desenvolvimento, validaÇÃo e aplicaÇÃo de … · 1.5 canabinóides em matrizes biológicas...
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DESENVOLVIMENTO, VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MICROEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA E
MICROEXTRAÇÃO EM FASE LÍQUIDA PARA DETERMINAÇÃO DE CANABINÓIDES EM CABELO
HUMANO POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS NO
MODO TANDEM
ELISSANDRO SOARES EMÍDIO
ORIENTADOR: Prof. Dr. Haroldo Silveira Dórea
São Cristóvão
2010
Dissertação apresentada ao Núcleo de
Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal de Sergipe como
um dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Química.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
E53d
Emídio, Elissandro Soares Desenvolvimento, validação e aplicação de microextração em
fase sólida e microextração em fase líquida para determinação de canabinóides em cabelo humano por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas no modo tandem / Elissandro Soares Emídio. – São Cristóvão, 2010.
121 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Química) – Programa de Pós-Graduação em Química, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2010.
Orientador: Prof. Dr. Haroldo Silveira Dórea
1. Canabinóides. 2. Cromatografia. 3. Espectrometria. 4. Analise toxicológica. I. Título.
CDU 543.51:543.544.3
Dedico este trabalho: A Deus, por estar presente em minha vida e me iluminando em todos os momentos. Aos meus pais, pela vida, pelo exemplo de luta, perseverança e amor dedicados a mim. Ao meu irmão pelo apoio e amparo nos momentos que precisei de sua ajuda.
AGRADECIMENTOS
"Cada um que passa em nossa vida passa sozinho,
Porque cada pessoa é única e nenhuma substitui outra.
Cada um que passa em nossa vida passa sozinho,
Mas não vai só, nem nos deixa só,
Leva um pouco de nós, deixa um pouco de si mesmo.
Há os que levaram muito, mas não há os que deixaram nada.
Essa é a maior responsabilidade de nossas vidas,
E a prova de que as pessoas não se encontram por acaso."
Por este motivo... meus agradecimentos,
• A Universidade Federal de Sergipe, ao Departamento de Química, ao
Programa de Pós-Graduação em Química e ao Laboratório de Análise de
Compostos Orgânicos Poluentes (LCP) por terem me dado a
oportunidade de realizar este gratificante trabalho.
• Em especial ao professor orientador e amigo Haroldo Silveira Dórea, pela
confiança em acreditar no meu potencial nesses 5 anos integrando o
grupo. É difícil expressar com poucas palavras a gratidão que eu tenho
pelo senhor. Agradeço pelos ensinamentos, pelos conselhos, pelos seus
conhecimentos compartilhados. Aprendi contigo a ser um indivíduo mais
dedicado e solidário. Espero que Deus te dê em dobro o que você tem
me proporcionado nesses anos de convívio. Desejo do fundo de meu
coração muita saúde para você e sua família. Muito obrigado por tudo!!
• Ao professor Sandro Navickiene pela presença e apoio incondicional nos
momentos de apelo. Um profissional extremamente responsável e
diligente a quem todos devem se espelhar.
• Aos professores Marcelo da Rosa, Carlos Alexandre, Paulo e Péricles,
que contribuíram em algum momento na realização deste trabalho.
• Aos amigos e companheiros atuais e antigos do LCP: Adalberto, Alain,
Ricardo, Márcia, Geovânia, Rogério, Cláudia, Daniela, Danielle, Gisele,
Samia, Renata, Adriano, Pedro, Débora, Claydson, Michel, Marcell,
Bruno, Tamires, Vanina, Gabriela, Alberto, Thaíse, Larissa, Fabrício,
Alex, Waneide, Danny, Clóvis pelos momentos de descontração no
laboratório, e que sem dúvida aprendi um pouco com cada um. Em
especial a Vanessa, por estes últimos anos termos criado uma amizade
ímpar. Agradeço-lhe por ter me apoiado e incentivado no
desenvolvimento do meu trabalho, pela parceria e companheirismo.
Posso afirmar que a nossa amizade foi um dos melhores frutos deste
mestrado. Também aprendi muito contigo. Agradeço de coração a todos
vocês!!
• Agradeço também aos colegas do curso de mestrado Amanda, Márcia,
Rogério, Cláudia, Ariadna, Cristiane, Wesley, Sandra, Renê, Neemias
pelos momentos alegres e de união. Desejo sucesso para cada um de
vocês.
• Também, não posso me esquecer de agradecer ao pessoal do Grupo
LEMON (Amanda, Juliana, Valéria, Bruno, André) pelos poucos
momentos, mas gratificantes de amizade e alegria.
• Aos funcionários do NPGQ e do DQI por serem sempre solícitos.
• A FAPITEC pela bolsa concedida.
• Ao CNPq pelo auxílio financeiro.
SUMÁRIO
CURRICULUM VITAE ........................................................................................ i
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ v
LIS TA DE TABELAS ...................................................................................... viii
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS ..................................................... ix
RESUMO ............................................................................................................ xiii
ABSTRACT ........................................................................................................ xiv
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
1.1 Cannabis sativa ................................................................................................ 1
1.2 Canabinóides ................................................................................................... 2
1.3 Perfil de consumo e efeitos da maconha ....................................................... 6
1.4 O uso abusivo de drogas e seus aspectos sociais ........................................... 7
1.5 Canabinóides em matrizes biológicas convencionais e alternativas ......... 10
1.6 Utilização do cabelo como matriz na investigação do consumo de Cannabis ................................................................................................................ 14
1.6.1 Aspectos históricos ...................................................................................... 14
1.6.2 Anatomia e fisiologia do cabelo ................................................................. 16
1.6.3 Incorporação e eliminação de drogas ....................................................... 18
1.6.4 Coleta da amostra de cabelo ...................................................................... 22
1.6.5 Análise de cabelo ......................................................................................... 23
1.6.5.1 Descontaminação ................................................................................... 23
1.6.5.2 Digestão ou desintegração ..................................................................... 25
1.6.5.3 Procedimentos de extração e análise.................................................... 25
1.7 Microextração em fase sólida (SPME) ........................................................ 27
1.7.1 Aspectos termodinâmicos e cinéticos ........................................................ 31
1.8 Microextração em fase líquida por fibra oca (HF-LPME) ....................... 34
1.9 Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas no modo tandem (GC/MS/MS) ................................................................................. 40
2. OBJETIVOS .................................................................................................. 44
2.1 Objetivo geral ................................................................................................ 44
2.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 44
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................ 45
3.1 Materiais ........................................................................................................ 45
3.1.1 Reagentes, solventes e outros materiais .................................................... 45
3.1.2 Soluções-padrão .......................................................................................... 45
3.1.3 Equipamentos e acessórios ......................................................................... 46
3.2 Métodos .......................................................................................................... 46
3.2.1 Coleta da amostra ....................................................................................... 46
3.2.2 Preparação da amostra .............................................................................. 47
3.2.3 Procedimento por HS-SPME e GC-MS/MS para determinação de canabinóides no cabelo ........................................................................................ 48
3.2.4 Procedimento por HF-LPME e GC-MS/MS para determinação de canabinóides no cabelo ........................................................................................ 49
3.2.5 Condições cromatográficas de análise ...................................................... 51
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 52
4.1 Desenvolvimento de método por MS operando no modo tandem ............. 52
4.2 Otimização dos parâmetros de extração por HS-SPME .......................... 56
4.2.1 Fibra ............................................................................................................. 56
4.2.2 pH ................................................................................................................. 57
4.2.3 Força iônica ................................................................................................. 58
4.2.4 Temperatura de extração ........................................................................... 60
4.2.5 Massa de cabelo........................................................................................... 61
4.2.6 Tempo de saturação .................................................................................... 62
4.2.7 Tempo de extração ...................................................................................... 63
4.2.8 Tempo de dessorção e carryover ................................................................ 64
4.3 Otimização dos parâmetros de extração por HF-LPME .......................... 67
4.3.1 Seleção do solvente orgânico ...................................................................... 67
4.3.2 Planejamento fatorial fracionário ............................................................. 68
4.3.3 Planejamento composto central (PCC) ..................................................... 71
4.4 Validação ....................................................................................................... 78
4.4.1 Seletividade .................................................................................................. 79
4.4.2 Linearidade e curva analítica .................................................................... 81
4.4.3 Precisão ........................................................................................................ 84
4.4.4 Recuperação ................................................................................................ 86
4.4.5 Limites de detecção e quantificação .......................................................... 88
4.5 Perfil dos pacientes amostrados ................................................................... 91
4.6 Aplicação dos métodos HS-SPME e HF-LPME ......................................... 91
4.6.1 HS-SPME .................................................................................................... 91
4.6.2 HF-LPME .................................................................................................... 94
5. CONCLUSÕES ............................................................................................. 98
6. REFERÊNCIAS .......................................................................................... 100
ANEXOS ............................................................................................................. 111
ANEXO A – Questionário para verificação do perfil de consumo ................ 112
ANEXO B – Declaração do Comitê de Ética ................................................... 115
ANEXO C – Produções científicas ................................................................... 116
ANEXO D – Matérias publicadas em jornal de circulação ........................... 118
i
CURRICULUM VITAE Nome: Elissandro Soares Emídio Filiação: Sandoval Emídio Vieira e Maria Conceição Soares Emídio Data de nascimento: 14/03/1985 Naturalidade: Aracaju-SE FORMAÇÃO � 2003 - 2008 − Graduação: Bacharelado em Farmácia pela Universidade Federal
de Sergipe
ATUAÇÃO ACADÊMICA � 2005-2008 − Vínculo: Bolsista - PIBIC/CNPq, Enquadramento Funcional:
Iniciação Científica, Carga horária: 20 horas semanais. � 2008-2010 − Vínculo: Bolsista - Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação
Tecnológica do Estado de Sergipe - FAPITEC/SE, Enquadramento Funcional: Mestrando, Carga horária: 40 horas semanais, Regime: Dedicação exclusiva.
� 09/2008 - 01/2009 − Ensino, Engenharia Agronômica, Nível: Graduação.
Disciplina ministrada: Química Analítica Agrícola I. Carga horária: 4h semanais. Estágio de docência vinculado à Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe - FAPITEC/SE.
� 03/2009 -07/2009 − Ensino, Farmácia, Nível: Graduação. Disciplina ministrada:
Química Experimental II. Carga horária: 4h semanais. Estágio de docência vinculado à Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe - FAPITEC/SE.
ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE A GRADUAÇÃO � Trabalhos publicados em anais de congressos
ii
• Otimização de método analítico para determinar poluentes orgânicos em sedimentos. Comparação dos detectores PID e FID. XV Encontro de Iniciação Científica, 2005, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE.
• Poluentes orgânicos em sedimento. Uso do planejamento fatorial para
estabelecimento da metodologia analítica. 13º Encontro Nacional de Química Analítica, 2005, Niterói-RJ.
• Análise de fenóis em águas ambientais por SPME. In: XVI Encontro de
Iniciação Científica, 2006, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE.
• Determinação de BTEX em efluentes por P&T-GC-PID/FID. 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006, Águas de Lindóia-SP.
• Análise de alcanos em sedimentos ambientais por ultra-som. XVII Encontro
de Iniciação Científica, 2007, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE.
• Comparação da extração ultra-som com Soxhlet para análise de alcanos em
sedimentos ambientais. 14º Encontro Nacional de Química Analítica, 2007, João Pessoa-PB.
• SPME para determinação de pirimetanil, pirimicarbe e buprofezina em águas
ambientais por GC-MS. Congresso Latino Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas - COLACRO XII, 2008, Florianópolis-SC.
• Validação de método para análise de HPAs em cachaça. In: XV Seminário
Latino Americano e do Caribe de Ciência e Tecnologia de Alimentos e XXI Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2008, Belo Horizonte-MG.
• Validação de método por SPE e GC para análise de HPAs e pesticidas em cachaça. 18º Encontro de Iniciação Científica e 4º Encontro de Pós-Graduação, 2008. Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE.
• Identificação de compostos orgânicos em charuto por MSPD e GC-MS. 18º
Encontro de Iniciação Científica e 4º Encontro de Pós-Graduação, 2008, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE.
• Análise de alcanos em sedimentos ambientais por ultra-som. In: 60º Reunião
Anual da Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência, 2008, Campinas-SP. 60º Reunião Anual da Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência, 2008.
iii
• Determinação de BTEX em águas subterrâneas e de efluentes por Purge and Trap e GC/FID. IV Encontro Nacional de Química Ambiental, 2008, Aracaju-SE.
� Artigos completos publicados em periódicos
• Análise de fenóis em águas ambientais por SPME. Caderno de Cultura do Estudante (UFS), v. 5, p. 109-115, 2006.
• Análise de Poluentes Orgânicos Tóxicos na Cachaça. Revista da FAPESE de
Pesquisa e Extensão, v. 4, p. 5-18, 2008.
• Multivariate optimization of a solid phase microextraction-headspace procedure for the determination of benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes in effluent samples from a waste treatment plant. Journal of Chromatography, v. 1203, p. 99-104, 2008.
• The structure of the benthic macrofaunal assemblages and sediments characteristics of the Paraguaçu estuarine system, NE, Brazil. Estuarine, Coastal and Shelf Science, v. 78, p. 753-762, 2008.
ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE O MESTRADO � 30/05 a 02/06/2009 − 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química.
2009, Fortaleza-CE. Apresentação dos trabalhos na forma de pôster: 1. Otimização dos parâmetros de extração por SPME-HS para análise de
canabinóides em cabelo por GC-MS/MS. 2. Validação de método cromatográfico por GC-MS/MS na determinação de ∆9-
tetraidrocanabinol, canabidiol e canabinol em cabelo humano. O trabalho "Validação de método cromatográfico por GC-MS/MS na determinação de ∆9-tetraidrocanabinol, canabidiol e canabinol em cabelo humano" foi selecionado para apresentação oral na sessão coordenada de Química Analítica na 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. � 15/06 a 18/06/2009 − II Encontro Sergipano de Química. 2009. Universidade
Federal de Sergipe. São Cristóvão-SE. Apresentação do trabalho na forma oral: Desenvolvimento de método para análise de compostos da maconha em cabelo humano por HS-SPME e GC-MS/MS.
iv
� 18/10 a 21/10/2009 − 15º Encontro Nacional de Química Analítica e 3º
Congresso Iberoamericano de Química Analítica. 2009, Salvador-BA. Apresentação do trabalho na forma de pôster: Estudo da fragmentação por MS/MS de canabinóides para análise em cabelo e otimização das condições de extração por static headspace.
Participação nos trabalhos: � MSPD como técnica de extração para identificação de compostos orgânicos em
charutos por GC-MS. 19º Encontro de Iniciação Científica, 2009, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE.
� Otimização multivariada na análise de compostos voláteis em charuto por HS-SPME e GC-MS. In: 15º Encontro Nacional de Química Analítica e 3º Congresso Iberoamericano de Química Analítica, 2009, Salvador-BA.
� Caracterização de charutos utilizando extração por MSPD, análise por GC-MS e
métodos quimiométricos. 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2009, Fortaleza-CE.
� Determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos presentes na castanha
de caju (Anacardium occidentale L.). In: II Simpósio em Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2010, Aracaju-SE.
Artigos em periódicos e matérias divulgadas � Artigo publicado na revista Analytica Chimica Acta com o título: “Validation of
an analytical method for analysis of cannabinoids in hair by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography ion trap tandem mass spectrometry”, v. 670, p. 63-71, 2010. (ANEXO C).
� Artigo aceito na revista Journal of Chromatography B: “Hollow fiber-based liquid phase microextraction with factorial design optimization and gas chromatography–tandem mass spectrometry for determination of cannabinoids in human hair”, em 3 de junho de 2010 (ANEXO C).
� Matérias publicadas em jornais e sites a respeito do trabalho desenvolvido nos
meses de janeiro e fevereiro de 2010 (ANEXO D).
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Morfologia da planta Cannabis sativa. 1- Broto; 2- inflorescência masculina; 3- flôr masculina; 4- inflorescência feminina; 5- flôr feminina; 6-fruto; 7- semente. ........................................................................... 3
Figura 2. Rota de biossíntese para a produção dos principais canabinóides e subprodutos do ∆9-THC. (∆T = aquecimento, [O] = oxidação, [I] = isomerização). .............................................................................................................. 5
Figura 3. Prevalências sobre (porcentagem) uso na vida de diferentes drogas psicotrópicas (exceto Álcool e Tabaco). .......................................................... 6
Figura 4. Via metabólica do ∆9-THC. ........................................................................ 11
Figura 5. Esquema do segmento de uma fibra de cabelo mostrando as estruturas majoritárias: cutícula, córtex e medula. ..................................................... 17
Figura 6. Incorporação e eliminação de drogas no cabelo. ........................................ 19
Figura 7. Efeito das propriedades ácidas e básicas na incorporação de drogas no cabelo. A = droga ácida; B= droga básica; e = extracelular; i = intracelular.................................................................................................................. 21
Figura 8. Procedimento de coleta na região do vértice posterior da cabeça. ........................................................................................................................ 23
Figura 9. Esquema do dispositivo comercial de SPME. ............................................ 29
Figura 10. Modos de extração com SPME. ............................................................... 30
Figura 11. Procedimento de extração por SPME. ...................................................... 31
Figura 12. Ilustração da extração por SDME. ............................................................ 35
Figura 13. Membrana de polipropileno utilizada em HF-LPME. .............................. 36
Figura 14. Configuração da HF-LPME. Sistema em “U” (A) e sistema tipo haste (B). ............................................................................................................. 37
Figura 15. Modos de extração utilizados na microextração em fase líquida (LPME): duas fases (A) e três fases (B). ....................................................... 38
Figura 16. Princípio de MS/MS. ................................................................................ 42
Figura 17. Coleta da amostra de cabelo ..................................................................... 48
Figura 18. Esquema do procedimento de SPME para determinação de canabinóides em cabelo.............................................................................................. 49
Figura 19. Esquema do procedimento de HF-LPME para determinação de canabinóides em cabelo. ........................................................................................ 50
Figura 20. Espectro de massa no modo SCAN para os canabinóides. A: ∆9-THC; B: ∆9-THC-D3; C: CBN; D: CBD. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5. ................................................................. 53
vi
Figura 21. Espectro MS/MS (ions filhos) dos canabinóides. A: ∆9-THC; B: ∆9-THC-D3; C: CBN; D: CBD. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5. ................................................................................................ 55
Figura 22. Comparação da eficiência de extração dos canabinóides entre as fibras PDMS (100 µm) e PDMS-DVB (65 µm). Condições: pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e sem adição de sal (N=3). .................................................................................. 57
Figura 23. Variação do pH para extração dos canabinóides em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e sem adição de sal (N=3). ..................................... 58
Figura 24. Influência da força iônica (Na2CO3) para análise dos canabinóides em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min (N=3). .................................................................................................................. 59
Figura 25. Estudo da força iônica ( % NaCl) para análise dos canabinóides em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min (N=3). .................................................................................................................. 60
Figura 26. Influência da temperatura de extração na análise dos canabinóide em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e 25 % (m/v) de Na2CO3 (N=3). ............................ 61
Figura 27. Influência da quantidade de cabelo no rendimento da análise. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e 25 % (m/v) de Na2CO3 (N=3). .................................................... 62
Figura 28. Avaliação do tempo de saturação para determinação dos canabinóides em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 10 mg; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e 25 % (m/v) de Na2CO3 (N=3). ......................................................................................................................... 63
Figura 29. Avaliação do tempo de extração para absorção dos analitos na fibra. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 10 mg; time de saturação: 10 min; time de saturação: 5 min e 25% (m/v) de Na2CO3 (N=3). ..................................................... 64
Figura 30. Teste do tempo de dessorção no rendimento da análise dos canabinóides. .............................................................................................................. 65
Figura 31. Cromatograma obtido pela análise por HS-SPME-GC/MS/MS em cabelo. Canabinóides adicionado de padrões na concentração de 1 ng mg-1: 1- CBD; 2- ∆9-THC + ∆9-THC-D3; 3- CBN. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5. ................................................................. 66
vii
Figura 32. Efeito do solvente de extração na eficiência de extração por HF-LPME. Condições: comprimento da fibra: 6 cm; NaCl: 12 % (m/v); volume da fase aceptora: 20 µL; tempo de extração: 20 min e velocidade de agitação: 600 rpm (N=3). ...................................................................................... 68
Figura 33. Gráfico de Pareto para o planejamento fatorial fracionário. ..................... 70
Figura 34. Gráfico dos valores observados versus valores previstos. ........................ 73
Figura 35. Gráfico de probabilidade normal dos resíduos. ........................................ 74
Figura 36. Gráfico dos resíduos versus valores previstos. ......................................... 74
