Proteínas

Proteínas

Proteínas

Estrutura

Primária

Ligação covalente

Secundária

Ligação de Hs

Terciária

Ligações S-S e H

Interacções hidrofóbicas e electrostáticas

Forças de Van der Walls

Quaternária

Ligações de H

Interacções electrostáticas

Proteínas: Estrutura terciária

Proteínas

Caracterização:

Conformação nativa/Desnaturação proteica

Peso molecular

Carga e pI

Solubilidade

Proteínas

ClassificaçãoSimples

Albumina e globulinas (globulares)

Colagénio, Fibrinogénio e queratina (fibrosas)

ConjugadasFracção proteica

Fracção não proteica• Lipoproteínas

• Nucleoproteínas (Histonas, Telomerases)

• Metaloproteínas

Metal ligado directamente à proteína

Complexo de metal

• Glicoproteínas

• Mucoproteínas (mucopolissacarídeos ou glicosaminoglicanos)

Proteínas

Distribuição

Compartimento intravascular/extravascular

Catabolismo

Aminoácidos NH4+

NH4+ ureia

Balanço de N

Anabolismo/catabolismo

Balanço +

Crescimento, gravidez, reparação celular

Balanço –

Fome, estado febril acentuado, queimaduras

ProteínasFunção Exs:

Transporte TBG (transporte de hormonas da tiroide, T3 e

T4)

Apolipoproteínas

Transferrina, …..

Imunidade humoral Imunoglobulinas

Manutenção pressão oncótica Todas (alb)

Enzimas Renina

Factores da coagulação

Complemento

Inibidores de proteases 1-antitripsina, 2-

macroglobulina

Tampão Todas

Principais proteínas do plasmaClasse Proteína sérica média (g/L)

Pre-albumina 0,25

Albumina 40

1-globulina 1-antitripsina 2,9

1-glicoproteína ácida 1,0

2-globulina haptoglobina 2,0

2-macroglobulina 2,6

ceruloplasmina 0,35

-globulina Transferrina 3,0

Lipoprot. baixa densidade 1,0

Comp do complemento 1,0

-globulina Imunoglobulina G 14,0

Imunoglobulina A 3,5

Imunoglobulina M 1,5

Imunoglobulina D 0,03

Imunoglobulina E vestígios

Determinação das proteínas plasmáticas

Amostra: soro não hemólisado e não lipémico

Determinação do azoto total

Determinação das proteínas totais

Método de Kjeldahl

Refratometria Estes métodos são influenciados por variações da

temperatura, relação albumina/globulinas, hiperglicemia, hiperbilirrubinemia ehiperlipemia.

Método do Biureto

Método de Lowry

Método de Folin ciocalteau

Absorção no UV (280nm)

Ligação a corantes

Electroforese

Métodos imunoquímicos

Doseamento das proteínas totais

Método do Biureto (reacção colorimétrica; método

usado na aula laboratorial)

Fundamento: as proteínas reagem com o ião cúprico em

meio alcalino, produzindo um complexo de cor violeta. A

intensidade da cor é proporcional à concentração de

proteínas na amostra (avaliação espectrofotométrica)

Amostra: soro ou plasma

Hemólise acentuada interfere com a determinação

Estabilidade - temperatura de conservação

Fácil de automatizar

Electroforese/Focagem isoeléctrica

Electroforese Focagem isoeléctrica

Condiç separação pH constante (8,6) Gradiente de pH

Meio usado Acetato de celulose Agarose

Agarose Gel poliacrilamida

Gel poliacrilamida

Separação baseada Carga pI

Peso molecular

Forma

tempo

Aplicação Bandas estreitas Volume e área n crítica

da amostra crítica N crítica (efeito da )

Difusão Reduz resolução Neutralizada por eft focagem

Temperatura Ambiente Arrefecimento, 10ºC

de sais N crítica prejudicial

Electroforese

Permite determinação semiquantitativa das proteínas do soro e

detecção de paraproteínas (Imunoglobulina produzida por um único

clone de células da série B - banda discreta, por norma na região )

Separação das proteínas – carga eléctrica

As proteínas principais têm carga negativa a pH 8,6 e migram para o

ânodo (a albumina desloca-se + rapidamente em direcção ao ânodo)

Amostra: soro

O fibrinogénio presente no plasma apresenta uma banda na região

Electroforese Separação em 5 bandas de acordo com a sua mobilidade:

Albumina/ 1-globulina/ 2-globulina/ -globulina/ -globulina

Com algumas técnicas – pré-albumina

Se em excesso, bandas discretas de: PCR, -fetoproteína

Electroforese

As amostras de soro são colocadas em meio adequado (proteínas saturadas

com tampão alcalino). As moléculas com maior carga negativa movem-se em

direcção ao ânodo + rapidamente.

Num proteinograma, observam-se 5 zonas de migração, em que a mais

aniónica corresponde à albumina (menor peso molecular e maior carga

eléctrica negativa) e as seguintes, respectivamente, as globulinas 1, 2, e

.

