjunto de estruturas locais, estáveis, e que são elementos

comuns à maioria das proteínas (33). Por estas razões, é possível prever , com alguma confiança, estes

elementos estruturais, pelo que serão potencialmente uma importante fonte de informação acerca da

estrutura da proteína.

Primeira Base Segunda Base U C A G UUU Phe UCU Ala UAU Tyr UGU Cys UUC Phe UCC Ala UAC Tyr UGC Cys UUA Leu UCA Ala UAA Fim UAG Fim UUG Leu UCG Ala UGA Fim UGG Trp CUU Leu CCU Thr CAU His CGU Arg CUC Leu CCC Thr CAC His CGC Arg CUA Leu CCA Thr CAA Gln CAG Arg CUG Leu CCG Thr CGA Gln CGG Arg AUU Ile ACU Pro AAU Asn AGU Ser AUC Ile ACC Pro AAC Asn AGC Ser AUA Ile ACA Pro AAA Lys AAG Arg AUG Met ACG Pro AGA Lys AGG Arg GUU Val GCU Ser GAU Asp GGU Gly GUC Val GCC Ser GAC Asp GGC Gly GUA Val GCA Ser GAA Glu GAG Gly GUG Val GCG Ser GGA Glu GGG Gly

U

C

A

G

Tabela 1.2

Correspondência entre as sequências dos tripletos no ARN e os aminoácidos que estes codificam.

21

Apesar de a ligação peptídica ser uma ligação rígida, as ligações adjacentes Carbono-Carbono e

Carbono-Azoto (ver Figura 1.3) tem grande

liberdade de Torção (ver 1.1 Ligação

Covalente), permitindo à cadeia peptídica uma

grande variabilidade estrutural.

Essencialmente existem três elementos da es-

trutura secundária: hélice-α, folha-β e dobra-β.

Estas estruturas são estabilizadas pela

formação de pontes de hidrogénio (ver 1.6 Outros

Elementos Estruturais, página 24) entre átomos

pertencentes à cadeia principal da proteína. São estruturas

estáveis e que podem ser previstas com alguma confiança

a partir da estrutura primária.

A hélice-α é uma espiral formada por pontes de

hidrogénio entre os átomos de Hidrogénio covalentemente

ligados aos átomos de Azoto, os átomos de Oxigénio

(grupo carbonilo) do aminoácido situado a quatro posições

à frente na sequência primária. A Figura 1.4 mostra

esquematicamente estas ligações. A Figura 1.5 mostra a

estrutura tridimensional da hélice-α. Nesta figura apenas

os átomos que participam na formação das pontes

Hidrogénio estão representados.

...Ala-Leu-Ala-Met-Glu-Glu-Leu-His-Lys...

Figura 1.4

Na hélice-α as pontes de Hidrogénio ligam cada aminoácido ao aminoácido quatro posições à frente na sequência da cadeia.

Figura 1.5

Hélice-α. Os átomos de Carbono e as cadeias laterais não estão representados para melhor claridade.

N

O

H

Ponte de Hidrogénio

C N O H Cadeia Lateral Amina Ácido

Carboxilico

Ácido Carboxilico Amina

Figura 1.6

Folha-β. Nesta figura as cadeias laterais são representadas apenas por um átomo. Os terminais Amina e Ácido Carboxilico estão identificados, ilustrando a orientação anti-paralela das cadeias.

22

A folha-β é formada por dois ou mais segmentos de cadeia

numa orientação paralela ou anti-paralela. Isto significa que

as cadeias estão paralelas, mas podem orientar-se no mesmo

sentido ou em sentidos opostos, ficando o extremo do grupo

amina de uma cadeia no sentido do grupo ácido carboxilico

da outra.

A Figura 1.6 mostra a estrutura de uma folha-β anti-paralela

formada por duas cadeias. Neste caso as pontes de

Hidrogénio são formadas entre aminoácidos que podem estar

distantes na sequência, ou mesmo pertencerem a diferentes

cadeias.

O terceiro elemento da estrutura secundária é a dobra-β. Esta

estrutura forma uma curva apertada na cadeia da proteína, estabilizada pela presença de uma ponte de

Hidrogénio entre o Oxigénio do grupo Carbonilo de um aminoácido (este é o resultante do grupo ácido

carboxilico após a formação da ligação peptídica, como ilustrado na Figura 1.3, página 19) com um

átomo de Hidrogénio ligado ao Azoto do aminoácido três posições adiante na sequência. A Figura 1.7

ilustra este elemento da estrutura secundária.

Os elementos de estrutura secundária, pela sua estabilidade, conferem grande estabilidade estrutural às

proteínas. De certa forma pode-se dizer que sustentam a estrutura tridimensional da proteína. No en-

tanto, as proteínas contêm também regiões que não participam na formação destas estruturas, e por

isso são potencialmente mais flexíveis. Este misto de rigidez e flexibilidade permite que as proteínas

possam ter uma vasta gama de formas, e mesmo mudar significativamente de forma por interacção

com outras moléculas. No entanto, as possibilidades quase ilimitadas de combinação destas estruturas

tornam a previsão da forma tridimensional uma tarefa muito complexa e de momento pouco fiável.

1.4 Estrutura Terciária

O termo Estrutura Terciária refere-se, formalmente, à relação espacial entre aminoácidos distantes na

sequência (33). Na prática, a fronteira entre estrutura secundária e terciária não é muito nítida (por

exemplo, uma folha-β contém relações espaciais entre aminoácidos distantes na sequência), mas po-

demos conceber a estrutura terciária como a forma tridimensional que uma cadeia de aminoácidos

toma, incluindo normalmente vários elementos de estrutura secundária.

A Figura 1.8 ilustra a estrutura terciária da quimotripsina (27). Esta representação salienta os diferen-

tes elementos de estrutura secundária presentes na proteína. As setas amarelas representam as folhas-β,

indicando o sentido de cada segmento de cadeia. A vermelho estão representadas as hélices-α, com a

Figura 1.7

Dobra-β. A ponte de Hidrogénio que liga um aminoácido ao aminoácido três posições adiante na sequência estabiliza esta estrutura.

C

N

O

H

23

α, com a sua característica forma em espiral. As dobras-β estão representadas a azul, sendo os

segmentos a branco regiões sem estrutura secundária definida. A estrutura terciária é assim

determinada pela relação espacial entre todos estes elementos. O objectivo deste trabalho é a

determinação desta relação espacial entre átomos a partir de restrições às distâncias entre estes. Estas

restrições podem ser determinadas experimentalmente, como veremos adiante.

1.5 Estrutura Quaternária

Em muitos casos uma proteína é composta por mais que uma cadeia de aminoácidos. Nestas proteínas

Figura 1.8

Representação estereoscópica da estrutura ternária da Quimotripsina. Os elementos da estrutura se-cundária estão representados com diferentes cores: Vermelho para hélices-α, amarelo para folhas-β e azul para as dobras-β.

Figura 1.9

Estrutura quaternária de duas proteínas. À direita a protease do vírus da imunodeficiência humana, à esquerda a hemoglobina humana. As diferentes cadeias de aminoácidos estão representadas em cores diferentes.

24

a relação espacial entre as várias cadeias é chamada estrutura quaternária. Na prática, as dificuldades à

determinação da estrutura quaternária são muito semelhantes ao caso da estrutura terciária, e no

âmbito deste trabalho não foi feita uma distinção explícita entre os dois casos. A Figura 1.9 mostra a

estrutura quaternária de duas proteínas: a protease do vírus da immunodeficiência humana (34) e a

hemoglobina humana(12).

1.6 Outros Elementos Estruturais

Nas secções anteriores mencionei alguns elementos que contribuem para a formação ou estabilização

das várias estruturas nas proteínas. Nesta secção irei detalhar um pouco mais três destes elementos

(33).

Pontes de Hidrogénio: As pontes de Hidrogénio formam-se entre dois átomos que partilham entre si

um átomo de Hidrogénio. Um exemplo é o dos grupos NH e CO na dobra-β. Neste caso o átomo de

Hidrogénio está fracamente ligado ao Azoto, podendo ser partilhado com o átomo de Oxigénio. Esta

partilha de ligações com o Hidrogénio força os átomos de Azoto e Oxigénio a aproximarem-se, efecti-

vamente ligando-os. Neste caso o Azoto é o átomo dador, pois está covalentemente ligado ao Hidro-

génio, e o Oxigénio é o receptor. Nas proteínas as pontes de Hidrogénio formam-se tipicamente entre

átomos de Azoto ou Oxigénio. Esta ligação é cerca de vinte vezes mais fraca do que as ligações cova-

lentes, mas mesmo assim desempenha um papel importante na determinação da estrutura da proteína

devido ao seu elevado número, formando redes extensas em toda a proteína.

Pontes de Dissulfureto: A Cisteína é um aminoácido contendo um átomo de Enxofre que tem a capa-

capacidade de formar uma ligação covalente com o

Enxofre de outra Cisteína (ver Figura 1.3, página 13).

Esta ligação covalente entre os dois átomos de enxofre é

chamada ponte de Dissulfureto, permite ligar

covalentemente duas cadeias de aminoácidos, ou uma

cadeia em regiões distantes na estrutura primária.

Grupos Prostéticos: Muitas proteínas contém mais que

aminoácidos. No caso da hemoglobina, por exemplo, é

um hemo contendo um átomo de Ferro (ilustrado na

Figura 1.10) que desempenha o papel crucial no trans-

porte do Oxigénio. Nestes casos a estrutura química

destes grupos deve ser considerada na determinação da

estrutura da proteína, bem como as suas ligações às

cadeias de aminoácidos que a formam.

C

N

O

Fe

Figura 1.10

Hemo da Hemoglobina humana. Os átomos de Hidrogénio não estão representados

25

1.7 Quiralidade

A quiralidade não é propriamente um elemento estrutural, mas sim uma característica de uma estrutu-

ra. A quiralidade foi definida por Kelvin (33) como:

"Eu designo qualquer figura geométrica, ou conjunto de pontos, como quiral, e digo que tem quirali-

dade, se a sua imagem num espelho plano, em condições ideais, não pode ser sobreposta de forma a

coincidir com o original."

Um exemplo de uma estrutura quiral é a mão. A mão direita é idêntica à imagem no espelho da mão

esquerda e vice-versa, mas ambas diferem da sua própria imagem no espelho. O termo quiral deriva

precisamente de cheir, palavra grega para mão.

Em geral, moléculas complexas como as proteínas, são quirais, ou seja, a imagem no espelho é dife-

rente da estrutura. Além disso, normalmente partes da estrutura também têm quiralidade. Um exemplo

são os centros quirais nos aminoácidos, que conferem a estes últimos duas formas possíveis, designa-

das R e S (de rectus e sinister, latim para direita e esquerda). Em sistemas biológicos existe em geral

apenas uma das duas formas possíveis para cada aminoácido. As hélices-α, outro exemplo de uma

estrutura quiral dentro da proteína, também só existem em seres vivos numa das duas formas possí-

veis.

Não é necessária para este trabalho uma abordagem detalhada deste tema. O importante a ter em conta

é que as proteínas são estruturas quirais, por isso diferentes da sua imagem no espelho, mas em que

apenas uma das formas tem realidade biológica. Este factor é importante porque um conjunto de dis-

tâncias, mesmo que suficiente para determinar completamente a estrutura duma proteína, terá sempre

no mínimo duas soluções, uma das quais é a imagem do espelho da solução correcta. Mais adiante (2.7

adiante (2.7 Verificação da Quiralidade, Página 49)

irei referir como este problema foi resolvido.

1.8 Ressonância Magnética Nuclear

Um tratamento detalhado das técnicas de RMN estru-

tural estaria fora do âmbito desta dissertação. No

entanto, penso que é importante dar uma visão geral

dos princípios que permitem obter experimentalmente

as restrições necessárias para definir a estrutura de

uma proteína (14,4).

Muitos núcleos atómicos são dipolos magnéticos. O

mais importante destes, em bioquímica estrutural, é o

núcleo do Hidrogénio, composto apenas por um pro-

Campo Externo

Menor Energia α

Maior Energia β

Figura 1.11

Possíveis orientações para o vector de momento magnético de um protão na presença de um cam-po externo.

26

protão.

Quando em presença de um campo magnético externo, o vector de momento magnético do protão

pode tomar uma de duas orientações, como mostrado na Figura 1.11. Para compreender este fenómeno

é preciso considerar que o protão está sujeito às leis da mecânica quântica. Por isso a sua energia está

quantizada, não podendo tomar valores arbitrários, o que apenas permite que este adopte uma de duas

orientações possíveis em relação ao eixo definido pelo vector do campo magnético externo (conven-

cionarei este eixo como sendo o eixo z do sistema de coordenadas). Se a componente z do vector de

momento linear tiver o mesmo sentido que o campo magnético externo, o protão encontra-se num

nível de energia inferior (α). No caso oposto encontra-se no nível superior (β) devido à interacção

desfavorável com o campo magnético externo.

Além disto, pelo princípio de incerteza de Heisenberg, as componentes x, y, e z do vector de momento

magnético do protão não podem ser todas determinadas simultaneamente. A componente z é fixa pela

sua relação com a energia do sistema devido à presença do campo magnético externo, e por isso as

componentes x e y (no plano perpendicular ao vector do campo magnético externo) são indeterminá-

veis.

Numa perspectiva clássica, podemos imaginar que o vector de momento magnético do protão gira em

torno do eixo formado pelo vector do campo magnético externo, descrevendo um cone no espaço,

como representado pela Figura 1.11. As componentes x e y do vector de momento magnético do pro-

tão estão assim a oscilar no plano perpendicular ao vector do campo magnético externo. Se aplicarmos

um outro campo magnético oscilatório com a mesma frequência e que oscile neste plano, este estará

em ressonância com as componentes x e y do vector de momento magnético do protão. Isto é conse-

guido irradiando a amostra com ondas de radiofrequência, cuja componente magnética oscila à fre-

quência desejada.

Esta frequência de ressonância depende da diferença energética entre o nível α e o nível β, ou seja, da

magnitude do campo magnético no ponto onde o protão se encontra. Por sua vez o campo magnético

sentido pelo protão é resultado não só do campo magnético aplicado externamente mas também do

campo magnético gerado na vizinhança do protão pelo movimento dos electrões na molécula. Como

consequência a frequência de ressonância de um protão depende do ambiente químico em que este se

encontra, pelo que é normalmente possível identificar um protão e distingui-lo de outros na molécula.

Ao irradiar a amostra com radiação na frequência de ressonância, um protão no estado de energia mais

baixo (α na Figura 1.11) absorverá energia da radiação fornecida, passando para o estado de energia

mais alto. Por outro lado, um protão no estado mais energético (β na Figura 1.11) será estimulado a

emitir uma radiação do mesmo comprimento de onda e transitar assim para o nível inferior.

27

Se as populações nos estados α e β forem idênticas, nenhum efeito será observável. Felizmente exis-

tem muitos campos magnéticos oscilatórios, gerados pela oscilação térmica dos átomos da proteína,

cuja interacção com o protão permitem a transição entre estes dois níveis mesmo na ausência de radia-

ção electromagnética externa. As populações no nível α e β encontram-se assim num equilíbrio térmi-

co em que o nível α é mais populado que o nível β, e por isso é detectável uma absorção de radiação

na frequência de ressonância de cada protão.

Se a probabilidade de um protão transitar do nível β para o nível α for alterada, o equilíbrio entre as

duas populações será alterado, e a absorção total medida será diferente. É possível conseguir isto expe-

rimentalmente porque a oscilação de um protão irradiado na sua frequência de ressonância pode alterar

a probabilidade de transição dos protões na vizinhança; este é o efeito de Overhauser. Como as fre-

quências de ressonância são geralmente diferentes para protões em posições diferentes, é possível

simultaneamente irradiar um protão e medir a absorção de outro protão.

Este é o princípio da RMN a duas dimensões,

e a Figura 1.12 mostra um espectro obtido

por esta técnica. Cada pico indica a variação

na absorção medida à frequência de

ressonância de um protão quando outro

protão é irradiado. A intensidade destes picos

cruzados permite-nos calcular limites para a

distância entre os dois protões. Esta técnica

pode fornecer assim a informação necessária

para determinar a estrutura de uma proteína.

