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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Cristiane de Sá Ferreira Facio
DESCRIÇÃO DO PERFIL IMUNOFENOTÍPICO DOS
TUMORES SÓLIDOS PEDIÁTRICOS POR
CITOMETRIA DE FLUXO
RIO DE JANEIRO
2012
Cristiane de Sá Ferreira Facio
DESCRIÇÃO DO PERFIL IMUNOFENOTÍPICO DOS
TUMORES SÓLIDOS PEDIÁTRICOS POR
CITOMETRIA DE FLUXO
Orientadores: Profª Elaine Sobral da Costa,
Prof Marcelo G.P. Land
Dra Sima Esther Ferman
Rio de Janeiro
2012
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Clínica
Médica da Universidade Federal do Rio de
Janeiro como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de mestre
em Clínica Médica.
DESCRIÇÃO DO PERFIL IMUNOFENOTÍPICO DOS TUMORES
SÓLIDOS PEDIÁTRICOS POR CITOMETRIA DE FLUXO
Cristiane de Sá Ferreira Facio
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO PROGRAMA DE
PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS
NECESSÁRIOS PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CLÍNICA
MÉDICA
Examinada por: ______________________________________
Dra. Beatriz de Camargo, Ph.D.
______________________________________
Prof. Stevens Kastrup Rehen, Ph.D.
______________________________________
Prof José Carlos Morais, Ph.D.
______________________________________
Profª Fernanda Pinto Mariz,Ph.D.
______________________________________
Profª Clemax Couto Sant’Anna, Ph.D.
Rio de Janeiro,RJ-Brasil
2012
Ferreira-Facio, Cristiane de Sá
Descrição do perfil imunofenotípico dos tumores sólidos pediátricos por citometria de fluxo/ Cristiane de Sá Ferreira Facio. -- Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2012.
xii, 89f. : il. ; 29,7cm.
Orientadores: Elaine Sobral da Costa e Marcelo Gerardin Poirot Land, co-orientadora: Sima Esther Ferman Dissertação (mestrado) – UFRJ / Faculdade de Medicina / Pós-Graduação em Clínica Médica, 2012. Referências bibliográficas: f. 79-87
1. tumores sólidos pediátricos.2.citometria de fluxo.3.diagnóstico Tese. I. Costa, Elaine Sobral. II. Land, Marcelo Gerardin Poirot. III.Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em clínica médica. IV. Título.
Cristiane de Sá Ferreira Facio
DESCRIÇÃO DO PERFIL IMUNOFENOTÍPICO
DOS TUMORES SÓLIDOS PEDIÁTRICOS POR
CITOMETRIA DE FLUXO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Clínica Médica da Universidade Federal do
Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de mestre em Clínica Médica.
Aprovada em
___________________________________
Elaine Sobral da Costa, UFRJ
___________________________________
Marcelo G.P. Land, UFRJ
___________________________________
Sima Esther Ferman, INCA
_____________________________________
Beatriz de Camargo, Ph.D
______________________________________
Stevens K. Rehen, Ph.D
____________________________________
José Carlos Morais, Ph.D
Dedico este trabalho a todos aqueles pequenos
seres humanos capazes de sorrir mesmo diante de
tanta adversidade. É por eles e para eles todo este
trabalho.
Agradecimentos:
Sem dúvida muitos contribuíram para a realização deste trabalho. Senão de maneira
formal na elaboração bastante laboriosa de todo o seu conteúdo, de maneira informal me
acompanhando nos bons e maus momentos destes 2 anos de intenso trabalho.
Primeiro gostaria de agradecer a minha família, sem eles eu não existo. Meu marido
Marcelo, melhor amigo, amante, amor da minha vida. Meus filhos, Maria Luísa, minha
pequena gênia e revisora principal; e, João Marcelo, meu artista que contribuiu com lindos
desenhos em todos os meus resumos. Minha mãe, sempre incansável, nunca disse não para
ficar com as crianças, mesmo que para isso abrisse mão de tudo. Meu pai, exemplo maior da
minha vida. E por último, mas não em menor importância, minha querida irmã e babá eleita
das crianças, que me socorria para tudo, conversas, olhar as crianças, ir no laboratório
comigo...
Em segundo lugar, mas com todas as honras do primeiro, vem minha querida
“mestra”, gênia, guru, orientadora, amiga, companheira de trabalho e grande exemplo
profissional. Foi ela a responsável pelo meu grande interesse em citometria de fluxo e é nela
que me espelho para continuar este trabalho. Juntamente à ela gostaria de agradecer ao
“GRANDE MESTRE” pessoa de grande sabedoria, paciência e igual humildade capaz de
transmitir seu conhecimento de maneira tão clara que transforma pobres mortais como eu em
aficionados pela arte da citometria – Dr Alberto Orfao muito obrigada!
Não poderia deixar de agradecer a todos os responsáveis pela minha formação
profissional e pessoal: Alice (chefe e madrinha), Ana Paula (confidente e geminiana como
eu), Marcelo (meu professor), Maria Célia (minha eterna amiga), Dra Sima (meu grande
exemplo na oncologia), Dr Fernando Werneck (grande sábio e mentor). Perdoem-me se
esqueci alguém. Mais agradeço a todos sem exceção. Obrigada Dra Luciane não só pelos
grandes conhecimentos iniciais na minha formação pediátrica, sempre atenciosa e paciente,
como também por me introduzir aos programas do SPSS tão complexos e úteis.
Como este trabalho envolve duas grandes áreas da medicina: cirurgia pediátrica e
patologia, não teria sobrevivido sem a ajuda e ensinamento deles. Dr Paulo Faria- muito
obrigada por acreditar no trabalho mesmo antes de ele existir e por ter passado maus
momentos por ele e mesmo assim continuar acreditando. Foi realmente fundamental o período
que passei na patologia do INCA para compreender a organização do pensamento
diagnóstico. Dr Samuel, Dra Raquel, Dra Daniela, e todos os residentes do serviço de
Oncologia do HSE e IPPMG por me ajudarem com as amostras, me ligarem e nunca
desistirem. Em especial, Dr Samuel por ter me ensinado a grande diferença entre um cirurgião
e um “retirador de bolotas”. Dra Cristiane Milito e Dr José Carlos por me ajudarem nesta fase
final do trabalho, mas tão importante para credibilidade e melhor entendimento dele.
Professora Fernanda Mariz que, com olhos e mente realmente privilegiada deu um toque final
extremamente importante ao trabalho.
Por fim, agradeço a todos os meus novos amigos do laboratório em especial Marcela,
Ellen e “meu filho” Vitor (um novo gênio) que me ajudaram até quando eu estava
terrivelmente chata porque alguma coisa não tinha dado certo. Obrigada aos alunos de PINC e
a todos os meus grandes amigos de trabalho; Patrícia (“minha amiga para sempre”), Dra
Elisabeth Frossard (me tornou uma hemoterapeuta- por incrível que pareça), Ana Maria
(minha chefe), Dona Iara (técnica fabulosa),dona Lourdes (luz do serviço), entre tantos
outros.
Obrigado Deus e Nossa Senhora de Fátima
DESCRIÇÃO DO PERFIL IMUNOFENOTÍPICO E ANÁLISE DE DNA
DOS TUMORES SÓLIDOS PEDIÁTRICOS POR CITOMETRIA DE FLUXO
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica
Médica/UFRJ como parte dos pré-requisitos necessários para obtenção do grau
de mestre em Clínica Médica.
Cristiane de Sá Ferreira Facio
Orientadores: Elaine Sobral da Costa
Marcelo Gerardin Poirrot Land
Sima Esther Ferman
Programa: Clínica Médica
Resumo da Dissertação
Os tumores sólidos pediátricos são, em sua maioria, de difícil caracterização
morfológica e seu diagnóstico diferencial depende da caracterização de expressão protéica por
imunohistoquímica e/ou molecular. Neste trabalho propomos a citometria de fluxo como uma
nova técnica para verificação de expressão protéica nos tumores sólidos pediátricos. Em
primeiro lugar, estabelecemos a metodologia para dissociação das amostras. A seguir,
estabelecemos uma estratégia em etapas para diferenciar massas reacionais de neoplásicas
(etapa 1), neoplasias hematológicas de não-hematológicas (etapa 2) e caracterização
imunofenotípica das células tumorais (etapa 3). Foram estudadas 52 amostras de 41 pacientes.
Todas as amostras reacionais ou normais (17/17) foram identificadas corretamente por
citometria de fluxo. Dentre as 35 amostras malignas apenas quatro foram consideradas
erroneamente reacionais, devido a intensa infiltração por células inflamatórias. Dentre os 35
tumores malignos foi possível estabelecer sua origem hematopoiética ou não com 100% de
acerto. Por fim, foram caracterizados imunofenotipicamente neuroblastomas,
rabdomiossarcomas, tumores neuroectodér-micos primitivos, tumores de Wilms, linfomas
não-Hodgkin, Linfomas de Hodgkin, carcinoma de nasofaringe, carcinoma de adrenal,
disgerminoma e hemangiopericitoma. Concluímos que este estudo abre portas para a
utilização da citometria de fluxo como técnica rápida e precisa na complementação do exame
histopatológico de rotina contribuindo para o diagnóstico precoce dos tumores sólidos
pediátricos
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4
2.1 Tumores sólidos pediátricos 4
2.1.1 Câncer Pediátrico: Epidemiologia 4
2.1.2 Patobiologia e relação com a embriogênese 6
2.1.3 Comportamento Clínico dos tumores sólidos pediátricos 13
2.1.4 Breve Histórico sobre Neuroblastoma 13
2.1.4.1 Epidemiologia e origem do Neuroblastoma 13
2.1.4.2 Genética do neuroblastoma 14
2.1.4.3 Comportamento Clínico do Neuroblastoma 14
2.1.4.4 Diagnóstico e estadiamento do Neuroblastoma 14
2.1.4.5 Tratamento do neuroblastoma 16
2.1.5 Breve Histórico sobre Rabdomiossarcoma 17
2.1.5.1 Epidemiologia e origem do Rabdomiossarcoma 17
2.1.5.2 Genética do Rabdomiossarcoma 18
2.1.5.3 Comportamento Clínico do Rabdomiossarcoma 18
2.1.5.4 Diagnóstico e estadiamento do Rabdomiossarcoma 18
2.1.5.5 Tratamento do Rabdomiossarcoma 20
2.1.6 Breve Histórico sobre Tumores da Família Ewing 20
2.1.6.1 Epidemiologia e origem dos Tumores da Família Ewing 20
2.1.6.2 Comportamento Clínico dos Tumores da Família Ewing 21
2.1.6.3 Diagnóstico e estadiamento dos Tumores da Família Ewing 21
2.1.7 Breve Histórico sobre Tumor de Wilms 22
2.1.7.1 Epidemiologia e origem do Tumor de Wilms 22
2.1.7.2 Genética do Tumor de Wilms 23
2.1.7.3 Comportamento Clínico do Tumor de Wilms 24
2.1.7.4 Diagnóstico e estadiamento do Tumor de Wilms 24
2.1.7 Breve Histórico sobre Linfoma 26
2.1.7.1 Epidemiologia dos Linfomas 26
2.1.7.2 Origem dos Linfomas 27
2.1.7.3 Genética dos Linfomas 30
2.1.7.4 Comportamento Clínico dos Linfomas Pediátricos 30
2.2 Citometria de Fluxo 31
2.2.1 Histórico da utilização da citometria de fluxo 31
2.2.2 A citometria de fluxo no diagnóstico das neoplasias hematológicas 32
2.2.3 Estudo dos tumores sólidos pediátricos por citometria de fluxo 39
2.2.3.1 Estudos de Citometria publicados em Neuroblastoma 39
2.2.3.2 Estudos de Citometria Publicados em Rabdomiossarcoma 40
2.2.3.3 Estudos de Citometria Publicados nos Tumores da Família Ewing 41
2.2.3.4 Estudos de Citometria Publicados em Wilms 41
2.2.3.5 Estudos de Citometria Publicados em Linfoma 42
3 OBJETIVOS 44
3.1 Geral 44
3.2 Específicos 44
4 METODOLOGIA DO ESTUDO 45
4.1 Desenho do Estudo 45
4.2 População estudada 45
4.2.1 Critérios de Inclusão 46
4.2.2 Critérios de Exclusão 47
4.3 Processamento da amostra 47
4.3.1 Pré-preparo das amostras de massas sólidas 47
4.3.2 Pré-preparo das amostras de medula óssea (MO), sangue periférico (SP) ou líquidos
corporais (LC) 47
4.3.3 Marcação celular 48
4.4 Aquisição e análise dos dados gerados por citometria 50
4.5. Preparo dos dados para realização de fusão e cálculo dos dados obtidos por citometria
de fluxo 51
4.6. Análise do Componente Principal (PCA) dos tumores pediátricos de pequenas células
redondas e azuis mais comuns 53
4.7 Análises Histopatológicas e Imunohistoquímicas 54
4.8 Outros Métodos Estatísticos 54
5 RESULTADOS 55
5.1 Dados Descritivos da População e amostras estudadas 55
5.2 Comparação entre as técnicas: Histopatológico e Imunohistoquímica X Citometria de
Fluxo 55
5.2.1 Identificação de amostras reacionais X malignas 56
5.2.2 Identificação de amostras malignas hematológicas X malignas não-hematológicas 59
5.2.3 Características Imunofenotípicas dos tumores sólidos pediátricos 60
5.2.3.1 Resultados encontrados em neuroblastoma 60
5.2.3.2 Resultados encontrados em Rabdomiossarcoma 63
5.2.3.4 Resultados encontrados em Tumor Neuroectodérmico Primitivo 64
5.2.3.5 Resultados encontrados em Tumor de Wilms 65
5.2.3.6 Resultados encontrados nos Linfomas 66
5.2.3.7 Resultados encontrados nos tumores sólidos pediátricos menos freqüentes 68
5.3 Análise do Componente Principal 70
6 DISCUSSÃO 72
6.1 Aplicação da citometria de fluxo no estudo dos tumores sólidos pediátricos 72
6.2 Viabilidade celular em amostras de tumor sólido submetidas à dissociação 73
6.3 Heterogeneidade da amostra e implicação para correta classificação dos tumores por
citometria de fluxo 73
6.4 Contribuição da citometria de fluxo no rastreamento de neoplasias malignas 74
6.5 Contribuição da citometria de fluxo na distinção entre neoplasias hematológicas e não-
hematológicas 75
6.6 Contribuição da citometria de fluxo para a caracterização dos tumores sólido não-
hematopoiéticos 76
7 CONCLUSÃO 78
REFERÊNCIAS 79
ANEXO I 88
LISTA DE ABREVIATURAS:
AAIR- taxa de incidência ajustada pela idade
AC- anticorpos monoclonais
AIDS- Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
APC-“ allophycocyanin”
APC-H7- “allophycocyanin- Hilite7”
CD- “cluster of differentiation”
CFM- citometria de fluxo multiparamétrica
c-kit- receptor tirosina-kinase de membrana tipo 3
CG- Clinical Group System “Intergroup Rhabdomyosarcoma Study
COG- “Children’s Oncology Group”
cyNSE- enolase neuroespecífica intracitoplasmática
EBV- virus Epstein-Baar
EGIL- Grupo Europeu de Classificação Imunológica das Leucemias
Epcam- molécula epitelial de adesão celular
EUROFLOW- Europeu de Citometria de fluxo
FAB- “French-American-British”
FACS- “Fluorescence-activated cell sorting”
FDC- células dendríticas foliculares
FISH- “fluorescence in situ hybridization”
FITC- “fluorescein isothiocyanate”
FN- falso negative
FP- falso positivo
FSC- “forward scatter”
GD2- disialogangliosideo
GEIL- Grupo Europeu de Estudos Imunológicos das Leucemias
HE- hematoxilina-eosina
HNK-“ human natural killer-1”
INPC - nternational Neuroblastoma pathology Classification”
INRG -“International Neuroblastoma Risk Group”
INSS- Sistema Internacional de Estadiamento do Neuroblastoma
IRS- “Intergroup Rhabdomyosarcoma Study “
LB- linfoma de Burkitt
LC- líquidos corporais
LCA- antígeno comum leucocitário
LDGCB- linfoma difuso de grandes células B
LH- Linfoma de Hodgkin
LNH- Linfoma não-Hodgkin
MFI- intensidade média de fluorescência
MKI- índice de mitose-cariorrexis
MPO- ieloperoxidase
MO- medula óssea
NCAM- molécula de adesão neural
NGFR- receptor de fator de crescimento neural
NK-“natural-killer”
NSE- esterase não-específica
NWTS- “National Wilms’ tumor Study Group”
OMS- Organização Mundial de Saúde
PaB- “pacific blue”
PaO-“pacific orange”
PBS- “phosphate buffered saline”
PCA- análise do componente princiapl
PCR- reação de polimerase em cadeia
PE-“ phycoerythrin”
PEcy7- “phycoerythrin-cyanin die 7”
PerCPcy5.5-“ peridinin chlorophyll protein-cyanin die 5.5”
PNET- tumor neuroectodérmico primitivo
PSA- ácido periódico de Schiff
RCBP- registro de câncer de base populacional
RMS- rabdomiossarcoma
RNM- Ressonância Nuclear magnética
SLE- sobrevida livre de eventos
SG- sobrevida global
SIOP- “International Society of Pediatric Oncology”
SP- sangue periférico
SNC- Sistema Nervoso Central
SSC- “side scatter”
TA- temperatura ambiente
TC- tomografia computadorizada
TFH- células T “helper” foliculares
TNM- “Tumor-nodes-metastasis”
VN- verdadeiro negativo
VP- verdadeiro positivo
VPN- valor preditivo negativo
VPP- valor preditivo positivo
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1. Taxas de Mortalidade por câncer no Brasil 6
Figura 2. Modelo de miogênese do músculo esquelético 17
Figura 3. Representação esquemática do envolvimento da via da ß- catenina no Tumor de
Wilms 23
Figura 4. Distribuição dos casos de linfoma no Brasil segundo Gaulco et AL 26
Figura 5. Representação diagramática da diferenciação da célula B e sua relação com as
neoplasias de células B 28
Figura 6. Representação diagramática da diferenciação de células T e as neoplasias
correspondentes aos diferentes estágios de maturação 29
Figura 7. Estratégia de análise e separação por classificação de padrão dos três diferentes
grupos de leucemias agudas com a utilização do programa de análise de dados Infinicity 37
Figura 8. Esquema do pré-preparo das amostras analisadas 48
Figura 9. Seleção das células neoplásicas viáveis em amostra de neuroblastoma 51
Figura 10. Fusão dos dados relativos a expressão da proteína nuMYOD1 dos pacientes com
neuroblastoma, rabdomiossarcoma e PNET 52
Figura 11. Análise do Componente Principal de Neuroblastoma e PNET 53
Figura 12. Morfologia celular de duas amostras analisadas 55
Figura 13. Análise fenotípica por citometria de fluxo de linfoma não-Hodgkin X amostra
reacional 58
Figura14. Morfologia (aumento de 40x e 100x) e análise fenotípica por citometria de fluxo
de Neuroblastoma 61
Figura15. Análise fenotípica por citometria de fluxo de Rabdomiossarcoma 63
Figura16. Análise de urina por citometria de fluxo em dois pacientes com rabdomiossarcoma
pélvico 64
Figura 17. Morfologia (aumento de 40x e 100x) e análise fenotípica por citometria de fluxo
de Tumor Neuroectodérmico Primitivo 65
Figura 18. Análise fenotípica por citometria de fluxo de Tumor de Wilms 66
Figura 19. Morfologia (aumento de 40x e 100x) de linfoma Linfoblástico B e análise
fenotípica por citometria de fluxo de Linfoma Linfoblástico B e Linfoma T associado
ao EBV 67
Figura 20. Análise fenotípica por citometria de fluxo de tumores raros pediátricos 69
Figura 21. Fusão dos dados das 35 amostras neoplásicas estudadas quanto à expressão das
proteínas de maior poder discriminativo e análise do componente principal dos três principais
grupos de tumores estudados 71
LISTA DE TABELAS:
Tabela 1.Taxas de Incidência dos diferentes tipos de câncer pediátrico em 14 RCBP no Brasil
de acordo com grupos da Classificação internacional de câncer pediátrico 5
Tabela 2. Descrição detalhada da expressão de proteínas úteis no diagnóstico dos
tumores sólidos pediátricos e testados em nosso estudo 8
Tabela 3. Sinais e Sintomas do câncer pediátrico presentes também em doenças comuns da
infância 13
Tabela 4. Avaliação prognóstica segundo INPC (Sistema Shimada) 15
Tabela 5. Estadiamento do neuroblastoma segundo INSS 16
Tabela 6. Sistema CG de estratificação do Rabdomiossarcoma 19
Tabela 7. Sistema TNM de estratificação do Rabdomiossarcoma 20
Tabela 8. Sobrevida Global do Sarcoma de Ewing distribuída nos diferentes grupos de
risco 22
Tabela 9. Principais diferenças no Estadiamento do Tumor de Wilms 25
Tabela 10. Classificação FAB de Leucemia Linfoblástica Aguda 33
Tabela 11. Classificação Imunofenotípica segundo Grupo Europeu para Classificação
Imunológica das Leucemias (EGIL) proposto em 1995 para leucemias linfoblásticas agudas
de precursores B 34
Tabela 12. Classificação Imunofenotípica segundo Grupo Europeu para Classificação
Imunológica das Leucemias (EGIL) proposto em 1995 para leucemias linfoblásticas agudas
de precursores T 34
Tabela 13. Classificação Imunológicas das Leucemias Bifenotípicas segundo sistema de
pontos desenvolvido pelo Grupo EGIL em parceria com o grupo Britânico (Royal Marsden
Hospital, Londres) 35
Tabela 14. Classificação Imunológica das leucemias Mielóides segundo GEIL em 2003 35
Tabela 15. Diagnóstico Histológico dos Casos Estudados 46
Tabela 16. Painel de anticorpos monoclonais utilizados de acordo com a seqüência de
investigação e a origem celular do tumor 49
Tabela 17. Análise Comparativa entre diagnóstico patológico dos tumores não-
hematopoiéticos por citometria de fluxo e técnica diagnóstica padrão ouro 56
Tabela 18. Infiltração Inflamatória Intra-tumoral 59
