desenvolvimento de uma tecnologia para … · desgranulação destas células, enquadrando-se como...
TRANSCRIPT
DESENVOLVIMENTO DE UMA TECNOLOGIA PARA DESATIVAR
EPITOPOS ALERGÊNICOS DE ALBUMINAS 2S PRESENTES EM
TORTA DE MAMONA (Ricinus communis L.).
NATALIA DEUS DE OLIVEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ.
FEVEREIRO - 2009.
ii
DESENVOLVIMENTO DE UMA TECNOLOGIA PARA DESATIVAR
EPITOPOS ALERGÊNICOS DE ALBUMINAS 2S PRESENTES EM
TORTA DE MAMONA (Ricinus communis L.).
NATALIA DEUS DE OLIVEIRA
Tese apresentada ao Centro de Biociências
e Biotecnologia da Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como
parte das exigências para obtenção do título
de Mestre em Biociências e Biotecnologia.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ.
FEVEREIRO - 2009.
iii
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Química e
Função de Proteínas e Peptídeos (LQFPP), no Centro de Biociências e
Biotecnologia (CBB) da Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro – UENF, sob a orientação da Professora Olga Lima
Tavares Machado.
Financiamentos:
- FAPERJ (Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa
do Estado do Rio de Janeiro).
- CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior)
- CNPq (Conselho Nacional de desenvolvimento Científico e
tecnológico)
iv
DESENVOLVIMENTO DE UMA TECNOLOGIA PARA DESATIVAR
EPITOPOS ALERGÊNICOS DE ALBUMINAS 2S PRESENTES EM
TORTA DE MAMONA (Ricinus communis L.).
NATALIA DEUS DE OLIVEIRA
Tese apresentada ao Centro de Biociências
e Biotecnologia da Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como
parte das exigências para obtenção do título
de Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em 16 de fevereiro de 2009.
Comissão examinadora:
Drª Marílvia Dansa de Alencar Petretski (UENF)
Dr. Renato Augusto DaMatta (UENF)
Dr. Maurício Afonso Verícimo (UFF)
Dr.ª Olga Lima Tavares Machado (UENF) (Orientadora)
v
Dedico este trabalho,
a todos que acreditaram que
era possível iniciar mais esta
etapa de minha vida.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre presente em todos os momentos de minha vida.
A minha orientadora Olga, pela dedicação ao conhecimento, pelo zelo com
seus alunos, pela companhia e força nas dificuldades e, principalmente, nas vitórias.
A revisora deste trabalho, professora Dr.ª Michelle Muzitano, pela atenção e
carinho dispensados, pela dedicação e profissionalismo dedicados a esta revisão.
Aos membros da banca, Dr.ª Marílvia Dansa de Alencar Petretski, Dr. Renato
Augusto DaMatta e Dr. Maurício Afonso Verícimo, pela atenção e profissionalismo já
dispensados.
A minha família, em especial meu pai Adão, que mesmo longe se faz
presente no meu dia-a-dia através dos ensinamentos plantados em minha vida.
Ao meu amigo e noivo Hélio Neto, pela companhia, compreensão, sabedoria
e paciência. Enfim, pela sua presença em minha vida.
Aos amigos do laboratório, a outros amigos da UENF, aos amigos do CEFET
Campos e a minha amiga de sempre Adriana Pacheco, pelo companheirismo, pelas
conversas e pela alegria nos encontros.
A família Crespo e a família Pepe por compartilhar comigo um pouquinho de
suas feições familiares e o aconchego de um lar.
A todos os funcionários do LQFPP e do LBCT pela disponibilidade.
Enfim, a todos que contribuíram para o término deste trabalho.
vii
"Se houver um general forte,
não haverá soldados fracos."
Provérbio chinês
viii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................x
LISTA DE TABELAS...................................................................................................xii
LISTA DE ABREVIAÇÕES.........................................................................................xiii
RESUMO...................................................................................................................xiv
ABSTRACT.................................................................................................................xv
1- INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
1.1- Economia da mamona................................................................................2
1.2- Semente.....................................................................................................3
1.2.1- O óleo...........................................................................................4
1.2.1.1- Biodiesel....................................................................................5
1.2.2- A torta...........................................................................................9
1.3- Compostos tóxicos e alergênicos.............................................................10
1.3.1- Ricina..........................................................................................10
1.3.2- Alérgeno de mamona – Albumina 2S.........................................12
1.4- Hipersensibilidade....................................................................................16
1.4.1 - Imunoglobulina do tipo E (IgE)...................................................19
1.4.2 - Receptor FcЄRI.........................................................................21
1.4.3 – Mastócito...................................................................................22
1.4.4 – Epitopo......................................................................................24
1.4.5- Alergia desencadeada por albumina 2S.....................................26
1.5- Processos de destoxificação e desalergenização da torta de mamona...27
2- OBJETIVO..............................................................................................................32
3- MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................33
3.1 - Obtenção do “pool” de albuminas 2S de sementes de mamona............33
3.2 - Obtenção de soro anti-albumina 2S........................................................33
3.3 - Tratamento químico do “pool” de albuminas 2S e da torta de mamona.34
ix
3.4 - Caracterização biológica – Avaliação da alergenicidade........................35
3.4.1 – Obtenção dos mastócitos de rato.............................................35
3.4.2 – Ensaios de desgranulação........................................................36
3.4.2.1 - Avaliação do percentual de desgranulação por
microscopia óptica.....................................................................36
3.4.2.2 – Quantificação de histamina.........................................37
3.4.3 - Obtenção das células RBL-2H3.................................................39
3.4.3.1- Quantificação de liberação da enzima β-
hexosaminidase.........................................................................39
3.5 - Análise estatística....................................................................................40
4- RESULTADOS.......................................................................................................41
4.1- Avaliação da atividade alergênica............................................................41
4.1.1- Morfologia celular - Microscopia óptica.......................................41
4.1.2- Quantificação da desgranulação de mastócitos.........................42
4.1.3- Quantificação de histamina.........................................................45
4.1.4- Quantificação de liberação da enzima β-hexosaminidase..........53
5- DISCUSSÃO..........................................................................................................56
6- CONCLUSÃO.........................................................................................................62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................63
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Partes da mamona, folhas, flor e fruto.........................................................1
Figura 2: Fluxograma do processo de extração do óleo da semente de mamona.....4
Figura 3: Estrutura secundária da ricina....................................................................11
Figura 4: Esquema do processamento do precursor das isoformas Ric c 3 e Ric c
1..................................................................................................................................14
Figura 5: Histórico das albuminas 2S de Ricinus communis L..................................15
Figura 6: Estrutura Primária do precursor das Albuminas 2S...................................16
Figura 7: Esquema da deflagração da alergia na presença do alérgeno..................19
Figura 8: Estrutura do receptor FcЄRI......................................................................21
Figura 9: Ativação celular do mastócito mediada pelo receptor FcЄRI.....................24
Figura 10: Estudo dos epitopos presentes nas albuminas 2S de mamona..............25
Figura 11: Fluxograma do tratamento proposto para desativar epitopos alergênicos
de albumina 2S de mamona utilizando diferentes compostos de cálcio....................34
Figura 12: Produto obtido a partir da reação química entre o-phthaldialdeido (OPA),
β-mercaptoetanol e a histamina proveniente dos grânulos liberados pelos mastócitos
do lavado peritoneal do rato.......................................................................................38
Figura 13: Microscopia eletrônica de transmissão de células RBL-2H3...................39
xi
Figura 14: Mastócitos do lavado peritoneal de rato corados por azul de toluidina,
após exposição à albumina 2S na presença de soros como fonte de IgE
específica...................................................................................................................42
Figura 15: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato (experimento
controle)......................................................................................................................43
Figura 16: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato frente as
amostras de albumina 2S tratadas.............................................................................44
Figura 17: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato frente as
amostras de torta de mamona tratadas......................................................................45
Figura 18: Padronização do método de dosagem de histamina...............................47
Figura 19: Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato.....49
Figura 20: Sobreposição dos perfis cromatográficos da histamina liberada das
amostras de células incubadas com albumina 2S nativa e albumina 2S tratada com
hidróxido de cálcio a 4%, após cromatografia de troca catiônica..............................50
Figura 21: Sobreposição dos perfis cromatográficos da histamina liberada das
amostras de células incubadas com torta nativa e torta tratada com hidróxido de
cálcio a 4%, após cromatografia de troca catiônica...................................................52
Figura 22: Determinação da atividade biológica de albumina 2S de mamona pelo
ensaio de desgranulação com as células RBL-2H3...................................................54
Figura 23: Esquema da interação eletrostática entre o cálcio e as carboxilas dos
ácidos glutâmicos (epitopo) presentes na estrutura da albumina 2S de mamona ....59
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Principais oleaginosas cultivadas no Brasil para a produção de
biodiesel......................................................................................................................8
Tabela II: Porcentagem de desgranulação dos mastócitos e quantificação da
histamina liberada de seus grânulos após incubação com o “pool” de albumina 2S
nativa e, com a albumina 2S após o tratamento com hidróxido de cálcio a
4%.............................................................................................................................51
Tabela III: Porcentagem de desgranulação dos mastócitos e quantificação da
histamina liberada de seus grânulos após incubação com a torta de mamona nativa
e, com a torta de mamona após o tratamento com hidróxido de cálcio a
4%.............................................................................................................................53
xiii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
CB-1A Castor Bean Allergen
D-MEM Meio Eagle Modificado por Dubelcco’s
DIC Differential Interference Contrast
DNP dinitrofenol
DTH Hipersensibilidade do tipo tardio
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
HEPES Ácido N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2'-Etanossulfônico
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
IgA Imunoglobulina A
IgD Imunoglobulina D
IgE Imunoglobulina E
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL-10 Interleucina 10
IL-4 Interleucina 4
IL-5 Interleucina 5
MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal
OPA o-phthaldialdeido
Ric c 1 Alérgeno 1 de Ricinus communis
Ric c 3 Alérgeno 3 de Ricinus communis
RBL-2H3 Rat Basophilic Leukemia Cells- Clone 2H3
TNP 2,4,6-trinitrofenol
TFA Ácido Trifluoracético
WRK Woodward´s Reagent
xiv
RESUMO
Ricinus communis L. é uma planta da família Euphorbiaceae, conhecida no Brasil
como mamona, tendo grande importância econômica devido ao óleo extraído de sua
semente que pode ser utilizado para a síntese de biodiesel. Após a extração do óleo, obtém-
se a torta que possui alto teor protéico, porém, não pode ser utilizada para consumo animal
por possuir proteínas tóxicas (ricina) e alergênicas (albumina 2S). O reconhecimento de
epitopos de albuminas 2S através de IgEs ligadas na superfície dos mastócitos promove a
desgranulação destas células, enquadrando-se como hipersensibilidade do tipo I. O
presente estudo tem por objetivo realizar tratamento químico com albumina 2S purificada e
com a torta bruta de mamona, visando desativar os epitopos alergênicos. O método químico
utilizado consistiu de tratamento com compostos de cálcio adicionados às amostras de
albumina 2S e torta de mamona, em tratamentos separados. As amostras foram incubadas
com uma solução de hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio, a 4 e a 8%
na proporção de 1:1 (v/v), durante 12 horas, a temperatura ambiente. O ensaio biológico,
empregado a fim de avaliar a atividade alergênica destas amostras, consistiu da
quantificação da desgranulação dos mastócitos do lavado peritoneal de ratos e da histamina
liberada dessas células. Ensaios de desgranulação utilizando células RBL-2H3 foram
utilizados como outra metodologia empregada para confirmar a desativação dos epitopos
das amostras após o tratamento proposto. Verificou-se neste trabalho que os tratamentos
utilizando os compostos de cálcio apresentaram similaridades para modificar o alérgeno de
mamona, mostrando-se eficazes. Este fato foi avaliado pela redução da alergenicidade por
quantificação da desgranulação de mastócitos (redução de 70% para aproximadamente
30%, valor observado no controle negativo) e por dosagem de histamina. Os resultados
obtidos neste trabalho utilizando estes compostos contribuem para a obtenção de um
produto mais seguro para manipulação dos trabalhadores e com possibilidade de expansão
da aplicabilidade econômica, por exemplo, na alimentação animal. Por fim, de acordo com
os dados descritos sobre a existência de reação cruzada entre alérgenos de mamona e
alérgenos de outras fontes, os tratamentos propostos neste trabalho poderiam também ser
utilizados para modificar outras proteínas alergênicas.
Palavras-chave: albumina 2S, alérgenos, epitopos, tratamento químico.
xv
ABSTRACT
Ricinus communis L. is a plant of the Euphorbiaceae family, known in Brazil as
mamona. It has a great economical importance due to the extracted oil of its seeds that is
used for the synthesis of biodiesel. After oil extraction, a castor cake that contains high
protein level is obtained, however, it can not be used for animal consumption due to toxic
proteins (ricin) and allergenic (2S albumin). The recognition of epitopes of 2S albumin
through the reaction between IgEs connected on the surface of the mast cells promotes the
degranulation of these, which is defined as type I hypersensitivity. The present study has the
objective to carry out chemical treatments with purified 2S albumin and the crude castor cake
for to deactivate the allergenic epitopes. The chemical method used consisted of treatments
with compounds of calcium added to 2S albumin samples and castor cake, in treatments
separate. The samples were incubated with a solution of calcium hydroxide, calcium
carbonate or calcium oxide, 4 and 8% in the ratio of 1:1 (v/v), during 12 hours, at the room
temperature. The biological assay, used to assess the allergenic activity of these samples,
consisted of the quantification of mast cells degranulation of peritoneal fluid of rats and of
histamin released from these cells. Degranulation assay using the cells RBL-2H3 were used
as another method to confirm the deactivation of the epitope deactivation of the samples
after treatment. The treatments using compounds of calcium verified in this work showed
similarities to modify the allergen of castor bean and all they are effectives. This was valued
by reducing the allergenicity by quantification of mast cells degranulation (reduction of 70%
to approximately 30% value observed in the negative control) and histamine determination.
The results obtained in this work using these compounds contribute to get of a safer product
for manipulation of the workers and with the possibility of expanding the economical
applicability, for example, in animal feed. Finally, according to the data described about the
existence of cross-reactivity between castor bean allergens and allergens from others
sources, the treatments proposed in this work could also be used to modify other allergenic
proteins.
Keywords: 2S albumin, allergens, epitopes, chemical treatment.
1- INTRODUÇÃO
A mamoneira (Ricinus communis L. – Figura 1) é uma oleaginosa conhecida
desde a Antiguidade por suas propriedades medicinais e como azeite para
iluminação (SANTOS et al., 2007; AZEVEDO & LIMA, 2001). É um vegetal
pertencente à família Euphorbiaceae e sua origem não é muito bem esclarecida,
devido a alguns autores divergirem, em sendo ora asiática, ora africana, e até
mesmo, como planta nativa da América. Sementes e outros objetos encontrados nos
túmulos comprovam que a mamona já era utilizada pelos egípcios há pelo menos
4000 anos (FELIX et al., 2008; SANTOS et al., 2007; FORNAZIERE JÚNIOR, 1986).
Figura 1: Partes da mamona, folhas, flor e fruto. Disponível em: http://www.vivercidades.org.br/publique222/media/florianas_mamona.jpg. Acesso em: 10/01/2009.
No Brasil a mamona é conhecida como carrapateira, rícino ou palma cristi.
Este vegetal cresce adequadamente em regiões que apresentam temperatura
temperada ou tropical, sendo uma espécie tolerante à seca e exigente em calor e
luminosidade, encontrada em diversas partes do mundo. Admite-se que essa
euforbiácea é conhecida no país desde a era colonial quando sua cultura foi
1
2
introduzida durante a colonização portuguesa, devido à vinda dos escravos
africanos, onde nesta época, o óleo extraído de suas sementes era utilizado para
lubrificar eixos de carroças (SANTOS et al., 2007; AZEVEDO & LIMA, 2001).
Atualmente ela está disseminada por quase todo o território nacional, sobretudo no
nordeste, cujas condições climáticas são as mais adequadas ao seu
desenvolvimento (não deixando, porém, de existir em todo o país) (FORNAZIERE
JÚNIOR, 1986).
1.1 - ECONOMIA DA MAMONA:
Segundo o Banco de Desenvolvimento de Minas Gerais S. A., da mamona se
aproveita tudo, já que as folhas servem de alimento para uma espécie do bicho da
seda e a haste, além de celulose própria para a fabricação de papel, fornece
matéria-prima para a produção de tecidos grosseiros. Além dessas aplicações, as
hastes e as folhas podem ser utilizadas na melhoria das características físicas e
biológicas do solo, e a folha ainda serve para aumentar a secreção láctea das vacas
(AZEVEDO & LIMA, 2001).
A mamona é cultivada em várias partes do mundo; da industrialização de sua
semente obtém-se o óleo e a torta, sendo o primeiro, o principal produto, e o
segundo, um produto com capacidade de restaurar terras esgotadas (SANTOS et
al., 2007; AZEVEDO & LIMA, 2001). O óleo é extensivamente utilizado para fins
medicinais e industriais, podendo ser empregado em rotas de síntese de muitos
produtos, como cosméticos, lubrificantes, polímeros, etc (CHIERICE & NETO, 2007;
ANANDAN et al., 2005). Comparações entre temperatura e quantidade de óleo têm
demonstrado que o teor de óleo das sementes é proporcional à soma do calor
recebido pela planta em todo o seu ciclo vegetativo. Portanto, embora se adapte em
regiões subtropicais, se não houver bastante calor, a planta reduz a qualidade do
óleo e, conseqüentemente, a produtividade das sementes (FORNAZIERI JÚNIOR,
1986).
A mamona apresenta grande potencial para ser cultivada em amplas áreas do
território brasileiro, em razão de apresentar expressiva resistência à seca, exigência
em calor e luminosidade e, se adaptar perfeitamente ao clima semi-árido (CARTAXO
et al., 2004). A mamona pode ser considerada uma das oleaginosas tropicais mais
importantes devido a sua extraordinária capacidade de adaptação às condições
3
adversas, à multiplicidade de aplicações industriais e medicinais de seu óleo (óleo
de rícino) e de seus produtos e, ao valor de sua torta (farelo restante das sementes
após a extração do óleo) utilizada como fertilizante (FORNAZIERI JÚNIOR, 1986).
No mercado mundial, no período compreendido entre 1978 e 2004, a Índia, a
China e o Brasil se mantiveram como principais produtores de mamona em baga
(semente descascada) (SANTOS et al., 2007). Na América do Sul, o Paraguai é o
produtor tradicional de mamona, com produção variável entre 10.000 e 25.000
toneladas anuais de mamona em baga (SAVY FILHO, 1999). No Brasil, a partir da
safra de 2001/2002, graças ao grande interesse mundial pelas fontes renováveis de
energia para substituição gradual das fontes minerais originárias do petróleo, tornou-
se evidente um programa nacional de estruturação da produção de mamona nos
estados do semi-árido brasileiro (BANDEIRA et al., 2004). No país, a produção em
escala comercial e tradicional da mamona no semi-árido é concentrada no estado da
Bahia, onde na safra de 2004/2005, foram colhidos 182.459 mil hectares com
produção estimada de 132.324 mil toneladas (SANTOS et al., 2007).
Com relação à produção mundial de biodiesel de mamona, no período
compreendido entre 2002 a 2003, 1,3 milhões de toneladas foram sintetizadas,
sendo deste total, aproximadamente 0.51 milhões de toneladas somente pela Índia
(BARNWAL & SHARMA, 2005). No Brasil, as indústrias de extração do óleo de
mamona em atividade estão instaladas na Bahia, em Minas Gerais, no Mato Grosso
e em São Paulo e, a capacidade destas empresas é suficiente para processar 440
mil toneladas/ano de mamona em baga, gerando, num período de 200 dias/ano, o
equivalente a 198 mil toneladas de óleo (SANTOS et al., 2007).
