PREVALÊNCIA DA MASTITE BOVINA: fESTUDO.COMPARATIVO DE MÉTODOS .. PARA SUA DETECÇÃO E DO COMPORTAMENTO DE VARIOS AGENTES ETIO­LÓGICOS FRENTE À PROVA DA REDUCÃO DO AZUL DE METILENO.

~-~

ANTONIO NADER FILHO -

Tese apresentada i Faculdade de Safide P~blica ~a Universidade de São Paulo, Deoartamento de Nutricão, para obten -· .... '.71 - -çao do t1tulo de 11 DCJutor em Saude Pu

ca 11• -

Orientador: Prof. Dr. Donald Wilson

São Paulo -

19 83

DED.ICATORIA

A MEUS PAIS

pelo exemplo de dignidade,

amor e compreençao

i í

A MINHA ESPOSA

cujo apôio, dedicação e

incentivo influíram na

realização deste trabalho

i i i

J'iS MINHAS FILHAS

Tatiana e Talita pelo

amor e compreensao

i v

AGRADECIMENTOS

AO PROF. DR. DONALD WILSON

homenagem de sincero reconhe

cimento e profunda gratidão

vi

AO PROF. DR. RUBEN PABLO

SCHOCKEN-ITURRINO

V l I

pelo. est1mulo e colaboração

prestada durante o planej~

menta e elaboração deste

trabalho

Yi i i

~ COORDENADORIA DE ASSISTÊNCIA

AO PESSOAL DE ENSINO SUPERIOR

(CAPES) e ~ FUNDAÇAO JUDITH

BUZAID, pela ajuda financei

ra proporcionada

i X

- Ao Prof, Dr, AILTO ANTONIO CASAGRANDE, mui digno Diretor da

Faculda~e de Ci~~cias.Agririas e Veterinirias Campus de

boticabal-UNESP, pelas condiç~es oferecidas para que

trabalho pudesse ser realizado;

. , ua

este

- Ao Prof. Dr. ORLANDO FERRARI, Chefe do Departamento de .Hi

giene Veterinãria e Safide P~blica da FCAVJ/UNESP, pelo

apoio irrestrito, amizade sincera e constante estlmulo;

- A colega SANDRA PEREIRA FUKUDA, pela colaboração

junto ao Lacticlnio Flor da Nata de Barretos/SP;

presta da

- Ao~ Prof. Dr. SEBASTIAO TIMO IARIA, Prof. Dr. GIL VIANNA

PAIM, Prof. Dr. OMAR MIGUEL, Prof~ Dr~ SIR.DEIA MAURA PERRO

NE FURLANETTO e Prof. Dr. ARAMIS AUGUSTO PINTO, pelas cr1ti

case sugestões apresentadas;

- Ao Prof.Dr. GIL VITAL ALVARES PESSÔA, pela colaboração pre~

tada junto ao Instituto Adolfo Lutz de São Paulo;

- Ao colega AUREO EVANGtLISTA SANTANA, pela colaboração pres-

tada junto ao laboratório do setor de Cllnica Medica da

FCAVJ/UNESP;

-·~As funcionãrias do Instituto Biologico de Ribeirão Preto

ANA MARIA MACHADO CARNEIRO, FLJ'\VIA CARNEIRO BUENO e TIYO OKA

DA MURA K A M I , p e 1 a c o 1 a b o ração p r e s ta da dura n te o e s t ã g i o r e_? ·

lizado na FCAVJ/UNESP;

- Aos FUNCibN~RIOS do Departamento de Higiene Veterinâria e

Safide Pfiblica e Departamento de Micro5iologia da FCAVJ I

UNESP, pelo apóio recebido,

-Aos FUNCIONJ\RIOS do Serviço de Inspeção do Lacticinio Flor

da Nata de Barretos/SP, pelo·interesse e dedicação,

E a todos aqueles, que direta ou indiretamente~ contribuíram

par a a r e a 1 i z ação deste t r aba 1 h o .

X

INDICE

Pãgina

RESUMO.......................................... xvii

SUMMARY........................................ XX

INTRODUÇAO..................................... 01

MATERIAL E MtTODOS............................. 15

RESULTADOS..................................... 38

DISCUSSAO ....... ·.....................•......... 59

CONCLUSAO...................................... 69

REFERtNCIAS BIBLIOGRAFICAS.... .. .. .. . ... .. .. . . . 72

INDICE DE TABELAS

TABELA 1 - Distribuição das fêmeas ppsitivas, sus

peitas e negativas a prova do CMT, se

gundo os rebanhos produtores de leite

tipo B, estudados na região do Muni

c 1 p i o de Bar retos , Sã o Pau 1 o , 1 9 8 2 ....

TABELA 2 - Prevalência da mastite bovina em seis

rebanhos produ to r e s de 1 e i te ti p o B ,

detectada pelo CMT e confirmada pelo

exame bacteriológico, se~undo o numero

de fêmeas e quartos analisados, na re

gião do Municfpio de Barretos; São Pau

,. o , 1 9 8 2 • • • • • • • • • 'I • • • • " • • • • • • • • • • • • • • •

Pâgina

43

44

-·

TABELA 3 - Distribuição das amostras positivas ao

exame bacteriolEgico, segundO a locali

zaçao do quarto afetado, nos rebanhos

produtores de leite tipo B, estudados

na região do Municipio de Barretos,São

X i i i

Pãgina

Paulo, 1982........................... 45

TABELA 4 - Distribuição do numero de quartos posi

tivos e negativos ao exame bacteriolo-

gi co, e dos quartos _11 pe r di dos 11, • segUI:!_

do os rebanhos produtores de lei te ti

po B, estudados na região do ~unicipio

de Barretos, São Paulo, 1982. ...... ... 46

TABELA 5 - Comparação dos resultados obtidos na

prova do CMT com os do exame bacterio­

lógico no diagnEstico da mastite bovi

na, e determinação do percentual de

concordância, nos rebanhos produtores

de leite tipo B, estudados na regiãodo

~.1unic1rHJó de Barretos, São Paulo, 1982. 47

TABELA 6 - Comparação dos resultados obtidos na

prova do CMT com os da contagem leuco­

citãria no diagnostico da mastite bovi

na, e determinação percentual de con

cordância, nos rebanhos produtores de

leite tipo B, estudados na região do

Municfpio de Barretos, São Paulo,l982. 4.8

TABELA 7 • Comparação dos resultados obtidos na

prova do CMT com os da pesquisa do

teor de cloretos no diagnEstico da mas

tite bovina, e determinação do percen­

tual de concordâncià, nos rebanhos pro

dutores de leite tipo B, estudados na

região do Municipio de Barretos, São

X i. V

Pãgina

Paulo, 1982........................... 49

TABELA 8 - Comparação dos resultados obtidos na

contagem leucocitãria com os do exame

bacteriolEgico no diagnõstico da masti

te bovi.na, e determinação do .r:_ perce!!_

tu a 1 de c o n c o r d â n c i a , nos rebanhos p r~

ditares de leite tipo B,estudados na

região do Municipio de Barretos, São

Paulo, 1982 ...... ...... :......... ..... 50

TABELA 9 - Comparação dos resultados obtidos na

contagem leucocitãria com os da pesqui

sa do teor de cloretos no diagnõstico

da mastite bovina, e determinacão do

p e r c e n t u a 1 de c o n c o r d â n c i a , n os 'r e b a

nhos produtores de lei te tipo B, estu-'

dados na região do ~unicipio de Barre-

tos, São Paulo, 1982.......... .. . . . . . . 51

TABELA 10 - Comparação dos resultados obtidos na

pesquisa do teor de cloretos com os do

exame bacteriolEgico no diagnõstico da

mastite boví.na, e determinação d:o p·e.!:..

c e n tu a 1 de c o n c o r d â n c i a , n os r e lb a n h o s

produtores de leite tipo B, estudados

na regfão do Munfcipio de Barretos,Sa-o

Pau l·a, 19 82 ........••...... ~ ..••.....

TABELA 11 - O i s t r i b ui ç ã o . dos age n te s e ti o 1 o gil c os no

exame bacteriológico das-56 fêmeas rea

gentes a prova do CMT, nos rebanhos

produtores de leite tipo B, estudados

na região do Municipio de Barretos

São Paulo, 1982 ..................... .

TABELA 12 - Comparação dos resultados obtidos, na

prova da redução do azul de métileno

com os da contagem padrão em placas ,

segundo as. 56 amostras de lei te ,, das ,,.

fêmeas reagentes a prova do CMI~ nos

rebanhos produtores de leite tiwo B,

estudados na região do Municipiu de

XV

Pã gin a

52

53

Bar retos , Sã o Pau 1 o , 1 9 8 2 . . . . . • .. . . . . . 54

TABELA 13- Comparação dos resultados obtidos: na

contagem leucocitãr·ia com os da prova

de redução do azul de meti leno,segun­

do as 56 amostras de lei te das fêmeas

reagentes a prova do CMT, nos reba

nhos produtores de lei te tipo 8, es·tu

dados ha região do Municipio de Bafr~

t .os , Sã o P a u 1 o , 1 9 8 2 . . . . . . . . . • • . . . . . . 5 5 ·

TABELA 14 • Comparação dos resultados obtidos na

prova da redução do azul de meti leno com

os dd contagem padrão em placas,segundo

as amostras de leite inoculadas experi­

mentalmente, dos rebanhos produtores de

leite tipo B, estudados na região do Mu

x vi

Pã g in a

nic1pio de Barretos, São Paulo, 1982... 56-

TABELA 15 - Distribuição dos resultados obtidos nas

anãlises realizadas pelo Serviço de Ins

peçao do Lactic1nio Flor da Nata,segun­

do os rebanhos produtores de leite tipo

B, estudados na região do Municfpio de

Barretos, São Paulo, 1982. ... .. . ... .. .. 57

TABELA 16 - Prevalência da mastite bovina nos reba

nhos produt-ores de lei te tipo B, estud~

dos na região do Munic1pio de Barretos,

São Paulo, seaundo o nümero de f&meas e

quartos analisados, e resultados obti~

dos pelo SIF na pesquisa do teor de elo

retos, prova de pus e na prova de Whi t~

si de, 1982............................. 58

RESUMO

Foram submetidas a prova do 11 California Mastitis

Test 11 (CMT), 468 vacas leiteiras pertencentes a seis prop1~i~

dades rurais produtoras de leite tipo B, localizadas na re

·gião do Município de Barretos, SP. Das 56 (12,0%) fêmeas rea

g e n te s a e s ta p r o v a , 4 8 ( 1 O , 3% ) f o r a m c o n f i r ma d a· s a t r a v e s ·do

isolamento e identificação do agente etiológico. A elevada

concordância (85,71%) verificada entre ,a prova do CMT e o

exame bacteriológico, confirma a eficiência desta prova na

detecção de transtôrnos da glândula mamãria não perceptíveis

clínicamente, uma vez que nenhuma das fêmeas analisadas apr~

sentou sinais da enfermidade.

A contagem leucocitãria e a pesquisa do teor de

cloretos efetuadas nas 56 fêmeas reagentes a prova do CMT,

apresentaram ·concordâncias de 87,5% e 50,0%, respectivamente,

X V i i i

em relação ao exame bacteriol6gico. O Staphylococcus aureus

foi o agente etiol6gico mais freqUente (52,08%) nos casos de

mas ti te bovina.

O estudo comparativo entre a contagem padrão em

placas e a prova da redução do azul de meti leno, efetuado nas

56 amostras reagentes a prova do Cf'vlT, revelou que 30 (53,,57%)

amostras apresentaram tempo de redução não condizente com o

nume1r0 de microrganismos determinado, isto e, tempo de redu­

çao menor que 3 l/2 horas e contagem total de microrganismos

inferior a 500.000 microrg/ml. Observou-se, ainda, que des

tas 30 amostras,26 (86,67%) apr_esentarél'm·· con:tra;gens lleucocitf

rias superiores a 2.500.000 leucõcitos/ml., sugerindo deste

mo do , um a p r o vã v e 1 i n te r f e r ê n c i a d os 1 e u c õ c i tos q u a n d o e m· n u

mero elevado, na prova da redução do azul de metileno.

O estudo comparativo entre a contagem padrão em

placas e a prova da redução do azul de metileno,ef~tuado nas

30 amostras negativas a prova do CMT, revelou que 27 (90,0%)

amostras apresentaram o .tempo de redu.ção condi zen te com o nQ

mero ·de microrganismos determinado, o que confirma a impo~

tância de sua utilização na rotina do Serviço de Inspeção.A

'provãvel interferência dos leucõcitos não compromete a efi

ciência desta prova, pois as variações observadas ocorrem no

sentido de abreviar o tempo de redução, sendo muito pequena

ã probabilidade de aceitação de um produto com o numero de

microrganismos superior ao permitido pelo Ministério da Agrl

cultura.

Dentre as provas utilizadas pelo Serviço de In~

peçao na detecção da mastite bovina a nfvel de Estabelecimen

tos Industriais a prova de Whiteside foi .a.que apresentou

maioP sensibilidade e especificidade, capaz de revelar a pre

sença de leite anormal em rebanhos cuja prevalência desta

doença foi igual ou superior a 7,0% das fêmeas ou 1,4% dos

xix

quartos analisados. A pesquisa do teor de cloretos aprese~

tou menor sensibilidade e esp~cificidade, incapaz de revelar

a presença de leite anormal em todos os rebanhos analisados.

Entretanto, este fato não invalida a utilidade de sua aplic~

ção, pois esta prova pode ser de fundamental importincia na

detecção de fraudes no leite.

A preval~ncia da mastite bovina em at~ 20,0% das

f~meas leiteiras ou em ate 5,0% dos quartos examinados, -nao

foi suficiente para colocar os quesitos analisados nas amos-

tras de leite, fora dos padrões normais. Acredita-se que es

tes padrões devam ser objeto d~ estudos posteriores.

SUMMARY

Four-hundred and sixty-eigth milk cows, beJon

ging to six type B mi1k producing dayry farm~, 1ocated in

the region of Barretos, SP, Brazi1 were submitted to '1Ca1i

fornia Mastitis Test", of the fifty-six (12,0%) cows positi­

ve to the mentioned test, forty eigth (10,31) had the djagno

sis confirmed throght iso1ation and identification of the

etio1ogic agent. High agreement (85,7%) was obtained between

CMT and bacterio1ogic examination, which co~firms the effici

ency of CMT in the detection of diseases of the mQmmary

glands, not perceptible by clinical examination, as none the

anima1s examined presented signs of disease.

Leucocyte count and determination o f chl o ri de le

vel performed on the fifty-six reactors presented agree.ment

of 87,5% and 50,0%, respectively, with bacteriologica1 exami

xxi

nation.

StaphyZoc6ccus aureuswas the most frequently iso

lated bacterium (52,08% of cases).

Comparison between total plate count and reducta

se test, performed on thirty samples negative to CMT ~ showed

that twenty-seven samples (90,0%) presented a reduction time

compatible with the number of microorganisms present,' confi..!:.

ming the importance of reductase test regarding inspection .

The theoretical interference of leucocytes was not important

in practice, as variations observed were abreviation of re

duction time, rendering the propability of·accepting a prQ

duct with a number of microorganisms over legal limits very

s ma 11 .

Considering tests used by the Inspection Service

for detection of bovine mastitis, the Whiteside test presen­

ted highest sensivity and specificity, as it was capable of

reveling abnormal milk when prevalence was 7,0% and over,co~

siderring animals and 1,1% considering quarters.

Chloride 1evel presented lower sensitivity and

specificity as it was unable to detect abnormal milk in all

dairy farms. However it is very important in the detection of

frauds.

Prevalence of mastitis of up to 20,0% of animals

or of 5,0% of quarters was not sifficient to bring the total

milk produced below standards.