Tabela 19. Expressão das diferentes proteínas estudadas nos tumores sólidos pediátricos 60
1
1 INTRODUÇÃO
O câncer pediátrico, apesar de raro, acomete cerca de 200 mil crianças menores de 14
anos em todo o mundo. 1 No Brasil, a taxa mediana de incidência em 14 Registros de Câncer
de Base Populacional (RCBP) é de 154,3 por milhão de crianças e adolescentes com idade até
19 anos.2 Embora, muitos avanços no campo do diagnóstico e tratamento tenham melhorado a
sobrevida deste grupo de pacientes, o câncer pediátrico permanece como a principal causa de
morte por doença nos países desenvolvidos e em alguns em desenvolvimento.3
No Brasil, o
câncer pediátrico já representa a primeira causa de morte por doença em todas as regiões para
faixa etária de 5 a 18 anos.4
Cerca de 30% dos tumores sólidos pediátricos são tumores disontogenéticos, cuja
morfologia se assemelha ou recapitula os tecidos embrionários de origem. Estes tumores,
inicialmente descritos no começo do século 19, evoluíam de maneira fatal, sendo utilizado
como tratamento apenas cirurgia e/ou radioterapia, em alguns casos.5
No diagnóstico
histopatológico, a maioria destes tumores pertence ao grupo de “tumores de células pequenas
redondas e azuis”, caracterizados por células indiferenciadas, pequenas e redondas,
usualmente de difícil diagnóstico morfológico. Este grupo de tumores inclui, mais
comumente: linfomas, neuroblastomas, rabdomiossarcomas, Sarcoma de Ewing/PNET (tumor
neuroectodérmico primitivo), tumor de Wilms e tumor desmoplásico de pequenas células
redondas e azuis. Algumas outras neoplasias da infância podem ser consideradas como
diagnóstico diferencial, dependendo da apresentação clínica. São elas: osteossarcoma de
células pequenas, condrossarcoma mesenquimal, retinoblastoma e hepatoblastoma.6
Em meados do século 20, com o advento da quimioterapia e o início dos grupos
cooperativos para tratamento destas patologias, a sobrevida melhorou sobremaneira. Estes
protocolos, agora multimodais, requeriam do patologista maior precisão diagnóstica, visto
que estes pacientes eram tratados com específicas combinações de cirurgia, quimioterapia e
radioterapia, direcionadas para seu subtipo histológico. 7
Neste contexto, entra a evolução das técnicas diagnósticas, desde a microscopia
óptica, útil para classificação morfológica, até técnicas mais específicas, que, atualmente,
estudam a expressão de genes e proteínas dos diversos subgrupos tumorais.5,7
O diagnóstico e classificação corretos deste grupo de doenças são o primeiro e mais
importante passo para um bom resultado terapêutico.7
Existe uma direta associação entre
diagnóstico rápido e preciso, e sucesso terapêutico -taxas de sobrevida global e livre de
doença, assim como, melhoria na qualidade de vida - o que demanda do patologista,
2
especialmente nos casos de tumores embrionários pediátricos, a utilização de um conjunto de
técnicas diagnósticas, além de uma grande expertise.8
A citometria de fluxo evoluiu, nas últimas três décadas, de uma nova e promissora
técnica, para uma ferramenta indispensável no diagnóstico e seguimento das neoplasias
hematológicas. 9
Embora, a citometria de fluxo seja amplamente utilizada na rotina diagnóstica em
hematologia, o estudo dos tumores sólidos permanece no âmbito da pesquisa. 10
Um dos
maiores limitantes à implementação da citometria de fluxo como técnica diagnóstica em
tumores sólidos se deve à necessidade de amostras frescas em suspensão. 10,11
A dissociação
celular de diferentes tipos tumorais foi campo de extensas pesquisas que serviram de base
para a posterior análise de antígenos celulares específicos. 12-14
Na avaliação diagnóstica rotineira, a citometria de fluxo apresenta grande utilidade,
uma vez que permite uma análise quantitativa da expressão antigênica de uma única célula
tumoral por vez. Com a citometria de fluxo, é possível a análise e armazenamento de
informação de milhões de células em poucas horas, o que poderia cooperar para um
diagnóstico rápido e um estudo detalhado em amostras heterogêneas e paucicelulares. 11, 15,16
No diagnóstico de tumores sólidos pediátricos, o uso clínico da citometria de fluxo se
restringe à análise de DNA, que é considerada de grande impacto prognóstico em alguns
subtipos tumorais. 17,18
A utilização, previamente estabelecida, de tecidos fixados ou
congelados para análise de DNA por citometria de fluxo favorece a aplicação da citometria de
fluxo para tumores sólidos em estudos de DNA. 19,20
Em poucos estudos (3), a
imunofenotipagem de células tumorais por citometria de fluxo foi comparada com técnicas
como FISH e PCR para detecção de infiltração da medula óssea, seja no estadiamento ou no
seguimento destes pacientes. 21, 22,23
Na última década, foram publicados alguns estudos para a identificação de
marcadores de linhagem específicos para os tumores sólidos na infância através da citometria
de fluxo. 24-27
Em 2001 identificou-se que células tumorais não-hematopoéticas expressavam
CD56 (molécula de adesão neural-NCAM) na ausência de CD45 (antígeno comum
leucocitário-LCA) por citometria de fluxo. 24
A seguir, em 2003, o mesmo grupo descreveu a
expressão de citoqueratina e molécula epitelial de adesão celular (Epcam), de miogenina e de
CD99 (MIC2), respectivamente, nos tumores de origem epitelial, muscular e
neuroectodérmica. 26
Dentre os tumores pediátricos, o neuroblastoma apresentou o maior
número de proteínas estudadas por citometria de fluxo, uma vez que este tumor infiltra
freqüentemente a medula óssea, e faz parte do diagnóstico diferencial de leucemias
3
linfoblásticas agudas na infância, situação em que a citometria de fluxo é utilizada
rotineiramente. Por exemplo, o fenótipo CD56+ /CD45
–/ CD9
+/CD81
+ já foi amplamente
descrito para este tumor. 27-30
Em tumores sólidos, não existem protocolos bem estabelecidos e sistematizados para
o diagnóstico destes na infância por citometria de fluxo multiparamétrica (CFM). Este projeto
propôs a realização sistemática de estudos imunofenotípicos em todos os tumores sólidos
diagnosticados no Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG)/UFRJ e
Hospital dos Servidores do Estado (HSE), em um período de dois anos, utilizando um amplo
painel de anticorpos monoclonais por citometria de fluxo, para identificar marcadores úteis
no diagnóstico diferencial neste grupo de tumores. Além dos anticorpos monoclonais
fabricados para citometria de fluxo, foram testados também anticorpos monoclonais
fabricados para uso na técnica de imuno-histoquímica e nunca antes utilizados para citometria
de fluxo. O padrão-ouro para estabelecer o diagnóstico foi o exame histopatológico
convencional, associado à técnica de imuno-histoquímica.
A revisão bibliográfica deste trabalho é apresentada no próximo capítulo do trabalho.
A primeira parte do capítulo apresenta o contexto do câncer pediátrico no Brasil e no mundo,
biologia tumoral, suas características clínicas e estudo histopatológico. A seguir, apresenta-se
um histórico do uso da citometria de fluxo, sua evolução nas patologias de origem
hematológica, sua utilização na análise de DNA e ciclo celular e, por fim, sua aplicação em
tumores sólidos. Por último, apresentamos um resumo dos estudos publicados até o momento
onde se utilizou a citometria de fluxo como ferramenta no diagnóstico ou estratificação dos
tumores sólidos pediátricos.
Os capítulos seguintes (3,4,5) descrevem os objetivos, a metodologia do estudo,
resultados obtidos e discussão. No último capítulo, são apresentadas a conclusão e as
sugestões futuras para prosseguimento da investigação no campo da citometria de fluxo em
tumores sólidos da infância.
4
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Tumores Sólidos Pediátricos
2.1.1 Epidemiologia:
A incidência anual estimada de câncer pediátrico, em todo o mundo, excede 200 mil
diagnósticos em crianças abaixo de 15 anos. Dentre estes diagnósticos, 80% estão localizados
em países de baixa renda.1,7
No Brasil, a partir de 1980, o Instituto Nacional do Câncer estabeleceu, em cidades
brasileiras distintas, 20 registros de câncer de base populacional (RCBP) e, em julho de 2009
publicou a primeira análise descritiva da incidência de câncer pediátrico no Brasil com base
nos dados de 14 RCBP, desde 1991.2 Com isto, obtiveram os seguintes resultados:
- Mediana da taxa de incidência nos 14 RCBP: 154.3/ 106 de crianças menores de 20 anos.
- Idade com maior taxa de incidência: entre 1-4 anos
- Subtipos de câncer mais comuns: leucemia (18-41%), linfoma (13-24%) e tumor de sistema
nervoso central (7-17%).
5
Células Germin – Células germinativas; AAIR- taxa de incidência ajustada pela idade
REGIÃO LEUCEMIA
AAIR
LINFOMA
AAIR
SNC
AAIR
NEUROBL
AAIR
RETINO
AAIR
RENAL
AAIR
FÍGADO
AAIR
OSSO
AAIR
PARTES
MOLES
AAIR
CÉLULAS
GERMIN
AAIR
CARCINOMAS
AAIR
OUTROS
AAIR
TOTAL
deCASOS/
AAIR
SUL
Curitiba 64.22 26.59 25.98 10.98 2.73 5.21 0.57 9.44 11.80 16.63 16.33 3.66 538/194.13
Porto Alegre 48.01 28.91 32.45 9.16 5.86 13.25 2.15 9.79 15.75 10.14 14.09 7.50 436/197.07
SUDESTE
Campinas 35.51 17.09 20.62 4.41 5.90 7.44 1.17 6.48 16.00 3.76 10.99 1.04 208/130.41
Jaú 53.77 39.01 21.00 0.00 6.95 0.00 0.00 0.00 8.52 11.49 16.47 0.00 29/157.22
São Paulo 47.50 30.58 29.41 7.72 7.04 9.19 1.31 18.20 12.92 8.79 17.83 13.09 3667/203.60
NORDESTE
Aracaju 26.84 19.60 21.81 5.43 5.43 10.95 1.50 9.37 10.89 7.03 16.57 2.05 123/137.46
Fortaleza 37.91 18.97 13.40 1.86 2.76 5.75 0.24 9.96 6.69 4.02 15.21 14.73 587/131.49
João pessoa 34.63 22.53 15.74 2.74 3.34 9.59 0.00 12.41 8.82 2.80 19.02 6.91 162/138.53
Natal 47.45 29.67 9.60 4.29 9.82 4.02 0.00 6.89 3.32 4.90 19.52 9.17 167/148.66
Salvador 21.36 13.57 10.92 3.82 5.11 8.22 2.42 5.90 7.12 3.58 7.27 2.92 417/92.20
Recife 48.53 24.13 22.85 8.67 3.87 10.42 1.58 8.25 9.39 4.60 10.08 16.71 436/169.08
NORTE
Manaus 67.36 24.56 18.43 1.80 4.53 4.90 1.57 10.12 4.27 3.84 7.48 9.39 397/158.26
CENTRO
Dist Federal 29.03 22.69 22.91 4.67 2.40 8.64 0.79 9.62 6.63 7.39 16.53 20.08 620/151.38
Goiânia 67.51 34.21 31.98 9.34 6.78 15.32 2.77 15.98 15.41 7.80 18.21 5.68 435/230.98
NºdeCASOS 2044 1291 1106 250 207 352 58 669 514 375 837 519 8222
Tabela 1. Taxas de Incidência dos diferentes tipos de câncer pediátrico em 14 RCBP no Brasil de acordo com grupos da Classificação internacional de câncer pediátrico
( Camargo B, 2009)
6
Apesar de raro, quando comparado ao câncer em adultos, o câncer pediátrico é a
segunda causa de morte na faixa etária de 5 a 19 anos, perdendo apenas para causas externas
(DATA SUS,2005).4,31
No Brasil, aproximadamente 44 meninos e 36 meninas por milhão de
crianças e adolescentes menores de 19 anos morrem de câncer a cada ano.31
Nos países
Europeus, a introdução de procedimentos diagnósticos, melhoria nas estratégias de
tratamento e na qualidade de vida destes pacientes com câncer aumentaram a sobrevida para
taxas entre 78-83% de acordo com o EUROCARE (2000-2002).32
No Brasil, a grande maioria
do país, ainda possui difícil acesso a centros especializados de tratamento do câncer, o que
mantém nossa taxa de sobrevida muito aquém do esperado. 4 Na figura 1, observamos que a
taxa de sobrevida manteve-se praticamente inalterada por todo o período, variando entre 40-
60% no ano de 2005 entre as diferentes regiões do país.
Figura 1.Taxas de Mortalidade por câncer no Brasil
FIGURA 1. Taxas de mortalidade por câncer, ajustada por idade, por 106 de crianças e
adolescentes no Brasil e Regiões de 1979 a 2005.( Camargo B, INCA, 2008)
2.1.2 Patobiologia e Relação com a Embriogênese
Durante o desenvolvimento tecidual, uma célula pode sofrer renovação celular,
progressão no ciclo celular, diferenciação, senescência ou morte celular programada.
Mecanismos genéticos e microambientais de sinalização célula-célula e célula-meio
extracelular regulam a entrada em cada uma destas condições. Acredita-se que a
7
tumorigênese seja um processo de múltiplos passos: iniciação (alteração molecular),
promoção (interação com o microambiente), progressão (capacidade de se adaptar e
influenciar o microambiente para crescimento tumoral).7
O câncer pediátrico, em sua maioria, origina-se de tecidos embrionários identificados
ao microscópio como tecidos semelhantes aos presentes no embrião ou no feto. Com o
advento de novas estratégias, foi possível a demonstração do envolvimento de múltiplas vias
embrionárias no desenvolvimento do câncer. A relação entre organogênese e tumorigênese no
câncer pediátrico se reflete na incidência idade-específica, nos períodos de máximo
crescimento tecidual do tecido relacionado normal e com a grande incidência de tumores
pediátricos em pacientes com síndromes herdadas de mutações em genes envolvidos no
desenvolvimento normal.7,33
Assim como demonstrado no genótipo, a expressão de proteínas nestas células
neoplásicas pode ser correlacionada com o encontrado em células embrionárias do tecido
normal correspondente. Várias proteínas envolvidas com desenvolvimento embrionário estão
expressas nos tumores sólidos pediátricos: LCA (CD45), c-Kit (CD117), Thy1 (CD90),
NCAM (CD56), NGFR (CD271), HNK (CD57), MYOD1, Miogenina.34-39
Na tabela 2 há
descrição detalhada da expressão de proteínas relacionadas ao desenvolvimento embrionário,
assim como de diferentes proteínas importantes para caracterização de linhagem tumoral.
8
Tabela 2. Descrição detalhada da expressão de proteínas úteis no diagnóstico dos
tumores sólidos pediátricos e testados em nosso estudo
CD nº
Antígeno/sinônimo Gene
localização
Função Utilidade diagnóstica
MARCADORES
HEMATOPOIÉTICOS
CD45 LCA/Antígeno Comum
leucocitário
1q31-q32 Conhecidos como moléculas
sinalizadoras que regulam
uma série de funções
celulares:crescimento celular,
diferenciação, ciclo mitótico e
transformação oncogênica
Específico de células
hematopoiéticas
MPO/mieloperoxidase 17q23.1 Proteína do Heme sintetizada
durante a diferenciação
mielóide produz ácido
hipohalous essencial na
atividade antimicrobicida dos
neutrófilos
Especificamente
expresso nas células
mielóides
CD79a IGA;MB-/ alfa-
imunoglobulina
19q13.2 Proteína do complexo
antigênico de células B
necessária para expressão e
função do receptor do
antígeno de células B
Especificamente
expresso em células B
CD3 T3;OKT3/T3 antígeno
associado com receptor
TCR
11q23 Ativação de células T
associada ao TCR
Especificamente
expresso em células T
CD4 CD4mut;OKT4/T4
antígeno
12pter-p12 Interage com o complexo de
histocompatibilidade (MHC)
de classe II;
Expresso em linfócitos
T,B; macrófagos e
granulócitos
CD7 GP40; TP41; Tp40;
LEU-9
17q25.2-
q25.3
Essencial na interação de
células T e entre células T e B
durante a ontogenia
linfocitária
Especificamente
expresso em linfócitos
T
CD8 MAL;p32;Leu2/T8
antígeno
2p12 Reconhece antígenos
apresentados pelas células
apresentadoras de antígenos
no contexto MHC de classe I
Especificamente
expresso em células T
9
CD19 B4;CIVC3/ antigeno
celular pan-B
16p11.2 Receptor de baixa afinidade;
diminui o limiar para
estimulação receptor
dependente ; atua na ativação
de células B
Especificamente
expresso em células B
CD20 B1; S7; Bp35;CVID5;
MS4A2; LEU-16/
membrane-spanning 4-
domains, subfamily A,
member1
11q12 Participa no desenvolvimento
e diferenciação celular B em
células plasmáticas
Especificamente
expresso em linfócitos
B
MARCADORES NEURAIS
CD56 NCAM/Molécula de
adesão celular 1
11q23.1 Envolvido na interação celular
célula-célula e célula –matrix
durante o desenvolvimento e
diferenciação
Linfócitos NK; Sistema
Nervoso Central
(SNC);células
neuroectodermais e
uma variedade de
tumores (Sarcoma de
Ewing; neuroblastoma;
tumores
neuroendócrinos)
CD57 Leu7; NK1; CD57;
HNK1; B3GAT1/ beta-
1,3-glucuronyltransferase
1
11q25 Parece ter um papel na
interação celular célula-célula
e célula - substrato
Alguns linfócitos T e
B; subpopulação de
células NK; células da
crista neural; uma
variedade de tumores
(neuroblastoma;
Sarcoma de Ewing;
rabdomiossarcoma)
CD99 MIC2; HBA71; MIC2X Xp22.32;
Yp11.3
Envolvido na migração
leucocitária, adesão de célula
T, gangliosídeo GM1e
transporte de proteína
transmembrana e morte dos
linfócitos T, onco-supressor
em osteossarcoma e Sarcoma
de Ewing possivelmente
contribui com a oncogenêse
prevenindo a diferenciação
neural
Linfóctios T, células
endoteliais; Linfoma
Linfoblástico,sarcoma
de Ewing e
rabdomiossarcoma
10
GD2/disialoganglioside 2 Possivelmente tem papel
importante na ligação celular
tumoral e com sua matrix
extracelular
Neuroblastomas;
tumores de origem
neuroectodermal ou
epitelial;melanomas;al
guns osteosarcomas e
sarcomas de partes
moles
CD271 NGFR/ receptor do fator
de crescimento neural;
p75NTR; TNFRSF16;
p75(NTR)
17q21-q22 Pode aumentar ou diminuir a
atividade do receptor Trk
mediada por
neurotrofina;cascata de
sinalização autônoma que
resulta na indução de apoptose
ou promove a sobrevida
Células tronco
mesenquimais;tumores
neuroectodermais ;
alguns neuroblastomas;
melanoma
MARCADORES
MIOGÊNICOS
MYOD1;PUM;
MYF3/diferenciação
miogênica 1
11p15.4 Regula a diferenciação celular
muscular induzindo parada no
ciclo celular um pré-requisito
para iniciação miogênica
Especificamente
expresso nos
precursores de músculo
estriado esquelético;
rabdomiossarcoma
Miogenina;MYF4;
bHLHc3/fator miogênico
4
1q31-q41 Essencial para o
desenvolvimento do músculo
esquelético funcional
Especificamente
expresso no músculo
estriado esquelético;
rabdomiosarcoma
Desmin 2q35 Papel crítico na manutenção
estrutural e integridade
mecânica do aparato contrátil
no tecido muscular
Proteína muscular
específica; tumor
desmoplásico;
sarcomas;
rabdomiossarcoma
MARCADORES
EPITELIAIS
Epcam; ESA; KSA;
M4S1; MK-1; /molécula
de adesão celular
epitelial
2p21 Atua como molécula de
adesão celular e como parceiro
da E-caderina, promove
integridade epitelial e
morfogênese epitelial;em
câncer está associado a
progressão tumoral, migração
e invasão
Maioria das células
epiteliais normais e
carcinomas
11
MARCADORES
PRECURSORES
CD34 MY10;B1.3C5 1q32 Células hematopoiéticas
CD34 tem papel importante
na modulação da adesão;
células endoteliais CD34 tem
papel no extravasamento de
leucócitos por “afrouxar as
ligações célula –célula”
Células endoteliais de
vasos pequenos;
células hematopoiéticas
progenitoras; tumores
de origem epitelial;
alguns tecidos fetais e
adultos do SNC;alguns
tumores mesenquimais;
leucemias agudas
CD90 Thy-1 antígeno de
superfície celular
11q23.3 Ativação de célula
T;crescimento de neurite ;
sinalização para
apoptose;adesão e migração
celular de melanócitos e
leucócitos; supressão tumoral;
importante regular de
interação célula –célula e
célula-matrix
Células T, timócitos,
neurônios, células
endoteliais e
fibroblastos, células
tronco mesenquimais;
alguns carcinomas;
neuroblastoma;
PNET;rabdomiossarco
ma; linfoma;melanoma
CD117 c-kit; PBT; SCFR; C-Kit 4q11-q12 Participa da sobrevivência
celular; diferenciação e
proliferação
Tumor gastrointestinal
estromal, mastocitose,
leucemia mielóide
aguda; melanoma;
PNET;
neuroblastoma;tumor
de células germinativas
MARCADORES DE
LINHAGEM NÃO-
RESTRITOS
CD9 MIC3; MRP-1; BTCC-1;
DRAP-27; TSPAN29
12p13.3 Função em qualquer processo
celular incluindo
diferenciação, adesão,
transdução de sinal; a
expressão de gene tem papel
importante na supressão de
metástase e motilidade celular
Leucemia linfoblástica
Aguda (LLA);
variedade de tumores:
epitelial;
neuroectodermal;
osteossarcoma;
rabdomiossarcoma
CD10 CALLA;NEP;MME/
metalo-endopeptidase de
3q25.1-
q25.2
Quebra peptídeos no sítio
amino dos resíduos
Variedade de tecidos
normais; precursores
12
membrana hidrofóbicos e inativa muitos
hormônios peptídeos
glucagon, encefalina,
substância P, neurotensina,
ocitocina e bradicinina.