1.2 - SEMENTE:
A semente da mamoneira é muito variável, envolvendo cor, forma, tamanho,
peso, proporção do tegumento, presença ou ausência de carúncula e, maior ou
menor aderência do tegumento ao endosperma (FERNANDES, 2008). A
composição química das sementes de mamona varia com o cultivar e com a região
de cultivo, sendo que cerca de 90% do total de óleos presentes na semente
representam o ácido graxo ricinoléico (C17H32OHCOOH) que é extraído da semente
ou da baga por meio de máquinas apropriadas. A extração do óleo da semente ou
da baga é realizada por meio de máquinas apropriadas em que o método utilizado
4
para se extrair o óleo pode ser por prensagem, a frio ou a quente, ou extração por
solvente, observe a Figura 2.
Figura 2: Fluxograma do processo de extração do óleo da semente de mamona (adaptado de FREIRE et al., 2007).
O óleo da mamona possui a capacidade de ser solúvel em álcool devido aos
três grupos hidroxílicos e à posição da dupla ligação na cadeia, o que o torna eficaz
para ser eficaz para a produção de biodiesel. Segundo dados da Embrapa de 2001
obtêm-se de cada 100 Kg de mamona em bagas, 45 Kg de óleo e 50 Kg de farelo e
torta (SANTOS et al., 2007). Alguns compostos, também encontrados nas sementes
da mamona, impedem a ampla aplicação de produtos originados de seu
processamento, como por exemplo, a proteína ricina (toxoalbumina) e o alcalóide
ricinina, que são produtos tóxicos, e uma fração alergênica que se trata de um
conjunto de glicoproteínas denominado CB-1A - Castor-bean allergen (BEWLEY &
BLACK, 1994).
1.2.1 - O óleo:
O óleo extraído das sementes de mamona abriga moléculas com
propriedades bastante flexíveis e estrutura, de certa forma incomum entre os ácidos
graxos existentes nos óleos vegetais. Segundo Vieira e colaboradores (1998) essas
características conferem, ao óleo da mamona, grande versatilidade química dentro
do ramo industrial, permitindo sua utilização em mais de 400 processos industriais.
A maior parte do óleo extraído da mamona é usada na fabricação de tintas,
vernizes, cosméticos e sabões. É utilizado também na produção de plásticos e de
fibras sintéticas, sendo essas últimas, antitóxicas e antialérgicas. Salienta-se
Semente Pré-limpeza
Aquecimento
Extração por prensagem
Óleo
Extração por solvente
Óleo
Torta
Farelo
5
também que este óleo, devidamente processado, é um excelente lubrificante, sendo
ideal para motores de alta rotação, como foguetes espaciais e, os sistemas de freios
dos automóveis. O óleo desta oleaginosa pode ser utilizado na fabricação de
corantes, anilinas, desinfetantes, germicidas, óleos lubrificantes de baixa
temperatura, colas e aderentes, base para fungicidas, inseticidas, tintas de
impressão, vernizes, nylon e matéria-plástica. Outro uso deste óleo é na
biomedicina, na elaboração de próteses e implantes, substituindo o silicone, como
ocorre em cirurgias ósseas, de mama e de próstata (SANTOS et al., 2007;
OGUNNIY, 2006; MENEGHETTIA et al., 2006; AZEVEDO & LIMA, 2001).
Alguns pesquisadores admitem que o óleo de mamona seja o melhor óleo
vegetal para a produção de biodiesel, por ser o único solúvel em álcool e não
necessitar de calor, reduzindo o gasto de energia para sua transformação em
combustível (BELTRÃO & LIMA, 2007; OGUNNIY, 2006; MENEGHETTIA et al.,
2006; PARENTE, 2004). Uma série de estudos vem sendo realizados para tornar
viável o uso da mamona para a produção de biodiesel, que é um combustível
renovável, biodegradável, não corrosivo e ambientalmente correto, sucedâneo ao
óleo diesel mineral (FORNAZIERI JÚNIOR, 1986). Segundo estudos internacionais,
o Brasil, país que possui excelentes condições climáticas, com temperatura quente e
úmida e com precipitações pluviais regulares, tem potencialmente a capacidade de
abastecer o mercado com biodiesel, substituindo 60% do consumo mundial de óleo
diesel de petróleo. Neste contexto, sabe-se que a proporção de fabricação de
biodiesel é de 1.000 kg de óleo vegetal produzem 1.000 litros de biodiesel, sendo
que, 1.000 kg de sementes de mamona produzem 470 kg de óleo vegetal
(PARENTE, 2004).
1.2.1.1- Biodiesel:
A denominação de biodiesel para o novo combustível, composto basicamente
de um éster monoalquílico e com rendimento térmico equivalente ao diesel de
petróleo, foi usada pela primeira vez em 1988 por pesquisadores chineses
(KNOTHE, 2001). O Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB)
define biodiesel como um combustível obtido de uma mistura de diesel fóssil e
ésteres alcalinos de óleos vegetais ou gordura animal. Tecnicamente, biodiesel é um
éster álcali de ácidos graxos, feito por transesterificação catiônica de óleos ou
6
gorduras, de plantas ou animais, com pequenas cadeias de álcoois tais como, o
metanol ou etanol (NASS, 2007).
O biodiesel substitui, total ou parcialmente, o óleo diesel de petróleo em
motores e pode ser usado puro ou misturado ao diesel em diversas proporções. A
mistura de 2% de biodiesel ao diesel de petróleo é chamada de B2 e assim
sucessivamente, até o biodiesel puro, denominado B100 (Disponível em
http://www.biodiesel.gov.br/. Acesso em 10/01/09).
Levando em consideração o meio ambiente, biodiesel é considerado “carbono
neutro” porque todo o dióxido de carbono liberado durante o consumo tem sido
seqüestrado para a atmosfera para o crescimento da safra das oleaginosas. Estudos
têm demonstrado que o consumo de biodiesel tem emitido menos poluente quando
comparado ao diesel (BARNWAL & SHARMA, 2005). Embora o interesse em óleos
vegetais como matéria-prima para combustíveis não seja recente, seu uso em
motores esbarrava na elevada viscosidade e na necessidade de manutenção
intensiva provocada pelo alto índice de resíduos de sua combustão. A solução para
tais limitações foi idealizada por Chavanne, cientista belga que, em 1937, misturou
álcool aos óleos vegetais e patenteou o processo de transesterificação (KNOTHE,
2001).
Muitos países estão buscando alternativas ao diesel derivado do petróleo por
causa do aumento do preço de petróleo, sua escassez e a preocupação mundial
com o meio ambiente (NASS et al., 2007). A União Européia é atualmente a líder
global na produção de biodiesel e o uso, com a Alemanha e França contabiliza 88%
da produção mundial, acompanhados pelos Estados Unidos, que produz 8% da
produção mundial. Nos Estados Unidos, a produção de biodiesel tem aumentado de
1.9 milhões de litros em 1999 para 284 milhões de litros em meados de 2007. No
Brasil, o progresso com relação ao biodiesel ocorreu em 2002, quando o ministro da
ciência e da tecnologia iniciou o Programa brasileiro para desenvolvimento
tecnológico do Biodiesel (ProBiodiesel). O Programa Nacional de Produção e Uso do
Biodiesel (PNPB) foi estabilizado (implantado) dois anos após, em dezembro de
2004 e, em 2005, a primeira planta de processamento de biodiesel foi estabelecida
no estado de Minas Gerais, usando a mamona como fonte de óleo vegetal. O PNPB
apresenta-se como um programa interministerial do Governo Federal que tem por
objetivo a implementação de forma sustentável, tanto técnica, como
7
economicamente, a produção e uso do Biodiesel, com enfoque na inclusão social e
no desenvolvimento regional, via geração de emprego e renda (NASS et al., 2007).
O Brasil é o maior produtor de combustível de origem vegetal, além do
combustível 100% a base de álcool, adiciona-se 25% de álcool à gasolina
comercialmente vendida (CARVALHO, 1988). Quando o país começou o programa
de estudo e desenvolvimento de combustíveis alternativos e renováveis em 1930,
ele iniciou como pioneiro na pesquisa em biodiesel e, em 1980, a Universidade
Federal do Ceará obteve a primeira patente brasileira para o processamento do
biodiesel. O uso de espécies de plantas oleaginosas para a produção do biodiesel
no Brasil foi primeiramente proposto em 1975, coincidindo com o início do Pró-
álcool. A iniciativa do biodiesel resultou no programa intitulado Pró-óleo, ou
produção de óleos vegetais para propósito energético. O objetivo do Pró-óleo foi
gerar excedentes de óleos vegetais para a produção de biodiesel competitivo com o
petróleo. A meta inicial do Pró-óleo foi desenvolver um combustível baseado numa
mistura de 30% de óleo vegetal com o óleo diesel, com a eventual substituição do
diesel de petróleo por biodiesel. Porém, o Pró-Óleo não recebeu suporte financeiro
suficiente para crescer e desenvolver-se, sendo descontinuado no ano de 1980
(NASS, 2007).
O país atualmente tem em vista a necessidade de mudança para alcançar a
meta estabelecida em janeiro de 2005 pelo Programa Nacional de Produção e Uso
do Biodesel - PNPB (Lei #11.097/2005), e introduzir na matriz energética brasileira o
uso obrigatório de pelo menos 2% (B2) de biodiesel até 2008 e de 5% (B5) até 2013.
O PNPB tem por diretrizes implantar um programa sustentável, promovendo inclusão
social, garantir preços competitivos, qualidade e suprimento e, por fim, produzir o
biodiesel a partir de diferentes fontes oleaginosas e, em regiões diversas. A Agência
Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP) está avaliando várias
solicitações para o financiamento do biodiesel, e com a abertura das novas fábricas
de biodiesel propostas, a capacidade de produção do país será suficiente para
alcançar a meta de 2008. Entretanto, um maior aumento no processamento será
necessário para alcançar o requerimento legal de 5% de biodiesel para 2013
(BELTRÃO & LIMA, 2007; NASS et al., 2007). Em fevereiro de 2009, o governo
brasileiro confirma a adição de 4% de biodiesel ao diesel para julho de 2009 e de 5%
em 2010 (Disponível em: http://www.biodieselbr.com/noticias/bio/governo-confirma-
b4-julho-b5-2010-27-02-09.htm. Acesso em 04/03/09).
8
Várias matérias-primas e várias tecnologias têm sido usadas para produção
do biodiesel, contudo, para que sejam lucrativos, os biocombustíveis necessitam
fornecer um ganho de energia em rede, ser ambientalmente correto, ter um custo
competitivo, e ser produzido em quantidades suficientes, sem redução do
suprimento alimentício. A agricultura brasileira é facilitada pelo clima quente,
precipitação regular, muita energia solar, aproximadamente 13% da água potável do
planeta e, muitos hectares de terras férteis cultiváveis. Como mostrado na tabela I,
várias espécies de oleaginosas têm sido cogitadas como fontes para a produção do
biodiesel e outras ainda estão sob investigação com potenciais matérias-primas para
a produção de biodiesel, dentre elas o pinhão manso, cupuaçu, milho, murumu, etc.
As matérias-primas para a produção de biodiesel no Brasil variam grandemente
entre as regiões onde, a soja, o girassol, o algodão, a mamona, e a canola são
crescidas no sul, sudeste, e regiões centrais; a palma africana, o babaçu, a soja e a
mamona são encontrados nas regiões nordeste e norte (NASS et al., 2007).
Tabela I: Principais oleaginosas cultivadas no Brasil para a produção de biodiesel.
Cultivo Fonte botânica do óleo Teor de óleo (%)
Palma africana (Elaeis guineensis) Semente 22.0
Avocado (Persea americana) Fruto 7.0–35.0
Babaçu (Attalea speciosa) Semente 66.0
Mamona (Ricinus communis) Grão 45.0–48.0
Coco (Cocos nucifera) Fruto 55.0–60.0
Canola (Brassica spp.) Grão 40.0–48.0
Algodão (Gossypium hirsutum) Grão 15.0
Amendoim (Arachis hypogaea) Grão 40.0–43.0
Soja (Glycine max) Grão 18.0
Girassol (Helianthus annuus) Grão 38.0–48.0
Fonte: MAPA (2006b); Cadernos NAE (2005).
Com relação ao melhor cultivar de mamona para ser empregado para
produção de biodiesel, levando-se em consideração fatores como teor de óleo,
níveis de ricina e de alérgenos nas sementes de mamona, os estudos realizados por
Fernandes em 2008, objetivou verificar estes fatores em quatro cultivares de
mamona amplamente utilizada para o plantio no Brasil, e em cinco linhagens
utilizadas como intermediários na obtenção de novas cultivares pelo programa de
9
melhoramento desta oleaginosa no país. Observou-se neste estudo que as
sementes dos cultivares IAC-226, BRS Nordestina e a linhagem SM Pernambucana
são as mais apropriadas para o cultivo, com teor de óleo superior a 45%, níveis de
ricina inferiores a 2% e concentrações de albumina 2S inferiores a 1,1%.
1.2.2 - A torta:
De acordo com Severino (2005), a torta é o principal produto da cadeia
produtiva da mamona, produzida a partir da extração do óleo das sementes na
proporção aproximada de 1,2 toneladas para cada tonelada de óleo extraída, ou
seja, corresponde a 55% de peso das sementes, valor que pode variar de acordo
com o teor de óleo da semente e do processo industrial de extração do óleo.
De acordo com Horton e Williams apud Chierice e Neto (2007) a torta da
mamona é uma massa orgânica que fica retida nos filtros após a extração do óleo
por prensagem; as características típicas deste produto, obtido em processos de
prensagem a quente, apresentam após terem sido retiradas as toxinas e os
alérgenos, dentre vários constituintes, 43% de proteínas, 35% de fibras, 10% de
umidade, 8% de cinzas, 2% de óleo, 1% de fósforo, 0,5% de cálcio e 0,5% de
magnésio.
Na Índia, o principal país produtor de mamona, cerca de 85% da torta são
utilizados como fertilizante orgânico (KONNUR & SUBBARAO, 2004) por ser
excelente fonte de nitrogênio e apresentar propriedades inseticidas e nematicidas
(DIRECTORATE OF OILSEEDS RESEARCH, 2004); além disso, a torta pode ser
usada como matéria-prima para a produção de aminoácidos, plásticos, em especial
os biodegradáveis, colas e outros produtos (CHIERICE & NETO, 2007).
O principal uso da torta residual da extração do óleo de mamoneira é como
adubo orgânico, que se constitui em um excelente fertilizante. A adição de torta de
mamona no solo, com dosagens variando de acordo com a cultura e o tipo de solo e
da riqueza ou não de nutrientes, além de suprir as necessidades nutricionais das
plantas, aumenta o pH do solo, eleva o conteúdo de carbono e promove a melhoria
geral na parte física do solo. A utilização da torta no solo, além de reduzir os
nematóides e elevar o poder tampão e a capacidade de troca de cátions do solo,
tem propriedade de reduzir a densidade aparente do ambiente em todos os tipos de
solos, o que interfere positivamente no crescimento e no desenvolvimento radicular,
10
devido a melhor porosidade do solo, com rápida renovação adequada do oxigênio
(FORNAZIERI JÚNIOR, 1986).
As indústrias processadoras da semente preferem comercializar a torta
somente como fertilizante orgânico do solo, devido aos altos custos com os
processos de desintoxicação, destacando seu uso na lavoura canavieira, desde as
gerações passadas. Antes do conhecimento dos processos de desintoxicação, a
utilização da torta se limitava à adubação do solo, entretanto, os avanços científicos
neste ramo, poderão contribuir para aumentar sua utilização como ração animal
(AZEVEDO & LIMA, 2001). A torta pode obter maior valor comercial se utilizada
como alimento animal, mas esse emprego não tem sido possível até o momento, em
virtude da presença de fatores tóxicos e alergênicos em sua composição e da
inexistência de tecnologia industrial viável para seu processamento (FREIRE et al.,
2007).
Apesar de apresentar um alto teor de proteínas dentre elas 60% são
globulinas (solúveis somente em soluções salinas), 20% glutelinas (solúveis em
ácidos e álcalis diluídos), 16% são albuminas (solúveis em água e tampões diluídos
em pH neutro) e 4% são proteases (SILVA JR. et al., 1996), não se recomenda o
uso da torta para ração animal, pois é tóxica devido à presença da proteína ricina
(toxoalbumina), do alcalóide ricinina e do complexo alergênico, denominado de CB-
1A (Castor-bean allergen) que é uma mistura de proteínas de baixo peso molecular
e polissacarídeos. Atualmente sabe-se que o complexo alergênico CB-1A representa
cerca de 12,5% do peso da torta, como determinado pelo teste de precipitação de
antígenos diluídos. Este complexo é formado por cerca de 20 isoformas de proteínas
com massa molecular entre 10 e 14 kDa, sendo pertencentes à classe das
albuminas 2S. Duas isoformas alergênicas, Ric c1 e Ric c3 já se encontram
seqüenciadas e com características biológicas bem determinadas (FELIX et al.,
2008; SILVA JR. et al., 1996).
1.3 – COMPOSTOS TÓXICOS E ALERGÊNICOS DA MAMONA:
1.3.1 - Ricina:
A ricina é uma proteína encontrada exclusivamente no endosperma das
sementes de mamona, não sendo detectada em outras partes da planta, como
raízes, folhas ou caules. Representa de 1,5 a 2% do peso total da semente
11
(ANADAN et al., 2005; COOK et al., 2006). Ela é a principal responsável pela toxidez
da torta de mamona e, está entre as proteínas de maior toxidez conhecida pelo
homem (MOSHKIN, 1986).
Trata-se de uma proteína heterodimérica, Figura 3, com massa molecular de
aproximadamente 65 KDa. Consiste de uma cadeia A (RTA), que exibe atividade
catalítica, unida por uma única ponte dissulfeto a uma cadeia B (RTB), que possui
propriedades lectina, sendo capaz de ligar-se à superfície de glicoproteínas
contendo resíduos de galactose e N-acetil-galactosamina (BRANDT et al., 2005). A
ricina é uma potente toxina que mata as células eucarióticas por inibir a síntese
protéica. Assim, ela é uma proteína da classe de toxinas conhecidas como proteínas
inativadoras de ribossomos, RIPs (COOK et al., 2006).
Figura 3: Estrutura secundária da ricina (BRANDT et al., 2005).
As RIPs podem ser do tipo 1 (monoméricas) e do tipo 2 (diméricas). As RIPs
tipo 1 apresentam apenas a cadeia A, que é uma glicosidase que remove um
resíduo de adenina do RNA ribossomal 28S. O RNA então depurinado fica
susceptível à hidrólise em pH alcalino, e em pH ácido na presença de anilina. A
região do RNA ribossômico modificada é essencial para ligação do fator de
alongamento, e os ribossomos modificados não podem dar suporte à síntese
protéica (OLSNES et al., 1975). No entanto, RIPs tipo 1 não são tóxicas pois não
possuem a cadeia B que é necessária para a ligação da toxina a célula alvo e para o
12
direcionamento intracelular da cadeia A (OLSNES, 2004). Quando estão presentes
ambas as cadeias A e B, a toxina é classificada como RIP tipo 2, que é o caso da
ricina (COOK et al, 2006).
A cadeia A da ricina é muito eficiente dentro da célula, apenas uma molécula
inativa milhares de ribossomos por minuto. Assim, uma molécula pode inativar
ribossomos mais rapidamente que a célula pode sintetizar novos ribossomos e,
portanto, a mata (OLSNES & KOZLOV, 2001). Os estudos conduzidos por Brito &
Tokarnia (1996) demonstram que a dose letal de sementes administradas por sonda
intragástrica para coelhos seria de 2g/Kg.
Na área médica, a ricina tem se destacado entre um grupo de proteínas
tóxicas que vêm sendo usadas como imunotoxinas, isto é, agentes terapêuticos
empregados no tratamento de câncer e doenças auto-imunes (BRANDT et al., 2005;
WOO et al., 1998; LORD et al., 1994).
A ricina é o principal empecilho para uso alimentar da torta da mamona para
animais (NA et al., 2004). Neste contexto, a destoxicação da torta de mamona diz
respeito, principalmente, a eliminação de ricina e, muitos grupos de pesquisa têm
trabalhado a fim de alcançar esse objetivo. Anadan e colaboradores em 2005
obtiveram êxito utilizando processos físicos, baseados no calor – fervura, autoclave,
forno de ar quente - e químicos baseados em álcalis – NaOH, Ca(OH)2, amônia.