No entanto é evidente a complexidade dos

espectros obtidos por esta técnica quando

aplicada a proteínas. Por isso a tarefa de atri-

buir a cada pico o respectivo par de protões

está longe de ser trivial. Os átomos e os ami-

noácidos a que pertencem são identificados

identificados por padrões característicos. No entanto é comum haver ambiguidade na atribuição, como

por exemplo quando a proteína contém vários aminoácidos do mesmo tipo, caso em que pode ser

difícil distingui-los. Em geral as primeiras tentativas contêm atribuições erradas, ou muito

incompletas, e só tentando calcular a estrutura repetidas vezes é que é possível resolver estes

problemas. As atribuições provisórias são usadas para calcular uma estrutura, que por sua vez fornece

a informação sobre a vizinhança dos átomos que permite corrigir a atribuição. Este carácter iterativo

do processo torna particularmente importante a eficiência do cálculo da estrutura a partir das restri-

ções.

Figura 1.12

Espectro de NMR Bidimensional (Derivado de Ní-quel da Rubredoxina).

28

29

30

2. Método

"Tudo deve ser feito tão simples quanto possível, mas não mais." Albert Einstein

Para qualquer algoritmo existe um nível óptimo de complexidade. Tanto algoritmos demasiado com-

plexos como demasiado simplificados sofrem degradação no desempenho e na qualidade dos resulta-

dos. A ideia central no desenvolvimento deste método foi precisamente tentar encontrar esse valor óp-

timo.

Assim, diversas simplificações foram feitas, nomeadamente a nível da modelação das restrições de

distância e da representação dos domínios. Outras simplificações, como a redução do problema a do-

mínios finitos, pareceram à partida atraentes por terem sido usadas nem problemas relacionados, como

análise teórica de estruturas de proteínas (5), ou na atribuição de picos cruzados em NMR multidimen-

sional (23,36). No entanto os resultados favoráveis obtidos com o presente método indicam que tal

simplificação é provavelmente excessiva no caso da determinação de estruturas.

A comparação de apenas dois métodos; a aplicação comercial DYANA (17) e o algoritmo aqui pro-

posto, não permite concluir que este último está próximo do óptimo de desempenho. É evidente que

muitas alternativas ficam ainda por explorar. Este método é assim apenas um primeiro passo, mas que

cumpre já o objectivo de mostrar que as técnicas de programação por restrições são apropriadas para a

resolução deste problema.

2.1 Modelação do Problema

A informação acerca da estrutura a calcular é modelada pelo conjunto das

restrições de distância entre átomos e das variáveis de domínio represen-

tando as posições dos átomos que são consistentes com estas restrições

(2.3 Adaptação do Modelo, página 40). No modelo são considerados

todos os átomos excepto os átomos de Hidrogénio. Apesar de a informa-

ção de RNM a duas dimensões fornecer restrições às distâncias entre áto-

mos 1H, estas são facilmente convertidas em restrições de distância entre

os átomos covalentemente ligados aos 1H, porque cada átomo de Hidro-

génio está ligado a um e só um átomo. Isto permite reduzir para cerca de

metade o número de variáveis a considerar.

De momento estão implementadas três fontes de restrições. A primeira é a

informação da estrutura primária (1.2 Estrutura Primária, Página16) da proteína. O conhecimento das

estruturas dos vários aminoácidos permite criar uma rede de restrições de distância entre pares de

Figura 2.1

Algumas restrições de distância deduzidas da estrutura da Lisina.

31

átomos em qualquer um dos 20 aminoácidos. Estas restrições estão ilustradas na Figura 2.1. Como as

ligações químicas possuem alguma flexibilidade e algumas permitem a rotação em torno da ligação,

estas restrições de distância não representarão um valor único mas sim um intervalo de valores permi-

tidos para a distância entre os átomos. Mais adiante (2.3 Adaptação do Modelo, Página 40) descreverei

como as restrições são implementadas para permitir esta modelação. Apesar de estas restrições consti-

tuírem cerca de metade das restrições usadas no cálculo de uma estrutura, não são por si só suficientes

para determinar o enrolamento da cadeia de aminoácidos, pois são restrições apenas dentro de ami-

noácidos e entre aminoácidos próximos na estrutura primária. Além disso são em grande parte restri-

ções redundantes, pois o sistema de restrições gerado pela estrutura química de um aminoácido con-

tém uma restrição para cada par de átomos diferentes no aminoácido. O uso de restrições redundantes

aumenta o desempenho na resolução do sistema pois permite a eliminação mais rápida de soluções

impossíveis quando não se garante uma consistência total (11). Esta é certamente uma técnica a

explorar de futuro, na sequência do trabalho aqui apresentado.

A segunda fonte de restrições é a informação de Ressonância Magnética Nuclear. A intensidade dos

picos cruzados permite estimar uma distância média entre os 1H em ressonância, que por sua vez per-

mite criar um intervalo de distâncias permitidas entre os átomos ligados a estes átomos de Hidrogénio

(os átomos de Hidrogénio, como referido acima, não são incluídos no modelo). Estas restrições afec-

tam muitas vezes aminoácidos em posições distantes na sequência da proteína, fornecendo por isso a

informação necessária para a determinação das estruturas de ordem superior (secundária, terciária e

quaternária, ver Estrutura de Proteínas, Página 15).

A terceira fonte de restrições é a própria estrutura a calcular. Obviamente, esta informação só pode ser

usada para testar o método, pois a estrutura tem que ser conhecida à partida. No entanto é extrema-

mente simples medir numa estrutura as distâncias que se quer considerar e criar a partir destas as res-

trições necessárias. Este processo permite testar o método em qualquer uma das muitas estruturas dis-

poníveis (normalmente determinadas por cristalografia de Raios X), sem exigir o acesso a dados expe-

rimentais de NMR. Além disto permitiu evitar inicialmente problemas de ambiguidade na atribuição

dos picos cruzados e de parametrização da conversão de distâncias entre 1H em restrições sobre os

átomos covalentemente ligados a estes. Sendo o objectivo principal deste trabalho estudar a aplicabili-

dade das técnicas de processamento de restrições à determinação de estruturas, foi bastante útil nesta

fase poder adiar a resolução destas pequenas dificuldades, avançando primeiro com o trabalho prioritá-

rio.

O sistema a resolver consiste assim num conjunto de variáveis correspondentes às posições dos áto-

mos, e cujos valores se quer determinar, e um conjunto de restrições binárias (i.e. relações entre pares

de variáveis) de distância. Estas restrições permitem uma gama de valores e não apenas um valor úni-

co para a distância entre os dois átomos. A forma mais intuitiva de as modelar será como uma conjun-

32

conjunção de duas restrições: distância superior ou igual a um valor e distância inferior ou igual a

outro valor.

Relativamente a um átomo, um outro átomo terá que estar Fora de uma esfera com raio igual à distân-

cia mínima permitida pela restrição, e simultaneamente Dentro de outra esfera de raio igual à distância

máxima permitida. Esta será a designação usada para estas duas restrições, definidas analiticamente

como:

Dentro kzzyyxx ≤−+−+− 221

221

221 )()()(

Equação 2.1

Fora kzzyyxx ≥−+−+− 221

221

221 )()()(

Equação 2.2

Estas restrições são suficientes para modelar toda a informação estrutural disponível à excepção da

quiralidade (1.7 Quiralidade, Página 25), que é considerada só após o cálculo da estrutura.

2.2 Técnicas de Consistência

O objectivo do método é gerar uma estrutura que respeite as restrições impostas. Essencialmente o

problema consiste em encontrar, num universo de inúmeras combinações de posições de átomos,

aquelas que cumprem o objectivo. Esta pesquisa pode ser imaginada como a exploração de uma

árvore. Cada ramificação corresponde à atribuição de valores a uma variável, com cada ramo

correspondendo a um valor específico para esta variável. Esta atribuição designa-se por enumeração,

sendo a solução final obtida quando todas as variáveis estão enumeradas. Como em cada ramificação é

escolhido um valor para uma variável, este momento no processo de procura é chamado ponto de

escolha. Durante a pesquisa vários pontos de escolha são criados, e possivelmente a execução terá que

retroceder a alguns destes para modificar a escolha feita.

A Figura 2.2 exemplifica esta pesquisa para o problema de colocar duas moedas de forma a que o nú-

mero indicando o valor não seja visível. No inicio é desconhecida a posição de qualquer uma das

moedas. Na primeira ramificação é determinada a posição de uma moeda, e cada ramo corresponde a

um dos dois possíveis estados em que a moeda pode estar (enumeração). Para cada um destes, a

segunda moeda é enumerada. No total temos 22 possibilidades, que são examinadas uma a uma. Sem-

pre que uma possibilidade incorrecta é descoberta, a pesquisa retrocede para a ramificação anterior,

escolhendo o ramo seguinte. Os números na Figura 2.2 indicam uma possível ordem de pesquisa, e as

letras indicam a ordem dos pontos de escolha gerados. Por exemplo, para passar da situação 2 para a

situação 3 é necessário retroceder até ao ponto de escolha B. Após todas as escolhas em B terem sido

exploradas, a execução retorna a A, onde será tomada a escolha 4, alternativa a 1.

33

Figura 2.2

Árvore de pesquisa para o problema de posicionar duas moedas de forma a que os números não sejam visíveis. As setas azuis indicam o caminho na enumeração para a solução correcta.

Se em vez de duas moedas tivéssemos quatro dados de seis faces, teríamos 64 possibilidades. Genera-

lizando, o número total de possibilidades será igual ao produto para todas as variáveis do número de

valores que cada variável pode tomar, ou seja uma complexidade para o pior caso de O(an), em que n

representa o número de variáveis e a a cardinalidade do domínio. É fácil ver que esta explosão combi-

natória faz com que na prática uma pesquisa ingénua não seja viável.

Para melhorar a eficiência podemos usar melhor a informação fornecida pelas restrições. Em vez de

usar as restrições apenas para testar as soluções enumeradas, a pesquisa pode ser guiada mantendo a

consistência das enumerações. No exemplo das moedas, temos uma restrição que impede que uma

face com o número esteja voltada para cima. Assim, na primeira ramificação da árvore de pesquisa

podemos logo eliminar o ramo superior (ver Figura 2.2), pois sabemos que nenhuma solução nesse

ramo poderá respeitar esta restrição. Se conseguirmos manter uma consistência completa com as res-

trições impostas, a árvore de pesquisa fica reduzida apenas às soluções que respeitam as restrições (o

caminho a azul na Figura 2.2). Mesmo que a consistência seja parcial podemos reduzir drasticamente

o número de hipóteses a enumerar, e por isso o tempo de pesquisa.

Em geral, o problema de satisfação de restrições é NP-completo. NP porque é possível para uma má-

quina não determinista resolver o problema em tempo polinomial, pois o número de operações

necessárias para verificar se uma solução está correcta é polinomial em relação aos dados do proble-

ma; mais formalmente, existe um polinómio p(n) que, para cada valor n da dimensão do problema, é

superior ao número de operações necessárias para determinar se uma solução é válida ou não (25).

NP-completo porque nenhum problema da classe NP pode ser mais difícil de resolver que um que o

problema de satisfação de restrições mais um factor polinomial; formalmente, um problema A é NP-

completo se e só se A for NP e para qualquer problema B∈NP exista uma função f calculável em

tempo polinomial tal que x∈B se e só se f(x)∈A. Este facto é importante, porque se algum algoritmo

resolver o problema geral de satisfação de restrições em tempo polinomial, todos os problemas NP são

? ?

?

?

1

2

3

4

5

6

A

B

C

34

problemas NP são de facto problemas P, ou seja, poderão ser resolvidos deterministicamente em

tempo polinomial.

A distinção entre P e NP merece ser clarificada; um problema ser NP quer dizer que, dada uma poten-

cial solução, esta pode ser confirmada ou rejeitada em tempo polinomial. Isto nada diz acerca de como

encontrar a solução correcta. Como mostra o exemplo das moedas, o número de soluções potenciais

cresce exponencialmente com o número de variáveis, e mesmo que consigamos determinar em tempo

polinomial se as restrições são violadas, se enumerarmos todas as hipóteses podemos demorar um

tempo exponencial até encontrar a solução correcta. Se seleccionarmos as soluções de uma forma não

determinista, é possível acertar rapidamente na solução correcta, e assim resolver o problema em

tempo polinomial. Mas, se bem que possível, tal é em geral demasiado improvável.

O ideal seria conseguir um algoritmo determinista que garantisse que a solução correcta era encontra-

da em tempo polinomial. Tais algoritmos existem para alguns problemas NP. Por exemplo, virar todas

as moedas com o número para baixo é um algoritmo determinista que resolve o problema da Figura

da Figura 2.2 em tempo polinomial. No entanto este problema não é

NP completo, e por isso este algoritmo não terá sucesso idêntico no

caso geral. Desconhece-se ainda se é possível resolver todos os

problemas da classe NP de uma forma determinista em tempo

polinomial. No entanto, como vimos para o exemplo da Figura 2.2,

em muitos casos podemos resolver o problema em tempo útil de

uma forma determinista, se durante a pesquisa for mantida a

consistência entre os valores das variáveis. Neste exemplo simples a

posição de cada moeda está restrita de uma forma independente da

posição da outra. Neste caso para garantir a consistência do sistema

basta considerar cada moeda individualmente. A isto chama-se

consistência de nó, em que cada variável é considerada

isoladamente quando eliminamos valores possíveis do seu domínio.

O nome deriva da representação do sistema de variáveis e restrições

como um grafo, em que os nós são as variáveis e os arcos são as

restrições. Temos também assim a noção de consistência de arco,

em que duas variáveis unidas por uma restrição são consideradas em

conjunto. Se, neste caso das moedas, a restrição fosse que não

poderiam ter a mesma face voltada para cima, só poderíamos cortar

ramos da árvore de pesquisa referentes à enumeração da segunda

moeda, e dependendo do valor da primeira. A Figura 2.3 ilustra os

dois tipos de restrições e consistência.

É importante não confundir, quando as restrições unem variáveis

A B

A B A≠B

B≠A

Figura 2.3

Consistência de nó (grafo supe-rior), no caso em que as moedas não podem ter o número visível, e de arco (grafo inferior), para o caso que as faces visíveis têm que ser diferentes.

Figura 2.4

Grafo representando o problema das 3 moedas em posições dife-rentes. Cada arco representa uma restrição, e cada elipse representa uma moeda, com os dois valores possíveis à partida.

35

duas a duas, a noção de consistência de arco (em que duas variáveis são consideradas) com consistên-

cia global. Vamos supor que temos três moedas, e queremos colocá-las de forma a que não haja duas

moedas com a mesma face voltada para cima. Tal problema é obviamente impossível. No entanto a

consistência de arco não permite chegar imediatamente a este resultado; só após enumerar a primeira

moeda, é que a consistência de arco permite remover essa orientação dos domínios das outras duas

moedas, e concluir a inconsistência (pois as duas restantes moedas teriam que ter a mesma orientação).

Nesse caso faltaria ainda escolher o outro valor possível para a primeira moeda, o que daria eventual-

mente o mesmo resultado. Só então é que o se poderia concluir que o problema não tem solução. A

Figura 2.4 representa o grafo deste problema.

Esta conclusão seria imediata se considerássemos as três moedas em simultâneo. Desta forma seria

logo evidente que três moedas com dois estados cada uma não podem estar todas em estados diferen-

tes. Como este exemplo demonstra, mesmo um sistema em que as restrições se referem apenas a pares

de variáveis pode ser necessário considerar mais que duas variáveis em simultâneo para garantir uma

consistência completa. Isto é importante para o método que aqui proponho, no qual como veremos

adiante as restrições são modeladas como distâncias entre pares de átomos.

Se três variáveis são consideradas em simultâneo trata-se de consistência de caminho. Esta progressão

no número de variáveis consideradas simultaneamente quando se impõe consistência pode se estender

para qualquer valor. Por exemplo, se quisermos colocar sete dados de seis faces todos com uma face

diferente para cima, a consistência de caminho não garante consistência global, exigindo uma longa

pesquisa pela arvore. Para concluir que o problema é impossível seria necessário considerar as sete

variáveis em simultâneo. Podemos assim falar de consistência-k, em que k é o número de variáveis

consideradas quando a consistência é imposta. A consistência de nó será assim k=1, consistência de

arco k=2, e a consistência de caminho para k=3.

A manutenção de consistência k é tão mais exigente em termos computacionais quanto maior for k. A

complexidade temporal da consistência de nó é linear com a cardinalidade dos domínios (a) e o núme-

ro de variáveis (n), ou seja O(an). No caso da consistência de arco, a complexidade temporal máxima é

de O(a3e) para o algoritmo AC-3 (26), em que e representa o número de restrições binárias no sistema.