de células renais;
células tumorais
germinativas; tumor de
mama; leucemia
linfoblástica aguda
CD81 S5.7; CVID6; TAPA1;
TSPAN28
11p15.5 Papel na regulação do
desenvolvimento celular,
ativação, crescimento e
motilidade
LLA; variedade de
tumores:
neuroblastoma;
melanoma;
rabdomiossarcoma;
glioma osteossarcoma;
linfoma
CD58 LFA3; LFA-3;
FLJ23181; FLJ43722
1p13 Ligante da proteína CD2 dos
linfócitos T e funciona na
adesão e ativação de linfócitos
T
LLA; linfoma;
carcinoma
vimentina 10pter-
10q23
Parte do citoesqueleto; emerge
como um organizador de um
número de proteínas
críticasenvolvidas na ligação,
migração e sinalização celular
Controle de qualidade;
reage com a maioria
das células
mesenquimais
CD38 T10;OKT10 4p15 Funciona na adesão celular,
transdução da sinalização via
cálcio
Expresso em diferentes
tipos celulares
incluindo timócitos,
células T ativadas e
células B com
diferenciação terminal
(plasmócitos)
13
2.1.3. Apresentação Clínica dos tumores sólidos pediátricos:
O câncer pediátrico, além de raro, tem comportamento inicial bastante semelhante a
diversos processos patológicos comuns na infância. Sendo assim, o diagnóstico inicial desta
doença é muitas vezes retardado até estágios disseminados da doença, onde seus sinais e
sintomas são mais claramente relacionados. 40
Na tabela 3, há uma pequena relação de sinais
e sintomas que podem ser comuns a doenças benignas e malignas da infância.
Tabela 3. Sinais e Sintomas do câncer pediátrico presentes também em doenças comuns
da infância (Rodrigues, 2003)
SINAIS E SINTOMAS DOENÇAS FREQUENTES CÂNCER
Mal-estar, febre e adenomegalias Mononucleose, viroses Leucemias e linfomas
Cefaléia, náuseas e vômitos Meningite, encefalite Tumor de SNC
Massa óssea, dor óssea Trauma, infecção,tuberculose Sarcoma de Ewing,
Osteossarcoma,
Neuroblastoma
Hematúria, disúria Infecção urinária Rabdomiossarcoma,
Tumor de Wilms
2.1.4 Breve Histórico sobre Neuroblastoma:
2.1.4.1 Epidemiologia e origem do Neuroblastoma
O Neuroblastoma é o tumor sólido extracraniano mais comum na infância,
correspondendo a 8-10% de todos os tumores pediátricos. É o tumor mais comum em
lactentes (54%) e tem mediana de idade ao diagnóstico de 19 meses. Originário das células da
crista neural comprometidas com a linhagem nervosa simpática periférica possui
características únicas: pode ser um tumor altamente letal, mesmo com tratamento agressivo,
até um tumor diferenciado com regressão espontânea. 4,41
14
2.1.4.2. Genética do Neuroblastoma
Um subgrupo de pacientes com neuroblastoma exibe uma predisposição genética
herdada autossômica dominante.Uma história familiar de predisposição genética é encontrada
em 1-2% dos casos novos de neuroblastoma. 4
Alterações genéticas no neuroblastoma
geralmente ocorrem de 3 formas: amplificação de oncogene e ganho ou perda cromossomial
segmentar.42
Exemplos destas alterações cromossomiais são: amplificação do NMYC,
duplicação do lócus NMYC (2p24), ganho do 17q e perda do 1p.41
Nos últimos anos, a
tecnologia de “microarray” evidenciou a possibilidade de identificar subgrupos tumorais em
neuroblastomas a partir da identificação de genes especificamente expressos e predizer
resultados de sobrevida nestes subgrupos. Entretanto, estudos de perfil de expressão global
(mRNA e proteína) são necessários para melhor avaliação funcional, pois estudam
diretamente a molécula efetora final. Chen et al43
, estudaram em paralelo a expressão
protéica e de mRNA em dois subgrupos de neuroblastoma (estágio 1 e 4 com NMYC
amplificado) e encontraram um total de 433 e 130 proteínas super expressas ou com baixa
expressão comparativamente nos estágios 4 e 1. Entre elas estão proteínas relacionadas com
adesão celular, desenvolvimento do Sistema Nervoso Central (SNC) e processos de
diferenciação celular.
2.1.4.3. Apresentação Clínica do Neuroblastoma
Os sinais e sintomas dos pacientes com neuroblastoma refletem a localização da
doença e seu potencial metastático. Pacientes com doença localizada são geralmente
assintomáticos e detectados acidentalmente, enquanto pacientes com doença disseminada
costumam cursar com dor óssea (34%), febre (28%) e perda de peso (21%). Pode ocorrer,
também, secreção de hormônios (peptídio vasoativo intestinal e catecolaminas) e síndromes
paraneoplásicas (opsoclonus-mioclonus, Horner entre outras).44
2.1.4.4. Diagnóstico e Estadiamento do Neuroblastoma
O diagnóstico do neuroblastoma pode ser realizado a partir da detecção de células
infiltrantes na medula óssea, por biópsia da medula óssea, elevação urinária do ácido
vanilmandélico ou homovanílico, cintilografia com meta-iodo-benzil-guanidina (MIBG) e/ou
biópsia direta da massa tumoral. De acordo com a INPC (“International Neuroblastoma
15
pathology Classification”) os tumores neuroblásticos (neuroblastoma, ganglioneuroblastoma
e ganglioneuroma), historicamente, apresentam o grau de maturação neuroblástica à células
ganglionares, como característica morfológica de importância prognóstica. Com o objetivo de
aprimorar a relação classificação patológica X prognóstico, o comitê internacional de
patologia de neuroblastoma publicou, em 1999, uma avaliação prognóstica baseada no
sistema Shimada (tabela 4)45
A estratificação cirúrgica do neuroblastoma é realizada pelo Sistema Internacional de
Estadiamento do Neuroblastoma (INSS), desenvolvido em 1986, e revisado em 1993, que
leva em consideração: localização, ressecabilidade, presença de metástase local ou à distância
e idade ao diagnóstico.44,46
Na tabela 5 encontra-se a descrição do estadiamento segundo INSS
Tabela 4 Avaliação prognóstica segundo INPC (Sistema Shimada)
INPC Classificação Shimada Prognóstico
Neuroblastoma
Favorável
<1,5 anos
1,5 anos-5 anos
Desfavorável
<1,5 anos
1,5-5 anos
>5 anos
Pobre em estroma Schwan
Pouco diferenciado ou em
diferenciação com MKI baixo
ou intermediário
Diferenciando e baixo MKI
a)Tumor indiferenciado
b) MKI alto
Tumor indiferenciado ou pouco
diferenciado
MKI intermediário ou alto
Todos os tumores
Pobre em estroma Schwan
Favorável
Desfavorável
Favorável
Desfavorável
Ganglioneuroblastoma,
“intermixed”
Rico em Estroma de Schwan Rico em Estroma de Schwan
“intermixed”
Favorável
Favorável
Ganglioneuroma
Amadurecendo
Maduro
Estroma de Schwan dominante
Bem diferenciado
Favorável
Ganglioneuroma
Favorável
Ganglioneuroblastoma
nodular
Composição estroma rico-
dominante e pobre
Estroma rico nodular
Desfavorável
Desfavorável
INPC- International Neuroblastoma Pathology Classification ; MKI- índice de mitose-cariorrexis
16
Tabela 5 Estadiamento do neuroblastoma segundo INSS
Estágio Definição
1 Ressecção macroscópica completa sem infiltração de linfonodos adjacentes
(linfonodos resecados) junto com o tumor podem ser positivos
2A Tumor com ressecção macroscópica incompleta e linfonodos ipsilaterais
negativos
2B Tumor com ou sem ressecção cirúrgica macroscópica completa + linfonodos
ipsilaterais positivos e contralaterais negativos
3 Tumor irressecável ultrapassando linha média ou linfonodo contralateral
positivo com tumor ressecável ou tumor de linha média com extensão bilateral
ou com envolvimento linfonodal
4 Qualquer tumor com metástase à distância: fígado, osso, linfonodos, medula
óssea, pele e/ou outros ossos. (exceção 4S)
4S Tumor primário localizado (1,2ª,2B) com disseminação para pele, medula
óssea(<10%) e/ou fígado em pacientes <1 ano de idade
2.1.4.5. Tratamento do Neuroblastoma
Em 2009, o INRG (“International Neuroblastoma Risk Group”) publicou um
consenso de estratificação por grupo de risco para unificação da estratificação pré-
tratamento.46
Com esta estratificação, foi possível aprimorar o tratamento para os grupos de
risco de melhor prognóstico ( INSS 1, 2, 3 e 4S sem NMYC amplificado) com sobrevidas
livre de eventos (SLE) e global (SG) de 87% e 95% respectivamente. Enquanto para aqueles
com doença avançada, maiores de 1 ano e amplificação do NMYC novas pesquisas vêm
sendo desenvolvidas para melhoria da SLE, que atualmente corresponde a 19%, e SG que
hoje é de 22%.46
17
2.1.5. Breve Histórico sobre Rabdomiossarcoma
2.1.5.1 Epidemiologia e origem do Rabdomiossarcoma
O rabdomiossarcoma é o sarcoma de partes mole mais comum na infância que
corresponde a 3-4 % de todos os cânceres na infância. Aproximadamente 60% destes tumores
acometem crianças menores de 6 anos. O sítio mais acometido é a cabeça e o pescoço, que
compreendem 40% dos casos. O rabdomiossarcoma é originalmente descrito como um tumor
proveniente de células musculares imaturas, comprometidas com a formação do músculo
esquelético. Entretanto, o rabdomiossarcoma pode acometer locais onde não há músculo
esquelético (bexiga, vesícula biliar, medula óssea). Este fato, associado à grande diversidade
de apresentações clínicas dos diferentes subtipos histológicos, levou a uma grande discussão
da origem do rabdomiossarcoma.47
Na figura 2, observa-se um modelo da miogênese do
músculo esquelético associado com as possíveis origens do rabdomiossarcoma.
Figura 2 Modelo de miogênese do músculo esquelético associado às possíveis origens
celulares do rabdomiossarcoma. A diferenciação muscular a partir do mesoderma depende de
fatores de transcrição específicos (PAX3,PAX7,MYOD, Myf5,Miogenina e Myf6). A
maturação pós-natal de células musculares ou regeneração muscular se faz a partir do
recrutamento de células precursoras satélites que proliferam, se diferenciam e se unem para
formar os miotubos multinucleados. Dependendo do oncogene expresso e do estágio de
maturação celular no qual ocorre o dano, os diferentes subtipos de rabdomiossarcoma podem
surgir.48
18
2.1.5.2. Genética do Rabdomiossarcoma
Embora a grande maioria dos casos de rabdomiossarcoma sejam de origem
esporádica, o rabdomiossarcoma pode ocorrer associado a síndromes genéticas como Li-
Fraumeni e neurofibromatose tipo 1. Os subtipos de rabdomiossarcoma alveolar e
embrionário se apresentam com padrões de anormalidades genéticas completamente
diferentes. O rabdomiossarcoma embrionário é caracterizado por perda de heterozigose no
braço curto do cromossoma 11 (11p15.5), sugerindo inativação de um gene supressor
tumoral. O rabdomiossarcoma alveolar é caracterizado por possuir uma translocação
recíproca em cerca de 80% dos casos envolvendo o cromossomo 2 (gene PAX3) e o
cromossomo 13 ( gene FOXO1) t(2;13) ou 10-15% dos casos envolvendo o cromossomo 1
(gene PAX7) e o cromossomo 13 (gene FOXO1) t(1;13). Esta fusão gera proteínas
quiméricas com capacidade de ligação ao DNA, interferindo na diferenciação miogênica
celular e apoptose.49
2.1.5.3. Apresentação Clínica do Rabdomiossarcoma
A apresentação clínica do rabdomiossarcoma é variável e influenciada por diversos
fatores: sítio de origem, idade do paciente e presença ou ausência de metástases ao
diagnóstico. Menos de 25% dos pacientes apresentam doença metastática ao diagnóstico.
Mais de 50% das crianças com rabdomiossarcoma possuem um único sítio de doença.
Tumores que acometem cabeça e pescoço costumam cursar com massa orbitária, cervicais,
obstrução nasal com descarga mucosanguinolenta. Tumores de extremidades podem cursar
com sinais flogísticos nos membros; e, os tumores que ocorrem no trato genitourinário podem
cursar com hematúria, disúria e obstrução urinária, assim como massa envolvendo testículo e
região vaginal com descarga sanguinolenta.49
2.1.5.4. Diagnóstico e Estadiamento do Rabdomiossarcoma
O diagnóstico do rabdomiossarcoma é feito a partir da biópsia do sítio primário. De
acordo com a classificação patológica internacional, atualmente utilizada pelo COG
(“Children’s Oncology Group”), o rabdomiossarcoma é subdividido em embrionário, de
células fusiformes, botrióide, alveolar (incluindo variante sólida), rabdomiossarcoma não
especificado, sarcoma não especificado e sarcoma indiferenciado.50
O estadiamento inicial do
19
rabdomiossarcoma é feito pela avaliação da extensão de doença no sítio primário e possíveis
locais metastáticos como: pulmão, linfonodos e medula óssea. Como menos de 25%
apresentam doença metastática ao diagnóstico, dependendo do sítio primário, existe a
possibilidade de ressecção cirúrgica total no momento inicial quando o diagnóstico é feito na
peça cirúrgica. Pacientes com doença localizada e totalmente ressecada têm um prognóstico
excelente com taxas de sobrevida livre de eventos >90%. A estratificação por grupo de risco
mais utilizada atualmente associa dois estadiamentos diferentes: o “Clinical Group System
(CG)”, desenvolvido em 1972 pelo “Intergroup Rhabdomyosarcoma Study (IRS)”, que leva
em consideração a ressecção cirúrgica e extensão de doença ao diagnóstico (tabela 6)7; e o
“Tumor-nodes-metastasis (TNM)” modificado por sítio de origem desenvolvido no IRS IV
em 1992 (tabela 7)51
Tabela 6 Sistema CG de estratificação do Rabdomiossarcoma
Estágio Definição
I A tumor confinado ao sítio de origem e completamente ressecado
B tumor com extensão ao redor do sítio de origem, porém
completamente ressecado
II A ressecção macroscópica completa porém doença residual
microscópica
B extensão para linfonodos adjacentes, porém completamente ressecado
C extensão para linfonodos adjacentes e doença microscópica residual
III A doença macroscópica residual- apenas biópsia
B doença macroscópica residual – mais de 50% de ressecção
IV Doença metastática independente de ressecção cirúrgica
20
Tabela 7 Sistema TNM de estratificação do Rabdomiossarcoma
Estágio Sítio Invasividade Tamanho Linfonodo Metástase
I Órbita
Cabeça e pescoço
Geniturinário
T1ouT2
T1ouT2
T1ouT2
a ou b
a ou b
a ou b
N0,N1ou Nx
N0,N1ou Nx
N0,N1ou Nx
M0
M0
M0
II Bexiga e próstata
Extremidade
Parameníngeo
outros
T1ouT2
T1ouT2
T1ouT2
T1ouT2
a
a
a
a
N0 ou Nx
N0 ou Nx
N0 ou Nx
N0 ou Nx
M0
M0
M0
M0
III Bexiga e próstata
Extremidade
Parameníngeo
outros
T1ouT2
T1ouT2
T1ouT2
T1ouT2
a
b
b
b
N1
N0,N1ou Nx
N0,N1ou Nx
N0,N1ou Nx
M0
M0
M0
M0
IV Todos T1ouT2 a ou b N0 ou N1 M1
2.1.5.5 Tratamento do Rabdomiossarcoma
O tratamento do rabdomiossarcoma, desenvolvido por grupos colaborativos reunidos
no IRS, combina diferentes modalidades terapêuticas, e se divide de forma complexa com
base na estratificação descrita acima. A sobrevida livre de eventos varia sobremaneira entre
os diferentes grupos de risco, podendo ser >90% em pacientes CGI até <20% em pacientes
CG IV.52
2.1.6. Breve Histórico sobre Tumores da Família Ewing
2.1.6.1 Epidemiologia e origem dos Tumores da Família Ewing
Os tumores da Família Ewing são responsáveis por 3% dos diagnósticos de câncer
pediátrico, sendo o segundo tumor maligno ósseo mais comum. Embora seja o tumor ósseo
mais comum, 15% dos tumores da Família Ewing surgem em sítios
extraósseos.7,52
Compreendem um grupo de tumores caracterizados por morfologia de células
pequenas redondas e azuis, e uma translocação específica envolvendo o gene EWS no
cromossomo 22 com um dos três genes ETS no cromossomo 11. Pertencem a este grupo:
Sarcoma de ewing, Tumor Neuroectodérmico Primitivo (PNET), Neuroepitelioma Periférico
e o Tumor de Askin.7
21
Desde sua primeira descrição, em 1921, por James Ewing, sua origem celular
permanece desconhecida. A principal hipótese aceita, atualmente, sugere que a célula de
origem seja a célula tronco-mesenquimal proveniente do tecido hematopoiético ou
neuroectodermal, capaz de manter sua dupla plasticidade e proporcionar uma base biológica
plausível para seu fenótipo diferenciado.53
2.1.6.2 Apresentação Clínica dos Tumores da Família Ewing
A apresentação clínica mais comum do sarcoma de Ewing é dor local, que pode ser
intermitente e de intensidade variável, seguida de massa palpável. Como a maioria dos
pacientes está na segunda década de vida, esta dor pode ser facilmente confundida com dor
do crescimento ou por exercício físico.54
A duração dos sintomas até o diagnóstico leva, em
média, 3-9 meses. Ao contrário do osteossarcoma, o Ewing acomete mais os “ossos chatos”
do esqueleto axial. O crescimento tumoral leva a uma massa tumoral visível ou palpável, em
geral, com edema ao redor. Porém, tumores pélvicos, de parede torácica ou osso femoral
podem demorar meses até serem realmente perceptíveis. Como os tumores da Família Ewing
podem acometer virtualmente qualquer osso ou qualquer tecido mole do corpo, seus sintomas
estarão relacionados com o sítio acometido. Sinais de compressão medular por tumores
retroperitoneais requerem intervenção imediata cirúrgica, radioterápica ou quimioterápica.54
2.1.6.3 Diagnóstico e Estadiamento dos Tumores da Família Ewing
O diagnóstico dos Tumores da Família Ewing é, obrigatoriamente, histopatológico por
biópsia do sítio primário. Como estes tumores fazem parte do grupo dos tumores de células
pequenas redondas e azuis, existe sempre a necessidade de complementação com imuno-
histoquímica, onde uma forte expressão da glicoproteína de membrana MIC2 (CD99) está
presente em 95-100% dos casos. Em alguns casos, há necessidade de confirmação
diagnóstica com citogenética ou biologia molecular. A investigação inicial dos pacientes com
Ewing incluem: radiografia do osso suspeito e articulação adjacente, ressonância nuclear
magnética (RNM) do sítio acometido, tomografia de Tórax (TC), cintilografia óssea,
mielograma e biópsia de medula óssea bilateral e biópsia aberta da massa.7,54
A estratificação dos tumores de Ewing inclui uma correta avaliação do local primário
e presença de metástase à distância. Ao diagnóstico, 25% dos pacientes apresentam doença
metastática. Em 2007, Galindo et al 52
realizaram um trabalho para avaliação dos principais
22
fatores prognósticos e concluíram que, na era atual de tratamento, permanecem como
importantes fatores independentes: tamanho e estágio de doença ao diagnóstico. Neste
estudo, foram definidos 4 grupos de risco descritos na tabela 8.