1.- INTRODUÇÃO

A mastite bovina por suas implicações na prod~

çao de leite, constitui importante problema de saúde publica,

al~m de acarretar considerãveis perdas econ5micas represent!

das pela queda de produção lãctea ou pela perda total desta

capacidade (FIGUEIREDO, 1962; LEITE & cols.~ 1976).

Embora esta enfermidade ocorra em todas as esp!

cies animais, adquire maior importãncia entre os bo~inos 5

pois é considerada em dos principais entraves a exploração

leiteira em praticamente todos os países do mundo (CORRtA &

CORRtA, 1979; FERREIRO, 1978).

MARTINEZ (1958), LANGENEGGER & cols. (1970) ,HARROP

& cols(l975) e FERREIRO & cols.(l981), estudando as 11 bacias

leiteiras~~ de Porto Alegre, Rio de Janeiro, Pernambuco e da 11 Zona da Matau Minas Gerais, observaram prevalências .de 6 ,2%,

02

20,0%, 14,5% e 14,2%, respectivamente. Ve~ifica~am ainda que

as proporções de quartos pe~didos foram de 27,8%, 7,0%, 3,9%

e 1,78%, respectivamente.

A mastite bovina determina a diminuição da cap~

cidade produtora de secreção lãctea em nfveis que variam en

te 10,0% e 25,% (PLASTRIDGE, 1958; RAWLAND & coZs~~l959; O'

DONOVAN & coZ.C;.,~l966; LANDREY, 1966 e SANTOS & MOREIRA,l977).

Esta doença pode acarretar variações de alguns dos componen­

tes do leite, reduzindo os teores de lactose, gordura, sõli

dos não gordurosos, especialmente caseina (HEIDRICH & RENK ,

1969; JANSEN, 1970), alem de co11]prometer as caracte·rrsticas

fisico-qu1micas dos produtos derivados, alterando o sabor,

viscosidade e textura de manteiga e queijos (SANTOS & MOREI­

RA, 1976).

r muito freqüente a possibilidade do leite de

uma fêmea mastitica ser incorporado ao leite de vacas nor

mais, nas atuais condições de produção (SANTOS & ~10RE~RA,

1977), podendo desta forma alterar a eficãcia do processo de

pasteurização, constituindo-se, portanto, em ameaça a sa~de

p~bliaa.

O leite cr~ procedentes de fêmeas infectadas,re

presenta perigoso veículo de infecção para o homem, podendo

ser transmitidas doenças como a brucelose,estafilococcias,es

ir~otoc6cias! alguns casos de tuberculose e febre Q (TOLLE ,

1971).

Embora nao tenham sido notificados casos de in

toxicação alimentar determinados por enterotoxina estafilocõ­

cica· presente no leite e derivados, ARANALDE & cols.(l974)

chamaram a atenção para a possibilidade desta intoxicação na

população humana.

Segundo PANETTA (1977), ainda e grande a quant~

03

dade de queijo minas frescal manufaturado no Brasil com leite

nãp pasteurizado, podendo este fato representar sêrio risco

para a populaçio humana. Observa-se ainda que outros tipos de

queijo são produzidos com leite não pasteurizado, ~on~tituin­

do-se,portanto em ameaça a safide pfiblica.

t muito vasta a literatura sobre os agentes :eti~

lÕgicos causadores da mastite bovina, tendo sido relacionadas

cerca de 43 espécies de microrganismos pertencentes a 25 gene

ros (SANTOS & MOREIRA, 1977). Entretanto, a investigação da

etiologia desta enfermidade em diversos pa1ses, tem evidenci~

do a predominância de bactérias_do gênero Staphylococcus e

Streptococcus(HARROP & aols._,l975;LANGENEGGER & cols._, 1970,

FERREIRO, 1980).

A primeira referência qe _que se tem not'íci a no

Brasil,sobre o isolamento e identificação de bactérias consi­

deradas como agentei etiológicos da mastite, é atribuída a

SOARES FILHO ( 1944). Este autor,a parti r de lei te de vacas com

mastite, isolou cepas de bactérias pertencentes ao gêneroStre_p

to c o c cus . L A C E R[' A J O N I O R & c o Z s . ( 1 9 5 4 ) , i de n t i f i c a r a m c o mo s ta

phylococcus aureus, as cepas isoladas de casos de mastite bo

vina em São Paulo. Apõs esta publicação tem-se verificado que

este agente tem sido o microrganismo mais isolado de casos de

mastite bovina nas diversas 11 bacias leiteiras 11 do pa'ís.

FIGUEIREDO (1962) LANGENEGGER & cols. (1970), FER

NANDES & cols. (1973)~HARROP & cols. (1975) e FERREIRO & cóls.

(1981), estudando amostras de lei te obtidas de vacas com mas

tite, em 11 bacias leiteiras 11 de Minas Gerais, Rio de Jianeiro,

Rio Grande do Sul, Pernambuco e Minas Gerais, verificaram que

o Staphylococcus aureus foi o patõgeno mais freqtlentemente is_2

lado (57,4%, 53,1%, 50,0%, 59,2% e 30,49% das amostras, respe~

tivamente).Ainda segundo estes autores, o isolamento de cepas

de Streptococcussp aparecem na sequência da ordem de importâ.!!_

04

cia causui.s.tica.

A Escherichia coZi e o Corynebacterium pyogenes

sao outros agentes que tamb~m foram isolados de leite de va-

cas com mastite nos Estados de São Paulo, Rio de Janeiro e

Rio Grande do Sul ,cujos níveis de prevalência em relação a

outros agentes etiológicos, situaram-se entre 0,3 e 10,0%

FERREIRO, 1978).

Atualmente o StaphyZococcus aureus ~ provavelme~

te o agente etiológico mais freqUentemente isolado das mastl

tes bovinas em todo o mundo. Esta predominância tem ocorrido

~rincipalmente onde a terapêutica~ efetuada intensivamente

com penicilina e onde a ordenha.manual tem sido substituida

p e 1 a o r de n h c me c a n i c a (H A R R O P & c o Z s . , 1 9 7 5 ; B L O O O & H E N O E R S O N ,

l976;SILVA & PORTO, l977;CORRÊA & CORRÊA,l979;FERREIRO,l980).

A principal fonte de infecção desta doença e re

presentada pela vaca infectada,que ao eliminõr o agente etio

lÕgico através do leite, propicia condições favoraveis para

a c o n t a m i n a ç ã o da s m ã o s _do o r de n h a d o r , de s u a s r o u p a s , d ~ s 11 c~

pos 11 da ordenhadeira e do meio ambiente, que podem determi

nar uma rapida disseminação dos micro~ganismos causadores de

mastites a outros animais do rebanho(CORRÊA & CORRtA, 1979).

A infecção da glândula mamãria ~sempre ascende~

te a partir do canal galactõforo, ocorrendo geralmente o de

senvolvimento de inflamação,decorrente de traumatismos veri7

ficados principalmente durante a ordenhe, seguida de inf~c

çao, que ocorre como um fenômeno natural. Excetua-se a esta

regra a mastite tuberculosa, cujo m~todo de disseminação p~

de se r por v i a hem a t õ g e na ( TO L L E , l 9 7 l ; S C H M I D T , l 9 71 ) .

o diagnóstico cli.nico e relativamente fãcil de

ser efetuado em estaÇJios avançados da doença,quando as anor­

malidades do leite mostram-se bastante evidenciadas, sendo ob

05

servada a presença de coãgulos, flÕculos, alterações de cor ,

fluidez e odor (KASTLI, 1967; FIGUEIRED0,1962;BLOOD & H E N DE R

SON, 1976). A presença de alteração da glândula mamãria, deco2:

rentes da substituição do tecido glandular por tecido conjunt!

vo, detectãveis através da pa1pação, facilitam em muito o diaR

n õ s t i c o c 1 in i c o de s t a e n _f e rm i d a d e ( H E I O R I C H & R E N K , 1 9 6 9 ) .

A identificação das formas s~b~lfnicas da doença

~ dificil, constituindo-se em um grande problema da atualida­

de, devido ao elevado numero destes casos (PLASTRIDGE, 1958_;

GIESECKE & VAN DEN HEEVER, 1974), sendo, portanto, indispens~

vel o emprêgo de métodos auxiliares de diagnõstico (TOLLE

1971).

Vârios são os métodos auxiliares de diagnõstito da

mastite bovina, utilizãveis tanto a nivel de campo quanto a

nivel de laboratõrio, dentre os quais destacam-se:

California Mastitis Test (CMT)

SCHALM & NOORLANDER (1957), desenvolveram a pro­

v a do C a 1 i f o rn i a Mas ti t i s Te s t ( C M T ) ; i de a 1 i z a da p a r a u s o em

larga escala a nTve·l de campo, objetivando detectar a masti

te bovina, inclusive na sua forma subclinica.

A prova do CMT fúndamenta-se em três fenômenos

bem conheci dos, decorrentes da mas ti te bovina, representados

pelo aumento do numero de leucõcitos no leite, pelo fenômeno

de Whiteside, que na expressao de seu descobridor se traduz

pela formação de massa viscosa e, também,1n..a variação do .pH

(FIGUEIREDO, 1962).

O reagente quando adicionado a igual volume de

leite mastTtico, produz inicialmente uma gelificação com sub

sequente aparecimento. de filamentos ou flocos . ~sbranqui~a

dos. Esta gel i fi cação, que aparece gradualmente, e consequen

te a reaçao do alquiFb:enzeno sulfato de sÕdio contido no .de

06

tergente com o DNA dos leuc5cttos. A adição do violeta de bro

mocresol como indicador de pH proporciona a informação sobre

a alcalinidade patol5gica do l~ite (WITTLESTONE, 1970).

A prova do CMT tem evidenciado sua eficãcia, mas

ex i g e o p e r adores bem t r e i na dos . E s p e l h a o n ü me r o total de l e u

cõcitos e polimorfonucleares do leite, sendo um bom indicador

do estado sanitãrio do rebanho, devido a sua elevada concot~

d~ncia com a t~cnica de contagem celular, sendo mais precisa

que outros metades indiretos (DANIEL & cols.~ 1966; BRATTIE

19 6 7 ; AS TE R ~1A R K & c o l s . ., l 9 6 9 ) .

A concord~ncia da p~ova do CMT com a contagem leu

cocitãria é da ordem de 90 a 99% nos casos de resultados ne

gativos, istó e, amostras negativas ao CMT que apresentam-co~

tagens leucocitãrias inferiores a 500.000 leucõcitos/ml ( DA

NIEL & cols.~ 1966; BRPTTIE, 1967; MILLER.& KEARMS, 1967). A

concord~ncia entre estas provas nos casos de resultados posi

tivos, isto e, amostras reagentes ao CMT que apresentam conta

gens leucocitãrias iguais .ou súperior~s a 500.000 leucócitos/

ml, e·da ordem de 81,7% a 84,0% (MILLER & KEARJviS, 1967; PEAR­

SON & cols . ., 1970).

A concord~ncia da prova do CMT com o exame · batte

riolÕgico isto é, amostras positivas ao CMT em que e confir

mada a mastite através da investigação bacteriolÕgica, e da

õrdem de 67,4% a 85,7%, sendo esta concordância tanto maior

quanto mais fortemente positiva se apresentar a reaçao na

prova do CMT (FIGUEIREDO, 1962; LANGENEGGER & cols . ., 1970

Hl\RROP & cols.~ 1975).

As princtpais vantagens atribuídas a prova do CMT,

sao representadas pela eficiência n~ detecção de transtôr.nos

individuais dos quartos da glândula mamãria não p~rceptfv~is

clfniçamente, pela rapidez e facilidade de execução, pelo bai

xo custo, quando comparados a outros métodos de diagnõstico ,

07

pela praticabilidade e pelo pequeno numero de falsos- negati­

vos proporcionados (2,8%} (HEIDRICH & RENK, 1969; LANGENEGGER

& cols.> 1~70; HARROP & cols., 1975).

A prova do CMT apresenta como principais desvan­

tagens: o fato de não defini r exatamente o numero de leuoóci

tos nó leite; a presença de resultados falsos- positivos devi

do a variação fisiológica do numero de leucócitos observada

principalmente no infcio e final do periodo de lactação; a

interpretação é subjetiva no tocante a r.radação da positivid~

de (BLOOD & HENDERSON, 1976).

Prova de Whites·ide

WHITESIDE (1939) comunicou que a edição de 2,0ml

de solução normal de NaOH a 10,0 ml de leite mastítico, prod~

zia uma reação caracterizada pela formação de massa viscosa .

Entretanto este método_era pouco satisfatório, pois apresent!

va resultados positivos apenas diante de leite com alterações

evidenciadas macroscÕpicamente.

MURPHY & HANSEN (1941) modificaram a prova de

Whiteside, com o intuito de detectar alterações do leite nao

perceptíveis macroscópicamente. Estes autores conseguiram es

tabelecer uma relação entre o numero de leucócitos polimorfo-

nucleares presentes no leite com a viscosidade resultante da

reaçao entre o leite e a solução de NaOH.

O apareci~ento de massa viscosa ou gelif.icada

associada a ocorre'lcia de grumos e estrias, verificada nesta

- -reaçao, e atribuído ao aumento da permeabilidade e alise dos

leucócitos, determinada pela ação do hidróxido de sódio.A gr~

dação da positividade desta reação, permite estimar o conteu-

do leucocitãrio do produto (CORRtA & CORRtA, 1979).

OBIGER (1957} verificou uma elevada concordância

entre a prova de Whiteside e a contagem leucocitãria, cujos

08

p e r c e n tu a i. s f o r a m de 8 6 , 4 , 7 9 ; 6 e 7 4 , O , q u a n d o c o n s i de l~ a d a s

amostras oriundas dos quartos individuai·s~ mistura dos quar­

tos e amos·tras· dos latões, respectivamente.

A prova de Whiteside e a prova do CMT, sao as

mais freqUentemente utilizadas no diagn5stico da mastite bo

vina, sendo consideradas prãticas e eficientes. As vantagens

e desvantagens atribui das a prova de Hhi tesi de são pratica­

mente as mesmas da prova do CMT, uma vez que ambas fundamen­

tam-se na estimativa do conte~do l~ucocitãrio do leite (PLA~

TRIDGE, 1958; THOMPSON & POSTLE, 1974).

Contagem leucocitãria

Quantidades anormais de leucõcitos no lei·te são

geralmente indicação indireta de transtôrnos secretõrios da

gl~ndula mamãria. Este fato pode ser justificado pelo aumen~

to do numero de leucõcitos decorrente do mecanismo de defesa

do organismo animal, diante de processos infecciosos locali­

zados a n1vel de quartos glandulares (FIGUEIREDO, 1962;

CORRtA & CORRtA, 1979) ..

Segundo PLASTRIDGE (1958), o leite de v a c as

normais raramente contém acima de 500.000 leucõcitos por m·l ~

ao contrãrio do que ocorre com f~meas mast{ticas, cuja cont!

gem leucocitãria é geralmente superior a este valor (TOLLE ,

1971).

A concordância da contagem leucocitãria com o

exame bacterio15gico, isto é, amostras com contageos superiQ

res a 500.000 leucõcitos/ml em que é confirmada a mastite bo

vina através da investigação bacteriolÕgica, é da ordem de

87,0 a 90,0%(SINGH & BAXI,l980). Entre as amostras com conta

gens inferiores a 500.000 leucõcitos/ml,a mastite bovina não

é confirmada através da investigação bacteriol5gica em cerca

de 90,0 a 99,0% dos casos (SCHALM, 1957; PLASTRIDGE, 1958

B RA T TI E , 1 9 6 7) . ·

09

Embora ocorram variaç~es fisio15gicas principal

mente no inicio e final do oeríodo de lactação (HIPOLITO &

cols., 1965), bem como alteraç~es determinadas pela idade da

fêmea(WHITE & BLACKBURN, 1957), o método da contagem leucoci-

tãria é considerado um bom indicador da ocorrência da mastite

bovina (PEARSON & cols., 1970).