Todos os métodos de destoxicação de torta de mamona para sua aplicação como
ração animal devem garantir eficiência, sem gerar efluentes ou resíduos sólidos, não
utilizar agentes químicos perigosos ou que causem riscos aos animais, além do
mais, a tecnologia empregada deve ser economicamente viável. O uso da torta
destoxicada como insumo para ração animal agrega valor a este outro produto
obtido a partir do processamento da semente para síntese do biodiesel (Empresa
Bombrasil, 2005).
1.3.2 – Alérgeno de mamona - Albumina 2S:
O termo alérgeno é utilizado para identificar substâncias que possuem a
capacidade de promover duas ou três propriedades moleculares distintas: i) a
propriedade para sensibilizar (isto é, induzir a produção de anticorpos de alta
afinidade, particularmente da classe IgE, pelo sistema imune); ii) a propriedade de
se ligar aos anticorpos IgE; e ainda, iii) a propriedade para ativar uma reação
13
alérgica (isto é, desencadear sintomas alérgicos em uma pessoa sensibilizada)
(AALBERSE, 2000).
Os alérgenos vegetais em geral, são proteínas de defesa, que permitem a
planta resistir aos estresses bióticos e abióticos. Muitos tecidos de plantas, que são
consumidos por humanos, contêm milhares destas proteínas alergênicas.
Aproximadamente 0.5% da população dos Estados Unidos é afetada por vários
estágios da alergia alimentar mediada por imunoglobulina do tipo E (EL-AGAMY,
2007; BREITENEDER & RADAUER, 2004).
Os alérgenos de plantas são classificados dentro de famílias e superfamílias,
baseados na estrutura e função. Elas são agrupadas dentro de uma mesma família
se possuírem 30% (ou mais) de resíduos idênticos ou ainda se tiverem baixa
homologia, mas apresentarem função e estrutura muito similares. Os alérgenos de
origem vegetal mais abundante pertencem às superfamílias Cupin e Prolamina,
sendo que as albuminas 2S pertencem à família das prolaminas. Existem também
outros alérgenos pertencentes aos grupos das “proteínas relacionadas à
patogênese” e profilinas (BREITENEDER & RADAUER, 2004). Adicionalmente
tornou-se evidente que o nível de exposição e, as propriedades do alérgeno em si
são importantes para a determinação do potencial alergênico (BREITENEDER &
MILLS, 2005).
A existência da família prolamina é baseada na presença de um esqueleto
conservado de oito resíduos de cisteína. Todas as proteínas dessa superfamília são
de baixo peso molecular, além de serem ricas em cisteínas e apresentarem estrutura
tridimensional semelhante e rica em α-hélice. Nesta família estão incluídas as
proteínas transportadoras de lipídeo não específico (nsLTPs), os inibidores de α-
amilase e de proteases, a prolamina de cereais e as albuminas 2S (BREITENEDER
& RADAUER, 2004).
A família das albuminas 2S é um grupo de proteínas de reserva presente nas
dicotiledôneas ou magnoliopsidas, além de serem os principais alérgenos da
mamona. Estas proteínas são heterodiméricas e, apresentam massa molecular de
10.000 - 18.000 Da e altos teores de arginina, serina e glutamina. Sabe-se que
algumas delas são inibidoras de proteases e outras podem ainda apresentar
propriedades alergênicas (MACHADO & SILVA, 1992).
As albuminas 2S são sintetizadas em tempos específicos durante o
desenvolvimento da semente e depositadas dentro dos vacúolos (corpúsculos
14
protéicos) durante o desenvolvimento da semente, para então serem degradadas
durante a germinação, dando suporte ao crescimento da semente (AHN & CHEN,
2007; REGENTE & LA CANAL, 2001). Elas são sintetizadas no retículo
endoplasmático rugoso, como um precursor protéico de alto peso molecular, Figura
4. Posteriormente este precursor é clivado proteoliticamente, gerando um peptídeo
ligante e outros pequenos peptídeos (JOLLIFFE et al., 2004; SHEWRY et al., 1995).
A glicosilação dessas proteínas pode ocorrer durante a síntese protéica e os
carboidratos incorporados são, em sua maioria, manose e glicosamina (JOLLIFFE
et al., 2004; BEWLEY & BLACK, 1994).
Figura 4: Esquema do processamento do precursor das isoformas Ric c 3 e Ric c 1. A) Precursor intacto com Peptídeo sinal em bege, pontes de enxofre em amarelo, Ric c 3 e Ric c 1 respectivamente em vermelho (cadeias leves) e em marrom (cadeias pesadas), peptídeos de ligação em azul; B) Perda do peptídeo sinal; C) Perda dos peptídeos de ligação com conseqüente separação das duas isoformas (Gomes da Silva, L).
Acreditava-se que as albuminas 2S fossem inativas metabolicamente, mas
atualmente, devido à sua capacidade inibidora de proteinases, às propriedades
alergênicas (MACHADO & SILVA, 1992), e à ação antifúngica (AGGIZIO et al.,
2003), acredita-se que elas estejam envolvidas em funções de defesa constitutivas
da planta (REGENTE & LA CANAL, 2001).
As propriedades alergênicas das albuminas 2S são resistentes à
desnaturação térmica e química, podendo, mesmo após os tratamentos de
desintoxicação, desencadear alergia por contato bem como por inalação
(MACHADO & SILVA, 1992; SILVA JR. et al., 1996).
15
Historicamente (Figura 5), no ano de 1943, Spies e Coulson isolaram da
semente de mamona uma fração protéica de baixo peso molecular, estável ao calor,
que foi denominada CB-1A (castor bean allergens). No ano de 1947 a
hipersensibilidade desencadeada por mamona foi descrita pela primeira vez e em
1977, Li e colaboradores isolaram e caracterizaram uma proteína das sementes de
Ricinus communis L. de baixo peso molecular com alto “teor” de glutamina que
mostrou propriedades similares àquelas da proteína anteriormente isolada de
mamona. Posteriormente, no ano de 1978, Youle e Huang concluíram que CB-1A
era a mesma proteína de reserva caracterizada por Li et al. em 1977. Em 1982,
Sharief e Li isolaram e sequenciaram uma proteína das sementes de Ricinus
communis L. (Ric c 1), com coeficiente de sedimentação 2S, constituída de duas
subunidades unidas por pontes de enxofre. A menor contendo 34 aminoácidos (Ric c
1 cadeia leve) com massa molecular aparente de 4 kDa e a subunidade maior
composta de 61 aminoácidos (Ric c 1 cadeia pesada) com massa molecular de 7
kDa.
Figura 5: Histórico das albuminas 2S de Ricinus communis L. 1943 - Spies e Coulson, (CB-1A); 1977 - Li e colaboradores, isolaram e caracterizaram uma “outra”; 1978 – Youle e Huang; 1982- Sharief e Li, sequenciaram Ric c1; 1992 – Machado e Silva isolaram e sequenciaram Ric c3 (~11 KDa); Atualmente: ~ 20 isoformas de albuminas 2S já foram isoladas e parcialmente caracterizadas.
No ano de 1992, Machado e Silva isolaram e seqüenciaram um segundo
alérgeno da semente de mamona, denominado de Ric c 3, tendo peso molecular em
torno de 11 kDa, presente no mesmo precursor de 29 kDa de Ric c 1, como
mostrado na Figura 6; este alérgeno teve sua estrutura completamente elucidada no
ano de 1996. Desde 2003, muitas outras proteínas alergênicas, pertencentes à
classe das albuminas 2S, têm sido identificadas nas sementes de mamona por
Machado e colaboradores (FELIX et al., 2008; FREIRE et al., 2007).
1943 1977
1978
1982 1992
CB-1A Ric c1 Ric c3
Atualmente
16
Figura 6: Estrutura Primária do precursor das Albuminas 2S. Verde = cadeia leve e cadeia pesada de Ric c 3; Marrom= cadeia leve e cadeia pesada de Ric c 1; Cinza = peptídeos que são eliminados durante o processamento (SILVA JR., 1996).
Muitos alérgenos de sementes pertencem a classe das albuminas 2S e, estes
podem também ser encontrados no pólen de plantas como girassol, gergelim,
amendoim e castanha; alérgenos semelhantes estão também presentes em algumas
fontes animais como peixe e camarão. Tais proteínas possuem estruturas
semelhantes o que poderia promover reações cruzadas entre tais alérgenos. Alguns
exemplos de alérgenos dessa família são: Ber e1, de castanha do Maranhão
(Bertholletia excelsa), Jug r1, de noz (Juglans regia) (BREITENEDER & RADAUER,
2004).
1.4 – HIPERSENSIBILIDADE:
O termo alergia ou hipersensibilidade refere-se a um estado alterado ou
anormal do sistema imune no qual, se o antígeno estiver presente e, o estado
imunológico humoral (anticorpos) ou celular se encontrar em nível intensificado,
pode ocorrer uma reação excessiva que conduzirá a grandes danos aos tecidos.
Relembrando que, o organismo que teve uma pré-exposição a um determinado
antígeno e, subseqüentemente, tem contato com o mesmo antígeno, a resposta
imunológica é reforçada (EL-AGAMY, 2007). As células do organismo previamente
sensibilizado, ao entrar em contato com o alérgeno, são atraídas para o local de
inoculação do antígeno e, estas, orquestram mecanismos celulares para tentar
eliminar e/ou proteger o corpo de maiores danos, contribuindo assim, para exacerbar
os sintomas nos indivíduos alérgicos (SICHERER & LEUNG, 2008).
De acordo com a classificação de Coombs e Gell (apud ROITT et al., 2003),
quatro tipos de reação de hipersensibilidade são descritas (I, II, III, IV), dentre as
quais, as três primeiras dependem da interação do antígeno com o anticorpo
humoral e são denominadas reação de tipo “imediato”; e o quarto tipo de reação
SSFFAAYYRRRRIITTTTIIEEIIDDEESSKKGGEERREEGGSSSSSSQQQQRRQQEEVVQQRRKKDDLLSSSSCCEERRYYLLRRQQSSSSSSRRSSTTGGEEEEVVLLRRMMPPGGDDEENNQQQQEESSQQQQLLQQQQCCCCNNQQVVKKQQVVRRDDEECCQQCCEEAAIIKKYYIIAAEEDDQQIIQQQQGGQQLLHHGGEEEESSEEVVAAQQRRAAGGEEIIVVSSSSCCGGVVRRCCMMRRQQTTRRTTNNSSQQGGCCRRGGQQIIQQEEQQQQNNLLRRQQCCQQEEYYIIKKQQQQVVSSGGQQGGPPRRRRSSDDNNQQEERRSSLLRRGGCCCCDDHHLLKKQQMMQQSSQQCCRRCCEEGGLLRRQQAAIIEEQQQQQQSSQQGGQQLLQQGGQQDDVVFFEEAAFFRRTTAAAANNLLLLPPSSMMCCGGVVSSPPTTSSRRFF
17
envolve receptores ligados à superfície do linfócito, apresentando maior duração,
sendo, por isso, denominada de hipersensibilidade do tipo tardio (EL-AGAMY, 2007;
SICHERER & LEUNG, 2008).
O tipo I de hipersensibilidade, ou também conhecida como hipersensibilidade
imediata, depende da reação entre um antígeno com o anticorpo específico IgE
ligado na superfície dos mastócitos e/ou basófilos através do fragmento Fc,
conduzindo a liberação do conteúdo dos grânulos (histamina, leucotrienos e fator de
ativação de plaquetas, fatores quimiotáticos de eosinófilos e neutrófilos) (MAINTZ &
NOVAK, 2007). As moléculas de IgE específicas se ligam, através do receptor
FcЄRI de alta afinidade, na superfície de mastócitos teciduais e basófilos circulantes
(primeira sensibilização).
A hipersensibilidade citotóxica envolve a morte de células que possuem o
anticorpo ligado a um antígeno de superfície; este tipo de hipersensibilidade é do
tipo II e a morte celular se processa pelas células fagocíticas que se ligam através
do reconhecimento com IgG ou C3b, ou por lise mediada pelo sistema complemento
que é constituído de um conjunto de proteínas presentes no sangue que
complementam a ação dos anticorpos (GIERAS et al., 2007).
Outros tipos de anticorpos podem formar complexos imunes na circulação
que podem se depositar, principalmente, nos vasos sanguíneos, levando a lesão
mediada pela ativação do complemento, atração dos leucócitos e agregação
plaquetária, sendo esta reação, admitida como do tipo III de hipersensibilidade
(SICHERER & LEUNG, 2008).
Por fim, o tipo IV de hipersensibilidade é caracterizado como sendo celular ou
do tipo tardio (DTH) e é baseada na interação do antígeno com células T pré-
sensibilizadas. Estas são produzidas no timo e possuem receptores específicos em
sua superfície que quando estimuladas pelo contato com o antígeno apresentado
por APCs, elas internalizam o mesmo, o processam e posteriormente apresentam-no
em associação com moléculas do MHC de classe II à linfócitos CD4+ (ROITT et al.,
2003).
Em processos alérgicos ocorre a tendência ao desenvolvimento de fortes
respostas de hipersensibilidade imediata, e neste mecanismo estão envolvidos
reações imunes humorais (hipersensibilidade do tipo I) e mediadas por células
(hipersensibilidade do tipo IV). Numa reação alérgica, o epitopo ou determinante
antigênico, que é a menor porção do antígeno com potencial de gerar a resposta
18
imune é reconhecido pelas imunoglobulinas do tipo E, desencadeando todo o
processo alérgico. Estes epitopos são compostos por resíduos de aminoácidos
seqüenciais ao longo da cadeia polipeptídica (epitopo linear ou contínuo) ou por
resíduos não-sequenciais oriundos de segmentos linearmente afastados, que após a
montagem da conformação da proteína permanecem unidos (epitopo
conformacional ou descontínuo) (GIERAS et al., 2007; ALEKSEEVA et al., 2007;
SCHEIN et al., 2005; WOLFF et al., 2004). Os epitopos contínuos são mantidos
após uma desnaturação, contudo, os epitopos conformacionais são perdidos
(ABBAS, 2003).
Sabe-se que as manifestações das respostas alérgicas acontecem de
maneira diferente de um organismo para outro, porém, todas estas respostas se
iniciam por um processo silencioso, conhecido como sensibilização
(LICHTENSTEIN, 1993). A sensibilização de um organismo se inicia com um
primeiro contato de um antígeno, normalmente uma proteína, que induz alergia,
sendo denominado alérgeno. Esta substância, ao penetrar no organismo por vias
aéreas ou por outros tecidos, é encontrada por células apresentadoras de antígenos
(APCs), como macrófagos e/ou células dendríticas, que endocitam esta substância
estranha que sofre clivagem proteolítica; os fragmentos peptídicos gerados, também
conhecidos como ‘epitopos de célula T” são direcionados para a membrana externa
da APC pelo complexo de histocompatibilidade principal de classe II (MHC II), na
forma de um complexo, peptídeo – MHC de classe II (ALEKSEEVA et al., 2007;
LICHTENSTEIN, 1993). Os linfócitos T auxiliares (TH 1 e/ou TH 2) reconhecem
esses epitopos expostos e juntamente com os linfócitos B iniciam a resposta
imunológica. A ativação de clones de células TH 2, específicas para o antígeno, é
essencial para o desenvolvimento de doenças atópicas, pois estas células ativadas
pelo contato com APCs produzem quantidades relativamente grandes de citocinas,
interleucinas 4 (IL-4) e 5 (IL-5), que podem, dentre outras funções, atuar como sinais
para a biossíntese de IgE pelos linfócitos B, que se associam aos receptores FcЄRI
que estão ligados na superfície dos mastócitos e basófilos (KAMBAYASHI &
KORETZKY, 2007).
Numa subseqüente exposição ao mesmo antígeno, conhecida como
segunda sensibilização, expressiva resposta alérgica é observada. Após a interação
do alérgeno com o tecido humano, ocorrerá ligação cruzada entre os segmentos
específicos do antígeno (epitopo de IgE) e as IgEs anteriormente ligadas aos
19
receptores FcЄRI nos mastócitos e/ou basófilos, promovendo a ativação de
mensageiros intracelulares e posterior liberação de mediadores celulares, como
histaminas e prostaglandinas, que por sua vez induzirão mudanças fisiológicas e
anatômicas que desencadearão os sintomas alérgicos da hipersensibilidade
imediata, conforme o esquema da Figura 7 (KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007;
ABBAS et al., 2003).
Figura 7: Esquema da deflagração da alergia na presença do alérgeno. (1) Primeiro contato do antígeno com células apresentadoras de antígenos (APCs) do organismo do indivíduo; (2) Apresentação do peptídeo pata linfócitos T via complexo peptídeo – MHC de classe II; (3) Linfócito T produz citicinas estimulatórias; (4) Linfócito B estimulado produzindo IgEs específicas; (5) e (6) IgEs específicas se ligam, através do receptor FcεRI, a superfície de mastócitos teciduais e basófilos circulantes, respectivamente; (7) Segunda sensibilização do organismo e ligação-cruzada; (8) Liberação do conteúdo dos grânulos celulares (por exemplo histamina).
1.4.1 - Imunoglobulina do tipo E (IgE):
A IgE é uma imunoglobulina dimérica, que possui peso molecular de 188 kDa
e que possui nível sérico (média em adulto mg ml-1) de 5 x 10-5 (JANEWAY et al.,
2002). É diferente das outras imunoglobulinas porque possui um domínio extra de
região constante, uma estrutura diferente para a região da dobradiça e sítios de
ligação diferentes para ambos os receptores de alta e baixa afinidade, FcЄRI e
FcЄRII, respectivamente (ROITT, 2003).
1
2
3
4
5
6
7
8
20
O isotipo de imunoglobulina IgE contém a cadeia pesada Є, está presente em
baixas concentrações no plasma (1µg/ml) e circula como um anticorpo bivalente. As
regiões variáveis (V) da cadeia pesada e leve da IgE são as mesmas que de outras
imunoglobulinas. O gene épsilon (Є) codifica as regiões constantes (C) para esta
imunoglobulina e a IgE é produzida devido a alteração de isotipo da cadeia pesada
que é uma mudança sofrida pelos linfócitos B ativados que começam a expressar
outras classes de cadeias pesadas de imunoglobulinas, que não µ para IgM e δ para
IgD, e sim cadeias γ para IgG, α para IgA ou Є para IgE (ABBAS, 2003).
A biosíntese de IgE é realizada pelo linfócito B e, esta produção é regulada
por diferentes fatores como, a herança biológica, a exposição ao antígeno e as
citocinas de células T (ALEKSEEVA et al., 2007).
O anticorpo IgE proporciona o reconhecimento do antígeno para as reações
de hipersensibilidade imediata, na qual um antígeno é reconhecido por linfócitos B,
que se diferenciam em plasmócitos que sintetizam IgE específicas. Estes anticorpos
se ligam na superfície de mastócitos ou basófilos através de receptores FcЄRI de
alta afinidade e, com adjacente exposição a este mesmo antígeno, desencadeia-se
uma reação por ligação cruzada das moléculas de IgE, com posterior ativação dos
mastócitos e, subseqüente liberação de seus mediadores (KAMBAYASHI &
KORETZKY, 2007; ABBAS et al., 2003).
Como mencionado anteriormente, esta imunoglobulina é reconhecida
somente pelas células que expressam o receptor específico (FcЄRI) de alta
afinidade em condições de repouso, como é o caso de mastócitos, nos tecidos, e
basófilos na circulação (KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007; ALEKSEEVA et al.,
2007; GIERAS et al., 2007; RIVERA & GILFILLAN, 2006; SCHEIN et al., 2005). O
mastócito e o basófilo são células que possuem a capacidade de liberar substâncias
mediadoras que afetam a permeabilidade vascular quando ativados, participando,
deste modo, na proteção das superfícies de mucosas contra patógenos (JANEWAY
et al., 2002).