Tabela 8 Sobrevida Global do Sarcoma de Ewing distribuída nos diferentes grupos de
risco52
Grupo de risco Definição SG
Favorável Idade<14anos, localizado,
não-pélvico
88,1%
Intermediário Idade>14 anos, localizado ou
pélvico
64,9%
Desfavorável
Pulmonar
Metástase pulmonar isolada 53,8%
Desfavorável
Extra-pulmonar
Metástase extra-pulmonar 27,2%
2.1.7. Breve Histórico sobre Tumor de Wilms
2.1.7.1 Epidemiologia e origem dos Tumores de Wilms
O tumor de Wilms ou nefroblastoma é o tumor primário renal mais comum da
infância, correspondendo a 6% dos diagnósticos de câncer pediátrico. 7 É, discretamente,
mais freqüente em meninos (meninas:meninos- 0,92:1), e tem mediana de idade de 41,5
meses nos casos onde a apresentação é unilateral, e 29,5 meses quando a apresentação é
bilateral.7O tumor de Wilms foi o primeiro tumor pediátrico onde a quimioterapia adjuvante,
realmente, resultou em um aumento significativo da sobrevida global, que passou de 30% em
1930 a 85% nos dias atuais.55,56
Embora a célula de origem do tumor de Wilms ainda permaneça desconhecida, existe
forte evidência do seu desenvolvimento a partir dos restos nefrogênicos. Os restos
nefrogênicos são estruturas anormais formadas a partir de uma falha na diferenciação do
tecido mesenquimal em nefrons. Estas estruturas existem, normalmente, em pequena
quantidade no rim normal e estão presentes em grande quantidade no tumor de Wilms. Na
23
grande maioria dos casos, o tumor de Wilms possui componentes mesenquimal e epitelial,
isto sugere que sua origem esteja relacionada a célula precursora renal.57
2.1.7.2 Genética do Tumor de Wilms
Aproximadamente, 10% dos pacientes com tumor de Wilms possuem anormalidades
congênitas ou síndromes genéticas; estas últimas classificadas como “overgrowth” e “non-
overgrowth”. Dois exemplos bastante conhecidos são a síndrome de WAGR e a Síndrome de
Beckwith-Wiedman. A partir do estudo destas crianças foi possível a identificação do
primeiro gene supressor tumoral WT1 no cromossomo 11p13.57,58
Alterações genéticas
conhecidas do tumor de Wilms incluem: mutação no gene WT1 (18%) que leva a supressão
deste gene, mutações no gene da ß- catenina que leva a um acúmulo de ß- catenina no núcleo
e mutações no gene supressor tumoral ligado ao X - WTX (30%) também relacionado com a
via da ß- catenina. A figura 3 mostra uma representação esquemática do envolvimento da via
da ß- catenina no Tumor de Wilms57
Figura 3. As mutações na via da ß- catenina resulta em sinalização ativa constitutiva da
via. a) Na ausência do WNT a ß- catenina é direcionada para ubiquitinação ou
degradação proteossomal por um complexo de destruição. Mutações ativas da ß- catenina
a) b)
24
impedem sua fosforilação, impedindo assim sua degradação. Esta ß- catenina mutada atua
no núcleo como fator de transcrição interagindo com o TCF/LEF. b) Este evento é similar
a ativação da ß- catenina induzido por sinais do WNT. Os sinais do WNT são mediados
por Frizzled, LRP5 e 6 (LDL- receptor relacionado das proteínas 5 e 6), e DSH
(Dishevelled) e inativa a destruição do complexo, levando ao acúmulo de ß- catenina no
núcleo. 57
2.1.7.3 Apresentação Clínica do Tumor de Wilms
A grande maioria dos pacientes com tumor de Wilms apresenta-se assintomático com
o achado incidental de uma massa abdominal. Dor abdominal, hematúria macroscópica e
febre também podem estar presentes ao diagnóstico. 7 Hematúria macroscópica é raro e está
associado ao acometimento da pelve renal. Cerca de 25% dos pacientes podem apresentar
hipertensão por aumento de renina, que se resolve com a ressecção cirúrgica do tumor.55
É,
especialmente, importante investigar qualquer sinal de síndromes associadas ao tumor de
Wilms como aniridia, dismorfismos faciais, hemihipertrofia parcial ou completa e
anormalidades genitourinárias.7
2.1.7.4 Diagnóstico e Estadiamento do Tumor de Wilms
No diagnóstico dos pacientes com tumor de Wilms, a radiologia tem um papel crítico
tanto para avaliação da localização renal da massa, quanto para avaliação de extensão da
doença. Em geral, o exame radiológico inicial é a ultrassonografia abdominal que irá
diferenciar entre massa sólida ou cística, origem renal ou extra-renal da massa e tamanho
tumoral. A seguir, exames de TC de abdome e pelve possibilitam uma melhor avaliação da
extensão da doença. A TC de tórax também é importante para avaliação de metástase. O
momento e modalidade de tratamento cirúrgico para diagnóstico histopatológico difere de
acordo com o grupo de tratamento a ser seguido. 7
A estratificação dos pacientes com tumor de Wilms pode ser realizada por dois
diferentes sistemas de estadiamento: um com estratificação cirúrgica pré-quimioterapia
“National Wilms‟ tumor Study Group” (NWTS) e um com estratificação com base na
resposta quimioterápica pré-cirurgia “International Society of Pediatric Oncology” (SIOP).
55,59 (Tabela 9 )
25
Tabela 9 Principais diferenças no Estadiamento do Tumor de Wilms NWTS X SIOP59
ESTÁGIO NWTS (antes da quimioterapia) SIOP (depois da quimioterapia)
I a)Tumor limitado ao rim e completamente
ressecado
b) Não houve ruptura tumoral antes ou
durante o procedimento cirúrgico
c) Os vasos do seio renal não estão
envolvidos >2mm
d) Não há tumor residual aparente além das
margens cirúrgicas
a)Tumor limitado ao rim ou envolto
por pseudocápsula fibrosa, caso esteja
fora do rim não pode exceder a cápsula
e precisa ser totalmente ressecado
b)O tumor pode se “debruçar” na
pelve renal porém não pode infiltrar
suas paredes
c)Os vasos do seio renal não podem
estar envolvidos
d)Vasos do seio renal podem estar
envolvidos
II a)Tumor se estende além do rim mas é
completamente ressecado
b)Sem tumor residual aparente nas margens
cirúrgicas
c)Caso haja trombo nos vasos extra-renais
este deve ser removido com o tumor para ser
estágio II
a)O tumor se estende além do rim mas
é completamente ressecado
b)O tumor se estende ao seio renal,
vasos linfáticos ou sanguíneos mas é
completamente ressecado
c)O tumor infiltra veia cava ou órgãos
adjacentes mas é completamente
ressecado
III
(Tumor
residual
confinado ao
abdome)
a)Envolvimento de cadeias linfáticas no hilo
renal e Peri-aórticas ou próximas
b)Contaminação peritoneal difusa
c)Implante peritoneal
d) Tumor além das margens cirúrgicas (macro
ou microscópico)
e) Tumor não é completamente ressecado por
causa de estruturas vitais envolvidas
a) Tumor além das margens cirúrgicas
(macro ou microscópico)
b) Qualquer envolvimento linfonodal
abdominal
c) Ruptura tumoral antes ou durante
cirurgia
d) Envolvimento da superfície
peritoneal
e) Trombo tumoral nos vasos ou ureter
não completamente ressecado
f) Biópsia tumoral a “céu aberto”
prévia a quimioterapia
IV a)Presença de disseminação metastática
linfonodal à distância ou hematogênica
b)Tumor bilateral ao diagnóstico
a) Presença de disseminação
metastática linfonodal fora da região
abdomino-pélvica ou hematogênica
b) Tumor renal bilateral ao diagnóstico
V Tumor bilateral Tumor Bilateral
26
2.1.8 Breve Histórico dos Linfomas Pediátricos
2.1.8.1 Epidemiologia dos Linfomas
Os linfomas são o terceiro grupo mais comum de câncer pediátrico, sendo responsável
por 13% dos diagnósticos de câncer nesta faixa etária nos Estados Unidos.60
Distribuem-se
nos EUA da seguinte forma: 60% de linfomas não-Hodgking e 40% de linfoma de Hodgkin.
No Brasil, Gualco et al61
publicaram uma revisão dos diagnósticos de linfoma com uma série
de 1301 casos distribuídos nas diferentes regiões do país e mostraram uma proporção
semelhante com relação à distribuição entre linfomas de Hodgkin e não-Hodgkin, porém
grande variabilidade inter-regional quanto à distribuição dos subtipos de linfoma. (Figura 4)
Embora o linfoma de Hodgkin tenha um pico de incidência bimodal acometendo adolescentes
e adultos acima dos 59 anos, o linfoma não-hodgkin apresenta uma incidência crescente com
a idade.
Figura 4 Distribuição dos casos de linfoma no Brasil segundo Gaulco et AL
27
O linfoma não-Hodkin pediátrico possui um espectro histológico bem menos amplo
quando comparado a enorme variedade de subtipos histopatológicos do linfoma não-hodgkin
do adulto. Em pediatria, os subtipos histológicos mais comuns são o Linfoma de Burkitt, o
Linfoma Linfoblástico, o linfoma anaplásico de grandes células e o Linfoma difuso de
Grandes Células B, o que compreende 90% dos diagnósticos. 60
O linfoma de Hodgkin
pediátrico, também, difere do linfoma de Hodgkin no adulto. Os subtipos predomínio
linfocítico (10-20%) e de celularidade mista (30-35%) são mais comuns na faixa etária pré-
puberal que nos adultos. O subtipo esclerose nodular acomete apenas 45-50% de crianças,
enquanto em adolescentes e adultos jovens é o subtipo predominante (70-80% dos casos)61
2.1.8.2 Origem celular dos linfomas
Os linfomas de células B, T/NK são expansões clonais de células B, T/NK que, de
alguma maneira, recapitulam os estágios normais de diferenciação linfóide. A diferenciação
normal de células B se inicia na medula óssea com os progenitores de células B que sofrem
rearranjo da imunoglobulina e se diferenciam em células B naive. Estas células, ao
Regiões: A- Norte,B-Nordeste, C- Central, D-Sul
e E-Sudeste
A) B) C)
D) E) Linfoma Linfoblástico
Linfoma de Burkitt
Linfoma difuso de grandes células B
Linfoma não-classificado
Linfoma anaplásicoALK+
Linfoma Anaplásico ALK-
Linfoma T/NK
Linfoma não-classificado
Hodgkin-predomínio linfocitário
Hodgkin- clássico
28
encontrarem o antígeno que se encaixa ao seu receptor de imunoglobulina, sofrem
transformação, proliferação e maturação em plasmócitos secretores de anticorpo e células B
de memória. Na figura 5 observamos os diferentes estágios de maturação do linfócito B e a
relação entre estes estágios e o desenvolvimento dos diferentes subtipos de linfoma B. 63,64
Figura 5. Representação diagramática da diferenciação da célula B e sua relação com as
neoplasias de células B. As neoplasias de células B correspondem a estágios maturativos das
células B, mesmo quando sua contrapartida celular normal não é completamente conhecida.
Os precursores de células B que amadurecem na medula óssea podem sofrer apoptose ou se
transformar em células B naive que, ao serem expostas ao antígeno, podem se transformar em
plasmócitos de meia-vida curta ou entrar no centro germinativo, onde ocorre hipermutação
somática e “switch” de cadeia pesada. Os centroblastos ou sofrem apoptose ou se
transformam em centrócitos. Pós-centro germinativo são plasmócitos de meia-vida longa ou
células B de memória ou zona marginal.63,64
29
A diferenciação normal de células T surge a partir de um precursor da medula óssea
que sofre maturação e adquire função no timo. Células T antígeno-específicas amadurecem
no córtex do timo. Os diferentes estágios de maturação da célula T se refletem na
leucemia/linfoma linfoblástico T. Os linfomas do sistema imune inato são
predominantemente extranodais na apresentação, refletindo a distribuição funcional dos
componentes deste sistema. Interessante o fato de que a maioria dos linfomas de células T e
NK, comumente encontrados em crianças e adolescentes, são derivados de células do sistema
imune inato. Estes incluem leucemia de células NK, doença linfoproliferativa de células T
ligada ao EBV, linfomas T hepatoesplênicos e linfomas T γδ, afetando sítios cutâneos e
mucosas. Na figura 6, observamos os diferentes estágios de maturação do linfócito T e a
relação entre estes estágios e o desenvolvimento dos diferentes subtipos de linfoma T. 63,64
Figura 6. Representação diagramática da diferenciação de células T e as neoplasias
correspondentes aos diferentes estágios de maturação. Os progenitores linfóides T entram no
timo onde se diferenciam em uma variedade de células T naive.A via de maturação precisa
das células NK e células T γδ não é completamente entendida. As células T αβ deixam o timo
e nos tecidos linfóides periféricos, após exposição ao antígeno se diferenciam em células
TCD4+ e TCD8+ e células T de memória.
FDC- células dendríticas foliculares TFH- células T “helper” foliculares.63,64
30
2.1.8.3 Genética dos Linfomas:
Existem algumas diferenças entre a genética dos linfomas pediátricos e de adultos
embora guardem bastante similaridade entre si. O linfoma anaplásico de grandes células
compreende 13% dos LNH em crianças, e em 90% dos casos, possui a translocação t(2;5)
(p23;q35) envolvendo o gene ALK no cromossomo 2 e o gene NPM no cromossomo5 muito
menos freqüente em adultos.O rearranjo do gene ALK presente, quase sempre, nos linfomas
anaplásicos em crianças confere um bom prognóstico nesta faixa etária, enquanto no adulto,
além de menos freqüente, confere um pior prognóstico. O linfoma difuso de grandes células
B (LDGCB) compreende 15-20% dos diagnósticos de LNH na criança; e, crianças e
adolescentes com LDGCB apresentam um bom prognóstico. O cariótipo dos LDGCB em
crianças, embora pouco estudado, se caracteriza por ser complexo, poliplóide e raramente
incluir a t(14;18) presente em 30% dos LDGCB do adulto. O rearranjo do CMYC é freqüente
em crianças (38%) enquanto ocorrem em menos de 10% dos adultos. Em adultos, o rearranjo
do Bcl6 ocorre em 40% dos casos e do Bcl2 em 30% dos casos. O linfoma de Burkitt (LB)
compreende 1/3 dos diagnósticos de LNH na criança. A translocação envolvendo o oncogene
CMYC (8q24.1) é uma marca do LB e em 80% dos casos envolve o gene da IgH t(8;14).65
2.1.8.4 Apresentação Clínica dos Linfomas Pediátricos
A apresentação clínica dos diferentes tipos de linfoma varia de acordo com o sítio de
apresentação e extensão da doença. Usualmente, o Linfoma de Hodgkin se apresenta com
linfadenomegalia supraclavicular ou cervical, em geral os linfonodos são de consistência
elástica e indolores, podendo ser dolorosos à palpação. Pelo menos, 2/3 dos pacientes com
Linfoma de Hodgkin apresentam algum grau de envolvimento mediastinal e, em casos de
doença mais avançada, sintomas sistêmicos como febre, perda de peso e suor noturno são
comuns.7 Nos linfomas não-Hodgkin a apresentação clínica é bastante diversa, podendo ir,
desde massas mediastinais de rápido crescimento com risco de obstrução de vias aéreas
(linfomas linfoblásticos T), até grandes massas abdominais (Linfomas de Burkitt).7
A melhoria nas técnicas diagnósticas, nas últimas duas décadas, para melhor
classificação desta grande variedade de doenças e tratamento mais direcionado ao subtipo
específico, aumentou a sobrevida deste pacientes com linfoma não-Hodgkin e Linfoma de
Hodgkin para taxas >85%.60
31
2.2 Citometria de Fluxo
2.2.1 Histórico da utilização da citometria de fluxo
A tecnologia da citometria de fluxo foi criada no final da década de 60 e se tornou,
nos dias atuais, uma ferramenta de grande impacto na biologia celular e medicina clínica, e,
principalmente, no diagnóstico de muitas neoplasias hematológicas. É capaz de medir
diversos parâmetros de fluorescência e dispersão de luz simultaneamente em cada célula
individualizada 66
.
O primeiro citômetro de fluxo introduzido, comercialmente na década de 70
(Technicon‟s Hemalog D), tinha o objetivo de classificar leucócitos. Para tanto, possuía uma
medida de dispersão e de absorção de luz e três diferentes comprimentos de onda. Enzimas
cromogênicas eram usadas para gerar substratos que emitiam luz e permitiam identificar
neutrófilos e eosinófilos pela presença de concentrações moderadas, altas ou muito altas de
peroxidase, que eram detectadas por um mesmo detector de fluorescência. Outro canal de
fluorescência identificava os monócitos pelo seu conteúdo de esterase. A identificação de
basófilos era baseada na detecção de glicosaminoglicano nos grânulos basofílicos corado com
azul Alcian. Uma única lâmpada halógena servia de fonte de luz para os três sistemas de
fluxo.67
Em meados da década de 80, com a emergência da AIDS, novos citômetros de uso
clínico começaram a surgir (FACScan, FACSsort), possibilitando sua rápida incorporação na
prática clínica.67
Em oncologia, uma das primeiras aplicações clínicas foi a análise do
conteúdo de DNA e detecção de antígenos de membrana em neoplasias hematológicas,
utilizados até os dias atuais.67,68
A partir de 2002, aparelhos contendo múltiplos lasers e sistemas ópticos, eletrônicos e
fluídicos de alta eficácia melhoraram a resolução e diminuíram o custo destes citômetros.
Atualmente, com o advento da citometria de fluxo multiparamétrica, é possível a
identificação de características celulares, desde a detecção das medidas de dispersão frontal e
lateral (FSC e SSC), parâmetros que refletem o tamanho e a complexidade interna da célula,
até a identificação de diversas moléculas em diferentes localizações (nucleares,
intracitoplasmáticas ou de membrana). A estratégia mais usual é submeter uma suspensão
celular a um conjunto de anticorpos monoclonais, conjugados a distintos fluorocromos, frente
a antígenos de interesse. Esta suspensão é submetida a uma pressão negativa, passa por uma
câmara de fluxo linear, que alinha as células, e chega a um fino capilar onde as células
32
passam uma por vez. Incide, sobre este capilar, um laser que excita a emissão de
fluorescências pelos fluorocromos, conjugados aos anticorpos ligados às células. As medidas
de dispersão frontal e lateral da luz, assim como as medidas de fluorescência, são detectadas
e registradas. Outras estratégias são utilizadas quando o objetivo é diferente, por exemplo,
aferir a quantidade de DNA por célula. Neste caso, utilizam-se fluorocromos capazes de se
intercalarem diretamente ao DNA. Até o momento, as amostras mais freqüentemente
analisadas são o sangue periférico e a medula óssea. 66-69
A tecnologia da citometria de fluxo mantém sua evolução com novos flurocromos,
novos analisadores mais rápidos e com maior número de lasers, capacidade multidirecional
de “sorteio”, integração com técnicas de biologia molecular e análise de marcadores livres no
plasma como citocinas.70
2.2.2 A citometria de Fluxo no diagnóstico das Neoplasias Hematológicas
A classificação do grupo cooperativo FAB (French-American-British)71
surgiu em
1976, com o objetivo de unificar o diagnóstico morfológico e citoquímico das leucemias
agudas, tornando-o comparável em todo o mundo. Para tal, foram utilizadas a morfologia de
Romanowsky ( técnica de coloração contendo no mínimo corante vermelho ácido eosin Y e
um básico azul azure B) e a coloração com mieloperoxidase, Sudan Black B, NSE (esterase
não específica) e PSA (ácido periódico de Schiff). Inicialmente, foram descritos 3 subtipos de
leucemia linfobástica aguda (L1,L2 e L3), como descrito em detalhes na tabela 10 e mielóide
(M1-M6).