As fracções proteicas são fixadas, coradas (Ponceau S) e quantificadas por

densitometria

Variação da concentração das proteínas:

Taxa de Síntese proteica

Taxa de remoção das proteínas

Volume da distribuição das proteínas

Apenas as alterações nas proteínas mais abundantes

(albumina e imunoglobulinas) tem um efeito significativo na

concentração total de proteína.

As alterações na concentração de proteínas plasmáticas

pode fornecer uma ajuda útil na avaliação do estado de

hidratação.

Proteínas do plasma Hipoproteinemia

Perda excessiva Doença renal

D tracto gastrointestinal

Inflamações do sistema digestivo

Perda de sangue

Redução de ingestão Deficiência de proteínas na dieta

Deficiente absorção

Redução da síntese Doenças hepáticas

Alterações de imunodeficiência

Catabolismo acelerado Queimaduras

Traumas

Outras lesões

Hiperproteinemia Desidratação

Vómito

Diarreia

Acidose diabética

Hipoaldosteronismo (deficiência de aldosterona )

Produção excessiva (principalmente gamaglobulinas)

Causas das alterações das proteínas

totais do plasma

Aumento

Hipergamaglobulinemia síntese proteica

Paraproteinemia

Artefacto hemoconcentração(aplicação errada de um torniquete)

Desidratação volume de distribuição

Redução

Má nutrição/má absorção

Doença hepática síntese proteica

Imunodeficiência humoral

Super-hidratação volume de distribuição

Permeabilidade capilar

Estados catabólicos excreção /metabolismo

Perda de proteínas

Proteínas do plasmaPré-albumina

Raramente observada como banda isolada

Semi-vida: 8 horas

Rica em triptofano

Liga-se à tiroxina (T4) e triiodotironina (T3)

Liga-se à proteína transportadora do retinol

Concentração diminuída Lesão hepática

Queimaduras

Necrose dos tecidos

Ingestão de salicilatos

Concentração aumentada Síndromes nefróticos

Avaliação do estado nutricional

Proteínas do plasmaAlbumina

Presente em maior concentração no soro (cerca de 60%)

Tempo de semi-vida 15 a 19 dias

Síntese: fígado

Velocidade de síntese depende da ingestão protéica e do teor

de albumina circulante

Proteína pequena – perdas na urina quando ocorrem lesões

nos glomerulos renais

Proteínas do plasmaAlbumina

Funções Pressão osmótica coloidal do fluído intravascular

Tampão

Transporte Bilirrubina

Ácidos gordos

Cálcio e magnésio

Cortisol

Algumas drogas (salicilatos)

Anomalias Redução da concentração plasmática

Ausência de albumina (analbuminemia)

Albumina com características moleculares anormais(bisalbuminemia) – variante de albumina – sem consequênciasclinicas

Hipoalbuminemia

Redução da síntese

Má nutrição

Má absorção

(doença de Crohn)

Doença hepática

(crónica)

Volume distribuição

Permeabili// capilar

- septicemia

- hipoxia

Excreção/degradação

Síndrome nefrótico

Queimaduras

Hemorragias

Estados catabólicos

Proteínas do plasma

Ο Hiperalbuminemia

Ο Desidratação

Ο Artefacto (inadequada colheita de sangue, infusão de

albumina)

Ο A síntese de albumina pode encontrar-se elevada em

algumas situações patológicas, mas não conduz a

Hiperalbuminemia

Doseamento de albumina

Precipitação/biureto – as globulinas são precipitadas porelevadas concentrações de sais; albumina doseada nosobrenadante pela reacção do biureto

Electroforese

“Dye binding” – formação de complexos entre proteínase corantes

HABA (2-(4`-hidroxiazobenzene) benzoic acid)

BCG (bromocresol green)

apresenta boa especificidade e não sofre interferências debilirrubina, salicilatos, hemoglobina ou lipemia quando em níveismoderados.

BCP (bromocresol purple)

Laranja metilo

Globulinas

1 – Globulinas - inibidores de proteases

1-antitripsina

Proteína de fase aguda

Função: neutralizar enzimas “tripsin like”

Níveis elevados – reacções inflamatórias,

durante a gravidez e com uso de contraceptivos

Cirrose hepática juvenil – deficiência de ATT (é

sintetizada mas não se liberta do hepatócito)

Detecção – imunodifusão radial, ensaios

imunonefelométricos, ens. imunoenzimáticos.

1-glicoproteína ácida Formação de certas membranas e fibras (em

associação com colagéneo)

Fonte – membrana das plaquetas

Baixo PM, Semi vida 5 dias

É uma proteína de fase aguda, importante nodiagnóstico e seguimento de processos inflamatórios

Concentração aumentada

Processos inflamatórios

Gravidez

Neoplasias

Pneumonia

Artrite reumatóide

Detecção – imunodifusão radial, ens.imunoenzimáticos

Globulinas