Figura 37. Perfis para os valores previstos e desejabilidade dos canabinóides. .............................................................................................................. 76
Figura 38. Gráfico de superfície de resposta da função de desejabilidade global (D). .................................................................................................................. 76
Figura 39. Cromatograma obtido pela análise por HF-LPME-GC/MS/MS em cabelo. Fortificação dos analitos na concentração de 1 ng mg-1: 1- CBD; 2- ∆9-THC + ∆9-THC-D3; 3- CBN. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5. ................................................................. 77
Figura 40. Avaliação da seletividade. (A) branco da amostra por HS-SPME (B) branco da amostra por HF-LPME (C) branco da amostra + ∆9-THC-D3 por HS-SPME e GC-MS/MS (D) branco da amostra + ∆9-THC-D3 por HF-LPME e GC-MS/MS. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5. ................................................................................................ 80
Figura 41. Curva analítica para canabidiol pelo método HS-SPME. ......................... 82
Figura 42. Curva analítica para ∆9-tetraidrocanabinol pelo método HS-SPME. ........................................................................................................................ 82
Figura 43. Curva analítica para canabinol pelo método HS-SPME. .......................... 83
Figura 44. Curva analítica para canabidiol pelo método HF-LPME. ........................ 83
Figura 45. Curva analítica para ∆9-tetraidrocanabinol pelo método HF-LPME. ........................................................................................................................ 84
Figura 46. Curva analítica para canabinol pelo método HF-LPME. ......................... 84
Figura 47. Cromatograma de amostra real por HS-SPME obtida de usuário de Cannabis situado em clínica de reabilitação. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5. ................................................................. 94
Figura 48. Cromatograma (GC-MS/MS) de amostra real obtida da análise de cabelo por HF-LPME contendo: 14 pg mg-1 de CBD, 232 pg mg-1 de THC e 107 pg mg-1 de CBN. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5.............................................................................................................. 97
viii
LIS TA DE TABELAS
Tabela 1. Comparação entre as análises de cabelo e urina para determinação de drogas. ........................................................................................................................ 16
Tabela 2. Parâmetros no modo tandem MS/MS para detecção dos canabinóides. .............................................................................................................. 53
Tabela 3. Lista de íons filhos (m/z) do espectro MS/MS dos canabinóides para quantificação (abundância relativa - %). .................................................................... 54
Tabela 4. Resultados dos parâmetros otimizados de SPME na análise de canabinóides em cabelo.............................................................................................. 66
Tabela 5. Variáveis e níveis investigados utilizando o planejamento fatorial fracionário. ................................................................................................................. 69
Tabela 6. Estimativa dos coeficientes de regressão e análise de variância do modelo previsto. ......................................................................................................... 73
Tabela 7. Condições estabelecidas para extração dos canabinóides por HF-LPME. ........................................................................................................................ 77
Tabela 8. Precisão e recuperação absoluta do método HS-SPME. ............................ 87
Tabela 9. Precisão e recuperação absoluta do método HF-LPME. ............................ 88
Tabela 10. Limites de detecção e quantificação dos canabinóides para o método HS-SPME. .................................................................................................................. 90
Tabela 11. Limites de detecção e quantificação dos canabinóides para o método HF-LPME. ..................................................................................................... 90
Tabela 12. Tempo de extração, limites de detecção e quantificação e recuperação dos métodos propostos comparado com outros métodos analíticos por SPME. .................................................................................................................. 91
Tabela 13. Resultados das análises de cabelo a partir de usuários de Cannabis pelo método HS-SPME. ............................................................................................. 93
Tabela 14. Resultados das amostras de cabelo utilizando o método HF-LPME. ...... 96
ix
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS
A i Área interfacial
AMD Desenvolvimento de método automatizado, do inglês Automated Method Development
ASE Extração acelerada por solvente, do inglês Accelerated Solvent Extraction
BSTFA N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoracetamida, do inglês N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
C0 Concentração inicial do analito na matriz
CBCA Ácido canabinocrenóico, do inglês Cannabichromenic acid
CBD Canabidiol, do ingles Cannabidiol
CBDA Ácido canabidiólico, do inglês Cannabidiolic acid
CBGA Ácido canabigerólico, do inglês Cannabigerolic acid
Cf Concentração do analito na fibra no equilíbrio
CH Concentração do analito no headspace no equilíbrio
CID Dissociação induzida por colisão, do inglês Collision-induced dissociation
Cm Concentração do analito na matriz aquosa no equilíbrio
CBN Canabinol, do inglês Cannabinol
CEBRID Centro Brasileiro de Informações sobre Drogas Psicotrópicas
CV Coeficiente de variação
CW Carbowax
D Coeficiente de difusão do analito na fibra
Dm Coeficiente de difusão do analito na matriz
DH Coeficiente de difusão do analito no headspace
x
EI Ionização por elétrons, do inglês Electron ionization
eV elétron-volt
g Grama
GC Cromatografia em fase gasosa, do inglês Gas chromatography
GC-MS Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas, do inglês Gas chromatography-mass spectrometry
GC-MS/MS
Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas no modo tandem, do inglês Gas chromatography/tandem mass spectrometry
hidroxi-∆9-THC 11-hidroxitetraidrocanabinol
HF-LPME Microextração em fase líquida com fibra oca, do inglês Hollow-fiber liquid phase microextraction
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência, do inglês High performance liquid chromatography
HS-SPME Microextração em fase sólida por headspace, do inglês Headspace Solid Phase Microextraction
k Constante de velocidade
keV Quilo elétron-volt
K fm Constante de distribuição fibra/matriz
K fH Constante de distribuição fibra/headspace
KHm Constante de distribuição headspace /matriz
Kow Coeficiente de partição octanol/água
LD Limite de detecção
L f Espessura da fibra
LH Espessura do headspace
LLE Extração líquido-líquido, do inglês Liquid-liquid extraction
Lm Espessura da matriz
xi
LPME Microextração em fase líquida, do inglês Liquid-phase microextraction
LQ Limite de quantificação
min Minuto
mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milimetro
MSn Espectrometria de massas de estágios múltiplos
MS/MS Espectrometria de massas no modo tandem
MSTFA N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoracetamida, do inglês N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
m/v Relação massa/volume
m/z Relação massa/carga
n Número de moles do analito
N Velocidade da barra de agitação
NCI Ionização química negativa, do inglês Negative chemical ionization
ng Nanograma
PA Poliacrilato, do inglês Polyacrylate
P.A Padrão analítico
PCC Planejamento composto central
PDMS Polidimetilsiloxano, do inglês Polydimethylsiloxane
PDMS/DVB Polidimetilsiloxano/divinilbenzeno, do inglês Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene
R Raio da barra de agitação
R2 Coeficiente de determinação
RIA Radioimunoensaio, do inglês Radio-imuno-assay
xii
RPM Rotações por minuto
RSD Desvio padrão relativo, do inglês Relative standard deviation
SDME Microextração em gota suspensa, do inglês Single-drop microextraction
SFE Extração com fluido supercrítico, do inglês Supercritical fluid extraction
S/N Relação sinal/ruído
SPE Extração em Fase Sólida, do inglês Solid-phase extraction
SPME Microextração em Fase Sólida, Solid-phase microextraction
te Tempo de equilíbrio
THCA Ácido ∆9-tetraidrocanabinólico A, do inglês Tetrahydrocannabinolic acid
THC-COOH Ácido 11-nor-9-carboxi-∆9-tetrahidrocanabinol
Vf Volume da fibra
VH Volume da fase headspace
Vm Volume da matriz
Vorg Volume da fase orgânica
α Espessura da fase polimérica da fibra
β0 Coeficiente de transferência de massa total
∆9-THC ∆9- tetraidrocanabinol, do inglês ∆9- Tetrahydrocannabinol
µg Micrograma
µL Microlitro
µm Micrometro
xiii
RESUMO
O consumo de drogas de abuso tem criado diversos problemas de ordem moral, social e econômica, além de não possuir fronteiras de classes sociais, educacionais e religiosas. A análise químico-toxicológica é um recurso indispensável para confirmar a exposição de pessoas a essas drogas. Dependendo da finalidade da análise, diversas matrizes biológicas podem ser utilizadas. Atualmente, o cabelo é reconhecido como uma das principais amostras biológicas para determinação de drogas, ao lado da urina e do sangue. A coleta de amostras de cabelo é um processo simples, não invasivo, sendo difícil sua adulteração. As técnicas baseadas na minituarização de extração têm ganhado um papel importante no cenário mundial frente às técnicas convencionais. Entre essas técnicas destacam-se a microextração em fase sólida (SPME) e a microextração em fase líquida (LPME). No presente trabalho, um método analítico foi desenvolvido para determinação de ∆9-tetraidrocanabinol (∆9-THC), canabidiol (CBD) e canabinol (CBN) em cabelo humano por microextração em fase sólida no modo headspace (HS-SPME) e microextração em fase líquida por fibra oca (HF-LPME) por cromatografia em fase gasosa e espectrometria de massas operando no modo tandem (GC-MS/MS). Na etapa de preparação da amostra, uma pequena massa de cabelo (10 mg) foi descontaminada com éter de petróleo (2 mL) por 10 minutos em ultra-som (3X), seguida de digestão alcalina (NaOH 1 mol L-1). Um planejamento univariado foi utilizado para o estudo das condições ótimas dos parâmetros de HS-SPME, tendo sido deferidos: pH (10), temperatura (90 ºC); massa de cabelo (10 mg); tempo de extração (40 min); tempo de dessorção (10 min); força iônica (Na2CO3); tempo de saturação (10 min) e fibra (PDMS). Para HF-LPME um planejamento fatorial fracionário foi empregado na triagem de algumas variáveis desta técnica seguido pelo planejamento composto central na avaliação dos valores ótimos das variáveis escolhidas: solvente de extração (acetato de butila), pH da fase doadora (14), velocidade de agitação (600 rpm), tempo de extração (20 min), força iônica (6,8 % m/v) e volume da fase aceptora (20 µL). Os métodos foram submetidos ao processo de validação demonstrando boa linearidade, com coeficientes de determinação (R2) acima de 0,994. A precisão foi determinada a partir dos limites inferior e superior da faixa linear apresentando valores de RSD entre 6,6 e 16,4% para HS-SPME e 4,4-13,7 % para HF-LPME. Recuperações absolutas foram de 1,1 a 8,7 % (HS-SPME) e 4,4 a 8,9 % (HF-LPME). Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram de 7 a 62 pg mg-1 e 0,5 a 20 pg mg-1 para HS-SPME e HF-LPME, respectivamente. O ∆9-THC apresentou valores de limites de quantificação para os dois métodos abaixo do valor de cut-off (LQ ≤ 100 pg mg-1). Finalmente, os métodos desenvolvidos e validados foram aplicados na determinação de CBD, ∆9-THC e CBN em amostras de cabelo de pacientes de centro de reabilitação de dependentes químicos. As concentrações dos canabinóides nas amostras variaram do limite de detecção a 18 pg mg-1 para CBD, do limite de detecção a 232 pg mg-1 para ∆9-THC e 9-300 pg mg-1 para CBN, demonstram a aplicabilidade do método em estudos de monitorização. Palavras-Chave: Canabinóides, cabelo, microextração em fase sólida, microextração em fase líquida, cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas.
xiv
ABSTRACT
The drug abuse has created several problems, moral, social and economical, and does not have borders of social class, educational and religious. The chemical-toxicological analysis is an indispensable resource to confirm the exposure of humans to these drugs. Depending on the purpose of analysis, various biological matrices can be used. Nowadays, hair is being recognized as a third fundamental biological sample for drug testing besides urine and blood. The collection of hair samples is simple, noninvasive being difficult its adulteration. The techniques based on the miniaturization of extraction have gained an important role on the world stage in relation to conventional techniques. Among these techniques, stand out to solid phase microextraction (SPME) and liquid phase microextraction (LPME). In this work, a analytical method was developed for determination of ∆9-tetrahydrocannabinol (∆9-THC), cannabidiol (CBD) and cannabinol (CBN) in human hair by headspace solid-phase microextraction (SPME) and hollow fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME) using gas chromatography coupled to mass spectrometry, operating in tandem mode (GC-MS/MS). Initially, in step sample preparation, a small mass of hair (10 mg) was decontaminated with petroleum ether (2 mL) for 10 minutes of ultrasound application (3 times) followed by alkaline digestion (NaOH 1 M). A univariate design was used for the determination the better condictions of the parameters of HS-SPME: pH (10), temperature (90 °C), mass of hair (10 mg), extraction time (40 min), desorption time (10 min), ionic strength (Na2CO3), saturation time (10 min) and fiber (PDMS). For HF-LPME a fractional factorial design was used in the screening of some variables of this technique followed by central composite design in the evaluation of optimal values of variables. The variables assessed and the optimum values of these were: extraction solvent (butyl acetate), donor phase pH (14), agitation speed (600 rpm), extraction time (20 min), ionic strength (6.8 % m/v) and acceptor phase volume (20 µL). The methods were submitted to the validation process showed good linearity with coefficient of determination (R2) above 0.994. Precision was determined using two different concentrations (upper and lower limits of the linear range) and RSD values were between 6.6 and 16.4 % for HS-SPME and 4.4-13.7% for HF-LPME. Absolute recoveries were in the range 1.1 to 8.7 % (HS-SPME) and 4.4 to 8.9 % (HF-LPME). The limits of detection and quantification ranged between 7-62 pg mg-1 and from 0.0005-0.020 ng mg-1 to HS-LPME and HF-LPME, respectively. The ∆9-THC showed values of limits of quantification for both methods below the cut-off (LQ ≤ 100 pg mg-1). Finally, the methods developed and validated were applied in determining CBD, ∆9-THC and CBN in hair samples of patients from a center of rehabilitation for drug addicts. The concentrations were in the range of LD-0.018 ng mg-1 for CBD, LD-232 pg mg-1 for ∆9-THC and 9-300 pg mg-1 for CBN show the applicability of the method in monitoring studies. The concentration of cannabinoids in the samples ranged from limit of detection to 18 pg mg-1 for CBD, limit of detection to 232 pg mg -1 for ∆9-THC and 9 to 300 pg mg-1 to CBN demonstrate the applicability of the method in monitoring studies.
Keywords: Cannabinoids, hair, solid-phase microextraction, hollow fiber liquid-phase microextraction, gas chromatography−tandem mass spectrometry.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Cannabis sativa
A Cannabis sativa (Cannabis) é um arbusto, classificado pelo naturalista e
médico sueco, Carolus Linneaus como Cannabis sativa L. em 1753. Os seus efeitos
medicinais e euforizantes são conhecidos há mais de quatro mil anos. Na China,
existem registros históricos das suas ações medicinais desde o século III a.C. No
início do século passado, passou a ser considerada um “problema social”, sendo
banida legalmente na década de 30. O seu uso médico declinou lentamente, pois
pesquisadores não conseguiram isolar os seus princípios ativos em função da rápida
deterioração da planta. Alguns países começaram a relacionar o abuso da maconha à
degeneração psíquica, ao crime e à marginalização do indivíduo. Nas décadas de 60 e
70, o seu consumo voltou a crescer significativamente, chegando ao ápice no biênio
1978/1979. (RIBEIRO et al., 2005).
De certa maneira, a história do Brasil está intimamente ligada à planta
Cannabis sativa, desde a chegada à nova terra das primeiras caravelas portuguesas
em 1500. Não só as velas, mas também o cordame daquelas embarcações, eram
feitas de fibra de cânhamo, como também é chamado a planta. Aliás, a palavra
maconha (denominação da Cannabis sativa no Brasil) em português seria um
anagrama da palavra cânhamo.
A Cannabis sativa é uma planta dióica, pois tem espécimes masculinas e
femininas. A planta masculina geralmente morre após polinizar a planta feminina.
Outros nomes atribuídos aos produtos da Cannabis são marijuana, hashish, charas,
bhang, ganja e sinsemila. Hashish (haxixe) e charas são os nomes dados à resina seca
extraída das flores de plantas fêmeas, que apresenta a maior porcentagem de
2
compostos psicoativos (de 10 a 20 %). Os termos ganja e sinsemila são utilizados
para definir o material seco encontrado no topo das plantas fêmeas, contendo cerca
de 5 a 8 % de compostos psicoativos. Bhang e marijuana são preparações com menor
conteúdo (2 a 5 %) de substâncias psicoativas extraídas do restante da planta
(HONÓRIO et al., 2006).
A composição química da Cannabis tem sido estudada por muitos anos.
Aproximadamente 500 compostos foram identificados na planta destacando-se:
terpenos, açúcares, hidrocarbonetos, esteróides, flavonóides, compostos
nitrogenados, aminoácidos, entre outros (RADWAN et al., 2008).
1.2 Canabinóides
Entre os compostos presentes na Cannabis, ressaltam-se os canabinóides
que são encontrados exclusivamente nesta planta. Os canabinóides são compostos
terpenofenólicos com 21 átomos de carbono e representam a principal classe dentre
os constituintes da Cannabis. Estes compostos são secretados pelos tricomas da
planta. Essas tricomas são encontradas em partes específicas das inflorescências nas
espécies masculina e feminina (Figura 1), sendo que esta região contém as maiores
concentrações dos canabinóides seguido pelas folhas. Menores quantidades são
encontradas no caule e raiz e nenhuma nos frutos (DE BACKER et al., 2009).
Até o momento, 86 canabinóides foram isolados da Cannabis (AHMED et
al., 2008). O primeiro estudo sobre o isolamento, em forma pura, de um princípio
ativo da Cannabis, o ∆9-tetraidrocanabinol (∆9-THC) foi reportado em 1964 por
Gaoni e Mechoulam. Devido ao grande interesse nos efeitos causados pelos
compostos extraídos da Cannabis, vários estudos têm sido realizados com o objetivo
de identificar possíveis relações entre a estrutura química e a atividade biológica
apresentada por estes compostos. Na década de 70, vários canabinóides foram
isolados e sintetizados e as principais rotas de síntese e biossíntese foram elucidadas
(BRENNEISEN, 2007).
3
Figura 1. Morfologia da planta Cannabis sativa. 1- Broto; 2- inflorescência masculina; 3- flôr masculina; 4- inflorescência feminina; 5- flôr feminina; 6-fruto; 7- semente.
Fonte: TINDALL et al., (2005, p. 52)
Os canabinóides são biossintetizados pelo metabolismo da planta na forma
de ácidos carboxílicos. Os tipos mais comuns encontrados são o ácido ∆9-
tetraidrocanabinólico A (THCA), ácido canabidiólico (CBDA) e o ácido
canabigerólico (CBGA). O CBGA é o precursor direto do THCA, CBDA e o ácido
canabinocrenóico (CBCA). Como o grupo carboxil é instável, este é facilmente
perdido na forma de CO2, sob influência de luz, calor, estocagem prolongada ou
quando a Cannabis é consumida, resultando em seus análogos neutros
correspondentes: ∆9-THC, canabidiol (CBD) e canabigerol (CBG). A conversão mais
importante é a transformação do THCA em ∆9-THC, o qual é o principal constituinte
psicoativo presente na Cannabis. O CBD apresenta significante efeito
4
anticonvulsivante e sedativo, não sendo um componente psicoativo. O CBN
apresenta atividade antiinflamatória, e seu efeito psicoativo é observado apenas por
via intravenosa (THAKUR et al., 2005).
Várias condições durante os estágios de crescimento, colheita,
processamento, estocagem e o uso podem induzir a formação de subprodutos dos
canabinóides. O subproduto mais comum encontrado é o canabinol (CBN),
produzido pela degradação oxidativa de ∆9-THC sob influência de calor e luz. O ∆9-
THC pode também ser transformado pela isomerização do ∆8- tetraidrocanabinol. A
Figura 2 mostra a rota de biossíntese dos principais canabinóides encontrados na
Cannabis (STOLKER et al., 2004).
Um cigarro típico de maconha contém cerca de 0,3 a 1g de maconha. A
concentração de ∆9-THC nas diferentes apresentações da Cannabis (maconha,
haxixe, skunk) varia de 1 % a 15 %, ou seja, de 2,5 mg a 150 mg de ∆9-THC.
Estima-se que a concentração mínima preconizada para a produção dos efeitos
euforizantes seja de 1 % ou um cigarro de 2 a 5 mg (ADAMS; MARTIN, 1996).
5
Figura 2. Rota de biossíntese para a produção dos principais canabinóides e subprodutos do ∆9-THC. (∆T = aquecimento, [O] = oxidação, [I] = isomerização).
Fonte: De Backer et al., (2009, p. 4116)
1.3 Perfil de consumo
Segundo o relatório mundial sobre drogas, promovido pela
Office on Drugs and Crime
droga ilícita mais consumida
média no ano de 2007, equivalente a 3,8
anos.
O II levantamento domiciliar sobre
realizado em 2005 envolvendo as 108 maiores cidades do Brasil
demonstrou que 8,8
idade consumiram maconha
resultado com outros estudos pode
como EUA (40,2 %), Reino Unido (30,8
e Chile (22,4 %). Mas superior à Bélgica (5,8
os dados deste estudo
etárias são maiores para o sexo
o sexo feminino. O consumo se inicia
um máximo para os dois sexos entre 18 e
mais de 35 anos (5,6
Figura 3. Prevalências sobre (porcentagem)psicotrópicas (exceto Álcool e Tabaco).
0
5
10
15
20
25
Qua
lque
r dr
oga
22,8
%
Perfil de consumo e efeitos da maconha
o relatório mundial sobre drogas, promovido pela
Office on Drugs and Crime em 2009 (UNODC, 2009), a maconha
consumida mundialmente, com 166,4 milhões de usuários
no ano de 2007, equivalente a 3,8 % da população na faixa etária entre
evantamento domiciliar sobre o uso de drogas psicotrópicas
realizado em 2005 envolvendo as 108 maiores cidades do Brasil
% da população pesquisada (Figura 3) entre 12 e
idade consumiram maconha pelo menos uma vez na vida. Comparando
resultado com outros estudos pode-se verificar que é bem menor que o de países,
%), Reino Unido (30,8 %), Dinamarca (24,3 %),
%). Mas superior à Bélgica (5,8 %) e Colômbia (5,4
deste estudo, que as porcentagens de uso de maconha, em todas
para o sexo masculino, em média três vezes superior
consumo se inicia já na idade de 12 a 17 anos (4,1
para os dois sexos entre 18 e 24 anos (17,0 %), diminuindo na faixa de
%).
. Prevalências sobre (porcentagem) uso na vida de diferentes drogas ópicas (exceto Álcool e Tabaco).
Fonte: UNIFESP (2005, p. 39).
Qua
lque
r dr
oga
Mac
onha
Sol
vent
e
Ben
zodi
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Ore
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Est
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Cra
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Bar
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Ant
icol
inér
gico
s
22,8
5,8 6,1 5,64,1 3,2 2,9 1,9 1,3 1,1 0,9 0,7 0,7 0,5
6
o relatório mundial sobre drogas, promovido pela United Nations
), a maconha continua sendo a
milhões de usuários em
pulação na faixa etária entre 15 a 64
o uso de drogas psicotrópicas no Brasil
realizado em 2005 envolvendo as 108 maiores cidades do Brasil (UNIFESP, 2005)
entre 12 e 65 anos de
Comparando-se esse
bem menor que o de países,
%), Espanha (22,2 %)
%) e Colômbia (5,4 %). Nota-se com
, em todas as faixas
superior ao uso para
anos (4,1 %) e atinge
%), diminuindo na faixa de
uso na vida de diferentes drogas
Ant
icol
inér
gico
s
Mer
la
Her
oína
0,5 0,2 0,09
7
Um estudo sobre o consumo de drogas psicotrópicas entre estudantes do
ensino fundamental e médio da rede pública de ensino nas 27 capitais brasileiras
realizado em 2004 pelo CEBRID (Centro Brasileiro de Informações sobre Drogas
Psicotrópicas, da Universidade Federal de São Paulo) informa que a porcentagem
dos estudantes do ensino fundamental e médio nas 27 capitais brasileiras que já
fizeram uso de maconha foi de 5,9 %. No estudo domiciliar de 2001, a porcentagem
de uso na vida para a faixa etária de 12 a 17 anos foi de 3,5 %. As regiões que
apresentaram as maiores porcentagens de uso de maconha foram a região Sul com
8,5 % e a região Sudeste com 6,6 %. As duas capitais com maior consumo dessa
droga foram as cidades de Boa Vista com 8,5 % (região Norte) e Porto Alegre com
8,3 % (região Sul). A cidade de Aracaju teve uma porcentagem de 5,5 % (CEBRID,
2004).
Quando se fuma um cigarro usual de maconha (considerar um cigarro com
500 mg da erva contendo de 1 a 2% de ∆9-THC, ou seja, equivalente a cerca de 5 a
10 mg de ∆9-THC ) são observados os seguintes efeitos de caráter geral em curto
prazo: período inicial de euforia (“alto”), perda da discriminação de tempo e de
espaço, coordenação motora diminuída, prejuízo da memória recente, hiperemia das
conjuntivas (olhos vermelhos), aumento do apetite com secura da boca e garganta.
Os efeitos a longo prazo são muitos, mas poucos deles são totalmente comprovados.
Aqueles que ainda necessitam de confirmação estão relacionados a um decréscimo
na resposta imune, disfunção dos hormônios sexuais, anormalidades
comportamentais do recém-nascido e malformação congênita. O comprometimento
do sistema pulmonar e cardiovascular está bem esclarecido (MOREAU, 2008).