O processo que atrai as células que contém histamina para o local de entrada
do alérgeno no organismo, é uma das razões para que os indivíduos alérgicos
tornem-se mais sensíveis (ROITT, 2003). Observa-se também, que indivíduos
atópicos, ou seja, aqueles pré-dispostos a hipersensibilidade imediata, possuem
maiores títulos de IgEs no sangue que os não atópicos, aumentando portanto o
21
reconhecimento do antígeno pelo organismo e, desencadeando os sintomas da
alergia (ALEKSEEVA et al., 2007).
1.4.2 - Receptor FcЄRI:
Os FcЄRI são receptores que se ligam na IgE na superfície dos mastócitos e
basófilos, Figura 8. Esses receptores são expressos na superfície de mastócitos e
basófilos e se apresentam como um receptor tetramérico composto de uma cadeia
α, uma cadeia β e duas cadeias γ que são compartilhados com outros receptores
imunes (KAMBAYASHI AND KORETZKY, 2007; RIVERA AND GILFILLAN, 2006).
Figura 8: Estrutura do receptor FcЄRI compreendido de uma cadeia α que se liga a IgE, uma cadeia β transmenbrana e um homodímero de cadeia γ. Ambas cadeias β e γ contém ITAM. (RIVERA AND GILFILLAN, 2006).
A cadeia α é responsável pela ligação a molécula de IgE e as cadeias β e γ
participam na transdução de sinais na célula. Na ligação-cruzada do FcЄRI com
complexos de antígenos/IgE, a agregação de múltiplos complexos resulta na
transfosforilação de regiões do tipo ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based
Activation Motif) da cadeia β e γ por Lyn (proteína da família Src – tirosino quinases
que não são receptores) que está constitutivamente associada a cadeia β
(KAMBAYASHI AND KORETZKY, 2007; RIVERA AND GILFILLAN, 2006).
22
Os mastócitos e basófilos expressam em sua superfície grande número de
receptores Fc de alta afinidade para IgE (FcЄRI). Em conseqüência, a superfície de
cada célula mostra-se recoberta por moléculas de IgE que foram produzidas pelos
plasmócitos, estas moléculas foram absorvidas da circulação e atuam como
receptores para antígenos específicos (ABBAS, 2003).
1.4.3 – Mastócito:
Os mastócitos foram primeiramente identificados por Paul Ehrlich que assim
os denominou (mast, bem nutridos ou saciados, do alemão) devido a seus grânulos
característicos que são densamente compactados (KAMBAYASHI AND KORETZKY,
2007; ROITT, 2003). Esta célula possui a capacidade de liberar substâncias que
afetam a permeabilidade vascular quando ativados, orquestrando as respostas
alérgicas e, acredita-se, que tenham um papel na proteção das superfícies de
mucosas contra patógenos (JANEWAY et al., 2002).
O precursor dos mastócitos se origina a partir de células sem grânulos
citoplasmáticos na medula óssea. Quando seus precursores migram para o tecido
conjuntivo ou para a lâmina basal própria da mucosa, há a sua proliferação e o
acúmulo de grânulos citoplasmáticos. Ambos, mastócitos e basófilos contêm
grânulos e derivam do mesmo progenitor na medula óssea (KIERSZEMBAUM,
2004). Na circulação, os mastócitos nos diferentes tecidos não podem ser
identificados, mas estas células são distintas tanto do ponto de vista morfológico
quanto citogenético, nos diferentes tecidos (ROITT, 2003). Basófilos e mastócitos
humanos, localizados respectivamente, na circulação e nos tecidos, têm sua origem
a partir de uma mesma população progenitora de células mielóides humanas
expressando CD34+ (KIRSHENBAUM, 1991).
Os mastócitos estão localizados predominantemente nas proximidades dos
vasos sanguíneos e nervos, abaixo dos epitélios e mucosas, estando presentes
também em órgãos linfóides. São caracterizados pela extrema abundância de
grânulos, os quais preenchem todo o citoplasma a ponto de, freqüentemente,
impedir a visibilidade do núcleo (DA SILVA & MOTA, 2003). Esses grânulos são
constituídos principalmente por glicoproteínas e coram-se metacromaticamente
devido ao seu conteúdo em proteoglicanos, destacando-se facilmente em cortes
corados por azul de toluidina (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004). Na maioria das
23
espécies, os mastócitos são extremamente ricos em histamina e heparina, e, no rato
e no camundongo, são, além disso, ricos em serotonina (DA SILVA & MOTA, 2003).
A ativação dos mastócitos se dá pela ligação cruzada das moléculas do
receptor FcЄRI, causada pela ligação de antígenos multivalentes às moléculas IgE
ligada ao receptor (ABBAS, 2003). Essa ativação resulta em três respostas
biológicas: secreção dos conteúdos pré-formados dos grânulos; síntese e secreção
de mediadores lipídicos; e secreção de citocinas. As funções efetoras dos
mastócitos são mediadas por estas moléculas solúveis liberadas das células sob
ativação.
As moléculas liberadas pelos mastócitos e basófilos após ativação (Figura 9)
podem ser divididas em mediadores pré-formados, que incluem as aminas
biogênicas, ou vasoativas e as macromoléculas dos grânulos, e os mediadores
recém-sintetizados, que incluem mediadores derivados de lipídeos e citocinas. Nos
mastócitos humanos o único mediador da classe das aminas biogênicas presentes
em quantidades significantes é a histamina (ABBAS, 2003). Os mais importantes
mediadores lipídicos são produtos do metabolismo do ácido araquidônico, tais como
prostaglandina D2, leucotrienos, especialmente o leucotrieno C4 (LTC4) e o
leucotrieno B4 (LTB4) que é um potente estimulador de neutrófilos, induzindo
quimiotaxia, adesão e degranulação, sendo estas reações envolvidas na
hipersensibilidade do tipo I, e o fator ativador de plaquetas (PAF) (BOYCE, 2003). A
histamina, a prostaglandina D2 e o leucotrieno C4 contribuem para a modulação da
mucosa pela indução de edema e da secreção de muco e, no caso de asma,
broncoconstrição. Mastócitos também secretam citocinas pró-inflamatórias incluindo,
IL-4, IL-5 e IL-13, que regulam a síntese de IgE pelo linfócito B e o desenvolvimento
de inflamação eosinofílica (BRADDING,1999).
Os mediadores vasoativos liberados em um processo alérgico são
provenientes dos grânulos citoplasmáticos contidos nestas células, Figura 9
(KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007; MAINTZ & NOVAK, 2007). Esses grânulos
secretados são elétron-densos e heterogêneos, contêm histamina, heparina e
mediadores quimiotáticos que atraem outras células, como monócitos, neutrófilos e
eosinófilos circulantes do sangue, para os locais de ativação dos mastócitos
(KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007; GIERAS et al., 2007; KIERSZEMBAUM et al.,
2004).
24
Figura 9: Ativação celular do mastócito mediada pelo receptor FcЄRI. A interação do receptor ligado a IgE, realizando ligação cruzada com um antígeno que inicia diversas vias de ativação intracelular, culminando na liberação dos mediadores inflamatórios (adaptado de KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007).
Os mastócitos são historicamente conhecidos pelo seu envolvimento na
hipersensibilidade do tipo I, mas possuem funções protetoras e homeostáticas. Eles
reconhecem diretamente os produtos de infecções bacterianas através de várias
proteínas receptoras na superfície, liberando proteases, citocinas e mediadores que
recrutam neutrófilos, limitando o alcance da infecção bacteriana e facilitando o
reparo do tecido (BOYCE, 2003).
1.4.4 – Epitopo:
A seqüência de aminoácidos reconhecida pela molécula de anticorpo é muito
menor que a macromolécula imunogênica. Por isso, a ligação do anticorpo ocorre
somente numa porção específica do antígeno. Esta região é chamada de epitopo ou
determinante antigênico. Os antígenos podem ter múltiplos epitopos e cada um pode
se ligar a uma molécula de anticorpo (ABBAS, 2003).
Com relação aos epitopos presentes na molécula de albumina 2S de mamona
(Figura 10), Vieira em 2002 observou que ambas as isoformas isoladas do “pool” de
albuminas 2S, Ric c 1 e Ric c 3, mesmo após serem submetidas à desnaturação,
são capazes de desencadear a desgranulação de mastócitos, indicando a presença
de epitopos contínuos nas duas isoformas. Mayerhoffer em 2004 verificou que após
a clivagem enzimática dessas isoformas, dois peptídeos presentes na cadeia
pesada de Ric c 3, induziram uma resposta significativa quanto a desgranulação dos
Núcleo
Leucotrienos
Citocinas Quemocinas
Histamina Leucotrienos Citocinas Quemocinas
Grânulos
Desgranulação
Antígeno
25
mastócitos. Neste mesmo trabalho, Mayerhoffer caracterizou um epitopo linear, cuja
seqüência peptídica está presente também em outros alérgenos. Felix em 2006
caracterizou cinco epitopos lineares alergênicos nas isoformas de albumina 2S, Ric
c 1 e Ric c 3, de mamona. Na seqüência de todos os peptídeos identificados por
Felix em 2006 e Mayerhoffer em 2004 era possível observar a presença de pelo
menos dois resíduos de aminoácidos dicarboxílicos (ácido glutâmico e/ou aspártico).
Esta característica suporta a hipótese de que os grupamentos carboxílicos laterais
destas cadeias podem ser importantes na interação com as moléculas de IgE. Desta
forma, Carriello-Gama em 2006, tratou as albuminas 2S, bem como os peptídeos
sintéticos, identificados como epitopos ligantes de IgE, com o reagente Woodward`s
Reagent K (WRK - N-etil-5-fenilisoxazolium-3`-sulfonato), específico para ácidos
glutâmicos. Este trabalho obteve resultados satisfatórios para modificar a proteína
alergênica ao nível dos ácidos glutâmicos e, foi fundamental para provar que este
aminoácido participa, de modo direto, no reconhecimento pela IgE. Sendo assim,
Oliveira em 2008, passou a utilizar outras substâncias, menos específicas, no
entanto mais econômicas, que poderiam modificar o grupamento lateral deste
aminoácido.
Figura 10: Estudo dos epitopos presentes nas albuminas 2S de mamona. 2002 – Vieira demonstra a presença de epitopos contínuos Ric c1 e Ric c3; 2004 – Mayerhoffer identifica 1 epitopo (Desgranulação de mastócitos); 2006 – Felix demonstra a participação de resíduos de aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e aspártico) nos 5 epitopos; 2006 – Carrielo-Gama confirma da participação do glutâmico no epitopo, com o tratamento utilizando WRK; 2008 – Oliveira propõe modificações no grupamento lateral deste aminoácido utilizando compostos de cálcio.
Conhecendo o envolvimento de ácidos glutâmicos na ligação à IgE , testes in
vitro foram propostos utilizando aminoácidos livres como agente bloqueadores de
IgE, neste modelo, os experimentos empregaram os aminoácidos dicarboxilícos, os
quais protegeram os mastócitos de rato, já sensibilizados com IgE contra albuminas
2S de R. communis L. Nesses experimentos, ficou evidente que este medicamento
impediu a resposta cruzada entre alérgenos de mamona e alérgenos alimentares e
2002 2004 2006 2006 2008
Epi
topo
s lin
eare
s
Am
inoá
cido
s ác
idos
Epi
topo
WR
K
Com
post
os
de c
álci
o
26
inalantes (patente depositada em 2005). Nesse sentido, além do desenvolvimento
de agentes farmacêuticos bloqueadores na molécula de IgE, a produção de vacinas
anti-alérgicas baseada nos peptídeos específicos, anteriormente descritos, poderia
ser realizada de forma mais consciente através do reconhecimento dos epitopos
presentes no alérgeno.
1.4.5- Alergia desencadeada por albumina 2S:
A alergia desencadeada pela albumina 2S de mamona é causada
principalmente pela inalação da poeira da torta, representando um problema para os
trabalhadores das usinas de extração quanto para a população que habita as
proximidades da fábrica (GARCÍA-GONZÁLEZ, et al., 1999). Cabe salientar também
que Thorpe e colaboradores em 1988 demonstraram que os alérgenos de mamona
poderiam estar presentes também no pólen, uma vez que as pessoas que moravam
próximo às áreas de plantio apresentavam anticorpos específicos contra estas
proteínas (FREIRE et al., 2007).
Além da poeira da torta, como dito anteriormente, o pólen também representa
outro fator a ser considerado quando se trata de alergia desencadeada por mamona.
A mamona é um vegetal que possui flores que podem ter mais de 60 mil grãos de
pólen/flor que contém substâncias alergênicas, semelhantes às encontradas nas
sementes. As condições para dispersão desses grãos são: temperatura de 26 ºC a
29 ºC e umidade relativa do ar de 60%, variando de acordo com o cultivar
(BELTRÃO & AZEVEDO, 2007). A mamona apresenta longo período de floração e
seu pólen pode ser encontrado em algumas estações do ano, apresentando-se com
uma estrutura de tamanho médio e oval com 20 µm a 22 µm de largura e 29 µm a 33
µm de comprimento (BELTRÃO & AZEVEDO, 2007; GARCÍA-GONZÁLEZ, et al.,
1999).
Como descrito anteriormente, os alérgenos presentes na semente de
mamona são bem conhecidos, mas observam-se poucos relatos quanto ao papel
desempenhado pelos alérgenos presentes em seu pólen. Na Índia uma pesquisa
desenvolvida por Singh e colaboradores em 1992 demonstrou que existe variação
no perfil protéico de extratos de pólen de mamona em diferentes anos e lugares
deste país. No ano de 1997, a reação cruzada e a presença de epitopos comuns
entre as sementes e os extratos de pólen de mamona foram confirmadas (Singh et
al., 1997). Neste mesmo ano, alguns trabalhos demonstraram a reação cruzada de
27
pólen de mamona com pólen de outras espécies vegetais como, Mercurialis annua
(Vallverdu et al., 1997), Putranjiva roxburghii (Singh et al., 1997). Em 1999, estudos
desenvolvidos por Garcia-Gonzalez e colaboradores demonstraram que o pólen de
mamona provoca sintomas de alergia respiratória. Nesse sentido, Parui e
colaboradores em 1999 propuseram uma nova abordagem para identificação e
caracterização parcial das proteínas alergênicas do pólen de Ricinus communis L.
No ano de 2002, Palosuo e colaboradores evidenciaram a reação cruzada entre
alérgenos de mamona e outros vegetais da família Euforbiácea, ratificando a
importância de estudos de reação cruzada como uma pesquisa diagnóstica.
Sabe-se que as doenças alérgicas têm aumentado muito nos últimos anos e
que, mais de 30% da população sofre de uma ou outra doença alérgica, tendo como
principais agentes causadores grãos de pólen, esporos fúngicos, os ácaros, epitélios
animais, etc. Os trabalhos de Singh & Kumar em 2003 demonstraram, de forma
quantitativa e qualitativa a prevalência de pólens na região da Índia, verificando que,
além de outros aeroalégenos, existe uma distribuição significativa de pólen de
mamona nesta área. Conhecendo também que a poluição do ar tem sido descrita
como um fator importante para o recente aumento na incidência de doenças
respiratórias e, que o ar transporta muitos grãos de pólen, o trabalho desenvolvido
por Bist e colaboradores, em 2004, observou uma variabilidade protéica do pólen de
mamona antes e após a exposição a poluentes atmosféricos. Outro recente estudo
desenvolvido por Felix em 2007 demonstra que mastócitos primeiramente
sensibilizados com imunoglobulinas do tipo E anti-albuminas 2S de mamona podem
sofrer desgranulação quando expostos a aeroalérgenos tais como poeira do ar,
fungos e tabaco e, a componentes alergênicos presentes em diversos alimentos tais
como camarão, peixe, glúten, trigo, soja, amendoim e milho. Estes estudos alertam
para a importância das exposições ao pólen desta oleaginosa, indicando a cautela
com relação à exposição a este antígeno para minimizar os riscos de reações
cruzadas.
1.5 - PROCESSOS DE DESTOXICAÇÃO E DESALERGENIZAÇÃO DA TORTA DE
MAMONA:
Visando agregar valores a torta, produto da extração do óleo da semente, e
aumentando o número de possíveis utilizações, dentre elas a alimentação animal,
28
muitas pesquisas estão sendo realizadas em todas as partes do mundo visando
eliminar fatores que impedem a sua plena utilização, como a toxina ricina e o
alérgeno CB-1A.
A literatura (Perrone e colaboradores em 1966 e Kling em 1974) apresenta
algumas metodologias, já testadas e patenteadas em diversos países,
demonstrando a possibilidade de destoxificar à torta de mamona pelo seu
cozimento. Em 1940, Pertrozyan e Ponomarev (citados por Kling, 1974) apontaram
um processo de destoxicação que consistia em ferver a torta repetidamente, por
curtos períodos de tempo, com mudança de água após cada fervura. Do mesmo ano
até 1942 algumas patentes foram concedidas para processos de destoxicação da
torta de mamona em diferentes partes do mundo.
Em 1960, Gardner e colaboradores testaram diferentes processos para
destoxicação da torta de mamona combinando diferentes temperaturas, adição de
produtos químicos e outros processos, desde a adição de produtos alcalinos à
fermentação aeróbia, não levando em consideração a viabilidade industrial nem
econômica e tampouco as características nutricionais e a palatabilidade do produto
obtido. Este foi um primeiro relato sobre a tentativa de desenvolver um método para
destoxificação e, ao mesmo tempo, a desalergenização da torta de mamona,
combinando diferentes temperaturas e adição de produtos químicos. As
metodologias desenvolvidas por estes pesquisadores eram eficazes, mas ainda
precisavam de avaliação quanto ao custo e a palatividade do produto obtido.
Freitas, em 1974, avaliou a destoxicação e desalergenização da torta de
mamona pelo uso de radiação ionizante, concluindo que o processo foi capaz de
eliminar ambos os fatores anti-nutricionais.
Gandhi e colaboradores em 1994 propuseram um novo método para
destoxificação que consistia na mistura da torta de mamona com a torta da planta
Shorea robusta que também é tóxica devido ao alto teor de tanino o qual precipita a
ricina.
Segundo Kling em 1974, os métodos de destoxificação referidos na literatura
não possuem aplicabilidade industrial em virtude do alto custo e por prejudicarem a
qualidade do produto. Um dos primeiros requisitos para que a indústria possa operar
uma unidade de destoxificação e desalergenização é o desenvolvimento de métodos
confiáveis e de fácil execução.
29
A alergenicidade não é tão grave quanto a toxidez, pois dificilmente causa
morte de animais ou seres humanos, porém a sua eliminação é bem mais difícil que
a inativação da ricina. A preocupação com a alergenicidade da torta de mamona
refere-se aos trabalhadores das indústrias de extração do óleo e os moradores dos
arredores das indústrias ou áreas de plantio, os quais estão expostos à poeira
levada pelo vento; outro fator a ser analisado é o risco de reações alérgicas dos
trabalhadores de campo que utilizam a torta como adubo e ficam submetidos à
poeira. O primeiro relato de alergia causada em uma comunidade por uma indústria
de extração de mamona foi feito no ano de 1928 em Toledo, Ohio, USA. Após este
caso, diversos relatos foram feitos: Alemanha (1942), Figline Valdarno, Itália (1949),
Tchecoslováquia (1949), Hungria (1950), Bauru, no estado de São Paulo (1953),
África do Sul (1953) e outros (ICOA, 1989).
Verifica-se que, ainda não existem processos industriais viáveis de
destoxicação da torta de mamona, porém em processos experimentais de pequena
escala, como na área acadêmica, a destoxicação é obtida por tratamento térmico,
como a autoclavagem (FREIRE et al., 2007). Poucas metodologias visando à
desativação dos alérgenos presentes na torta de mamona foram propostas, e
nenhuma delas realmente atingiu resultados satisfatórios que possibilitasse o
emprego industrial.
Em 2006, a inativação do alérgeno de mamona (CB-1A) foi descrita por KIM,
pela da utilização de aquecimento conjugado a tratamentos químicos (NaOH e
NaOCl). Segundo o autor, o alérgeno mostrou um decréscimo drástico em sua
atividade antigênica, desaparecimento de bandas na eletroforese, quando a
temperatura (70ºC) foi associada aos compostos químicos. No ano de 2008,
GODOY promoveu estudos experimentais das condições de cultivo do fungo
Penicillium simplicissimum para produção de lipases em rejeito de mamona e, de
forma indireta, obteve, após a fermentação em estado sólido submetida ao rejeito,
um produto destoxicado, ou seja, sem a presença da ricina.