P e· s q u ;-s a d o te o r- de c 1 o r e t os

A pesquisa do teor de cloretos no leite é indi

cada como sendo um método rãpido e ·sensivel no diagn5stico da

mastite bovina, tanto em sua forma clinica quanto na subclinl

ca, pois, o aumento da concentração deste teor indica trans

t6rnos secretõrios da gl~ndula mamãria (EL-NAGGAR, 1973).

Durante o processo inflamat5rio da glândula ma

' mãria ocorre a dilatação dos vasos sanguineos que irrigam a

irea afetada, o que proporciona um aumento no volume de s~n

gue transportado, com uma velocidade de fluxo menor. Este fa

to aliado ao aumento da permeabilidade dos vasos, facilita a

chegada dos fluidos sanguineos a irea inflamada, atingindo co~

sequentementeo leite. Os fluidos apresentam concentrações de

s6dio, potãssio e cloro, semelhantes ãs do plasma. Assim, mes

clados ao leite, que por sua vez apresenta urna compos·i ção

constante detes elementos, acarreta alterações na composição

i~nica do produto, representadas principalmente pelo .aumento

de cloreto de sódio. Estas alteraç~es tornam-se ainda mais

e v i de n te s ã me d i da q u e di m i n u i a q u a n t i da de de 1 e i te p r o d u z i -

da (BARRY & RAWLAND, 1953; ROOK & WHEELOCK, 19167).

A pesquisa do teor de cloretos é conoecida des

de 1917, quando HAMMER & BAILEY descreveram u~ método volumé­

trico para a sua determinação aproximada. ROSSEL (1931) ... modi

ficou a reação objetivando resultados mais precisos .. -HAYDEN

(1932) desenvolveu um método rãpido de dPtermiinação e na sua

opinião, a mas ti te estã presente rquando o teo.r de cloretos e

superior a O, 14%.

10

-EL-NAGGAR (1973} desenvolveu uma metodologia ra

pida e s·ensí~el, realizável a n1vel de campo, capaz de diag­

nosticar a mastite tanto em sua forma cl1nica quanto sub

cllnica. Segundo ~ste autor, a maioria dos pesquisadores con

cordam em afirmar que o aumento do teor de cloretos no leite

e sinal patognomônico da mastite bovina. Entretanto,HEIDRICH

& RENK (1969) e CECILA (1980), afirmaram que esta pesquisa é

de valor limitado, pois ocorrem considerãveis variações fi

siolÕgicas, individuais e raciais, que contribuem para a ele

vaçao do teor de cloretos, além do que, o leite normal apr~

senta este teor aumentado no inicio e final do periodo de

lactação.

Vãrios autores observaram que na mastite bovina

ocorre aumento de teor de cloretos no leite,quando comparado

ao lei te normal (SJOLLEt~A & VAN DEN ZANDE, 1922; BARRY & RAW

LAND, 1953; ROOK, 1961; CECIL &cols., 1965; WHELLOCK & co ls. _,

G UI L L E S , 1 9 6 6 ; TAPE R NO U X & c o ls . _, 1 9 6 7 ; M U L DO O N & L I S K A , 1 9 71 ;

EL-NAGGAR, 1973; NEWSTEAD; 1973;0SHIMA & cols._,<l974; CHANDER &

BAXI, 1975).

O teor de cloretos no leite procedente de vacas

sadias e infectadas e de o, 137% e 0,192%, r e s p e c ti v a mente

(BRYAN & TROUT, 1935). Segundo NARAYANAN & IYA (1954), a co~

centração média do teor de cloretos no leite de vacas sadias

e inferior a 0,09%, enquanto que WAHB.'? & NARS (1957), assina

laram· uma concentração media de 0,133%(0,0939 -o, 1737%

p a r a fê me as não i n f e c ta das .

CHANDER & BAXI (1975) utilizando vãrios métodos

de diagnõstico da mastite bovina, observaram que a pesquisa

do teor de cloretos no leite apresentou uma concordância de

apenas 52,0% com o e~ame bacteriolÕgico, sendo este perce!!_

túal inferior ao de todos os outros testes estudados.

11

NADER fiLHO & MIGUEL (19811, realizaram um estu

do comparativo entre as provas do CMT e pesquisa do te o r.

de cloretos na detec~~o da mastite su5clfnica em bovinos,te~

do observado uma elevada associação positiva entre ambas as

provas (concordância de 80,11%). Estes autores concluiramser

indiferente o uso de uma ou de outra prova como m~todo auxi­

liar de diagn6stico da mastite.

Prova de pus

A prova de pus, tem por objetivo avaliar a sani

dade do produto a ser dado ao consumo, sendo muito utilizada

a n1vel de estabelecimentos industriais. Nesta prova, a pr~

sença de pus~ indicada pela formaç~o de filamentos ou :gr~

mos, resultantes da adiç~o de amonfaco no leite. Embora esta

prova seja muito difundida, pouco se conhece sobre a sua efi

ciência ( BEHMER, 1978).

Prova da redução do azul de metileno

Segundo LOPES & coZs.(l964), ~prova da redução

do azul de metileno adquire grande importância industrial,

pois permite classificar os vãrios tipos de leite com simpl!

cidade e rapidez.

A maioria dos microrganismos presentes no leite

elaboram um enzima, redutase, capaz de modificar o potencial

de oxi-redução do produto, descorando, assim, o a.zul de meti

leno. Sua apreciação colorométrica, portanto, permite esti

mar a população microbiana do leite. O tempo de redução de

pende do numero de microrganismos presentes, sendo, portanto,

estabelecida uma relação indireta (FOSTER & coZs., 1975;VEIS

SEYRE, 1972). Entretanto, segundo LOPES & coZs.(l964),hã va

ri ações na capacidade redutora dos diferentes microrganismos.

Alguns estreptococos causadores da mastite bovina, por exem­

plo, possuem a peculiaridade de não reduzir o azul de metile

Strtlço da Biblioteca e Documtnração fACUlDADE DE SAÚDE PÚBliCA OIIYEISIDADE DE SlO PAULO

12

leno, o qual exerce uma açao inibidora sobre os mesmos.Assi~

sendo, estas bact~rias podem estar presentes em n~mero el~va

do no leite sem que a prova da redução do azul de metileno

r e v e 1 e e s te f a to .

In v e s ti'ga· Ção· 'f:>' a c te ri'o'lõg·i' c a

A investigação bacteriol6gica representada pelo

isolamento e identificação do agente etiol6gico, atrav~s de

meios e provas espec1ficas, constitui-se no m~todo mais efi-

ciente de diagnõstico, muito embora os resultados nega ti, vos

não excluam, obrigatoriamente, a possibilidade de · infecção

(HIPOLITO & cols._, 1965).

Diante do exposto, depreende-se:

que a mastite limita a exploração econômica

leiteira, por causar progressiva queda na prQ

dução de leite, a medida que se propaga no r~

banho, al~m de oferecer riscos a sa~de do con

sumi dor;

a necessipade de maiores informações sobre os

m~todos auxiliares de diagnóstico, uma vez

que sao mencionadas controv~rsias em r~lação

a sua efici~ncia no diagnõstico da mastite bo

vi na;

- a inexist~ncia de informações sobre o compor

tamento das anâlises de rotina efetuadas pelo

Serviço de Inspeção junto aos esta b e 1 e c i me n

tos industriais, no que se refere a detecção

da mastite bovina a n1vel de plataforma de re

cepçao;

a necessidade de maiores informações sobre a

prova da redução do azul de metileno, . tendo

em vista a afirmação de LOPES & cols. (1964)no

13

que se refere a efici~ncia desta prova diante

de alguns estreptococos causadores da mastite

bovina;

- a inexfst~ncia de informações sobre a relação

existente entre a contagem padrão em placas e

a prova da redução do azul de metileno, dian­

te dos virias agentes etiol6gicos da ... mastite

bovina;

-a ausencia de dados sobre a preval~ncia desta

enfermidade, bem como a distribuição dos age~

tes etiol6gicos na região do Municfpio de

Barretos/S.!?:

- que a identificação dos quartos g 1 a n d u 1 a r e s

afetados constitui uma das etapas i ni ci ais de

fundamental importância para a execução de

programas de contrôle desta enfermidade.

*****

Pelas razoes apresentadas, cremos ter jus ti f·i c~

do a oportunidade deste trabalho, que tem por f i n' a 1 i d a de

atingir os seguintes objetivos:

-Conhecer a prevalência da mastite bovina e a

distribuição dos agentes etiolÕgicos isolados

entre os rebanhos lei te i ros das propriedades

produtoras de leite tipo B, localizadas na re

gião do Municfpio de Barretos/SP.

- Conhecer a capacidade de detecção da mas ti te

bovina das provas: pesquisa do teor de clore-

tris, prova de Whiteside e a pesquisa de -pus '

realizadas nos estabelecimentos industriais.

1 4

- Verificar a relação existente entre a contagem

padrão em placas e a prova da redução do azul

de metileno, considerando-se os vãrios a~entes

eti.olÕgicos·.

- Verificar o comportamento dos agentes etiolÕgi

cos da mastite bovina, diante da prova da redu

-çao do azul de metileno.

-Verificar a relação existente entre o 11 Califor

nia Mastitis test 11, contagem leucocitãria e

pesquisa do teor de cloretos com o exame bacte

riolÕgico.

2.- MATERIAL E METODOS

Foram submetidos a prova do 11 California Mastit·is

Test 11 (CMT), 468 vacas leiteiras pertencentes a seis propri~

da de s r u r a i s p r o d u to r as de 1 e i te t i p o B , 1 o c a 1 i z a da s n a .re

gião do Municfpio de Barretos/SP. Ap6s a colheita de amos

tras de leite das fêmeas reagentes, efetuou-se a pesquisa do

teor de cloretos, a contagem leucocitãria e o isolamento e

identificação do agente etiológico, com o intuito de conhe

cera prevalência da doença nesta região, a distribuição dos

agentes etiológicos e de analisar comparativa~ente a eficiên

cia destas provas no diagn6stico da mastite bovina. Reali

zou-se, ainda, a contagem padrão em placas e a prova da redu

tàse, a fim de verificar a relação existente entre ambas as

provas e de conhecer o comportamento dos agentes etiológicos

isolados, diante da prova da redutase.

Simultâneamente, o leite de conjunto de cada pr.2_

1 6

priedade, contendo inclusive o produto das fêmeas reagentes

ao CMT, foi submetido a pesquisa do teor de cloretos, a pr.~

v a de ~1 h i t i s i de e a p e s q ui s a de p u s , c o m o i n t u i t o de c o n h e -

cer a eficiência destas provas na detecção da mastite bovi

na, a nível de estabelecimentos industriais. Efetuou-se,ai~

da, as anãlises de rotina do Serviço de Inspeção, represen­

tadas pela acidez, densidade, teor de gordura, extrato seco

total, extrato seco desengordurado, ponto crioscõpio, redu

tase e contagem padrão em placas, com o objetivo de comp~

rar com os padrões estabelecidos pelo Ministério dá Agricu_l

tura. Estes procedimentos são a·presentados detalhadamente a

seguir:

Propriedade rurais

Foram estudadas seis propriedades rurais produt~ • ras de leite tipo B, localizadas na região do Município de

Barretos, Estado de São Paulo, as quais correspondiam a to

talidade dos estabelecimentos produtores deste tipo de lei

te na referi da região.

Características da população bovina

Os rebanhos eram constituídos, em sua grande

maioria, por animais da raça holandesa variedades preta e

branca e vermelha e branca, sendo verificada a presença de

animais da raça pitangueiras em apenas uma das propriedades

visitadas. Em todas as fazendas adotava-se o sistema de or

denha mecânica, realizada duas vezes ao dia, cuja produção

média diãria situava-se em torno de 9,5 litros por vaca.

Amostras de lei te

Durante o período de agosto a outubro de 1982

1 7

468 vacas leiteiras foram submetidas ao 11 California Mastitis

Test 11 {SCHALM & NOORLANDER, 1957), com o intuito de verificar

a prevalência da mastite bovina nas propriedades rurais loca

lizadas na região·em estudo. A escolha destes animais era

efetuada ao acaso, sendo analisadas cerca de 60% das fêmeas

lactantes em cada fazenda.

Diante dos resultados positivos ou suspeitos, co

lhia-se em tubos de ensaio esterilizados, 50,0 ml de leite

dos quartos reagentes, obedecendo-se as normas de assepsia

(VEISSEYRE, 1972). Em seguida, as amostras eram acondiciona­

da s e m c a i x a de m a te r i a 1 i s o te rm i c o ( 11 i s o p o r " ) , c o n te n do cu

bos de gelo, sendo transportadas para o laboratõrio do Depa~

tamento de Higiene Veterinãria e Saude Publica da Faculdade

de Ciências Agrãrias e Veterinãrias de Jaboticabal-UNESP.

No referido laboratõrio, as amostras eram submeti

das a contagem padrão em placas e a prova da redutase (MINI~

TtRIO DA AGRICULTURA, 1981), a fim de verificar a relação

existente entre ambas as provas. Em seguida, efetuava-se a

pesquisa do teor de cloretos (EL-NAGGAR, 1973), contagem leu

cocitãria (SUBCOMMITTEE on Screening Test National Mastitis

Council, 1968) e o isolamento e identificação do possível

agente etiológico, com o objetivo de confirmar a pres~nça do

processo infeccioso entre as fêmeas reagentes a prova do CM~

Simultâneamente, o leite de conjunto de cada pr.Q_

priedade, contendo inclusive o produto das fêmeas reagentes,

era analisado no laboratório do Lacticinio Flor da Nata Ltda,

localizado em Barretos/SP, (SIF nQ 2186) de modo que a parti­

da de lei te analisado contivesse o produto· Ela ordenha por

nõs estudada. A coleta de amostras era efetuada de· acord.o com

a rotina do Serviço· de Inspeção do Ministério da Agricultura,

ou seja, uma mistura de todos os latões orocedentes da pr.Q_

18

priedade considerada.

A determinação da densidade, teor de gordura, aci

dez, extrato seco total, extrato seco desengordurado, ponto

criosc5pico, redutase e contagem padrão em placas ( MIMIST~

RIO DA AGRICULTURA, 1981), era realizada com o intuito de

comparar com os padrões estabelecidos .pelo Mini"stério daAgri

cultura, enquanto que a prova de \.Jhiteside, pesquisa de pus, e

a pesquisa do teor de cloretos (MINISTtRIO DA AGRICULTUTA

1981), eram efetuadas com a finalidade de determinar a sensi

bilidade e a especificidade em relação a mastite bovina pr~

valente em cada propriedade.

Posteriormente, inic.iou-se uma nova etapa. com o

objetivo de verificar o comportamento dos agentes etiológicos - .

{solados na fase anterio~,diante da prova da redução do azul

de metileno. Selecionaram-se lO (dez) f~meas negativas ao

CMT, das quais colheram-se 100 ,O ml de lei te de cada uma, em

frascos esterilizados, observando-se os mesmos cuidados de

assepsia e transporte jã.mencionados.

As amostras eram submetidas a contagem padrão em

placas e a prova da redução do azul de meti leno(MINISTtRIO DA

AGRICULTURA, l98l).Em seguida, cada amostra era fracionada em 2

(duas) sub-amostras com cerca de 50,0ml cada,sendo formado desta

forma, dois grupos, contendo cada um, 10 {dez) sub-amostras.

As amostras do primeiro grupo eram submetidas ao

processo de autoclavação em vapor fluente durante 20 minutos.