Pesquisas mostram que a Cannabis pode não causar dependência (como
cocaína, heroína, cafeína e nicotina) e que a suspensão do uso não causa síndrome de
abstinência (como o álcool e a heroína). Seu uso prolongado em certas circunstâncias
causa dependência psicológica, e pode levar ao consumo de outras drogas
psicoativas. Por ser uma poderosa droga psicotrópica e alucinogênica, seu uso
indiscriminado é perigoso (HONÓRIO et al., 2006).
1.4 O uso abusivo de drogas e seus aspectos sociais
8
O consumo de drogas é tão antigo quanto à humanidade, relatado inclusive na
Bíblia. Sua ocorrência ao longo dos anos foi caracterizada como um fenômeno
cultural. Porém, o que se observa nos dias de hoje é uma expansão tão grande e
rápida que podemos falar em epidemia. Ao tratar deste assunto tão complexo, como
o uso abusivo de drogas, não podemos menosprezar aspectos importantes como a
predisposição orgânica, a estrutura de personalidade e a dinâmica familiar. Da
mesma forma, não podemos minimizar a influência da sociedade moderna no uso e
abuso de drogas. Para se “desdrogar” a sociedade são necessárias transformações
estruturais e qualitativas. Falar em prevenção é falar em uma sociedade menos
patológica. Fazendo uma breve comparação do uso de drogas analisados por estudos
histórico-antropológicos de antigamente e nos dias atuais constatamos que:
- Antigamente: o uso de drogas era um elemento de integração. Utilizado na
maioria das vezes por adultos, com objetivos místicos, religiosos, intelectuais ou
guerreiros por certos grupos e em certas circunstâncias. A droga estava inserida
inclusive num contexto sócio-cultural, ou seja, a maconha era utilizada no oriente, o
álcool no ocidente.
- Atualmente: o uso de drogas é utilizado como elo desintegrador, ocupando o
espaço da intimidade das relações interpessoais. A plantação, produção e comércio
das drogas envolvem quantias astronômicas, atingindo o terceiro lugar na
classificação dos “negócios” que mais movimentam o mercado financeiro a nível
mundial. Nesse contexto, as pessoas usam as drogas porque encontram nelas algum
tipo de prazer ou de alívio para o desprazer. O álcool, anfetaminas e tranquilizantes,
ou drogas ilegais como a maconha, cocaína e heroína, sempre, trazem, pelo menos
num primeiro momento, certa sensação de bem estar, a impressão de que ficou mais
fácil lidar com os problemas, como questões de interação social (BRAHA, 2008).
Três décadas de pesquisas científica e prática clínica produziram uma
variedade de métodos eficazes para o tratamento contra o consumo de drogas. Dados
documentam que tratamento contra dependência no consumo de drogas é tão eficaz
quanto tratamento da maioria de outras condições médicas crônicas semelhantes.
Apesar de evidência científica que mostra a eficácia do tratamento de abuso de
drogas, varias pessoas acreditam ser ineficaz. Em parte isso é por causa de
expectativas irrealistas. Várias pessoas equiparam a dependência simplesmente ao
9
uso de remédios e por isso esperam que a dependência seja curada rapidamente; e se
isso não acontece, o tratamento é um fracasso (NIDA, 1998).
A Fazenda da Esperança é um centro para recuperação de dependentes de
drogas criada pelo frade franciscano Hans Stapel e pelo leigo Nelson Giovanelli
Rosendo dos Santos em 1979 no município de Guaratinguetá, estado de São Paulo.
Ainda na década de 80, uma segunda fazenda foi criada em Coroatá, no Maranhão,
em 87. Dois anos depois, teve início o trabalho para a construção de uma casa, em
Guaratinguetá, para abrigar mulheres drogadas. Em 90, nasceu o terceiro centro
masculino, em Lagarto (Sergipe). Nos anos seguintes, vieram as fazendas do Sul, do
Norte e do Nordeste, e mais unidades no Sudeste (em Minas e no Rio de Janeiro). Ao
todo são 34 unidades hoje no Brasil e 10 no exterior. O primeiro centro fora do Brasil
foi fundado em Berlim, Alemanha. Depois, vieram as unidades da Fazenda da
Esperança na Rússia, Paraguai, Filipinas, Guatemala, México, Argentina e
Moçambique (FAZENDA DA ESPERANÇA, 2010).
A filosofia de trabalho na Fazenda da Esperança busca não apenas libertar
os jovens do uso de drogas, mas também devolver-lhes a dignidade e o sentido da
vida, preparando-os para retornar a sociedade. Ali, um dos princípios é o trabalho, a
busca de meios para o próprio sustento. O dependente químico precisa desejar e
manifestar a vontade de ter uma vida livre das drogas e do álcool, pedindo uma
segunda chance via carta escrita de próprio punho para ser acolhido, explicando os
motivos que o levaram a solicitar ajuda. Cada jovem é responsável por sua própria
recuperação. A comunidade terapêutica só acolhe as pessoas que pedem ajuda, pois
os internos não ficam em locais fechados por muros ou portões. Tudo é aberto e dá
acesso a rua. A Fazenda da Esperança acolhe pessoas com idade entre 15 e 45 anos e
lhes propiciam moradia, alimentação e outras necessidades básicas para que
continuem firme em sua caminhada rumo ao retorno à vida. Os recuperantes vivem
do seu próprio trabalho como fonte de auto-estima e auto-sustento. Nos 12 meses de
recuperação, só a partir do terceiro mês o recuperante recebe visita dos familiares.
Além da recuperação de toxicodependentes, o projeto Fazenda Esperança contém
outras iniciativas como: projeto de moradia para famílias carentes, creches,
reciclagem de lixo inorgânico, apoio para portadores do vírus HIV positivo em fase
terminal (FAZENDA DA ESPERANÇA, 2010).
10
1.5 Canabinóides em matrizes biológicas convencionais e alternativas
A análise química para a verificação do uso de drogas de abuso vem sendo
requisitada com o objetivo de identificar o usuário para que medidas de controle e
prevenção sejam tomadas, já que o seu uso atinge indivíduos de diversas faixas
etárias e camadas sociais (KIDWELL et al., 1997). Essas análises vêm sendo
utilizadas por diversos segmentos da sociedade e aplicadas para verificar o uso de
drogas no ambiente de trabalho, esporte, no auxílio e acompanhamento da
recuperação de usuários em clínicas de tratamento e com finalidade forense
(SACHS, 1997).
Os canabinóides mais frequentemente determinados em amostras
biológicas são CBD, CBN, ∆9-THC e seus produtos metabólitos. O ∆9-THC é
extensivamente metabolizado pelas enzimas hepáticas. Em humanos mais de 20
metabólitos foram identificados na urina e fezes. Os metabólitos com duas
hidroxilas: 11-hidroxi-∆9-THC e 8-β-hidroxi-∆9-THC são psicoativos, sendo que o
último é menos potente. Concentrações plasmáticas de 11-hidroxi-∆9-THC são
tipicamente menores que 10 % da concentração de ∆9-THC após o consumo da
maconha. Mais dois compostos hidroxilados foram identificados como majoritários:
8-α-hidroxi- ∆9-THC e 8,11-dihidroxi-∆9-THC. A oxidação do 11-hidroxi-∆9-THC
origina o metabolito inativo ácido 11-nor-9-carboxi-∆9-tetrahidrocanabinol (11-nor-
9-carboxi- ∆9-THC ou THC-COOH). Este metabólito pode ser conjugado com o
ácido glicurônico (conjugação, ver Figura 4) e excretado (27%) na urina. A fração
conjugada nas fezes é insignificante. Estudos mostram que os metabólitos urinários
podem ser eliminados durante várias semanas após a interrupção do uso de maconha.
Assim em usuários crônicos, o THC-COOH pode ser detectado na urina até 20 a 60
dias após o início da abstinência. Em usuários ocasionais, este tempo é
aproximadamente de sete dias (MOREAU, 2008; JENKINS, 2008).
11
Figura 4. Via metabólica do ∆9-THC. Fonte: Jenkins (2008, p. 47)
A determinação de drogas de abuso incluindo os canabinóides é realizada
tradicionalmente em sangue e urina (matrizes convencionais). Matrizes alternativas
têm ganhado uma grande importância na toxicologia forense, toxicologia clínica,
controle de dopagem, determinação de drogas no ambiente de trabalho e
monitoramento no tratamento de usuários de drogas de abuso em clínicas de
reabilitação. Estas amostras apresentam algumas vantagens sobre as matrizes
convencionais (sangue e urina), tais como: suas coletas não são invasivas, a
adulteração das amostras é mais dificultosa e o tempo de detecção das drogas é bem
maior. Dentre estas amostras, destacam-se: saliva, suor, unhas e cabelo
(GALLARDO; QUEIROZ, 2008)
A urina é a matriz biológica mais utilizada para a determinação de drogas de
abuso. A evidência do uso de Cannabis por esta matriz se deve principalmente pelo
metabólito carboxilado do ∆9-THC: o ácido 11-nor-9-carboxi-∆9-tetrahidrocanabinol,
na sua forma conjugada ou não-conjugada. Outros metabólitos do ∆9-THC
determinados na urina são: 8-α-hidroxi-∆9-THC, 8-β-hidroxi-∆9-THC, 8,11-
dihidroxi-∆9-THC e 11-hidroxi-∆9-THC. A urianálise tem a vantagem de detectar os
metabólitos do ∆9-THC por um período de tempo relativamente extenso. Estes
metabólitos sendo altamente lipofílicos são distribuídos nos tecidos corporais e
12
lentamente eliminados na urina. Portanto, os metabólitos persistem na urina por
vários dias depois do uso de um único cigarro de maconha. Um período de 3 a 4
semanas pode ser requerido para eliminar todos os metabólitos no caso de usuário
crônico (ELSOHL et al., 2008). Para a análise, a amostra é submetida a uma digestão
alcalina ou enzimática, posteriormente acidificada e extraída por extração líquido-
líquido (LLE- liquid-liquid extraction) ou extração em fase sólida (SPE- solid-phase
extraction). Uma mistura de hexano:acetato de etila, tipicamente 7:1 ou 9:1 (v/v) é
utilizada frequentemente para extração do THC-COOH na urina. Potenciais
problemas que podem ocorrer na determinação de canabinóides em urina incluem
alguns interferentes como outras drogas ácidas, perdas por adsorção durante a
estocagem da amostra e degradação de THC-COOH como consequência de
adulteração pela adição de íons nitrito (NO2-) (TINDALL et al., 2005).
Ao contrário do sangue, as concentrações de canabinóides em urina não são
adequadas para verificação do uso recente de Cannabis. Então, em casos forenses é
importante a avaliação das concentrações de canabinóides em sangue ou plasma,
particularmente os canabinóides ∆9-THC e THC-COOH são detectados em maiores
concentrações. Porém, a análise de canabinóides em sangue ou plasma é complicada
pela dificuldade de separar os analitos dos componentes endógenos lipofílicos e
protéicos, que não estão presentes comumente em urina. Métodos de extração como
LLE (CHU; DRUMMER, 2000) e SPE (D’ASARO, 2000) são bastante utilizados
para extração de canabinóides no sangue com derivação utilizando N,O-
bis(trimetilsilil)trifluoracetamida (BSTFA) e análise por cromatografia em fase
gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS) ou cromatografia líquida de
alta eficiência sem derivação (FOLTZ, 2007).
A saliva tem sido avaliada como uma matriz alternativa para determinação
de drogas de abuso. As drogas são incorporadas na saliva por meio de transporte
ativo (secreção ativa), difusão pelos poros das membranas (ultrafiltração) ou por
difusão passiva a favor do gradiente de concentração (HUESTIS; CONE, 1998).
Atualmente é a matriz de escolha para monitoramento de motoristas sob influência
de drogas ou análise de drogas no ambiente de trabalho. A saliva contém
predominantemente ∆9-THC, em comparação aos metabólitos hidroxi-∆9-THC ou
THC-COOH, devido à contaminação da mucosa oral durante o fumo ou ingestão da
droga. O ∆9-THC é detectado na saliva numa faixa de 2 a 10 horas depois da
13
exposição da droga. A saliva é a matriz que melhor indica o uso recente de uma
determinada droga em relação à urina (MILMAN et al., 2010). Moore et al. (2007)
determinaram CBN, ∆9-THC e THCA em amostras de saliva obtendo concentrações
entre 0,7 e 93 ng mL-1. A determinação de canabinóides em saliva tem sido uma
problemática devido a fatores como: aderência dos canabinóides nos dispositivos de
coleta, análise de baixas concentrações dos analitos em um volume mínimo da
amostra geralmente coletada, a variação do fluxo salivar, que altera a concentração
das espécies no meio, e a potencial contaminação externa no ato de fumar a droga
por meio da mucosa oral (KINTZ; SAMYN, 2002).
A análise de suor é utilizada para monitorar usuários de drogas em
tratamento, vigilância de liberdade condicional e programas de emprego. Múltiplos
mecanismos têm sido sugeridos para a incorporação de drogas no suor incluindo
difusão passiva e migração transdérmica. Para a coleta desta amostra dispõe de
adesivos especiais denominados patches que são aderidos à pele por um período
usualmente de 7 dias. Há poucos estudos da excreção de canabinóides em suor.
Apenas ∆9-THC foi identificado nesta matriz, já os metabólitos 11-hidroxi-∆9-THC
e THC-COOH não foram detectados. A possibilidade de degradação da droga no
adesivo ou pele, reabsorção e perdas de compostos voláteis pelas membranas do
adesivo são algumas das desvantagens na determinação de drogas a partir dessa
amostra (HUESTIS et al., 2008).
A unha pode ser utilizada como uma matriz forense para detecção de drogas
de abuso. De fato, a literatura científica tem reportado a análise de unhas na detecção
de drogas postmortem, detecção de drogas no ambiente de trabalho e exposição de
drogas durante a gestação pela análise da unha de recém-nascidos (PALMIERI et al.,
2000). Drogas são consideradas serem transportadas para a unha pela deposição na
raiz dessa matriz durante o crescimento via fluxo sanguíneo. A presença de drogas
em unhas evidencia a exposição do usuário durante meses a anos. Uma pequena
quantidade de amostra é requerida para análise, tipicamente 10 a 50 mg. A detecção
de ∆9-THC em unhas não é preferível para verificação do uso de Cannabis, pois
pode estar presente a contaminação externa da fumaça do cigarro de maconha nessa
matriz. A determinação do metabólito THC-COOH é preferível considerado um
biomarcador do consumo da droga (PALMIERI et al., 2000). Lemos et al. (1999)
determinaram ∆9-THC e THC-COOH em unhas por GC-MS. Onze das quatorze
14
amostras analisadas foram solubilizadas sob pH básico com concentração média de
1,44 ng mg-1 para ∆9-THC. O metabólito THC-COOH foi detectado em duas de três
amostras extraídas sob condições ácidas com concentração média de 19,85 ng mg-1.
A desvantagem na determinação de drogas nesta matriz é que o mecanismo de
incorporação de drogas ainda não foi estabelecido, dificultando a interpretação dos
resultados encontrados, a inexistência de valores de referência estabelecidos
(LEMOS et al., 1999), bem como as taxas de crescimento da unha são diferentes
entre os dedos, entre os dedos dos pés e das mãos, e mesmo o clima interfere nesse
crescimento.
1.6 Utilização do cabelo como matriz na investigação do consumo de Cannabis
1.6.1 Aspectos históricos
A urina se tornou a mais bem-sucedida matriz biológica para determinação
de drogas de abuso. A popularidade desta matriz para detecção de drogas e seus
metabólitos é provavelmente devido ao fato que, ao contrário do sangue, a coleta de
urina não requer profissional treinado. Contudo, para provar que a amostra é
autêntica, torna-se necessário supervisionar o doador na coleta da amostra. Esta
invasão de privacidade pode causar empecilho para alguns indivíduos resultando em
resistência para participação em programas de determinação de drogas. Como muitas
drogas de abuso são eliminadas do corpo dentro de dois a três dias depois do uso, a
análise de urina é limitada na detecção à exposição de drogas. Sabe-se que, a
determinação de drogas pode ser requerida em algum momento, como uma condição
de emprego, por exemplo. Poucos dias de abstinência antes da amostra ser coletada
resultará em um resultado negativo. Por causa destes problemas associados à análise
de urina, amostras alternativas têm sido investigadas como potenciais indicadores de
exposição a drogas. Atualmente, a mais promissora matriz para detecção de drogas
de abuso é o cabelo (TEBBETT, 1999).
15
Nas décadas de 60 e 70 do século passado, a análise de cabelo foi
inicialmente utilizada para avaliar a exposição a metais pesados, como arsênio,
chumbo ou mercúrio. Pesquisadores presumiram que o cabelo era uma amostra
biológica preferível a sangue e urina para avaliação de substâncias tóxicas presentes
no ambiente, visto que o cabelo poderia reter estas substâncias por um longo período.
A análise de cabelo para compostos orgânicos, especialmente fármacos e drogas de
abuso ocorreu vários anos mais tarde, por causa da falta de sensibilidade dos
métodos analíticos para estas substâncias. Em 1979, Baumgartner e colaboradores
publicaram o primeiro trabalho utilizando radioimunoensaio (RIA) para detectar
morfina em cabelo de usuários de heroína. Ultimamente, métodos cromatográficos
acoplados a espectrometria de massas representam a melhor escolha para
identificação e quantificação de drogas em cabelo por causa de sua capacidade de
separação e sensibilidade (PRAGST; BALIKOVA, 2006).
Tecnicamente, a análise de drogas em cabelo não é mais difícil ou
desafiadora do que outras matrizes alternativas. Hoje, a análise de cabelo é utilizada
como matriz para detecção de drogas de abuso, fármacos, contaminantes ambientais,
hormônios etc (KINTZ, 2008). O uso desta matriz para determinação incluem:
investigação de cadáveres, liberdade condicional, custódia de crianças, casos de
divórcio, investigação de pessoas mortas que sobreviveram por alguns dias depois de
consumir drogas, detecção de único ou múltiplo consumo de drogas, avaliação de
candidatos que almejam obter a carteira de motorista, acompanhamento de usuários
de drogas situados em centro de reabilitação, envenenamento crônico. (SROGI,
2006).
Atualmente, o cabelo é a terceira principal matriz biológica para
determinação de drogas, atrás da urina e sangue (NAKAHARA, 1999). As
substâncias presentes no cabelo (queratina, melanina, lipídios) são estáveis por um
longo período, provendo que as amostras são protegidas da luz e umidade. As
vantagens desta matriz em comparação a sangue e urina são: a coleta de cabelo não é
invasiva, fácil manuseio e não necessita de profissional treinado; apresenta longo
período de detecção de uma substância (meses a anos) dependendo do comprimento
do cabelo, versus poucos dias na matriz urina (Tabela 1). A amostra de cabelo não é
fácil de adulterar por diluição com água (por exemplo, como ocorre em urianálise) e
no caso de suspeita (amostras trocadas ou quebra na cadeia de custódia) é possível
16
coletar outra amostra idêntica do indivíduo. Obviamente, esta última característica é
de grande importância no campo da Ciência Forense.
Tabela 1. Comparação entre as análises de cabelo e urina para determinação de drogas.
Urina Cabelo
Tempo de detecção do analito
1 – 7 dias meses a anos
Reprodutibilidade de outra amostra coletada
não comparável comparável
Potencial invasivo baixo a moderado baixo
Estocagem/manipulação requer refrigeração / possível contaminação bacteriana
temperatura ambiente/ baixo risco
de contaminação bacteriana
Fonte: Srogi (2006)
1.6.2 Anatomia e fisiologia do cabelo
O cabelo é composto de 65 a 95 % de proteínas (queratina), 1 a 9 % de
lipídios, 15 a 35 % de água, 0,1 a 5 % de pigmentos (melanina), quantidades de
elementos minoritários (cálcio, magnésio, potássio, zinco, sódio, cloro etc) e
polissacarídeos. A proteína queratina confere alta estabilidade para usuais
tratamentos químicos e físicos. Esta característica é resultado do alto grau de ligações
dissulfeto (S-S) entre as ligações peptídicas nas moléculas. A queratina é composta
por 21 aminoácidos. Quando estes aminoácidos são agrupados de acordo com o
grupo funcional, há um alto conteúdo de grupos hidroxila, amida primária e
aminoácidos básicos (lisina, arginina, histidina). A queratina no cabelo humano é
caracterizada por conter elevado conteúdo de enxofre, devido à presença do
aminoácido cisteína em grande quantidade (17-19 %) (KRONSTRAND; SCOTT,
2007).
17
Cada fio de cabelo consiste de células queratinizadas conectadas por uma
membrana celular que unidas formam três estruturas celulares concêntricas: a
cutícula, o córtex e a medula (Figura 5). A cutícula é composta por uma única
camada de células alongadas justapostas. A cutícula envolve o córtex central
composto por células queratinizadas longas. No córtex estão presentes os grânulos
pigmentares chamados de melanina, responsáveis pela cor dos fios de cabelo. A
medula se localiza na região central e pode não estar presente se este for muito fino
(HARDING; ROGERS, 1999).
Figura 5. Esquema do segmento de uma fibra de cabelo mostrando as estruturas majoritárias: cutícula, córtex e medula.
Fonte: Harding e Rogers (1999, p.15)
O ciclo de vida do fio de cabelo humano consiste de três estágios: a
anágena, a catágena e a telógena. O ciclo começa com a fase anágena ou fase de
crescimento, na qual o folículo se desenvolve e o cabelo é produzido. A duração
desta fase varia entre 7 a 94 semanas, mas pode permanecer por vários anos
dependendo da região anatômica. Nesse período a taxa média de crescimento é de
0,3 a 0,4 mm/dia (0,9 – 1,2 cm/mês). Durante esta fase, os capilares sanguíneos
fornecem ao redor dos folículos nutrientes e componentes exógenos como drogas e
metais. Estes componentes começam incorporar no fio de cabelo e transportando-os
ao longo dos fios com o seu crescimento. A fase catágena (4 a 6 semanas) é a
18
transição entre o crescimento ativo e a fase de repouso. A raiz começa a queratinizar,
e então o cabelo começa a entrar na fase de repouso, conhecida como telógena. Esta
fase dura de 2 a 3 meses, antes que o crescimento de um novo fio comece a surgir.
Após esta fase, inicia-se um novo ciclo (KRONSTRAND; SCOTT, 2007; PRAGST;
BALIKOVA, 2006).
De aproximadamente um milhão de folículos de cabelo de um humano
adulto, 85 % encontra-se na fase anágena e 15 % permanece no estágio de
quiescência (catágena e telógena). O cabelo na região da cabeça cresce a uma taxa de
aproximadamente 0,22 a 0,52 mm/dia ou 0,6 a 1,42 cm/mês. O crescimento depende
do tipo de cabelo (raça), idade, gênero e localidade anatômica (KINTZ, 2008). Esses
são os principais fatores que dificultam o estabelecimento do valor de referência para
cabelo.