Pesquisas visando reconhecer os epitopos presentes em albumina 2S de
mamona foram iniciadas no nosso grupo de pesquisa. Nesse sentido, Vieira em
2002 observou a presença de epitopos contínuos nas duas isoformas alergênicas
(Ric c 1 e Ric c 3) de albuminas 2S de mamona. No ano de 2004, Mayerhoffer
identifica um desses epitopos presentes no alérgeno de mamona através de ensaios
de desgranulação de mastócitos, caracterizando, neste trabalho, um epitopo linear,
30
cuja seqüência peptídica está presente também em outros alérgenos. Dando
prosseguimento aos trabalhos realizados por Mayerhoffer, Felix e colaboradores,
mapeou quais seriam os aminoácidos responsáveis pela ligação da proteína
alergênica de mamona nas IgEs, identificando, deste modo, epitopos de ligação a
IgE contínuos em Ric c1 e Ric c3, sendo estes, mais resistentes a desnaturação
térmica, química e a proteólise (FELIX et al., 2008). Uma característica observada na
sequência dos epitopos alergênicos identificados em 2004 e em 2006 é a presença
de pelo menos dois resíduos de aminoácidos dicarboxílicos (ácido glutâmico e/ou
aspártico). Esta informação suporta a hipótese de que os grupamentos carboxílicos
laterais destas cadeias podem ser importantes na interação com as moléculas de
IgE.
No ano de 2006, em nosso grupo de pesquisa, Carrielo-Gama propôs
metodologias para o tratamento químico da albumina 2S de mamona. O tratamento
químico proposto modifica a estrutura da proteína ao nível dos ácidos glutâmicos,
epitopos contínuos anteriormente caracterizados, impedindo a ligação da proteína
modificada às IgEs ligadas nos mastócitos. Neste trabalho foi utilizado um reagente
específico contra os ácidos glutâmicos, muito empregado para modificações de
ácidos dicarboxílicos, conhecido como Woodward´s Reagent (WRK) que em sua
estrutura possui um átomo de N (nitrogênio) carregado positivamente em um
isozaxolium adjacente a um grupo fenilsulfonato aromático. Os resultados obtidos
por Carrielo-Gama, utilizando este tratamento químico, foram satisfatórios para a
modificação da proteína alergênica e, fundamentais para a confirmação da
participação dos glutâmicos na formação dos epitopos das albuminas 2S de
mamona, porém o WRK é um reagente caro e inviável para uso em escala industrial.
A proposta deste trabalho é baseada no tratamento químico da amostra do
alérgeno isolado e do alérgeno presente na torta de mamona, utilizando compostos
de cálcio, hidróxido, carbonato e óxido de cálcio. Estes compostos químicos já são
amplamente utilizados como suplementos alimentares e, se constituem reagentes
baratos para serem utilizados em escala industrial. Sabe-se também que o
tratamento da torta de mamona com hidróxido de cálcio já havia sido proposto por
Anandan em 2005 e, o mesmo, mostrou-se eficaz para desativar a proteína tóxica
ricina. Desta forma, nossa meta é comprovar a desalergenização das amostras
submetidas aos tratamentos com compostos de cálcio propostos neste trabalho.
Para a reação entre os compostos de cálcio e o alérgeno, acreditamos que o íon
31
cálcio (Ca++) seja capaz de interagir eletrostaticamente com os ácidos glutâmicos,
epitopos anteriormente identificados, presentes na molécula de albumina 2S de
mamona e, desta forma, ocupando o local de interação com a IgE.
32
2- OBJETIVO
O objetivo geral deste trabalho é desenvolver uma metodologia capaz de
desativar epitopos alergênicos presentes na torta de mamona (Ricinus communis L.)
utilizando tratamento químico com compostos de cálcio.
Os objetivos específicos são:
• Avaliar a eficiência dos compostos Ca(OH)2, CaCO3 e CaO em
desativar epitopos alergênicos de albumina 2S de Ricinus communis L.
através de testes de desgranulação de mastócitos;
• Avaliar a possibilidade de utilização de células RBL-2H3 para
determinação da atividade alergênica;
33
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - OBTENÇÃO DO “POOL” DE ALBUMINAS 2S DE SEMENTES DE MAMONA:
As albuminas 2S foram extraídas de sementes de Ricinus communis L.
cultivar IAC-226 segundo a metodologia descrita por Thorpe et al. (1988), com
adaptações propostas por Machado e colaboradores em 2003. Cerca de 140 gramas
de sementes foram descascadas e, após a retirada das casacas, a massa livre do
tegumento foi registrada. Esta massa foi macerada com grau e pistilo e,
posteriormente embebida em hexano (300 mL) visando a extração do óleo. Esta
suspensão foi mantida sob agitação, à temperatura ambiente, durante 18 horas.
Após a agitação, a amostra foi centrifugada a 2250 x g por 30 minutos e, os lipídeos
que formaram uma camada na superfície do líquido puderam ser removidos. Essa
metodologia foi repetida por duas vezes. Após a extração do óleo, as proteínas
foram solubilizadas em tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,0) na proporção de 1:4
e, os resíduos insolúveis foram eliminados por centrifugação a 30.000 x g durante 15
minutos a 4°C. As proteínas do sobrenadante foram precipitadas com sulfato de
amônio a 90% de saturação durante 18 horas sob agitação. Após a precipitação, a
amostra foi centrifugada a 15.000 x g durante 15 minutos e o precipitado, contendo
as proteínas, foi recolhido e o sobrenadante descartado. O material recolhido foi
fervido durante 15 minutos, em banho-maria, visando flocular a ricina e,
subseqüentemente, submetido a uma nova centrifugação e, o sobrenadante
recolhido. Para separar a albumina 2S das outras proteínas presentes na amostra, a
mesma foi submetida a filtração em gel utilizando resina Sephadex-G-50
previamente equilibrada em TFA (ácido trifluoracético) 0,1%. A amostra foi eluída
com TFA 0,1% sob um fluxo de 1,0 mL/min e, frações de 1 mL foram coletadas e
detectadas a 280 nm. As frações correspondentes as albuminas 2S, foram
acumuladas, liofilizadas e guardadas a 4 ºC, em pequenas alíquotas.
3.2 - OBTENÇÃO DE SORO ANTI-ALBUMINA 2S:
O soro policlonal de rato anti-albumina 2S de mamona foi produzido na
Universidade Federal Fluminense, em colaboração com o Dr. Maurício Afonso
Verícimo. Para tanto, 10 ratos RA/Thor foram imunizados por injeção intraperitoneal
34
de 0.5 mL de salina contendo 0.01 mg do “pool” de albumina 2S e 5.0 mg de
hidróxido de alumínio. Um mês, após a 1ª imunização, os animais receberam uma
dose reforço de antígeno. Neste caso, a mesma quantidade do antígeno foi
misturada com 2.5 mg de hidróxido de alumínio. Os animais foram anestesiados e
sangrados, por punção cardíaca, 7 dias após o reforço, volumes de soro iguais de
cada animal foram recolhidos, reunidos e guardados em alíquotas de 0.1 mL. Essas
alíquotas representam o “pool” de IgE anti-albumina 2S.
3.3 - TRATAMENTO QUÍMICO DO “POOL” DE ALBUMINAS 2S E DA TORTA DE
MAMONA:
O tratamento químico consistiu da adição de 100 µL de diferentes soluções de
compostos de cálcio (hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio) nas
concentrações de 4 e de 8% a 100 µL de “pool” de albumina 2S (1mg/mL). O meio
reacional (200 µL) foi deixado sob agitação por 12 horas, a temperatura ambiente,
figura 11.
Figura 11: Fluxograma do tratamento proposto para desativar epitopos alergênicos de albumina 2S de mamona utilizando diferentes compostos de cálcio.
A torta de mamona utilizada nos experimentos foi cedida pela EMBRAPA
(Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuária) e o tratamento químico com a torta
de mamona também consistiu da adição de 100 µL de diferentes soluções de
Ca(OH)2 CaO CaCO3
Alb 2S Torta
4%
8%
4%
8%
4%
8%
Caracterização Biológica
Amostras Tratadas
Microscopia óptica Ensaio de desgranulação Dosagem de histamina
35
compostos de cálcio (hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio) nas
concentrações de 4 e de 8% a 100 µL de amostra de torta de mamona (0,3 g/mL). O
meio reacional (200 µL) foi mantido sob agitação por 12 horas, a temperatura
ambiente.
3.4 - CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA – AVALIAÇÃO DA ALERGENICIDADE:
Para analisar as propriedades alergênicas das amostras empregamos ensaio
de desgranulação de mastócitos obtidos de lavado peritoneal de rato, o qual foi
avaliado por análise da morfologia celular por microscopia óptica e pela dosagem de
histamina liberada das mesmas. Como avaliação complementar, utilizamos ensaios
de desgranulação utilizando células RBL-2H3 por meio de quantificação da enzima
lisossomal β-hexosaminidase.
3.4.1 – Obtenção dos mastócitos de rato:
Ratos da linhagem Wistar (não imunizados), de aproximadamente 250 g cada
foram empregados como fonte de mastócitos. Três ratos foram sacrificados, um de
cada vez, por asfixia em CO2 e, posteriormente submetidos a uma incisão na
cavidade peritoneal, de aproximadamente 5 cm. Nesta abertura, foram inseridos 20
mL de meio de cultura DMEM (meio mínimo essencial de Eagle modificado por
Dulbecco) contendo 12 U.I./ mL de heparina para realizar a lavagem. O conteúdo
recolhido do primeiro rato foi utilizado para realizar a lavagem do segundo e assim
sucessivamente, objetivando enriquecer o conteúdo do lavado com mastócitos. O
lavado obtido dos animais foi retirado da cavidade peritoneal com o auxílio de uma
pipeta Pasteur e armazenado em tubo cônico tipo Falcon.
O conteúdo final recolhido do peritôneo dos ratos, aproximadamente 15 mL,
foi transferido para uma placa de Petri, permanecendo por 30 minutos em estufa à
37°C, visando separar os mastócitos dos macrófagos. Após esse período de tempo,
2/3 do meio de cultura foi retirado cuidadosamente da superfície da placa com
auxílio da pipeta Pasteur e descartado. O líquido remanescente (cerca de 4 - 5 mL)
contendo os mastócitos foi transferido para um tubo cônico tipo Falcon e essa
suspensão final de células, dividida em alíquotas de 100 µL, para posterior
sensibilização.
36
3.4.2 – Ensaios de desgranulação:
Avaliamos a ativação dos mastócitos mediada ou não por imunoglobulinas. As
alíquotas de 100 µL da preparação enriquecida em mastócitos foram submetidas ao
tratamento com 1 µL de soro total anti-albumina 2S e com 10 µL da amostra a ser
testada (10 µg/mL). A mistura foi incubada por 1 hora a 37 oC. Nos controles de
ativação inespecífica, o soro foi omitido do ensaio. Para a avaliação da
desgranulação, uma alíquota de 10 µL foi utilizada para a contagem de mastócitos
por microscopia óptica, o remanescente foi reservado para a dosagem de histamina.
Para a detecção do percentual de desgranulação em todos os testes
realizados, o “pool” de IgE anti-albumina 2S obtido após imunização de ratos
RA/Thor foi diluído a uma proporção de 1:100 na suspensão de células. As amostras
foram preparadas para que se tivesse 1 µg/mL na mesma solução. Esta mistura foi
incubada por 1 hora na estufa de cultura de células a 37o C.
A desgranulação dos mastócitos foi avaliada por microscopia óptica e pela
quantificação da histamina liberada.
3.4.2.1 - Avaliação do percentual de desgranulação por microscopia
óptica:
A suspensão de células contendo os mastócitos (10 µL), após os diversos tipos
de incubação, foram misturadas e incubadas durante 15 minutos com 10 µL de
solução aquosa contendo 0,1% de azul de toluidina, 10% de formaldeído e 1% de
ácido acético, pH 2,8 para evidenciar a desgranulação. A contagem diferencial dos
mastócitos, íntegros e desgranulados, foi realizada em câmara de Neubauer, nos
quatro quadrantes, sendo visualizados em microscopia de contraste de interferência
diferencial de Normarski (DIC) utilizando o microscópio óptico Zeiss Axioplan.
Como controle negativo de sensibilização induzida, mastócitos sem
tratamento prévio foram também incubados com o corante nas condições citadas e,
observados ao microscópio óptico. A contagem destas células, íntegras e
desgranuladas, permitiu uma avaliação do procedimento de obtenção. Cada
experimento foi feito em duplicata e, foram empregados mastócitos do mesmo
animal. Os gráficos apresentando os resultados dos ensaios de desgranulação
foram construídos utilizando o programa GraphPad Prism 4.
O restante do material celular (90 µL) foi utilizado para a determinação da
histamina liberada, como descrito no item 3.4.2.2.
37
Para verificar as mudanças morfológicas sofridas pelas células ao serem
incubadas com albumina 2S de mamona ao longo do tempo, os mastócitos do
lavado peritoneal de rato expostos ao alérgeno de mamona foram incubados em
diferentes tempos, variando de 0 a 1 hora. Transcorrido o tempo de cada amostra,
as células foram coradas por azul de toluidina, como descrito anteriormente e,
observadas através do microscópio óptico acoplado a uma filmadora para a captura
das imagens.
3.4.2.2 – Quantificação de histamina:
Para esta dosagem empregamos um processo de cromatografia de troca
catiônica, seguido por derivatização pós-coluna. A histamina presente no meio
reagiu com o-phthaldialdeido (OPA), produzindo um composto fluorescente. Vários
gradientes de eluição foram testados e o processo utilizado baseou-se na eluição
isocrática empregando-se NaOH 0,2M. Uma curva padrão foi feita empregando-se
de 1pmol a 1 nmol de histamina fornecida pela r-Biopharm.
Para este ensaio foram utilizados os 90 µL restantes da suspensão de células
do lavado peritoneal, pré-incubadas com soro e amostras de albuminas 2S ou torta
de mamona submetidas ao tratamento descrito no item 3.4.2.1. Neste caso, a
suspensão de células foi sedimentada através de uma centrifugação (4000 g) e por
um curto período de tempo (10 minutos). Vinte microlitros do sobrenadante foram
aplicados na coluna de troca catiônica para quantificação da histamina liberada, por
processos cromatográficos. O restante da amostra (70 µL) foi sonicado por 30
segundos para rompimento da membrana dos mastócitos. Uma alíquota de 20 µL da
amostra sonicada também foi analisada por cromatografia para dosagem da
histamina total. O processo de sonicação provocava o rompimento de praticamente
todas as células e os valores da quantificação de histamina foram tomados como
100%.
Os valores de histamina liberada pela incubação com o soro de cada uma das
amostras foram expressos em porcentagem. A construção de uma planilha de
valores (programa excel) foi realizada para corrigir os valores de histamina liberada
pelo número de células contadas por microscopia óptica.
A histamina foi dosada após separação dos componentes do meio reacional
(DMEM) por cromatografia de troca catiônica, empregando um sistema HPLC (High
Performance Liquid Chromatography). A eluição da histamina retida foi feita com
38
NaOH 0,2 M empregando um fluxo de 0,6 mL/min. A histamina foi detectada após
associação com OPA, seguindo a reação apresentada na figura 12. A detecção foi
feita por derivatização pós-coluna, utilizando o reagente o-phthaldialdeido*.
Inicialmente o eluato foi neutralizado com a solução A (Na2CO3, H3BO3; K2SO4) e
depois reagia com a solução B (OPA 0,08%). Utilizamos um detector de
fluorescência da Shimatzu, modelo RF 535, sendo que, o produto da reação quando
excitado a 375 nm, emite no comprimento de onda de 460 nm.
Figura 12: Produto obtido a partir da reação química entre o-phthaldialdeido (OPA), β-mercaptoetanol e a histamina proveniente dos grânulos liberados pelos mastócitos do lavado peritoneal do rato.
* Preparo de reagente o-phthaldialdeído (OPA):
- Solução A:
Preparo de 1L do tampão com a seguinte composição química:
40,7 g de Na2CO3 (0,384M); 13,6 g de H3BO3 (0,216M); 18,8 g de K2SO4
(0,108M)
Os reagentes foram dissolvidos em água até um volume final de 1L. Ficando
o pH da solução próximo a 10, sem ajuste necessário.
- Solução B – OPA 0,08%:
400 mg de OPA foi dissolvido em 7 mL de etanol e em seguida foi adicionado
1 mL de 2-mercaptoetanol. O volume foi ajustado a 500 mL com a solução A.
CH
O
CH
O
+ HO-CH2-CH2-SH +
OPA
ββββ- mercaptoetanol
N – CH2 – CH2
C
C
H
S-CH2-CH2-OH
39
3.4.3 - Obtenção das células RBL-2H3:
As células RBL-2H3 (Rat Basophilic Leukemia Cells- Clone 2H3) foram
gentilmente cedidas pela professora Dr.ª Maria Célia Jamur da USP- Ribeirão Preto.
Estas células pertencem a uma linhagem celular primeiramente isolada e clonada
em 1978 de basófilos de ratos Wistar que foram mantidas como tumor no Laboratory
of Immunology do National Institute of Dental Research, nos Estados Unidos da
América. Estas células possuem a morfologia característica de fibroblastos, com
propriedade de crescimento aderente e expressa o receptor FcЄRI (MORENO,
2003). As células RBL-2H3 (Figura 13) foram cultivadas em meio mínimo essencial
de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 15% de soro fetal
bovino, 0,434 mg/mL de glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de
estreptomicina e 0,25 µg/mL de anfotericina B, como previamente descrito
(BASCIANO et al., 1986; PIERINI et al., 1996) e mantidas em atmosfera úmida
contendo 5% de CO2 a 37ºC.
As células foram monitoradas com auxílio de um microscópio invertido e,
quando confluentes, foram removidas dos frascos de cultivo utilizando-se Tripsina a
0,5% contendo EDTA – 4Na (incubação de 15 minutos a 37 ºC, em atmosfera úmida
contendo 5% de CO2). Após a centrifugação a 1000 rpm/ 5 minutos, o sobrenadante
foi descartado e o sedimento ressuspendido em meio de cultura para subcultivos
destas células.
Figura 13: Microscopia eletrônica de transmissão de células RBL-2H3. (A) não estimuladas, (B) após estimulação (MORENO, 2003).
3.4.3.1- Quantificação de liberação da enzima ββββ-hexosaminidase:
Os ensaios de desgranulação utilizando as células RBL-2H3 foram conduzidos
e realizados no laboratório de Biologia Celular e Molecular de Mastócitos do
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - Campus de Ribeirão Preto.
40
Para avaliar a desgranulação das células RBL-2H3, a quantificação de
liberação da enzima lisossomal β-hexosaminidase (% de desgranulação), um
mediador pré-formado, foi realizada. Um volume de 25 µL do sobrenadante ou 25 µL
do solubilizado de células, obtido com tampão Tyrode*, pH 7.3, em Triton 100-X 1%,
foi misturado com 25 µL do substrato sintético p-nitrofenol-N-acetil-β-D-glucosamida
(NAG; Sigma) preparado em tampão citrato-acetato* 0,1M, pH 4,5. As amostras
foram incubadas por 30 minutos a 37ºC e a reação foi parada pela adição de 50 µL
de NaCl 0,2M, NaOH 0,2M e glicina 0,2M. A reação da enzima celular com o
substrato foi detectada a 405 nm utilizando o leitor de microplacas (MORENO,
2003).
A preparação dos tampões utilizados nos ensaios de quantificação de liberação
da enzima β-hexosaminidase das células RBL-2H3 é descrita abaixo:
- Tampão Tyrodes - 3X (100 mL de água):
0,057g de CaCl2 2H2O
0,060g de KCl
0,302g de NaHCO3
2,402g de NaCl
0,013g de NaH2PO4
6,12 uL (4,9M) de MgCl2
0,300g de Sacarose
0,715g de HEPES
- Tampão citrato-acetato:
23,5 mL de ácido cítrico (2,44g + 116,0mL de H2O)
26,5 mL de citrato de sódio (3,32g + 112,9 mL de H2O)
3.5- ANÁLISE ESTATÍSTICA:
Os dados obtidos nos ensaios de desgranulação utilizando mastócitos de rato
foram analisados estatisticamente pelo one way ANOVA, utilizando o teste de
comparação múltipla de Tukey (P<0,001). Esta análise foi realizada pelo programa
GraphPad Prism 4.