Outros algoritmos para manter a consistência de arco têm desempenhos melhores; O(a2e) para o AC-4

(29) e AC-5 (20). O algoritmo AC-6 (9), se bem que com uma complexidade temporal idêntica no pior

dos casos, têm em média um desempenho melhor. Quanto à consistência de caminho, os algoritmos

PC-1 e PC-2 (26) tem complexidades no pior dos casos de respectivamente O(n5a5) e O(n3a5) em que n

representa o número de variáveis. O algoritmo PC-3 tem uma complexidade temporal O(n3a3) (29),

mas a sua complexidade espacial é também O(n3a3), o que para casos com um número significativo de

variáveis e valores pode ser proibitivo.

Geralmente não é garantida uma consistência completa, mas sim apenas consistência parcial, o que

torna necessária uma enumeração de muitas alternativas e o retrocesso na pesquisa sempre que são

36

descobertas enumerações inconsistentes. A manutenção de consistência permite reduzir a complexida-

de da pesquisa, que como vimos seria de O(an), para O(a’n nk), em que a’ é a cardinalidade dos domí-

nios após redução por imposição de consistência. Como a’ é menor que a, consegue-se uma redução

no tempo de pesquisa, mas a um preço nk, em que n é o número de variáveis e k o nível de consistên-

cia. Por isso a consistência de arco é a mais usada na prática; os custos de manter uma consistência de

ordem maior, em geral, não são compensados pela redução na pesquisa.

Neste trabalho foi usada uma versão modificada do algoritmo AC-3 (26), mostrado na Figura 2.5 em

pseudo código. Este algoritmo é menos eficiente que as alternativas mais recentes. No entanto, trata-se

de um algoritmo geral, aplicável a qualquer domínio, ao passo que os algoritmos posteriores de

consistência de arco ganham eficiência especializando-se em problemas de domínios finitos. Recente-

mente foi criado um paradigma que sistematiza vários algoritmos de propagação de restrições (1). O

AC-3 foi o mais evoluído dos algoritmos de consistência de arco que foi possível incluir neste para-

digma, precisamente pelo seu carácter geral. Como se discute adiante, foi escolhida uma modelação

por domínios contínuos, pelo que não foi possível tomar partido das técnicas dos algoritmos mais re-

centes.

procedimento REVER(Vi,Vj) REMOVE <- falso; para cada X em Di se não existe Y in Dj tal que (X,Y) é consistente, então remover X de Di; REMOVE <- verdadeiro; fimse; fimpara; devolve REMOVE; fim REVER procedimento AC-3 Q <- {(Vi,Vj) em arcos(G),i≠j}; enquanto não Q vazio selecciona e remove qualquer arco (Vk,Vm) de Q; se REVER(Vk,Vm) então Q <- Q união {(Vi,Vk) tal que (Vi,Vk) em arcos(G),i≠k,i≠m} fimse fimenquanto fim AC-3

Figura 2.5

Representação em pseudo código do algoritmo AC-3

Este algoritmo é composto por um procedimento REVER, que elimina os valores do domínio de uma

variável Vi que não têm suporte na variável Vj. Este procedimento é chamado para todos os pares de

variáveis relacionadas por uma restrição (i.e. unidas por um arco pertencente ao grafo G). Quando o

procedimento REVER é chamado, o arco correspondente ao par seleccionado é removido da lista de

arcos a processar. Se o domínio de uma variável é alterado pelo procedimento REVER, todos os arcos

pertencentes a G e que tocam essa variável são adicionados à lista de arcos a processar. O procedimen-

to termina quando esta lista estiver vazia.

37

Recapitulando, podemos reduzir a enumeração de soluções forçando durante a pesquisa alguma con-

sistência com as restrições impostas. No entanto não é prático manter uma consistência completa, e

por isso muitas das escolhas feitas durante a enumeração podem resultar em inconsistência, exigindo

que se retroceda e altere uma escolha feita anteriormente. Assim torna-se também importante ter uma

boa heurística de enumeração, ou seja, um conjunto de regras de preferência que aumente a probabili-

dade de escolher o caminho certo quando existem várias hipóteses.

Para ilustrar isto, consideremos o problema de colocar três berlindes em três orifícios, como ilustrado

na Figura 2.6. As restrições impostas são que apenas um berlinde tem pode ocupar cada orifício, e que

o berlinde tem que caber no orifício. Consideremos que apenas é mantida consistência de arco da para

a primeira restrição (i.e. entre pares de berlindes, que têm que ocupar posições diferentes), e não se

mantém a consistência de nó para a segunda restrição (i.e. o berlinde tem que caber no orifício).

Figura 2.6

Enumeração para o problema de colocar 3 berlindes em três orifícios. O berlinde amarelo é colocado no primeiro orifício. Por consistência de arco, este orifício não está disponível para o berlinde rosa, que é colocado no segun-do orifício. Por fim o berlinde verde só pode ser colocado num orifício no qual não cabe.

Como se pode ver na Figura 2.6, o primeiro berlinde é colocado no primeiro orifício. Impondo consis-

tência de arco à primeira restrição (posições diferentes), o segundo berlinde só poderá ser colocado em

um dos dois orifícios restantes, sendo colocado no segundo. Finalmente, o terceiro berlinde pode ape-

nas ser colocado no terceiro orifício, mas ao completar a enumeração desta hipótese é verificada a vio-

lação da segunda restrição (o berlinde tem que caber no orifício), cuja consistência não foi mantida.

Assim torna-se necessário retroceder para explorar hipóteses alternativas. Mas retroceder um passo,

até à colocação do segundo berlinde, não é suficiente. De facto o erro foi feito logo na primeira opção,

quando o berlinde mais pequeno foi colocado no orifício maior.

38

Em situações reais pode ser muito grande o número de retrocessos e tentativas falhadas até que o erro

seja resolvido, pois este pode ter sido feito muito antes da inconsistência ser detectada. Por isso é mui-

to importante ter uma heurística de escolha que minimize a probabilidade de erro e que cometa os

erros tanto quanto possível próximo da detecção das inconsistências. Para este exemplo, a heurística

de colocar cada berlinde no menor orifício em que este caiba resolveria este problema. É de salientar

que este exemplo simples não é realista, pois não haveria razão para não impor a consistência da

segunda restrição. A ideia importante é que, se não é garantida a consistência completa, é vantajoso

ordenar as enumerações de forma a encontrar o menor número de falhas.

Existem dois tipos de escolha durante a enumeração; qual a variável a enumerar, e qual o valor a atri-

buir-lhe. A ordenação das variáveis e dos valores pode ser estática, se for determinada no início da

execução, ou dinâmica, se depender do estado da pesquisa durante a execução (7). A heurística de fa-

lha primeiro é a mais comum para ordenação das variáveis. Baseia-se no principio que se detectará

uma falha mais cedo enumerando as variáveis com menores domínios. Parece contraditório procurar

uma falha, mas se uma solução parcial é incorrecta, é preferível detectá-lo antecipadamente, evitando

uma busca infrutífera nesse ramo da árvore. Outras heurísticas também têm o mesmo objectivo, como

escolher a variável que participa no maior número de restrições, ou que tem mais restrições com vari-

áveis já enumeradas. Em todas estas heurísticas a ideia base é de tentar resolver primeiro os casos mais

difíceis, o que resulta numa redução média da profundidade dos ramos da árvore de pesquisa.

Quanto à ordenação dos valores, o efeito é ordenar os ramos explorados. Evidentemente nos casos em

que não existem soluções ou nos casos em que se quer enumerar todas as soluções a ordenação de va-

lores é irrelevante. Mas de outra forma, uma ordenação ideal de valores pode produzir uma solução

sem necessidade de retrocesso. Neste caso a ideia base é a do sucede primeiro, ou seja, queremos

escolher o valor com maior probabilidade de ser o correcto. Isto pode ser conseguido, como no caso

do algoritmo AC-4, contando o suporte que cada valor tem e escolhendo o valor mais suportado. Em

alternativa, pode-se escolher o valor que simplificará ao máximo o problema a resolver.

No trabalho aqui apresentado, como veremos adiante (3.3 Heurística de Enumeração, página 55), foi

usada uma ordenação de variáveis por falha primeiro e uma ordenação de valores por sucede primeiro.

Todos os exemplos apresentados até agora referem-se a problemas em que as variáveis podem tomar

valores dentro de um domínio finito. Nestes casos manter a consistência consiste em retirar do domí-

nio de uma variável aqueles valores que levariam necessariamente a uma violação das restrições. No

exemplo da Figura 2.6, ao colocar o primeiro berlinde, os domínios do segundo e do terceiro deixam

de conter o orifício ocupado. No entanto o problema que pretendo resolver não é necessariamente um

problema de domínios finitos. O objectivo é determinar a posição de cada átomo, e esta pode tomar

qualquer valor real, tendo assim um número infinito de valores possíveis.

39

Este problema poderia ter sido resolvido de duas formas. Uma opção seria considerar que cada átomo

ocuparia uma posição numa grelha tridimensional, resolvendo assim o problema com técnicas de do-

mínios finitos. No entanto, mesmo usando uma grelha relativamente grosseira de por exemplo 0.5Å

para converter as posições em domínios finitos, teria cerca de 100 valores possíveis para cada coorde-

nada. É fácil ver que com um número tão elevado de restrições e variáveis (na ordem dos milhares), o

problema seria na prática impossível de resolver. Mesmo com algoritmos de consistência como o AC-

6 ou o PC-3 a complexidade é respectivamente quadrática e cúbica com a cardinalidade dos domínios.

Optei por isso pela forma alternativa; considerar os domínios como contínuos, e neste caso não é viá-

vel remover do domínio das variáveis valores pontuais pois o domínio não é enumerável. O ponto de

partida para a representação dos domínios é a consistência de limite (bound consistency, 19).

Para exemplificar esta representação, consideremos o problema (Figura 2.7) de encontrar os valores

para duas variáveis reais X e Y de forma a que se respeite as duas restrições; X é metade de Y e Y é

igual a X. Supondo que se sabe à partida que a solução em ambos os casos se encontra no intervalo [-

10; 10], podemos restringir X ao intervalo [-5; 5], pois os valores de X não podem ultrapassar metade

dos de Y. Podemos então restringir Y ao mesmo intervalo, pois Y tem que ser igual a X. Segundo este

conceito, para efeitos de consistência são apenas testados os limites do intervalo de valores que forma

o domínio de uma variável. No entanto, para o problema específico que aqui pretendo resolver, é pos-

sível estender esta representação de forma a poder remover valores dentro do domínio. Essa represen-

representação, baseada na consistência de limite mas

mais poderosa, será descrita na próxima secção.

Este exemplo, além de ilustrar o conceito de consistên-

cia de limite, mostra também uma dificuldade em satis-

fazer restrições em domínios contínuos. O processo de

redução de domínios será repetido num ciclo infinito,

pois se bem estes reduzidos para metade a cada passo,

nunca se chegará ao valor exacto que é solução do pro-

blema (ambas as variáveis iguais a zero). Em geral é

impossível obter em tempo finito valores exactos para

exactos para problemas em domínios reais. É por isso necessário fixar inicialmente um limite para a

precisão da solução obtida, para que o algoritmo pare em tempo finito quando este limite for atingido.

Outro problema desta opção é não poder recorrer aos algoritmos mais avançados de consistência PC-3

e AC-4, 5 e 6, pois estes baseiam-se na tabulação e contagem de valores suportados pelas restrições, e

no caso de domínios contínuos esta técnica não é aplicável. Foi necessário optar entre uma consistên-

cia de arco como o AC-3 e consistência de caminho como o algoritmo PC-2. O algoritmo AC-3 tem

uma complexidade temporal O(a3e), que é linear com o número de restrições, o que é vantajoso devido

X Y

X = Y/2 Y=X

X = Y/2 Y=X

0 -10 -10

Figura 2.7

Redução progressiva dos domínios de X e Y por imposição de consistência de limite.

40

vantajoso devido ao elevado número de restrições nos problemas que pretendo resolver. A

complexidade cúbica com a cardinalidade dos domínios não à partida um problema grave, pois a

cardinalidade efectiva, na prática, dependerá da precisão desejada, e por isso poderá ser controlada.

Uma consistência mais completa, como a consistência de caminho do algoritmo PC-2, não foi tentada

pois a sua complexidade de O(n3a5), sendo cúbica com o número de variáveis, é uma grande

desvantagem para estes problemas.

A concepção do método foi determinada por todas estas considerações. Em suma, sendo inviável

manter consistência completa, torna-se necessária uma pesquisa pelas possibilidades que a consistên-

cia parcial não elimina à partida. Esta pesquisa terá que ser guiada por uma heurística apropriada que

reduza o impacto das escolhas erradas na enumeração. Considerando os domínios como contínuos, o

processo de satisfação das restrições terá que ser interrompido quando todas as variáveis estiverem

restritas a intervalos aceitáveis, visto que não se podem obter valores exactos em tempo finito. Por úl-

timo, o elevado número de variáveis e restrições nestes problemas limita o critério de consistência

usado a uma consistência de arco. A consistência de nó neste caso não tem qualquer utilidade devido à

natureza do problema, e critérios de consistência mais completos, se bem que possivelmente

vantajosos em subconjuntos de variáveis, dificilmente poderão ser aplicados em geral.

2.3 Adaptação do Modelo

Esta secção descreve os vários problemas de modelação e as soluções implementadas. Nomeadamente,

a escolha das variáveis, a modelação das restrições e domínios, e os métodos de propagação das restri-

ções.

2.3.1 As variáveis usadas

Para resolver a estrutura é necessário determinar as coordenadas de cada átomo. Apesar da posição de

cada átomo estar definida por três variáveis (x, y e z), a modelação destas como variáveis separadas é

problemática, pois a restrição Fora é uma disjunção de três restrições sobre estas três variáveis

(Equação 2.2). Garantindo apenas consistência de arco não é possível propagar estas restrições, pois

em geral é possível encontrar suporte para todos os valores do domínio de cada variável. A Figura 2.8

ilustra melhor este problema num espaço bidimensional, em que um átomo cujo domínio abrange a

região a azul tem que ser excluído da proximidade do átomo na posição (x1, y1). Nenhum valor pode

ser removido dos domínios das variáveis x2 e y2.

41

Figura 2.8

O átomo 1 no ponto (x1, y1) excluí, por uma restrição Fora, o átomo 2 da região marcada a rosa. Os domínios das variáveis x2 e y2 abrangem a zona marcada a azul. Podemos ver que para qualquer valor (a, b ou c) de x2 existem valores possíveis para y2, sendo impossível reduzir o domínio de x2 impondo consistência de arco. Como o recíproco também se verifica, também não é possível reduzir o domínio de y2. No entanto é evidente que a zona marcada a branco devia ser removida do domínio do átomo 2.

Para resolver este problema as variáveis consideradas não são cada uma das três coordenadas de um

átomo, mas o ponto P(x, y, z) que representa a posição no espaço do centro geométrico do átomo.

2.3.2 Restrições e Domínios das Variáveis

Um outro problema é a propagação de restrições que definem volumes esféricos. O domínio de um

átomo sujeito a duas ou mais restrições Dentro será a intersecção das esferas definidas por estas restri-

ções. No entanto, o cálculo e a representação destas intersecções, usando as restrições tal como defini-

das anteriormente (Equação 2.1 e Equação 2.2), é computacionalmente muito exigente. Por isso a

noção de distância foi simplificada, substituindo a distância Euclidiana, e definindo as restrições

como:

Dentro kzzyyxx ≤−+−+− |)||||max(| 212121

Equação 2.3

Fora kzzkyykxx ααα ≥−∨≥−∨≥− |||||| 212121 3

1=α

Equação 2.4

A restrição Dentro será assim o cubo que contém a esfera de raio k e centro (x1, y1, z1), a restrição

Fora será o cubo contido nesta esfera. É necessário o parâmetro α para garantir que a restrição Fora

simplificada não excluí valores possíveis.

x2

y2

a b c

x1 , y1

42

A Figura 2.9 ilustra esta simplificação para o caso a duas dimensões (note-se que a duas dimensões o

parâmetro α é igual a 1/√2).

Figura 2.9

Esta figura mostra, em duas dimensões, a diferença entre a definição Euclidiana de distância e a definição mais simples usada. Note-se que a restrição Dentro contém o círculo definido pela distância Euclidiana e a restrição Fora tem está contida neste.

Devido a esta simplificação, os domínios não são intersecções de esferas mas sim de paralelepípedos.

Como uma intersecção de paralelepípedos é também um paralelepípedo, evita-se o aumento na com-

plexidade da representação e do cálculo dos domínios.