1.6.3 Incorporação e eliminação de drogas
O mecanismo exato para incorporação de drogas no cabelo permanece
pouco claro, requerendo uma investigação minuciosa. Em linhas gerais é proposto
que as drogas podem estar presentes no cabelo por dois processos: adsorção a partir
do ambiente externo e incorporação no folículo capilar durante seu crescimento pelos
capilares sanguíneos que banham esta região. Drogas podem aderir ao cabelo na
exposição por produtos químicos em aerossóis, fumo, ou secreções do suor e das
glândulas sebáceas (sebo). O suor pode conter drogas presentes no sangue. Pela sua
porosidade, o cabelo pode aumentar seu peso em 18 % por absorver líquidos,
transferidos facilmente pelo suor (SROGI, 2006).
Henderson em 1993 propôs um modelo multi-compartimental para
demonstrar a incorporação de drogas no cabelo e geralmente aceita na prática, sendo
composto de três vias: (1) difusão ativa ou passiva dos vasos sanguíneos para a base
do folículo capilar; (2) através do suor pelas glândulas sudoríparas e sebo pelas
glândulas sebáceas que nutrem a fibra capilar durante seu crescimento; (3)
contaminação externa pelo fumo, aerossóis ou poeira (Figura 6). Esse modelo é mais
adequado que o modelo passivo (transferência do sangue para as células da base do
19
folículo capilar) para explicar vários experimentos como: (i) a proporção de drogas e
metabólitos em sangue é bastante diferente que aqueles encontrados em cabelo e (ii)
concentrações de drogas e metabólitos em cabelo diferem notadamente em
indivíduos que recebem a mesma dose. Evidência para a transferência da droga por
meio do suor e sebo pode ser sugerido, visto que drogas e metabólitos estão presentes
nesses dois líquidos em altas concentrações e persistem por um maior tempo que no
sangue (HUESTIS; CONE, 1998). A natureza das substâncias incorporadas
(estrutura, propriedades químicas) como bem as características físico/fisiológicas do
indivíduo influenciam fortemente no qual mecanismo de incorporação predominará
(PRAGST; BALIKOVA, 2006).
.
Figura 6. Incorporação e eliminação de drogas no cabelo. Fonte: Pragst e Balikova (2006, p. 20).
Vários componentes do cabelo foram sugeridos como possíveis sítios
moleculares de ligação e interação de drogas. Dentre estes, a queratina, melanina e
lipídios foram investigados em alguns detalhes para avaliar os mecanismos pela qual
20
estas ligações ocorrem. A ligação de drogas à melanina foi primeiramente publicado
há mais de quatro décadas atrás. Nestes estudos foram demonstrados que moléculas
neutras e iônicas têm a capacidade de se ligar a melanina por forças eletrostáticas
entre grupos catiônicos das drogas e o grupo carboxilado aniônico da melanina.
Forças de van der Walls entre o núcleo aromático indol da melanina e os anéis
aromáticos das drogas, interações hidrofóbicas do núcleo hidrofóbico da melanina
com moléculas alifáticas e ligações covalentes foram também relatados em estudos
in vitro. A ligação de drogas a queratina tem sido muito menos investigada.
Potenciais grupos reativos inerentes a queratina são: carboxila, amida, hidroxila
fenólica, hidroxila alifática, grupos sulfidrila e ligações de hidrogênio podem
também participar na interação droga-matriz. O aminoácido cisteína, o qual contém a
ligação dissulfeto (S-S), é reportado como sendo mais numeroso e reativo
aminoácido presente na queratina do cabelo e é um potencial sítio de ligação para
moléculas nucleofílicas. Drogas podem difundir para células da fibra capilar e
poderiam estar associadas nestas estruturas. Os lipídios presentes nas membranas
celulares do cabelo podem interagir com as drogas. Por exemplo, o ácido graxo
fosfaditilcolina contém grupos aniônicos fosfato e catiônicos como a colina que
podem interagir com drogas catiônicas e aniônicas, respectivamente (CONE;
JOSEPH JÚNIOR, 1996).
Geralmente, a incorporação de drogas para o cabelo a partir do sangue é
controlado por princípios farmacológicos de distribuição de drogas. Moléculas
orgânicas lipofílicas (não-ionizadas) podem facilmente penetrar nas membranas e
difundirem de acordo com o gradiente de concentração. No entanto, para moléculas
hidrofílicas ou íons orgânicos de massa molecular intermediária, as membranas das
células formam uma barreira impermeável. Drogas ácidas ou básicas ionizadas no
pH do plasma podem alcançar a membrana celular seguido por desprotonação e
protonação, respectivamente a um estado neutro (Figura 7). O pKa do composto e o
pH das células são ambos importantes. O pH intracelular dos queratinócitos são mais
ácidos que o plasma e o pH dos melanócitos está entre 3 e 5. Além do mais, uma
grande afinidade da melanina para drogas básicas foi demonstrada in vitro. As baixas
concentrações de drogas ácidas ou metabólitos do ácido salicílico, ácido valpróico ou
∆9-THC (THC-COOH) em cabelo em relação a drogas básicas podem ser explicadas
pelos seguintes parâmetros: o ∆9-THC tem alta afinidade pelas proteínas presentes no
21
plasma, ∆9-THC não exibe afinidade pela melanina e as baixas concentrações de
THC-COOH (pKa = 4,5) em cabelo (36.000 vezes menores que a cocaína) podem ser
devido à carga negativa do grupo carboxílico que seria repelida pela membrana
celular da matriz do cabelo pelo equilíbrio químico desfavorecido (PRAGST;
BALIKOVA, 2006).
Figura 7. Efeito das propriedades ácidas e básicas na incorporação de drogas no cabelo. A = droga ácida; B= droga básica; e = extracelular; i = intracelular.
Fonte: Pragst e Balikova (2006, p. 21).
Drogas incorporadas no cabelo podem ser eliminadas por tratamentos
cosméticos. Entre esses tratamentos incluem: tingimento, descoloração, relaxamento
ou permanente, nas quais a cutícula presente no cabelo começa a danificar-se por
estresse mecânico. De fato, uma diminuição de 1 a 90 % da concentração original da
droga pode ocorrer. O processo de descoloração oxidativa utilizando peróxido de
hidrogênio altera as propriedades físico-químicas do cabelo, uma vez que as ligações
dissulfeto do aminoácido cisteína presente na queratina confere estabilidade ao
cabelo. Isto resulta na formação de ânions perihidroxi (H2O -), nos quais reagem com
a cisteína para formar resíduos de ácido cistéico. Este processo resulta uma perda
aproximada de 15 % desse aminoácido e consequentemente uma possível eliminação
de uma determinada droga associada a este componente. Algumas pesquisas indicam
que a influência de raios ultravioleta e umidade influenciam na concentração de
drogas no cabelo. Por exemplo, canabinóides são particularmente sensíveis a luz
22
solar e umidade. De 11 amostras positivas para ∆9-THC (0,11-1,72 ng mg-1),
somente 3 permaneceram positivos (0,10-0,35 ng mg-1) depois de 10 semanas as
amostras estarem contidas em vasos de quartzo expostos a luz solar e umidade. Na
presença de alta umidade, as concentrações declinaram mais rapidamente. O ∆9-THC
foi o canabinóide mais instável analisado em relação à CBD e CBN (SKOPP et al.,
2000; CONE; JOSEPH JÚNIOR, 1996).
1.6.4 Coleta da amostra de cabelo
Procedimentos de coleta para determinação de drogas em cabelo não tem
sido padronizados. Em muitos estudos publicados, as amostras são obtidas de
localidades randômicas no couro cabeludo. No entanto, o cabelo é coletado
preferencialmente de uma área atrás da cabeça, denominada vértice posterior (Figura
8). Comparada com outras áreas da cabeça, esta área tem menor variabilidade no
crescimento do cabelo, o número de fios na fase de crescimento é mais constante, o
cabelo é menos sujeito a influências relacionadas ao sexo e idade e os fios
permanecem nessa área mesmo em casos de calvície (KINTZ, 2008).
Os fios de cabelo são cortados o mais próximo possível do couro cabeludo e
pode ser estocada a temperatura ambiente em papel alumínio, envelope ou tubo
plástico. Quando não é possível coletar o cabelo no couro cabeludo, por ser muito
curto, o cabelo da área das axilas, braços ou região pubiana poderiam ser coletadas
como uma fonte alternativa na detecção de drogas. Quando a análise seccionada é
realizada, o cabelo é cortado em segmentos de 1, 2, ou 3 cm, nos quais correspondem
a 1, 2 ou 3 meses de crescimento de exposição a uma droga (SROGI, 2006).
23
Figura 8. Procedimento de coleta na região do vértice posterior da cabeça. Fonte: Kintz (2008, p. 70)
1.6.5 Análise de cabelo
Métodos analíticos para a determinação de canabinóides em cabelo
geralmente incluem as seguintes etapas básicas:
1. Descontaminação do cabelo por lavagem com um solvente adequado (éter de
petróleo, diclorometano) que possa remover possíveis canabinóides
adsorvidos na superfície do cabelo;
2. Digestão alcalina ou enzimática do cabelo para facilitar a extração dos
canabinóides;
3. Extração dos canabinóides presentes no cabelo digerido e clean-up (limpeza);
4. Análise instrumental. (FOLTZ, 2007)
1.6.5.1 Descontaminação
A descontaminação para amostras de cabelo é necessária por duas razões.
(1) resíduos de produtos de limpeza para cabelo (xampu, condicionador, géis) assim
24
como, suor, sebo e poeira tipicamente presentes no cabelo podem aumentar o
background. (2) as drogas podem se originar do ambiente, o que contribui para um
resultado incorreto. Este tipo de contaminação externa não é improvável para pessoas
envolvidas com drogas ilícitas (PRAGST; BALIKOVA, 2006).
Os solventes utilizados para descontaminação do cabelo devem remover
impurezas externas o máximo possível, mas não extrair drogas da matriz.
Baumgartner e Hill (1996) estabeleceram um princípio de drogas que são
sequestradas no cabelo por três compartimentos: acessível, o semi-acessível e o
domínio inacessível. As drogas encontradas na superfície do cabelo, por
contaminação externa, ligam-se no domínio acessível de acordo com o modelo multi-
compartimental. Neste domínio, elas são facilmente removidas por soluções de
lavagem. Uma vez que, solventes orgânicos como isopropanol, hexano e
diclorometano são incapazes de alterar a estrutura do cabelo, estes solventes podem
somente remover resíduos oleosos e materiais particulados da superfície, mas não da
estrutura interna do cabelo. Entretanto, drogas podem ser removidas deste domínio
por solventes ou soluções de digestão como metanol, ácidos ou bases
(BAUMGARTNER; HILL, 1996).
Strano-rossi e Chiarotti (1999) analisaram a efetividade de diferentes
procedimentos de descontaminação na contaminação passiva de cabelo. Neste
estudo, amostras de branco de cabelo foram expostas a fumaça do cigarro de
maconha. Várias técnicas de descontaminação foram testadas utilizando solventes e
ultra-som durante um tempo de 10 min. Os autores observaram que três lavagens
consecutivas com éter de petróleo foram adequadas para remover completamente os
canabinóides adsorvidos.
Lavagens de amostras de cabelo por duas vezes utilizando 5 mL de
diclorometano durante 2 min foram considerados suficientes na descontaminação
para determinação de ∆9-THC, CBD e CBN (CIRIMELE et al., 1996).
Subsequentes procedimentos de lavagem usando água deionizada, éter de
petróleo e finalmente diclorometano foram aplicados com sucesso para
descontaminação de canabinóides em cabelo. As soluções de lavagem foram
analisadas por GC-MS (MUSSHOFF et al., 2002).
25
1.6.5.2 Digestão ou desintegração
Os procedimentos de preparação da amostra para análise de drogas ilícitas
ou terapêuticas envolvem a digestão ou desintegração da matriz de cabelo. Estes
procedimentos são divididos em três modos: digestão com álcali, digestão com ácido
e tratamento enzimático. Nessas condições, o solvente penetra na matriz degradando-
a com consequente liberação da droga ligada a matriz por difusão (MUSSHOFF;
MADEA, 2007).
Para extrair canabinóides eficientemente, o cabelo é primeiramente
dissolvido tanto por digestão alcalina como por digestão enzimática. A digestão
alcalina é geralmente favorecida, visto que ela pode ser realizada muito rapidamente
e os canabinóides são estáveis em meio alcalino obtendo alto rendimento na
extração. Depois da adição do padrão interno para quantificação, o cabelo é sujeito a
adição de NaOH (1-2 mol L-1), a 80-95 ºC, por 10-30 min, ou, a 37 ºC, durante uma
noite. A digestão enzimática pode ser realizada para extração de canabinóides
utilizando β- glucuronidase/arilsulfatase por 2 h a 40 ºC. A principal desvantagem
dessa digestão é o alto custo (FOLTZ, 2007).
1.6.5.3 Procedimentos de extração e análise
A determinação de canabinóides em cabelo tem focado no principal
composto psicoativo, o ∆9-THC. As análises são incluídas outros dois canabinóides:
canabinol (CBN) e canabidiol (CBD) que são regularmente encontrados em amostras
de cabelo (MUSSHOFF et al.., 2003). Recentemente foi demonstrado que a soma das
concentrações de ∆9-THC, CBD e CBN foram melhor correlacionadas para reportar
o uso de Cannabis que a concentração individual de ∆9-THC (SKOPP et al., 2007).
A detecção desses três canabinóides em cabelo, submetido ao processo de
descontaminação, indica exposição à Cannabis (BAPTISTA et al., 2002). Para
obtenção de uma prova concreta (distinção da exposição passiva da ingestão
intencional de consumo da droga), ou em casos de objeção do resultado o metabólito
26
THC-COOH pode ser determinado, mas necessita de uma etapa adicional de
derivação (para análise por cromatografia em fase gasosa) para atingir a
sensibilidade de 0,2 pg mg-1, pois a taxa de incorporação deste metabólito no cabelo
é extremamente baixa (NADULSKI; PRAGST, 2007).
Balabanova et al. (1989) foram os primeiros autores a publicar um método
por radioimunoensaio (RIA) na detecção de canabinóides em cabelo seguido por GC-
MS para confirmação de ∆9-THC.
O método de preparação de amostra mais utilizado para determinação de
canabinóides em cabelo na década de 90 foi a extração líquido-líquido (LLE). Em
um trabalho mais recente, Baptista et al., (2002) determinaram ∆9-THC, CBD e CBN
utilizando a LLE em duas etapas utilizando clorofórmio:isopropanol (97:3) e
hexano:acetato de etila (9:1) com derivação e análise por GC-MS.
A extração com fluido supercrítico (SFE- supercritical fluid extraction) foi
realizada por Cirimele et al. (1995a) na extração de canabinóides de amostras de
cabelo.
Um método de extração utilizando SPE foi desenvolvido por Wicks e
Tsanaclis (2005) para determinação de CBN, CBD, ∆9-THC, THC-COOH e 11-
hidroxi- ∆9-THC em cabelo por GC-MS/MS com LD de 0,01 ng mg-1 para os três
primeiros canabinóides. Foi a primeira publicação reportando a análise de 11-
hidroxi- ∆9-THC.
O primeiro trabalho empregando a microextração em fase sólida no modo
direto (DI-SPME) para determinação de canabinóides em cabelo foi de Strano-Rossi
e Chiarotti (1999). O cabelo (50 mg) foi digerido com NaOH (1 mol L-1) a 90 ºC por
15 min. Uma fibra PDMS de 30 µm foi utilizada para extração dos canabinóides (∆9-
THC, CBD e CBN) com LD variando de 0,1 a 0,2 ng mg-1. Este método demonstrou
ser mais rápido em relação à LLE e SPE.
Musshof et al. (2002) utilizaram a microextração em fase sólida no modo
headspace (HS-SPME) pela primeira vez para determinação de ∆9-THC, CBD e
CBN em cabelo (10 mg). Uma fibra de 100 µm PDMS foi empregada com exposição
exposta em headspace por 33 min a 90 ºC. Os canabinóides foram derivados
utilizando N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoractamida (MSTFA). Os limites de
detecção foram de 0,05 a 0,14 ng mg-1.
27
Nadulski e Pragst (2007) determinaram ∆9-THC, CBD e CBN em cabelo
por digestão alcalina com uma etapa de LLE anterior a HS-SPME. Para LLE, a
adição de isooctano (na obtenção do extrato orgânico), derivação com BSTFA e
extração por HS-SPME (PDMS 100µm) a 125 ºC por 25 min. A análise foi realizada
por GC-MS.
De Oliveira et al. (2007) empregaram a HS-SPME sem derivação para
determinação de ∆9-THC, CBD e CBN em cabelo. Uma fibra PDMS 100 µm foi
exposta ao headspace por 40 min a 90 ºC e análise por GC-MS. O limite de
quantificação foi de 0,12 ng mg-1 para os analitos.
A cromatografia em fase gasosa capilar acoplada à espectrometria de
massas (GC-MS) é o método de análise mais empregado na análise de cabelo. As
vantagens de GC-MS incluem a alta resolução da coluna capilar utilizada e a alta
especificidade da ionização por elétrons (EI) no espectrômetro de massas. Juntas
permitem o desenvolvimento de procedimentos sensíveis e seletivos para uma
variedade de drogas ou metabólitos com grande exatidão a baixas concentrações.
(PRAGST; BALIKOVA, 2006).
1.7 Microextração em fase sólida (SPME)
Geralmente, os métodos analíticos envolvem processos como amostragem
(coleta das amostras), preparação da amostra (separação da matriz, concentração,
fracionamento e, se necessário, derivação) separação, detecção e análise de dados.
Estudos mostram que mais de 80 % do tempo de análise é consumido na coleta e
preparo da amostra. Isto é necessário, porque muitos instrumentos analíticos não
podem analisar as amostras diretamente. Diante desses fatos, tem-se buscado o
desenvolvimento de técnicas mais rápidas de preparo de amostras, principalmente
para a análise de amostras complexas. Além da rapidez, outras características
requeridas para um bom método de preparo de amostras são a simplicidade, baixo
custo, repetibilidade e ausência de solventes orgânicos. Algumas técnicas como a
extração com fluido supercrítico (SFE) e extração acelerada por solvente (ASE) têm
cumprido alguns destes requisitos. Apesar da vantagem destas técnicas sobre aquelas
28
clássicas, como LLE e SPE, ainda continuam necessitando grande quantidade de
solvente ou requerem múltiplas etapas na execução da técnica (VAS; VÉKEY,
2004).
A microextração em fase sólida (SPME – solid phase microextraction) é
uma técnica de preparo de amostras que possui a maioria dos requisitos necessários
para uma técnica considerada ideal. A SPME tem encontrado um grande número de
aplicações nos últimos anos, tendo crescido acentuadamente o número de
publicações empregando esta técnica. Esta técnica foi desenvolvida inicialmente para
a análise de compostos voláteis na área ambiental, mas ultimamente, tem sido
aplicada na análise de uma grande variedade de matrizes sólidas, líquidas e gasosas,
e para diversos analitos, de voláteis a não voláteis (PAWLISZYN, 1997).
A SPME foi introduzida por Pawliszyn e colaboradores em 1989 em uma
tentativa de solucionar as limitações inerentes as técnicas de LLE e SPE. SPME
integra extração, concentração, clean-up e introdução da amostra em uma única
etapa. O dispositivo básico de SPME (Figura 9) consiste de um amostrador (uma
espécie de seringa) com um bastão de fibra ótica, de sílica fundida de 100 µm de
diâmetro, com 10 µm de uma extremidade recoberto com um filme fino de um
polímero como polidimetilsiloxano (PDMS), poliacrilato (PA) ou carbowax (CW),
ou de um sólido adsorvente, como carvão ativo microparticulado (Carboxen). As
espessuras dos recobrimentos das fibras comerciais variam de 7 µm a 100 µm e seus
volumes de 0,03 µL a 0,7 µL (VALENTE; AUGUSTO, 2000).
O método se caracteriza por economia no tempo de extração e no custo, por
permitir automação nas análises, reutilização das fibras, rápido processo operacional
e ser portátil. A SPME tem sido rotineiramente utilizada em combinação com
cromatografia em fase gasosa (GC) e GC-MS e aplicada satisfatoriamente para uma
variedade de compostos, especialmente para extração de compostos orgânicos
voláteis e semi-voláteis de amostras ambientais, alimentícias e biológicas (VAS;
VÉKEY, 2004).
29
Figura 9. Esquema do dispositivo comercial de SPME.
Fonte: Theodoridis et al. (2000, p. 51)
O processo de extração envolve a partição entre os analitos na matriz e a
fibra extratora, sendo que este particionamento é controlado por propriedades físico-
químicas dos analitos, da matriz e da fase estacionária. Esta técnica possui duas
etapas: partição dos analitos entre a fibra extratora e a matriz e dessorção dos analitos
concentrados no instrumento analítico. Na primeira etapa, a fibra recoberta com a
fase extratora é depositada em contato com a matriz ou com o headspace. O primeiro
permite que haja partição dos analitos entre a matriz e a fibra (sistema duas fases) e o
segundo a fibra entra em contato com o vapor em equilíbrio com a amostra líquida
ou sólida (sistema três fases). Posteriormente, a fibra contendo os analitos é
transferida para um instrumento, onde a dessorção, separação e quantificação dos
analitos ocorrem. Quando a técnica analítica utilizada é a cromatografia em fase
gasosa, a etapa de dessorção ocorre no injetor do equipamento, onde os analitos são
dessorvidos termicamente e quando se utiliza a cromatografia líquida de alta
eficiência, os analitos são dessorvidos pela fase móvel (PAWLISZYN, 1997).
30
Dois modos básicos de extração (Figura 10) são utilizados na SPME:
extração direta e extração por headspace, na qual é denominada HS-SPME
(headspace-solid phase microextraction).
Figura 10. Modos de extração com SPME. Fonte: Nerín et al. (2009, p. 812)
O procedimento de extração é realizado da seguinte maneira (ver Figura
11): com a fibra retraída no interior do dispositivo de SPME, o septo do vial da
amostra é perfurado pela agulha do dispositivo (1) e a fibra é exposta à amostra
(modo direto ou headspace) com auxílio do êmbolo (2); Após atingir o equilíbrio de
partição do soluto entre as fases (aquosa, polimérica e gasosa), a fibra é novamente
retraída para o interior da agulha e esta é retirada do vial (3). Para análise por GC, a
agulha do dispositivo de SPME é inserida no injetor aquecido (4); e a fibra é exposta
no liner para dessorção térmica (5). Após o tempo de dessorção, a fibra é retraída (6).
Este procedimento pode ser repetido por várias vezes com a mesma fibra, com média
de 100 a 200 extrações (PAWLISZYN, 1999).