41
4- RESULTADOS
4.1- AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ALERGÊNICA:
4.1.1- Morfologia celular - Microscopia óptica:
A atividade alergênica foi investigada por ensaios de ativação dos mastócitos e,
a desgranulação foi desencadeada por albumina 2S e, posteriormente, avaliada por
visualização e contagem das células íntegras e desgranuladas no microscópio óptico
e/ou por quantificação da histamina liberada. As figuras 14 (A, B e C) mostram
mastócitos sem qualquer tratamento para ativação e as figuras 14 (D e E e F)
ilustram mastócitos sensibilizados por soro de albuminas 2S de R. communis L. e na
presença do alérgeno.
Para verificar as mudanças morfológicas sofridas pelas células ao serem
incubadas com albumina 2S de mamona, as mesmas foram observadas e
monitoradas durante diferentes tempos de incubação (0, 15, 30, 45, 55 e 60
minutos).
As células obtidas da cavidade peritoneal do rato foram mantidas inicialmente
na presença de DMEM e, posteriormente, expostas ao “pool” de albumina 2S de
mamona. Nestes ensaios utilizou-se como fonte de IgE específica o “pool” anti-
albumina 2S produzidos em ratos (RA/Thor) que foram imunizados contra albumina
2S de mamona.
Transcorrido o tempo de cada amostra, as células foram coradas por azul de
toluidina e observadas através do microscópio óptico acoplado a uma filmadora para
a captura das imagens. Os mastócitos demonstrados na figura 14 abaixo, fotos (A),
(B) e (C) foram utilizados como padrões de células íntegras e, os mastócitos das
fotos (D), (E) e (F) foram utilizados como exemplos de células desgranuladas.
42
Figura 14: Mastócitos do lavado peritoneal de rato corados por azul de toluidina, após exposição à albumina 2S na presença de soros como fonte de IgE específica. Mastócitos sem ativação: A) tempo 0; B) após 30 minutos; C) após 60 minutos; Mastócitos ativados: D) tempo 0; E) após 30 minutos; F) após 60 minutos; Aumento de 400X.
Após contagem dos mastócitos íntegros e desgranulados, observamos que a
fração enriquecida com os mastócitos (controle negativo) apresentou cerca de 30%
de desgranulação, tanto na ausência, como na presença de soro total, indicando que
este percentual de desgranulação é inerente ao processo empregado para o
isolamento dos mastócitos ou reflete as condições fisiológicas do animal. Valores
similares foram encontrados quando albumina 2S foi incubada com os mastócitos na
ausência de soro total. No entanto, quando os mastócitos foram sensibilizados com
o soro total e a albumina 2S de mamona foi adicionada, observamos uma
desgranulação de cerca de 70% das células.
Em todos os ensaios de desgranulação, após a visualização e contagem das
células no microscópio óptico, uma alíquota foi retirada para quantificação de
histamina.
4.1.2- Quantificação da desgranulação de mastócitos:
Antes de iniciarmos os tratamentos propriamente ditos com as amostras de
albumina 2S e torta de mamona tratadas, primeiramente avaliamos o percentual de
desgranulação promovido pelos compostos propostos para o tratamento químico.
Nesse sentido, os compostos de cálcio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio e
óxido de cálcio, nas concentrações de 4 e de 8%, foram incubados com os
mastócitos provenientes do lavado peritoneal de rato. A figura 15 apresenta os
resultados obtidos após estas incubações. Podemos observar que esses compostos
A B C
D E F
43
na presença ou na ausência de IgE específica anti-albumina 2S são incapazes de
ativar as células ao nível do controle positivo (albumina 2S + IgE específica) e
desencadear uma resposta celular. A desgranulação das células frente aos
compostos de cálcio foi de, aproximadamente, 40%. Esta etapa foi fundamental para
podermos afirmar que o tratamento químico proposto e, conseqüentemente, o
produto obtido não interfere biologicamente nos mastócitos de rato utilizados nos
ensaios in vitro.
Figura 15: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato (experimento controle). (1): Células-controle não estimuladas; (2): Albumina 2S + soro anti-albumina 2S; (3): Ca(OH)2 4%; (4): Ca(OH)2 8%; (5): CaCO3 4%; (6): CaCO3 8%; (7) CaO 4%; (8): CaO 8% (n=3, média ± D.P.; * P<0,001 em comparação com o controle positivo, pelo one way ANOVA, teste de comparação múltipla de Tukey).
A desgranulação dos mastócitos ao serem incubados com as amostras de
albumina 2S e torta de mamona tratadas com os compostos de cálcio como descrito
no item 3.3, também foi avaliada. Para tanto, as células obtidas do lavado peritoneal
de rato foram submetidas a incubação com as amostras tratadas na presença de
soro anti-albumina 2S de mamona. A Figura 16 abaixo evidencia a atividade
alergênica das amostras de albumina 2S após os tratamentos com os compostos de
cálcio. Pode-se observar que todos os tratamentos, hidróxido de cálcio, carbonato
de cálcio ou óxido de cálcio, nas duas concentrações, promoveram a redução da
alergenicidade das amostras de albumina 2S. Esta redução, demonstrada pelos
ensaios de desgranulação de mastócitos de rato, mostrou-se significativa,
apresentando-se próxima aos valores observados no controle negativo.
1 2 3 4 5 6 7 80
10
20
30
40
50
60
70
Amostras
*
*
** *
*
Po
rcen
tag
em d
e d
esg
ran
ula
ção
(%
)
44
Figura 16: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato frente as amostras de albumina 2S tratadas, na presença do soro anti-albumina 2S. (Ct -) controle negativo: células não-estimuladas; (Ct +) controle positivo: células + albumina 2S sem tratamento; (A) Albumina 2S tratada com Ca(OH)2 a 4 ou 8%; (B) Albumina 2S tratada com CaCO3 a 4 ou 8%; (C) Albumina 2S tratada com CaO a 4 ou 8%; (n=3, média ± D.P.; * P<0,001 em comparação com o controle positivo, pelo one way ANOVA, teste de comparação múltipla de Tukey).
A figura 17 evidencia a atividade alergênica das amostras de torta de
mamona após os tratamentos com os compostos de cálcio. Pode-se observar que
todos os tratamentos, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio,
nas duas concentrações, promoveram a redução da alergenicidade das amostras
de torta de mamona, assim como observado nas amostras do alérgeno isolado
(dado mostrado anteriormente – Figura 16). Esta redução, demonstrada pelos
ensaios de desgranulação de mastócitos de rato, também se mostrou significativa,
apresentando-se próxima aos valores observados no controle negativo.
Ct - Ct + 4% 8%0
10
20
30
40
50
60
70
Ca(OH)2
(A)
Po
rcen
tag
em d
e d
esg
ran
ula
ção
(%
)
* *
Ct - Ct + 4% 8%0
10
20
30
40
50
60
70
CaCO3
(B)
Po
rcen
tag
em d
e d
esg
ran
ula
ção
(%
)
* *
Ct - Ct + 4% 8%0
10
20
30
40
50
60
70
CaO
(C)
Po
rcen
tag
em d
e d
esg
ran
ula
ção
(%
)
**
45
Figura 17: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato frente as amostras de torta de mamona tratadas, na presença do soro anti-albumina 2S. (Ct -) controle negativo: células não-estimuladas; (Ct +) controle positivo: células + albumina 2S sem tratamento; (T.N.) Torta Nativa: células + torta de mamona sem tratamento; (A) Torta de mamona tratada com Ca(OH)2 a 4 ou 8%; (B) Torta de mamona tratada com CaCO3 a 4 ou 8%; (C) Torta de mamona tratada com CaO a 4 ou 8%; (n=3, média ± D.P.; * P<0,001 em comparação com o controle positivo, pelo one way ANOVA, teste de comparação múltipla de Tukey).
4.1.3- Quantificação de histamina:
Para dosagem de histamina, empregamos inicialmente um processo de
cromatografia de troca catiônica, em que o material foi fixado em uma coluna Shim-
pack – amino – Na+ da Shimadzu, normalmente utilizada para a separação de
componentes de fluídos fisiológicos. O material ligado foi eluído por dois tampões
(Tampão citrato - ácido perclórico pH 3,2 e citrato - ácido bórico, pH 10,0) e
posteriormente por NaOH 0,2M. A histamina foi eluída com cerca de 5 minutos de
lavagem com este último eluente. Este processo durava cerca de 150 minutos e,
baseado nesta observação, aperfeiçoamos os processos cromatográficos, ajustando
a cromatografia para um método isocrático, de 10 minutos. Neste processo
cromatográfico, foi utilizado somente o hidróxido de sódio (NaOH 0,2 M), num fluxo
de 0,6 mL por minuto como eluente. Esta nova condição permitiu que os vários
Ct - Ct + T. N. 4% 8%0
10
20
30
40
50
60
70
Ca(OH)2
(A)
* *P
orc
enta
gem
de
des
gra
nu
laçã
o (
%)
Ct - Ct + T. N. 4% 8%0
10
20
30
40
50
60
70
CaCO3
(B)
**
Po
rcen
tag
em d
e d
esg
ran
ulç
ão (
%)
Ct - Ct + T. N. 4% 8%0
10
20
30
40
50
60
70
CaO
(C)P
orc
enta
gem
de
des
gra
nu
laçã
o (
%)
**
46
componentes do meio DMEM utilizado nos ensaios de desgranulação fossem
eluídos logo no início do processo, separando-se da histamina.
A padronização do método de dosagem de histamina mostrou-se linear para
concentrações entre 1pmol e 125 pmols de histamina. Estes experimentos de
padronização foram realizados em co-participação com FELIX, no nosso grupo de
pesquisa, no ano de 2007. A Figura 18A mostra a sobreposição dos cromatogramas
de histamina na concentração de 12,5 pmols com a histamina na concentração de
125 pmols preparados em 20 µL de DMEM. A Figura 18B mostra uma ampliação da
sobreposição destes cromatogramas. Podemos observar que há uma boa resolução
entre os componentes do DMEM e a histamina. A Figura 18C mostra a sobreposição
dos cromatogramas de histamina a 1 pmol com a histamina na concentração de 12,5
pmols. A sobreposição realizada na Figura 18C demonstra que há uma boa
resolução do método, mesmo em quantidades pequenas de histamina.
47
Figura 18: Padronização do método de dosagem de histamina. (A) Sobreposição do perfil cromatográfico da histamina 12,5 pmols com histamina 125 pmols. A linha azul delimita o DMEM; (B) Ampliação da sobreposição do perfil cromatográfico da histamina 12,5 pmols com histamina 125 pmols; (C) Sobreposição do perfil cromatográfico da histamina 1 pmol com histamina 12,5 pmols (FELIX, 2007).
C
48
Após a padronização do método, verificando sua sensibilidade, iniciamos os
procedimentos para avaliar o percentual de liberação de histamina das células
obtidas do lavado peritoneal de rato. Nesta etapa, foi necessário, inicialmente,
ajustarmos uma metodologia para romper os mastócitos a fim de liberar
completamente o conteúdo de histamina contido nos seus grânulos. Deste modo,
tempos gradativos de exposição ao ultrassom (10 a 60 segundos) foram
empregados, sendo observado que 30 segundos foi a condição mais adequada para
liberação total de histamina.
Como controle do processo de sonicação, uma solução contendo 125 pmol de
histamina padrão por mL de DMEM foi submetida ao processo de sonicação por 30
segundos. Uma alíquota de 10 µL desta solução, após a sonicação, foi submetida ao
processo cromatográfico e, foi observado que o processo da sonicação não foi
destrutivo para histamina neste período de tempo.
Após as devidas padronizações para a quantificação da histamina, os ensaios
de desgranulação utilizando mastócitos de rato foram conduzidos. As células foram
observadas por microscopia óptica e 20µL do sobrenadante foi fracionado por
cromatografia de troca catiônica para quantificação da histamina liberada. O volume
remanescente foi sonicado, por 30 segundos, e uma alíquota de 20µL foi,
novamente, submetida ao fracionamento cromatográfico para quantificação da
histamina total.
A Figura 19A mostra a sobreposição dos cromatogramas referente a
histamina liberada das células dos lavado de rato obtidos após a incubação dos
mastócitos com albumina 2S na ausência de soro total e quando, os mesmos, foram
sensibilizados na presença do soro total anti-albumina 2S e também, na presença do
alérgeno (albuminas 2S). No experimento conduzido com albumina 2S de mamona
em presença de IgE específica, podemos observar a liberação de histamina
correspondente a desgranulação de mastócitos.
A Figura 19B mostra a sobreposição dos cromatogramas obtidos para a
quantificação de histamina liberada no ensaio de desgranulação com os mastócitos
de rato para histamina total (suspensão de células após sonicação). Neste
experimento, as células foram ativadas com albumina 2S de mamona em presença
de IgE específica.
49
Figura 19: Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato. (A) Incubação das células com albumina 2S na presença de IgE específica (rosa) e na presença de albumina 2S sem o soro (preto). (B) Incubação das células com albumina 2S na presença de IgE específica antes (rosa) e, após a sonicação (histamina total) (preto) (FELIX, 2007).
A Figura 20 apresenta a sobreposição dos perfis cromatográficos das
amostras de albumina 2S de mamona nativa e após o tratamento com hidróxido de
cálcio a 4%. Podemos observar que este tratamento com o Ca(OH)2 foi eficiente ao
modificar os epitopos alergênicos presentes na amostra de albumina 2S e, deste
modo, reduzir a alergenicidade desta amostra. Nesta figura podemos verificar que o
nível de histamina liberada dos grânulos das células quando incubadas com
A
B
50
albumina 2S submetida ao tratamento com o hidróxido de cálcio foi menor quando
comparado ao de histamina liberada dos grânulos celulares após incubação com
albumina 2S nativa. A dosagem de histamina confirma os resultados provenientes
do ensaio de desgranulação dos mastócitos de rato.
Figura 20: Sobreposição dos perfis cromatográficos da histamina liberada das amostras de células incubadas com albumina 2S nativa e albumina 2S tratada com hidróxido de cálcio a 4%, após cromatografia de troca catiônica. Seta indica tempo de retenção da histamina.
Para a determinação do percentual de histamina liberada, associou-se os
valores quantificados pelo método cromatográfico, com o número de células
empregadas em cada ensaio, correlacionando esses valores com o total de
histamina liberada após o processo de sonicação (Tabela II). Podemos observar que
durante o processo de isolamento dos mastócitos ocorre cerca de 30% de
desgranulação, o que implica na detecção de 2% de histamina. Quando as células
são sensibilizadas com albuminas 2S na presença de IgE específica, a
desgranulação foi superior a 60% e o percentual de liberação de histamina é maior
que 50%. A histamina liberada dos grânulos dos mastócitos quando os mesmos
foram incubados com a albumina 2S tratada com hidróxido de cálcio a 4% na
presença de IgE específica encontrou-se, após detecção e quantificação, valores
próximos aos níveis observados no controle negativo. Este resultado ratifica os
dados obtidos nos ensaios de desgranulação, utilizando amostras de albumina 2S
Legenda:
__ Alb 2S tratada
__ Alb 2S nativa
Tempo de retenção (min)
51
tratada com hidróxido de cálcio a 4%, já que a desgranulação resulta na liberação de
mediadores, dentre eles a histamina (Figura 16A).
Tabela II: Porcentagem de desgranulação dos mastócitos e quantificação da histamina liberada de seus grânulos após incubação com o “pool” de albumina 2S nativa e, com a albumina 2S após o tratamento com hidróxido de cálcio a 4%.
Amostra Desgranulação dos
mastócitos (%)
Histamina
detectada
(pmol)
Histamina
Sonicada
(pmol)
Histamina
liberada (%)
Controle negativo 33 0,2 10,6 2
Albumina 2S nativa sem
soro
34 0,3 9,4 3
Albumina 2S nativa + soro
(controle positivo)
61 1,5 2,7 56
Albumina 2S tratada + soro 40 0,4 5,6 7
A Figura 21 apresenta a sobreposição dos perfis cromatográficos das
amostras de torta de mamona nativa e após o tratamento com hidróxido de cálcio a
4%. Podemos observar que este tratamento foi eficiente ao modificar os epitopos
alergênicos presentes na amostra de torta e, deste modo, reduzir a sua
alergenicidade. Nesta figura podemos verificar que o nível de histamina liberada dos
grânulos das células quando incubadas com torta de mamona submetida ao
tratamento com o hidróxido de cálcio foi significantemente menor quando comparado
ao de histamina liberada dos grânulos celulares após incubação com torta nativa. A
dosagem de histamina confirma os resultados provenientes do ensaio de
desgranulação dos mastócitos de rato.
52
Figura 21: Sobreposição dos perfis cromatográficos da histamina liberada das amostras de células incubadas com torta nativa e torta tratada com hidróxido de cálcio a 4%, após cromatografia de troca catiônica. A seta indica tempo de retenção da histamina.
Assim como realizado para os experimentos utilizando albumina 2S, os
ensaios para determinação do percentual de histamina liberada dos mastócitos
utilizando a incubação com a torta de mamona também foram submetidos a uma
associação entre os valores quantificados pelo método cromatográfico e o número
de células empregadas em cada ensaio, correlacionando esses valores com o total
de histamina liberada após o processo de sonicação (Tabela III). Quando as células
foram incubadas com concentrações elevadas da torta de mamona nativa ou tratada
(1 mg/mL), 100 vezes acima da concentração utilizada para o alérgeno isolado, não
foi possível observar de forma quantitativa a desgranulação dos mastócitos devido a
presença de resíduos da torta que mascaravam a contagem. No entanto, podemos
observar que o tratamento da torta com hidróxido de cálcio a 4% reduziu os níveis
de liberação de histamina em cerca de 20%, ratificando os resultados obtidos nos
ensaios de desgranulação utilizando amostras de torta de mamona tratada com
hidróxido de cálcio a 4% (Figura 17A).
Legenda __ Torta nativa
__ Torta tratada
Tempo de retenção (min)
53
Tabela III: Porcentagem de desgranulação dos mastócitos e quantificação da histamina liberada de seus grânulos após incubação com a torta de mamona nativa e, com a torta de mamona após o tratamento com hidróxido de cálcio a 4%. (*N.d.: não determinado em função dos resíduos da torta no meio reacional).
Amostra Desgranulação dos
mastócitos (%)
Histamina
detectada
(pmol)
Histamina
Sonicada
(pmol)
Histamina
liberada (%)
Controle negativo 33 0,2 10,6 2
Albumina 2S nativa sem
soro
33,9 0,3 9,4 3
Torta de mamona nativa +
soro (controle positivo)
N.d.* 14,3 16,3 87
Torta de mamona tratada +
soro
N.d.* 28,6 44,8 64
Os outros tratamentos propostos com hidróxido de cálcio a 8%, carbonato de
cálcio e óxido de cálcio a 4 e a 8%, para a desativação de epitopos alergênicos
presentes nas amostras de albumina 2S e de torta de mamona somente foram
avaliados biologicamente através de ensaios de desgranulação de mastócitos de
rato, como mostrado anteriormente nas Figuras 16 e 17.
4.1.4- Quantificação de liberação da enzima ββββ-hexosaminidase:
A enzima lisossomal β-hexosaminidase foi quantificada a partir das células
RBL-2H3, como descrito no item 3.4.3.1. A Figura 22 apresenta os resultados do
ensaio de desgranulação utilizando esta linhagem celular. Estes experimentos foram
conduzidos e realizados na Universidade de São Paulo - Campus de Ribeirão Preto
e, para tanto, as concentrações de albumina 2S (amostra: 10 µg/mL) e de soro
específico (soro total anti-albumina 2S: diluição 1:100), foram as mesmas utilizadas
nos ensaios de desgranulação com as células do lavado peritoneal de rato, como
descrito no item 3.4.2.