Em seguida,? (sete) ~~las foram inoculadas Staphylococcus a~

reus_, Streptococcus dysagalact1:ae_, Streptococcus agalactiae_,

Streptococcus uberis_, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus

epidermidis e Escherichia coZi, respectivamente. As 3 (três)

sub-amostras restantes, também foram inoculadas com

Streptococcus dysagalactiae, Streptococcus agalactiae_,

19

e Streptococcus uberis respec~ivamente. O inEculo consistiu

de 3 (tr~sl alçadas de cultura desses agentes~ sendo estas

sub-amostras mantidas a 32QC por 3 (tr€s) horas. Decorrido

este interv-alo de tempo, efetuava-se a contagem padrão de

placas e a prova da redução do azul de metileno (MINISTtRIO

DA AGRICULTURA, 1981}.

O tratamento dispensado 'âs sub-amostras do segu~

do grupo, diferia do anterior, apenas no fato do leite

ser submetido previamente a tratamento têrmico. Assim,

demais passos representados pela inoculação do agente,

-na o

os

tem

peratura e tempo de incubação, contagem padrão em placas, e

prova da redução do azul de meti leno, foram conduz·i dos de

forma id€ntica (MINISTrRIO DA AGRICULTURA, 1981).

Têcni cas

California Mastitis Test (CMT

De acordo com a têcnica proposta por SCHAM &

NOORLANDER (1957), desprezavam-se os tr€s primeiros 11 jatos"de

leite, sendo as amostras.obtidas diretamente do úbere em

uma bandeja plãstica apropriada, contendo quatro "bocais"ou

"copos" distintos.

Colhiam-se cerca de 2 ,Oml de lei te de cada qua_!:

to da glandula mamãria nos respectivos "copos", aos quais

adicionava-se igual quantidade de reagente (Solução on -

FATEC*). Apôs a execução de movimentos circulares e unifor­

mes imprimidos ã bandeja, realizava-se a leitura

(*) Solução CMT-FATEC/ Eôrmula

Violeta de bromocresol ------------------------0,02% Alquil-benzeno-sulfato de s5dio ________________

1,

34%

Veiculo Q.S.Q--------------------------------100,00%

20

A interpretação do resultado da prova baseava -

se na seguinte convenção: negativo (-}, suspeitos ou traços

{T), fracamente positivos (+), distintamente positivos (++)

e fortemente positivos (+++),em··função do aparec.imentoounãode

gel e alteração do pH, esta ultima evidenciada pelo indica

dor violeta de b}~omocresol, contido no reagente (HIPliLITO &

col., 1965).

Pesquisa do teor de cloretos

De acordo com a t~cnica proposta por EL- .NAGGAR

(1973),adicionavam-se em um tubo de ensaio, 0,5 ml de leite

5,0 ml de solução de nitrato de prata a O, 134% e 3 gotas de

solução de cromato de potassio a 10,0%. Apõs a agitação ef~

tuava-se a leitura do resultado, sendo consideradas positi­

vas as amostras que apresentavam coloração entre o beje e

o amarelo canario, e negativas as que revelavam coloração

entre o vermelho tijolo e o marron claro.

Deve-se assinalar que esta técnica proposta por

EL-NAGGAR (1973), foi aplicada apenas ãs amostras que apr~

sentavam positividade ou suspeição ante a prova do CMT, e

foram realizadas no laboratõrio do Departamento de Higiene

Veterinaria e Saude Publica da FCAVJ/UNESP.

Por outro lado, o leite de conjunto da proprie­

dade, também era submetido a pesquisa do teor de cloretos ,

no laboratõrio do Lacticinio Flor da Nata. Entretanto, a

técnica adotada oelo Minist~rio da Aaricultura, diferia da . . ~

quela empregada no laboratõrio do Departamento de Higiene

Veterinaria e Saude Publica da FCAVJ/UNESP, embora o funda

mento da prova fosse o mesmo. Assim sendo, utilizavam - se

21

10,0 ml de leite, aos quais adicionavam-se 4,5 ml de solução

de nftrato de prata O,lN e 8 a 10 gotas de solução de crema

to de potissio a 10,0%. Ap6s a agitação efetuava-se a leitu

ra, de modo fnd~ntico a t~cnica proposta por EL-NAGGAR(l973).

Contagem padrão em placas

-Para aexecuçao desta prova, apos a homoge:inj_

zaçao de amostras de leite, preparavam-se diluiç~es de 10 -1

até 10-5, empregando-se como diluente solução salina a 0,85%.

Em seguida, 1,0 ml de cada diluição era colocado em placas ~

de Petri esterilizadas, em dup'licatas, vertendo-se a seguir

cerca de 10,0 ml de agar padrão (Difco-B0-479), previ,amente

fundido e resfriado a 43/459C.

ApÕs a homogeinização e solidifi·cação em temper~

tura ambiente, as placas eram incubadas em estufa a . 32Q.C

por 48 horas, quando efetuava-se a contagem de colÔnias. O

numero de colônias contados em cada placa, contendo entre 30

e 300 colônias, era multiplicado pela respectiva da diluição

correspondente e o resultado obtido expressava o numero de

microrganismos mesÕfilos aerõbios ou facultativos, viãveis

por ml de lei te. {MINISTtRIO DA AGRICULTURA, 1981).

Prova de redução do azul de meti leno

De acordo com a t~cnica adotada pelo Ministério

da Agricultura (1981), preparava-se uma solução de 11 estoque 11

de azul de metileno, dissolvendo-se l,l g de corante seco

em 500 ml de ãgua destilada, sendo esta solução mantida em

frasco escuro.

Para a realização desta prova, a cada l ,O ml de

solução de 11 estoque 11 adicionavam-se 39,0 ml de ãgua destilada.

22

Em seguida, 1,0 ml desta solução era adicionada a 10,0 ml da

amostra a ser analisada. A incuóação era efetuada em banho -

maria a 37gc, at~ o momento da descoloração, quando então re

gistrava-se o tempo decorrido para a viragem da cor azul P!

ra a branca.

Contagem leucocitãria

A contagem de c~lulas somãticas no leite, foi

efetuada atrav~s de microscopia direta, de acordo com a t~c

nica proposta pelo SUBCOMMITTEE on Screening Tests National

Council, (1968), a qual~ uma modificação da t~cnica propo~

ta por BREED (1910).

Para a execuçao desta prova, espalhava-se 0,01

m l da amos t r a de 1 e i te s o b r e a c â ma r a de N e u b a u e r , n um a

- 2 -a r e a c i r cu 1 a r de 1 c m . A p o s a s e c a g e m , o e s f r e g a ç o e r a c o

rado pelo m~todo de Newman e, em seguida, usando-se a obje­

tiva de imersão, efetuava-se a contagem de todas as c~lulas .

somãticas nucleadas presentes na unidade da ãrea examinada .

. Determinação da densidade

De acordo com a t~cnica recomendada pelo MINIS-

TE'RIO DA AGRICULTURA (1981), vertiam-se cerca de 200 ml de

leite em uma proveta, cuja capacidade era de 250 ml, tendo­

se o cuidado de evitar a formação de espuma.

Em s e g ui d a , me r g u 1 h a v a.- s e o ·: te r mo 1 à: c t o de n s i m ~

tro, sendo a leitura da densidade efetuada a altura do ni

vel do leite. Simultâneamente, anotava-se a temperatura ob

servada na escala superior do aparelho. Caso esta temperatu­

ra fosse diferente de l5QC, efetuava-se a correção do va

lor da densidade através do uso de tabela apropriada.

23

De!ermjnação do teor de gordura

A determinação do teor de gordura foi ré ali za da

através do Butirômetro de Gerber, ao qual juntavam-se 10,0 ml

de acido sulfúrico (D=l,820), 11,0 ml de leite e 1,0 ml de

alcool amilico (D=0,815). Apõs a homogeinização, esta mistura

era submetida a centrifugação (800/1200 rpm) durante 3 a 5

minutos.

O percentual de gordura da amostra de leite exami

nada, correspondia ao percentual da camada gordurosa verifica­

da na escala do aparelho.

Determinação do extrato seco total

De acordo com a técnica recomendada pelo MINISTr

RIO DA AGRICULTURA (1981), a determinação do extrato seco to

tal foi realizada através do calculador de Ackermann. O referi

do calculador ~constitui do por dois discos superpostos ,sendo

um mõvel, com graduações. correspondentes a densidade, e o ou

tro fixo, onde são encontradas duas ordens de graduações; a

primeira, mais interna, denota o percentual de gordura, enqua~

to que a segunda, mais externa, mostra o extrato seco total.

Para a determinação do extrato seco total, fazia­

se coincidir o valor da densidade com o valor do teor de gord~

ra obtido. Assim, o ponteiro indicador existente no

disco, apontava o valor do extrato seco total.

Determinaçaõ do extrato seco desengordurado

primeiro

A determinação do extrato seco desengordurado,era

realizada através de .subtração do teor de gordura, obtido P!

lo método de Gerber, do extrato seco total, obtido pelo calcu­

lador de Ackermann (MINISTtRIO DA AGRICULTURA,l981).

24

Determinação da acidez

A determinação de acidez foi realizada atraves

do metodo de Dornic. Assim, em um érlemeyer juntavam-se 10,0

ml de leite e 3 a 5 gotas de solução de fenolftaleina(2,0%).

Paralelamente, em uma bureta graduada de 25 ml, colocavam- se

25 ml de solução de Hidroxido de sõdio (N/9).

Para a titulação gotejava-se a solução(NaOH/9

ao leite contendo fenolftaleina até o aparecimento de ligel

ra tonalidade rosa, sendo anotada a quantidade de soda Dor

nic gasta durante o processo. Este nGmero multiplicado por

10, correspondia ao grãu de acidez da amostra analisada(Ml

NISTtRIO DA AGRICULTURA, 1981).

Determinação dd pontd triost5~ico

A determinação do ponto crioscõpico do leite foi

realizada através de Lactocrioscõpico. Assim, adicionavam­

se cerca de 10,0 ml de leite em tubo de ensaio apropriado ,

sendo este, imediatamente colocado no interior da cuba cons

tituinte do aparelho, a qual apresentava uma temperatura em

torno de -5QC, obtida através da mistura de gelo e clo~eto

de sõdio.

O tubo de ensaio contendo q amostra de leite

era acoplado a um termômetro especial de mercúrio, .çuja

graduação era em centésimos de grãu. Através de uma haste

efetuava-se continua agitação da amostra, até o ponto de

congelamento, verificado pela estabilização da coluna de

mercGrio (MINISTtRIO DA AGRICULTURA, 1981).

25

Isolamento e identificação do~ pds~fveis agentes atiol6gicos

No isolamento de bactérias pertencentes a este

g~nero, eram utilizados o ãgar StaphyZococcus 110 (Difco) e

o ãgar Baird-Parker (Oxoid), recomendados pela AMERICAN PU

BLIC HEALTH ASSOCIATION (1976). As· amostras de leite ~ram se

meadas nestes meios, seguindo-se a técnica proposta por DEMf

TER (1969). Ass~m, adicionavam-se 10,0 ml de leite em tubos -

de forma c~nica (17xl08 mm) e centrifugava-se a 3000 rpm por

1 O m i I! u tos . Em segui da , de s p r e z a v a -se o s obre n a da n te e , c o m

alça de níquel-cromo, semeava-se o sedimento na suoerf1cie

dos referidos meios, empregando-se a técnica de esgotamento,

sendo as placas incubadas a 379C por 24/48 horas.

Apõs a incubação, havendo cre?cirnento de colô

nias com coloração amarelada ou branca no agar StáphyZocoE_

cus 110, algumas delas eram submetidas a verificação micros­

c6pica em esfregaços corados pelo método de Gram. Das eolô

nias que se revelassem com cocos Gram-positivos em cachos,

eram isoladas até duas de cada uma, as quais eram semeadas em

agar nutriente inclinado. No local da retirada da colônia,g~

tejava-se solução de azul de bromo-timol a 0,0'4% e deixava-se

a placa em repouso por 10 minutos. O aparec_5nwento de colora

ção amarelada, indicava ser a prova do manitol positiva, en

q u a n t o q u e a c o r e s v e r de a d a , de n o ta v a p r o v a de ma n i to 1 n e g a +.

tiva. Em seguida, vertiam-se 5,0 ml da solu.ç.ão aquosa de sul

fato de amônia saturada sobre a superffcie do meio sendo a

placa, a seguir, mantida durante 10 minutos em estufa a 379C.

O aparecimento da zona transparente ao redor da colônia indi

cava prova positiva para a produção da gelatinase.

26

As col~nias que em agar Baird-Parker se aprese!:!_.

tassem com coloraçio negra circundadas por uma zona transpa­

rente, eram tamb~m submetidas a verificação microsc~pica em

esfregaços corados pelo m~todo de Gram. Das col5nias que se

revelassem com cocos Gram-positivos em cachos, duas eram iso­

ladas e semeadas em ágar nutriente inclinado.

Os tubos de ensaio contendo pagar nutriente incli

nado semeados com as colônias isoladas de ambos os me i, os ,

eram incubadas a 37QC por 24-48 horas. Apõs a incubação, era

realizado um repique de cada cepa para agar nutriente incli~

·nado e depois conservado em refrigerador a 4QC, para sua ma

nutenção.

A partir dos outros tubcs, realizavam-se as pr~

vas de catalase (HARRIGAN & McCANGE, 1969), ,c)xi dação e fer

mentação (0-F)da glicose, coagulase, DNase (AMERICAN PUBLIC

HEALTH ASSOCIATION, 1976), utilização do manitol e .hemÕlise

{BLAIR & coZs., 1971) e da lecitinase (ITO & coZs.~l969) que

-serao apresentadas detalhadamente a seguir.

Prova da catalase

Para a execuçao desta prova, as cepas ·isdladas

eram semeadas em caldo de infusão de cérebro e coração(Difco)

e, a seguir, incubada a 379C por 24-48 horas.Posteriormente,

a cada tubo adicionava-se 1 ,O ml de solução de ãgua oxigena­

da a 3%e efetuava-se a leitura, sendo a prova considerada PQ

sitiva quando ocorria.1.0 despreendimento de bolhas. Paralela-

mente, eram realizadas as provas contrôles positiva e neoa . ~-

tiva, empregando-se culturas de StaphyZococcus epidermidis e

Streptococcus faecalis,respectivamente (HARRIGAN & McCANCE ,

1969).

27

Prova de oxi'daÇão e ferme·nta·ção· -da· -g'li cose (O-F)

As cepas isoladas eram semeadas no meio para a

prova da 0-F, pot~ picada, usando fio longo, de modo que o

in6culo atingisse o fundo do tubo. Cada cepa era semeada em

dois tubos de ensaio contendo o referido meio, sendo que em

um deles, a superf1cie era coberta com vaselina l1quida este

ril. Havendo a produção de ãcido em toda a extensão do meio

em a m b os os t u b os , ou se j a , p r o v as de o x i dação e de f e rm e n t a­

ção positivas, o microrganismo era classificado como sendo

do gênero StaphiLococcus. A acidificação era evidenciada p~

la viragem de cor do indicador do verde para o amarelo(AMER!

CAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, 1976).

Prova da coagulase livre

P a r a a e x e c u ç ã o de s ta p r o v a , a s c e p a s i s o l a d a s

eram semeadas em caldo de infusão de cérebro e coração(Difco)

e, incubadas a 379C por 24-48 horas. Posteriormente, em tu

bos de ensaio (10x70 mm),· juntavam-se 0,25 ml desta cultura

a 0,5 ml de plasma de coelho citratado (dilu1do a 1:5 em so

lução fisiol6gica a 0,85~. Ap6s a agitação, os tubos eram in

. cuba dos a 3 7 9 C , se n do as 1 e i tu r as real i z a das a p 6 s 1 , 2 , 4 e

24 horas. O resultado era considerado positivo quando .:ocor

ria a coagulação do plasma. Simult~neamente eram reáltzadas

provas controles positiva e negativa, empregando-se culturas

de Staphy Zococcus aure us e de Staphy Loco ccus epi de rmi dis , r e s­

pectivamente. ( AMERICAN PUBLIC. HEALTH ASSOCIATION, 1976).