31
Figura 11. Procedimento de extração por SPME. Fonte: Ulrich (2000, p. 170)
1.7.1 Aspectos termodinâmicos e cinéticos
A microextração em fase sólida é baseada em um processo de equilíbrio
multifásico. As discussões abaixo se referem ao sistema trifásico (fibra, fase gasosa
ou headspace e matriz), onde durante o processo de extração os analitos migram
entre as três fases até que o equilíbrio seja alcançado, isto é naturalmente um sistema
ideal, sem considerar a heterogeneidade da matriz ou características físico-químicas
do analito, como instabilidade ou degradação (ULRICH, 2000).
A massa total do analito presente durante a extração é representada pela
seguinte relação de balanço de massa:
���� � ���� � ���� � �� (1)
onde, C0 é a concentração inicial do analito na matriz, Cm, Cf, CH são as
concentrações do equilíbrio ou final dos analitos na matriz, fibra e headspace, e Vm,
32
Vf, e VH são os volumes da matriz, fibra e headspace, respectivamente. O coeficiente
de distribuição fibra/headspace pode ser definido como:
� � ��/� (2)
e o coeficiente de distribuição headspace/matriz pode ser definido como:
� � �/�� (3)
A massa do analito absorvido na fibra é determinada por:
� � ���� (4)
e pode ser expressado usando as equações 2-4 como:
� � �� �������� �� ���� ������� (5)
em adição:
�� � �� (6)
e a equação (5), portanto pode ser simplificada como:
� � �������� ����� �������
(7)
Os três termos no denominador da equação 7 representam a disposição do
analito de cada uma das três fases: revestimento da fibra (KfmVf), headspace
33
(KHmVH), e a matriz (Vm). Se não há headspace no sistema (vial para extração
completamente cheio), o termo KHmVH pode ser eliminado da equação (7):
� � �������� �������
(8)
Em muitos casos, a constante de distribuição fibra/matriz é menor referente
à relação do volume da matriz e fibra (Vf << Vm). Neste caso, a capacidade do
volume da matriz é significamente menor que a capacidade do revestimento da fibra
e a equação (8) torna-se:
� � ������ (9)
É visto que, não é necessário que o volume da amostra seja bem definido,
porque a quantidade do analito extraído pela fibra é independente do volume da
matriz (Vm). Isto implica que a relação da concentração do analito entre a amostra e a
fibra em equilíbrio deve compensar por várias ordens de grandeza a diferença de
volume entre as duas fases. As equações acima são limitadas ao polímero de
revestimento líquidos (polidimetilsilosano) onde a extração é baseada no fenômeno
de absorção e fortemente relacionada ao volume da fase. Contudo, para
revestimentos sólidos (adsorção) são, com algumas restrições, análogos para
concentrações baixas do analito (MESTER et al., 2001).
A SPME é um método de extração baseado no equilíbrio, mas naturalmente,
em alguma matriz um efeito exaustivo ocorre na proximidade da fibra, no qual
significa que a concentração do analito da matriz próximo a fibra é sempre menor
que no volume da matriz. Uma perfeita agitação da amostra serve para eliminar este
gradiente de concentração (PAWLISZYN, 1995). O tempo requerido para o
equilíbrio do analito entre a fase polimérica da fibra e a matriz é dependente somente
da espessura do revestimento da fibra e do coeficiente de difusão do analito na fibra:
�� � ��
�� (10)
34
onde, te é o tempo de equilíbrio, α é a espessura da fase polimérica da fibra e D é o
coeficiente de difusão do analito na fase de extração.
Em HS-SPME, a equação 10 é também válida para a estimativa do te se a
matriz e a HS são perfeitamente agitadas. Várias variáveis têm sido levadas em conta
para estimar o te no caso de agitação real (equação 11): espessura do revestimento,
headspace e matriz (Lf, LH e Lm, respectivamente), velocidade de agitação da barra
de agitação (N), raio da barra de agitação (R), coeficiente de difusão do analito na
matriz (Dm) e coeficiente de difusão do analito no headspace (DH) assim como Khm e
Kfm.
�� � 1,8 � �� �� ����."�#$%&�' � ��
",(. �)��,�*%&�'+ . ��,� (11)
As condições que afetam o processo de extração de SPME durante o
desenvolvimento do método destacam-se: tipo de fibra, força iônica, tempo de
extração, temperatura de extração, tempo de saturação, velocidade de agitação, pH,
tempo de dessorção (ULRICH, 2000).
Matrizes biológicas, como por exemplo, o cabelo, contém componentes de
alta massa molecular, como proteínas, que podem interferir na extração por SPME.
Controlam-se estes inconvenientes, quando se substitui a exposição direta da fibra na
amostra pelo modo de headspace (MILLS; WALKER, 2000). Este modo de extração
é frequentemente a técnica de escolha se os analitos são voláteis ou semi-voláteis
utilizando aquecimento moderado da amostra (SNOW, 2000).
1.8 Microextração em fase líquida por fibra oca (HF-LPME)
Recentemente, na procura por novas técnicas de preparação de amostras,
surgiu a miniaturização da técnica de extração líquido-líquido com o objetivo de
reduzir a razão volumétrica entre a fase aquosa e a fase orgânica e favorecer a
transferência dos analitos da primeira para a segunda fase (alto fator de
35
enriquecimento). Isto pode ser obtido usando tanto fases líquidas imiscíveis
(microextração em gota suspensa), quanto membranas separando as fases aceptora e
doadora (extração por membrana) (DE OLIVEIRA et al., 2008).
O conceito de microextração em fase líquida foi introduzido em 1996 por
Jeannot e Cantwell. A microextração em gota suspensa (SDME – single drop
microextraction) envolve o uso de uma microgota de um solvente orgânico suspensa
na ponta da agulha de uma microseringa e mergulhada em uma amostra aquosa
(Figura 12). Durante o processo de extração, os analitos são extraídos da matriz para
a microgota por difusão passiva. Contudo, a SDME não é uma técnica muito robusta
devido à baixa estabilidade da microgota do solvente, na qual é facilmente perdida
durante o processo de extração, especialmente quando é aplicada uma agitação para
acelerar o processo de extração, além da necessidade de pré-tratamento de amostras
bastante viscosas ou contendo material particulado (possível colisão com a
microgota) (PEDERSEN-BJERGAARD; RASMUSSEN, 2008).
Figura 12. Ilustração da extração por SDME. Fonte: Wardencki e Namieśnik (2007, p. 270)
Em função das limitações da técnica de SDME, em termos de estabilidade e
confiabilidade, Pedersen- Bjergaard e Rasmussen introduziram em 1999 a
microextração em fase líquida com fibra oca, (HF-LPME- hollow fiber liquid-phase
36
microextraction) ou simplesmente LPME, que pode ser considerada uma evolução
dos métodos de microextração com solventes. Esta técnica é baseada no uso de uma
simples, descartável, de baixo custo e porosa membrana cilíndrica feita de
polipropileno (Figura 13). A fibra tem porosidade de 70 %, o tamanho do poro de 0,2
µm, espessura da parede da fibra de 200 µm e diâmetro interno de 600 µm
(PEDERSEN-BJERGAARD; RASMUSSEN, 2008).
O volume da amostra aquosa empregado na HF-LPME é tipicamente na
faixa de 0,1 a 4,0 mL, dependendo da aplicação, e o comprimento da fibra é
normalmente de 1,5 a 10 cm. Antes da extração a membrana deve ser imersa em um
solvente orgânico para imobilizá-lo nos poros da mesma, o excesso do solvente deve
ser removido em água ultrapura e o lúmen da fibra é preenchido com microlitros de
uma fase aceptora. O solvente orgânico deve ser imiscível em água para garantir que
ele permaneça dentro dos poros durante a extração sem vazamento para a amostra
aquosa. O volume do solvente imobilizado é aproximadamente de 5 a 30 µL e o
volume do solvente presente no lúmen da fibra varia de 2 a 30 µL (RASMUSSEN;
PEDERSEN-BJERGAARD, 2004).
Figura 13. Membrana de polipropileno utilizada em HF-LPME.
Nenhum aparato específico é necessário para implantação da HF-LPME.
Existem duas configurações principais em que a HF-LPME é empregada:
configuração em “U” (Figura 14), que utiliza duas microseringas de HPLC
conectadas à fibra (mais empregada) na qual uma seringa serve para introduzir o
solvente de extração e a outra para coleta no final da extração. A outra configuração
é tipo “haste”, onde somente uma microseringa é utilizada para injetar e coletar a
37
fase aceptora com a membrana fechada em uma das extremidades (PSILLAKIS;
KALOGERAKIS, 2003a).
Figura 14. Configuração da HF-LPME. Sistema em “U” (A) e sistema tipo haste (B).
Fonte: De Oliveira et al.(2008, p. 638)
Como ilustrado na Figura 15, a HF-LPME pode ser utilizada no modo de
duas ou três fases, de acordo com as características do analito em questão. No modo
duas fases, os analitos são extraídos da amostra aquosa (fase doadora) para um
solvente orgânico (fase aceptora) sendo o mesmo imobilizado nos poros da
membrana. Neste modo, a fase orgânica é diretamente compatível na análise por
cromatografia em fase gasosa. Para obtenção de resultados favoráveis neste modo de
extração, o analito deverá ser moderado ou altamente hidrofóbico, podendo conter
grupos ionizáveis ácidos ou básicos. Para o modo de três fases a fase aceptora é outra
solução aquosa (solução ácida ou alcalina), sendo que, os analitos são extraídos da
amostra aquosa (fase doadora) por meio de um solvente orgânico imiscível em água
imobilizado nos poros da membrana para a fase doadora. Logo, este modo é
conciliável com cromatografia líquida de alta eficiência, eletroforese capilar e
espectroscopia atômica (DADFARNIA; SHABANI, 2010).
38
Figura 15. Modos de extração utilizados na microextração em fase líquida (LPME): duas fases (A) e três fases (B).
Fonte: De Oliveira et al.(2008, p. 639)
Para o sistema de duas fases, este processo pode ser ilustrado com as
seguintes equações:
-.�/012. 3 -/24â678. (12)
onde, A representa o analito. O coeficiente de partição para A é definido como:
9 � �:;<â=>?@�@�:AB;@
(13)
onde, Corgânica é a concentração de A na fase orgânica (fase aceptora) em equilíbrio e
Camostra é a concentração de A na amostra em equilíbrio (fase doadora). Baseado na
equação (13), a recuperação (R) de A no equilíbrio pode ser calculada:
C � D�:;< D�:;<��@�:AB;@
E100% (14)
39
onde, Vorg é o volume total da fase orgânica no sistema (soma do solvente orgânico
presente nos poros da membrana e no lúmen) e Vamostra é o volume da amostra. Da
equação 14, pode ser previsto que a recuperação é dependente do coeficiente de
partição, do volume do solvente orgânico e o volume da amostra. Recuperação
elevada pode ser obtida para compostos com coeficiente de partição elevados. Isto
pode ser alcançado pelas propriedades do solvente orgânico, pH para analitos
ácido/básico e alguns casos pela adição de NaCl em altas concentrações na amostra.
Além disso, pequenos volumes da amostra são vantajosos para obter recuperações
elevadas para extrações em equilíbrio (PEDERSEN-BJERGAARD; RASMUSSEN,
2008).
A cinética de extração para o sistema de duas fases pode ser descrita pela
equação:
�/24â678. � ��H,/24â678. 1 I JKL1' (15)
onde, k é a constante de velocidade definida por:
M � N>�:;<
O� /24â678.;.�/012.�:;<
�@�:AB;@� 1' (16)
Corgânica é a concentração de A na fase orgânica no tempo t, Ai é a área interfacial, β0 é
o coeficiente de transferência de massa total relacionado à fase orgânica. A equação
(16) revela que para extrações rápidas, Ai e β0 deve ser maximizado e Vamostra deve
ser minimizado.
Diferentes parâmetros devem ser otimizados durante o desenvolvimento do
método de HF-LPME, tais como: ajuste do pH da amostra, força iônica, tipo de
membrana, volume da fase doadora e aceptora, tipo de solvente orgânico, tempo de
extração e agitação do sistema (PSILLAKIS; KALOGERAKIS, 2003a).
Em geral, a eficiência de extração alcançada com HF-LPME é maior que a
SDME, uma vez que a membrana oca permite o uso de velocidade de agitação
vigorosa para acelerar a cinética de extração. Além disso, a área de contato entre a
amostra aquosa e a fase doadora é maior que na SDME, favorecendo a taxa de
transferência de massa. O uso de membrana provém à proteção da fase extratora e
consequentemente, a análise de amostras “sujas” é viável. Além disso, o pequeno
40
tamanho dos poros da membrana permite a microfiltração da amostra, produzindo
extratos muito limpos (PENA-PEREIRA et al., 2009).
1.9 Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas no modo tandem (GC/MS/MS)
A cromatografia pode ser combinada a diferentes sistemas de detecção,
tratando-se de uma das técnicas analíticas mais utilizadas e de melhor desempenho.
O acoplamento de um cromatógrafo com o espectrômetro de massas combina as
vantagens da cromatografia (alta seletividade e eficiência de separação) com as
vantagens da espectrometria de massas (informação estrutural e aumento da
seletividade) (VÉKEY, 2001).
A união da cromatografia gasosa com a espectrometria de massas é
relativamente simples, uma vez que as características de funcionamento do
cromatógrafo a gás são suficientemente compatíveis com a necessidade de alto vácuo
do espectrômetro de massas. Quando são utilizadas colunas capilares em GC é
possível conectar a saída da coluna diretamente à fonte do espectrômetro, uma vez
que, em condições normais de operação, o sistema de bombeamento do
espectrômetro de massas é capaz de captar todo o eluente da coluna (CHIARADIA et
al., 2008).
A cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas no
modo tandem (espectrometria de massas acoplada à espectrometria de massas –
MS/MS) é uma técnica normalmente utilizada como confirmatória na identificação
de substâncias e atualmente vem sendo utilizada também para quantificação de
substâncias em amostras de caráter forense. (SEBBEN, 2007).
Os analisadores de massas existentes são: quadrupolo, ion trap, analisador
de tempo de vôo (TOF), eletromagnético, transformador de Fourier. O sistema mais
popular é o do tipo ion trap (captura de íons por quadrupolos tridimensionais), o qual
apresenta uma série de vantagens em relação ao sistema quadrupolo, entre elas:
menor custo, facilidade de limpeza, robustez, excelente analisador para realizar
massas seqüenciais de estágios múltiplos (MSn) e melhor sensibilidade no modo
41
SCAN (varredura linear), pois os íons são analisados no mesmo local em que são
originados (DE HOFFMANN; STROOBANT, 2007).
Neste tipo de analisador a seleção, a decomposição e a subsequente análise
dos íons é realizada na mesma parte do instrumento, de maneira que estes processos
ocorrem separados apenas pelo tempo. Para isso, o trap é ajustado para capturar
todos os íons que entram no espectrômetro de massas e os íons de m/z que não são de
interesse são levados à instabilidade para ocasionar sua ejeção do trap. Os íons
remanescentes no trap são dissociados. Os íons produzidos na dissociação do íon de
m/z selecionado tornam-se sequencialmente instáveis e são liberados do trap para
gerar o espectro de massas (CHIARADIA et al., 2008).
Nas análises no modo tandem (MS/MS) por ion trap, a sequencia de eventos
(Figura 16) geralmente são: primeiramente as moléculas são fragmentadas a 70 eV e
então o sistema é capaz de isolar um íon selecionado (íon pai) expulsando todos os
outros do trap. Este íon isolado é fragmentado utilizando uma energia de excitação
por colisões, denominada CID (Colision Induced Dissociation). As colisões são
realizadas utilizando átomos gasosos ou moléculas, como nitrogênio, argônio ou
hélio, no qual está sempre presente no sistema (gás de arraste) gerando o espectro
obtido do íon pai. (WESTMAN-BRINKMALM; BRINKMALM, 2009).
Na colisão parte da energia cinética translacional é convertida em energia
rotacional do íon pai. A energia cinética translacional do íon pai pode ser aumentada
utilizando-se dois modos de excitação: ressonante e não-ressonante. No modo
ressonante (0 a 1 eV) é submetido uma alta frequência nos pólos dos eletrodos.
Assim, os íons ganham energia cinética adicional com aumento da energia
translacional que é convertida em energia vibracional por colisões com um gás ou
com espécies neutras presentes dentro do trap. O modo não-ressonante (0 a 100 eV)
é baseado na imposição de baixas frequências a partir dos pólos dos eletrodos do trap
com as espécies iônicas de interesse. O íon sofre uma mudança da energia potencial,
na qual é imediatamente convertida em energia cinética pela ação de um campo
elétrico (ANDALO et al., 1998).
Dependendo do tipo de analisador de massa utilizado, uma energia é
solicitada. Baixa energia da CID (1-100 eV) é comum em analisadores como
quadrupolo e ion trap e CID de altas energias (keV) são vistas em analisadores como
o TOF (DE HOFFMANN; STROOBANT, 2007).
42
Figura 16. Princípio de MS/MS.
Fonte: De Hoffmann e Stroobant (2007, p. 190)
Neste sentido, o emprego da cromatografia com detecção por espectrometria
de massas no modo tandem mostra-se vantajoso, uma vez que por MS-MS é possível
obter uma grande quantidade de informação estrutural acerca do analito, o que
assegura sua identificação com maior exatidão em relação às outras técnicas de
detecção cromatográficas, que se baseiam nas características de retenção dos
compostos analisados. Além disso, quando existem compostos que não podem ser
totalmente separados pela técnica cromatográfica empregada, usando MS-MS é
possível detectá-los individualmente se possuírem diferentes massas molares ou
1
2
43
gerarem diferentes espectros de massas. Quando se utiliza MS-MS é possível obter
maior detectabilidade e menores limites de detecção e quantificação do que quando
se utiliza MS, devido aos modos de varreduras possíveis de serem realizados, o que
favorece a sua aplicação à análise de traços (CHIARADIA et al., 2008).
44
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Desenvolver e validar um método analítico para análise de canabinóides em
cabelo humano utilizando as técnicas de extração por microextração em fase sólida
por headspace (HS-SPME) e a microextração em fase líquida com fibra oca (HF-
LPME) e análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas operando no modo tandem (GC-MS/MS).
2.2 Objetivos específicos
• Definir as melhores condições para GC e a seleção dos parâmetros ideais para
MS/MS: íon pai (íon base); íons filhos; energia de excitação; relação sinal/ruído
(S/N).
• Otimização dos parâmetros de extração por HS-SPME (pH, temperatura de
extração, massa de cabelo, tempo de extração, tempo de dessorção, força iônica,
tempo de saturação e tipo de fibra), HF-LPME (tipo de solvente orgânico,
volume da fase aceptora, força iônica, pH, velocidade de agitação e tempo de
extração) na determinação de ∆9-tetraidrocanabinol (∆9-THC ), canabidiol (CBD)
e canabinol (CBN) em cabelo humano por GC-MS/MS.
• Validação analítica dos métodos desenvolvidos: seletividade, linearidade,
precisão, recuperação absoluta, limites de detecção e quantificação.
• Aplicação dos métodos validados em amostras de cabelo de usuários de drogas
de Centros de Reabilitação situados no estado de Sergipe.
45
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
3.1.1 Reagentes, solventes e outros materiais
Hidróxido de sódio micropérola (Synth, Brasil), ácido sulfúrico (95-98 % -
pureza) (Synth, Brasil), carbonato de sódio anidro P.A (Vetec, Brasil), éter de
petróleo P.A (Synth, Brasil), acetona grau HPLC (Tedia, USA), diclorometano grau
HPLC (Tedia, USA), água deionizada purificada pelo sistema Milli-Q® (Millipore),
frasco para headspace de 10 mL (Agilent, USA), termômetro de mercúrio, fita de pH
(Machrey-Nagel, Alemanha), micropipetas automáticas com volumes reguláveis
(Jencons Scientific, USA).
3.1.2 Soluções-padrão
Soluções-padrão estoque em metanol de ∆9-tetraidrocanabinol, canabinol,
canabidiol na concentração de 1mg mL-1 e de ∆9-tetraidrocanabinol deuterado
(padrão interno - ∆9-THC-D3) na concentração de 100 µg mL-1 (Tedia, USA)
Soluções-padrão de trabalho em metanol de ∆9-tetraidrocanabinol,
canabinol, canabidiol de 10 µg mL-1, 1 µg mL-1 e 0,1 µg mL-1 e ∆9-tetraidrocanabinol
deuterado na concentração de 10 µg mL-1, obtidas pela diluição das soluções padrão
estoque.
46
Todas as soluções foram armazenadas a -18°C, conforme as especificações
do fabricante.
3.1.3 Equipamentos e acessórios
� Sistema GC-ion trap-MS/MS: Cromatógrafo a gás modelo CP-3800 associado ao
espectrômetro de massa modelo 4000MS ambos da Varian (Walnut Creek, CA,
USA) equipado com: amostrador automático (autosampler) modelo CP-8400;
injetor SPI (septum-equipped programmable inject); injetor split/splitless e
coluna capilar VF- 5MS (5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano), Factor Four/MS
(Varian, EUA) de sílica fundida (30 m, 0,25 mm d.i., 0,25 µm de espessura do
filme), sistema de aquisição de dados Workstation Star 5.0 (Varian, EUA);
� Dispositivo para microextração em fase sólida (SPME) da Supelco (Bellefonte,
PA, USA) equipado com fibra 100 µm de polidimetisiloxano (PDMS) e 65µm de
polidimetilsiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB).
� Membrana de polipropileno para HF-LPME com diâmetro interno de 600 µm,
espessura de 200 µm e poros de 0,2 µm (Q3/2 Accurel PP, Membrana,
Wuppertal, Germany);
� Microseringa 50 µL (Hamilton, Bonaduz, Switzerland, model 705SNR)
� Balança analítica de precisão, com quatro casas decimais, modelo TE2145
Sartorius;
� Estufa de secagem e esterilização modelo TE-393/1 Tecnal;
� Agitador magnético com aquecimento analógico (Fisher Scientific);
� Ultra-som – Unique Modelo USC1400;
3.2 Métodos
3.2.1 Coleta da amostra
47
Para a análise das amostras reais, os pacientes envolvidos no estudo estavam
situados em Centros de Reabilitação para dependentes químicos no estado de
Sergipe. Os pacientes foram esclarecidos dos objetivos da pesquisa, com garantia do
sigilo das identidades dos participantes. Por meio de um questionário (ANEXO A),
verificou-se o perfil de cada paciente quanto à utilização de maconha, participando
somente os indivíduos que fizeram uso da droga em algum momento de sua vida. A
coleta destas amostras foi realizada de acordo com um procedimento aprovado pelo
Comitê de Ética da Universidade Federal de Sergipe (ANEXO B).
3.2.2 Preparação da amostra
Para o desenvolvimento, validação (obtidas de voluntários que não fizeram
uso de produtos contendo canabinóides) e aplicação do método, as amostras de
cabelo foram coletadas do vértice posterior da cabeça (Figura 17), cortado o mais
próximo possível do couro cabeludo e armazenado à temperatura ambiente em
envelopes de papel. A amostra de cabelo foi cortada cuidadosamente em pequenos
segmentos menores do que 2,0 mm. Uma alíquota de cabelo (10 mg) foi transferida
para um vial 10 mL e submetida à descontaminação prévia com éter de petróleo (2
mL) por 10 minutos em ultra-som. Este procedimento de descontaminação foi
repetido mais duas vezes (STRANO-ROSSI; CHIAROTT, 1999).