Como vimos atrás a noção de consistência de limite não permite remover valores no interior do domí-

nio. Por isso é necessário estender a representação do domínio.

Restrição Fora

Restrição Dentro

Distância Euclidiana

43

Figura 2.10

O domínio da posição de um átomo é representado por um conjunto de paralelepípedos definindo duas regiões. A região Permitida, representada por um paralelepípedo, e a região Excluída, representada por zero ou mais pa-ralelepípedos.

Assim, o domínio de uma variável de posição de um átomo será representado por um conjunto de um

ou mais paralelepípedos. Um paralelepípedo define a região onde o centro geométrico do átomo se

pode encontrar de forma a verificar todas as restrições Dentro que lhe foram impostas, e será

designado região Permitida. Os restantes

paralelepípedos definem a região onde o centro

geométrico do átomo não pode estar por ter sido

excluído devido a restrições Fora. Esta região será

designada região Excluída, e é composta por zero ou

mais paralelepípedos, sem sobreposições e contidos na

região Permitida. Desta forma é possível remover

regiões internas ao domínio, o que não seria possível

apenas por consistência de limite.

Cada paralelepípedo é definido por dois pontos, corres-

pondendo a dois vértices opostos do paralelepípedo. O

vértice Menor é o vértice com o menor valor nas três

coordenadas. O vértice Maior é o vértice oposto, com o

maior valor em cada uma das coordenadas. Esta repre-

coordenadas. Esta representação simplifica significativamente as operações de intersecção de

paralelepípedos, como se descreve adiante. A Figura 2.11 ilustra esta representação.

2.3.3 Propagação das Restrições

Região Permitida

Região Excluída

Vértice Menor

Vértice Maior

y

x

z

0

Figura 2.11

Representação de um paralelepípedo pelos vértices Maior e Menor. Também estão representados os três semi-eixos positivos das coordenadas x, y e z.

44

Máximo dos vértices Menores

Mínimo dos vértices Maiores

Intersecção

Figura 2.13

Intersecção de dois rectângulos. O caso tridimensional com paralelepípedos é idêntico.

Cada tipo de restrição (Fora e Dentro) é propagado de forma diferente. As restrições do tipo Dentro

são propagadas por operações de intersecção entre paralelepípedos. A região Permitida de um átomo

A será a intersecção da sua região Permitida com a vizinhança da região Permitida do átomo B. A

vizinhança de B é o paralelepípedo que define a região Permitida de B, aumentado em todas as direc-

ções de uma distância igual á distância que define a restrição (k na Equação 2.3). A vizinhança de B

define assim a região onde o átomo A pode estar sem violar a restrição Dentro que o relaciona com B,

como ilustra a Figura 2.12.

Após esta intersecção, todos os paralelepípedos que definem a região Excluída do átomo A são

intersectados com a nova região Permitida deste. Esta operação simplifica a região Excluída,

removendo quaisquer paralelepípedos desnecessários.

A intersecção de paralelepípedos é simples de calcular. O paralelepípedo resultante da intersecção terá

no vértice Menor (ver Figura 2.11) o valor máximo de cada coordenada dos vértices Menores dos

paralelepípedos a intersectar. O vértice Maior terá como coordenadas os valores mínimos das

coordenadas dos vértices Maiores. Se paralelepípedo resultante tiver no vértice Menor uma

coordenada com valor superior á correspondente no

vértice Menor, então a intersecção é vazia. Esta

operação está ilustrada na Figura 2.13 para o caso

semelhante a duas dimensões.

Uma restrição do tipo Fora é propagada acrescentando

ao conjunto de paralelepípedos que define a região Ex-

cluída de um átomo A a zona de exclusão do átomo B.

A zona de exclusão de B é um paralelepípedo calculado

calculado a partir da

zona Permitida de B,

subtraindo ao cada

coordenada do vértice Maior e somando a cada coordenada do

vértice Menor o valor de distância correspondente à restrição (αk na

Equação 2.4), gerando respectivamente os vértices Menor e Maior

da zona de exclusão. Mais uma vez, se o vértice Menor desta tiver

uma ou mais coordenadas com um valor superior à coordenada

respectiva no vértice Maior, a zona de exclusão é nula. A Figura

2.14 ilustra esta operação.

Região Permitida

Vizinhança

k

Figura 2.12

Cálculo da vizinhança de um domínio à distância k (representação bidimensional).

45

Uma vez adicionada a zona de exclusão de B à região

Excluída de A, esta última é processada para garantir que

os paralelepípedos que a definem não se intersectam.

Esta é a operação mais complexa na propagação das res-

trições, mas facilita a determinação da falha na pesquisa

da solução quando o volume da região Excluída iguala

ou ultrapassa o volume da região Permitida, e simplifica

a representação da zona Excluída reduzindo o número de

paralelepípedos necessários para a representar. Isto é

conseguido com um processo iterativo em que primeiro

um bloco da zona excluída é expandido em todas as di-

recções até ter a dimensão máxima possível enquanto

completamente contido na zona Excluída. Em seguida

este novo paralelepípedo é subtraído à zona Excluída. O

subtraído à zona Excluída. O processo é repetido até a zona Excluída estar vazia. A zona Excluída

simplificada é o conjunto destes paralelepípedos expandidos. A Figura 2.15 resume a propagação das

restrições Dentro e Fora.

Figura 2.15

Propagação dos dois tipos de restrição. Para a restrição Dentro o domínio do átomo A é reduzido intersectando a região Permitida deste com a vizinhança de B. No caso da restrição Fora a zona de exclusão de B intersectada com a região Permitida de A é adicionada à região Excluída de A. Note-se são desprezadas as regiões onde a região de exclusão de B intersecta com os paralelepípedos da região Excluída de A.

A propagação das restrições é feita de forma a garantir a consistência de arco. Isto é conseguido pro-

pagando as restrições de cada variável sempre que o domínio dessa variável é alterado. A Figura 2.16

mostra em pseudo código o algoritmo usado. Este é uma adaptação do AC-3, em que foi alterado o

procedimento REVER e a inicialização da lista de arcos Q.

αk

αk

Zona de Exclusão

Região Permitida

Figura 2.14

Cálculo da zona de exclusão de um domínio à distância αk (representação bidimensional).

Domínio Original de A

Novo Domínio

de A

Vizinhança de B

Restrição Dentro

Região Permitida de A

Região Excluída

de A

Zona de Exclusão

de B

Adição à Região

Excluída de A

Restrição Fora

46

procedimento REVER(Vi,Vj) REMOVE <- falso; propagar restrição(j,i); se mudou Di então REMOVE <- verdadeiro; devolve REMOVE; fim REVER procedimento AC-3 Q <- {(Vi,Vj) em arcos(G),i≠j, Dj alterado}; enquanto não Q vazio selecciona e remove qualquer arco (Vk,Vm) de Q; se REVER(Vk,Vm) então Q <- Q união {(Vi,Vk) tal que (Vi,Vk) em arcos(G),i≠k,i≠m} fimse fimenquanto fim AC-3

Figura 2.16

Representação em pseudo código do algoritmo utilizado para manter consistência. Este algoritmo é baseado no AC-3 (26), mostrado na Figura 2.5.

No procedimento REVER já não são testados e removidos individualmente os valores do domínio que

não são suportados. Em substituição, é propagada a restrição de Vj em Vi da forma descrita acima,

conforme a restrição é Dentro ou Fora. Se o domínio Di sofre alteração devido a esta propagação, to-

dos os arcos de restrições que partem de Vi são adicionados à lista Q.

A inicialização da lista Q incluí apenas os arcos de variáveis cujo domínio foi alterado, quer por enu-

meração quer na fase de inicialização do cálculo, como se descreve na secção seguinte.

A consistência de arco é mantida para todas as restrições colocadas explicitamente no grafo. Existe,

num entanto, um restrição que não é tratada explicitamente; a impossibilidade de colocar dois átomos

na mesma posição. O modelo que proponho usa exclusivamente restrições binárias, e a forma de pro-

cessar esta restrição no modelo é convertê-la numa rede de restrições Fora unindo todos os pares de

átomos. O problema é que isto gera um número demasiado grande de restrições (da ordem do quadra-

do das variáveis) pelo que não é viável tratá-las explicitamente. Por isso estas restrições são propaga-

das apenas na enumeração de cada variável, não sendo mantida a consistência de arco para este caso.

2.4 Enumeração

Visto não ser mantida uma consistência completa, é necessário explorar as possibilidades de colocação

dos átomos. Esta exploração pode ser vista como uma pesquisa por uma árvore, em que cada nó cor-

responde à enumeração de uma variável (ver 2.2 Técnicas de Consistência). Como o domínio das

posições dos átomos não é discreto, não será dado um valor exacto à variável enumerada como no

exemplo da Figura 2.2. Se assim fosse, cada nó teria um número infinito de nós descendentes, o que

tornaria a pesquisa impossível. A enumeração consiste por isso em reduzir o domínio das variáveis até

se atingir a precisão desejada.

47

Em geral, quanto maior for a redução do domínio da variável em cada passo da enumeração, maior o

número de nós descendentes. Por outro lado, quanto menor for a redução do domínio, maior a profun-

didade da árvore de pesquisa para um dado valor de precisão final (ver Figura 2.17). Se não recorresse

à propagação das restrições, seria preferível reduzir a profundidade da árvore, o que reduziria o núme-

ro de nós visitados. Mas como em cada nó são propagadas as consequências da respectiva redução do

domínio, quanto maior a profundidade da árvore maior é a capacidade de corte desta propagação.

Assim, optei por dividir o domínio de cada variável em duas partes iguais em cada passo de enumera-

ção.

Figura 2.17

Para atingir a mesma precisão final, dividir o domínio em quatro partes (árvore da esquerda) gera mais descen-dentes por nó do que dividindo em duas partes (árvore da direita), mas produz uma árvore menos profunda.

O ciclo de enumeração consiste em:

1. Selecção de um átomo de acordo com a heurística de falha primeiro

2. Redução do domínio a metade. A metade é seleccionada de acordo com o princípio de

sucede primeiro.

3. Propagação das consequências da redução de domínio

Da selecção e redução de domínio excluem-se todos os átomos cuja posição esteja definida com a pre-

cisão desejada. Também se exclui provisoriamente qualquer átomo que tenha sido seleccionado para

enumeração num ciclo anterior, até que todos os átomos sejam seleccionados. Desta forma a selecção

para enumeração é feita em regime de rotatividade.

Assim o primeiro passo na enumeração consiste em seleccionar o átomo cujo domínio tenha o menor

volume, pois este corresponde á variável mais problemática. Isto corresponde á heurística de falha

primeiro, em que se tenta ordenar as variáveis de forma a detectar a falha o mais cedo possível.

O domínio é então dividido ao meio por um plano de corte perpendicular ao maior comprimento do

paralelepípedo que define a região Permitida. O novo domínio será uma a metade com menor sobre-

posição com domínios de outros átomos. Este é o princípio de sucede primeiro, pois este novo domí-

nio terá menor probabilidade de causar violações de restrições.

Após esta redução do domínio de um átomo, as restrições são propagadas como descrito na secção

anterior até atingir um novo ponto fixo.

48

A razão para seguir um regime de rotatividade na enumeração é discutida adiante (3.3 Heurística de

Enumeração, página 55), mas a ideia fundamental é que ao seleccionar o átomo com menor domínio e

em seguida reduzir o domínio para metade, é quase certo que esse seja o átomo seleccionado em se-

guida. Isto equivale na prática a atribuir ao átomo imediatamente um domínio com a dimensão final

desejada, que foi uma opção rejeitada por reduzir os efeitos da propagação de restrições. Assim todos

os domínios são reduzidos uma vez antes que qualquer domínio seja seleccionado pela segunda vez.

A enumeração é aplicada apenas aos átomos cujo domínio não esteja suficientemente reduzido. Qual-

quer átomo cujo domínio se possa incluir num paralelepípedo de dimensões predefinidas (tipicamente

de 2.5Å, ver 3.6 Dimensão Final dos Domínios, página 64) considera-se completamente enumerado e

é por isso excluído deste processo.

A escolha do novo domínio também é discutida em mais detalhe adiante (3.3 Heurística de

Enumeração, página 55). A heurística implementada consiste em somar os volumes da intersecção da

região Permitida do átomo a enumerar com as regiões Permitidas dos outros átomos. É escolhida a

metade candidata cujo volume total seja inferior, reduzindo desta forma a probabilidade de dois

átomos serem colocados no mesmo volume.

Como descrito na secção anterior, uma vez seleccionado o novo domínio é propagada uma restrição

Fora a todos os átomos com os quais não exista já uma restrição Fora explícita. Trata-se aqui de uma

situação de compromisso; é importante propagar para todos os átomos a informação que um átomo já

está a ocupar um determinado volume. No entanto é demasiado dispendioso garantir consistência de

arco neste caso, e por isso estas restrições só são propagadas no passo de enumeração de cada átomo.

Finalmente, o átomo enumerado é marcado como alterado, e a lista de arcos Q no algoritmo de

consistência (Figura 2.16) é inicializada com todas as restrições em que este esteja envolvido.

2.5 Retrocesso

Como a consistência de arco não garante a consistência completa do sistema, a enumeração é falível.

Uma falha é descoberta sempre que o domínio de um átomo fica vazio, indicando que é impossível

colocar esse átomo respeitando as restrições e os domínios dos outros átomos. Assumindo que o sis-

tema tem uma solução, isto indica que foi feita uma escolha errada durante a enumeração. É necessário

retroceder (Backtracking) na enumeração para corrigir esta decisão.

O retrocesso é feito repondo todos os valores dos domínios na altura da última enumeração. A última

enumeração é então repetida escolhendo a metade alternativa do domínio, que foi rejeitada da primeira

vez (como exposto em 2.4 Enumeração, a enumeração consiste em dividir o domínio em duas partes e

escolher uma para o novo domínio). Se um novo retrocesso é necessário e ambas as metades do domí-

nio nesta enumeração foram testadas, então o retrocesso prossegue até uma enumeração anterior em

que ainda haja uma região alternativa para testar.

49

Se este retrocesso prossegue para além da primeira enumeração feita, o sistema é considerado impos-

sível, pois nenhuma escolha permite a colocação de todos os átomos.

Se a qualquer momento não houver átomos para enumerar (por terem todos domínios de dimensões

inferiores ao mínimo predeterminado) o processo de enumeração é considerado completo e bem suce-

dido.

2.6 Minimização

Mesmo após terminada a enumeração, a posição de cada átomo ainda não está complemente determi-

nada, sendo definida pelo domínio da respectiva variável de posição. Para obter uma estrutura defini-

da, cada átomo é colocado no ponto central do seu domínio, e em seguida as posições de todos os

átomos são alteradas para minimizar a diferença entre a distância entre todos os pares de átomos uni-

dos por restrições e a distância esperada para esses átomos. Esta distância esperada é o valor médio do

intervalo de distância definido por cada par de restrições Fora e Dentro.

Para isto foi usado o algoritmo de minimização multidimensional de Powell (como descrito em 30).

Este algoritmo consiste em minimizar cada variável (cada coordenada de cada átomo) independente-

mente das outras, percorrendo todas as variáveis. Este ciclo é repetido até que a diferença entre duas

estruturas consecutivas seja suficientemente pequena. A Figura 2.18 mostra em pseudo código o algo-

ritmo de minimização.

procedimento MINIMIZA repete SOMA <- 0 para todos atomos Ai para todas coordenadas Cj C <- MINIMO(Cj, j) SOMA <- SOMA + (C-Cj)^2 Cj <- C fimpara fimpara ate SOMA < PRECISAO fim MINIMIZA

Figura 2.18

Representação em pseudo código do algoritmo de minimização

A função MINIMO devolve o valor da coordenada Cj, ao longo da direcção j do vector de coordena-

das, que minimiza as diferenças entre as distâncias ideais e as medidas para todas as restrições. Esta

função MINIMO é uma minimização linear pelo método da bissecção pela razão de ouro (30, Golden

Section Search in One Dimension, página 397).

50

2.7 Verificação da Quiralidade

A distância entre dois pontos numa estrutura é igual à distância entre as imagens desses pontos num

espelho. Assim, existem no mínimo duas soluções para um sistema possível de restrições de distância,

em que uma solução é a imagem espelhada da outra. Como já foi mencionado (ver 1.7 Quiralidade,

Página 25) apenas uma destas é desejável no caso de estruturas de proteínas.