Prova da desoxirribonuclease (DNase)

A prova da DNase era realizada a partir de cult~

ras de 24 horas em caldo de infusão de cérebro e coração(Dif.

co) a 379C. A semeadura era efetuada em estria curta, na su

perf1cie do ~gar DNase (Oxoid), em plac~s, sendo estas, a

28

seguir,incub~das por 24 horas a 37QC. Ap5s a incubação, a su

perf{cie do meio era banhada com solução de ~cido cloridrico

,N/1. A prov.a era considerada pos·itfva, quando ocorria o apa­

recimen~o de zona clara em torno da·semeadura, indicando des

te modo, a despolimerização do ~cido desoxirribonucl~ico em

decorrência da ação desoxirribonuclease produzida durante o

crescimento bacteriano (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION ,

19 76) .

Utilização do manitol

Para a execuçao desta prova, as cepas isoladas

eram semeadas em estria em placa contendo ãgar manitol salg~

do (Difco), sendo estas, a seguir, incubadas a 37QC por .24

horas. A prova era considerada positiva, quando ao redor do

crescimento bacteriano, o meio apresentava c-oloração amorela,

determinada pela viragem do indicador vermelho de fenol, ac~

sando deste modo, a produção de ãcido a partir da ·utiliza

ção do manitol(BLAIR & cols._, 1971).

Verificação da hem51ise

As cepas isoladas eram semeadas, em estria, 1na

superf1cie do ãgar sangue(Difto ), em placas, sendo estas, a

seguir, incubadas a 37QC por 24 horas. A prova era conside­

rada positiva, quando ao redor das colônias, desenvolvia- se

um halo de hemolise (BLAIR & cols._, 1971).

Pfdva da lecitinase

O teste de atividade lecitinãsica (produção de 1 e c i; ti n as e )

era efetuada em ãgar NI, adicionado de gema de ovo(ITO i&

cols._, 1969). Apos a semeadura em estria, em placas, estas

eram incubadas a 37QC por 24 horas. A prova para produção de

lecitinase era considerada positiva, quando ocorr~a uma zona

de opalescência ao redor da semeadura. Quando ap5s 24 horas

29

de incubação a p~ova e~a neg~tiva~ as placas e~am reincubadas

por mais 24 horas a 370C, ap6s o que efetuava~se a leitura "fi

na 1 •

Com a realização destas provas, as cepas isoladas ~

podiam ser classificadas como pertencentes ao genero StaphyZ~

coccus, porem para serem consideradas como sendo da :espécie

s. aureus, levava-se em consideração, fundamentalmente, a pr.2_

va positiva para produção de coagulase (SPERBER & TATTINI; 1975).

As que se apresentavam negativamente a esta prova, pode Piam

pertencer as espécies S. epidermidis ou S. saprophyticus.

B a c te ri as· ·do gênero Strep toco cc~s

No isolamento de bactérias pertencentes a este g~

nero, eram uti 1 izados o me i o de Edwards (Oxoi d) e o agar san

gue azida (Difto), recomendados pela AMERICAN PUBLIC HEALTH

ASSOCIATION (1976). As amostras de leite eram semeadas nestes

meios, seguindo-se a técnica proposta por DEMETER (1969), sen

do as placas incubadas a_ 37QC por 24-48 horas.

Ap6s a incubação, havendo o crescimento de [olô

nias puntiformes com ou sem halo de hemõlise, eram também su~

·metidas a verificação microsc6pica em esfregaços corados pelo

método de Gram. Das colônias que se revelassem com cocos· Gram­

positivos em cadeias, eram isoladas até duas de cada uma(hem.2_

lítica e não hemolítica), as quais eram semeadas em agar nu

triente inclinado, sendo estes, a seguir, incubados a 37QCpor

24-48 horas.

A partir destes tubos, realizavam-se as provas da

catalase (HARRIGAN & McCANCE, 1969), da verificação do cresci

mento a lOQC e 45QC (FOSTER & coZs., 1969), de hemÕlise(BLAIR

& coZs., 1971), da hidrÕlise da esculina e do hipurato de s§..

dio, do CAMP-Test (DEMETER, 1969) e da utilização de carbohi-

30

dratos e alcoois, representados pela rafinose, arabinose,mal - - . ' . . .

tose, sacaro.se, salic\na. lactose, trealose~ inulina~ glice-

rina, manit61, sor5itol e amido (DEMETER, 1969; AMERICAN PU

BLIC HEALTH ASSOCJATION, 1976). Estas provas serao apresert"t~

das detalhadamente a seguir.

P r o" v a· c a ta la s e

Para a execução desta prova, adotava-se a técnica proposta

por HARRIGAN & McCANCE (1969), descrita no isolamento e iden

tificação das bactérias pertencentes ao genero StaphyZococcus.

Verificação do trescimento a l09C e 459C

Cada cepa isolada era semeada em dois tubos de

ensaio contendo caldo de infusão de cérebro e coração(Difc·o),

os quais eram incubados a l09C e 459C, respectivamente, du

rante 24-48 horas. Apõs a incubação, efetuava-se· a leitura ,

sendo a prova considerada positiva quando ocorria a turvação

do caldo, cujo crescimento era comprovado pela verificaçãom_j

croscõpica em esfregaços _corados pelo método de Gram. Simul-

taneamente eram realizadas provas de controle negativa,

pregando-se tubos de ensaio contendo caldo de infusão de

'rebro e coração sem inõculo (FOSTER & coZs.~ 1969).

Verificação da hemõlise

em

-c e-

As cepas isoladas eram semeadas, em estria, na

superf1cie de ãgar sangue (Difco ) , em placas, sendo estas ,

a seguir, incubadas a 379C por 24 horas em atmosfera de co 2 .

A hemÕlise era considerada como sendo do tipo alfa, quarido

ao redor das colÔnias, desenvolvia-se um halo de hemÕlise

parcial, procurando-se constatar, também, a viridescência,

através da presenÇa de coloração esverdeada no referido halo.

A hemõlise era consi"derada como sendo do tipo beta hemol1ti­

co, quando ao r.edor das colônias, desenvolvia um halo de

31

hem5lise total, com evidente clareamento do sangue. Eram con

siderados como sendo do tipo gama ou ine~te, quando, ao re

dor das col~ni~s, havia aus~ncia de hem~lise (BLAIR & cols.~

1971).

Para a execução desta prova, as cepas eram seme~

das em caldo extrato 1de carne (Merck) e, incubadas a 379C por

4 dias. Ap~s a incubação. adicionava-se 1 ,O ml de solução de

cloreto ferrico a 7%, agitava-se e efetuava-se a leitura. A

prova era considerada positiva, quando ocorria o aparecimen­

to de um precipitado negro esve.rdeado,e, negativa, quando o

meio apresentava coloração amarelada (DEMETER, 1969).

Hidr5lise do hipOr~to de s5dio

As cepas isoladas eram semeadas em caldo simples

contendo 1% de hipurato de s5dio e, incubadas a 37%C por 4

dias. Apõs a incubação, juntava-se em um tubo de ensaio, 1 ,O

ml de sobrenadante destas culturas a O ,3 ml de solução de

cloreto ferrico (12 g. de cloreto ferrico, 0,25 ml de 1.ãcido

clorídrico concentrado e 100,0 ml de ãgua destilada). ApÕs a

agitação desta mistura, efetuava-se a leitura da prova, sen­

do considerada positiva quando ocorria o aparecimento de um

precipitado marron escuro e, negativa quando o meio nao apr~

sentava turvação ou precipitação (DEMETER, 1969).

CAMP-test

Para a execuçao desta prova era utilizado o meio

de Edwards {Oxoid), recomendada por DEMETER(l969). Assim, s~

meava-se, inicialmente, no centro da placa, uma estria long~

tudinal de cultura de uma ceoa de Staphyloeoccus aureus pt~.Q_

dutora de beta toxina. Em seguida, semeava-se perpendicular­

mente a esta estria, as cepas a serem testadas, tendo-se o

32

cuidado de nao junta-las â linha de inoculação do Staphylococ

cus aureus, _sendo mantida uma distância de pelo menos 2 mm.

Posteriormente, as placas eram incubadas a 379C por 24 /;horas

em atmosfera de ~0 2 .

Apõs a incubação, efetuava-se a leitura, observan­

do-se as catacterTsticas de zona hemolTtica desenvolvida,pri~

cipalmente na extremidade da estria perpendicular, pr6ximo da

estria longitudinal. Era considerada como sendo de Strept9_

coccus agaZactiae, as cepas das estrias perpendiculares que

apresentavam formação de zona hemolTtica cuneiforme (em forma

de pâ). Eram consideradas como_sendo Streptococcus uberis, as

cepas que apresentavam formação de uma zona hemoliti ca· em for

ma quadrada (ou de enxadão); por outro lado eram ti das como

sendo de Streptococcus dysagalactiae, as cepas que apresenta­

vam formação de uma zona hemolitica, tamb~m em forma de enxá

dão, por~m, muito mais t~nue que a observada para as cepas de

s . ub e ri s . ( DE ME T E P , 1 9 6 9 ) .

Fermentação d~ earbohid(atos e alcoois

Para a execuçao desta prova, era utilizado o caldo

base com vermelho de fenol (Difco), dividido em aliquotas,adf

cionadas dos diversos carbohidratos e âlcoois estudados, re

presentados pela arabinose, maltose, sacarose, lactose, trea­

lose, rafinose, inulina, glicerina, manitol, sorbitol, salicf

na e amido (DEMETER, 1969; AMERICAM PUBLIC HEALTH ASSOCIATION,

19 76).

As cepas isoladas eram semeadas em caldo infusãode

c~rebro e coração (Difco) e, incubadas a 379C por 24 horas.Em

seguida, a partir destas culturas, eram semeadas em tubos cor

respondentes aos diferentes carbohidratos e ~lcoois, sendo es

tes incubados a 379C por 24 horas. Ap6s a incubação, realiza-

va-s·e a leitur_a, sendo a prova considerada positiva quando

33

ocorria a viragem de cor do indicador do vermelho para o ama

relo. Simult~neamente eram realizadas provas de controle ~e

gati~a, empregando~se tubos de ensaio contendo os

vos meios n~o inoculados.

re s pé c ti'

Di1ante da realizaç~o destas provas, eram identi-

ffcadas como sendo StPeptococcus dysagalactiae, as cepas

qüe apresentavam resultados positivos nas provas de fermenta

çao da sacarose, maltose~ trealose e do amido, assim sendo ,

resultados negativos nas provas de verificação de crescimen­

to a 109C e 45QC, da hidrÕlise da esculina e do hipurato de

s5dio, da catalase da fermenta~ão da arabinose, rafinose,in~

lina, manitol, sorbitol e sali~ina, e que apresentavam form!

ç~o de zona hemolltica caracteristica no CAMP-test e hemõli-

se do tipo alfa em ãgar sangue (DEMETER, 1969).

Eram identificadas como sendo de Streptococcus

agalactiae, as cepas que apresentavam resultados positivos

nas provas de fermentação da maltose, sacarose, lactose,tre~

lose, salicina, amido e·da hidrÕlise de sÕdio, assim como,

resultados negativos nas provas de crescimento a lOOC e 459Cda

hidrÕlise da esculina, da catalase, de fermentação da arabi-

nose, rafinose, inulina, glicerina, manitol e do sorbitol, e

que-apresentavam formação de zona hemolftica caracte~Istica

no CAMP-test (DEMETER, 1969).

Eram identificadas como sendo de Streptococcus

uberis~ as cepas que apresentavam resultados positivos nas

provas de fermentação da maltose, sacarose, lactose, trealo-

se, salicina, amido e da hidrÕlise do hipurato de sõdio e da

esculina, assim como, resultados negativos nas provas de ve

rificaçâo do crescimento al09C e 45QC, da catalase, da fer

mentação da araóinose, rafinose, inulina ,e do amido e, que

apresentavam formação de zona hemolftica caracterfstica no

Senlço de iitllioteto e Dotumentação fAtULDADE DE SAÚilE PÚIU(A UIIWEISIDADE DE SlO PAULO

CAMP·test e ~em6ltse do tipo alfa em ~gar sangue lDEMETER

1969}.

34

Eram identificados como sendo Streptococcus pyo­

genes, as cepas que apresentavam resultados positivos nas

provas de fermentação da maltoie, sacarose, lactose, trealo­

se e salicina, assim como, resultados negativos nas provas de

verificação do crescimento a lOQC e 459C, da catalase, da h!

dr6lise da esculina e do hipurato de s6dio, de fermentação

da arabinose, rafinose, inulina, glicerina, manitol,sorbitol ·

e amido e, que apresentavam hemÕlise do tipo beta em-. ~ãgar

sangue (DEMETER, 1969}.

Escherichia coZi

No isolamento desta bactéria, eram utilizados o

agar eosina azul de metileno (Oxoid) e o ~gar Macf2onkey

(Oxoid), recomendados pela AMERICAN PUBLIC HEALTH ---~-_ASSOCIA

TION (1976). As amostras de leite eram semeadas nestes meios,

seguindo-se a técnica recomendada por DEMETER (1969), sendo

as placas incubadas a 379C por 24-48 horas.

Ap6s a incubação, havendo o crescimento de colô

nias com centro escuro e brilho verde metálico no agar eosi­

na azul de metileno, algumas delas eram submetidas a verifi

cação microsc6pica em esfregaços corados pelo método de Gram.

-Das colônias que se revelavam com bacilos Gram-negativos,duas

eram semeadas em ~gar nutriente.

As colÔnias que em ãgar MacConkey se apresentas­

sem com coloração rosada e aspecto muc6ide, eram também sub

metidas a verificação microscõpica em esfregaços corados p~

lo método de Gram. Das colônias que se revelavam com bacilos

Gram-negativos, duas eram semeadas em ãgar nutriente inclina

do.

35

Os tubos de ensaio contendo ~gar nutriente incli

nado semeadoscom col~nias isoladas de ambos os meiris, eram

incubados a 379C por 24~48 horas. ApÕs a incubação, era rea

lizado um repique de cada cepa para ~gar nutriente inclinad~

que apõs a incubação a 37QC por 24-48 horas~ era conservado

em refrigerador a 4QC, para sua manutenção.

A partir dos outros tubos, as cepas isoladas eram

emeadas no meio IAL (Instituto Adolfo Lutz), recomendado por

PESSOA & SILVA (1974) e, incubadas a 37QC por 24 horas. Apõs

a incubação, efetuava-se a leitura das propriedades bioqu1ml

cas pesquisadas neste meio. Assim, eram selecionadas as ce

pas que apresentavam resultados positivos nas provas do in

dol e da fermentação da glicose com produção de gas e, nega­

tivos nas provas da desaminação do l-trjptofano da produção

de H2s e da hidrÕlise da uréia.

Posteriormente,as cepas isoladas eram submetidas

a várias outras provas bioqufmicas de identificação. Assim ,

eram confirmadas como sendo de Escherichia coZi~ as cepas

que apresentavam resultados positivos nas provas de indol ,de

vermelho de metila, da fermentação do manitol, da produção

de Beta-galactosidase e Beta-xilosidase e, negativos nas prQ

vas de Voges Proskauer, do aproveitamento do citrato de

Simmons, da fermentação do adonitol, inositol e rafinose, da

utilização do molonato, da produção da urease, gelatinase e

desaminase da Feriil-alanina e de crescimento em KCN.