48
Figura 17. Coleta da amostra de cabelo
3.2.3 Procedimento por HS-SPME e GC-MS/MS para determinação de
canabinóides no cabelo
A amostra de cabelo (10mg) descontaminada e cortada foi transferida para
um frasco de headspace de 10 mL. Posteriormente, 40 ng do padrão interno
deuterado (∆9-THC -D3) foi adicionado à amostra. A digestão do cabelo foi realizada
por digestão alcalina com 1 mL de NaOH (1mol L-1) a 90ºC por 15 minutos. Após o
resfriamento da solução à temperatura ambiente, o pH foi ajustado a
aproximadamente 10 com H2SO4 (1 mol L-1) e 0,5 g de Na2CO3 (em solução aquosa)
foi adicionado à amostra com auxílio de uma microsseringa (500 µL). Para a
extração dos analitos na matriz o dispositivo de SPME contendo a fibra PDMS (100
µm) foi inserido através do septo do frasco e a fibra foi exposta (modo headspace)
por 40 min a 90ºC sob agitação magnética constante (1000 rpm). Os analitos retidos
na fibra foram dessorvidos termicamente (260 °C) pela exposição no injetor do
cromatógrafo durante 10 min (Figura 18).
49
Figura 18. Esquema do procedimento de SPME para determinação de canabinóides em cabelo.
3.2.4 Procedimento por HF-LPME e GC-MS/MS para determinação de
canabinóides no cabelo
Uma microsseringa de 50 µL para injeção em HPLC (Hamilton, Bonaduz,
Switzerland, model 705SNR) foi utilizada para introduzir a fase aceptora e uma outra
para sua retirada (configuração em “U”). Antes da extração, a membrana de HF-
LPME foi limpa em acetona por ultra-som durante 5 min para remoção de possíveis
contaminantes aderidos na fibra. Depois de seca, a fibra foi cortada manualmente em
um comprimento de 6 cm. Uma nova fibra foi usada para cada extração, evitando
assim carryover entre as análises. Após o processo de descontaminação, a amostra
foi seca à temperatura ambiente. A digestão do cabelo foi realizada por digestão
alcalina com 1 mL de NaOH (1mol L-1) a 90 ºC por 15 min. Após o resfriamento da
solução à temperatura ambiente, foram adicionados 6,8 % de NaCl (m/v). A fibra foi
imersa no solvente orgânico por 10 s para impregnar os poros e, posteriormente, foi
colocada em água ultrapura por 10 s para retirar o solvente orgânico residual, situado
na superfície da fibra. Antes da extração, a microseringa foi lavada 10 vezes com
acetato de butila para evitar carryover e a formação de bolhas de ar. Para a extração,
50
20 µL de acetato de butila foram injetados na fibra e esta foi imersa na matriz
aquosa. A extração foi realizada à temperatura ambiente durante 20 min a uma
velocidade de agitação de 600 rpm. Depois da extração, 5 µL do ∆9-THC-D3 (padrão
interno com 0,2 µg mL-1) em acetato de butila foi adicionado ao extrato,
homogeneizado e 1 µL foi injetado no GC-MS/MS. A Figura 19 mostra o esquema
deste processo de extração.
Figura 19. Esquema do procedimento de HF-LPME para determinação de canabinóides em cabelo.
51
3.2.5 Condições cromatográficas de análise
As seguintes condições foram definidas para a análise dos canabinóides
extraídos do cabelo.
Temperatura do injetor 260 ºC
Programação da Rampa
60 ºC (0 min); 35 ºC min-1 até 255 ºC (1min);
2 ºC min-1 até 280 ºC (2 min).
Gás de arraste Hélio (99,995 %)
Fluxo do gás de arraste 1,0 mL min-1
Temperatura da interface 280 ºC
Temperatura do trap 190 ºC
Temperatura do manifold 50 ºC
Modo de ionização Ionização por elétrons (70 eV)
Modo full SCAN (varredura) 40-500 m/z
Íons pai (m/z)
299 (∆9-THC); 231 (CBD); 295 (CBN); 317
(∆9-THC -D3)
Energia de excitação
1,9 eV (∆9-THC); 0,7 eV (CBD); 1,4 eV
(CBN); 0,6 eV (∆9-THC -D3)
Íons filhos para quantificação (m/z)
217 (∆9-THC); 174 (CBD); 238 (CBN); 302
(∆9-THC -D3)
52
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Desenvolvimento de método por MS operando no modo tandem
Os experimentos iniciais deste estudo foram conduzidos para o
estabelecimento das condições cromatográficas, o que permitiu obter uma
programação de temperatura da coluna satisfatória para uma análise simultânea dos
canabinóides. Esta foi obtida a partir de injeções diretas e individuais dos analitos
(1µL) com concentração de 5 µg mL-1 no GC-MS/MS, operando no modo SCAN
(varredura).
Após o estabelecimento da programação de temperatura da coluna, foi
realizada a escolha dos íons de maior intensidade (íon pai) para cada canabinóide
(Tabela 2 e Figura 20) no modo SCAN para o estudo do AMD (Automated Method
Development). Este é realizado para a obtenção dos íons filhos que são formados a
partir da dissociação induzida por colisão (CID - Colision Induced Dissociation).
Dessa maneira, no desenvolvimento do método cromatográfico no modo
tandem MS/MS é necessário determinar a energia de excitação (CID) adequada para
que ocorra a quebra do fragmento selecionado (íon pai) e obter aumento na
detectabilidade da técnica. Para isso, foi realizado um estudo para determinar a
melhor energia de excitação para os canabinóides. Esse estudo foi realizado
variando-se essa energia de excitação de 0 a 90 elétron-volts (eV) no modo não-
ressonante e 0 a 2 eV no modo ressonante. A Tabela 2 mostra os parâmetros para a
definição das condições ótimas de análise dos canabinóides no modo tandem
MS/MS.
53
Figura 20. Espectro de massa no modo SCAN para os canabinóides. A: ∆9-THC; B: ∆9-THC-D3; C: CBN; D: CBD. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5.
Tabela 2. Parâmetros no modo tandem MS/MS para detecção dos canabinóides.
Canabinóides Íon pai (m/z)
tR*
(min) Energia de excitação (eV) Faixa de massa
(íons filhos) (m/z)
CBD 231 9,76 0,7 165-235
∆9-THC -D3 317 10,49 0,6 200-320
∆9-THC 299 10,52 1,9 150-305
CBN 295 11,10 1,6 220-300
* tR – tempo de retenção
54
A determinação da melhor energia de excitação (CID) foi realizada por
meio da análise comparativa da intensidade do sinal cromatográfico pela razão
sinal/ruído (S/N) obtida referente a cada energia. Os fragmentos originados do íon
pai a partir da CID são chamados de íons filhos. O modo não-ressonante se mostrou
ineficaz para determinação dos canabinóides, pois foram observadas perdas
significativas em detectabilidade em comparação ao modo ressonante, que originou
picos até três vezes mais intensos. A energia de excitação otimizada no modo
ressonante foi a que permitiu maior valor da relação S/N para as moléculas em
estudo (Tabela 2), e por fim escolhidas para o método MS/MS na obtenção dos íons
filhos para posterior quantificação. A Tabela 3 e a Figura 21 demonstram os íons
filhos de maior intensidade, extraídos do espectro MS/MS otimizado para
quantificação.
Tabela 3. Lista de íons filhos (m/z) do espectro MS/MS dos canabinóides para quantificação (abundância relativa - %).
Canabinóide m/z*
CBD
174 (100 %), 175 (16 %)
∆9-THC -D3 234 (33 %), 243 (52 %), 258 (26 %), 302 (100 %)
∆9-THC 193 (55 %), 217 (100 %), 243 (64 %), 257 (78 %)
CBN 238 (100 %), 239 (19 %)
* Íons de quantificação em negrito
O modo MS/MS oferece vantagens sobre o modo SCAN em relação à
seletividade e detectabilidade. No modo MS/MS obtêm-se maior seletividade que o
modo SCAN, pois permanecem no trap apenas o fragmento (íon pai) selecionado para
refragmentação, seguindo para o detector apenas os íons filho. Dessa maneira, o
modo MS/MS é uma ferramenta muito útil na análise de matrizes complexas (como a
amostra de cabelo), pois a amostra pode apresentar outras moléculas que eluem no
mesmo tempo de retenção do analito (interferentes), que no modo SCAN, chegariam
55
juntamente com os analitos ao detector, ocasionando erros na identificação e
quantificação do analito. Além disso, o modo MS/MS muitas vezes apresenta ganhos
em detectabilidade em relação ao modo SCAN, devido a fatores como a obtenção de
maior relação S/N e menor interferência de outros elementos da amostra
(CRISTALE; SILVA; MARCHI, 2008).
Figura 21. Espectro MS/MS (ions filhos) dos canabinóides. A: ∆9-THC; B: ∆9-THC-D3; C: CBN; D: CBD. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5.
Uma vez desenvolvido o método GC-MS/MS, foram realizados os testes
para otimização dos parâmetros de extração por HS-SPME.
56
4.2 Otimização dos parâmetros de extração por HS-SPME
Antes de efetuar os ensaios necessários para validação do método, alguns
parâmetros experimentais foram avaliados durante o desenvolvimento do método na
determinação dos canabinóides em cabelo, objetivando aumentar a velocidade,
detectabilidade e seletividade. Os estudos foram conduzidos para se determinar quais
dos parâmetros envolvidos na técnica de SPME são determinantes na extração dos
analitos na matriz.
Em todos os testes de otimização do método, uma alíquota da amostra do
branco de cabelo (10mg) foi fortificado com 5 ng mg-1 de cada um dos canabinóides
de interesse (∆9-THC, CBN, CBD). Os parâmetros avaliados e seus níveis foram: pH
(4; 7; 10), temperatura de extração (50; 70; 90ºC); massa de cabelo (10; 20; 40 mg);
tempo de extração (20; 30; 40 min); tempo de dessorção (5; 10 min); força iônica
(NaCl; Na2CO3; sem adição de sal); tempo de saturação (10; 20min) e fibra (PDMS –
100µm; PDMS-DVB – 65µm). Cada um dos parâmetros analisados foi realizado em
triplicata, observando a intensidade (área) do pico cromatográfico obtido no GC-
MS/MS.
4.2.1 Fibra
A escolha da fibra de extração foi realizada segundo os critérios de
polaridade do polímero e do analito que devem ser próximos, e do revestimento, que
deve ser resistente a diversas condições químicas (pH, sal, aditivos) e físicas (alta
temperatura). O valor de Kfm (constante de distribuição fibra/matriz) para PDMS é
esperado ser alto para analitos apolares (ULRICH, 2000). A eficiência na extração
(média das áreas dos picos) dos canabinóides é mostrada na Figura 23. A fibra
PDMS (apolar) mostrou uma eficiência maior na extração dos analitos em relação à
fibra PDMS-DVB (bipolar) como era esperada, pois as moléculas dos analitos
estudados apresentam coeficientes de partição octanol-água elevados (Log Kow: CBN
= 7,2; CBD = 8,0; ∆9-THC = 7,2). Uma substância é considerada hidrofóbica
57
quando seu Log Kow ≥ 3,0 (KANAZAWA, 1989), ou seja, as moléculas estudadas
são extremamente lipofílicas, sendo melhor extraídas pela fibra PDMS que tem
característica apolar. Musshoff et al. (2002), Strano-Rossi e Chiarotti (1999), De
Oliveira et al. (2007), Nadulski e Pragst (2007) também utilizaram a fibra PDMS
para análise de canabinóides em cabelo. Aproximadamente 100 extrações foram
realizadas com uma mesma fibra. As condições dos outros parâmetros de extração
estão dispostas na legenda da Figura 22.
0
500
1000
1500
2000
2500
PDMS-DVB 65 µm
PDMS100 µm
Áre
a do
pic
o
Fibras (SPME)
CBD THC THC-D3 CBN
Figura 22. Comparação da eficiência de extração dos canabinóides entre as fibras PDMS (100 µm) e PDMS-DVB (65 µm). Condições: pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e sem adição de sal (N=3).
4.2.2 pH
O pH da extração pode influenciar o coeficiente de distribuição do analito
sendo importante para drogas que possuem grupos dissociáveis que são dependentes
do pH, uma vez que a forma não dissociada (apolar) será extraída pela fibra pelos
processos de absorção/adsorção (LORD, PAWLISZYN, 2000). Conforme mostra a
Figura 23, o teste em pH 10 permitiu maior eficiência de extração para os
58
canabinóides. Para compostos de características ácidas, o pH deve ser ajustado uma a
duas unidades inferior ao pKa do analito, para garantir que os analitos permaneçam
na sua forma não-ionizada em torno de 99% (MESTER et al., 2001). O ∆9-THC, por
exemplo, tem um pKa de 10,6 sendo o pH ótimo teoricamente em torno de 9 a 10.
Em condições ácidas (pH 4), resultados insatisfatórios foram vistos para os
canabinóides, pois se verificou baixa eficiência de extração. Esse fato se relaciona
com a precipitação das proteínas presentes na matriz, vistos a olho nu, na qual os
canabinóides devem se ligar fortemente ao precipitado, diminuindo sua volatilização
e consequentemente diminui a eficiência de extração. O valor de pH 10 foi o valor
mais elevado que foi avaliado, pois acima desse valor pode danificar a fibra de
PDMS. Este valor de pH foi encontrado como o melhor observado também por
Musshoff et al. (2002) e De Oliveira et al. (2007). A Figura 23 mostra os resultados
obtidos para a extração dos canabinóides com diferentes valores de pH e as
condições de todos os outros parâmetros de extração.
4 7 10
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
CBD THC THC-D3 CBNÁ
rea
do p
ico
pH
Figura 23. Variação do pH para extração dos canabinóides em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e sem adição de sal (N=3).
4.2.3 Força iônica
59
O aumento da força iônica do meio, ou seja, a adição de uma determinada
quantidade de sal na amostra pode diminuir a solvatação das moléculas do analito
com perda de solubilidade ocorrendo assim, uma mudança no coeficiente de
distribuição entre a matriz e a fase headspace e consequente aumento na eficiência
de extração por HS-SPME. Este efeito é conhecido como salting out (ULRICH,
2000). Musshoff et al. (2002) observaram que, dentre os diferentes sais, o carbonato
de sódio foi aquele que promovia maior efeito salting out. Neste trabalho, a
utilização do carbonato de sódio, comparada ao cloreto de sódio, revelou ser mais
efetiva em relação à análise sem a adição de sal (Figura 24). Por outro lado, a
comparação do NaCl e a ausência de sal demonstrou uma queda no rendimento da
análise (Figura 25). O sal cloreto de sódio pode aumentar a viscosidade do meio
(agente espessante), reduzindo a velocidade de difusão dos analitos para a fibra (LEE
et al., 1997). De Oliveira et al. (2007) avaliaram diferentes sais na extração de
canabinóides em cabelo e o Na2CO3 foi aquele que promovia maior efeito salting out
comparado com outros sais (cloreto de sódio, sulfato de amônio e sulfato de sódio) e
da análise sem a adição de sal. As condições de análise das variáveis de extração
estão descritas nas legendas das Figuras 24 e 25.
0 25600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
CBD THC THC-D3 CBN
Áre
a do
pic
o
Força Iônica (Na 2CO3) (%)
Figura 24. Influência da força iônica (Na2CO3) para análise dos canabinóides em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min (N=3).
60
0 25
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
CBD THC THC-D3 CBN
Áre
a do
pic
o
Força iônica (NaCl) (%)
Figura 25. Estudo da força iônica ( % NaCl) para análise dos canabinóides em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min (N=3).
4.2.4 Temperatura de extração
Em HS-SPME, o coeficiente de distribuição Khm (headspace/matriz) e Kfh
(fibra/headspace) aumentam seus valores à medida que a temperatura é elevada, e a
velocidade no processo de extração é facilitada, em especial para analitos de
volatilidade baixa a moderada, considerando-se o processo de absorção como
exotérmico e que este seja o mecanismo predominante na interação analito/fibra
(ULRICH, 2000). Em relação às temperaturas analisadas (50, 70, e 90 ºC), observou-
se que a temperatura de 90 ºC promoveu uma eficiência bem superior em relação aos
demais níveis para extração dos canabinóides (Figura 26). Strano-Rossi e Chiarotti
(1999) relataram em seu estudo que baixas temperaturas foram insuficientes para a
volatilização dos analitos no procedimento por headspace. Observa-se que este
parâmetro foi o mais importante para um maior aumento do sinal analítico em
relação aos demais. Temperaturas acima de 90 °C se tornaram inviáveis, pois o
61
sistema entra em ebulição, ocorrendo perda da amostra. As condições experimentais
das outras variáveis de extração estão dispostas na legenda da Figura 26.
50 70 90
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
CBD THC THC-D3 CBN
Áre
a do
pic
o
Temperatura (ºC)
Figura 26. Influência da temperatura de extração na análise dos canabinóide em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; massa de cabelo: 20 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e 25 % (m/v) de Na2CO3 (N=3).
4.2.5 Massa de cabelo
Dentre as massas de cabelo (10, 20 e 40 mg) avaliadas, (Figura 27) a que
apresentou maior rendimento da análise foi de 10 mg (menor nível). A utilização de
massas maiores de cabelo ou de uma matriz apresenta um aumento de
detectabilidade do sistema de detecção, uma vez que a relação matriz/analito é
proporcional. Entretanto devido à complexa estrutura do cabelo, uma maior
quantidade da amostra provoca maior viscosidade pelo aumento de proteínas,
melanina e lipídios (principais substâncias presentes no cabelo) (STAUB, 1999). O
aumento da quantidade destas três substâncias causa também a ligação dos
canabinóides a estas, promovendo assim, menor resposta devido à menor facilidade
de volatilização dos analitos. As condições dos outros parâmetros de extração estão
indicadas na legenda da Figura 27.
62
10 20 30 40
100
350
600
850
1100
1350
1600
1850
2100
2350
CBD THC THC-D3 CBNÁ
rea
do p
ico
Massa de cabelo (mg)
Figura 27. Influência da quantidade de cabelo no rendimento da análise. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e 25 % (m/v) de Na2CO3 (N=3).
4.2.6 Tempo de saturação
O tempo de saturação refere-se ao tempo de volatilização dos analitos para a
fase headspace até atingir o equilíbrio e está relacionado com a constante de
distribuição headspace-matriz, Khm = CeH/Cem (e = equilíbrio). Esse tempo
corresponde, no presente estudo, o intervalo entre o fim da hidrólise alcalina e a
exposição da fibra no headspace. Verificou-se que o aumento no tempo de saturação
(20 min) não resultou em melhora expressiva em relação ao tempo de 10 min (Figura
28). Logo, ocorre uma rápida difusão dos analitos presentes na matriz para a fase
headspace. As condições experimentais das outras variáveis de extração são
mostradas na legenda da Figura 28.
63
10 20
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
CBD THC THC-D3 CBN
Áre
a do
pic
o
Tempo de saturação (min)
Figura 28. Avaliação do tempo de saturação para determinação dos canabinóides em cabelo. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 10 mg; tempo de extração: 30 min; tempo de dessorção: 5 min e 25 % (m/v) de Na2CO3 (N=3).
4.2.7 Tempo de extração
Para assegurar a eficiência do processo de extração, uma das etapas mais
importantes no desenvolvimento de um método empregando SPME é determinar o
tempo necessário para o processo de extração alcançar o equilíbrio entre a fibra e a
amostra. Tipicamente, a extração é considerada completa quando é atingido o
equilíbrio de distribuição entre o analito presente na amostra e o polímero da fibra.
Na prática, isso significa que, quando o equilíbrio é alcançado, a quantidade extraída
é constante, independente do aumento do tempo de extração. A Figura 29 mostra os
diferentes tempos de extração dos analitos que foram ponderados. Para todos os
canabinóides, o melhor tempo de exposição da fibra foi 40 min em relação a 20 e 30
min. A quantidade extraída dos analitos aumenta progressivamente com o aumento
do tempo de extração. No período estudado (40 min), o equilíbrio não foi atingido
para todos os canabinóides. A extração pode ser realizada sem necessariamente
atingir o equilíbrio, desde que as condições de agitação, tempo e temperatura
64
permaneçam constantes (LORD, PAWLISZYN, 2000). As condições dos outros
parâmetros de extração para este teste são mostradas na legenda da Figura 29.
20 30 40
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
CBD THC THC-D3 CBN
Áre
a do
pic
o
Tempo de extração (min)
Figura 29. Avaliação do tempo de extração para absorção dos analitos na fibra. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 10 mg; time de saturação: 10 min; time de saturação: 5 min e 25% (m/v) de Na2CO3 (N=3).
4.2.8 Tempo de dessorção e carryover
O efeito do tempo de dessorção (tempo em que a fibra é exposta no injetor
do cromatógrafo) e “carryover” (quantidade do analito que pode ter ficado na fibra
após a dessorção) foi estudado. O aumento no tempo de dessorção (5 a 10 min)
resultou em uma pequena diferença para os analitos estudados, mostrando que os
canabinóides são rapidamente dessorvidos da fibra (Figura 30). Carryover em SPME
não é um motivo de grande preocupação como em outros métodos, já que se trata de
um processo de equilíbrio. Carryover pode ser um problema somente quando a
concentração do analito na amostra seguinte é tão baixa que o equilíbrio na fibra é
menor do que a concentração causada por carryover de análises anteriores
(GORECKI, PAWLISZYN, 1995). Nos testes de otimização e validação não foi
65
observado o fenômeno de carryover, pois os brancos da fibra foram avaliados
periodicamente durante as extrações, não apresentando nenhum sinal dos analitos nos
cromatogramas. As condições dos outros parâmetros de extração estão indicadas na
legenda da Figura 30.
5 10
600
750
900
1050
1200
1350
1500
1650
1800
1950
2100
CBD THC THC-D3 CBN
Áre
a do
pic
o
Tempo de dessorção (min)
Figura 30. Teste do tempo de dessorção no rendimento da análise dos canabinóides. Condições: fibra: PDMS 100 µm; pH: 10; temperatura de extração: 90 ºC; massa de cabelo: 10 mg; tempo de saturação: 10 min; tempo de extração: 40 min e 25 % (m/v) de Na2CO3 (N=3).
A Tabela 4 e a Figura 31 mostram as condições otimizadas no
desenvolvimento do método proposto por HS-SPME para determinação de ∆9-THC,
CBD e CBN em cabelo humano e o cromatograma característico da análise
otimizada, respectivamente.
66
Tabela 4. Resultados dos parâmetros otimizados de SPME na análise de canabinóides em cabelo.