Nesta fase de desenvolvimento e avaliação do método, a selecção entre as duas soluções foi sempre

feita por comparação com a estrutura alvo. A partir da solução produzida, a solução alternativa foi

criada invertendo o sinal de uma das coordenadas para cada átomo, e a solução mais semelhante à

solução alvo foi guardada. Este processo tem o mérito de ser extremamente simples de implementar, e

não distorce os resultados porque se uma estrutura for muito semelhante à estrutura alvo (o que acon-

teceu na maioria dos casos) a outra é forçosamente muito diferente, não havendo por isso o perigo de

estar artificialmente a melhorar os relutados obtidos com uma escolha tendenciosa.

Para uma futura aplicação a um caso real, este processo não poderá ser utilizado (não se conhece a

estrutura alvo). A solução neste caso será a análise da quiralidade dos centros quirais dos aminoácidos

ou de estruturas secundárias como as Hélices-α (ver 1.3 Estrutura Secundária., Página 20), que só

existem em sistemas biológicos numa das duas formas possíveis.

2.8 Discussão do Método

Nesta secção irei expor algumas das limitações e características inovadoras do método. Uma limitação

importante é o critério de consistência usado (2.2 Técnicas de Consistência), especialmente para o

caso particular da restrição que os átomos não se podem sobrepor. A modelação desta restrição como

uma rede de restrições Fora gera um número demasiado grande de restrições, pelo que nem é viável

manter a consistência de arco para este caso. No entanto é potencialmente viável garantir uma consis-

tência mais completa. Este tipo de situação é conhecido como "todos diferentes" (all different). Uma

restrição que imponha que todas as variáveis sejam diferentes têm propriedades que podem ser explo-

radas de forma a melhorar a eficiência. O predicado Diffn (8) é exemplo de um algoritmo para garantir

que um conjunto de blocos tridimensionais pode ser acomodado num espaço limitado. O problema

para a implementação de um sistema semelhante neste trabalho é que estes algoritmos operam invaria-

velmente em domínios finitos, e tornam-se impraticáveis em domínios com cardinalidade muito ele-

vada ou em problemas com muitas variáveis. A determinação de estruturas de proteínas é um proble-

ma precisamente com estas características e por isso, até à preparação deste documento, ainda não foi

explorada a implementação desta restrição global.

Outra limitação da presente implementação é o algoritmo de minimização. O problema principal é que

este algoritmo minimiza todas as restrições da mesma forma. No entanto as restrições associadas a

51

ligações covalentes são extremamente rígidas, e deviam ser tratadas como tal. O resultado é que este

algoritmo produz soluções com alguma distorção nas ligações químicas.

Por fim, uma potencial fraqueza do método é a heurística de ordenação de valores, descrita em 2.4

Enumeração, que dá prioridade, na divisão dos domínios, à metade que mais se afasta dos outros áto-

mos. O maior defeito desta heurística é assumir que todos os átomos que ficarão próximos na estrutura

final têm no modelo uma restrição Dentro. Se assim for, ao maximizar a distância entre eles dentro

dos limites das restrições impostas, não se incorre em qualquer erro, pois estas restrições não permi-

tem que os átomos se afastem demasiado. Mas em casos reais um grande número destas restrições

pode não estar incluída no modelo, o que em teoria é problemático. No entanto os testes feitos ao

método até ao momento indicam que na prática esta heurística é apropriada nos casos reais (ver 3.5

Dependência das Restrições, página 61, e 3.7 Outras Estruturas Testadas, página 70).

Este método tem duas características inovadoras. Em primeiro lugar, a sua natureza mista, que combi-

na um algoritmo construtivo, utilizando técnicas de processamento de restrições, com um algoritmo

reparativo, a minimização final. Isto permite colmatar duas dificuldades complementares nestas técni-

cas; tipicamente, a maior dificuldade dos algoritmos construtivos em domínios contínuos será obter

soluções com grande precisão, enquanto que o problema nos algoritmos reparativos é essencialmente a

pesquisa pelo espaço de possibilidades. O método que proponho consiste numa redução inicial do

espaço de procura, seguida por uma minimização que aproveita esta informação como ponto de parti-

da. Como descrevo no próximo capítulo (3.7 Comparação com DYANA, página 67), esta combinação

melhora consideravelmente o desempenho.

A outra inovação é a representação dos domínios, como descrito em 2.3 Adaptação do Modelo. Está

descrita na literatura uma representação alternativa para problemas em domínios contínuos (31). Nes-

ta, um domínio é representado por uma árvore em que cada nó corresponde a um cubo (no caso tridi-

mensional), e pode ter até oito descendentes, correspondendo cada um destes a um octante deste cubo.

Por isto esta forma de representar um domínio designa-se por Octree (Quadtree para o caso bidimen-

sional). Como cada um dos descendentes corresponde por sua vez também a um cubo, esta representa-

ção permite, em teoria, uma precisão arbitrária, dependendo apenas da profundidade da árvore (as

regiões pertencentes ao domínio são aquelas representadas pelos nós folha).

A vantagem desta representação é a sua flexibilidade, pois permite representar qualquer forma no

espaço. No entanto, o seu carácter genérico não permite tomar partido de certas características do

domínio. No caso deste trabalho, devido às simplificações feitas às restrições de distância (ver 2.3

Adaptação do Modelo) o domínio pode ser representado exclusivamente por paralelepípedos. Desta

forma a representação é muito mais simples que pelo método das Octrees. Este assunto é discutido em

mais detalhe na secção 3.2 Representação dos Domínios (página 54).

52

3. Resultados

"Resultados! Homem, tenho imensos resultados. Já sei de milhares de coisas que não funcionam."

Thomas A. Edison

A fase inicial deste trabalho foi essencialmente uma exploração de hipóteses alternativas, a grande

maioria das quais foi rejeitada antes mesmo do método estar delineado. Uma análise exaustiva desses

"rascunhos" não seria útil. Mas durante a fase intermédia em que o algoritmo implementado já conse-

guia resolver algumas estruturas, foi necessário optar entre várias alternativas como heurísticas de

enumeração ou valores de parâmetros. Este capítulo mostrará algumas das alternativas exploradas,

justificando as escolhas feitas com os resultados obtidos, e uma análise do desempenho do método

como descrito no capítulo anterior.

3.1 Estrutura de Teste

Para a maioria dos testes apresentados neste capítulo, a estrutura escolhida foi a cadeia de aminoácidos

de um monómero da Dessulforedoxina. Esta proteína bacteriana (Dessulfovibrio gigas) reunia três

vantagens. A estrutura é conhecida, determinada quer por cristalografia Raios-X (2) quer por

Ressonância Magnética Nuclear (16). É uma proteína pequena, o que facilitou a execução de múltiplos

testes, e é uma estrutura com a qual estou familiarizado, o que permitiu em muitas situações uma

rápida avaliação qualitativa dos resultados.

Cada monómero contem um grupo prostético (ver 1.6 Outros Elementos Estruturais, Página 24), que é

neste caso um átomo de Ferro. A presente implementação não modela ainda qualquer grupo prostético,

e por isso este átomo foi ignorado, considerando assim no modelo apenas a cadeia de aminoácidos de

um monómero.

Também foram ignorados os átomos de Hidrogénio, como descrito em 2.1 Modelação do Problema

(Página 30). A estrutura usada para teste consiste assim numa cadeia de 36 aminoácidos, com 261

átomos. A Figura 3.1 ilustra a estrutura da Dessulforedoxina e o monómero usado para teste.

As restrições usadas foram no total 4950 (2475 restrições Fora e 2475 restrições Dentro), sendo:

2404 restrições obtidas da estrutura conhecida de cada aminoácido.

1273 restrições Dentro entre todos os pares de átomos na estrutura que na proteína estão ligados a

átomos de Hidrogénio e que se encontram a uma distância inferior a 6Å. Este processo simula as res-

trições fornecidas por RMN num caso ideal, em que a interacção dos átomos de Hidrogénio permitia

detectar a proximidade destes. Num caso real a distância obtida entre átomos de Hidrogénio seria fa-

53

seria facilmente convertida numa distância máxima entre os átomos a que estes estão ligados, pois

cada átomo de Hidrogénio pode ligar-se apenas a um átomo. O valor de distância para cada uma destas

restrições é de 120% da distância medida na estrutura de Raios-X, previamente conhecida. Esta

margem adicional de 20% simula a incerteza na conversão da intensidade do pico cruzado em

distância.

1273 restrições Fora associadas às restrições Dentro obtidas por simulação dos dados de RMN. Devi-

do à incerteza nos valores de distância obtidos na prática por RMN, seria em princípio arriscado impor

restrições de distância mínima com base nos dados experimentais. Por isso na presente implementação

estas restrições são consideradas como uma imposição explicita da restrição que os átomos não se

podem sobrepor, e não se considera assim que derivem directamente dos dados experimentais. A

justificação para impor explicitamente estas restrições é que os átomos com restrições Dentro terão,

em princípio, mais propensão para se sobrepor, pois estas restrições vão obrigar o algoritmo a manter

estes átomos em proximidade. No entanto, é importante salientar que os resultados com esta estrutura

de teste não suportam esta hipótese (ver 3.4 Sobreposição de Átomos). É possível que a heurística de

enumeração seja suficiente para resolver este potencial problema, pelo que a incorporação destas res-

trições será algo a estudar em mais detalhe no futuro. Para além disto, é teoricamente possível usar a

informação experimental para obter valores mínimos de distância e não apenas valores máximos. Se

na prática isto for viável, estas restrições virão também directamente dos dados experimentais.

Figura 3.1

À esquerda a estrutura da Dessulforedoxina. Os dois monómeros, na realidade idênticos, estão representados a verde e azul. Cada monómero contém um átomo de Ferro, representado a vermelho. À direita a estrutura de tes-te, que consiste num monómero sem os átomos de Hidrogénio e sem o Ferro prostético. Esta estrutura contêm 261 átomos. A escala indicada é em Ångstrom.

54

Salvo especificação em contrário, todos os resultados apresentados foram calculados num processador

Pentium a 133MHz.

3.2 Representação dos Domínios

Como já foi mencionado (2.8 Discussão do Método, página 50), foi considerada uma forma alternativa

de representar os domínios das variáveis, utilizando as técnicas de Octrees (31) em vez da representa-

ção escolhida, por conjuntos de paralelepípedos. A diferença de desempenho entre estas alternativas

depende principalmente da complexidade das representações dos domínios das variáveis. Quanto mais

complexos estes forem, mais demoradas as operações de propagação de restrições.

Antes de apresentar as razões que me levaram a optar pela representação usada, descreverei primeiro

esta técnica de representação de domínios em árvore para o caso a duas dimensões (Quadtrees). Cada

nó da árvore representa uma quadrado no plano, e cada nó pode ter até quatro nós descendentes, cor-

respondendo aos quatro quadrantes do quadrado. Å Figura 3.2 mostra a representação por este método

de uma região elíptica. Como se pode ver, é possível aproximar a uma precisão arbitrária qualquer re-

gião aumentando a árvore.

Figura 3.2

Três representações em árvore do domínio representado a laranja. O nó raiz corresponde ao quadrado maior. Os nós a cinzento representam o domínio. Da esquerda para a direita aumenta a precisão da representação.

Esta capacidade de representar qualquer domínio com precisão arbitrária é por vezes muito importan-

te, mas acarreta um custo na complexidade da representação. Como podemos ver na figura, para repre-

sentar a região rectangular que contêm a elipse (árvore da direita) é necessária uma árvore com três

níveis e seis nós. Mesmo para representar uma região rectangular o problema poderia ser idêntico no

caso (muito provável) que a fronteira da região não coincidisse exactamente com as fronteiras entre as

regiões correspondentes aos nós.

Uma estimativa da complexidade da árvore necessária para representar os domínios das posições dos

átomos foi feita medindo as variações de volume destes domínios. Usando a estrutura de teste foi

55

gerado o histograma mostrado na Figura 3.3. Cada classe representa uma gama de volumes, e este grá-

fico mostra o número variações de volume dos domínios das variáveis para cada classe. Os valores

numéricos das classes são o logaritmo de base 8 dos volumes correspondentes, criando assim uma

divisão logarítmica de classes. Isto parece uma representação estranha, mas justifica-se se considerar-

mos que cada nó numa Octree tem um volume oito vezes menor que o nó anterior. Assim cada classe

no gráfico da Figura 3.3 representa um nível numa Octree, assumindo para simplificar que as divisões

de volumes seriam todas cúbicas, caso ideal para uma Octree. Esta premissa não é realista, mas dá nos

uma medida para a complexidade mínima da árvore que seria necessária para manter a mesma preci-

são que o método aqui implementado (2.3 Adaptação do Modelo, página 40).

A unidade usada foi a resolução da representação por paralelepípedos, por isso a classe 0 corresponde

a um volume de 10-6Å3, e cada classe seguinte a um volume 8 vezes maior que a classe anterior. No

entanto este valor é irrelevante, apenas determinando a posição do gráfico no eixo das abcissas.

1

10

100

1000

10000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Variação de Volume (Log 8)

Num

ero

de o

corr

ênci

as

Figura 3.3

Histograma da variação no volume dos domínios pela propagação de restrições. A escala das abcissas é logarít-mica de base 8. Quadro A.1, Página 84

O que é relevante é a gama de valores que a variação de volume pode tomar, abrangendo 11 classes,

ou seja, 11 níveis de uma hipotética Octree com capacidade de representar esta gama de variações. Se

cada nó desta Octree tivesse apenas 2 nós filhos (de um máximo de 8), a representação teria 2048 nós.

É certo que nem todas as árvores usadas necessitariam de 11 níveis, mas a representação que proponho

para este método necessita em média de apenas 2 paralelepípedos por domínio, e é extremamente pro-

vável que o recurso a Octrees gerasse representações mais complexas. Por isso estes resultados dão

bastante confiança que, para este problema, a representação por paralelepípedos é uma escolha

apropriada.

56

3.3 Heurística de Enumeração

Como já foi descrito (ver 2.4 Enumeração, Página 46), para enumeração é seleccionado primeiro o

átomo com o domínio mais reduzido. Em seguida o domínio deste é dividido em duas partes seme-

lhantes, e uma é seleccionada para ser o novo domínio. Nesta secção descreverei alguns dos resultados

que ajudaram a implementar as duas heurísticas; sucede primeiro para a ordenação de valores e falha

primeiro para a ordenação das variáveis.

3.3.1 Ordenação dos Valores

Se bem que a conceito de sucede primeiro seja de aplicação geral, a implementação da heurística de

escolha entre as duas partes do domínio seria forçosamente específica deste problema de determinação

de estruturas moleculares. Duas alternativas foram consideradas; ou escolher apenas pela ordem pela

qual as duas partes eram geradas, ou escolher em primeiro lugar a parte do domínio que menos ocupa-

da por domínios de outros átomos.

A primeira alternativa consistia simplesmente em separar o domínio em dois domínios e escolher o

primeiro destes. Se eventualmente isto resultasse num sistema impossível, quando o programa voltasse

a esta escolha por retrocesso (ver 2.5 Retrocesso, Página 48) o segundo seria então escolhido. A ordem

de escolha, nesta alternativa, é irrelevante. Esta seria uma heurística por defeito caso nenhuma outra

heurística melhorasse consistentemente o desempenho.

Na segunda alternativa são somados os volumes das regiões Permitidas (ver 2.3 Adaptação do

Modelo, página 40) dos domínios de outras variáveis que intersectam cada uma das duas partes do

domínio da variável seleccionada, e é escolhida a parte cujo volume total das intersecções seja menor.

Isto tende a afastar os domínios dos átomos, colmatando de certa forma a deficiente propagação da

restrição implícita que proíbe as sobreposições. Tal como no caso alternativo, se a execução voltar por

retrocesso a esta escolha, a outra parte do domínio será então escolhida. Esta é uma implementação

específica para este problema da heurística de sucede primeiro, pois a região com menor probabilidade

de causar violações é a menos ocupada. Isto deve-se à propagação tardia das restrições Fora, que só

podem ser propagadas quando o domínio está suficientemente reduzido para gerar zonas de exclusão.

Ao manter os átomos afastados evita-se que, mais tarde, surjam conflitos que forcem o retrocesso.

A Figura 3.4 mostra o tempo medido para estruturas de tamanho variável entre 2 e 32 aminoácidos.

Estas estruturas foram geradas usando a parte inicial (terminal amina) da estrutura de teste (ver 3.1

Estrutura de Teste). Dois efeitos contribuem para a diferença de desempenho entre as duas heurísticas.

Para estruturas maiores, neste caso acima dos 32 aminoácidos, a heurística de escolha pela ordem de

geração resulta facilmente em enumerações inconsistentes, e o número excessivo de retrocessos impe-

de, na prática, a resolução.