Coryn~bacteruim pyoqenes

No isolamento desta bactéria, eram utilizados o

-meio de Lo~ffler (Difco) em tubos e o agar com dextrose- ~n~

teose nQ 3 adicionado de sangue e télurito de potãssio(Difco)

em placas. As amostras de leite eram semeadas mestes meios~

seguindo-se a·tecnica proposta por DEMETER{l969). A seguir,

36

os tubos e as placas sem~ados eram incubados a 37QC po~ 24 ho

ras em atmosfera de co2.

Ap5s a incubação, caso houvesse crescimento em

meio de Lo~ffler e formaçao de colônias granulosas com color~

ção cinza ou negra no âgar dextrose-proteose nQ 3 ;aditionado

de sangue e telurito de potâssio, seria realizada a verifica­

ção microsc5pica em esfregaços corados pelo m~todo de Gram.

Caso fosse detectada a presença de bacilos Gram-positi,vos com

extremidades entumeci das (em forma de clava) e agrupamentos·

caracter1sticos em forma de letras chinesas, proceder-se-ia o

isolamento de colônias e sua semeadura em meio de Lo~ffler,s~

guido de incubação a 37QC por 24 horas em atmosfera de co 2.

Poderia ocorrer o caso de haver crescimento · em

meio de Lo~ffler,por~m não em placa contendo meio de isolamen

to. Neste caso, se· fosse constatada a presença, no meio de

Lo~ffler de bact~rias com as caracter1sticas referidas, parti~

do-se desta cultura, proceder-se-ia a semeadura em placa,para

realização do isolamento de colônias~

Apôs a incubação, seria realizada a identificação

das cepas isoladas, atrav~s das provas da catalase (~6UCHANAN

'& GIBBONS,l974), do leite tornasolado (PREVOT.·& FREDETTE,l966)

e da fermentação da dextrose, sacarose, maltose, trealose e

lactose(BUCHANAN E GIBBONS, 1974).

Seriam identificadas como sendo Corynebacteruim

pyogenes as cepas que apresentassem resultados positivos na

fermentação da dextrose, maltose,e trealose e, negativos nas

provas da catalase, do leite tornasolado e da fermentação da

sacarose e lactose (COLLINS, 1969).

Salienta-se que para nenhuma amostra .anali.sada

foi observado crescimento em meio de Lot:!ffler e nem a presença

de colôni~s em âgar dextrose-proteose nQ 3 adicionado de san

37

gue e telurito de potâssio) que apresentassem as caracterts

ticas do genero Coryne5aaterium.

Meios de cultivo utilizados e seu preparo

Os meios de cultivo utilizados, assim -como seu

preparo, são apresentados detelhadamente nos Anexos.

3.- RESULTADOS

Os dados inseri dos nas TABELAS 1 a 11, referem-se

a ocorrência de mastite.subclínica, uma vez que nas seis pr~

priedades estudadas, não fot~am constatadas, ao exame clínico,

a presença de fêmeas doentes.

A TABELA 1 mostra a distribuição das fêmeas posl

tivas, suspeitas e negativas a prova do CMT, segundo os reba

nhos produtores de leite tipo B, estudados na região do Muni

cípio de Barretos, São Paulo. Observa-se que das 468 f~meas

submetidas ã prova do CMT, 44 (9,4%) foram positivas, 12

{2,6%) suspeitas e 412 (88,0%) negativas.

A TABELA 2 mostra a prevalência da mastite bovina

nos seis rebanhos produtores de leite tipo B, na região do

Município de Barretos, São· Paulo, segundo o numero de fêmeas

e quartos analisados. O exame bacteriolõgico efetuado nas

amostras de leite das 56 fêmeas reagentes(positivas e suspeitas)a

39

prova do CMT, revelou que a preval~ncia da mastite bovina na

região em e~tudo foi de 10,3%, tendo variado entre 6,3~~ ( re

banho F) e 20,0% (rebanho B).

A TABELA 3 mostra a distribuição das amostras p~

sitivas ao exame bacteriol6gico, segundo a localização do

quarto afetado, nos rebanhos produtores de leite tipo B,est~

dados na região do Municipio de Barretos, São Paulo. Os da

dos desta tabela mostram maior ocorr~ncia de casos (31,3%

no quarto anterior direito. Entretanto, a aplicação do teste

de dupla proporcionalidade aos valores desta tabela, eviden

ciou ser nao significativa est~ variação.

A TABELA 4 mostra a distribuição do numero de

quartos positivos e negativos ao exame bacterio16gico, e dos

quartos 11 perdidos'~ segundo os rebanhos produtores de leite ti

po B, estudados na região do Municfpio de Barretos, Sâo Pau

lo. Observa-se que o numero de quartos "perdidos" variou en

tre 0,3% (rebanho F) e 3,7% (rebanho C), de modo que o pe.!:

centual da região em estudo foi de 1.9.

Para melhor-ilustrar os resultados obtidos na pr~

va do CMT, contagem leucocitãria e pesquisa do teor de clore

·tos, analisados comparativamente entre si e em relação ao

exame bacteriol6gico, constituiu-se as TABELAS de 5 a 10.

A TABELA 5 mostra a comparação dos resultados ob

tidos na prova do CMT com os do exame bacteriol6gico no dia~

n6stico da mastite bovina, e determinação de percentual da

concordância, nos rebanhos produtores de leite tipo B, estu

dados na região do Municfpio de Barretos, São Paulo. O pe.!:

centual de concordância estabelecido para ambas as provas foi

de 85,71, tendo variado entre 58,33% (reações s·uspeitas ou

traços) e 100,00% (~eações fortemente positivas).

A TABELA 6 mostra a comparação dos resultados ob

40

tidos na prova do CMT com os da contagem leucocitâria no dia~

nóstico da mastite bovina, e determinação do percentual de

concordincia, nos rebanhos produtores de leite tipo B, estud!

dos na r.egião do Município de Barretos, São Paulo. O percentu

al de concordincia estabelecido para ambas as provas foi de

83,93, tendo variado entre 41,67% (reações suspeitas ou tra

ços) e 100,00% (reações fortemente positivas).

A TABELA 7 mostra a comparação dos resultados ob

tidos na prova do CMT com os da pesquisa do teor de éloretos

no diagnóstico da mastite bovina, e determinação do perce~

tual de concordincia, nos rebanhos produtores de leite tipo B,

estudados na região do ~1unic1pio de Barretos, São Paulo. O

percentual de concordância estabelecido oara <;.mbas:asprovas foi

de 46,43, tendo variado entre 25,0% (reações suspeitas ou tra

ços) e 70,0% (reações fortemente positivas).

A TABELA 8 mostra a comparação dos resultados ob

tidos na contagem leucocitãria com os do exame bacteriológico

no diagnóstico da mastite bovina, e determinação do percen­

tual de concordância, nos rebanhos produtores de leite tipo

B, estudados na região do Munic1pio de Barretos, São Paulo. O

~ercentual de concordincia estabelecido para ambas as provas

f o i de 8 7 , 5 : •.

A TABELA 9 mostra a comparaçao dos resultados ob

tidos na contagem leucocitãria com os da pesquisa do teol' de

cloretos no diagnóstico da mastite bovina, e d~terminação do

percentual de concordância, nos rebanhos prodll!tores de leite

tipo B, estudados na região do Município de Barretos, São Pau

lo. O percentual de concordância estabelecido liDara ambas as

provas foi de 55,36.

A TABELA .10 mostra a comparaçao dlllls; resultados ob

tidos na pesquisa do teor de cloretos com os dD exame bacte

41

riologico no diagnostico da masti.te bovina, nos rebanhos pr_Q

d u to r e s de l. e i te t i p o B , e s t u d a dos n a r e g i ã o d o t~ u n i c i p i o de

Barretos, São Paulo. O percentual de concordância estabeleci

do para ambas ãs provas foi de 50,0.

A TABELA 11 mostra a distribuição dos agentes

etiológicos isolados no exame bacteriológico das 56 f~meas

reagentes i prova do CMT, nos rebanhos produtores de léite

tipo B, estudados na região do Município de Barretos, São

Paulo. Observa-se a predominância do Staphylococcus aureus

(52,08%) sobre os demais microrganismos. O Corynebacte~ium

pyogenes não foi isolado em nen~uma das amostras analisadas,

e o percentual de cultivos sem crescimento fo·i de 14,29.

A TABELA 12 mostra a comparação dos resultados ob

tidos na prova da reduçaõ do azul de metileno <;om as da corita

gem padraõ emplacas ,segundo as 56 amostl~as das fê1neas reagentes· a

prova do CMT, nos rebanhos produtores de leite tipo B, estu­

dados na região do Município de Barretos, São Paulo. Os da

dos desta tabela revelam que 30 (53,57%) amostras apresent~

ram o tempo de redução não condizente com o numero de micror

ganismos determinado, isto e, tempo de redução menor que

'3 l/2 horas ·e contagem total de microl~ganismos inferior a

500 .. 000 mi crorg/ml.

A TABELA 13 foi constituída com o intuito de ten

ta r j u s ti f i c a r as v a r i a ç õ e s o b se r v a das n a T AB E L A 1 2 . Os d a

dos desta tabela mostram a comparação dos resultados obtidos

na contagem leucocitãria com os da prova da redução do azul de

meti leno,segundo as 56 amostras de leite' reagentes a prova

CMT, nos rebanhos produtores de leite tipo B,. estudados

Região do Município de Barretos, São Paulo. Observa-se

26 (86,67%) amostra~ com tempo de redução inferior a

horas, apresentavam contagens leucocitãrias superiores

do

na

que

3 l/2

a

42

2.500.000 leuc/ml., enquanto que 23 (88,46%)_ amostr:as com te~

po de redução superior a 3 1/2 horas, apresentavam contagens

leucocitãrias igua-is ou menores que 2,500,000 leuc/ml.

Com o intuito de verificar a relação existenteentre

a prova da redução do azul de meti leno e a contagem padrão em p l~

c as , di ante dos v a r i os agentes et i o l õ g i c os i s o 1 a dos , c o n s ti tu i u-se

a TABELA 14.0s dadosdesta tabela mostramo. comparação dos resul­

tados obtidos na prova da redução do azul de metileno com os

da contagem padrão emplacas,segundo as amostras de leite ino­

culadas experimentalmente.Observa-se que 27(90,0%) amostras

apresentaram o tempo de redução- na prova da redução do azul de me

tileno compat1vel com o numero de m1crosganismos determinado.

A TABELA 15 mostra a distribuição dos resultados

obtidos nas analises realizadas pelo Serviço de Inspeção do

Lacticínio Flor da Nata, segundo os rebanhos produtores de

leite tipo B, na região do MunicTpio de Barretos, São Paulo .

Os dados desta tabela evideciam que todos os resultados obti­

dos, atenderam as exig~ncias estabelecidas pelo Regulamento

de Inspeção Industrial e Sanitaria de Produtos de Origem Ani

mal do Ministério da Agricultura.

A TABELA 16 mostra a preval~ncia da mastite bovina

nos rebanhos produtores de leite tipo B, na região do Munic1-

pio de Barretos, São Paulo, segundo o numero de f~meas e quar

tos analisados, e resultados obtidos na pesquisa do teor de

cloretos, prova de pus e prova de Whiteside.A prova~ Whitesl

de mostrou positividade a partir de uma prevalência de 7,0 %

das fêmeas ou 1,7% dos quartos analisados. A prova de pus mos

trou positividade a partir de 16,4% das f~meas ou 4,1% dos

quartos analisados e a pesquisa do teor de cloretos, mostrou­

se negativa em todos os rebanhos estudados.

43

TABELA 1 - DISTRIBUIÇAO DAS FrMEAS POSITIVAS, SUSPEITAS E ~EG~

TIVAS ~ PROVA DO CMT, SEGUNDO OS .REBANHOS PRODUTO

RES DE LEITE TIPO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO MUNICI

PIO DE BARRETOS, SÃO PAULO, 1982.

Fêmeas Examinadas Positivas Suspeitas Negativas

Rebanhos NQ % NQ % NQ %

A 42 7 16 '7 3 7 '1 32 76 '2

B 30 5 16;7 2 6,7 23 76 '8

c 61 7 11 ,5 4 6,6 50 83,3

o 73 7 9 '6 66 91 '7

E 86 4 4,7 3 3,5 79 91 '9

F 1 76 14 8,0 162 92,0

TOTAL 468 44 9,4 12 2 '6 412 88,0

44

TABELA 2 - PREVAL[NCIA DA MASTITE BOVINA E~ SEIS REBANHOS PRO-

Amostras

Rebanhos

A

B

c D

E

F

TOTAL

DUTORES DE LEITE TIPO B, DETECTADA PELO CMT E ÇON

·FIRMADA PELO EXAME BACTERIOLOGICO, SEGUNDO O NUMERO

DE FtMEAS E QUARTOS ANALISADOS, ESTUDADOS NA REGIAO

DO MUNICTPIO DE BARRETOS, SJ\.0 PAULO, 1982.

Fêmeas Positivas Quartos Positivos

analisadas NQ % analisados %

42 8 19 ' 1 16 8 4,8

30 6 - 20 ,o 120 5 ,O

61 o 10 16 '4 244 4' 1

73 7 9 ,6 292 2,4

86 6 7,0 .. 34 4 1 '7

176 1 1 6,3 704 1 '6

468 48 10,3 1872 2,6

45

TABELA 3 - DJSTRIBUIÇAO DAS AMOSTRAS POSITIVAS AO EXAME BAC

TERIOLOGICO, SEGUNDO A LOCALIZAÇAO DO QUARTO AFE

TADO, NOS REBANHOS PRODUTORES DE lEITE TIPO B, E~

TUDADOS NA REGIAO DO MUNICfPIO DE SARRETOS, SAO

PAU L O, 19 82 .

Amostras Positivas

Quartos

afetados NQ %,* %** ~

Ante ri o r di te i to 1 5 3,.3 31 , 2

Anterior esquerdo 13 2 ,.8 2 7' 1

Posterior direito 14 3 ,.0 29,2

Posterior esquerdo 6 1 "3~ 12,5

TOTAL 48 100,00

(*) -Em relação ao numero total de fêmeas ra.nalisadas.

(**) - Em relação ao numero total de fêmeas ~ositivas.

46

TABELA 4 - DISTRIBUIÇAO DO NOMERO DE QUARTOS POSITIVOS E Nf

GATIVOS AO EXAME BACTERIOLOGICO, E DOS QUARTOS

·~ERDIDOS~ SEGUNDO OS REBANHOS PRODUTORES DE LEI

TE TIPO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO MUNICIPIO DE

BARRETOS, SAO PAULO, 1982.

Quartos Examina dos Positivos Negativos ·Perdidos

Rebanhos NQ %* NQ %* NQ %*

A 168 8 ~ 4,8 159 94,6 l 0,6

B 120 . 6 5,0 112 93,3 2 1 '7

c 244 10 4, 1 225 92,2 9 3' 7

D 292 7 2,4 280 -- 9~ '9 5 1 '7

E 344 6 1 '7 337 9 8 'o 1 0,3

F 704 11 1 , 6 6 76 96,0 1 7 2 '4

** ** ** TOTAL 1 872 48 2,6 1789 95,6 35 1,9

(*) .- Em relação ao numero total de quartos analisados em

-cada rebanho.

(**) - Em relação ao numero total de quartos analisados em

todos os rebanhos.

. 4 7

TABELA 5 - COMPARAÇAO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA PROVA DO CMT

COM OS DO EXAME BACTERIOLOGICO NO DIAGNOSTICO DA

MASTITE BOVINA, E DETERMINAÇAO DO PERCENTUAL DE

CONCORDÂNCIA, NOS REBANHOS PRODUTORES DE LEITE TI

PO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO MUNICIPIO DE

TOS, S/\0 PAULO, 1982.