33
Tabela 10 Classificação FAB de Leucemia Linfoblástica Aguda
Características
Citológicas
L1 L2 L3
Tamanho celular Predominância de
pequenas células
Células grandes e
heterogêneas
Células grandes e
homogêneas
Cromatina nuclear Homogênea Variável e
Heterogênea
Finamente pontilhada
e homogênea
Formato do núcleo Não visível ou
pequeno e
“inconspicuous”;mais
vesicular
Núcleo irregular
com fissuras e
identações
Regular- oval a
redondo
Nucléolo Regular; ocasionais
fissuras ou identações
Um ou mais;
quase sempre
grande
Proeminente; um ou
mais
Quantidade de
citoplasma
pouco Variável; quase
sempre
abundante
Abundante
Basofilia do
citoplasma
Leve a moderada;
raramente intensa
Variável, intensa
em alguns casos
intensa
Vacuolização do
citoplasma
variável variável Quase sempre
presente
Em 1986, Todd e Foon72
fizeram uma extensa revisão sobre a classificação
imunológica das leucemias e linfomas. Nesta época, com o advento da técnica de hibridoma,
foi possível a produção de diversos anticorpos monoclonais expandindo sobremaneira sua
utilização. Neste mesmo ano, Neame PB et al.73
publicaram um estudo comparativo entre a
classificação FAB (padrão ouro naquele momento) e a utilização dos anticorpos monoclonais
,(35) por técnica de microscopia de fluorescência, com 138 casos de leucemias agudas, com
o objetivo de aprimorar a classificação até então vigente. Houve uma concordância de 83%
entre a morfologia pela classificação FAB e o imunofenótipo. Neste estudo, concluíram que o
34
melhor método até o momento para caracterização das leucemias agudas seria uma
combinação entre morfologia, citoquímica e imunofenotipagem.
Em 1995, o Grupo Europeu de Classificação Imunológica das Leucemias (EGIL)
propôs um algoritmo para a classificação de leucemias de linhagem B, T e bifenotípica,
segundo tabela 11,12 e 1374,75
; e, em 2003, o Grupo Europeu de Estudos Imunológicos das
Leucemias (GEIL) propôs uma classificação imunológica para as leucemias mielóides
descrito a seguir na tabela 14.76
Tabela 11 Classificação Imunofenotípica segundo Grupo Europeu para Classificação
Imunológica das Leucemias (EGIL) proposto em 1995 para leucemias linfoblásticas
agudas de precursores B
Classificação cCD79,CD19 e cCD22 ou
sCD22
CD10 cµ sIg
BI + - - -
BII + + - -
BIII + + + -
BIV + + + +
Tabela 12 Classificação Imunofenotípica segundo Grupo Europeu para Classificação
Imunológica das Leucemias (EGIL) proposto em 1995 para leucemias linfoblásticas
agudas de precursores T
Classificação cCD3 CD7 CD2,CD5 e
CD8
CD1a CD3+/CD1a-
TI + + - - -
TII + + + - -
TIII + + + + -
TIV + + + - +
35
Tabela 13 Classificação Imunológicas das Leucemias Bifenotípicas segundo sistema de
pontos desenvolvido pelo Grupo EGIL em parceria com o grupo Britânico (Royal
Marsden Hospital, Londres)
Sistema de Pontos
Linfóide B
Linhagem
Linfóide T
Mielóide
2 cyCD79a
CD22
cyIgM
CD3 cyMPO
1 CD19
CD10
CD2
CD5
CD13
CD33
0.5 nuTdt nuTdt
CD7
CD14/CD15
CD11b/CD11c
Tabela 14 Classificação Imunológica das leucemias Mielóides segundo GEIL em 2003
Classificação CD13 ou CD33
ou CD117
CD7 CD35 ou CD36 CD15
MA + - - -
MB + + - -
MC + +/- + -
MD + +/- +/- +
ME - +/- +/- +/-
Em 2006, foi criado o Consórcio Europeu de Citometria de fluxo (EUROFLOW),
cujo objetivo maior é desenvolver e padronizar testes rápidos, altamente sensíveis e precisos
para o diagnóstico, prognósticos e subclassificação das neoplasias hematológicas por
citometria de fluxo, assim como, seguimento e avaliação de resposta ao tratamento. Em 2009,
Lhermitte L et al.77
, apresentaram no Congresso da Sociedade Européia de Hematologia, um
estudo com 157 pacientes com suspeita de leucemia aguda, cujo objetivo era identificar a
linhagem celular de origem (B,T ou mielóide ) com apenas um tubo de orientação contendo a
combinação de 8 anticorpos monoclonais (cyMPO/cyCD79a/CD34/ CD19/CD7/cyCD3/
36
smCD3/CD45). Os dados de cada paciente foram coletados e processados com a utilização do
programa de análise de dados Infinicity (Cytognos,Salamanca). A partir deste tubo de
orientação, uma classificação mais detalhada direcionada para a linhagem celular específica
seria aplicada para melhor caracterização fenotípica de cada caso. Na figura 7, evidenciamos
a perfeita separação entre os diferentes casos de leucemias agudas realizado após fusão dos
dados da população blástica de cada caso e classificação não-supervisionada das diferentes
leucemias por análise dos componentes principais. (vide pág.50 e 51 - materiais e métodos)
37
Figura 7 Estratégia de análise e separação por classificação de padrão dos três diferentes grupos de leucemias agudas com a utilização
do programa de análise de dados Infinicity (Cytognos, Salamanca) (Lhermitte,2009)
Estratégia de análise
Célula blástica
Monócitos
Células B residuais
Células T residuais
Neutrófilos
1)
2)
3)
38
4)
6)
5)
39
2.2.3 Estudo dos tumores sólidos pediátricos por citometria de fluxo
Embora a citometria de fluxo possa ser utilizada para estudar qualquer componente
celular, para tal, as células têm que estar em suspensão. Em tumores sólidos, a citometria de
fluxo foi inicialmente descrita para análise de DNA, visto que técnicas específicas permitiam
o uso de tumores embebidos em parafina, utilizando técnica de digestão por pepsina e
rehidratação dos fragmentos.10,19,20,78-81
A dificuldade técnica na obtenção de células viáveis
em suspensão para análise de proteínas celulares em tumores sólidos levou a uma gama de
trabalhos com objetivo de aprimoramento e análise da melhor técnica para dissociação destes
tumores.10-16
Em 1992 Van Dam et al12
, analisaram 5 métodos de dissociação celular em
tecidos frescos, fixados e congelados e constataram que a dissociação mecânica foi o melhor
método em todos os casos, levando a poucos debris celulares e preservação da expressão das
proteínas.
Em pediatria, a citometria de fluxo é ferramenta indispensável no diagnóstico de
leucemias agudas, porém, ainda não utilizada no diagnóstico e estratificação de tumores
sólidos. Em alguns destes tumores, já foi avaliado o papel da citometria de fluxo para análise
do DNA como fator prognóstico. 17, 18, 46, 82
Na década de 90, foram realizados alguns estudos em tumores sólidos pediátricos a
partir da observação de células não-hematológicas na medula óssea. 28,83,84
A seguir, alguns
estudos com o objetivo de acompanhar o acometimento medular metastático nestes pacientes
permitiram a identificação de proteínas úteis na caracterização de linhagem, principalmente
de neuroblastoma e tumor da Família Ewing.21-23,28,29
Em virtude da dificuldade técnica e
raridade do câncer pediátrico, os estudos até o momento se limitam à descrição de poucos
casos com análise de no máximo 4 marcadores por amostra.21-30
2.2.3.1 Estudos de Citometria publicados em Neuroblastoma
Com o advento do transplante de medula autólogo para pacientes com neuroblastoma
em estágio de doença avançado, o uso da citometria de fluxo, entre outras técnicas, foi
bastante difundido na pesquisa de células tumorais residuais na medula óssea e sangue
periférico de pacientes com neuroblastoma.21-23
Diferentes combinações de anticorpos monoclonais foram testadas com o objetivo de
obter uma maior especificidade. Komada et al em 199884
, utilizaram uma combinação de
CD9/CD56/CD45 para detecção de células residuais de neuroblastoma na medula óssea e
40
sangue periférico. Neste estudo, a análise simultânea através do uso de diferentes
fluorocromos evidenciou uma população celular distinta com o fenótipo CD9+/CD56
+/CD45
–
sugerindo a presença de células do neuroblastoma metastáticas. Outro estudo, desenvolvido
no Japão por Nagai et al28
, concluiu que CD81+/CD56
+/CD45
- era uma combinação mais
sensível e específica para detecção de doença residual mínima. Neste estudo, a reatividade do
CD81 foi comparada com a do CD9, demonstrando uma sensibilidade maior com a utilização
do CD81, devido, possivelmente, a interferência do CD9 na marcação de plaquetas, afetando
os resultados. Vale ressaltar, que nenhum destes estudos usou marcadores para descartar o
confundimento com células B, uma vez que os marcadores CD9 e CD81 podem estar
presentes em neoplasias hematológicas de células B, que devem ser descartadas pela ausência
de outros marcadores (CD79a, CD22, CD19), já que o CD45 pode ser, aberrantemente,
negativo nas neoplasias B imaturas. 87
Em 2002, Warzynski et al23
estudaram, também, a proteína de membrana
disialogangliosideo (GD2) e a enolase neuroespecífica intracitoplasmática (cyNSE) em
células de neuroblastoma, além de utilizarem marcadores já anteriormente descritos para
identificar estas células. Concluiram que as células de neuroblastoma são CD45-
/CD56+F
/GD2+/ cyNSE
+. Em 2005, o mesmo autor descreveu uma alteração na técnica para
detecção de GD2.85
Em 2005, Ocku et al21
propuseram a combinação
CD9FITC/CD56PE/CD45PerCP para a detecção de doença residual mínima em medula óssea
de pacientes com neuroblastoma. Encontraram uma sensibilidade de 6/105. Contudo, a
intensidade de expressão de CD9 nas células do neuroblastoma foi fraca, o que pode levar a
dificuldades técnicas na análise dos dados obtidos. Até o momento, não há estudos para
estabelecer um painel diagnóstico por citometria de fluxo multiparamétrica para
neuroblastoma em tumores frescos utilizando a histopatologia como padrão-ouro.
2.2.4.2. Estudos de Citometria Publicados em Rabdomiossarcoma
O rabdomiossarcoma, até o momento, possui poucas descrições fenotípicas por
citometria de fluxo, visto que sua infiltração metastática para medula óssea ocorre em menos
de 25% dos casos. Embora sua caracterização fenotípica por citometria de fluxo não tenha
sido amplamente explorada, a análise de DNA e proliferação celular foi considerada de
grande impacto prognóstico neste grupo de tumores. 17
Em 2003, Chang et al26
demonstraram
que é possível detectar a expressão de miogenina nuclear por citometria de fluxo,
descrevendo dois casos onde as células tumorais foram CD56+F
/CD57+/nuMiogenina
+. Em
41
2008 Bozzi et al88
, estudaram 30 amostras de medula óssea e sangue periférico de pacientes
com rabdomiossarcoma, utilizando uma combinação de 4 cores (CD45/CD56/CD57/CD90),
com o objetivo de identificar infiltração de células neoplásicas na medula óssea associado a
avaliação por PCR (reação de polimerase em cadeia) da Myf4. Neste estudo, ficou
demonstrada a eficiência deste painel para detecção de infiltração neoplásica na medula
óssea; entretanto, não foi possível a distinção entre rabdomiossarcoma e infiltração por
células de neuroblastoma, exceto quando da utilização conjunta do PCR para Myf4. Neste
mesmo ano, Gautam27
publicou um estudo comparativo entre imunocitoquímica e citometria
de fluxo com 37 amostras de tumores de células pequenas redondas e azuis. Entre as 37
amostras estudadas, 5 amostras eram de rabdomiossarcoma, e a proteína muscular utilizada
foi a desmina, sendo obtido uma concordância de 100% entre citoquímica e citometria de
fluxo nas 5 amostras estudadas.
2.2.4.3 Estudos de Citometria publicados em Tumores da Família Ewing
Em 1998, Gardner et al89
, identificaram a expressão de CD56/CD57 em 2 casos de
PNET sugerindo que, embora não específica, a expressão de CD56, juntamente com CD99,
na ausência do CD45, poderia ser altamente sugestiva de PNET. Em 2003, Chang et al26
descreveram um caso de Sarcoma de Ewing positivo para CD56, CD99, CD90 e CD117.
Recentemente, Dubois et al90
, descreveram o achado de células CD99+/CD45
- em amostras
de sangue periférico e medula óssea de pacientes com Sarcoma de Ewing.
2.2.4.4 Estudos em citometria publicados em Tumor de Wilms
Análises fenotípicas em tumor de Wilms foram, recentemente, publicadas a nível
experimental em estudos do desenvolvimento embrionário renal como modelo para
tumorigênese. 91,92
Em 2009, Pode-Shakked et al91
descreveram a expressão variada de
marcadores hematopoiéticos (CD34,CD117,CD133), mesenquimais (CD105,CD90, CD44) e
relacionados a câncer (CD133, MDR1) e a associação entre a positividade para NCAM
(CD56) e a fração de “células tronco tumorais”. Em 2010, Royer-Pokora92
et al descreveram
o estabelecimento e caracterização de 5 células de linhagem provenientes de tumor de Wilms
com mutação do WT1 quanto à expressão de genes e proteínas previamente descritos nas
células tronco mesenquimais e mesoderma paraxial (CD73,CD90 e CD105).
42
2.2.4.5 Estudos de Citometria publicados em Linfoma
Nos Linfomas não-Hodgkin de células B, a demonstração de clonalidade por
citometria de fluxo através da expressão das cadeias leves de imunoglobulina (Kappa e
Lambda) já foi muito bem estabelecida93
, assim como o perfil imunofenotípico de diversas
entidades clínicas aí incluídas (ex: Linfoma Folicular, Linfoma do Manto, Linfoma
Linfoblástico, etc)64,93,94,95
Dentre os Linfomas não-Hodgkin T, o Linfoma Linfoblástico T e
o Linfoma de Grandes Células Granulares também foram caracterizados
fenotipicamente.65,96,97
Em 2006, Mann G et al98
, analisaram suspensões celulares frescas de 56 crianças e
adolescentes com diagnóstico de Linfoma não-Hodgkin, através da técnica de citometria de
fluxo associada a citomorfologia. Em todos os 42 casos em que havia material de tumor
sólido disponível para análise, o diagnóstico preliminar por citometria de fluxo foi
confirmado por morfologia e imunohistoquímica.
Em 2011, Barrena S et al95
publicaram a análise comparativa entre citologia/histologia
X citometria de fluxo multiparamétrica de 448 amostras provenientes de punção aspirativa de
pacientes com suspeita de linfoma, utilizando a classificação da Organização Mundial de
Saúde para subclassificação das amostras malignas. Neste estudo, o grau de concordância
entre citologia e CFM foi de 93%, tendo sido mais sensível que a citologia no diagnóstico de
amostras não-neoplásicas (92-100% CFM x 64-94%citologia).
Nos Linfomas de Hodgkin, a população neoplásica representa apenas 0,01-1% do
total de células na amostra em meio a um rico infiltrado reacional policlonal.64
Esta
população neoplásica, chamada células de Reed-Sternberg, são reconhecidas por sua
morfologia característica.Uma característica única desta doença é a formação de rosetas entre
a célula de Reed-Setrnberg com linfócitos T.99,100
Sendo assim, o diagnóstico de Linfoma de
Hodgkin, até recentemente, era feito, exclusivamente, por análise morfológica. Nos últimos
20 anos, o acréscimo de imuno-histoquímica no diagnóstico de Linfoma de Hodgkin veio
acrescentar informações úteis adicionais ao diagnóstico: expressão de CD15 e CD30,
expressão variável de CD45, na ausência de CD20 e CD3; positividade para CD40 e CD95 na
grande maioria dos casos. 99
Embora a utilidade da citometria de fluxo no diagnóstico das
neoplasias hematológicas já tenha sido amplamente descrita, em linfoma de Hodgkin a
utilização de citometria de fluxo ainda é controversa. Conseqüentemente, a utilidade clínica
da citometria de fluxo, ainda, não foi demonstrada. 99
Em 2006, Fromm et al.100
, publicaram
um novo método de detecção de células de Reed-Sternberg a partir do bloqueio na ligação
43
entre linfócitos T e estas células pré-marcação. Neste estudo, dos 27 linfonodos positivos
para Linfoma de Hodgkin por morfologia, 18 foram corretamente classificados como
Linfoma de Hodgkin por citometria de fluxo, utilizando uma combinação de 10 cores
(CD15+/CD30
+/CD40
+/CD45
-/CD71
+/CD95
+/HLA-DR
+/CD3
-/CD20
-/CD19
-).
44
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral:
Construir uma estratégia diagnóstica por citometria de fluxo estruturada em duas
etapas: 1ª rastreamento e 2ª caracterização e diagnóstico diferencial de tumores sólidos
pediátricos; e, a seguir, comparar os resultados obtidos por citometria de fluxo
multiparamétrica (CFM) com os resultados do exame histopatológico, associado à
imunohistoquímica.
3.2 Objetivos Específicos:
a) Desenhar uma estratégia inicial de rastreamento para discernir por CFM;
a1) neoplasia maligna X doença reacional ou amostras normais;
a2) dentre as neoplasias malignas, discernir entre origem hematológica e não hematológica;
b) Desenhar uma estratégia para a segunda etapa de investigação: caracterização e diagnóstico
diferencial dos tumores sólidos pediátricos por CFM;
b1) Descrever a expressão fenotípica das seguintes proteínas nos tumores sólidos
pediátricos:CD3, CD4, CD7, CD8, CD9, CD10, CD15, CD19, CD20, CD22, CD30, CD34,
CD38, CD45, CD56, CD57, CD58, cyCD79a, CD81, CD90, CD99, CD117, CD271, nuTdt,
nuMiogenina, nuMYOD1,cy Bcl2, cyDesmina;
b2) Verificar quais destas proteínas são expressas com intensidades diferentes em cada tipo de
tumor estudado;
b3) Identificar e selecionar marcadores com maior poder discriminativo entre os diferentes
grupos tumorais;
c) Utilizar a análise de componentes principais como uma ferramenta de suporte para o
diagnóstico diferencial entre os seguintes tumores sólidos pediátricos; Neuroblastoma versus
PNET versus Rabdomiossarcoma;
d) Estabelecer o nível de concordância entre a CFM e o exame histopatológico associado à
imunohistoquímica (padrão-ouro atual).
45
4 METODOLOGIA
4.1 Desenho do Estudo:
Estudo transversal, descritivo e observacional.
4.2 População Estudada:
Pacientes matriculados no setor de oncologia e hematologia do Instituto de
Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira e Hospital dos Servidores do Estado com suspeita
de neoplasia maligna, submetidos a procedimento cirúrgico e/ou diagnóstico, no período de
novembro de 2009 a dezembro de 2011.
Um total de 52 amostras de 41 pacientes- 51,2% (21/41) meninos e 48,8% (20/41)
meninas foi coletado durante o período do estudo, correspondendo a 48 amostras obtidas ao
diagnóstico e 4 amostras em reavaliação pós-quimioterapia. A mediana de idade, no momento
de entrada no estudo, foi de 5 anos (1-14 anos). Um total de 34 amostras provenientes de
tecido, 12 amostras de medula óssea, 3 amostras de sangue periférico, 1 líquido ascítico e 2
amostras de urina fizeram parte do estudo. Todas as amostras foram submetidas a exame
histopatológico ou citológico e imunohistoquímica, quando indicado, exceto duas amostras de
sangue periférico.
46
Tabela 15. Diagnóstico Histológico dos Casos Estudados
DIAGNÓSTICO AMOSTRA Nº PACIENTE/AMOSTRA
Neuroblastoma Tumor
MO
SP
Linfonodo
5
7
1
1
2 pacientes-Tumor +medula
1paciente –Tumor+linfonodo
2 pacientes-tumor
1paciente-SP
5pacientes-MO
Rabdomiossarcoma Tumor
Urina
3
2
2 pacientes –tumor
1 paciente – tumor +urina
Tumor neuroectodermico
Primitivo
(PNET)
Tumor
MO
SP
2
1
1
1 paciente – tumor+MO+SP
1 paciente - tumor
Carcinoma de adrenal Tumor 1
Carcinoma de nasofaringe Tumor 1
Hemangiopericitoma Tumor 1
Disgerminoma Tumor
Líquido ascítico
2
1
1 paciente – tumor + líquido
ascítico
1 paciente- tumor
Linfoma de Hodgkin Tumor
MO
1
1
Linfoma não-Hodgkin Tumor
MO
SP
5
4
1
3 pacientes – tumor + MO
1 paciente – tumor + SP
1 paciente – tumor
1 paciente - MO
Tumor de Wilms Tumor 2
Processo inflamatório Massa abdominal
Partes Moles
Linfonodo
2
1
6
MO = medula óssea; SP = sangue periférico
4.2.1 Critérios de Inclusão:
a) Pacientes entre 0 e 18 anos com suspeita de neoplasia malígna que tenham sido submetidos
a procedimento diagnóstico ou de revisão pós-quimioterapia;
b) Pacientes cujos responsáveis consentiram com o estudo.
47
4.2.2 Critérios de Exclusão:
a) Pacientes com tratamento oncológico prévio em outra instituição.