57

Para estruturas menores isto não é um problema, pois existem menos átomos e menos restrições; para

os casos com menos de 32 aminoácidos não houve diferença significativa entre o número de retroces-

sos. Neste caso o que reduz o desempenho da heurística de escolha por ordem de geração é o aumento

no número de paralelepípedos necessários para descrever os domínios. Evidentemente, a heurística de

escolher as regiões mais afastadas de outros domínios reduz substancialmente a propagação das restri-

ções Fora, o que por sua vez resulta em domínios formados por um número menor de paralelepípedos,

020406080

100120140160180200

2 7 12 17 22 27 32

Numero de Aminoácidos

Tem

po (

s)

Escolha por ordem de geração

Escolha por sobreposição de domínios

Figura 3.4 Este gráfico mostra o tempo de cálculo em função do número de aminoácidos para cada heurística. A diferença no desempenho acentua-se com o aumento no tamanho da estrutura. Quadro A.2, Página 84

A Figura 3.5 mostra como a heurística por ordem de geração produz invariavelmente um número mai-

or de paralelepípedos por domínio.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

2 7 12 17 22 27 32

Numero de Aminoácidos

Num

ero

de P

aral

elep

íped

os Escolha por ordem de geração

Escolha por sobreposição de domínios

58

Figura 3.5

Este gráfico mostra o número médio de paralelepípedos nos domínios em função do tamanho da estrutura para as duas heurísticas de enumeração. Quadro A.3, Página 85

A razão para esta diferença é os átomos ficarem em média mais afastados, tanto quanto as restrições

Dentro o permitem, no caso da escolha por sobreposição de domínios. Desta forma a propagação de

restrições Fora é menos frequente, o que reduz em média a dimensão das regiões Excluídas dos domí-

nios. O tempo de cálculo é reduzido não só porque as restrições Fora tem que ser propagadas menos

vezes, mas também porque quanto mais simples forem os domínios mais rápida é a propagação das

restrições.

3.3.2 Ordenação das Variáveis

A escolha da variável mais restrita (first fail) é uma heurística clássica bem documentada na literatura

(32, 19), aplicável na generalidade dos problemas. Por isso as variáveis são escolhidas de acordo com

esta heurística. A implementação desta heurística consiste em seleccionar para enumeração a variável

com o menor domínio. No entanto esta enumeração é feita em regime de rotatividade, em que todos as

variáveis são enumeradas uma vez antes que qualquer variável seja enumerada segunda vez (ver 2.4

Enumeração, Página 46). As duas opções seriam assim a enumeração sequencial por falha primeiro,

em que seria permitido enumerar o mesmo átomo várias vezes consecutivas, ou uma enumeração por

rotatividade, em que um átomo enumerado ficaria excluído da enumeração até que todos os outros fos-

sem enumerados uma vez. A Figura 3.6 mostra a comparação do desempenho das duas heurísticas

alternativas, em ambos os casos escolhendo na enumeração a parte do domínio menos ocupada por

domínios de outros átomos. O teste foi feito apenas para estruturas até 14 aminoácidos porque para

tamanhos superiores uma enumeração sequencial demorava demasiado tempo.

020406080

100120140160180200

2 10 18 26

Numero de Aminoácidos

Tem

po (

s)

Enumeração sequencial

Enumeração por rotatividade

05

1015202530354045

2 10 18 26

Numero de Aminoácidos

Num

ero

de P

aral

elep

íped

os

Enumeração sequencial

Enumeração por rotatividade

Figura 3.6

Gráficos do tempo e número médio de paralelepípedos nos domínios em função do tamanho da estrutura para as duas heurísticas de selecção de átomos para enumeração. Quadro A.4, Página 85

59

O tempo de cálculo para a enumeração sequencial é maior devido ao grande aumento na complexidade

dos domínios. Quando um átomo é enumerado o seu domínio diminui para metade, tornando muito

provável que esse átomo seja seleccionado diversas vezes consecutivas. Desta forma o domínio de um

átomo é drasticamente reduzido enquanto os domínios de outros átomos, na sua maioria, praticamente

constantes. As restrições Fora no átomo a ser enumerado são então propagadas a muitos outros áto-

mos, aumentando o número de paralelepípedos que define a zona Excluída destes.

Na enumeração por rotatividade todos os domínios já estão significativamente reduzidos quando as

restrições Fora começam a ser propagadas. Assim muitos domínios já não intersectam com a zona de

exclusão do átomo enumerado, o que limita muito o aumento na complexidade dos domínios.

3.4 Sobreposição de Átomos

Numa estrutura molecular os átomos não se podem sobrepor. A heurística de escolha de domínios na

enumeração tem aqui um papel importante, tendendo a afastar os átomos o máximo permitido pelas

restrições como vimos em 3.3 Heurística de Enumeração. Também importante é o conjunto de restri-

ções Fora que se incluem no modelo. Grande parte destas surge da informação estrutural dos vários

aminoácidos, disponível a priori, que permite que todos os átomos pertencentes ao mesmo aminoácido

estejam relacionados por restrições Fora e Dentro. Os valores de distância para estas restrições são

função da estrutura dos diferentes aminoácidos.

As restantes restrições Fora são impostas explicitamente associadas às restrições Dentro obtidas por

RMN (neste caso a partir de estruturas conhecidas, simulando os dados que poderiam ser obtidos por

RMN, como descrito em 3.1 Estrutura de Teste) ou de uma forma não explícita entre todos os átomos

que não estejam relacionados por qualquer restrição. Estas restrições têm a função exclusiva de impe-

dir a sobreposição dos átomos que nem estão ligados covalentemente nem pertencem ao mesmo ami-

noácido, e os valores de distância para estas restrições são um parâmetro que tem que ser ajustado.

Nesta secção mostrarei os resultados que levaram à escolha de um valor de 1.5Å para a distância (αk

na Equação 2.4, Pág. 41) para este conjunto de restrições Fora. Os valores de distância para as

restantes restrições Fora foram obtidos directamente das estruturas dos aminoácidos e não foram

ajustados.

60

0

100

200

300

400

500

600

700

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3Distância (Angstrom)

Tem

po (

s)

Figura 3.7

Gráfico do tempo de cálculo para diferentes valores de distância para as restrições Fora impostas. Quadro A.5, Página 86.

No modelo foi assumido o mesmo valor de distância para todas estas restrições Fora impostas para

impedir a sobreposição de átomos. Usando a estrutura de teste descrita atrás (3.1 Estrutura de Teste)

foi resolvido o sistema de restrições com diferentes valores de distância. A Figura 3.7 mostra o tempo

de cálculo em função do valor de distância.

Como se pode ver, o tempo de cálculo aumenta lentamente aproximadamente até um valor de cerca de

2Å, a partir do qual o aumento é mais acentuado.

Também foram avaliadas as soluções obtidas, comparando-as com a estrutura alvo. A diferença entre

estruturas de macro-moléculas é normalmente medida pela raíz quadrada da média dos quadrados das

distâncias (RMQD, em Inglês RMSD Root Mean Square Deviation) entre átomos equivalentes quando

as estruturas são sobrepostas. Se as estruturas forem exactamente iguais, as distâncias entre átomos

equivalentes serão todas nulas, e por isso o valor da RMQD será também nulo. Regra geral para

proteínas duas estruturas são consideradas bastante semelhantes se o valor de RMQD obtido para os

átomos Carbono e Azoto da cadeia principal da proteína (ver 1.2 Estrutura Primária, Página 16). A

Figura 3.8 mostra a qualidade das soluções obtidas em função do valor de distância para as restrições

em causa.

61

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3Distância (Angstrom)

RM

QD

(A

ngst

rom

)

Figura 3.8

Gráfico da Raíz da Média do Quadrado da Distância (RMQD) entre a cadeia principal da estrutura alvo e a solu-ção calculada em função da distância para as restrições Fora impostas. Quadro A.5, Página 86.

A qualidade das soluções é óptima para valores até 1.5Å, e significativamente pior para valores supe-

riores (se bem que com uma dependência algo errática). Para valores superiores a 1.5Å o modelo co-

meça afastar-se da realidade química. Impor uma restrição de distância mínima entre os núcleos dos

átomos com um valor muito elevado vai inevitavelmente distorcer o modelo, pelo que é fácil com-

preender esta perda de qualidade para estes valores.

Mais complexo é o que se passa a valores inferiores. Os resultados apresentados na Figura 3.8 pare-

cem indicar que este parâmetro é irrelevante para valores abaixo de 1.5Å. No entanto a qualidade das

soluções nesta gama de valores deve-se à abundância de restrições. Nestas condições a heurística de

redução de domínio usada na enumeração (ver 2.4 Enumeração, Página 46) e a minimização após a

resolução das restrições bastam para evitar sobreposições entre átomos. No entanto trata-se de uma

situação ideal que infelizmente não é representativa da realidade. É quase certo que numa aplicação

prática deste método o conjunto de restrições não contenha todas as restrições potencialmente detectá-

veis por RMN. Por isso o valor escolhido para parametrizar estas restrições foi de 1.5Å, por ser o valor

que torna o modelo menos dependente da abundância de restrições e por estar de acordo com a

realidade química.

Como descrito atrás (3.1 Estrutura de Teste), algumas destas restrições são impostas explicitamente

associadas a restrições Dentro obtidas por RMN (ou, neste caso, por simulação). Intuitivamente, áto-

mos unidos por restrições Dentro terão maior probabilidade de sobreposição, e desta forma a restrição

Fora de 1.5Å é imposta explicitamente para contrariar esta tendência. No entanto, nesta estrutura de

teste, nenhuma diferença prática foi detectada entre impor ou não explicitamente estas restrições. É

possível que a heurística de enumeração e a optimização consigam resolver este problema sem que

isto seja necessário, mas no presente método decidi manter esta imposição explícita porque o reduzido

62

reduzido custo associado (cerca de 3% do tempo total, sendo menos de metade do número total de

restrições Fora. Ver adiante 3.6 Desempenho) é, a meu ver, compensado pela possibilidade deste

procedimento ser vantajoso em geral. Afinal, o efeito deste procedimento foi até ao momento testado

em apenas uma estrutura, o que não permite concluir com confiança que será inútil também em outros

casos.

3.5 Dependência das Restrições

A simulação de restrições experimentais (3.1 Estrutura de Teste) é útil para a parametrização do méto-

do, mas é essencial que o método seja capaz de lidar com sistemas em que o número de restrições en-

tre átomos não ligados seja mais reduzido, pois são essas as condições que se observam na prática.

A Figura 3.9 mostra a qualidade das soluções obtidas quando algumas restrições foram removidas ale-

atoriamente. Cada restrição foi removida com uma probabilidade variável entre 10% e 80%, em múlti-

plos de 10%. O cálculo da estrutura foi repetido dez vezes para cada valor de probabilidade (para um

total de 80 pontos no gráfico), pois de cada vez diferentes restrições eram rejeitadas, e o número de

restrições rejeitadas também variava ligeiramente.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Restrições Removidas

RM

QD

(A

ngst

rom

)

Figura 3.9

Gráfico da Raíz da Média do Quadrado da Distância (RMQD) entre a cadeia principal da estrutura alvo e a solu-ção calculada em função da fracção de restrições removidas. Quadro A.6, Página 86.

Como o gráfico mostra, a qualidade das soluções obtidas é muito sensível à remoção de algumas res-

trições críticas (pois mesmo removendo apenas 10% das restrições muitas soluções têm uma qualidade

inaceitável, com valores de RMQD significativamente superiores a 1Å), mas pouco sensível à remo-

ção de alguns conjuntos grandes de restrições (mesmo para valores de 70% de restrições removidas,

algumas soluções tinham valores de RMQD próximos de 1Å).

63

Este resultado é compreensível, pois é natural que alguns conjuntos de restrições tenham um papel

crucial para definir a estrutura. Se for retirada alguma destas restrições a qualidade do resultado é infe-

rior. À primeira vista é um resultado desanimador, pois sabemos que na prática não são conhecidas

todas as restrições que a RMN potencialmente fornece. Numa aplicação real uma fracção considerável

seria excluída à partida por limitações experimentais. Se esta exclusão for aleatória o resultado pode

ser desastroso. Mas esta condição não é inteiramente realista, pois a intensidade dos picos cruzados

(ver 1.8 Ressonância Magnética Nuclear, Página 25) é dependente da distância, sendo maior quanto

menor for a distância entre os átomos. Regra geral, podemos assumir que uma restrição terá mais

probabilidade de ser detectada experimentalmente quanto mais intenso for o pico cruzado obtido no

espectro de RMN, ou seja, quanto menor for a distância.

Isto significa que a exclusão de restrições que se espera na prática não é completamente aleatória. Se

bem que parcialmente aleatória, o factor mais importante para determinar se a restrição é detectada

será a distância entre os átomos. Para testar esta hipótese as restrições obtidas experimentalmente para

o dímero da Dessulforedoxina (16, dados cedidos por Brian Goodfellow) foram comparadas com as

restrições simuladas como descrito atrás (3.1 Estrutura de Teste). Chamo a atenção para o facto desta

estrutura ser diferente da estrutura de teste (trata-se do dímero, com as duas cadeias de aminoácidos), e

o número total de restrições ser maior.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

<3 3 a 4 4 a 5 5 a 6

Distâncias das restrições (Angstrom)

Núm

ero

de R

estr

içõe

s

Simulação

Experimental

Figura 3.10

Histograma com o número de restrições obtidas por simulação e experimentalmente para quatro gamas de dis-tância. Quadro A.7, Página 87.

A Figura 3.10 mostra esta comparação. Foram consideradas apenas restrições com distâncias até 6Å

de acordo com o método de simulação descrito em 3.1 Estrutura de Teste.

64

0

1

2

3

4

5

6

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Restrições Removidas

RM

QD

(A

ngst

rom

)

Figura 3.11

Variação da qualidade da solução obtida em função da fracção de restrições removidas. Quadro A.8, Página 87.

Este resultado confirma a hipótese que as restrições de menor distância são na sua maioria detectáveis

experimentalmente. É por isso mais adequado simular uma situação real removendo restrições em fun-

ção dos seus valores de distância do que duma forma aleatória. A Figura 3.11 mostra a variação na

qualidade da solução obtida em função da fracção de restrições removidas. Neste caso para cada ponto

foram removidas as restrições com distância superior a um valor de corte, aumentando-se a fracção

removida reduzindo o valor de corte.

Uma simulação mais realista consiste em retirar as restrições aleatoriamente, mas com uma probabili-

dade dependente da distância da restrição, reproduzindo a proporção verificada experimentalmente

como se mostra na Figura 3.10.

0123456789

10

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Restrições removidas

RM

DQ

(A)

Média

+ Desvio Padrão

- Desvio Padrão

Esperado experimentalmente

65

Figura 3.12

Qualidade da solução obtida em função da fracção de restrições usadas. Indica-se a média e a média a mais e a menos um desvio padrão para os dez valores calculados a cada ponto. Quadro A.9, Página 87.

No gráfico mostra-se também a proporção de restrições disponíveis experimentalmente (16% das obti-

das por simulação). Este pequeno número de restrições, quando seleccionadas aleatoriamente, gera

soluções de fraca qualidade. No entanto é de salientar que as restrições produzidas experimentalmente

não são aleatórias, pois a atribuição dos picos é revista até ser possível gerar uma estrutura suficiente-

mente restrita. Além disso, apenas foram consideradas no modelo restrições entre átomos a menos de

6Å de distância (ver 3.1 Estrutura de Teste). Isto é uma aproximação apropriada para a maioria das

restrições, pois como mostra a Figura 3.11 as restrições entre átomos mais distantes são apenas uma

pequena fracção. Mas mesmo um número pequeno de restrições entre átomos a mais de 6Å de distân-

cia pode ser importante para restringir a estrutura. Por estas razões (por não ser aleatória a selecção e

por não se restringirem a restrições com menos de 6Å), as restrições de origem experimental podem

definir adequadamente a estrutura, como se mostra adiante (3.7 Outras Estruturas Testadas).

3.6 Dimensão Final dos Domínios

Como foi descrito anteriormente (ver 2.4 Enumeração, Página 46) a fase de processamento de restri-

ções é terminada quando todos os domínios dos átomos têm uma dimensão suficientemente pequena,

sendo em seguida o resultado optimizado por minimização. O valor deste parâmetro (dimensão final

do domínio) determina o tempo de cálculo tanto para a fase de processamento de restrições, pois quan-

to menor for este valor mais prolongada será esta fase, como a fase de optimização, pois quanto maior

o valor mais longe de um mínimo local estará a estrutura a minimizar.