Parâmetros Valores otimizados
pH 10
Temperatura 90ºC
Massa de cabelo 10 mg
Tempo de extração 40 min
Tempo de dessorção 10 min
Força iônica Na2CO3
Tempo de saturação 10 min
Tipo de fibra PDMS (100 µm)
Figura 31. Cromatograma obtido pela análise por HS-SPME-GC/MS/MS em cabelo. Canabinóides adicionado de padrões na concentração de 1 ng mg-1: 1- CBD; 2- ∆9-THC + ∆9-THC-D3; 3- CBN. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5.
Tempo (min)
kCounts
67
4.3 Otimização dos parâmetros de extração por HF-LPME
Após a otimização dos parâmetros de extração por HS-SPME, algumas
variáveis que controlam a eficiência da microextração em fase líquida por fibra oca
(HF-LPME) foram avaliadas com a finalidade de obter uma resposta máxima (área
do pico) para os canabinóides estudados. As variáveis avaliadas foram: solvente de
extração, tempo de extração, força iônica, velocidade de agitação, pH da fase
doadora e volume da fase aceptora. As extrações foram efetuadas com fortificação de
1 ng mg-1 dos canabinóides.
4.3.1 Seleção do solvente orgânico
Uma etapa crucial na otimização do método para a HF-LPME é a seleção do
solvente de extração (PSILLAKIS; KALOGERAKIS, 2003a). A escolha deve ser
realizada de acordo com algumas características: (1) boa afinidade com os analitos,
(2) baixa solubilidade em água para evitar dissolução na fase aquosa, (3) baixa
viscosidade para aumentar a transferência de massa. Quando o modo de duas fases é
utilizado, o solvente deve ter alta solubilidade para os analitos e compatível com
injeção direta na coluna capilar do GC (PSILLAKIS; KALOGERAKIS, 2003b).
Baseado nestas considerações, seis solventes orgânicos foram investigados, incluindo
tolueno, 1-octanol, isooctano, acetato de butila, ciclohexano, e octano (Figura 32). As
extrações foram realizadas com adição de 12 % de NaCl (m/v) e volume de 20 µL
dos solventes orgânicos foram avaliados durante um tempo de extração e velocidade
de agitação de 20 min a 600 rpm, respectivamente. O acetato de butila demonstrou
ser o melhor solvente entre os seis solventes avaliados em função da maior área do
pico cromatográfico e perda de solvente. Consequentemente, os experimentos
posteriores foram conduzidos com acetato de butila. Quando ciclohexano e tolueno
foram usados, houve a formação de bolhas na superfície da fibra e perda do solvente
durante o processo de extração, que podem ser facilitadas por causa de seus baixos
pontos de ebulição em relação aos demais solventes.
68
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
toluenociclohexanoisoctanon-octanoacetato de butila1-octanol
Áre
a do
pic
o CBD THC CBN
Figura 32. Efeito do solvente de extração na eficiência de extração por HF-LPME. Condições: comprimento da fibra: 6 cm; NaCl: 12 % (m/v); volume da fase aceptora: 20 µL; tempo de extração: 20 min e velocidade de agitação: 600 rpm (N=3).
4.3.2 Planejamento fatorial fracionário
O planejamento fatorial fracionário é bastante utilizado quando um
problema envolve muitas variáveis e se quer reduzir o número de experimentos,
assim como não ocorrem perdas significantes de informações (FERREIRA et al.,
2004). Os fatores e níveis empregados neste planejamento estão listados na Tabela 5
e foram escolhidos a partir de estudos experimentais preliminares e levando em conta
as limitações do sistema experimental. A resposta nesta etapa foi avaliada a partir da
área do pico do ∆9-THC, por ser o analito com menor sensibilidade.
69
Tabela 5. Variáveis e níveis investigados utilizando o planejamento fatorial fracionário.
A Figura 33 mostra o diagrama de Pareto com os resultados para a triagem
das variáveis. A linha vertical do gráfico demonstra se os efeitos são estatisticamente
significativos ou não. As barras que se estendem além da linha, correspondem aos
efeitos que são estatisticamente significativos com um nível de confiança de 95% (p
= 0,05). O valor do teste t de Student foi de 3,1824. O modelo proposto consegue
explicar cerca de 98,4 % da variância indicando um bom ajuste dos dados
experimentais. Conforme os resultados, todas as variáveis e suas interações tiveram
seus efeitos com valores positivos, ou seja, a resposta aumentará quando uma
variável passa do nível menor para o nível maior. Resultados similares foram obtidos
para CBD e CBN.
A força iônica (% de NaCl) foi o fator mais significativo (maior valor
numérico da estatística do teste t de Student) dentre as variáveis estudadas. As
interações de segunda ordem entre as variáveis velocidade de agitação e pH e tempo
de extração e % NaCl também foram significativas, assim como os efeitos principais
de pH e volume da fase orgânica, conforme a Figura 33.
Variáveis
Níveis
Baixo (-1) Central (0) Alto (+1)
(t) Tempo de extração (min) 10 20 30
(pH) pH da fase doadora 4 7 10
(SS) Velocidade de agitação (rpm) 300 600 900
(S) Força iônica (NaCl, m/v%) 0 7.5 15
(O) Volume da fase orgânica (µL) 8 14 20
70
,4632149
-,577237
1,389645
1,446656
1,574931
1,717459
1,959756
2,330328
2,985955
3,071471
3,313768
3,698593
3,769857
3,855374
4,796056
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
Estimativa dos efeitos (valores absolutos)
p=0,05
2x5
1x3
4x5
2x3
(1) tempo de extração (min)
1x5
(3) velocidade de agitação (rpm)
2x4
3x5
1x4
3x4
(4) pH
1x2
(5) volume (fase aceptora) µL
(2) % NaCl
Figura 33. Gráfico de Pareto para o planejamento fatorial fracionário.
A adição de sal (como NaCl, Na2SO4 ou Na2CO3) diminui a solubilidade
dos analitos na matriz, e assim, aumenta o seu particionamento dentro da fase
orgânica (efeito salting out) (PSILLAKIS; KALOGERAKIS, 2003a). Resultados
similares já foram descritos anteriormente em que, o aumento da força iônica
aumentaria a eficiência da extração para o ∆9-THC, CBD e CBN (MUSSHOFF et al.,
2002; SPORKERT; PRAGST, 2000; DE OLIVEIRA et al., 2007). O pH teve
influência importante no aumento da resposta dos analitos, sendo extraídos de forma
mais eficiente no nível maior (pH 10). Em pH ácido (pH 4) foi observado a
precipitação das proteínas contidas no cabelo (observadas a olho nu) que aderiram na
superfície da fibra de LPME, prejudicando possivelmente a difusão dos analitos para
o lúmen e, consequentemente, diminuindo a resposta dos canabinóides. Como o
ponto isoelétrico (valor de pH em que ocorre equivalência entre as cargas positivas e
negativas de uma molécula) do cabelo em geral e da queratina (principal proteína
presente no cabelo) é aproximadamente 4, as forças de repulsão entre as moléculas
71
das proteínas e as forças de interação com o solução aquosa são mínimas
(KIDWELL; BLANK, 1996). Assim, as proteínas (sobretudo a queratina) vão
formando aglomerados que, cada vez maiores, tendem a precipitar. O volume da fase
orgânica (acetato de butila) demonstrou ter importância no rendimento da extração
dos analitos. Um maior rendimento foi obtido à medida que aumenta o volume do
solvente orgânico, devido ao acréscimo do número de moles dos analitos transferidos
para a fase orgânica presente dentro do lúmen da fibra, deslocando a condição de
equilíbrio para esta fase (SALEH et al., 2009). De acordo com o gráfico de Pareto, o
tempo de extração e a velocidade de agitação não foram estatisticamente
significativos no rendimento da extração dos canabinóides. Provavelmente, devido à
condição de equilíbrio já ter sido atingida no nível baixo do tempo de extração, no
domínio escolhido. Verificou-se que uma alta velocidade de agitação produziu
formação de bolhas de ar na superfície da membrana, assim como, promoveu a
evaporação do solvente. Baseado nestes resultados, as variáveis % de NaCl, pH e
volume da fase orgânica foram incluídas no estudo do planejamento composto
central.
4.3.3 Planejamento composto central (PCC)
As variáveis % NaCl (S), pH da fase doadora e volume da fase orgânica (O)
foram incluídas no planejamento composto central para otimização das respostas
máximas dos canabinóides pelo método proposto. Tempo de extração de 20 min e
velocidade de agitação a 600 rpm foram fixados. O planejamento composto central
consiste de 2k corridas fatoriais com 2k corridas axiais (α) e C corridas centrais. O
número total de experimentos necessários (N) é determinado: N=2k +2k + C, onde k
é o número de variáveis e C é um número de pontos centrais (STALIKAS et al.,
2009). Um planejamento composto central 23 (2 níveis com 3 variáveis) foi realizado
com 6 corridas axiais (pontos estrela) e 3 pontos centrais totalizando 17
experimentos (23 + (2×3)+3=17). O valor de α foi ± 1,682 para estabelecer a
condição de rotabilidade. Os níveis deste planejamento estão dispostos na Tabela 6.
72
Tabela 6. Fatores e níveis utilizados no planejamento composto central.
Os coeficientes de regressão de cada termo do modelo e a análise de
variância (ANOVA) dos efeitos são apresentados na Tabela 6. O valor do R2 indicou
que o modelo explica 95,5 % da variabilidade. O gráfico dos valores experimentais
versus valores previstos (Figura 34), o gráfico de probabilidade normal dos resíduos
(Figura 35), e os resíduos versus resposta prevista (Figura 36) foram avaliados. A
Figura 34 revela que o modelo proposto descreve bem os dados experimentais, visto
que os pontos localizam-se próximos à linha reta. A Figura 35 mostra que os pontos
experimentais estão próximos da linha contínua, garantindo assim a normalidade dos
resíduos. A Figura 36 indica que os pontos estão distribuídos de forma aleatória,
caracterizando uma variância constante dos erros. Isto demonstra a confiabilidade
dos dados apresentados neste planejamento.
Variáveis
Níveis
Pontos estrelas (α = 1,682)
Baixo (-1) Central (0) Alto (+1) -α +α
(S) (NaCl; m/v%) 7 11 15 4 18 (pH) 9 11 13 8 14 (O) (µL) 15 20 25 12 28
73
Tabela 6. Estimativa dos coeficientes de regressão e análise de variância do modelo previsto.
Variáveis Coeficientes F* p
Sa -2532, 690 6,770 0,035
pH 9557,399 96,413 0,000
Ob 1,948 0,000 0,998
S2 -1174,504 1,202 0,309
pH2 5089,048 22,565 0,002
O2 -433,986 0,164 0,698
S x pH -4675,375 13,515 0,008
S x O 433,625 0,116 0,743
pH x O -281,375 0,049 0,831
* Fcrítico (1;7;0,05) = 4,45
-5000
5001000
15002000
25003000
35004000
45005000
5500
Valores observados
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Val
ores
pre
vist
os
R2 = 95,5%
Figura 34. Gráfico dos valores observados versus valores previstos.
74
-1000 -800 -600 -400 -200 0 200 400 600 800
Resíduos
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Val
ores
nor
mai
s es
pera
dos
,01
,05
,15
,35
,55
,75
,95
,99
Figura 35. Gráfico de probabilidade normal dos resíduos.
-1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Valores previstos
-1000
-800
-600
-400
-200
0
200
400
600
800
Res
íduo
s
Figura 36. Gráfico dos resíduos versus valores previstos.
75
Um valor de p menor que 0,05 na tabela ANOVA (Tabela 6) indicam que
um efeito é estatisticamente significativo a 95 % do nível de confiança. Os dados
mostram que a porcentagem de NaCl (S) e principalmente o pH tiveram seus efeitos
lineares significativos. O volume da fase orgânica (O) não mostrou algum efeito
significativo na resposta para os termos lineares e quadráticos. Os termos
quadráticos e a interação de segunda ordem de S e pH foram significativos.
As análises dos valores ótimos do PCC foram realizadas pela metodologia
de superfície de resposta utilizando o modelo quadrático, sendo que, as resposta dos
três canabinóides (área do pico) foram transformadas em função do valor de
desejabilidade (D). O valor de D pode ser definido como a média geométrica de
todas as desejabilidades individuais (di): D = (d1 x d2 x ...dn)1/n (BERTELLI et al.,
2008).
Os valores de di variam de 0 (resposta mínima) a 1 (resposta máxima). De
acordo com a Figura 37, a função de D permitiu obter os valores ótimos dos
parâmetros experimentais do CCD, sendo: S = 6.8 %, pH = 14 e O = 28 µL, com D =
1. A Figura 38 mostra o gráfico de superfície de desejabilidade e as combinações
das três variáveis experimentais escolhidas. As regiões em vermelho correspondem
aos valores ótimos para D. Na Figura 38 (A) confirma a existência da interação
significativa negativa entre pH e porcentagem de NaCl, sugerindo que um nível
baixo de sal e alto do pH aumenta a eficiência da extração dos canabinóides. Pode-se
observar também uma diminuição das respostas com concentrações de NaCl
elevadas. Segundo Psillakis e Kalogerakis (2003a) isto é justificado devido a uma
possível alteração das propriedades físico-químicas da amostra, como a tensão
superficial e viscosidade, diminuindo a taxa de transferência de massa dos analitos
para a fase aceptora. Um pH elevado favoreceu uma melhor resposta para os analitos,
também observado por outros autores (MUSSHOFF et al., 2002; NADULSKI;
PRAGST, 2007; STRANO-ROSSI; CHIAROTTI, 1999). As Figura 38 (B) e (C)
mostram a interação do sal e do pH com o volume da fase orgânica, evidenciando
que esta variável não influenciou a eficiência da resposta (ver Tabela 6). Assim, foi
escolhido um valor intermediário de 20 µL do solvente orgânico para a validação do
método.
76
S
-3E4
25815
39331
52848
70000
pH O Desejabilidade
0,
,5
1,
1255
19115
36974
CB
D
-4000
3820
6035
8249
12000
0,
,5
1,
98
2421
4745
TH
C
-15E4
98095
1690E2
2399E2
35E4
0,,5
1,
2820
66989
131200
CB
N
4 6,8 18
1,0000
8 14 12 28
Des
ejab
ilida
de
Figura 37. Perfis para os valores previstos e desejabilidade dos canabinóides.
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
(A)
(B) (C)
S
O OS
pH
pH
Des
ejab
ilid
ade
Des
ejab
ilid
ade
Des
ejab
ilid
ade
Figura 38. Gráfico de superfície de resposta da função de desejabilidade global (D).
77
A Tabela 7 e a Figura 39 mostra as condições otimizadas na determinação
de ∆9-THC, CBD e CBN em cabelo humano por HF-LPME e o cromatograma
característico da análise otimizada, respectivamente.
Tabela 7. Condições estabelecidas para extração dos canabinóides por HF-LPME.
Parâmetros Valores otimizados
Solvente orgânico Acetato de butila
pH 14
Força iônica (NaCl) 6,8 % (m/v)
Tempo de extração 20 min
Velocidade de agitação 600 rpm
Volume da fase orgânica 20 µL
Figura 39. Cromatograma obtido pela análise por HF-LPME-GC/MS/MS em cabelo. Fortificação dos analitos na concentração de 1 ng mg-1: 1- CBD; 2- ∆9-THC + ∆9-THC-D3; 3- CBN. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5.
kCounts
Tempo (min)
78
4.4 Validação
A validação de um método analítico é definida como um processo contínuo
de avaliação, desde a etapa de planejamento, passando pelo desenvolvimento e coleta
de dados, até o monitoramento constante da aplicação e transferência deste (RIBANI
et al., 2004). O objetivo é garantir que os dados gerados possuam a qualidade
necessária, em termos de confiabilidade e rastreabilidade, entre outros para o fim que
se propõe. Assim, deve-se selecionar, estudar e monitorar constantemente os
parâmetros mínimos necessários para garantir a interpretação inequívoca dos
resultados.
A validação do método analítico foi realizada de acordo com as orientações
da Society of Toxicological and Forensic Chemistry (GTFCh) que detalha a respeito
da validação em toxicologia analítica forense e recomendações especiais para
procedimentos em análise de cabelo (PETERS et al., 2004).
Assim, os parâmetros de desempenho selecionados para os métodos de HS-
SPME e HF-LPME foram:
• Seletividade;
• Linearidade;
• Precisão (repetitividade e precisão intermediária);
• Recuperação;
• Limite de detecção e limite de quantificação
As soluções padrão dos canabinóides nas concentrações de 0,01; 0,1, 1, 2, 4
e 8 µg mL-1 em metanol foram preparadas para avaliação dos parâmetros das figuras
de mérito.
79
4.4.1 Seletividade
Uma amostra, de maneira geral, consiste dos analitos a serem medidos, da
matriz e de outros componentes que podem ter algum efeito na medição, mas que
não se quer quantificar. A seletividade está relacionada ao evento da detecção. Um
método que produz a resposta para vários analitos, mas que pode distinguir a
resposta de um analito da de outros, é chamado seletivo (INMETRO, 2007).
Assim, se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a
precisão estarão seriamente comprometidas. Por isso, a seletividade é o primeiro
passo no desenvolvimento e validação de um método instrumental de separação e
deve ser reavaliada continuamente durante a validação e subsequente uso do método
(RIBANI et al., 2004).
A seletividade do método foi avaliada a partir da análise de seis replicatas
de brancos da amostra sem fortificação dos analitos e outra análise em duplicata do
branco da amostra com fortificação do padrão interno (∆9-THC-D3) na concentração
de 4 ng mg-1 para HS-SPME e 1 ng mg-1 para HF-LPME. Um possível acúmulo de
interferentes traços das matrizes a partir destas análises não foi observado nos
cromatogramas. Nas análises da matriz com adição do padrão interno, observou-se
que este não continha os canabinóides analisados. A Figura 40 demonstra que os
métodos obtiveram ótima seletividade, sendo livre da presença de interferentes que
poderiam intervir na determinação dos canabinóides.
80
Figura 40. Avaliação da seletividade. (A) branco da amostra por HS-SPME (B) branco da amostra por HF-LPME (C) branco da amostra + ∆9-THC-D3 por HS-SPME e GC-MS/MS (D) branco da amostra + ∆9-THC-D3 por HF-LPME e GC-MS/MS. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5.
Tempo (min)
81
4.4.2 Linearidade e curva analítica
A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados
linearmente proporcionais à concentração do analito, enquadrados em uma faixa
analítica especificada (BRITO et al., 2003).
Na prática a linearidade é determinada através das chamadas curvas
analíticas, que são gráficos que relacionam a resposta do equipamento em função das
diferentes concentrações do analito (LANÇAS, 2004).
A relação matemática entre a resposta medida e a concentração do analito
nestes casos (modelo linear) pode ser descrita pela equação da reta:
Q � RE � S (17)
Onde:
y = resposta medida (absorbância, área do pico etc)
x = concentração
a = inclinação da curva de calibração (sensibilidade)
b = intersecção com eixo y, quando x = 0.
A correlação é, normalmente, calculada por intermédio do coeficiente r de
Pearson ou pelo coeficiente de determinação R2 (ANVISA, 2003).
Neste caso, o r indica o grau de ajuste do modelo de regressão. Este
parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, quanto mais
próximo de um, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a
incerteza dos coeficientes de regressão estimados a e b. Normalmente um coeficiente
de correlação maior que 0,999 é considerado como evidência de um ajuste ideal dos
dados para a linha de regressão (RIBANI et al., 2004).
A curva analítica foi construída a partir da adição dos padrões na matriz e
posteriormente foram submetidas ao processo de extração por HS-SPME e HF-
LPME. Esta se baseou nas áreas médias dos picos dos analitos utilizando o modo
MS/MS, a partir da análise de duas replicatas para cada ponto. A linearidade da
82
curva analítica foi avaliada por meio das concentrações: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 e 8,0 ng
mg-1 para todos os analitos por HS-SPME e 0,001; 0,02; 0,05; 0,2 e 0,5 ng mg-1 para
CBD e CBN e 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 ng mg-1 para ∆9-THC por HF-LPME. Uma
boa linearidade foi obtida com coeficientes de determinação (R2) acima de 0,994
para todos os analitos nos dois métodos propostos. As Figuras 41 a 46 mostram as
curvas analíticas para os canabinóides avaliados.
Figura 41. Curva analítica para canabidiol pelo método HS-SPME.
Figura 42. Curva analítica para ∆9-tetraidrocanabinol pelo método HS-SPME.
y = 8340,4x + 969,12
R² = 0,9945
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
0 1 2 3 4 5
Áre
a do
pic
o
Concentração (ng mg -1)
Canabidiol
y = 0,2845x - 0,1036
R² = 0,9976
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8
Áre
a re
lativ
a do
pic
o
Concentração ng mg-1
∆∆∆∆9999----Tetraidrocanabinol
83
Figura 43. Curva analítica para canabinol pelo método HS-SPME.
Figura 44. Curva analítica para canabidiol pelo método HF-LPME.
y = 11266x + 4350,3
R² = 0,9991
0
20000
40000
60000
80000
100000
0 2 4 6 8 10
Áre
a d
o p
ico
Concentração (ng mg -1)
Canabinol
y = 8702,9x - 28,789
R² = 0,9943
0
1000
2000
3000
4000
5000
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Áre
a d
o p
ico
Concentração (ng mg-1)
Canabidiol
84
Figura 45. Curva analítica para ∆9-tetraidrocanabinol pelo método HF-LPME.
Figura 46. Curva analítica para canabinol pelo método HF-LPME.
4.4.3 Precisão
Precisão é o termo geral para avaliar a dispersão de resultados entre ensaios
independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões,
y = 0,5565x - 0,0675
R² = 0,9960
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Áre
a re
lativ
a do
pic
o
Concentração (ng mg-1)
Δ9-Tetraidrocanabinol
y = 33275x - 299,54
R² = 0,9942
0
5000
10000
15000
20000
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Áre
a d
o p
ico
Concentração (ng mg-1)
Canabinol
85
em condições definidas (INMETRO, 2007). A precisão é geralmente expressa em
termos de repetitividade e precisão intermediária.
A repetitividade (precisão intra-dia) define a precisão do método em repetir,
em um curto intervalo de tempo, os resultados obtidos nas mesmas condições de
análise, ou seja, com o mesmo analista, com o mesmo equipamento, no mesmo
laboratório e fazendo uso dos mesmos reagentes (CASSIANO et al., 2009).
A precisão intermediária (precisão inter-dias) define a habilidade do método
em fornecer os mesmos resultados quando as análises são conduzidas no mesmo
laboratório, mas em diferentes dias, por diferentes analistas e diferentes
equipamentos. Para a determinação da precisão intermediária, recomenda-se um
mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes e, na maioria das validações
bioanalíticas, adotam-se três dias não consecutivos. (ANVISA, 2003).