4.3 Processamento da Amostra:
4.3.1 Pré-preparo das amostras de massas sólidas:
As amostras provenientes de procedimentos cirúrgicos foram coletadas em solução
fisiológica 0,9%, estéreis, imediatamente, após o procedimento. Este material foi transportado
em solução fisiológica 0,9% a 4°C até o laboratório de pesquisa, no IPPMG, onde foi
processado até 6h após a coleta.
No laboratório, as amostras de tumor sólido foram pesadas em placa de Petri estéril e
submetidas à dissociação mecânica, com o uso de pinça e duas agulhas 21G estéreis, para
individualização das células tumorais. A suspensão obtida foi filtrada em filtro de seringa
Filcon 100 mm estéril (BD Bioscience), para retirada de debris e pequenos fragmentos
resultantes da dissociação. Após a filtragem, a suspensão celular foi centrifugada a 540g por
10 min e o pellet ressuspendido em 300 l de phosphate buffered saline (PBS). A esta
suspensão foi adicionado 10 ml de Albumina 0,5% e centrifugado a 540g por 5min, com o
objetivo de retirar imunoglobulinas sobrenadantes. Ao final, o pellet foi ressuspendido em
300 l de PBS. Alíquotas de 30-100 l (aproximadamente 1x106 células) foram distribuídas
em tubos 12X75 mm para proceder à marcação.
4.3.2 Pré-preparo das amostras de medula óssea (MO), sangue periférico (SP) ou líquidos
corporais (LC)
As amostras provenientes de suspensões celulares, seja ele de medula óssea, sangue
periférico, urina, ou líquido pleural e ascítico, foram centrifugadas a 540g com 10 ml de
Albumina 0,5% por 5 min, seguido de ressuspensão do pellet em 300 l de PBS e distribuição
nos tubos 12X75 mm para marcação. As amostras de urina foram submetidas a 2 lavagens
com PBS a 540g por 5 min, com o objetivo de retirar a maior quantidade de urina possível,
restando apenas as células para análise. Na figura 8, podemos observar um esquema do pré-
preparo das amostras.
48
Figura 8. Esquema do pré-preparo das amostras analisadas
MASSA SÓLIDA MO/SP/LC
PESAR
dissociação CENTRIFUGAR
CENTRIFUGAR
suspensão celular
4.3.3. Marcação celular
Em todas as amostras, realizamos uma estratégia de processamento e análise
seqüencial. Na amostra recém recebida, realizamos uma fase inicial de orientação diagnóstica
com 2 tubos com combinações diferentes de anticorpos, cujo objetivo foi diferenciar entre
processo inflamatório, neoplasia hematológica e tumor sólido não-hematológico. A seguir,
utilizamos para: a) processo inflamatório reacional apenas os dois tubos iniciais (em 3 casos
realizamos a marcação celular completa com o objetivo de caracterização da expressão dos
marcadores estudados em populações celulares não tumorais); b) suspeita de neoplasia
hematológica de linhagem B- tubos para linfoma B + tubos para marcação de tumor sólido
não-hematológico; c) suspeita de tumor sólido não hematológico- tubos para caracterização de
tumor sólido. Ver tabela 16 abaixo.
MO-medula óssea
SP-sangue periférico
LC-líquidos corporais
49
Primeiro Passo: Tubo de orientação
PacB PacO FITC PE PePerCPCy5.5 PECy7 APC APC-
H7
cyCD3 UCHT1
BDBioscience
CD45 HI30Invitrogen
MPO MPO-7Dako
cyCD79a HM57Dako
CD34 8G12BD Bioscience
CD19 J3119BeckmanCoulter
CD7 124-
1D1eBioscinece
sCD3 SK7BD
Bioscience
CD20 2H7
eBioscience
CD45 HI30
Invitrogen
CD8/sIg Lymphoclonal
Cytognos
CD56/sIg Lymphoclonal
Cytognos
CD19/CD4 Lymphoclonal
Cytognos
CD56 N901/NKH1
Beckman Coulter
CD3 Lymphoclonal
Cytognos
Segundo Passo: Painel de anticorpos monoclonais para caracterização de tumor sólido pediátrico
CD20 2H7
eBioscience
CD45 HI30
Invitrogen
CD57 HNK-1
BD Bioscience
CD90 5E10
BD Bioscience
CD34 8G12
BD Bioscience
CD56 N901/NKH1
Beckman Coulter
Epcam EBA-1
BD Bioscience
CD45
HI30
Invitrogen
CD99 TÜ12
BD Bioscience
CD81 JS-81
BD Bioscience
CD9 M-L13
BD Bioscience
CD56 N901/NKH1
Beckman Coulter
CD117 104D2
BD Bioscience
CD45
HI30
Invitrogen
CD58 1C3
BDBioscience
CD38 HB-7
BD Bioscience
CD56 N901/NKH1
Beckman Coulter
CD10 HI10A
BD Bioscience
CD45
HI30
Invitrogen
CD271 C40-1457
BD Bioscience
CD56 N901/NKH1
Beckman Coulter
E quarto tubos com um único anticorpo + rabbit anti-IgG FITC:
nuMYOD
Moab 5.8ª
BD Bioscience
nuMyogenin F5D
BD Bioscience
GD2 14.G2a
BDBioscience
nuDesmina RD301
BD Bioscience
Segundo passo: Painel com anticorpos monoclonais para caracterização de Linfoma B
CD45
HI30
Invitrogen
nuTdt HT6
Dako
CD34 8G12
BD Bioscience
CD19 J3119
BeckmanCoulter
CD22 S-HCL-1
BD Bioscience
CD20 2H7
eBioscience
CD45 HI30
Invitrogen
cyBcl2 124
Dako
CD38 HB-7
BD Bioscience
CD34 8G12
BD Bioscience
CD19 J3119
BeckmanCoulter
CD10 HI10A
BD Bioscience
CD45
HI30
Invitrogen
cyIgM polyclonal rabbit serum
Dako
CD34 8G12
BD Bioscience
CD19 J3119
BeckmanCoulter
CD21 LT-21
Exbio
CD45 HI30
Invitrogen
CD15/CD65 MMA/88H7
BDBioscience/Beckman
Coulter
NG2 124
BeckmanCoulter
CD34 8G12
BD Bioscience
CD19 J3119
BeckmanCoulter
CD123 AC145
MiltenyiBiotec
Segundo Passo: painel para caracterização de Linfoma T ou Anaplásico
cyCD3 UCHT1
BD Bioscience
CD45 HI30
Invitrogen
nuTdt HT6
Dako
CD56 C5.9
Cytognos
CD4 8K3
BDBioscience
CD8 SFCI21Thy2D3
Beckman Coulter
CD7 124-1D1
eBioscinece
sCD3 SK7
BD
Bioscience
cyCD3 UCHT1
BD Bioscience
CD45 HI30
Invitrogen
nuTdt HT6
Dako
CD99 TÜ12
BD Bioscience
CD5 L17F12
BDBioscience
CD1a HI149
BDBioscience
sCD3 SK7
BD
Bioscience
cyCD3 UCHT1
BD Bioscience
CD45 HI30
Invitrogen
CD2 RPA-2.10
BDBioscience
CD117 104D2
BDBioscience
CD4 8K3
BDBioscience
CD8 SFCI21Thy2D3
Beckman Coulter
CD7 124-1D1
eBioscinece
sCD3 SK7
BD
Bioscience
HLA-DR L243
Biolegend
CD45 HI30
Invitrogen
CD13 L138
BDBioscience
CD4 8K3
BDBioscience
CD8 SFCI21Thy2D3
Beckman Coulter
CD123 AC145
MiltenyiBiotec
sCD3 SK7
BD
Bioscience
Segundo Passo: Painel de anticorpos monoclonais para caracterização de Linfoma de Hodgkin,Linfoma T
ou Linfoma Anaplásico*
CD20 2H7
eBioscience
CD45 HI30
Invitrogen
CD15 MMA
BD Bioscience
CD30 BerH8
BD Bioscience
CD5 L17F12
BD Bioscience
CD56 N901/NKH1
Beckman Coulter
CD10 HI10A
BD Bioscience
Tabela 16. Painel de anticorpos monoclonais utilizados de acordo com a seqüência de
investigação e a origem celular do tumor
PacB- pacific blue, PacO-pacific Orange, FITC- fluorescein isothiocyanate, PE-phycoerythrin, PerCPcy5.5- peridinin chlorophyll protein-cyanin die 5.5, PE-cy7- phycoerythrin-cyanin die 7, APC- allophycocyanin,
APCH7- allophycocyanin- Hilite7
50
a)
b)
a)Marcação de membrana: após a distribuição das alíquotas da amostra em cada tubo,
iniciamos a distribuição dos anticorpos monoclonais (AC) dispostos numa combinação de
até 8 cores em cada tubo como mostra a tabela 16, sendo incubados no escuro por 15 min
à temperatura ambiente (TA). Após este período de incubação, a alíquota foi incubada
com 2 ml da solução de lise de hemácias FACSlysing (BD Bioscience) diluída 1:10 em
água destilada, por 10 minutos, à TA, no escuro. A seguir, as células foram lavadas com 2
ml de PBS, centrifugadas a 540g por 5 min e ressuspendidas em 300 l de PBS. A
mensuração foi feita imediatamente após a ressuspensão do pellet. Juntamente aos tubos
marcados, seguiu-se um tubo controle não marcado para obtenção de um padrão negativo
controle no canal de fluorescência estudada.
b)Marcação intracelular: Após a incubação com os marcadores de membrana, as células
foram lavadas com 2 ml de PBS e centrifugadas a 540g por 5 min. A seguir, foram
ressuspendidas em 100 l da solução A do reagente Fix and Perm (Invitrogen, Carlsbad,
CA) e incubadas por 15 minutos no escuro à TA. Após este período, foram lavadas com 2
ml de PBS, centrifugadas a 540g por 5 minutos e incubadas com 100l da solução B do
reagente Fix and Perm (Invitrogen, Carlsbad, CA) associada aos anticorpos monoclonais
por 15 minutos, no escuro, à TA. Por último, as células foram lavadas com 2 ml de PBS,
centrifugadas a 540g por 5 minutos e ressuspendidas em 300 l de PBS. A mensuração foi
feita, imediatamente, após a ressuspensão do pellet. Para a marcação de AC não
conjugados com fluorescência, após o procedimento de marcação descrito, procedemos a
uma segunda incubação com o anticorpo secundário FITC isotipo IgG anti-mouse,
NEOPLASIA HEMATOLÓGICA NEOPLASIA NÃO-HEMATOLÓGICA
TUBOS TUMORES SÓLIDOS
TUBOS LINFOMA T
E ANAPLÁSICO
TUBOS LINFOMA B
E ANAPLÁSICO
Em caso de célula T Em caso de célula B
TUBO DE RASTREAMENTO
+
ESTUDO DE LINFÓCITOS
51
acompanhado de um tubo controle negativo, contendo apenas a marcação com o anticorpo
da segunda camada.
4.4 Aquisição e análise dos dados gerados por citometria
As alíquotas marcadas foram adquiridas imediatamente após a marcação, através do
citômetro de fluxo FACS Canto II ( BD Bioscience), no programa de aquisição de dados
FACS DiVA (BD Bioscience). Um mínimo de 104céls/tubo foram adquiridas (na maioria
dos casos adquirimos 5x104/alíquota). A análise foi feita no programa de análise de dados
INFINICITY (Cytognos/Salamanca/Espanha).
A viabilidade celular das amostras de tumor sólido foi verificada pela técnica de
“backgate”, onde são selecionadas apenas as células neoplásicas e delas retirada a população
não viável. Na figura 9 observamos um modelo de seleção de células viáveis pela técnica de
“backgate”.
Figura 9. Seleção das células neoplásicas viáveis em amostra de neuroblastoma
100% 25%
100% 71,4%
%
71,4%
%
SS
C
SS
C
CD
56
CD
56
C
D56
FSC-A FSC-A
CD45 CD45
CD45
52
4.5 Preparo dos dados para realização de fusão e cálculo dos dados obtidos por citometria
de fluxo
Para cada paciente, foi realizado um cálculo proveniente da junção computacional de
todos os tubos adquiridos em um único arquivo, com o objetivo de tornar possível a
visualização de todos os parâmetros aferidos por amostra processada. Para tal, selecionamos
as células neoplásicas com parâmetros comuns em cada tubo (FSC,SSC,CD45 e CD56)
utilizando o programa INFINICITY (Cytognos). Somam-se a estes marcadores, um
conjunto de outros marcadores presentes diferentemente em cada tubo. As informações
correspondentes as células neoplásicas selecionadas foram armazenadas em um novo arquivo
correspondendo a cada tubo adquirido. Em seguida, a informação, em cada tubo, dos „valores
faltantes‟ – valores dos parâmetros que não estão de fato medidos nas células contidas em
uma ou em várias alíquotas- são calculados para todo o painel de marcadores utilizado, para
cada um dos eventos utilizando-se o principio estatístico dos „vizinhos-mais-próximos‟102
Na
figura 10 observamos uma representação esquemática da estratégia de análise e fusão dos
dados.
Figura 10. Fusão dos dados relativos à expressão da proteína nuMYOD1 dos pacientes
com neuroblastoma, rabdomiossarcoma e PNET
A)
B)
C)
D)
53
Figura 10. Fusão dos tubos contendo a proteína nuMYOD1 de diferentes amostras para
posterior análise comparativa entre neuroblastoma, PNET e rabdomiossarcoma. A) As células
neoplásicas de diferentes amostras de neuroblastoma foram selecionadas quanto a expressão
ou não de nu MYOD, e, posteriormente, fusionadas em virtualmente um único tubo contendo
as informações dos diferentes pacientes quanto a expressão de nuMYOD. B) Amostras de
PNET fusionadas, virtualmente, em um único tubo. C) Amostra de rabdomiossarcoma
fusionadas, virtualmente, em um único tubo. D) Diagrama de caixas representando a
distribuição dos eventos de cada grupo tumoral. O traço preto no meio das caixas corresponde
à mediana dos dados, os limites superior e inferior da caixa representam o percentil 75 e 25,
respectivamente, e as barras externas à caixa representam os limites superior e inferior dos
dados.
4.6 Análise do Componente Principal (PCA) dos tumores pediátricos de pequenas células
redondas e azuis mais comuns
Para aplicação da análise do componente principal, foram criados três grupos de
referência (Neuroblastomas, PNETs e Rabdomiossarcomas), dentro das amostras do estudo.
Este grupo de tumores foi escolhido por 2 razões principais: fazem parte dos tumores de
células pequenas redondas e azuis de difícil caracterização morfológica e são os tumores
sólidos extracranianos não-hematopoiéticos mais comuns nesta faixa etária. A análise do PCA
e visualização gráfica a partir do “automated population separator” no programa
INFINICITY (Cytognos) gera dois eixos principais, o primeiro (X) e o segundo (Y)
componentes principais, produzidos por uma representação gráfica bidimensional do perfil
imunofenotípico estudado. Cada componente principal é uma combinação linear de
parâmetros com pesos distintos, permitindo uma representação bidimensional contendo os
parâmetros de maior relevância.102
Na figura 11 observamos uma representação esquemática
da fusão dos dados com posterior análise do componente principal em diferentes amostras de
neuroblastoma e PNET
54
Figura 11. Análise do Componente Principal de Neuroblastoma e PNET
Figura 11. Inicialmente, fazemos um “gate” na população de células blásticas analisadas, a
seguir é criado um arquivo contendo, virtualmente, toda a informação de expressão antigênica
desta célula em um único tubo. Estes tubos são, então, agrupados em um arquivo de
referência da patologia analisada. O mesmo é feito com os diferentes grupos de patologia,
como mostra a figura do neuroblastoma e PNET. A seguir, é realizada a análise do
componente principal (PCA): classificação não-supervisionada dos diferentes grupos de
patologia. Esta análise pode ser representada pela média da população expressa na figura
acima como pontos.
4.7 Análises Histopatológicas e Imuno-histoquímicas
Todas as amostras analisadas foram submetidas a diagnóstico convencional com
morfologia e imuno-histoquímica, exceto as duas amostras de sangue periférico. Todas as
amostras de tumores sólidos/linfoma foram revisadas por dois patologistas, de forma
independente. Com o objetivo de correlacionar os dados obtidos por citometria de fluxo,
foram realizados, além da marcação convencional com cromogranina, NB84, sianptofisina e
miogenina, sistematicamente a análise no tecido dos seguintes marcadores: CD99 e
nuMYOD1.
CD
56
CD
56
CD45
CD99
55
4.8 Outros Métodos Estatísticos
Para todas as variáveis contínuas, valores da média e mediana, assim como seu desvio
padrão juntamente com o percentil 25 e 75 e 95% de intervalo de confiança, foram calculados
usando o programa SPSS (versão 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Para variáveis
categóricas, utilizamos freqüência. A fim de estabelecer a significância estatística das
diferenças observadas entre os grupos, o teste de Mann-Whitney U e o teste de χ2 foram
usados para variáveis contínuas e categóricas, respectivamente. O número de verdadeiro
positivo (VP; amostras com a presença de uma população de células de tumor detectado por
ambos - técnicas de diagnóstico convencionais e citometria de fluxo), verdadeiro-negativo
(VN; amostras sem população de células de tumor, conforme medido pelos métodos
convencionais e citometria de fluxo) , falso-positivo (FP; amostras com a presença de uma
população de células de tumor por citometria de fluxo não detectado pelos métodos de
referência) e os resultados falsos negativos (FN; amostras com indetectáveis células tumorais
por citometria de fluxo, mas positiva pelas abordagens de referência), foram calculados. A
sensibilidade e a especificidade foram definidos como FN + VP / VP e VN / VN + FP,
respectivamente, enquanto os valores preditivos positivos (VPP) e negativo (VPN) foram
calculados como FP + VP / VP e VN / VN + FN, respectivamente.
56
5 RESULTADOS
5.1 Dados Descritivos da População e amostras estudadas:
A mediana de viabilidade celular foi 75% para todas as amostras analisadas, com
84,6% das amostras apresentando viabilidade superior a 50%. Para melhor avaliação da
morfologia celular e identificação da viabilidade celular, após dissociação mecânica, foram
realizados imprint e citospin das amostras analisadas. Na figura 12, observamos exemplos de
imprint e citospin de duas amostras analisadas.
Figura 12. Morfologia celular de duas amostras analisadas
Figura 12. Análise da morfologia celular com coloração em meio Grünwald-Giemsa e HE. A)
Pré-dissociação mecânica: imprint da amostra de neuroblastoma evidenciando aglomerado
celular de células pequenas redondas e azuis com morfologia preservada B) Pós-dissociação
mecânica: citospin de amostra de neuroblastoma, submetida a dissociação mecânica,
evidenciando morfologia de células pequenas redondas e azuis preservada.
5.2 Comparação entre as técnicas: Histopatológico e Imunohistoquímica versus Citometria
de Fluxo
Todas as amostras estudadas foram analisadas sem conhecimento prévio do
diagnóstico histopatológico, visto que o processamento foi realizado no dia da coleta do
material. Nossa hipótese diagnóstica foi guiada por estudos, previamente, descritos e
comparação entre nossas amostras. De modo geral, um acordo de 100% foi atingido para as
A) B)
57
17 amostras reativas / inflamatórias e não-infiltradas por células tumorais, enquanto a
concordância de 92% (23/25 amostras) foi conseguida por CFM, para amostras infiltradas por
células tumorais com descrição fenotípica prévia por CFM. Nos tumores onde não havia
descrição prévia por citometria de fluxo, a concordância não pode ser avaliada. Na tabela 17,
podemos observar a concordância entre os resultados da citometria de fluxo versus o resultado
do histopatológico+imunohistoquímica.
A análise histopatológica foi realizada no Hospital de origem do paciente e revistos no
Serviço de Anatomia Patológica do HUCFF. A avaliação morfológica do material enviado
guiou os estudos imuno-histoquímicos. Os marcadores utilizados no painel imuno-
histoquímico foram: LCA, cromogranina, vimentina, desmina, miogenina, NSE, sinaptofisina,
NB84, CD99, CD20,CD10,Ki-67, S-100, AE1/AE3, EMA, CD3, HHF35.
Tabela 17. Análise Comparativa entre diagnóstico patológico dos tumores não-
hematopoiéticos por citometria de fluxo e técnica diagnóstica padrão ouro
Diagnóstico Final
No. de
amostras
Total=49§
No. de casos
Concordância com CFM
Neuroblastoma 11 11/11
Gaglioneuroblastoma 1*
Sarcoma de Ewing/PNET 2 2/2
Rabdomiossarcoma 4 4/4
Carcinoma de adrenal 1*
Carcinoma de Nasofaringe 1*
Tumor de Células Germinativas
Tumor de Wilms
3*
2*
Linfoma Hodgkin 1 0/1
Linfoma não-Hodgkin 7 6/7
Reacional/ausência de malignidade 16 16/16
§Excetuando-se os três sangues periféricos onde não é possível a comparação com o
histopatológico*Primeira descrição por citometria de fluxo com esta combinação de anticorpos
monoclonais
58
5.2.1 Identificação de amostras reacionais X malignas:
Nove amostras (17,3%) reacionais e 8 amostras (15,3%) negativas para malignidade- 2
MO de pacientes com neuroblastoma, 1 SP e 1 MO de um paciente com PNET, 3 MO de 3
pacientes com linfoma e 1 urina de 1 paciente com rabdomiossarcoma- foram estudadas por
citometria de fluxo. De grande relevância, a citometria de fluxo atingiu uma concordância de
100% com o resultado histopatológico, em todas as amostras reacionais ou negativas para
malignidade (17/17). Dentre as amostras malignas, 2/35 (5,7%) foram, erroneamente,
consideradas como reacionais (1 Linfoma de Hodgkin esclerose nodular,1 Linfoma
Anaplásico). Em ambos os casos, a observação de um rico infiltrado inflamatório policlonal,
na ausência de anticorpos monoclonais direcionados para melhor caracterização destas
patologias, impossibilitou a correta classificação das mesmas. Conseqüentemente, todas as
amostras infiltradas por tumores sólidos e por linfomas de células B ou T foram corretamente
identificadas. Portanto, uma eficiência global de 96% com uma especificidade de 100% ,e
sensibilidade de 94%, foram alcançadas (VPP de 100% e VPN de 90%).