A parametrização deste valor será assim um compromisso entre os tempos de cálculo nas duas fases

(processamento de restrições e optimização), de forma a que o tempo total seja minimizado.

Um outro factor a considerar é a qualidade das soluções obtidas. Se a fase de propagação de restrições

for terminada prematuramente, ou seja, se este parâmetro de dimensão final tiver um valor muito ele-

vado, a solução fornecida para optimização pode estar demasiado longe da estrutura correcta para que

o algoritmo de optimização consiga gerar uma estrutura aceitável. A Figura 3.13 mostra a variação do

tempo de cálculo e da qualidade da estrutura obtida em função deste parâmetro.

66

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

1.01.52.02.53.03.54.04.55.0

Diâmetro Final (A)

RM

DQ

(A

)

0

20

40

60

80

100

120T

empo

(s)

Tempo (s)

RMDQ (A)

Figura 3.13

Variação da qualidade da solução obtida e do tempo total de cálculo em função da dimensão final dos domí-nios na fase de processamento de restrições. O gráfico mostra os resultados para três valores de distância para as restrições Fora impostas para evitar sobreposição atómica. Quadro A.10, página 88.

O tempo de cálculo diminui, em geral, sempre que a dimensão final dos domínios é aumentada, mas a

partir de um valor de aproximadamente 3Å a qualidade da solução obtida é variável. O valor óptimo

para este parâmetro seria ligeiramente superior a 3Å, valor para o tempo de cálculo é menor para a

zona em que as soluções são de qualidade aceitável.

Esta análise foi feita apenas com uma estrutura, e é por isso arriscado generalizar estes resultados. As-

sim o valor escolhido foi 2.5Å. Isto aumenta a confiança nos resultados para o caso geral, apenas com

um custo acrescido de cerca de 15% do tempo de cálculo em relação ao valor de 3Å.

Uma parametrização mais rigorosa exigiria naturalmente a repetição desta análise para várias estrutu-

ras. No entanto a prioridade é aperfeiçoar o algoritmo de optimização, e só depois se justifica uma

determinação mais cuidada deste valor, pois este está dependente do algoritmo de minimização.

3.6 Desempenho

O tempo despendido nas várias operações durante o cálculo da estrutura teste foi determinado inter-

rompendo a execução a cada 100ms e registando a fase corrente do programa. Como a periodicidade

desta interrupção e o tempo de execução em cada operação são ligeiramente variáveis (devido à exe-

cução concorrente de rotinas do sistema operativo), foi calculada a média para quatro execuções do

programa. A Figura 3.14 mostra esquematicamente a proporção do tempo de cálculo das fases princi-

pais em relação ao tempo total.

67

Figura 3.14

Proporção do tempo de cálculo para várias fases em relação ao tempo total de 69.3 segundos. Para maior detalhe ver Quadro A.11, página 88.

A característica mais saliente é a proporção total das várias fases de cálculo ser relativamente pequena

(cerca de metade do tempo total). Isto deve-se em parte aos processos como representação gráfica do

progresso, registo de estatísticas como as mostradas neste capítulo e as próprias rotinas de interrupção

e contagem do tempo despendido. Todos estes processos são supérfluos para o cálculo de estruturas,

estando apenas presentes nesta fase para auxiliar a avaliação do programa.

Pode-se ver também que o tempo despendido na optimização é muito reduzido (2.5%), o que indica

que este algoritmo pode ainda ser substancialmente melhorado sem perigo de aumentar significativa-

mente o tempo total de cálculo.

A propagação das restrições Fora que não estão explicitamente incluídas no sistema de restrições (ver

3.4 Sobreposição de Átomos), é feita apenas na fase de enumeração, e ainda assim requer uma fracção

significativa do tempo de cálculo. Estas restrições foram propagadas em média, para esta estrutura (ver

3.1 Estrutura de Teste), 237 vezes para cada enumeração, um número próximo do total de 261 átomos

na estrutura. As restrições Fora explicitamente impostas no problema foram propagadas aproximada-

mente 9 vezes para cada átomo (total de 2475 restrições fora explícitas para 261 átomos). Assim, se

estas restrições não explícitas fossem propagadas da mesma forma que as restrições Fora explícitas, o

tempo de cálculo destas restrições seria cerca de 25 vezes maior que o presente tempo de cálculo para

as restrições Fora explícitas (são 237 propagações por átomo em vez de apenas 9) o que iria triplicar o

tempo total de cálculo. Além disso o tempo de propagação destas restrições não explícitas aumenta

numa progressão quadrática com o número de átomos, pois o número destas restrições por átomo é

aproximadamente igual ao número total de átomos. Assim estas restrições não são impostas explicita-

mente, mas sim propagadas apenas na enumeração de cada átomo.

Por último, é aparente que a fase de enumeração é responsável por uma fracção significativa, seme-

lhante ao tempo total de propagação de restrições. Isto deve-se em parte à propagação das restrições

Fora não explícitas durante a enumeração e à escolha do novo domínio, mas cerca de metade do tem-

po de enumeração e oucupado a guardar o estado corrente de todos os átomos caso seja necessário re-

Partição do Domínio

Propagação Fora não explícita

Escolha de Domínio

Propagação Fora

Propagação Dentro

Retrocesso Optimização

Tempo Total, incluindo represen-tação gráfica da dimensão dos do-mínios e do progresso do cálculo, gestão de memória e acesso a fi-cheiros.

68

necessário repetir esta enumeração devido a um eventual retrocesso. Guardar simplesmente os

domínios de todos os átomos implicaria um uso excessivo de memória, pois tipicamente serão

guardados centenas de pontos de escolha (313 para o caso da estrutura de teste). Nesta implementação

o presente ponto de escolha é comparado com o anterior, e o ponto de escolha anterior é modificado

de forma a guardar apenas as diferenças entre o anterior e o presente, pois essa informação é suficiente

para reconstruir o estado do sistema a cada ponto de escolha. Desta forma o uso de memória é

reduzido para aproximadamente 5%, (1.1Mb para o cálculo da estrutura de teste usando este

processo), com um custo aceitável em tempo de execução (cerca de 5 segundos, 7% do tempo total,

para a estrutura de teste).

3.7 Comparação com DYANA

O método aqui proposto foi comparado com DYANA (17), a aplicação comercial usada de momento

no Departamento de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia para o cálculo de estruturas de

proteínas a partir de restrições de RMN. O método base desta aplicação é minimizar as violações às

restrições impostas. Uma estrutura inicial gerada aleatoriamente é minimizada por simulated

annealing, alterando iterativamente os ângulos de torção (ver 1.1 Ligação Covalente, Página 15) das

ligações químicas com liberdade de rotação. Estas são fundamentalmente as ligações C-C e C-N dos

átomos de cada aminoácido que formam a cadeia principal da proteína (a ligação peptídica entre

aminoácidos é considerada rígida. Ver 1.2 Estrutura Primária, Página 16), e algumas ligações nas

cadeias laterais de certos aminoácidos. Todos os outros ângulos de torção, todos os ângulos de flexão e

todos os comprimentos de ligação são considerados fixos, tendo cada aminoácido em média cerca de

três graus de liberdade.

Este método tem alguma tendência de convergir para mínimos locais distantes da estrutura que mini-

miza globalmente as violações às restrições impostas. Por isso numa aplicação típica 500 estruturas

são calculadas, sendo guardadas as 15 melhores (com valores menores para a violação das restrições).

Para comparar o desempenho do método aqui proposto com DYANA foi fornecida a este último a lista

de restrições (1273 restrições) obtidas simulando os dados ideais de RMN para a estrutura de teste (ver

3.1 Estrutura de Teste). Foram calculadas 500 estruturas com o programa DYANA, sendo guardadas

as 15 melhores.

Para produzir 15 estruturas com o método aqui proposto foi feito um retrocesso abrangendo entre 30%

e 70% dos pontos de escolha após o cálculo de cada estrutura, prosseguindo a enumeração e optimiza-

ção do ponto de escolha resultante. O número exacto de pontos de escolha recuados durante este retro-

cesso foi escolhido aleatoriamente. Desta forma conseguiu-se uma amostragem do espaço de soluções

possíveis.

69

A Figura 3.15 mostra a comparação dos resultados obtidos. As estruturas calculadas com o programa

DYANA têm uma qualidade ligeiramente superior e abrangem um maior espaço de possibilidades

para as restrições impostas.

A diferença na qualidade das estruturas não é muito acentuada, como mostra o Quadro 3.1. Quando

comparadas com a estrutura alvo, as soluções mais parecidas têm valores muito semelhantes de

RMQD, e em ambos os casos inferiores a 1Å. Esta pequena diferença deve-se ao algoritmo de optimi-

zação usado no método aqui proposto. Este algoritmo é muito menos sofisticado que o DYANA, pois

não faz qualquer distinção entre restrições associadas a ligações químicas rígidas e restrições de dis-

tância entre átomos não ligados.

É mais acentuada a diferença na amostragem de soluções compatíveis com as restrições impostas. No

Quadro 3.1 pode se ver também que em média as soluções geradas pelo DYANA diferem entre si qua-

se duas vezes mais que as soluções geradas pelo método aqui proposto. A principal causa desta defi-

ciência é o algoritmo de minimização. Por um lado, tratando-se de uma minimização ‘gananciosa’, o

algoritmo converge para o mínimo local mais próximo, sem explorar outras alternativas.. Por outro

lado, a optimização é feita no sentidos de que todos os valores de distância estejam o mais próximo

possível dos valores médios para cada par de átomos unidos por uma restrição, o que vai forçar a con-

vergência para um conjunto muito restrito de soluções.

Raiz da Média do Quadrado da Distância (RMQD) em Å

Para a Estrutura Alvo Dentro do Conjunto de Soluções Melhor Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão

DYANA 0.8 1.04 0.16 0.86 0.30

P.R. 0.9 1.20 0.19 0.52 0.26

Quadro 3.1

Comparação dos resultados obtidos pelo programa DYANA com os obtidos pelo método de Programação por Restrições (P.R.) aqui proposto. Os valores referem-se aos átomos da cadeia principal proteico.

Outro factor importante pode ser a forma implementada para gerar várias soluções, ou seja, retroceder

um número aleatório de pontos de escolha. É possível que esta não permita gerar soluções suficiente-

mente diversas para explorar o espaço de estruturas consistentes com as restrições.

70

Figura 3.15

Comparação dos resultados obtidos pelo programa DYANA com os obtidos pelo método aqui proposto. No topo é mostrada a estrutura alvo, de onde foram retiradas as restrições usadas. Nas figuras inferiores as estruturas cal-culadas são mostradas a azul, sobrepostas à estrutura alvo em cinzento.

A qualidade das soluções obtidas pelos dois métodos é também muito semelhante no que respeita à

violação das restrições impostas. Nas estruturas finais algumas restrições são violadas, se bem que a

magnitude das violações é desprezável. A Figura 3.16 mostra o número e a magnitude das violações às

restrições para os conjuntos de 15 soluções geradas. Como se pode ver todas as violações são signifi-

cativamente inferiores a 1Å, que corresponde ao diâmetro de um átomo de Hidrogénio e a cerca de

metade do diâmetro de um átomo de Carbono, e por isso tratam-se de violações insignificantes à esca-

la das estruturas proteicas .

Estes resultados reforçam a hipótese que a menor qualidade das soluções em relação ao DYANA

deve-se a uma deficiência do algoritmo de optimização implementado, pois aparentemente a compo-

nente de processamento de restrições é capaz de gerar estruturas adequadas.

A vantagem do método de Programação por Restrições é a grande eficiência com que soluções apro-

ximadas podem ser geradas. As soluções obtidas pelo método aqui proposto, incluindo optimização,

fora calculadas em 8 minutos num PC com um processador Pentium a 133 MHz, enquanto que o cál-

culo no DYANA demorou mais de 6 horas num computador O2 com um processador R5000. Conside-

rando a diferença de desempenho entre os computadores usados, o método aqui proposto representa

um aumento de cerca de cem vezes na velocidade de cálculo.

Estrutura Alvo

Estruturas obtidas com DYANA Estruturas obtidas com o método proposto

71

1

10

100

1000

10000

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

P.R. - 8%DYANA - 17%

Violação em Angstrom

Figura 3.16

Número de restrições violadas nas 15 soluções geradas em cada método em função da magnitude da violação para os dois métodos (Programação por Restrições e DYANA). Note-se a escala logarítmica nas ordenadas. In-dica-se também para cada método a percentagem total de restrições violadas.

3.7 Outras Estruturas Testadas

O método proposto neste trabalho foi também testado em três outras estruturas, com conjuntos de res-

trições obtidos em cada caso simulando as restrições potencialmente obtidas por RMN (ver 3.1

Estrutura de Teste). Além disso também foi feito um teste calculando a estrutura dimérica da

Dessulforedoxina a partir de restrições obtidas experimentalmente por RMN (16).

A Figura 3.17 mostra o resultado obtido para o cálculo da estrutura do Citocromo C de cavalo. As

restrições usadas foram obtidas a partir da estrutura conhecida da proteína (10), do modo descrito

anteriormente (ver 3.1 Estrutura de Teste). Nesta figura encontram-se representadas as 15 estruturas

geradas, a estrutura alvo e o grupo prostético desta proteína (ver 1.6 Outros Elementos Estruturais,

página 24). É de salientar que os grupos prostéticos não estão modelados na presente versão do

método, e por isso foi apenas considerada a cadeia de aminoácidos da proteína. Esta falha no modelo

degradou certamente a qualidade das estruturas obtidas, dado o papel estrutural importante que este

grupo tem na proteína.

72

Figura 3.17

Estruturas obtidas para o Citocromo C de cavalo (a azul) comparadas com a estrutura alvo (a cinzento). O grupo prostético (hemo) está representado a vermelho. Qualidade média 6.8Å RMQD.

A Figura 3.18 mostra as 15 soluções obtidas para a estrutura de um inibidor proteico da Tripsina,

comparadas com a estrutura alvo conhecida (28). As restrições usadas foram obtidas a partir desta úl-

tima.

Figura 3.18

Estruturas obtidas para o inibidor da Tripsina (a azul) comparadas com a estrutura alvo (a cinzento). Qualidade média de 2.8Å RMQD.

73

Figura 3.19

Estruturas obtidas para o inibidor da Tripsina Pancreática (a azul) comparadas com a estrutura alvo (a cinzento). Qualidade média de 3.9Å RMQD.

A Figura 3.19 mostra os resultados obtidos para outro inibidor proteico da Tripsina (Inibidor da Trip-

sina Pancreática Humana, 18) comparados com a estrutura alvo conhecida. De salientar neste caso a

região terminal da estrutura, à direita na figura, onde naturalmente as restrições são insuficientes para

que a estrutura seja correctamente determinada.

Figura 3.20

Estruturas obtidas para o dímero da Desulforedoxina (a azul) comparadas com a estrutura alvo (a cinzento). Qua-lidade média de 3.6 Å RMQD.

74

A Figura 3.20 mostra os resultados obtidos para o dímero da Desulforedoxina, comparados com a es-

trutura alvo conhecida (2). As restrições usadas para este teste foram obtidas experimentalmente por

RMN (16, dados cedidos pelo autor).

Para este teste foi necessário ignorar algumas restrições porque, na prática, alguns grupos de átomos

não são distinguíveis. Isto exige que o modelo inclua pseudo átomos imaginários no centro geométrico

destes grupos (solução adoptada no DYANA) ou que as restrições seja aplicadas, com modificação, a

todos os átomos do grupo. O presente modelo ainda não inclui estas características, o que certamente

afectou o resultado.

Nestes resultados é evidente que a qualidade das soluções obtidas é inferior ao caso da estrutura de

teste. Isto deve-se à incapacidade do algoritmo de optimização para minimizar satisfatoriamente

estruturas de maiores dimensões.

Como já foi descrito (ver 2.6 Minimização, página 49) este algoritmo simples minimiza todas as res-

trições indiscriminadamente. Desta forma a importante informação estrutural dada pela rigidez da

maioria das ligações químicas não é utilizada, não só aumentando muito o tempo de cálculo pelo

excessivo número de graus de liberdade, mas também gerando estruturas distorcidas por permitir

distorções irrealistas.

Figura 3.21

Comparação entre as várias estruturas testadas. O número de restrições, o número de átomos e o tempo encon-tram-se a escalas diferentes, mas a mesma escala é usada para todos os tempos e entre os vários casos. Quadro A.12, página 88.