BARRE

11 Ca1ifornia Mastitis Testn Exame.Bacted.olÕg.ico Concordância

Leitura NO Pos i j:ivo Negativo

Suspeitas ou

traços ( T) 12 7 5 58,33

Fracamente

positivas ( +) 21 1 9 2 90,91

Distintamente

positivas ( ++) 1 3 l 2 1 92,31

Fortemente

positivas (+++) 1 o 1 o lOO,OO

TOTAL 56 48 8 85,71

48

TABELA 6 -COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA PROVA DO CMT

COM OS DA CONTAGEM LEUCOCITARIA NO DIAGNOSTIVO DA

MASTITE BOVINA, E DETERMINAÇÃO DO PERCENTUAL DE

CONCORDÂNCIA, NOS REBANHOS PRODUTORES DE LEITE TI

PO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO MUNICIPIO DE

TOS, SÃO PAULO, 1982.

BARRE

"·Calífornia Mastitis Tests 11 · Contagem Leucocitãria ·Concordância

Leitura NQ Superior Inferior %

500.000/ml 500.00D/ml

Suspeitas ou

traços ( T) l 2 5 7 41 '6 7

Fracamente

positivas (+) 21 1 9 2 90,48

Distintamente

positivas ( ++) 1 3 1 3 100,00

Fortemente

positivas(+++) 10 10 100,00

TOTAL 56 47 9 83,93

49

TABELA 7 - COMPARAÇAO DOS RESULtADOS OBTIDOS NA PROVA DO CMT

COM OS DA PESQUISA DO TEOR DE CLORETOS NO DIAGNOS

TICO DA MASTJTE BOVINA, E DETERMINAÇAO DO PERCEN­

TUAL DE CONCORDANCIA, NOS REBANHOS PRODUTORES DE

LEITE TIPO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO MUNICIPIO.IDE

BARRETOS, SAO PAULO, 1982.

11

California Mastitis test 11

Teor de Cloretos Con co rdân c i a

Leitura NQ Posit-ivo Negativo %

NQ NQ

Suspeitas ou

traços (T) 12 3 9 25,00

Fracamente

positivas ( +) 21 9 1 2 42,86

Distintamente

positivas ( ++) 13 7 6 53' 85

Fortemente

positivas(+++) lO 7 3 70,00

TOTAL 56 26 30 46,43

50

TABELA 8 - COMPARAÇAO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA CONTAGEM LEU

COCIT~RIA COM OS DO EXAME BACTERIOLÚGICO NO DIAG­

NOSTICO DA MASTITE BOVINA, E DETERMINAÇAO DO PER

CENTUAL DE CONCORDANCIA, NOS REBANHOS ~PRODUTORES

DE LEITE TIPO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO MUNIC!PIO

DE BARRETOS, SAO PAULO, 1982.

Coritagem leucocitâria Exame bacterio15gico Concord~ncia

Leitura* NQ Positiv~ Negativo %

Positiva

Negativa

TOTAL

47

9

56

44

4

48

3

5

8

87,5

*Critério:

Positivo: Contagem leucocitãria igual ou superior

a 500.000 leuc/ml.

Negativo: Contagem leucocitãria inferior a

500.000 leuc/ml.

51

TABELA 9 - COMPARAÇAO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA CONTAGEM LEU

COCIT~RIA COM OS DA PESQUISA DO TEOR DE CLORETOS .

NO DIAGNOSTICO DA MASTITE BOVINA, E DETERMINAÇÃO

NO PERCENTUAL DE CONCORD~NCIA, NOS REBANHOS PRO­

DUTORES DE LEITE TIPO 8, ESTUDADOS NA REGIAO DO

MUNICfPIO DE BARRETOS, SAO PAULO, 1982.

Contagem leucocitãri·a Teor de cl eretos Concordância

Leitura * NQ Positivo Negativo %

Positiva 47 24 23 55' 36

Negativa 9 2 7

TOTAL 56 26 30

* Critério:

Positivo: Contagem leucocitãria igual ou superior

a 500.000 leuc/ml.

Negativo: Contagem Leucocitãria inferior a

500.000 leuc/ml.

52

TABELA lO - COMPARAÇAO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA PESQUISA DO

TEOR DE CLORETOS CO~ OS DO EXA~E BACTERIOLOGICO

NO DIAGNOSTICO DA MASTITE BOVINA, E DETERMINAÇAO

DO PERCENTUAL DE CONCORDÂNCIA, NOS REBANHOS PRO

DUTORES DE LEITE TIPO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO

.M U N I C fp I O DE B A R R E TO S , S A O P A U L O , 1 9 8 2

. Teor de cloretos

Leitura n9

Positiva .26

Negativa 30

TOTAL 56

Exame bacterio15gico

Positivo

23

25

. 48

Negativo

3

5

8

Con co rdân c i a

%

50,0

53

TABELA 11 - DISTRIBUIÇAO DOS AGENTES ETIOLÚGICOS ISOLADOS NO

EXAME BACTERIOLOGICO DAS 56 FrMEAS REAGENTES A

PROVA DO CMT, NOS REBANHOS PRODUTORES DE LEITE

TIPO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO MUNIC!PIO DE BAR

RETOS, SAO PAULO, 1982.

Agentes etio15gicos

StaphyZococcus aureus

Streptococcus dysagaZactiae

Streptococcus agaZactiae

Streptococcus uberis

Streptococcus pyogenes

StaphyZococcus epidermidis

ou S. saprophyticus

Escherichia coZi

Corynebacterium pyogenes

Cultivos sem crescimento

TOTAL

NQ

25

7

5

4

3

3

1

8

56

Amostras

%* %**

44,64 52,08

12,50 1 4 '58

8 '9 3 10,42

7,14 8,33

5,36 6,25

5' 36 6,25

l '79 2 'o 8

14,29

100,00 100,00

* - Em relação ao numero total de f~meas reagentes.

** - Em relação ao numero total de agentes etiolÕgicos iso

lados.

54

TABELA 12 - COMPARAÇAO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA PROVA DA

Redução do azu·l de meti le no.

(Horas}

1/21---

1,,00!--

1 l/2r--

2,00t--

2 l/2j---

3,00r--

3 l/2t--

4,00 ou

TOTAL

REDUÇ_AO DO AZUL DE fv'IETILENO CO-t~ OS DA CONTAGU~

PADRAO EM PLACAS,SEGUNDO AS 56 AMOSTRAS DE LEI

TE DAS F[MEAS REAGENTES A PROVA DO CMT,NOS REBA

NHOS PRODUTORES DE LEITE TIPO B,ESTUDADOS NA RI

GIAO DO MUNICIPIO DE BARRETOS, SAO PAULO, 1982.

CPP*

< 250 250-- 500 Total

1 /2 4** 4

1 '00 9** 9

1 1 /2 3** 1 ** 4

2,00 4** 1** 5

2 l /2 4** 4

3,00 3~* 3

3 1 /2 1 ** 1

4,00 1 1

mais 25 25

54 2 56

(*) CPP.- Contagem padrão em placas. (em milhar~s).

(**) - Tempo de viragem na prova da redutase não e comp~

tível com o numero de microrganis~os determinado.

55

TABELA 13 - COMPARAÇAO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA CONTAGEM LEU

COCIT~RIA COM OS DA PROVA DE REDUÇÂO DO AZUL DE

METILENO,SEGUNDO AS 56 AMOSTRAS DE LEITE DAS FfME

AS REAGENTES A PROVA DO CMT,NOS REBANHOS PRODUTO­

RES DE LEITE TIPO B,ESTUDADOS NA REGIAO DO MUNIC1

PIO DE BARRETOS, SAO PAULO, 1982

Redução do azul de me <3 1 /2 h s ~3 l/2hs To ta 1 tileno -

NQ - %* NQ OI*

NQ de leucõci tos lo

( X 1000)

500 9 34,62 9

500 1000 3 11 '54 3

1000----1 2500 4 13,33 11 42 '31 15

2500 5000 5 16,67 2 7,69 7

5000 110000 9 30,00 3,85 1 o

10000 ou mais 1 2 40,00 1 2

TOTAL 30 53,57** 26 46,43** 56

( *) Em relação ao tempo de viragem verificado na prova

da redu tas e .

(**) -Em relação ao nume:ro total de amostras analisadas.

56

TABELA 14- COMPARACAO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA PROVA DA RE

. DUÇAO DO AZUL DE ~1ETI LENO. COt-1 OS DA CONTAGU1 PA

ORAO EM PLACAS,SEGUNDO AS AMOSTRAS DE LEITE INO

CULADAS EXPERIMENTALMENTE, DOS REBANHOS PRODUTO­

RES DE LEITE TIPO B, ESTUDADOS NA REGIÃO DO MUNI

CTPIO DE BARRETOS, SÃO PAULO, 1982.

Redução CPP* <250 250-- 500 500 ou + Total do azul de meti. leno

(Horas)

1 I 2 1** 5 6

l/2i-- 1 ,00 l 1 1,00;--- 1 1/2 2 2

1 1/2t-- 2,00 1 ** 3 4

2,00t--- 2 1 I 2 3 3

2 1/2;- 3,00 2 2

3,00t--- 3 1 /2 1 1

3 1 /2J---- 4,00 3 1 1 ** 5

4,00 ou mais 6 6

TOTAL 1 1 2 1 7 30

(*) CPP - Contagem padrão em p 1 a c as (em mi 1 h ares) .

da redu tas e não -(**) Tempo de viragem na prova e com

pative 1 com o numero de microrganismos.

57

TABELA 15 - DISTRIBUICAO DOS RESULTADOS OBTIDOS NAS AN~LISES

.REALIZADAS PELO SERVICO DE INSPECAO DO LACTIC! . . .

NIO FLOR DA NATA, SEGUNDO OS REBANHOS PRODUTORES

DE LEITE TIPO B, ESTUDADOS NA REGIAO DO

PIO DE BARRETOS, SAO PAULO, 1982.

Rebanhos A B c n Anã1ises

Acidez ( Q o) 15 '5 1 5 '5 16,0 1 5 '5 15 '5

Densidade 1 'o 31 1 'o 31 1 'o 32 1 'o 3 3 1 'o 3 3

Gordura (%) 3,5 3,5 3,5 3,2 3,5

EST (%}* 1 2 '28 12,12 12,56 12,45 ·12,66

ESD (%}** 8,78 8,62 9,06 9 '25 9 '16

Cri os copia (QC) -0,55 -0,53 -0,54 -0,55 -0,55

Contagem padrão p1acas(x 1000) 1 3(} 240 230 360 440

Redu tas e (h s } 5,25 4,20 5 '25 4 '40 3,50

(*) EST - Extrato Seco Total.

(**) ESD - Extrato Seco Desengordurado.

t~1UN I Ci

F

. 1 5 '5

1 'o 31

4 '1

13,06.

8,96

-0,55

260

4,40

58

TABELA 16 - PREVALÊNCIA DA MASTITE BOVINA NOS REBANHOS PRODU

TO R E S. D E L E I TE T I P O B , E S T U O A DO S N A R E G I 7l. O DO fvl U

NIClPIO DE BARRETOS, SAO PAULO, SEGUNDO O NDMERO

DE FÊMEAS E QUARTOS ANALISADOS, E RESULTADOS OB

TIDOS PELO SIF NA PESQUISA DO TEOR DE CLORETOS ,

PROVA DE PÜS E NA PROVA DE ~HITESIDE,l982.

Rebanhos

A

B

c

D

E

F

% fêmeas

doentes

19 ' 1

20,0

16 '4

9,6

7,0

6,3

% quartos teor de prova prova

doentes cloretos de pus Whiteside

4,8 negativo positivo positivo

5,0 negativo pos·itivo positivo

4' 1 negativo pos-Itivo positivo

2,4 negativo negativo positivo

1 '7 nega ti v o negativo positivo

1 '6 negativo negativo negativo

4 - DISCUSSAO

Os dados in~eridos nas TABELAS 1 e 2 revelam a

ocorrência da mastite bovina a niveis razoavelmente baixos

quando comparados aos valores obtidos por LANGENEGGER & cols.

(1970) no Rio de Janeiro, HARROP & col&(l975) em Pernambuco

e FERREIRO & cols.(l981) em r~inas Gerais, cuja p r e v a 1 ê n c i a

f o i de 2 O , O% , 1 4 , 5% e 1 4 , 2% , r e s p e c ti v a mente . E s te fato ta 1

vez possa ser atribuído a adoção de algumas medidas profil~

ticas, representadas principalmente pela realização diãria

da prova da "caneca telada", exigida pelo Serviço de Inspe­

çao, nos estãbulos ~redutores de leite tipo B. Esta prova

permite a detecção de fêmeas infectadas, cujo afastamento da

linha de produção, determina a eliminação de importan~e fon

te de infecção do rebanho. A referida prova basea-se na ana

lise visual dos primeiros "jatos" de leite, os quais sao

60

passados ou transvazados i uma caneca apropriada, contendo em

sua abertura uma tela metâlica, cuja função~ a de reter os

grumos ou flÕcos presentes no leite mastitico.

A an~lise dos dados constantes na TABELA 3, evi

dencia ao teste de dupla proporcionalidade uma variação nao

significativa, quanto a localização do quarto afetado.Todavia,

ao agrupar-se os resultados dos quartos anteriores e posteri~

res, observa-se maior frea:Üência (58,3 %) de afecções nos

quartos anteriores. Este dado surpreende, devido a maior cap~

cidade secretora dos quartos posteriores e, consequentemente,

maior probabilidade de traumati~mos por ocasião da ordenha

FIGUEIREDO· (1962) obteve resultados semelhantes (56,28%) smas

afirmou ser esta diferença de pouco valor~ devido ao pequeno

numero de animais examinados (129). Diante da afirmação deste

autor, e considerando que o nfimero de fêmeas mastiticas por

nõs analisadas foi muito menor (48), acredita-se que tais

achados, devam ser atribuídos ao acaso.

A an~lise dos dados inseridos na TABELA 4, reve

la que 1,9% dos quartos examinados estavam "perdidos" em de

corrência de mastite bovina. Este achado foi muito semelhante

ao de FERREIRO & coZ.s.(l981), que verificaram 1,78%,entretan­

to, foi inferior aos de MARTINEZ (1958), LANGENEGGER & coZ.s.

(1970) e HARROP & coZ.S.(l975), cujas proporções observadas. f_Q

ram de 27,8%, 7,0% e 3,9% respectivamente. O nGmero relativa­

mente pequeno de quartos "perdi dos" observado na região de

Barretos/SP, talvez possa ser atribuído a utilização da prova

da "caneca telada", que permite a identificação do quarto af~

tado nos estigios iniciais da doença, quando as medidas tera

pêuticas apresentam maior eficiência.

A analise dos dados constantes da TABELA 5, reve

la que a concordincia entre a prova do CMT com a investigação

61

bacteriol6gica variou entre 58,33% e 100,00%~ sendo esta ton

cord~ncia t~nto maior quanto mais fortemente se apresentava

a reaçao de positividade na prova do CMT. O valor estabeleci

do para o refel'i·do percentual foi de 85,71; idêntico ao ob

tido por LANGENEGGER & col.s.(1970). FIGUEIREDO (1962) e

HARROP & coZs. (1975), determinaram valores inferiores, ou s'e

ja, 78,65% e 67,46%, respectivamente. Os dados desta tabela

oferecem informações extremamente importantes na interpreta­

ção da prova do CMT, ou seja, considerando-se apenas as rea

ções positivas, verifica-se que o percentual de concordância

com o exame bacteriol6gico 5 multo elevado, variando de

90,91% (fracamente positivas) a 100,00% (fortemente posit!

vas), o que confirma a eficiência desta prova na detecção de

transt6rnos secretõrios da glândula mamâria não perceptfveis

clínicamente. Este fato, aliado a rapidez, facil-idade de ex~

cuçao e baixo custo, em relação a outros mêtodos de diagnõs­

tico, justificam uma ampla utilização da prova do CMT a ni

vel de campo.