Neste experimento, o controle positivo, ou seja, as células quando estimuladas
(EST) na presença do antígeno TNP (2,4,6-trinitrofenol) e da molécula de IgE anti-
DNP (IgE anti-dinitrofenol), resulta num percentual total de liberação celular da
enzima β-hexosaminidase de aproximadamente 30%, Figura 22 (barra 2). Com
relação ao alérgeno de mamona, primeiramente, realizamos a comprovação de que
ele necessita de moléculas de IgE específica para ativar e desgranular os
mastócitos. Desta forma, foram utilizados dois tipos de incubação com
54
imunoglobulinas do tipo E, uma com IgE não-específica (IgE anti-DNP) e, outra com
a IgE específica (IgE anti-albumina 2S) na presença das albuminas 2S de mamona.
Como pode ser observado na figura 22 (barra 3), a incubação com a IgE inespecífica
não desencadeou a ativação e liberação da enzima comprovando, desta forma, que
a albumina 2S de mamona é dependente de moléculas de IgE específica. Outro tipo
de incubação realizada neste experimento foi somente a adição da amostra de
albumina 2S de mamona as células RBL-2H3 (barra 5), ensaio que não resultou na
liberação enzimática.
Quando a amostra de albumina 2S de mamona (Figura 22 - barra 3) foi testada
nas concentrações acima descritas e, na presença da molécula de IgE específica,
observou-se baixa ativação e desgranulação das células, acontecimento
quantificado pela liberação da enzima. Este evento pode ser explicado pela
necessidade do teste com a linhagem celular requerer maior concentração de soro
total e/ou de albumina 2S para ativar a desgranulação e, ensaios mais detalhados
são requeridos.
Figura 22: Determinação da atividade biológica de albumina 2S de mamona pelo ensaio de desgranulação com as células RBL-2H3. Barra 1: (NE) não estimulado, controle negativo; Barra 2: (EST) estimulado, controle positivo; Barra 3: Albumina 2S + IgE não específica; Barra 4: Albumina 2S + IgE específica; Barra 5: Albumina 2S. (n= 3, média± D.P.)
Os dados obtidos após a incubação das células RBL-2H3 com as amostras de
albumina 2S (barras 3, 4 e 5) mostraram-se, através da quantificação de liberação a
enzima β-hexosaminidase, não tão significativos quando em relação ao controle
positivo, células estimuladas (EST). Estes resultados podem ser explicados pela
necessidade de ajustes destes experimentos utilizando o alérgeno de mamona com
0
5
10
15
20
25
30
35
NE EST IgEantiDNP+A2S IgE espc+A2S A2S
% d
e lib
era
ção
de
b-h
exo
sam
inid
ase
55
esta linhagem celular, já que as concentrações utilizadas nestes ensaios foram as
mesmas utilizadas para os ensaios de desgranulação com as células do lavado
peritoneal de rato anteriormente descritas no item, 3.4.2. Outro fator a ser
considerado, é que estes ensaios foram conduzidos na cidade de Ribeirão Preto-SP
e, as amostras de albumina 2S e soro anti-albumina 2S foram transportadas da
UENF-RJ até o campus da USP daquela cidade. Durante este transporte, o soro
pode ter se desnaturado e, desta forma, interferido nos resultados dos experimentos
com as células RBL-2H3.
56
5- DISCUSSÃO
A crise mundial do petróleo e a adesão de alguns países ao protocolo de
Kyoto refletem a preocupação mundial com relação à falta de combustíveis e, com a
proteção do meio ambiente. A busca de alternativas para minimizar o uso de
combustíveis fósseis, como os derivados do petróleo, e a tentativa de reduzir a
emissão de gás carbônico na atmosfera, levou o mundo à pesquisa de combustíveis
renováveis (BARNWAL & SHARMA, 2005).
Estudos sobre o emprego de diversas fontes de biomassa na produção de
biodiesel têm sido intensificados no início deste novo milênio, tendo como proposta a
transformação de matéria-prima renovável em combustíveis alternativos aos
clássicos combustíveis derivados do petróleo, com baixo custo de produção e,
sobretudo de menor impacto ambiental (KHALIL, 2004).
Uma das propostas de desenvolvimento de combustíveis alternativos é a
síntese de biodiesel a partir de gorduras animais ou óleos extraídos de vegetais e,
como exemplo, pode-se citar o óleo de rícino, extraído da mamona. Sabe-se que o
elevado teor de óleo na semente de mamona, a precocidade de produção da
mamoneira e o rendimento de colheita por área plantada tornam a aplicação desta
oleaginosa altamente atrativa como matéria-prima no processo industrial de
produção de biodiesel (KHALIL, 2004). Além disto, o cultivar desta planta se ajusta
bem ao clima semi-árido da região nordeste do Brasil e torna seu plantio atrativo
para a fixação e desenvolvimento de famílias nesta região.
No ano de 2005, houve a aprovação da Lei n 11.097 que introduziu o biodiesel
na matriz energética nacional, tornando obrigatória a adição de 2% de biodiesel ao
diesel de petróleo a partir de janeiro de 2008 e de 5% a partir de 2013 (BELTRÃO &
LIMA, 2007; NASS et al., 2007). Devido a este crescente interesse nacional e,
mundial, na produção de biodiesel é de se esperar que o plantio desta oleaginosa
cresça de forma exponencial, aumentando enormemente o risco de sensibilização da
população exposta a substâncias alergênicas desta planta (FORNAZIERI JÚNIOR,
1986).
A alergenicidade não é tão grave quanto a toxidez, pois dificilmente causa
morte de animais ou seres humanos, porém a sua eliminação é bem mais difícil que
a inativação da ricina. A preocupação com a alergenicidade da torta de mamona
refere-se aos trabalhadores das indústrias de extração do óleo e os moradores dos
57
arredores das indústrias ou áreas de plantio, os quais estão expostos à poeira
levada pelo vento e ao pólen desta oleaginosa. Outro fator a ser analisado é o risco
de reações alérgicas dos trabalhadores de campo que utilizam a torta como adubo e
ficam submetidos à poeira.
Alguns processos industriais foram sugeridos para a desalergenização da
torta de mamona, no entanto estes processos são empíricos, pois foram propostos
sem o prévio conhecimento dos epitopos alergênicos.
Em 1971, Mottola e colaboradores avaliaram o processo de desalergenização
pelo uso de vapor em diversas pressões e tempos de exposição. Em 1972, Mottola e
colaboradores (citado por ICOA, 1989) apresentaram um método mais próximo da
viabilidade técnica, utilizando o tratamento da torta adicionada de óxido de cálcio a
4%, submetida a 120ºC com vapor durante 15 minutos, no qual se obteve relativa
redução da alergenicidade.
No ano de 1977, Bom demonstrou a possibilidade de degradar as proteínas
da torta de mamona utilizando diversas enzimas proteolíticas (papaína, pepsina,
pancreatinina, etc.), para serem adicionadas a torta.
Em 1985, a UNIDO (United Nations Industrial Development Organization) em
parceria com a “Texas A&M University” conduziu um grande projeto com o objetivo
de tornar viável um processo industrial conjugado para destoxicação e
desalergenização da torta de mamona, visando a economia e a viabilidade técnica
(HORTON E WILLIAMS, 1989). O presente projeto obteve sucesso e, em 1988, foi
apresentado um processo em escala piloto no qual se utilizou um extrusor para
aumentar a temperatura e a pressão e, promover um processo contínuo. Embora o
projeto tenha sido relatado como bem sucedido, por razões desconhecidas, as
indústrias de óleo de mamona ainda não realizam a destoxicação e
desalergenização da torta de mamona (SEVERINO, 2005).
Verifica-se que, ainda não existem processos industriais viáveis de
destoxicação da torta de mamona, porém em processos experimentais de pequena
escala, como na área acadêmica, a destoxicação é obtida por tratamento térmico,
como a autoclavagem (FREIRE et al., 2007). Em 2008, um processo foi proposto,
onde Godoy promovendo estudos experimentais das condições de cultivo do fungo
Penicillium simplicissimum para produção de lipases em rejeito de mamona, obteve,
indiretamante, após a fermentação em estado sólido ao qual o rejeito foi submetido,
um produto destoxicado, ou seja, sem a presença da ricina.
58
Com relação a desativação de alérgenos em escala experimental, em 2006, a
inativação do alérgeno de mamona (CB-1A) foi descrita por Kim, pela da utilização
de aquecimento e de tratamentos químicos (NaOH e NaOCl). Segundo o autor, o
alérgeno mostrou um decréscimo drástico em sua atividade antigênica,
desaparecimento de bandas na eletroforese, quando a temperatura (70ºC) foi
associada aos compostos químicos. Através de levantamentos bibliográficos,
observamos que poucas metodologias visando à desativação dos alérgenos
presentes na torta de mamona foram propostas, e nenhuma delas realmente atingiu
resultados satisfatórios que possibilitasse o emprego industrial.
Nesse sentido, no ano de 2006, tendo conhecimento dos trabalhos realizados
no nosso grupo de pesquisa por Felix, nos quais os epitopos alergênicos foram
caracterizados, Carrielo-Gama propôs metodologias para o tratamento químico das
albuminas 2S de mamona para que o alérgeno fosse modificado na estrutura da
proteína, ao nível dos seus ácidos glutâmicos, impedindo a ligação da proteína
modificada, às IgEs dos mastócitos. Desta forma, foi utilizado um reagente
específico contra esses aminoácidos, muito empregado para modificações de ácidos
carboxílicos, conhecido como Woodward´s Reagent (WRK). Este reagente possui
em sua estrutura um átomo de N carregado positivamente em um isozaxolium
adjacente a um grupo fenilsulfonato aromático. Carrielo-Gama obteve resultados
satisfatórios para a redução da alergenicidade das amostras tratadas com este
reagente e, comprovou a participação efetiva deste aminoácido na formação do
epitopo na molécula de albumina 2S.
Sabendo que este reagente é caro e inviável para uso em escala industrial,
novos tratamentos foram propostos e iniciados pelo nosso grupo de pesquisa. Neste
trabalho utilizamos reagentes economicamente mais viáveis, sendo eles, soluções
de hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio nas concentrações de
4 e de 8%, visando promover modificações químicas nos resíduos de ácidos
glutâmicos e, desta forma, reduzir e/ou impedir a capacidade destes epítopos de se
ligarem as moléculas de IgE.
Nestes tratamentos, o alérgeno purificado, ou presente na torta de mamona,
foi tratado quimicamente com os compostos de cálcio (hidróxido de cálcio, carbonato
de cálcio ou óxido de cálcio) e, posteriormente testado biologicamente, através de
ensaios de desgranulação de mastócitos de rato, dosagem de histamina e, também
pelo ensaio de desgranulação utilizando as células RBL-2H3. Vale à pena destacar
59
que uma metodologia para determinação do potencial alergênico, baseada em
ativação de mastócitos, quantificada por visualização através de microscopia óptica
e dosagem de histamina foi desenvolvida pelo nosso grupo de pesquisa.
Sabendo que o tratamento com hidróxido de cálcio já havia sido proposto por
Anandan em 2005 para desativação da proteína tóxica ricina, nossa meta era
comprovar a desalergenização das amostras, de albumina 2S e torta de mamona,
submetidas ao tratamento com os compostos de cálcio. Para a reação de
modificação do alérgeno (Figura 23), acreditamos que o íon cálcio (Ca++) presente
nos compostos químicos testados seja capaz de interagir eletrostaticamente com o
ácido glutâmico (epitopos anteriormente identificado) presente na molécula de
albumina 2S. Esta interação promove a ocupação dos radicais dos ácidos
carboxílicos e, desta forma, impede a ligação-cruzada entre o alérgeno e as
moléculas de IgE específicas pré-fixadas e, assim, impede a ativação e
desgranulação de mastócitos e basófilos.
Figura 23: Esquema da interação eletrostática entre o cálcio e as carboxilas dos ácidos glutâmicos (epitopo) presentes na estrutura da albumina 2S de mamona.
Os tratamentos utilizando compostos de cálcio propostos neste trabalho
foram eficazes para a modificação da proteína alergênica. Neste trabalho podemos
verificar que os tratamentos com esses compostos a 4 e a 8% promoveram a
redução da alergenicidade das amostras. Este fato foi observado utilizando os
ensaios de desgranulação de mastócitos de rato e, também por dosagem de
histamina destas células. Observou-se que as amostras do alérgeno isolado
(albuminas 2S) ou de torta de mamona, após os tratamentos, quando incubados
com mastócitos de rato, apresentaram redução na desgranulação destas células de
70% para valores observados no controle negativo, aproximadamente 30%. A
COO- COO- Ca+2
Interação eletrostática
Albumina 2S
60
quantificação de histamina liberada destas células comprovou a redução de ativação
celular pelas amostras de albumina 2S e torta de mamona tratadas, e consequente
liberação do conteúdo dos grânulos.
Outra metodologia iniciada neste trabalho foi a quantificação de ativação de
células RBL-2H3 através da dosagem da enzima lisossomal β-hexosaminidase.
Nesses ensaios, foram utilizadas as mesmas concentrações de alérgeno
anteriormente descrita para os ensaios de desgranulação com as células do lavado
peritoneal de rato anteriormente descritas no item, 3.4.2. Cabe salientar que, estes
ensaios foram conduzidos na cidade de Ribeirão Preto-SP e, as amostras de
albumina 2S e soro anti-albumina 2S foram transportadas da UENF-RJ até o campus
da USP daquela cidade. Os resultados utilizando esta linhagem celular foram
preliminares e não satisfatórios, porém, foram importantes para iniciar uma nova
metodologia de avaliação da atividade alergênica mediada por alérgenos de mamona
no nosso grupo de pesquisa.
Os dados apresentados neste trabalho assinalam para uma nova metodologia
a ser aplicada em escala industrial, por se basear em compostos baratos e, também,
por consistir numa metodologia já testada e confirmada experimentalmente neste
trabalho para modificar a proteína alergênica ao nível dos epitopos presentes na
molécula de albumina 2S de mamona. O produto tratado e modificado permite uma
manipulação mais segura por parte dos trabalhadores rurais que utilizam a torta
como adubo, bem como dos trabalhadores das usinas de processamento da
semente e, agrega maior valor e aplicabilidade a este outro artigo da produção do
biodiesel.
Uma expansão deste trabalho está baseada nos dados obtidos no ano de
2007 por Felix, que relatam a ocorrência de possíveis reações cruzadas entre
alérgenos alimentares e, também de alérgenos inalantes, com as albuminas 2S de
mamona. Com base nesses resultados, o tratamento com os compostos de cálcio
proposto para modificação da proteína alergênica de mamona poderia ser utilizado
também para modificar outras proteínas alergênicas que apresentaram a reação
cruzada descrita por Felix e, que também contenham o epitopo formado por
aminoácidos ácidos.
A proposta desse trabalho resume-se no desenvolvimento de uma tecnologia
capaz de modificar o alérgeno (albumina 2S) presente na torta de mamona, obtendo
desse modo um produto mais seguro para manipulação dos trabalhadores e com
61
possibilidade de maior aplicabilidade econômica, por exemplo, na alimentação
animal. Para complementar nossos estudos, o desenvolvimento de tratamentos
preventivos contra a deflagração e os sintomas da alergia devem ser desenvolvidos,
permitindo então uma maior segurança na manipulação da mesma e, agrega valores
a este produto. Os tratamentos utilizando os compostos de cálcio apresentaram
similaridades para modificar o alérgeno de mamona, mostrando-se eficazes. Desta
forma, novas pesquisas se tornam necessárias a fim de avaliar outros parâmetros
necessários, como a palatividade do produto obtido, os custos dos tratamentos, etc.,
para avaliar qual tratamento seria o mais vantajoso e promissor e, deste modo,
inserir o melhor em escala industrial.
62
6- CONCLUSÃO
• Os tratamentos com hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de
cálcio a 4 e a 8% promoveram uma redução na reatividade dos epitopos
alergênicos presentes na albumina 2S purificada ou presentes na torta de
mamona, como evidenciado pelos ensaios de atividade biológica de
desgranulação de mastócitos.
63
Referências Bibliográficas
AALBERSE, R.C. Structural biology of allergens. Journal of Allergy and Clinical Immunology. v.106 (nº 2), p. 228-238, 2000. ABBAS, A.K; LICHTMAN, A.H.; POBER, J.S. Imunologia Celular e Molecular. 4 ed. Revinter, p. 544, 2003. AGGIZIO, A.P.; CARVALHO, A.O.; RIBEIRO,S.F.F.;MACHADO,O.L.T.; AVES,E.W.; BLOCH JR, C.; OKOROKOV, L.A.; SAMARAO, S.S.; PRATES, M.V.; GOMES, V.M. A 2S albumin homologous protein from passion fruit seeds inhibits the fungal growth and acidification of the médium by Fusarium oxisporum. Archives of Biochemistry and Biophics. 46: 188-195, 2003. AHN, Y-J; CHEN, G. Q. Temporal and Spatial Expression of 2S Albumin in Castor (Ricinus communis L.) Journal Agricultural and Food Chemistry. v. 55, p. 10043–10049, 2007. ALEKSEEVA, L.; NEKRASOV, A.; MARCHENKO, A.; SHEVCHENKO, M.; BENEVOLENSKII, S.; SAPOZHNIKOV, A.; KURUP, V. P.; SVIRSHCHEVSKAYA, E. Cryptic B-cell epitope identification through informational analysis of protein sequences. Vaccine. v. 25, p. 2688–2697, 2007. ANADAN, S.; ANIL KUMAR, G. K.; GHOSH, J.; RAMACHANDRA, K. S.; Effect of different physical and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Animal Feed Science and Technology. v. 120, p. 159–168, 2005. AZEVEDO, D.M.P.; LIMA, E.F. O agronegócio da mamona no Brasil. 1ª edição. Editora Embrapa, 2001. BANDEIRA, D.S.; CARTAXO, W.V.; SEVERINO, L.S.; BELTRÃO, N.E.M. Resíduo industrial da mamona como fonte alternativa na alimentação animal. I congresso brasileiro de mamona. Campina Grande - PB, 2004. BARNWAL, B.K.; SHARMA, M.P. Prospects of biodiesel production from vegetable oils in Índia. Renewable & sustainable energy reviews. p. 363-378, 2005. BASCIANO, L.K., BERENSTEIN, E.H., KMAK, L., SIRAGANIAN, R.P. Monoclonal-antibodies that inhibit IgE binding. Journal of Biological Chemistry. v. 261, p. 1823- 1831, 1986.
64
BELTRÃO, N. E. M.; AZEVEDO, D. M. P. Fitologia. In: AZEVEDO, D. M. P.; BELTRÃO, N. E. M. O agronegócio da mamona no Brasil. 2º ed. Brasília, DF: EMBRAPA Informação Tecnológica, p. 504, 2007. BELTRÃO, N. E. M. & LIMA, R. L. S. Aplicação do óleo de mamona como fonte de energia: biodiesel. In: AZEVEDO, D. M. P.; BELTRÃO, N. E. M. O agronegócio da mamona no Brasil. 2º ed. Brasília, DF: EMBRAPA Informação Tecnológica, p. 504, 2007. BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Physiology of development and germination. New York: Plenum Press, 1994. BIST, A.; PANDIT, T.; BHATNAGAR, A.K.; SINGH, A.B. Variability in protein content of pollen of Castor bean (Ricinus communis) before and after exposure to the air pollutants SO2 and NO2. Grana. v. 43, p.94-100, 2004. BOYCE, J.A. Mast cells: beyond IgE. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 11: 25-32, 2003. BOM, J.H. Solubilização das proteínas da mamona por enzimas proteolíticas. 136p. Dissertação de Mestrado. UFRJ, Rio de Janeiro. 1977. BRADDING, P. Allergen immunotherapy, mast cell. Clinical and experimental Allergy. 29:1445-1448, 1999. BRANDT, N. N.; CHIKISHEV, A. Yu.; SOTNIKOV, A. I.; SAVOCHKINA, Yu. A.; AGAPOV, I. I.; TONEVITSKY, A. G. Ricin, ricin agglutinin, and the ricin binding subunit structural comparison by Raman spectroscopy. Journal of Molecular Structure. v. 735, p. 293-298, 2005. BREITENEDER, H. & MILLS, C., E.N. Plant food allergens – structural and functional aspects of allergenicity. Biotechnology Advances. 23: 395-399, 2005. BREITENEDER, H.; RADAUER, C. A classification of plant food allergens. Journal Allergy and Clinical Immunology. v. 113, p. 821-30, 2004. BRITO, M. F.; TOKARNIA, C. H. Intoxicação experimental pelas sementes trituradas de Ricinus communis (Euphorbiaceae) em coelhos. Pesquisa Veterinária Brasileira. 16: 1-7, 1996.