É de notar que a proporção da fase de optimização nestes casos é sempre superior ao caso do cálculo

de uma única estrutura, como visto na Figura 3.14. O cálculo de múltiplas estruturas é feito por um

Citocromo C

Inibidor Tripsina

Inibidor Tripsina (Pancreático)

Desulforedoxina

Número de Átomos

Número de Restrições

Tempo Total

Tempo de Processamento de Restrições

Tempo de Optimização

75

retrocesso parcial (entre 30% e 70% dos pontos de escolha), o que faz com que o tempo de processa-

mento de restrições seja menor para as estruturas a partir da primeira.

Apesar de não ser satisfatória a qualidade das soluções geradas pelo método como presentemente im-

plementado, estes resultados mostram que a programação por restrições permite gerar rapidamente

soluções aproximadas. Isto permite reduzir o espaço de pesquisa para o algoritmo de optimização, tor-

nando desnecessária a geração de centenas de estruturas como no caso de um método que recorra ape-

nas à optimização como o DYANA.

76

77

4. Conclusão

"A previsão é difícil, especialmente do futuro." Niels Bohr

Penso que este trabalho cumpriu o objectivo, mostrando que a aplicação de técnicas de programação

por restrições pode aumentar significativamente o desempenho no cálculo de estruturas a partir de res-

trições de distância. No que respeita ao caso particular da determinação de estruturas proteicas por

RMN, será necessário um estudo mais aprofundado para poder garantir que o método aqui apresentado

é de facto superior aos métodos correntemente usados. Os resultados obtidos são promissores, indi-

cando um aumento de cerca de cem vezes na velocidade de cálculo, mas dois pontos importantes fica-

ram em aberto.

Em primeiro lugar, as estruturas obtidas pelo método como implementado até ao momento são de qua-

lidade inferior. O presente algoritmo de minimização não distingue as restrições provenientes da RMN

das restrições associadas às ligações covalentes. Sendo estas últimas muito mais rígidas que as primei-

ras, a minimização indiscriminada gera estruturas com distorções inaceitáveis. No entanto este pro-

blema será quase certamente de resolução trivial, requerendo apenas uma minimização que modele

estas características estruturais do problema.

Em segundo lugar há a salientar a falta de testes com sistemas impossíveis. Este é um ponto importan-

te porque na prática a atribuição das restrições obtidas por NMR é um processo iterativo de tentativa e

erro, o que implica que o sistema de cálculo das estruturas seja capaz de gerar uma solução mesmo

que as restrições sejam incompatíveis. Esta solução será necessariamente errada, contendo violações

às restrições impostas, mas é indispensável para avaliar e rever as atribuições. Apesar de não ter testa-

do esta situação, penso que o método que aqui proponho é suficientemente robusto para resolver estes

casos. Um método exclusivamente construtivo como os métodos de programação por restrições não

poderia dar qualquer solução neste caso, exigindo que o problema das atribuições erradas fosse resol-

vido de outra forma. No entanto o método aqui proposto é misto, e os algoritmos reparativos, como a

minimização na fase final, não têm dificuldade em gerar soluções parcialmente incorrectas. Por isso

estou proponho que este será também um problema de resolução fácil, exigindo apenas que a fase

construtiva de processamento das restrições seja interrompida se uma solução consistente não for

gerada dentro de um período pré estabelecido. Visto que o número de retrocessos (2.5 Retrocesso, pá-

gina 48) foi sempre inferior a dez nos casos testados, penso que a imposição de um limite de cem ou

mil retrocessos pode distinguir com confiança os casos em que existem atribuições incompatíveis, e

este número de retrocessos não é suficiente para causar um impacto significativo no tempo de cálculo.

No que respeita ao uso de técnicas de processamento de restrições, existem ainda opções por explorar.

Como mencionei anteriormente (2.2 Técnicas de Consistência, página 32), nestes problemas não deve

78

ser vantajoso, em geral, aplicar critérios de consistência de ordem superior à consistência em arco.

Mas possivelmente haverá vantagem em aplicá-los de uma forma localizada. Por exemplo, o ângulo

entre duas ligações será uma restrição envolvendo três átomos. Esta restrição terciária é modelada

como uma rede de restrições binárias, e parte da informação não é usada se for mantida apenas a con-

sistência de arco. Uma solução possível seria aplicar um critério de consistência mais completo a esse

grupo de átomos. O mesmo conceito pode ser estendido a ângulos diedros (quatro átomos), a centros

quirais ou elementos de estrutura secundária (que podem conter um número variável de átomos).

A implementação de técnicas de propagação de restrições globais também poderá ser útil para impedir

a sobreposição de átomos. No presente método, a restrição que átomos não se podem sobrepor é

propagada de uma forma muito incompleta (2.3 Adaptação do Modelo, página 40) porque a rede de

restrições binárias que a modelam é demasiado extensa para manter sequer consistência de arco. Mas

esta é um exemplo clássico de uma restrição global, e possivelmente pode ser propagada de uma

forma mais eficiente.

Penso que o método aqui apresentado é uma boa base para o cálculo e previsão de estruturas molecu-

lares. Uma aplicação quase imediata será ao processamento de dados experimentais de RMN estrutural

de proteínas. Num âmbito mais geral, penso que terá também uma aplicação em previsão e determina-

ção de estruturas de macro-moléculas. A flexibilidade do método base permite uma adaptação a outros

dados de análise estrutural, e permite o aproveitamento de informação mais teórica, como modelação

por homologia ou previsão de estruturas locais. A simplicidade com que o método permite integrar

informação experimental e previsão teórica poderá resultar numa contribuição significativa para a aná-

lise estrutural de macro-moléculas. Será este o sentido em que este trabalho irá continuar; após o aper-

feiçoamento para o caso da resolução de estruturas proteicas por RMN, o objectivo será alargar a base

de informação usada e o âmbito da aplicação do método.

Se bem que a previsão, especialmente do futuro, seja difícil, penso que é promissora a aplicação de

técnicas de programação por restrições ao problema da análise estrutural de macro-moléculas.

79

Glossário

Cadeia Principal: Sequência de átomos formada pelos grupos Carboxilo e Amina de cada aminoáci-

do, unidos pelo Carbono-α, e unidos entre si pela ligação peptídica.

Consistência de limite: Noção de consistência em que apenas são testados os limites do intervalo de

valores possíveis.

Consistência-k: Critério de consistência que elimina os valores dos domínios das variáveis que não

são suportados quando são consideradas k variáveis em simultâneo.

Domínio: Conjunto de valores que uma variável pode tomar.

Efeito de Overhauser: Influência de um núcleo em ressonância na absorção de outro núcleo vizinho.

Enumeração: Processo de escolha do valor para as variáveis. No caso de problemas em domínios

contínuos consiste geralmente em reduzir o domínio das variáveis.

Falha primeiro: Heurística de escolha da variável a enumerar. Segundo esta heurística é escolhida a

variável com o menor domínio, o que tende a antecipar a detecção de falhas.

Não determinista: Algoritmo em que as decisões são tomadas de forma imprevisível ou aleatória.

PC: Personal Computer. Computador pessoal.

Picos cruzados: Designação dos picos nos espectros de RMN a duas dimensões, obtidos para um par

de frequências.

Ponto de escolha: Instante da execução em que o domínio de uma variável é restrito rejeitando valo-

res que são suportados pelo critério de consistência. No caso de falha a execução terá que voltar ao

ponto de escolha para optar pelos valores rejeitados.

Ressonância: Oscilação do vector de momento magnético de um núcleo em fase com a frequência da

radiação incidente.

RMN: Ressonância Magnética Nuclear. Técnica de espectroscopia baseada na detecção de transições

de um núcleo atómico com momento magnético não nulo imerso num campo magnético.

RMQD: Raiz Média do Quadrado da Distância entre os átomos correspondentes de duas estruturas

moleculares. O valor mínimo, obtido sobrepondo o melhor possível as duas estruturas, é usado como

medida da diferença entre as estruturas.

Sucede primeiro: Heurística de ordenação de valores a atribuir a uma variável. Consiste em seleccio-

nar primeiro os valores com menor probabilidade de falha.

80

81

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84

85

Apêndice A: Quadros

Classe Número 0 0 1 0 2 6 3 33 4 164 5 710 6 1192 7 1589 8 2976 9 4274

10 5616 11 1740 12 68 13 0

Quadro A.1

Dados para o gráfico da Figura 3.3, Página 55

Tempo (Segundos) para cada heurística

Aminoácidos Ordem de Geração Sobreposição de Domínios 2 0.8 0.5 4 2.6 1.7 6 6.9 3.8 8 16.0 7.5

10 19.3 10.4 12 29.5 13.6 14 43.3 17.7 16 49.5 19.6 18 56.7 24.9 20 68.6 33.6 22 89.8 36.9 24 109.6 38.6 26 134.4 38.2 28 199.5 42.2 30 265.6 43.8 32 268.7 54.8 34 912.6 64.6 36 256.9 70.4

Quadro A.2

Dados para o gráfico da Figura 3.4, Página 57. Valores a negrito indicam execuções inter-rompidas.

86

Média de paralelepípedos por domínio para a heurística:

Aminoácidos Ordem de Geração Sobreposição de Domínios 2 1.9 1.5 4 2.6 1.9 6 5.5 1.7 8 7.2 2.3

10 6.0 2.0 12 7.5 1.9 14 9.7 2.4 16 9.2 2.0 18 7.9 1.9 20 7.3 2.1 22 8.5 2.2 24 10.5 2.1 26 12.5 2.1 28 15.8 1.8 30 17.2 1.8 32 17.4 2.8 34 19.4 2.0 36 8.2 2.0

Quadro A.3

Dados para o gráfico da Figura 3.5 , Página 57. Valores a negrito indicam execuções interrompidas.

Por rotatividade Em Série

Aminoácidos Tempo(s) Nº Paral. Tempo (s) Nº Paral. 2 0.5 1.5 0.5 2.0 4 1.7 1.9 2.5 4.4 6 3.8 1.7 4.9 5.5 8 7.5 2.3 18.0 10.9

10 10.4 2.0 23.9 13.1 12 13.6 1.9 38.1 15.0 14 17.7 2.4 90.1 20.3 16 19.6 2.0 121.2 20.4 18 24.9 1.9 201.1 26.9 20 33.6 2.1 593.9 40.6 22 36.9 2.2 399.4 31.0 24 38.6 2.1 274.6 21.4 26 38.2 2.1 332.1 25.3 28 42.2 1.8 602.4 32.1

Quadro A.4

Dados para o gráfico da Figura 3.6, Página 58.

87

Distância (Å) Tempo(s) RMQD (Å) 0.0 50 0.9 0.2 52 0.9 0.4 52 0.9 0.6 52 0.9 0.8 52 0.9 1.0 56 0.9 1.2 62 0.9 1.4 67 0.9 1.6 72 0.9 1.8 76 1.1 2.0 95 1.1 2.2 117 1.9 2.4 255 0.9 2.6 246 2.3 2.8 658 2.9

Quadro A.5

Dados para o gráfico da Figura 3.7, Página 59 e para o gráfico da Figura 3.8, Página 60

Probabilidade de remoção

10% 20% 30% 40%

RMQD (Å) Removidas RMQD (Å) Removidas RMQD (Å) Removidas RMQD (Å) Removidas

1.05 9% 0.82 21% 1.36 30% 1.54 40% 1.49 10% 1.15 21% 1.73 28% 1.62 43% 1.68 10% 1.18 19% 1.77 30% 1.76 40% 2.13 9% 2.22 19% 1.91 30% 2.07 43% 2.15 10% 2.36 21% 2.01 29% 2.65 39% 2.43 11% 2.66 20% 2.16 32% 3.05 40% 3.66 10% 2.83 19% 2.38 30% 3.63 42% 4.29 11% 3.28 20% 2.40 28% 3.67 39% 4.43 9% 4.61 21% 3.47 29% 3.83 39% 4.94 10% 7.59 21% 4.34 30% 5.13 39% Probabilidade de remoção

50% 60% 70% 80%

RMQD (Å) Removidas RMQD (Å) Removidas RMQD (Å) Removidas RMQD (Å) Removidas

1.51 50% 1.74 62% 1.67 71% 3.03 78% 1.77 50% 1.92 60% 1.81 71% 3.07 81% 1.85 52% 2.01 59% 2.94 71% 3.12 80% 2.08 50% 2.73 60% 2.94 73% 3.77 79% 2.24 50% 2.88 59% 3.09 71% 3.79 79% 2.29 49% 3.12 59% 3.22 71% 3.84 79% 3.01 50% 3.33 60% 3.86 70% 3.87 79% 3.34 52% 3.56 60% 4.35 68% 4.88 83% 3.71 50% 3.65 60% 5.20 71% 4.95 80% 4.39 50% 4.44 60% 5.35 69% 5.04 79%

Quadro A.6

Dados para o gráfico da Figura 3.9, Página 62

88

Distância (A) Simulação Experimental <3 90 86 3 a 4 326 185 4 a 5 1030 149 5 a 6 1642 96

Quadro A.7

Dados para o gráfico da Figura 3.10, Página 63.

Restrições Removidas

RMQD

0% 0.9 11% 2.1 20% 1.5 29% 1.5 37% 2.6 45% 1.6 51% 1.9 60% 3.5 68% 3.8 74% 3.4 79% 3.2 83% 3.2 85% 5.1 87% 5.2 90% 7.3

Quadro A.8

Valores da RMQD (em Ångstrom) para o gráfico da Figura 3.11, Página 63.

Restrições RMQD (Å) Restrições RMQD (Å) Removidas Média Desvio Padrão Removidas Média Desvio Padrão

0% 1.2 0.0 55% 4.2 0.8 5% 2.0 0.7 60% 3.8 0.9

10% 3.2 1.7 65% 3.9 1.2 15% 2.9 1.4 70% 3.8 1.2 20% 2.7 1.1 75% 4.6 0.8 25% 3.1 0.9 80% 4.2 0.8 30% 2.5 1.0 85% 4.4 0.8 35% 3.0 1.0 90% 6.1 1.4 40% 3.6 1.4 95% 12.7 4.9 45% 3.7 1.2 100% 38.0 0.0 50% 3.3 1.0

Quadro A.9

Valores da RMQD (em Ångstrom) para o gráfico da Figura 3.12, Página64.

89

Dimensão Final (Å) RMQD (Å) Tempo (s) Dimensão Final (Å) RMQD (Å) Tempo (s) 5.0 1.49 41.7 3.2 0.93 46.7 4.9 1.50 43.0 3.1 1.03 47.8 4.8 1.50 43.3 3.0 0.93 48.9 4.7 1.48 43.0 2.9 0.99 65.2 4.6 1.52 44.0 2.8 1.02 66.1 4.5 1.52 42.8 2.7 0.98 66.8 4.4 0.71 43.2 2.6 0.96 68.4 4.3 3.48 43.9 2.5 0.92 69.3 4.2 3.57 49.0 2.4 0.98 72.1 4.1 3.59 44.1 2.3 0.92 75.6 4.0 4.04 44.6 2.2 0.97 76.0 3.9 4.13 48.1 2.1 0.94 80.4 3.8 3.90 48.1 2.0 1.00 79.4 3.7 4.01 49.2 1.9 0.98 83.6 3.6 4.26 45.9 1.8 0.94 87.0 3.5 3.78 46.1 1.7 0.94 90.5 3.4 3.90 49.9 1.6 0.93 92.2 3.3 3.91 46.9 1.5 0.94 96.8

Quadro A.10

Valores de RMQD (em Ångstrom) e tempo (em segundos) para o gráfico da Figura 3.13, página 65.

Partição Propagação

não explícita Escolha de Domínio

Propaga-ção Fora

Propagação Dentro

Tempo (s) 10.3 3.6 1.6 8.6 9.9 Fracção 14.9% 5.2% 2.3% 12.4% 14.3%

Simplificação de Dominio

Retrocesso Minimização Outros Total

Tempo (s) 0.1 0.1 1.8 33.4 69.3 Fracção 0.2% 0.1% 2.5% 48.1%

Quadro A.11

Proporções e tempos (em segundos) para as várias fases de cálculo apresentadas na Figura 3.14, página 66.

Tempo (Segundos) para 15 soluções

Processamento de Restrições

Optimização Total Átomos Restrições

Citocromo C 2289 413 3187 826 18238 Inibidor 733 196 1114 443 9098 Inibidor (Pancreático) 782 185 1154 457 9904 Desulforedoxina 958 171 1305 522 6440

Quadro A.12

Tempos de cálculo (em segundos), número de átomos e de restrições para os casos apresentados na Figura 3.21, página73.