Um dos valores numéricos utilizados para expressar a precisão é a
estimativa do desvio padrão relativo (RSD, do inglês relative standard deviation),
também conhecido como coeficiente de variação (CV), dada como:
CTU %' VW �� %' � 0X�
.100 (18)
Onde:
s = estimativa do desvio padrão absoluto
xm = média das medidas em replicatas
A precisão intermediária do método se baseou na análise das amostras de
cabelo com concentrações dos canabinóides (CBD, CBN e ∆9-THC) que corresponde
ao limite inferior e superior da faixa linear da curva analítica para cada método. As
análises foram realizadas em duplicata para cada concentração, executadas em cinco
dias diferentes (N =10). Uma boa precisão foi obtida com desvio padrão relativo
(RSD, %) variando de 6,6 a 16,4 % para HS-SPME e valores de RSD variando de
4,4 a 13,7 % para HF-LPME, obtendo melhor precisão em relação à HS-SPME. Os
valores obtidos são admissíveis, uma vez que os critérios aceitos para precisão são 15
% RSD e 20 % do RSD próximo ao limite de quantificação (PETERS et al., 2007).
86
4.4.4 Recuperação
O ensaio de recuperação constitui o método mais utilizado para exatidão de
processos analíticos, pois reflete a quantidade de determinado analito, recuperado no
processo, em relação à quantidade real presente na amostra (BRITO et al., 2003).
Um conceito bem difundido há alguns anos atrás era que a recuperação
estava diretamente relacionada com a exatidão. Porém, nem sempre esta relação é
verdadeira e recuperações menores que 50 % têm sido aceitas (ANVISA 2003),
desde que a precisão seja aceitável. Além disso, a recuperação pode ser sacrificada
intencionalmente para melhorar a seletividade (CAUSON et al., 1997). Para técnicas
de microextração como a SPME e LPME (extrações que se baseiam no equilíbrio), a
quantidade absoluta recuperada é relativamente pequena em relação à quantidade
inicial presente (em torno de 1 %) (LORD, PAWLISZYN, 2000), porém desde que o
método seja preciso e exato e não haja prejuízo na sua detectabilidade, essa
recuperação pode ser aceita.
A recuperação absoluta foi determinada para os métodos propostos, sendo a
quantidade absoluta dos analitos extraídos por SPME foi calculada como:
CJYWZJ[RçãV RS^V_W�R %' � á2�. a/ 978/ a� bcde /f �cdeá2�. a/ 978/ a. 76g�çã/ a72�1. E 100 (19)
Para a determinação da recuperação absoluta, uma amostra do branco de
cabelo foi fortificada com 1ng (10 µL da solução de 0,1 µg mL-1 em metanol) e 80
ng (10 µL da solução de 8,0 µg mL-1 em metanol) de cada canabinóide foram
analisadas de acordo com o procedimento HS-SPME em triplicata. Os resultados
foram comparados com a injeção direta dos padrões em metanol (1 e 80 ng µL-1)
com injeção de 1 µL. Para a HF-LPME as amostras foram fortificadas com 0,01 e 5
ng para os analitos CBD e CBN e 0,2 e 5 ng para ∆9-THC foram analisados de
acordo com o procedimento em triplicata. Os resultados foram comparados com a
injeção direta dos padrões em metanol (0,01, 0,2 e 5 ng µL-1) com injeção de 1 µL.
As recuperações alcançadas pelo método de HS-SPME ficaram entre 1,1 e 8,7 %. Os
87
valores encontrados são suficientes, pois ao contrário da injeção direta, a quantidade
total absorvida a partir da fibra de SPME é transferida para coluna do GC
(MUSSHOFF et al., 2003). Em relação à injeção direta, apenas uma fração do extrato
final é injetado (por exemplo, 1 µL de 1 mL do extrato final, resulta em 0,1% de
massa injetada). Sporkert e Pragst (2000) analisaram 17 drogas em cabelo por HS-
SPME e GC-MS, obtendo recuperações entre 0,04 e 5,7 %. Musshoff et al., 2002
através do seu trabalho empregando a HS-SPME conseguiram recuperações
absolutas na faixa entre 0,3 e 7,5 % para os canabinóides ∆9-THC, CBD e CBN em
cabelo. Valores maiores de recuperação absoluta foram obtidos pelo método de HF-
LPME variando na faixa de 4,4 a 8,9 %, sendo superiores em comparação com
outros métodos de HS-SPME na determinação de canabinóides em cabelo. As
Tabelas 8 e 9 estão os valores encontrados para os testes de precisão e recuperação.
Tabela 8. Precisão e recuperação absoluta do método HS-SPME.
Canabinóides
Fortificação (ng mg -1)
Recuperação absoluta (%)
(N=3)
Precisão intermediária
(RSD %) (N=10)
CBD 0,1 8,7 ± 1,1 16,4
8 2,4 ± 0,9 9,9
∆9-THC 0,1 1,7 ± 0,7 13,3
8 1,1 ± 0,6 10,9
CBN 0,1 3,2 ± 0,6 13,5
8 2,8 ± 0,5 6,6
88
Tabela 9. Precisão e recuperação absoluta do método HF-LPME.
4.4.5 Limites de detecção e quantificação
Em termos gerais, o limite de detecção (LD) é a menor quantidade ou
concentração do analito na amostra que pode ser diferenciada, de forma confiável, do
zero ou do ruído de fundo. O LD é definido como sendo a menor quantidade do
analito presente em uma amostra que pode ser detectada, porém não necessariamente
quantificada, sob as condições experimentais estabelecidas (PASCHOAL et al.,
2008).
O limite de quantificação (LQ) é definido como a menor quantidade ou
concentração do analito de interesse em uma amostra, que pode ser
quantitativamente determinado com valores aceitáveis de precisão e exatidão
(CASSIANO et al., 2009).
A ANVISA (2003) recomenda que o LD seja de 2 a 3 vezes superior ao
ruído da linha de base e o LQ seja 10 vezes superior o sinal do analito em relação ao
ruído.
Canabinóides
Fortificação (ng mg-1)
Recuperação absoluta (%)
(N=3)
Precisão intermediária
(RSD %) (N=10)
CBD 0,001 4,8 ± 1,3 6,9
0,5 4,4 ± 1,1 4,4
∆9-THC 0,02 8,9 ± 1,5 6,7
0,5 7,6 ± 1,2 11,9
CBN 0,001 8,2 ± 1,4 13,7
0,5 7,7 ± 0,9 12,9
89
Desde 1996, quando ocorreu o primeiro encontro da Society of Hair Testing
(SOHT) discute-se os aspectos legais da análise de cabelo, os critérios para se obter
resultados positivos e a relação entre a dose administrada e a concentração do
fármaco no cabelo (SOCIETY OF HAIR TESTING, 1997). Em 2004, a SOHT
publicou novas recomendações para análise de cabelo em casos forenses e neste
mesmo ano, a Society of Toxicological and Forensic Chemistry (GTFCh) estabeleceu
um valor de cut-off ≤ 100 pg mg-1 para ∆9-THC em cabelo com a Société Française
de Toxicologie Analytique (SFTA) (PRAGST; NADULSKI, 2005). Cut-off são
valores utilizados para decidir se o resultado analítico é causado por uma certa razão,
como por exemplo, o uso acentuado de uma droga ou não.
Os critérios para os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) dos
métodos foram estabelecidos pela relação sinal/ruído (S/N) igual a 3 e 10,
respectivamente, por meio da análise de concentrações decrescentes dos analitos. O
limite de detecção variou de 7 a 31 pg mg-1 e os valores do limite de quantificação
ficaram entre 12 e 62 pg mg-1 para HS-SPME. Os valores dos limites de detecção e
quantificação para HF-LPME variaram de 0,5 a 15 pg mg-1 e 1 a 20 pg mg-1,
respectivamente. As Tabelas 10 e 11 apresentam os valores de LD e LQ para os
métodos propostos.
Limites maiores foram obtidos na análise de ∆9-THC, CBD e CBN em
cabelo a partir da LLE e GC-MS/EI com valores de 0,1 ng mg-1 para o LOD
(BAPTISTA et al., 2002) e 0,01 ng mg-1 (LD) utilizando a SPE com GC-MS/MS-
NCI (WICKS; TSANACLIS, 2005). Estes dados corroboram que a técnica
desenvolvida por HS-SPME promove uma alta concentração dos analitos durante a
extração em relação às técnicas de extração convencionais.
A tabela 12 apresenta a comparação dos métodos propostos em relação aos
métodos que utilizam a SPME e GC-MS para a determinação de ∆9-THC, CBD e
CBN em cabelo
90
Tabela 10. Limites de detecção e quantificação dos canabinóides para o método HS-SPME.
Canabinóides Cut-off
(pg mg-1) LD
(pg mg-1) LQ
(pg mg-1)
CBD - 7 12
∆9-THC 100 31 62
CBN - 11 30
Tabela 11. Limites de detecção e quantificação dos canabinóides para o método HF-LPME.
Canabinóides Cut-off
(pg mg-1) LD
(pg mg-1) LQ
(pg mg-1)
CBD - 0,5 1
∆9-THC 100 15 20
CBN - 0,5 1
91
Tabela 12. Tempo de extração, limites de detecção e quantificação e recuperação dos métodos propostos comparado com outros métodos analíticos por SPME.
Método Tempo de extração
(min)
LD (pg mg-1)
LQ (pg mg-1)
Recuperação absoluta (%) Referência
DI-SPME 30 - 100-200 - Strano-Rossi; Chiarotti (1999)
HS-SPME 30 - - 0,04-5,7 Sporkert; Pragst (2000)
HS-SPME 33 50-140 - 0,3-7,5 Musshoff et al., 2002
HS-SPME com
derivação
25 12-16 37-48 6,4-59 Nadulski; Pragst,
2007
HS-SPME 40 70 120 7,0-11,2 De Oliveira et al., 2007
HS-SPME proposto
40 7-31 12-62 1,1-8,7
HF-LPME proposto
20 0,5-15 1-20 4,4-8,9
4.5 Perfil dos pacientes amostrados
No presente estudo foram coletadas 33 amostras de cabelo de pacientes do
sexo masculino (18 a 49 anos de idade) situados na Fazenda da Esperança localizada
no município de Lagarto-SE. Os pacientes amostrados relataram uma frequencia de
uso de maconha entre 1 e 35 cigarros por semana considerando que o último
consumo variou de 7 dias a 3 anos. Em relação à quantidade de dias que os
indivíduos estavam sob tratamento na fazenda variou de 2 dias a 2 anos e 6 meses.
4.6 Aplicação dos métodos HS-SPME e HF-LPME
4.6.1 HS-SPME
92
O método por HS-SPME foi aplicado em dez amostras de cabelo de
indivíduos do sexo masculino de centro de reabilitação, que relataram uso dos
produtos de Cannabis de acordo com o questionário aplicado. A Tabela 12 mostra os
resultados destas amostras com seu respectivo perfil de consumo. O CBN e CBD
foram identificados em 100% das amostras, sendo o primeiro com concentrações
superiores em relação ao ∆9-THC e CBD. Uma situação semelhante foi encontrada
por outros autores em seus respectivos estudos (CIRIMELE et al., 1995b; STRANO-
ROSSI; CHIAROTTI, 1999; BAPTISTA et al., 2002). O composto ∆9-THC estava
presente em 70 % das amostras com concentrações entre o LD e LQ. A baixa
concentração de ∆9-THC nas amostras, atrelada a maior concentração de CBN pode
estar relacionada à degradação pirolítica de ∆9-THC a CBN quando a Cannabis é
fumada. [44]. As concentrações variaram para CBD de 13 a 18 ng mg-1 (média de 14
pg mg-1), para ∆9-THC de 60 a 70 pg mg-1 (média de 65 pg mg-1) e para CBN de 31 a
300 ng mg-1 (média de 96 ng mg-1). Utilizando um cut-off de 100 pg mg-1 para ∆9-
THC, todos os casos foram julgados negativos, se enquadrando no uso ocasional da
droga (PRAGST; NADULSKI, 2005). A Figura 47 mostra um cromatograma típico
de uma amostra de cabelo analisada.
93
Tabela 13. Resultados das análises de cabelo a partir de usuários de Cannabis pelo método HS-SPME.
n.d: não detectado
< LQ: abaixo do limite de quantificação
Paciente Frequencia (cigarros
por semana)
Último uso (dias)
Dias internado
Concentração dos analitos em cabelo (pg mg-1) Consumo de outras drogas
CBD ∆9-THC CBN
1 4 21 20 14 < LQ 65 Álcool, anfetamina, cocaína, crack
2 2 120 3 13 < LQ 93 Álcool, cocaína, crack
3 15 90 10 14 60 64 Álcool, anfetamina, cocaína, crack
4 20 730 30 15 n.d 56 Álcool, cocaína, crack
5 7 120 120 14 n.d 78 Álcool
6 10 30 30 15 < LQ 114 Álcool, cocaína, crack
7 1 365 120 13 n.d 31 Álcool, anfetamina, cocaína, crack, LSD, ecstasy
8 2 30 15 18 70 300 Álcool, crack
9 15 365 365 15 < LQ 76 Álcool, cocaína
10 10 60 60 13 < LQ 86 Álcool, cocaína, crack
94
Figura 47. Cromatograma de amostra real por HS-SPME obtida de usuário de Cannabis situado em clínica de reabilitação. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5.
4.6.2 HF-LPME
O método desenvolvido e validado foi aplicado na análise de ∆9-THC, CBD
e CBN em amostras de cabelo de 23 pacientes do sexo masculino provenientes de
centro de reabilitação de dependentes químicos, que relataram uso dos produtos de
Cannabis com freqüência de 1 a 35 cigarros de maconha por semana em um período
variando de 1 a 27 anos de consumo. A Tabela 13 mostra os resultados quantitativos
dos canabinóides nas amostras reais para cada paciente, com a sua respectiva
frequência por semana, último consumo da droga, dias de internação e consumo de
outras drogas.
Tempo (min)
95
Das 23 amostras analisadas, somente o CBN foi detectado em todas as
amostras, sendo que, foi detectado apenas CBN (N = 12), CBN e CBD (N = 6) ou os
três analitos (N = 5). Esse comportamento pode estar relacionado com a conversão
de ∆9-THC a CBN por degradação pirolítica como mencionado anteriormente. O ∆9-
THC e CBD foram detectados em 22 % (N=5) e 48 % (N=11) das amostras
analisadas, respectivamente. As concentrações variaram para CBD de 1 a 18 pg mg-1
(média de 10 pg mg-1), para ∆9-THC de 20 a 232 pg mg-1 (média de 69 pg mg-1) e
para CBN de 9 a 107 pg mg-1 (média de 21 pg mg-1).
Considerando um cut-off de 100 pg mg-1 para ∆9-THC apenas uma amostra
foi positiva (paciente 9; ∆9-THC = 232 pg mg-1), enquadrando-se no uso regular da
droga. As amostras referentes aos pacientes 3 (63 pg mg-1 de ∆9-THC) e 6 (84 pg mg-
1 de ∆9-THC) indicaram um alto consumo da droga com 25 e 30 cigarros de
maconha por semana, respectivamente, sendo que seus resultados foram
considerados negativos de acordo com o valor de cut-off estabelecido. Pragst e
Nadulski (2005) propuseram uma diminuição do valor de cut-off de 50 pg mg-1 para
∆9-THC, pois verificaram que uma grande parte dos usuários ocasionais de Cannabis
não era detectado com um cut-off de 100 pg mg-1.
De acordo com a Tabela 12, a detecção negativa de ∆9-THC, assim como a
baixa concentração de CBD e CBN, pode estar relacionada com um período longo de
internação e último uso da droga, não descartando outros fatores que podem
influenciar na diminuição da concentração dos componentes da Cannabis, como o
uso de cosméticos ou tratamento capilar (JURADO et al., 1997), e exposição à luz
solar e umidade (SKOPP et al., 2000).
O método foi bastante seletivo, visto que os cromatogramas das amostras
reais não apresentaram picos interferentes próximos aos tempos de retenção dos
canabinóides. Do mesmo modo que a análise por HS-SPME, os pacientes relataram
uso de algumas drogas de abuso concomitantemente com a Cannabis (ver Tabela
13), assegurando desta forma, a análise dos analitos na presença de drogas de
diferentes classes químicas. O método também é capaz de detectar pelo menos um
dos analitos (CBN) em um período de até três anos (paciente 10) sem consumo da
droga, evidenciando sua alta sensibilidade. A Figura 48 mostra um cromatograma
típico de uma amostra positiva de um dos pacientes.
96
Tabela 14. Resultados das amostras de cabelo utilizando o método HF-LPME.
n.d: não detectado < LQ: abaixo do limite de quantificação
Paciente Frequencia (cigarros
por semana)
Último uso (dias)
Dias internado
Concentração dos analitos em cabelo
(pg mg-1)
Consumo de outras
drogas
CBD ∆9-THC CBN
1 20 365 30 18 < LQ 58 Anfetamina, barbitúricos, cocaína, crack, ecstasy,
LSD 2 10 28 18 < LQ < LQ 17 Crack, cocaína
3 25 14 14 6 63 14 Crack, cocaína
4 7 365 75 n.d n.d 13 Álcool, cocaína, crack
5 7 150 10 1 n.d 12 Álcool , cocaína, crack
6 30 7 5 6 84 57 Cocaína, crack, LSD
7 9 120 2 n.d n.d 18 Crack
8 8 28 5 < LQ n.d 13 Álcool, cocaína, crack
9 35 15 7 14 232 107 Álcool, cocaína
10 10 1095 38 < LQ n.d 12 Crack
11 10 150 120 n.d n.d 11 Álcool, cocaína, crack
12 14 90 960 6 n.d 18 Álcool, cocaína, crack
13 7 28 8 6 n.d 18 Álcool, anfetamina,
cocaína, crack, psilocibina
14 15 365 5 n.d n.d 13 Álcool, anfetamina,
cocaína, crack
15 30 365 365 n.d n.d 16 Álcool, cocaína, crack,
flunitrazepam, psilocibina
16 1 30 15 n.d n.d 11 Álcool, crack
17 10 30 28 n.d n.d 13 Álcool, cocaína
18 20 150 90 n.d n.d 11 Cocaína, crack
19 7 120 28 n.d n.d 11 Álcool, anfetamina, benzodiazepínicos,
cocaína, crack, morfina
20 12 365 14 7 n.d 11 Álcool, anfetamina,
cocaína, crack, psilocibina
21 7 90 45 n.d n.d 10 Álcool, cocaína, crack
22 10 45 30 n.d n.d 9 Álcool, cocaína, crack,
23 15 120 120 n.d n.d 9 Crack
97
Figura 48. Cromatograma (GC-MS/MS) de amostra real obtida da análise de cabelo por HF-LPME contendo: 14 pg mg-1 de CBD, 232 pg mg-1 de THC e 107 pg mg-1 de CBN. Para condições cromatográficas de análise ver item 3.2.5.
Tempo (min)
98
5. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que os métodos
desenvolvidos HS-SPME e HF-LPME aliados com a cromatografia em fase gasosa e
espectrometria de massas são adequados para determinação de ∆9-tetraidrocanabinol
(∆9-THC), canabidiol (CBD) e canabinol (CBN) em cabelo humano.
A utilização do modo tandem MS/MS ofereceu uma ótima seletividade e
detectabilidade para os compostos analisados, extremamente importantes em uma
análise no nível de traços.
A microextração em fase sólida no modo headspace (HS-SPME)
demonstrou ser uma técnica simples, livre de solventes orgânicos, fornecendo
extratos com poucos interferentes, dado a complexidade da amostra de cabelo. Para a
otimização dos parâmetros de extração (oito variáveis analisadas) estes foram
obtidos utilizando um planejamento univariado, sendo que todos os parâmetros
avaliados foram importantes na resposta dos canabinóides, sendo a variável
temperatura de extração a mais importante no aumento da resposta. O método de HS-
SPME foi validado, oferecendo bons resultados para recuperação absoluta (1,1 a 8,7
%) e precisão (6,6 a 16,4 %), boa linearidade entre 0,1 e 8,0 ng mg-1 e limite de
quantificação para ∆9-THC de 0,062 ng mg-1 sendo menor que o valor de cut-off
estabelecido pela SOHT, GTFCh, e SFTA.
A microextração em fase líquida por fibra oca (HF-LPME) para determinação
dos mesmos analitos em cabelo humano foi desenvolvido e validado. Devido a sua
simplicidade e seu baixo custo, a fibra pode ser descartada depois de cada extração,
eliminando a possibilidade de carryover, sendo esta a sua principal vantagem em
relação à SPME. Para a otimização das variáveis do método, o planejamento fatorial
fracionário e planejamento composto central foram aplicados (seis variáveis
analisadas), diminuindo o número de experimentos da otimização. Na etapa de
validação, os resultados mostraram que as figuras de mérito (seletividade,
99
linearidade, precisão, recuperação absoluta, limites de detecção e quantificação)
foram comparáveis ou superiores aos métodos existentes na análise de canabinóides
em cabelo, destacando a sensibilidade e linearidade, boas recuperações absolutas e
baixos limites de detecção e quantificação. Os resultados obtidos das amostras de
cabelo dos usuários de Cannabis (18 a 300 pg mg-1) indicaram que os métodos
desenvolvidos podem ser aplicados para evidenciar o uso anterior da droga, no
acompanhamento e na vigilância de dependentes químicos que estejam em clínicas
de reabilitação no período superior a 3 anos sem consumo da droga.
100
6. REFERÊNCIAS
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111
ANEXOS
112
ANEXO A – Questionário para verificação do perfil de consumo
Data da coleta:
Local da coleta:
Amostra nº________
1. Dados pessoais:
Idade: ________
Sexo: ( ) Masculino ( ) Feminino
2. Quando utilizou a maconha pela última vez?
( ) Últimas 24 horas
( ) Entre 1 e 7 dias
( ) Entre 2 e 4 semanas
( ) Entre 2 e 5 meses
( ) Mais de 5 meses. Quando?________________
3. Qual a via de consumo utilizada?
Pulmonar ( ) Oral ( )
113
4. Que quantidade foi consumida neste último uso de maconha?
______________cigarros
5. Qual é (foi) a freqüência de uso?
________cigarros/dia
________cigarros/semana
6. Há quanto tempo utiliza(ou) com esta freqüência?
______________________________________________
7. Quais outras drogas que utiliza(ou) além da maconha?
( ) Bebidas alcoólicas
( ) Cocaína
( ) Crack
( ) Heroína
( ) Anfetamina (“rebite”), metanfetamina (“ice”).
( ) Outras? Qual? _________________________
Há quanto tempo ? _____________________
8. Há quanto tempo está nesse centro de reabilitação?
______________________________________________
9. Cor do cabelo:
( ) Branco
( ) Loiro
( ) Castanho
( ) Preto
114
( ) Grisalho
( ) Ruivo
( ) Outro. Qual? __________
10. Utilizou algum tratamento cosmético recentemente?
( ) Sim. Qual? ________________________________________________
( ) Não
115
ANEXO B – Declaração do Comitê de Ética
116
ANEXO C – Produções científicas
117
118
ANEXO D – Matérias publicadas em jornal de circulação
119
120
121