Trinta e três amostras malígnas (94,2%) foram corretamente identificadas. Destas
amostras, 14/33 -11 amostras de neuroblastoma, 1 ganglioneuroblastoma e 2 PNET
apresentavam uma população aberrante com CD45-/CD56
+F, na ausência de marcadores
linfóides ou mielóides, claramente identificada no segundo tubo de orientação (vide tabela
16). Nas 7/8 amostras de linfoma não-Hodgkin corretamente classificadas– 3 linfomas de
Burkitt, 2 linfomas linfoblásticos e 2 linfomas T associado ao EBV- os tubos de orientação
foram úteis para a identificação de possível população aberrante clonal (linfoma de Burkitt-
clonalidade para cadeia leve Kappa ou Lambda no segundo tubo; Linfoma Linfoblástico- 51%
de células CD19 positivas com cyCD79a aberrantemente negativo no primeiro tubo de
orientação; Linfoma T associado ao EBV – 79% de células T sCD3+/cyCD3
+/CD4
+/CD7
-).
Nas 12/33 amostras restantes, identificadas como malignas – 4 rabdomiossarcomas, 2
Tumores de Wilms, 3 tumores de células germinativas, 1 carcinoma de nasofaringe, 1
carcinoma de adrenal e 1 hemangiopericitoma- a identificação de uma população CD45- nos
tubos de orientação foi melhor caracterizada com a utilização do painel completo. Na figura
13, podemos observar a clara diferença entre 1 amostra reacional e 1 uma amostra de Linfoma
de Burkitt.
59
Figura 13. Análise fenotípica por citometria de fluxo de linfoma não-Hodgkin X
amostra reacional Gráficos representando apenas as células B de interesse, sendo feito a
seleção por SSC/CD19+. A) Amostra proveniente de massa abdominal em paciente com
Linfoma de Burkitt apresentando fenótipo: CD45+/CD19
+/CD22
+CD10
+/CD20
+f/
CD38+F
/cyBcl2-/sIgλ
+/sIgκ
-. B) Amostra proveniente de adenomegalia em paciente em
investigação para Linfoma apresentando fenótipo compatível com amostra reacional:
CD45+/CD19
+/CD22
+/CD10
-/CD20
+F CD38
-/+/cyBcl2
-/sIgλ
+/sIgκ
+
A)
B)
60
5.2.2 Identificação de amostras malignas hematológicas versus malignas não-
hematológicas:
Um total de 9/52 (17,3%) amostras de linfoma e 26/52 ( 50%) amostras de tumores
sólidos não-hematológicos foram analisados em nosso estudo. Todas as neoplasias
hematológicas apresentavam CD45 positivo na presença de 1 ou mais marcadores de
linhagem linfóide B ou T associado. Todos os tumores sólidos não-hematológicos foram
negativos para CD45 e para antígenos linfóides ou mielóides. Em 18/26 tumores sólidos não-
hematológicos, a identificação de células hematológicas infiltrando o tecido tumoral pode ser
claramente caracterizada, podendo ser útil como controle intra-amostral para o CD45 e os
antígenos linfóides e mielóides, assim como fornecer informações valiosas quanto à resposta
inflamatória intra-tumoral. Na tabela 18, evidenciamos os diferentes graus de infiltração
inflamatória nos diferentes tipos histopatológicos.
Tabela 18. Infiltração Inflamatória Intra-tumoral
Patologia Linfócitos T(%)
CD4 CD8
Linfócitos T(%)
CD4/CD8 -
Linfócitos
T(%)
CD4/CD8 +
Linfócitos
B(%)
Neutrófilos
Neuroblastoma 17,7
63,9 30
5,0 1,1 5
6,8
Ganglioneuroblastoma 1,42
62 30,5
6,9 0,6 - 0,8
PNET 18
22,5 67,9
5,3 4,3 0,2
17,6
Tumor de Wilms 1,4
14,5 65,5
15 5 0,2 0,8
CA de adrenal 5,3
32,7 59
8,3 - 2,5 2,6
CA de nasofaringe 17
61,1 38,9
- - 7 4,6
TCG 8,3
47,1 42,1
10 0,6 1,5 1,6
61
5.2.3 Características Imunofenotípicas dos tumores sólidos pediátricos
Trinta e cinco amostras (67,3%), contendo infiltração por células neoplásicas, foram
analisadas por citometria de fluxo quanto à expressão de 30 diferentes proteínas celulares.
Das 30 proteínas estudadas, 19 (36,5%) foram consideradas de grande utilidade para
diferenciação e classificação dos grupos de patologias, como mostra a tabela 19. Embora
muitas proteínas possam ser expressas em diversos tipos de tumores, existem algumas que
parecem possuir algum poder discriminativo: nuMYOD e nuMiogenina só foram
identificadas em rabdomiossarcoma; a positividade para CD99 é altamente sugestiva de
PNET e a alta expressão da proteína GD2 parece estar fortemente correlacionada com o
neuroblastoma. Um único tumor apresentou positividade forte para CD34, sendo este tumor
de origem vascular (hemangiopericitoma).
Tabela 19 Expressão das diferentes proteínas estudadas nos tumores sólidos pediátricos
PATOLOGIA
CD
45
CD
56
CD
90
CD
99
CD
9
CD
81
CD
57
MY
OD
1
MY
OG
EP
CA
M
CD
271
GD
2
CD
117
CD
34
CD
38
CD
58
CD
10
CD
19
SC
D3
NEUROBLASTOMA
PNET
RABDOMIOSSARCOMA
LINFOMA NÃO-HODGKIN B
TUMOR DE WILMS
CARCINOMA DE ADRENAL
CARCINOMA DE NASOFARINGE
DISGERMINOMA
HEMANGIOPERICITOMA
Expressão heterogênea Negativo
Postivo fraco Positivo forte
5.2.3 Resultados encontrados em neuroblastoma
Um total de 14 amostras de 11 pacientes com neuroblastoma foi submetido à análise
por citometria de fluxo. Das amostras analisadas, 11/14 (78,5%) apresentaram infiltração por
células malignas com mesmo padrão de expressão antigênica CD56+F
/CD45-
/CD9+/CD81
+F/CD90
+F e expressão heterogênea de CD57, CD58, CD271 e GD2 (figura 10A
62
e 10B). A amostra de sangue periférico, obtida de uma paciente com neuroblastoma
metastático, apresentou 0,15% de células com fenótipo compatível com neuroblastoma CD56-
/+/CD45
-/CD9
+/CD81
+F, porém com CD90
-. Relevantemente, o único caso de
ganglioneuroblastoma apresentou 2 populações distintas em tamanho, complexidade e
imunofenótipo: 39% com fenótipo semelhante ao descrito anteriormente e 61% com maiores
características de dispersão da luz (FSC e SSC) e maior intensidade média de fluorescência de
CD56,CD57 e CD81.(Figura 10C) Nenhuma marcação para MYOD1, Miogenina, CD3,
CD10, CD19, CD20, CD34, CD38, CD45 e CD99 foi encontrada entre as amostras de
neuroblastoma estudadas. Apenas as amostras de neuroblastoma em medula óssea e um caso
em tumor foram positivos para CD117, em uma subpopulação, sendo a amostra tumoral
considerada indiferenciada pela patologia. Na figura 14 observamos a análise morfológica e
por citometria de fluxo de 1 caso de neuroblastoma.
Figura 14. Morfologia e imuno-histoquímica com cromogranina positiva (aumento de
40x ) e análise fenotípica por citometria de fluxo de Neuroblastoma
A)
63
B)
C)
D)
64
Figura 14: A) Morfologia celular com coloração HE x40 de amostra de neuroblastoma
evidenciando proliferação de células de tamanho intermediário, núcleos hipercromáticos e
redondos, escasso citoplasma dispondo-se em grupos, em algumas áreas, formando as
pseudorosetas de Homer Wright.B) Coloração por imunohistoquímica com cromogranina
evidenciando positividade nas células de interesse. C e D)Todos os gráficos representam
apenas as células tumorais selecionadas a partir de sua negatividade para CD45 e forte
expressão de CD56.C) Amostra dissociada de massa adrenal em paciente com neuroblastoma,
evidenciando uma população de células tumorais CD45-/CD56
+F/ CD90
+F/
CD81+/CD9
+het/GD2
+. D) Evidência de comprometimento metastático da medula óssea no
mesmo paciente, identificando 64% de células tumorais com mesma expressão fenotípica.
E)Amostra dissociada de massa retroperitoneal em paciente com ganglioneuroblastoma,
evidenciando duas populações celulares distintas em CD56,CD81 e por análise do
componente principal.
5.2.3.2 Resultados encontrados em Rabdomiossarcoma
Foram analisadas um total de 5 amostras de 3 pacientes com rabdomiossarcoma, todos
classificados segundo a OMS como rabdomiossarcoma embrionário pela patologia. Em 1
paciente foi possível a análise pré-e e pós-quimioterapia e ambas apresentaram nuMYOD1+F
diferindo apenas na expressão dos marcadores de membrana (CD56/CD90 e CD81) positivos
na amostra pré-quimioterapia e negativos na amostra pós. No outro paciente 2 amostras foram
analisadas quanto à presença de células neoplásicas (massa e urina) apresentando o mesmo
padrão de expressão antigênica (CD45-/CD56
+f/CD90
+/nuMiogenin
+F/nuMYOD1
+F). (figura
15A e 15B) Uma amostra de urinanálise, proveniente de 1 paciente com rabdomiossarcoma
pélvico, não evidenciou infiltração por células neoplásicas e, sim, grande número de
E)
65
granulócitos (MPO+F
/CD45). Resultado concordante com a clínica e análise citopatológica de
infecção urinária e ausência de infiltração neoplásica na bexiga. (figura 16 B )
Figura 15. Análise fenotípica por citometria de fluxo de Rabdomiossarcoma
Figura 15: Todos os gráficos representam apenas as células tumorais selecionadas a partir de
sua negatividade para CD45 e expressão heterogênea de CD56. A) Amostra dissociada de
massa intravesical em paciente com rabdomiossarcoma embrionário, evidenciando população
de células tumorais CD45-/CD56
+het/CD90
+f/CD81
+het/CD9
+het/nuMYOD1
+F. B) Evidência de
células tumorais em análise de urina do mesmo paciente com expressão antigênica semelhante
a massa tumoral.
Figura 16. Análise de urina por citometria de fluxo em dois pacientes com
rabdomiossarcoma pélvico.
A)
B)
A)
66
Figura 16. Análise comparativa entre duas amostras de urina provenientes de dois pacientes
com suspeita de infiltração neoplásica da bexiga. A) Urina com citologia positiva para
malignidade confirmada por citometria de fluxo onde evidenciamos uma população de células
malignas com fenótipo compatível com rabdomiossarcoma CD45-/CD56
+f/
CD81-/+
/CD9+f
/nuMYOD1+F
. B) Urina com citologia negativa para células neoplásicas
confirmada por citometria de fluxo onde evidenciamos infiltração por células inflamatórias
CD45+ ( 60,7%MPO
+, 38,5% sCD3
+ e 0,8% CD19
+)
5.2.3.4 Resultados encontrados em Tumor Neuroectodérmico Primitivo
Quatro amostras de 2 pacientes com tumor neuroectodérmico primitivo foram
analisadas, sendo 2 massas sólidas, 1 SP e 1 MO. Dentre estas amostras, duas apresentaram
infiltração por células malignas com mesmo padrão de expressão antigênico com CD45-
/CD56+hi
/CD90+/CD271
+/CD99
+ e expressão variável de CD9/CD81 e CD117 (10% da
população positiva para CD117 em uma amostra). Em um paciente foram evidenciadas duas
subpopulações: a primeira com o padrão descrito acima e a segunda com uma expressão de
CD99+F
/CD56+/CD90
+/CD271
+/CD81
+F. (figura 17C) Uma amostra de medula óssea e uma
de sangue periférico encaminhada para avaliação de metástase não evidenciou doença com
confirmação do resultado da MO por histopatológico. Nenhuma das amostras apresentou
expressão de nuMYOD1, nuMiogenina ou de antígenos linfocitários. Uma amostra
apresentou expressão fraca de GD2.
B)
67
Figura 17. Morfologia (aumento de 10x e 40x) e análise fenotípica por citometria de
fluxo de Tumor Neuroectodérmico Primitivo
A)
B)
68
Figura 17: A) Morfologia celular com coloração HE x10 de amostra de PNET evidenciando
perda da arquitetura tecidual com áreas de proliferação de células de tamanho intermediário e
algumas áreas de fibrose tecidualB) Morfologia celular com coloração HE x40 de amostra de
PNET evidenciando células de tamanho intermediário com núcleo redondo, hipercromático e
citoplasma escasso. C) Todos os gráficos representam apenas as células tumorais selecionadas
a partir de sua negatividade para CD45 e alta expressão de CD56. Amostra dissociada de
massa retroperitoneal de paciente com tumor neuroectodérmico primitivo, evidenciando duas
subpopulações de células tumorais CD45-/CD56
+F/CD90
+/CD81
+het /CD9
+/CD99
+F
5.2.3.5. Resultados encontrados em Tumor de Wilms
Duas amostras, 1 tumor de Wilms metastático e 1 tumor de Wilms bilateral foram
analisadas por citometria de fluxo. Ambas amostras apresentavam fenótipo CD45-
/CD56+F
/Epcam+F
/CD81+/CD9
-/+ , com expressão heterogênea de CD90/ GD2/ CD271. As
proteínas nuMYOD1 e nuMiogenina, assim como os antígenos linfocitários, foram negativos
em ambos os casos. Figura 18.
Figura 18. Análise fenotípica por citometria de fluxo de Tumor de Wilms
C)
69
Figura 18. Todos os gráficos representam apenas as células tumorais, selecionadas a partir de
sua negatividade para CD45 e alta expressão de CD56. Amostra proveniente de massa renal
bilateral evidenciando fenótipo CD45-/CD56
+F/CD81
+/CD9
-/+/Epcam
+F/CD271
+
5.2.3.6 Resultados encontrados nos Linfomas
Um total de 12 amostras de 8 pacientes com linfoma ( 6 massas, 5 MO e 1 SP). Destas
amostras, 3/12 (25%) foram negativas para malignidade (3 MO) por citometria de fluxo,
resultado confirmado por histopatológico. Todos os casos de Linfoma foram classificados
segundo a OMS, sendo: 1 Linfoma de Hodgkin subtipo esclerose nodular; 1 Linfoma
Anaplásico; 3 Linfomas de Burkitt; 2 Linfomas Linfoblásticos B e 2 Linfomas T associados
ao EBV. Como descrito anteriormente, os casos de Linfoma de Hodgkin e Linfoma
Anaplásico foram, erroneamente, classificados como amostra reacional. As três amostras de
Linfoma apresentaram resultado concordante com o histopatológico com fenótipo:
CD45+/CD56
-/cyCD79a
+/CD19
+/CD22
+/CD9
+/CD38
+F/ CD20
+F/CD10
+F/nuTdt
+, associados a
ausência de cyBcl2 e expressão clonal de cadeia leve da imunoglobulina (2 Lambda e 1
Kappa). Figura 19C. As duas amostras de Linfoma Linfoblástico B foram, corretamente,
classificadas por citometria de fluxo com fenótipo: CD45+/CD56
-/cyCD79a
+/CD19
+/CD22
-
/CD9+/CD38
+/CD58
+/CD81
+/CD20
+/CD10
-/nuTdt
+/cyBcl2
+/cyIgM
-/sIgλ
-/sIgκ
-. Duas
amostras de 1 paciente com relato prévio de infecção por vírus Epstein-Bar (EBV) (1SP e 1
linfonodo) apresentaram fenótipo compatível com neoplasia maligna T madura, sendo
corretamente, classificada como Linfoma T associado ao EBV: CD45+/CD56
-
/sCD3+/cyCD3
+/CD7
-/CD4
+/CD8
-/CD99
+/ nuTdt
-/CD34
-/CD57
-/CD1a
-/CD123
-.Figura 19D.
70
Figura 19. Morfologia (aumento de 10x e 40x) de linfoma Linfoblástico B e análise
fenotípica por citometria de fluxo de Linfoma Linfoblástico B e Linfoma T associado ao
EBV
B)
A)
71
Figura 19. A e B) Morfologia celular com coloração HE x10 e HE 40x de amostra de
Linfoma Linfoblástico B evidenciando perda da arquitetura tecidual com proliferação difusa
de células de tamanho intermediário, cromatina suja com nucléolos inconspicuous C e D)
Todos os gráficos representam apenas células tumorais selecionadas. C) Amostra proveniente
de linfonodo inguinal em paciente com diagnóstico de Linfoma Linfoblástico B com fenótipo
por citometria de fluxo: CD19+/nuTdt
-/CD22
-/cyBcl2
+/CD10
-. D) Amostra proveniente de
linfonodo cervical em paciente com diagnóstico de Linfoma T associado ao EBV com
fenótipo por citometria de fluxo: sCD3+/cyCD3
+/CD7
-CD4
+CD8
-/CD5
+
5.2.3.7 Resultados encontrados nos tumores sólidos pediátricos menos freqüentes
Cinco tumores pediátricos (5/35) menos freqüentes foram submetidos à análise por
citometria de fluxo: 1 carcinoma de adrenal; 1 carcinoma de nasofaringe; 1
Hemangiopericitoma e 3 tumores de células germinativas. Ambas as amostras de carcinoma
(adrenal e nasofaringe) apresentaram fenótipo CD45-/CD56
+/Epcam
+ (Figura 20) O carcinoma
de adrenal apresentou duas subpopulações com diferentes características de dispersão da luz
(SSC e FSC) e imunofenotípica. A primeira população (19,7%) com FSC e SSC menores
associada a fenótipo CD57+f
/CD90+f
/Epcam-/+
; a segunda população (80,3%) com FSC e SSC
maior e CD57+F
/CD90+F
/Epcam+F
. (Figura 20B) O carcinoma de nasofaringe apresentou
C)
D)
72
fenótipo: CD90+/CD81
+F/CD9
+/CD58
+f associado ao fenótipo descrito anteriormente.Figura
20A. Duas amostras de tumor de células germinativas(líquido ascítico e massa abdominal)
apresentaram uma população celular CD45+/CD56
+f porém sem marcação para nenhum outro
antígeno analisado e a outra apresentou fenótipo: CD45-/CD10
+/NG2
+CD38
-CD19
-. Por fim,
uma amostra de hemangiopericitoma apresentou negatividade para todos os marcadores
estudados, exceto para CD34 fortemente positivo.
Figura 20. Análise fenotípica por citometria de fluxo de tumores raros pediátricos
Figura 20: Todos os gráficos representam apenas as células tumorais selecionadas a partir de
sua negatividade para CD45 e positividade para CD56. A) Amostra dissociada de massa em
cabeça e pescoço de paciente com carcinoma de nasofaringe, evidenciando células tumorais
CD45-/CD56
+/CD90
+/CD81
+het /CD9
+/Epcam
+F. B) Amostra dissociada de tumor em adrenal
de paciente com carcinoma de adrenal, evidenciando duas subpopulações de células tumorais
com CD45-/CD56
+/CD90
-/+/CD81
- /CD9
+F/Epcam
+F
A)
B)
73
5.3 Análise do Componente Principal (PCA):
Como descrito previamente na seção de material e métodos, foram realizadas a fusão
dos arquivos correspondentes aos seguintes grupos de tumores de células pequenas redondas e
azuis: neuroblastoma, rabdomiossarcoma e PNET; e, subseqüentemente, realizada a análise
do componente principal (PCA). O PCA foi realizado “dois-a-dois” (Neuroblastoma X PNET,
RMS X PNET e RMS X Neuroblastoma ). Na figura 21E, podemos observar a clara
separação dos casos de neuroblastoma e rabdomiossarcoma (mediana de cada caso
representada por quadrados). De acordo com a projeção do primeiro componente, os
parâmetros mais informativos para explicar esta variância entre os eventos do neuroblastoma
e do rabdomiossarcoma foram: nuMYOD1, CD56, CD57 e CD81, com seus respectivos
pesos: 29.2%, 26.9%,16% e 12.9% . Da mesma maneira, podemos observar a separação entre
os casos de rabdomiossarcoma e PNET (figura 21F). Para esta comparação, os parâmetros
mais informativos no primeiro componente principal foram: nuMYOD1, CD99, CD9 e
nuMiogenina com seus respectivos pesos: 24.6%, 21.4%, 18.9% e 18.4%. Na última
comparação, alguns eventos do PNET caem muito próximos do Neuroblastoma; entretanto a
grande maioria está, completamente, separada (figura 21G). Para esta comparação
(neuroblastoma X PNET) os parâmetros mais informativos foram: CD99, CD56, CD81 e
CD57, com seus respectivos pesos: 32.9%, 23.6%, 15.1% e 12.8%. Na figura 21, observamos
a diferente expressão das proteínas de maior poder discriminativo e a análise do componente
principal dos três principais grupos de tumores estudados (neuroblastoma, rabdomiossarcoma
e PNET)
74
Figura 21. Fusão dos dados das 35 amostras neoplásicas estudadas quanto à expressão
das proteínas de maior poder discriminativo e análise do componente principal dos três
principais grupos de tumores estudados (neuroblastoma, PNET e rabdomiossarcoma)
Figura 21. Análise das células neoplásicas de todas as amostras estudadas fusionadas em
arquivo vitual único para cada grupo tumoral analisado. A,B,C,D) Diagrama de caixas
representando a intensidade de fluorescência do CD56 (21A), GD2 (21B), CD99 (21C) e
MYOD1 (21D) nos grupos tumorais estudados; E,F,G) Análise do componente principal,
respectivamente, rabdomiossarcoma versus neuroblastoma, rabdomiossarcoma versus PNET;
e, neuroblastoma versus PNET.