65
CARRIELO-GAMA, C. Desenvolvimento de uma tecnologia para desativar epítopos alergênicos de Ricinus communis (mamona). Monografia - Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro, Brasil, 2006. CARTAXO, W.V.; BELTRÃO, N.E. de M.; SILVA, O.R.R.F. da; SEVERINO, L.S.; SUASSUNA. N.D.; SOARES, J.J. Cultivo da mamona no semi-árido brasileiro. Campina Grande: EMBRAPA/CNPA, 20p. (EMBRAPA Algodão. Circular Técnica, 77), 2004. CARVALHO, L.O. de. Cultura da mamoneira. Campinas: CATI, 3p. (CATI. Comunicado técnico, 73), 1988. CHIERICE, G. O.; NETO, S. C. Aplicação industrial do óleo. In: AZEVEDO, D. M. P.; BELTRÃO, N. E. M. O agronegócio da mamona no Brasil. 2º ed. Brasília, DF: EMBRAPA Informação Tecnológica, 2007. 504p. COOK, D. L.; DAVID, J.; GRIFFITHS, G. D. Retrospective identification of ricin in animal tissues following administration by pulmonary and oral routes. Toxicology. 2006. DA SILVA, D.; MOTA, I. Imunologia Básica e aplicada. 5ª edição. Editora Guanabara Koogan S.A. p. 156-164, 2003. DIRECTORATE OF OILSEEDS RESEARCH. Diversifiel uses of Castor. In: INTERNATIONAL SEMINAR ON CASTOR SEED, CASTOR OIL AND ITS VALUE ADDED PRODUCTS. Proceedings... Ahmedabad: The Solvent Extractors Association of India, p.50-57, 2004. EL-AGAMY, E. I. The challenge of cow milk protein allergy. Small Ruminant Research. v. 68, p. 64–72, 2007. FELIX, S.P. Caracterização de epitopos ligantes de IgE em alérgenos de Ricinus communis e investigação de respostas cruzadas entre alérgenos. Monografia – Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro, Brasil, 2006. FELIX, S. P. Identificação de epitopos alergênicos de albumina 2S de Ricinus communis utilizando como modelos roedores e pacientes atópicos: reações cruzadas com alérgenos alimentares e inalantes e bloqueio através da ocupação dos sítios de reconhecimento. Tese (mestrado em Biociências e Biotecnologia) –
66
Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro Brasil, 2007. FELIX, S. P.; MAYERHOFFER, R. O.; DAMATTA, R. A.; VERÍCIMO, M. A.; NASCIMENTO, V. V.; MACHADO, O.L.T. Mapping IgE-binding epitopes of Ric c 1 and Ric c 3, allergens from Ricinus communis, by mast cell degranulation assay. Peptides. v. 2 9, p. 497 – 504, 2008. FERNANDES, K. V. Análise dos níveis de albuminas 2S e de ricina em sementes de diferentes cultivares e linhagens de mamona (Ricinus communis L.) Monografia - Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro, Brasil, 2008. FORNAZIERI JÚNIOR, A. Mamona: uma rica fonte de óleo e de divisas. São Paulo: Ícone, 71p, 1986. FREIRE, R.M.M. Ricinoquímica. In: AZEVEDO, D. M. P.; BELTRÃO, N. E. M. O agronegócio da mamona no Brasil. 2º ed. Brasília, DF: EMBRAPA Informação Tecnológica, 504p., 2007. FREITAS, J. Efeito da radiação ionizante sobre as proteínas da torta de mamona. 77p. Dissertação de Mestrado. UFRJ, Rio de Janeiro, 1974. GANDHI, V.M.; CHERIAN, K. M.; MULKY, M.J. Detoxification of cartor seed meal by interaction with sal seed meal. Journal of the American Oil Chemists Society. v. 71, n. 8, Ago. p. 827- 831, 1994. GARCÍA-GONZÁLEZ, J. J.; BARTOLOMÉ -ZAVALA, B.; DEL MAR TRIGO-PÉREZ, M.; BARCELÓ–MUÑOZ, J. M.; FERNÁNDEZ-MELÉNDEZ, S.; NEGRO-CARRASCO, M. A.; CARMONA-BUENO, M. J.; VEGA-CHICOTE, J. M.; MUÑOZ-ROMÁN, C.; PALACIOS-PELÁEZ, R.; CABEZUDO-ARTERO, B.; MARTÍNEZ-QUESADA, J. Pollinosis to Ricinus communis (castor bean): an aerobiological, clinical and immunochemical study. Clinical and Experimental Allergy. v. 29, p. 1265-1275,1999. GARDNER JR., H.K.; D’AQUIN, E.L.; KOULTUN, S.P.; McCOURTNEY, E.J.; VIX, H.L.E.; GASTROCK, E.A. Detoxification and deallergenization of Castor beans. Journal of the American Oil Chemists Society. v.37, p. 142- 148, 1960. GIERAS, A.; FOCKE-TEJKL, M.; BALL, T.; VERDINO, P.; HARTL, A.; THALHAMER, J.; VALENTA, R. Molecular determinants of allergen-induced effector cell degranulation. Journal Allergy Clinical Immunology. v. 119, 2007.
67
GODOY, M. G. Produção de lipase microbiana e detoxificação simultânea de rejeitos agroindustriais. Tese de mestrado - Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, 2008. HORTON, J.; WILLIAMS, M.A. A cooker-extruder for deallergenation of castor bean meal. Journal of the American Oil Chemists Society. v. 66, n. 2, p. 227- 231, 1989. ICOA. The processing of castor meal for detoxification and deallergenation. Ridgewood, 75p. (Technical Bulletin, 1), 1989. JANEWAY, C.A.; TRAVERS, P.; WALPORT, M.; SHLOMCHIK, M. Imunobiologia. O sistema imune na saúde e na doença. 5 ed. Artmed, 2002. JOLLIFFE, N. A.; BROWN, J. C.; NEUMANN, U.; VICRE´, M.; BACHI, A.; HAWES, C.; CERIOTTI, A.; ROBERTS, L. M.; FRIGERIO, L. Transport of ricin and 2S albumin precursors to the storage vacuoles of Ricinus communis endosperm involves the Golgi and VSR-like receptors. The Plant Journal. v. 39, p. 821–833, 2004. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J.. Histologia Básica. 10a. Edição. Editora Guanabara Koogan, 2004. KAMBAYASHI, T.; KORETZKY, G. A. Proximal signaling events in FcεRI-mediated mast cell activation. Journal Allergy Clinical Immunology. v. 119, n. 3, p. 544- 552, 2007. KHALIL, C.N. Processo de produção de biodiesel a partir de semente de mamona. I congresso brasileiro de mamona. Campina grande - PB, 2004. KIERZEMBAUM, A.L. Histologia e Biologia celular: uma introdução à patologia. Editora Elsevier, 2004. KIM, B. K. Inactivation of castor bean allergen CB-1A by heating and chemical treatment. Food Science and Biotechnology. v. 15, issue 3, p. 441-446, 2006. KIRSHENBAUM, A.S.; KESSEL, S.W.; GOFF, J.P.; METRALFE, D.D. Demonstration of the origin of human mast cells from CD34+ bone marrow progenitor cells. The Journal of Immunology. v. 146, issue 5, p. 1410-1415, 1991.
68
KLING, S.H.. Estudo da solubilidade das proteínas da mamona. 67p. Dissertação de Mestrado. UFRJ, Rio de Janeiro, 1974. KNOTHE, G. Historical perspectives on vegetable oil-based diesel fuels. Journal of the American Oil Chemists' Society. 2001. KONNUR, R.; SUBBARAO, E.C. Biogás form de oiled castor cake. In: INTERNATIONAL SEMINAR ON CASTOR SEED, CASTOR OIL AND ITS VALUE ADDED PRODUCTS. Proceedings... Ahmedabad: The Soplvent Extractors Association of India, p.31-35, 2004. LI, S.S.L.; LIN, T.T.S.; FORD, M.D.. Isolation and characterization of a low molecular weight seed protein from Ricinus communis. Biochimica et Biophysica, Acta. 492: 364-369. 1977. LICHTENSTEIN, L.M.. Allergy and the immune system. Scientific American. p. 85-93. 1993. LORD, J.M.; ROBERTS, L.M.; ROBERTUS, J.D. Ricin: structure, mode of action and some current applications. The FASEB Journal. 8: 201-208. 1994. MACHADO, O.L.T.; MARCONDES, J.A.; DE SOUZA-SILVA, F.; HANSEN, E.; RIBEIRO, P.D.; VERÍSSIMO, M.; KANASHIRO, M.; KIPNIS, T.L.; DA SILVA JR., J.G.; DOS SANTOS, M.F. AND COSTA E SILVA, M.C. Characterization of allergenic 2S albumin isoforms from Ricinus communis seeds. Allergologie. 26:45-51, 2003. MACHADO, O.L.T.; SILVA, J.G. An allergenic 2S storage protein from Ricinus communis seeds which is part of the albumin precursor predict by c-DNA data. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 25: 567-582, 1992. MAINTZ, L.; NOVAK, N. Histamine and histamine intolerance. The American Journal of Clinical Nutrition. v. 85, p. 1185–96, 2007. MAYERHOFFER, R.D.O. Peptídeos isolados de moléculas de MHC de classe II de macrófagos murinos pulsados com albumina 2S de sementes de Ricinus communis. Monografia - Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro Brasil, 2002. MAYERHOFFER, R.D.O. Identificação de peptídeos alergênicos de Albumina 2S de Ricinus communis (Mamona). Tese (mestrado em Biociências e Biotecnologia) – Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro Brasil, 2004.
69
MENEGHETTIA, S. M. P.; MENEGHETTIA, M. R.; WOLF C, R.; SILVA, E. C.; GILVAN E.S. LIMA, G. E. S.; COIMBRA, M. A.; SOLETTI, J. I.; CARVALHO, S. H. V. Ethanolysis of Castor and Cottonseed Oil: A Systematic Study Using Classical Catalysts. Journal of the American Oil Chemists’ Society. v. 83, nº 9, p. 819-822, 2006. MORENO, A. N.; JAMUR, M. C.; OLIVER, C.; ROQUE-BARREIRA, M. C. Mast cell degranulation induced by lectins: Effect on neutrophil recruitment. International Archives of Allergy and Immunology. v. 132, p. 221- 230, 2003. MOSHKIN, V. A.; Castor. New Delhi: Oxonian Press, 315p., 1986. MOTTOLA, A.C.; MACKEY, B.; HERING, V.. Castor meal antigen deactivation – pilot plant steam process. Journal of the American Oil Chemistry Societ. v. 48, set. P. 510-513, 1971. NA, D. H.; CHO, C. K.; YOUN, Y. S.; CHOI, Y.; LEE, K. R.; YOO, S. D.; LEE, K. C. Capillary electrophoresis to characterize ricin and its subunits with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Toxicon. 43, 329–335, 2004. NASS, L. L.; PEREIRA, P. A. A.; ELLIS, D. Biofuels in Brazil: An Overview. Crop Science. v. 47, p. 2228- 2237, 2007. OGUNNIYI, D. S. Castor oil: A vital industrial raw material. Bioresource Technology. v. 97, p. 1086–1091, 2006. OLIVEIRA, N. D. Desenvolvimento de uma tecnologia para desativar epitopos alergênicos de Ricinus communis (mamona). Monografia - Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro, Brasil, 2006. OLSNES, S.; KOZLOV, J. Ricin. Toxicon. v. 39, n.11, p. 1723-1728, 2001. OLSNES, S.; FERNANDEZ-PUEMTES, C.; CARRASCO, L.; VAZQUEZ, D. Ribosome inactivation by the toxic lectins abrin and ricin. Kinetics of the enzimic activity of the toxin A-chain. Europe Journal of Biochemistry. v. 60, p. 281-288, 1975.
70
OLSNES, S. The history of ricin, abrin and related toxins. Toxicon. v. 44, p. 361 – 370, 2004. PALOSUO, T.; PANZANI, R.C.; SINGH, A.B.; ARIANO, R.; ALENIUS, H.; TURJANMAA, K. Allergen cross-reactivity between proteins of the latex from Hevea brasiliensis, seeds and pollen of Ricinus communis, and pollen of Mercurialis annua, members of the Euphorbiaceae family. Allergy and Asthma Proceedings. v. 23, p. 141-147, 2002. PARENTE, E.J.S.: Minicurso do Congresso brasileiro de mamona. Campina Grande. CD-ROM. 2004. PARUI, S.; MONDAL, A.K.; MANDAL, S. Identification and partial characterization of the allergenic proteins of Ricinus communis L. pollen - a new approach. Grana. v. 38, p. 311-315, 1999. PERRONE, J.C.;IACHAN, A.; DOMONT, G.B.; DISITZER, L.V. ; CASTRO, V.R.O.; ROITMAN, R.; GOMES, S.M. Contribuição ao estudo da torta de mamona. Rio de Janeiro: Departamento de Imprensa Nacional, 1966. 51 p. PIERINI, L.; HOLOWKA, D.; BAIRD, B. FcεRI-mediated Association of 6-1xm Beads with RBL-2H3 Mast Cells Results in Exclusion of Signaling Proteins from the Forming Phagosome and Abrogation of Normal Downstream Signaling. The Journal of Cell Biology. v. 134, p. 1427-1439, 1996. REGENTE, M. & LA CANAL, L. Are storage 2S albumins also defensive proteins? Physiological and Molecular Plant Pathology. 59: 275-276, 2001. RIVERA, J.; GILFILLAN, A. M.. Molecular regulation of mast cell activation. Journal Allergy Clinical Immunology. v.117, n.6, p. 1214-1225, 2006. ROITT, I.; BROSTOFF, J.; MALE, D..Imunologia. 6ª edição. Editora Manole, Cap. 21- 24 p. 324-378, 2003. SANTOS, R. F.; KOURI, J.; BARROS, M. A. L.; MARQUES, F. M.; FIRMINO, P. T.; REQUIÃO, L. E. G. Aspectos econômicos do agronegócio da mamona. In: AZEVEDO, D. M. P.; BELTRÃO, N. E. M. O agronegócio da mamona no Brasil. 2º ed. Brasília, DF: EMBRAPA Informação Tecnológica, 504p. 2007. SAVY FILHO, A.; BANZATO, N.V.; BARBOZA, M. Z.; MIGUEL, A.M.R.O.; DAVI, L.O. de C.; RIBEIRO, F.M. Mamona. In: COORDENADORIA DE ASSISTÊNCIA
71
TÉCNICA INTEGRAL. Oleaginosas no estado de São Paulo: análise e diagnóstico. Campinas, 39p. (CATI. Documento Técnico, 107). 1999. SCHEIN, C. H.; IVANCIUC, O.; BRAUN, W. Common Physical-Chemical Properties Correlate with Similar Structure of the ige Epitopes of Peanut Allergens. Journal Agricultural Food Chemistry., v. 53, p. 8752-8759, 2005. SEVERINO, L.S. O que sabemos sobre a torta da mamona. Campina Grande, PB: Embrapa Algodão, 2005 31p. (Embrapa Algodão. Documentos, 134). http://www.prodemb.cnptia.embrapa.br SHARIEF, F.S.; Li, S.S. Aminoacid sequence of small and large subunits of seed storage protein from Ricinus communis. Journal of Biological Chemistry. 257:14753-14759, 1982. SHEWRY, P.R.; NAPIER, J.A.; TATHAM, A.S. Seed storage proteins: structures and biosynthesis. Plant Cell. 7:945-56, 1995. SICHERER, S. H.; LEUNG, D. Y. M. Advances in allergic skin disease, anaphylaxis, and hypersensitivity reactions to foods, drugs, and insects in 2008. Journal Allergy Clinical Imunology. v. 123, nº 2, p. 319-327, 2009. SILVA JR.; J.G., M.A.T.; MACHADO, O.L.T., IZUMI, C.; PANDOVAN, J.C.; CHAIT, B.T., MIRZA, U.A. &GREENE, L.J. Aminoacid sequence of New 2S Albumin from Ricinus communis Whith is Part of 29-Kda Precursor Protein. Archives of Biochemistry and Biophysics. v. 336, p. 10-18, 1996. SINGH, A; PANZANI, R. C.; SINGH, A.B. Specific IgE to castor bean (Ricinus communis) pollen in the sera of clinically sensitive patients to seeds. Journal of investigational allergology & clinical immunology. v. 7, p. 169-174, 1997. SINGH, A.B.; MALIK, P.; GANGAL, S.V.; BABU, C.R. Intraspecific Variations In Pollen Extracts Of Ricinus-Communis (Castor Bean) Prepared From Different Source Materials. Grana. v. 31, p.229-235, 1992. SINGH, A.B.; KUMAR, P. Aeroallergens in clinical practice of allergy in India. An overview. Annals of Agricultural And Environmental Medicine. v. 10, p. 131-136, 2003. SINGH, B.P.; VERMA, J.; SRIDHARA, S.; RAI, D.; MAKHIJA, N.; GAUR, S.N.; GANGAL, S.V. Immunobiochemical characterization of Putranjiva roxburghii pollen
72
extract and cross-reactivity with Ricinus communis. International Archives of Allergy and Immunology. v. 114, p.251-257, 1997. SPIES, J.R., COULSON, E.J.. The chemistry of allergens VIII. Isolation and properties of an active protein-polysaccharidic fration, CB-1A, from castor bean. Journal of American Chemical Society. v. 65, p. 1720- 1725. 1943. THORPE, S.C.; KEMEDY, D.M.; PANZANI, R.C.; MC GULR, B.; LORD, M. Allergy to castor bean II - Identification of the major allergens in castor bean seeds. Journal of Allergy and Clinical Immunology. v. 82, p. 67-72, 1988. VALLVERDU, A.; GARCIAORTEGA, P.; MARTINEZ, J.; MARTINEZ, A.; ESTEBAN, M.I.; DEMOLINA, M.; FERNANDEZTAVORA, L.; FERNANDEZ, J.; BARTOLOME, B.; PALACIOS, R. Mercurialis annua: Characterization of main allergens and cross-reactivity with other species. International Archives of Allergy and Immunology. v. 112, p. 356-364, 1997. VIEIRA, M.R. Desgranulação de mastócitos por isoformas de albumina 2S de sementes de R. communis. Monografia - Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro Brasil, 2002. VIEIRA, R.M.; LIMA, E.F.; BATISTA, F.A.S. Diagnóstico e perspectivas da mamona no Brasil. In: REUNIÃO TEMÁTICA DE MATÉRIAS-PRIMAS OLEAGINOSAS NO BRASIL: DIAGNÓSTICO, PERSPECTIVAS E PRIORIDADES DE PESQUISA, 1997, Campina Grande. Anais... Campina Grande: EMBRAPA-CNPA, p.139-150. 1998. WOLFF, N.; YANNAI, S.; KARIN, N.; LEVY, Y.; REIFEN, R.; DALAL, I.; COGAN, U. Identification and characterization of linear B-cell epitopes of β-globulin, a major allergen of sesame seeds. Journal Allergy Clinical Imunology. v. 114, nº 5, p. 1151-1158, 2004. WOO, B.H.; LEE, J.T.; LEE, K.C. Purification of Sepharose-unbinding ricin from Castor Beans (Ricinus communis) by hydroxyapatite chromatography. Protein Expression and Purification. 13: 150-154, 1998 YOULE, R.J.; HUANG, A.H.. Evidence that the castor bean allergens are the albumin storage proteins in the proteins bodies of castor bean. Plant Phisiology. 61: 1040-1042. 1978.