75
6 DISCUSSÃO
6.1 Aplicação da citometria de fluxo no estudo dos tumores sólidos pediátricos.
Até o presente momento, a utilização da citometria de fluxo para diagnóstico e
seguimento de neoplasias sólidas não foi estabelecida. Embora, seja uma técnica rápida e
precisa, indispensável para correta classificação e acompanhamento terapêutico de neoplasias
hematológicas, a citometria de fluxo permanece como ferramenta útil apenas no campo da
pesquisa, sem aplicação clínica comprovada nos tumores sólidos pediátricos.9,10,38,64,71-76,91,92
A maioria dos tumores sólidos pediátricos se origina em células embrionárias
primitivas mesenquimais ou neuroectodermais. 5,7
Apresentam características morfológicas
muito similares, por tanto de difícil diagnóstico morfológico. Este grupo de tumores, chamado
tumores de células pequenas redondas e azuis, são caracterizados por uma morfologia
composta de células de tamanho intermediário (duas vezes o tamanho da hemácia) com
citoplasma basofílico e relação núcleo-citoplasmática variável. Em pediatria, esta
classificação inclui os tumores pediátricos mais comuns: neuroblastoma, linfoma,
rabdomiossarcoma, Sarcoma de Ewing entre outros. Neste contexto, técnicas auxiliares de
diagnóstico, como a imuno-histoquímica, são de extrema importância para o diagnóstico e
classificação destes tumores. 5-8,45,50
Do ponto de vista clínico, o impacto do tempo, desde o
início dos sintomas até o início do tratamento, é um fator prognóstico importante para o
sucesso terapêutico.2,3
Este estudo propos a utilização da citometria de fluxo multiparamétrica para
diagnóstico e classificação dos tumores sólidos pediátricos. Nosso enfoque inicial, nos
tumores de células pequenas redondas e azuis, teve como objetivo avaliar a utilização da
citometria de fluxo multiparamétrica como técnica diagnóstica auxiliar em tumores de rápido
crescimento e difícil diagnóstico morfológico. Das 52 amostras analisadas neste estudo, 35
amostras pertenciam ao grupo de tumores de células pequenas redondas e azuis. De grande
relevância, foi à obtenção de concordância entre a CFM e o diagnóstico histopatológico de
88,5% (23/26 amostras) para amostras infiltradas por células tumorais com descrição
fenotípica prévia por CFM. Não sendo, corretamente, classificados apenas o Linfoma de
Hodgkin e o Linfoma Anaplásico.
76
6.2 Viabilidade celular em amostras de tumor sólido submetidas à dissociação
Desde a década de 90, estudos com o objetivo de investigar o papel da citometria de
fluxo em tumores sólidos de adultos (carcinoma de cólon, adenocarcinoma de mama,
adenocarcinoma de próstata) observam alta sensibilidade da citometria de fluxo na avaliação
de micrometástases ao diagnóstico. Entretanto, até os dias atuais, esta técnica não é utilizada
de forma rotineira. 105,106
Um fator limitante à implantação da técnica da citometria de fluxo no estudo dos
tumores sólidos é a obtenção de células em suspensão para análise. Van Dam et al107
examinaram 5 métodos diferentes de conservação da amostra em 15 tumores ginecológicos,
todos com técnica de dissociação mecânica para obtenção de células em suspensão. Neste
estudo, a viabilidade celular foi de 65,7% em amostras de tecido fresco armazenadas com
PBS até 24h. Em outro estudo, Van Dam et al11
estudaram a viabilidade celular para a
quantificação de antígenos tumorais e análise de DNA em 38 amostras de tecidos tumorais
ginecológicos e tecidos reacionais e obteve uma média de 4,8 x 107 células viáveis por grama
de tecido dissociado. Nosso estudo utilizou 52 amostras a fresco de diferentes sítios
anatômicos submetidas à dissociação mecânica com viabilidade celular mediana de 75%,
resultado superior ao descrito acima, possivelmente, devido ao tipo de material estudado. Em
ambos os estudos, foi possível a clara caracterização das células tumorais por citometria de
fluxo e a manutenção da morfologia celular em análises de citospin pós-dissociação. Devido
ao pequeno número de amostras nos diferentes grupos de tecido estudado (urina, líquido
ascítico, medula óssea, sangue periférico e diferentes tecidos), não foi possível estudar a
variação da intensidade média de fluorescência dos marcadores analisados nas células
tumorais presentes nestas amostras.
6.3 Heterogeneidade da amostra e implicação para correta classificação dos tumores por
citometria de fluxo
Uma das grandes vantagens da citometria de fluxo é a possibilidade de análise celular
individual. Com o advento da citometria de fluxo multiparamétrica, a análise fenotípica e de
DNA pode caracterizar melhor subpopulações intra-amostrais, antes de difícil caracterização,
por técnicas como a imuno-histoquímica. Em 2000, Könemann et al
15estudaram 6 diferentes
amostras de tumores sólidos com 5 combinações diferentes de anticorpos, quanto à expressão
diferenciada de antígenos celulares, e quantificação de DNA, sendo observada
77
heterogeneidade intra-tumoral em todas as 6 amostras. Outra importante aplicação da
citometria envolve a possibilidade de caracterização de infiltração linfocitária intra-tumoral e
a separação de possíveis células iniciadoras tumorais, a partir de seu perfil de expressão
antigênica.108,109
Em 11/35 amostras tumorais analisadas em nosso estudo, foi possível a clara
caracterização de subpopulações tumorais, a partir da identificação de características
diferenciadas de dispersão da luz e de expressão antigênica. De relevância, as amostras de
neuroblastoma metastático para medula óssea apresentaram, de forma sistemática, uma
pequena população com expressão de CD117 (c-kit), ausente nas amostras de massa primária,
exceto em uma amostra tumoral de um paciente com neuroblastoma considerado
indiferenciado pela patologia. Em 18/35, foi possível a caracterização de infiltrado
inflamatório composto principalmente por linfócitos T e raros neutrófilos.
6.4 Contribuição da citometria de fluxo no rastreamento de neoplasias malignas
O primeiro passo no raciocínio diagnóstico de uma suspeita de neoplasia malígna é a
correta identificação da amostra como reacional ou maligna. Amostras obtidas por punção
aspirativa já foram estudadas por citometria de fluxo quanto à capacidade de distinção entre
malignidade ou reacional. Em 1999, Chung et al110
descreveram a utilidade da citometria de
fluxo como técnica adjuvante a citomorfologia em 33 casos de linfadenomegalia com
identificação de populações celulares malignas, mesmo em amostras paucicelulares, porém,
neste estudo, a avaliação morfológica e fenotípica das amostras foi executada
simultaneamente. Em 2005, Laane et al111
estudaram um total de 424 amostras provenientes
de punção aspirativa de linfadenomegalias, com um painel de 4 cores, e encontrou uma
concordânica de 97% nas amostras reacionais entre as técnicas de citometria de fluxo e
imunocitoquímica. Em 2011, Barrena et al95
, encontrou uma sensibilidade de 100% e
especificidade de 96% para o diagnóstico de amostras reacionais, por citometria de fluxo,
maior que a citologia convencional, com sensibilidade de 94%, e especificidade de 94% em
167 amostras analisadas.
Em nosso estudo, 17 amostras foram, corretamente, identificadas por citometria de
fluxo como reacionais ou ausência de infiltração maligna, com 100% de concordância com o
resultado histopatológico. Importante, relatar a presença de 1 amostra de pseudotumor
abdominal e 1 amostra de massa de partes moles periosteal entre as amostras analisadas, visto
78
que os estudos comparativos, realizados até o momento têm como material de análise medula
óssea, sangue periférico, linfonodo e líquidos corporais. Como nosso estudo visa o
diagnóstico em diferentes tecidos corporais, é de suma importância avaliar a capacidade
discriminativa no maior número de tecidos possível.
6.5 Contribuição da citometria de fluxo na distinção entre neoplasias hematológicas e não-
hematológicas
Em tumores sólidos pediátricos, os primeiros estudos de expressão antigênica por
citometria de fluxo foram em células de cultura 112,113
,ou amostras de medula óssea
encaminhadas para avaliação de leucemia aguda.83,114
Nestes pacientes, a observação de uma
população CD45, negativa na ausência de marcadores de linhagem linfóide e mielóide,
conduziu à suspeita de tumor sólido infiltrando a medula óssea.
Treze medulas ósseas foram encaminhadas para avaliação de doença metastática
durante nosso estudo. Destas, 7/13 apresentaram infiltração por células neoplásicas em
concordância com o resultado histopatológico. A utilização de um extenso painel, com 30
diferentes proteínas, foi essencial para a melhor distinção entre as amostras de origem
hematopoiética, não-hematopoiética e normais. Isto porque, alguns marcadores, como
CD99,CD56,CD9,CD81,CD34,CD117, podem estar presentes tanto em amostras
hematológicas quanto não hematológicas, como observado em nosso estudo. De fato, o CD45
é de grande valia na distinção entre hematológicas e não-hematológicas, porém, em alguns
casos de linfoma ele pode ser, aberrantemente, negativo ou fraco.87
Embora, os estudos em citometria de fluxo para análise de diferentes subtipos de
Linfoma não-Hodgkin do adulto já tenham comprovado a grande utilidade desta técnica como
ferramenta diagnóstica, em pediatria, existem poucos estudos que comprovem sua
utilidade.115,116
Em 2010, Sethuraman116
estudou 41 amostras com suspeita de linfoma e
encontrou uma concordância de 93,1% entre a citometria de fluxo e o histopatológico, quando
excluídos os casos de linfoma de Hodgkin. Neste mesmo estudo um diagnóstico de
neuroblastoma foi considerado devido à positividade para CD9, CD81,CD56 e GD2.
Um total de 7/35 amostras infiltradas por células neoplásicas de origem
hematopoiética foram, claramente, distintas das não-hematopoiéticas com o painel de
anticorpos utilizado. Entre os marcadores úteis para a correta distinção entre as amostras
hematopoiéticas das não-hematopoiéticas os de maior relevância foram: CD45, CD56, CD90,
CD99, CD19, CD20, CD3, GD2, MYOD e miogenina.
79
6.6 Contribuição da citometria de fluxo para a caracterização dos tumores sólido não-
hematopoiéticos
Estudos da expressão antigênica por citometria de fluxo em tumores sólidos
pediátricos foram, inicialmente, descritos de forma isolada em grupos tumorais específicos.
21-23,28-30,84-86,88-90,112-114 Inicialmente, a observação de populações celulares contendo CD45
negativo e CD56 positivo conduziu à suspeita de infiltração na amostra por células de origem
não-hematopoiética.24
Em seguida, combinações de anticorpos monoclonais em 3-4
parâmetros diferentes foram analisadas em pacientes com diagnóstico histopatológico,
previamente, estabelecido.83-86,88-90
Em 2004, Swerts et al29
descreveram uma sensibilidade de
1x10-5
e uma concordância com imunocitologia de 86%, com uma combinação de 4 cores em
dois tubos: CD45-/CD56
+/CD81
+CD9
+ e GD2
+/CD81
+ /CD45
- /CD56
+. Em 2003, Chang et
al26
estudaram 21 casos quanto à expressão antigênica de CD45, CD56, CD99, citoqueratina,
miogenina e observaram a possibilidade de diagnóstico por citometria de fluxo neste grupo de
patologias. Em 2008, Gautam et al27
utilizaram a citometria de fluxo para caracterização dos
tumores de células pequenas redondas e azuis a partir da expressão de citoqueratina, vimetina,
desmina NSE, CD45 e CD99 em 37 amostras, observando uma concordância modesta de 59%
com o diagnóstico imunocitológico, possivelmente, pelo fato de terem estudado amostras
coletadas por punção aspirativa e pela utilização de poucos marcadores antigênicos .
80
7 CONCLUSÃO
A citometria de fluxo é uma técnica rápida, viável e exeqüível para o estudo dos
tumores sólidos pediátricos. Neste estudo, foi possível discernir, com segurança, entre
amostras reacionais e amostras malignas por citometria de fluxo multiparamétrica. Todas as
amostras reacionais foram corretamente identificadas. Dentre as amostras tumorais, apenas
2/35 foram, erroneamente, classificadas como reacionais. Assim, com este teste diagnóstico
rápido, é possível descartar, no mesmo dia, a suspeita de infiltração tumoral em amostras
reacionais e orientar o diagnóstico patológico, no caso de infiltração por células malignas.
No caso de amostras infiltradas por células neoplásicas malignas, foi possível
discernir, em 100% dos casos, entre as de origem hematológica e não-hematológica, fato de
grande utilidade em tumores de rápido crescimento e com comprometimento de órgãos
nobres (compressão medular, obstrução renal pós-renal, síndrome de veia cava superior, por
exemplo).
Até o momento atual de nosso conhecimento, este é o trabalho com o maior número
amostral estudado. Para tal, utilizamos 8 combinações de anticorpos diferentes, aplicados
sistematicamente, em todas as amostras, o que possibilitou a análise comparativa dos
antígenos estudados, entre os diferentes grupos tumorais. Neste contexto, observamos que:
a) não é possível discriminar neuroblastoma x PNET x rabdomiossarcoma x linfoma com
apenas 3-4 combinações de anticorpos;
b) a proteína NCAM (CD56) pode ser útil na discriminação entre tumores quando considerada
a intensidade média de fluorescência (MFI), com o neuroblastoma apresentando os maiores
níveis de MFI;
c) as tetraspaninas CD9 e CD81 são expressas em diferentes grupos tumorais sem padrão
específico, não sendo úteis na discriminação entre grupos tumorais;
d) a proteína MIC2 (CD99) parece ser, realmente, útil na diferenciação dos tumores da família
Ewing, fato já descrito anteriormente, principalmente, no que diz respeito ao neuroblastoma x
PNET, porém, não pode ser utilizada isoladamente;
e) o gangliosídeo de membrana GD2 parece ser útil na classificação de neuroblastoma,
principalmente, se analisarmos quanto a MFI, com o maior nível de MFI neste grupo tumoral;
81
f) o receptor de fator de crescimento neural (NGFR ou CD271) foi positivo no PNET com alta
MFI e em um neuroblastoma com baixa MFI, podendo ser útil na caracterização destes
tumores, sendo necessárias mais amostras para melhor avaliação;
g) a proteína epitelial Epcam foi útil em dois grupos tumorais- Wilms e carcinoma-
identificando, no primeiro, um subgrupo de células tumorais CD56+F
/Epcam+F
,
provavelmente, compatível com o componente epitelial do tumor de Wilms e, no segundo,
uma população mais homogênea com altos níveis de MFI, porém, necessitamos de um
número maior de amostras para melhor caracterização de sua utilidade;
h) as proteínas musculares MYOD1 e miogenina parecem ser específicas de
rabdominossarcoma e, embora, sua utilização tenha sido, amplamente, descrita por
imunohistoquímica, esta é a primeira descrição do uso das duas proteínas juntas por
citometria de fluxo.
O diagnóstico diferencial entre os tumores sólidos pediátricos mais freqüentes
(Neuroblastoma, Tumores da família Ewing e Rabdomiossarcoma) por citometria de fluxo
multiparamétrica parece viável, uma vez que encontramos padrões de expressão protéica
diferentes entre cada grupo tumoral. Entretanto, se faz necessário um número maior de
amostras, para melhor caracterização e confirmação dos dados obtidos.
Por fim, este estudo mostra, com clareza, a utilidade da citometria de fluxo como
técnica diagnóstica auxiliar na investigação de neoplasias na infância e abre campo para
maiores estudos na investigação fenotípica dos tumores sólidos pediátricos, na
heterogeneidade tumoral e no papel da infiltração inflamatória tumoral, como mecanismo de
defesa imune contra o câncer.
82
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91
ANEXO 1
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Projeto de pesquisa: “Diagnóstico Diferencial dos Tumores de Células Pequenas Redondas
e Azuis por Citometria de Fluxo - automação”.
Pesquisador responsável: Dra. Cristiane de Sá Ferreira Facio
Instituição responsável pela pesquisa: Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão
Gesteira – IPPMG/UFRJ
Endereço: Av Brigadeiro Trompowski s/no, Cidade universitária, Ilha do Fundão - Rio de
Janeiro-RJ Telefones: 25626151/25626181
Orientadores: Prof. Marcelo Gerardin P. Land, Dra Sima Esther Ferman e Dra. Elaine Sobral
da Costa
Eu,_____________________________________________________________,
voluntariamente permito a participação de meu filho(a) na pesquisa “Diagnóstico Diferencial
dos Tumores de Células Pequenas Redondas e Azuis por Citometria de Fluxo”, a ser
realizada pela Dra Cristiane de Sá Ferreira Facio sob a orientação dos Drs. Marcelo
Gerardin P. Land, Sima Esther Ferman e Elaine S. Costa. Esta pesquisa tem o objetivo
testar um método laboratorial para o diagnóstico de tumores da infância, conhecidos como
“tumores de células pequenas redondas e azuis”.
Hoje em dia, para diagnosticar o tipo destes tumores há necessidade de uma grande
experiência do patologista e de vários exames auxiliares. O que se pretende é testar um
método diagnóstico feito de maneira automática, chamado citometria de fluxo, que já é
usado de rotina para o diagnóstico de outras doenças. Além disso, estudaremos se é
possível encontrar células do tumor no sangue.
Caso eu concorde em participar do estudo, no momento da biópsia do tumor de meu
filho, o pedaço retirado para o exame de rotina (que se chama histopatológico) será dividido
e um pequeno pedaço dele será para testar este novo exame e compará-lo com o
diagnóstico que é feito normalmente. Além disso, será necessária uma pequena amostra (1
ml) de sangue (colhida no momento em que for necessário algum outro exame de sangue
do meu filho, ou seja, ele não será incomodado somente para o estudo). A retirada de 1 ml
de sangue não traz nenhum mal para meu filho. O material coletado só será utilizado para
os fins desta pesquisa. Não haverá prejuízo no diagnóstico e no tratamento de meu filho. O
diagnóstico e o tratamento dele serão realizados de acordo com os protocolos utilizados no
hospital onde está internado sem qualquer interferência deste estudo.
92
À mim, enquanto responsável por meu filho, é garantida a liberdade de querer não
participar do projeto de pesquisa ou me retirar no momento que achar conveniente, sem
prejuízo ao acompanhamento e tratamento do meu filho. Durante todo o projeto nós
poderemos pedir informações sobre o estudo, sempre que acharmos necessário. Não
haverá despesas pessoais ou qualquer tipo de compensação financeira relacionada à
participação de meu filho.
Os resultados serão apresentados em uma tese de mestrado na UFRJ e também
poderão ser apresentados em um ou mais artigos a serem publicados em revistas científicas
e divulgados em congressos, simpósios, reuniões científicas, conferências, mesas redonda,
salas de aulas, sempre mantendo o sigilo de identidade dos pacientes.
Eu, __________________________________________________, abaixo assinado,
responsável pelo menor ____________________________________________,acredito ter
sido suficientemente informado sobre a pesquisa “Diagnóstico Diferencial dos Tumores de
Células Pequenas Redondas e Azuis por Citometria de Fluxo” e autorizo voluntariamente a
participação do meu filho(a) nesse estudo. Declaro que li e entendi todas as informações
referentes a esse estudo e que todas as minhas perguntas e dúvidas foram claramente
respondidas pela pesquisadora.
Rio de janeiro, _____ de _________________ de 20___
Responsável legal – RG
Pesquisador
Sujeito da pesquisa
Telefones de contato: Cristiane: 97081715
CEP- HSE: 22913131 R:3544
IPPMG: 25626181/25626151