A anâlise dos dados constantes na TABELA 6~ reve

la que a concord~ncia entre a prova do CMT com a c:on ta qem

leucocitâria variou entre 41,67% a 100,00%, sendo esta

concord~ncia tanto maior quanto mais forteme~te se apresent!

vaa reação de positividade na prova do CMT. O valor esta.bele

ci do para o referi do percentual foi de 83,93. tHLLER & KE.ARMS

(1967) e PEARSON & cols .. (l970), determinaram valores s.emelh:~n·

tes, ou seja, 81,7% e 84,0%, respectivamente. Estes autores

também consideraram contagens leucocitãrias superiores a

500.,000 leucõcitos/ml, como sendo indicadores de transtôrnos

secretõrios da glândula mamãria. Considerando-se apenas as

reações positivas, v·erifica-se que o percentual de conco;~dân

cia entre ambas. as provas ê muito elevado, variando de 90,48%

62

(reações fracamente positivas) a 100~00% {distintamente e

fortemente positivas). Este fato era esperado, uma vez que,

a prova do CMT fundamenta-se entre outras alterações, no

aumento do numerq de leucõcitos presente no leite mastitico.

A anâlise dos dados inseridos na TABELA 7, mo!

tra que a concurd~ncia entre a prova do CMT com a pesquisa

do teor de cloretos variou entre 25,0% a 70,00%, sendo es

ta concord~ncia tanto maior quanto mais fortemente se apre-

~ntava a reação de positividade na prova do CMT. O valor es

tabelecido para o referido percentual foi de 46,43. NADER

FILHO & MIGUEL (1981)*, determinaram valores muito superi~

res, ou seja, 80,11%, além de verificar elevada associação

positiva e altamente significativa entre ambas as provas,

tendo afirmado ser indiferente o uso de uma ou outra prova,

como método auxiliar de diagnóstico da mastite bovina. A

elevada diferença verificada entre estes percentuais,talvez

possa ser atribuída ao fato destes autores terem efetuado o

estudo comparativo de ambas as provas, nas amostras de lei

te procedentes de fêmeas reagentes e não reagentes a prova

do CMT. Assim, se consideradas apenas as amostras reagentes,

·o percentual de concord~ncia entre ambas as· provas diminui ria

para 60,38. Deve ser assinalado ainda, que os referidos au

teres, analisaram o rebanho de apenas uma propriedade, na

* NADER FILHO, A. & MIGUEL, O. Estudo Comparativo entre as provas do California Mastitis Test e teor de cloretos na detecção da mastite subclínica em bovinos. Revista da Faculdade de Medicina Veterinâria e Zootecnia da USP. (Em publicação).

63

qual as condi"çõ'es de manejo, ordenha, etc.~ eram totalmente

diferentes das observadas na regiâo de Barretos/SP.

A análise dos dados inseridos·na TABELA 8, mos

tra que a concordância entre a contagem leucocitária e o

exame bacteriológico foi de 87,5%. Esta determinação coinci

de com os achados de SING & BAXI (1980)t que verificaram nf

veis de concordância entre 87,0 e 90,0%, isto é, amostras de

leite com contagens leucocitárias superiores a 500.000 leu

cõcitos/ml e com positividade no exame bacteriolÕgico~Entre

os métodos auxiliares de diagnõstico testados neste traba

lho, a contagem leucocitária foi o que apresentou maior pe~

centual de concordância com o exame bacteriológico. Limite

de confiança ao nível de 95% ou mais: 78,7- 96,3.

A análise dos dados constantes da TABELA 9,

evidencia que a concordânci.a entre a contagem leucoci:tãria

e a pesquisa do teor de cloretos foi de 55,36%. Consideran-

do-se que a contagem leucocitãria foi a prova que

tou maior concordância.com o exame bacteriolÕgico (87,5%)

era de se esperar que o percentual de concordância entre a

contagem leucocitária e a pesquisa do teor de cloretos, fos

se prõximo ao valor estabelecido entre a prova do teor de

cloretos com o exame bacteriológico, isto e, concordância de

50,0%, conforme ilustra a TABELA 10.

A análise dos dados inseridos na TABELA 10 ,

mostra que a concordância entre a pesquisa do teor de clore

tos e o exame bacteriolõgico foi de 50,0%. Esta dete1~mina

-çao foi muito semelhante a verificada por CHANDER & BA~I

(1975), que utilizando vãrios métodos auxiliares de diagnõ~

tico da mastite bovina, observaram que a pesquisa do teor

de cloretos apresentou 52,0% de concordância com o exame

bacteriológico, inferior a todos os outros testes estudados.

64

A a n ã 1 i s e dos d a dos i n s e r i dos n a TA B E L A 1 l , r~

vela que o Btaphyloaoccus aureus foi o agente etiolÕgico mais

freqHentemente isolado (52,08%) no exame bacteriol5gico, con

firmando os achados de FIGUEIREDO (1962), LANFENEGGER & col-s.

( 1 9 7 O ) , F E R N/\ N DE S & c o Zs. ( l 9 7 3 ) e H A R R O P & c o ls .. ( l 9 7 5 ) , q u e

estudando as 11 bacias leiteiras 11 de f~inas Gerais, Rio de Ja

neiro, Rio Grande do Sul e Pernambuco, verificaram 57,4%

5·3,1%, 50,0% e 59,2%, respectivamente. Os Streptococcus Hp

aparecem na segu~ncia de ordem de importância causulstica, o

q u e c o i n c i de c o m o s a c h a dos de H A R R O P & c o ls. ( 1 9 7 5 ) e S I L V A

& coZs.(l977). Dentre os microrganismos peJ~tencentes a este

g~nero, verificou-se apresença dos. dysagalactiae (14,58~n~

S. agalactiae (10,42%), S. uberis (8,33%) e S. pyogenes ( 6,

25%). O Staphylococcus epidermidis ou Staphylococcus saprophll_

ti a us f o r a m i s o 1 a dos em 6 , 2 5% dos c as os . F E R R E I R O & cols.

( 1 9 8 l ) e m M i n a s G e r a i s , i s o 1 a r a m o S ta p h y l o a o c cus e p i de r-m i di s

em 16,09% das amostras. Segue-se ainda a escherichia coZi aue

foi isolada de um unico caso (2,08%) de mastite bovina, sendo'

esta preval~ncia muito parecida e determinada oor FERNANDES &

cols. (1973) no Rio Grande do Sul (3,0%)· O Corynebacte r-z: um

pyogenes nao foi isolado em nenhuma das amostras analisadas.

Deve-se assinalar que na diferenciação das es

pêcies de bactérias pertencentes ao s genero treptococcus sp~

naõ foi possível a realização das provas sorolÕgicas, devido

ao eq~ivoco ocorrido durante a escolha do meio de conserva

ção (Agar Nutriente) das cepas isoladas, o que propiciou

perda das estirpes mais exigentes. a

A anãlise dos dados inseridos na TABELA 12, re

vela que 30 amostras de leite procedentes de f€meas

65

tes ao CMT,apresentaram o tempo de redução na prova da redu­

ção do azul de meti.leno nao condi.zente com o numero de miicror

ganismo determinado,isto ~' amostras cujas contagens Jforam

muito inferiores a 500.000 micror/ml ,com tempo de redução bem

abaixo de 3 1/2 horas. Este fato surpreende, pois, contraria

o fundamento da prova da redução do azul de met"ileno, o qual

estabelece uma relação entre o tempo de redução do azul de

metileno e o numero de microrganismos,de modo a proporcionar

uma estimativa do conteúdo bacteriano do leite.Observou - se

ainda que os agentes etiológicos isolados nas 26 amostras re_?

tantes que apresentaram comportamento esperado,eram pratica­

mente os mesmos das 30 amostras ·ar.teriot~es, não sendo verifj_

cada,portanto,qualquer relação com a etiologia da enfermidade.

Com o intuito de encontrar justificativas para

os achados da TABELA 12,realizou-se o cruzamento dos resulta

dos obtidos na contagem leucocitãria com os da prova da redu

-çao do azul de metileno, conforme ilustra a TABELA 13. A ana

lise dos dados desta tabela, evidencia que 86,67% das 30 amos

tras com tempo de redução inferior a 3 1/2 horas,apresentat~am

contagens leucocitãrias maiores que 2.500.000 leucocitos/ml,

enquanto que 88,46% das 26 amostras com tempo de redução su

perior a 3 1/2 horas~ apresentaram contagens leucoci tãri as

iguais ou menores que 2.500.000 leucocitos/ml.Estes dados su

gerem uma provãvel interferência dos leucócitos, quando em

numero elevado, na elaboração da enzima ou na alteração dO'PQ.

tencial de oxi-redução do produto,de modo a estimular a oxi­

dação do azul de metileno, fato este que talvei possa ju~ti

ficar os achados da TABELA 12~

A TABELA 14 mostra os resultados obtidos na com

paraçao da prova da redução do azul de meti leno com os da co~-­

tagem padrão em placas,segi.Jndo.,a's amostras procedentes de fêmeas·ne

66

gativas a prova do CMT:ãs quais inoculou~se os vãrios agentes

etfol5gicos isolados na fase anterior. A anãlise dos dados

desta ta5ela, evide~cia que dentr~ as 30 amostras estudadas ,

27 (90,0%) apresentaram o tempo de redução compatfvel com o

numero de microrganismos determinado. Nas 3 (10,0%) amostras

discordantes, os agentes etiol5gicos inoculados foram os mes

mos das 27 amostras que apres~ntaram comportamento esperado ,

nao sendo verificada qualquer relação entre as amostras dis

cordantes e os agentes testados. Observa-se, ainda, que nas 3

amostras discordantes, 2 apresentaram contagens inferiores a

250.000 mi crorg/ml., enquanto q.ue apenas 1 apresentou conta

gem superior a 500.000 microrg/ml. Em vista do exposto, depr~

ende-se que e muito pequena a probabilidade de aceitação de

um produto com o numero de microrganismos superior ao permiti

do pelo Ministério da Agricultura. Embora exista a probabili­

dade de rejeição de um produto que apresente o numero de mí

crorganismos dentro dos padrões normais, os valores desta ta

bela confirmam a eficiência da prova da redução do azul de meti

leno na estimativa do conteúdo bacteriano do leite,fatc este

que aliado a rapidez,facilidade de execução e baixo custo,qua~

do comparado ao da contagem padrão em olacas ,jústificam a ampl·a

utilização desta prova a nfvel de estabelecimentos industriais.

Considerando que os dados inseridos na TABELA

12, evidenciam diminuição do tempo de redução do azul de meti

leno nas amostras oriundas de fêmeas infectadas, fato este

que talvez possa ser justificado pela interferência dos leucõ

citas, quando em numero elevado, conforme ilustra a TABELA 13,

e tendo em vista a eficiência desta prova quando efetuada em

amostras de leite de fêmeas não reagentes a prova do CMT,como

pode ser verificado na TABELA 14, acredita-se que a prova da

redução do azul de metileno deva ser uti·lizada rotineiramente pelo

67

Se r v i ç o de I n s p e ç ã o , um a v e z q u e o e r m i te cl as si f i c a r os v â r i os t i

pos de leite com simplicidade e rapidez. As variações observadas na

TABELA 12 nio comprometem a efici~ncia desta prova,pois elas

ocorrem no sentido de abreviar o tempo de redução do azul de

metileno, determinando deste modo, a rejeição de um produto

anormal, impr5prio para o consumo humano.

A anãlise dos dados inseridos na TABELA l5,mo~

tra que os resultados das provas efetuadas pelo Serviço de

Inspeção no Lacticfnio Flor da Nata, apresentaram-se dentro

dos padrões estabelecidos pelo Ministério da Agricultura. A

preval~ncia da mastite bovina em até 20,0% das f~meas leitei

ras ou em até 5,0% dos quartos •examinados, conforme i lustra

a TABELA 2, não foi suficiente para colocar os quesitos ana­

lisados fora dos padrões normais. Este fato talvez possa ser

justificado pela mistura do leite mast1tico ao leite oriundo

de fêmeas normais, cuja diluição no leite de conjunto, nao

determina alterações que possam colocar o produto fora dos

padrões estabelecidos p~lo Ministério da Agricultura. Em vis

ta do exposto, acredita-se que estes padrões devam ser obje­

to de estudos posteriores.

A analise dos dados inseridos na TABELA 16, r~

vela que dentre as provas utilizadas pelo Serviço de Insp~

ção na detecção da mastite bovina a nfvel de estabelecimentos

industriais, a prova de Whiteside foi a que apresentou maior

sensibilidade e especificidade, capaz de revelar a presença

de leite anormal em rebanhos cuja preval~ncia desta doença

foi igual ou superior a 7,0% das f~meas ou 1,7% dos quar.tos

analisados. A prova de pus, embora tenha apresentado uma sen

sibilidade menor que' a prova de Hhiteside,mostrou elevada e~

pecificidade, capaz de revelar a presença de leite anormal

em rebanhos cuja preval~ncia da mastite foi igual ou sup~

. 68

rtor a 16,4% das f~meas ou 4,1% dos quartos analisados. A

pesquisa do teor de cloretos foi a prova que apresentou me

nor sensibilidade e especificidade, incapaz de revelar a

presença de leite anormal em todos os rebanhos analisados

Entretanto, este fato nao invalida a utilidade de sua ápl!

caçâo nas anilises de rotina do Serviço de Inspeção, pois

e s t a p r o v a p o de s e r de f u n d a lhe n t a 1 i m p o r t â n c i a n a de te c ç ã o

de fraudes por adiçâo de sal ao leite, efetuado simultanea

mente a adição da ãgua. Assim, .,esta fraude quando reali~zad;:;.

com habilidade, pode colocar praticamente todos os quesitos

analisados dentro dos padrões normais, exceto o ponto cri·os­

cõpio e a concentração de cloretos no produto. Tendo em vis

ta o fato de que a determinaçâo do ponto crioscõpico nem sem

pre e realizada no leite de todos os produtores, devido ao

tempo relativamente elevado necessârio para a execução desta

prova, a pesquisa do teor de cloreto~ passa a apresentar

uma grande importância na detecção .desta dupla fraude. Consi

derando que a detecção de lei te fraudulento é tão ,importante

'quanto o da mastite bovina em termos de Sa~de P~blica, acre

dita-se que esta prova deva ser utilizada rotina i ramente,

principalmente se considerada a rapidez e facilidade de sua

execuçao.

5 • - C O N' C L USA O

- A preval~ncia da mastite bovina nas propried!

des rurais produtoras de leite tipo B, local.:!_

zadas na região ào Munic1pio de Barretos, E~

tado de Sio Paulo, foi de 10~3%.0 Staphylbco~

cus aureus foi o agen1;e etiolÕgico mais isola

do (52,08%) dos casos de ma~tite bovina veri

ficados nesta região.

-Dentre os mêtodos auxiliares de diagnõsticoda

mastite bovina testados, a contagem ieucocitl

r i a f o i o q u e a p r e s e n to u ma i o r c o n c o r d â n c i a

(87,5%) com o exame bacteriológico. A elevada

c o n c o r d â n c i a ( 8 5 , 7 1 % ) v e r i f i c a da e n t r e a p r. o

va do CMT e o exame bacteriolÕgico, co~firma

a efici~ncia desta prova na detecção de trans

70

tôrnos individuais da glândula mamâria,não pe~

ceptiveis clinicamente. Este fato aliado a ra

pidez,facilidade de execução e baixo custo em

relação a outros métodos de diagnóstico, justl

ficam a ampla utilização da prova do CMT a ní

vel de campo.

-Os vários agentes etiológicos isolados dos ca

sos de mastite bovina apresentaram comportame~

to semelhante diante da prova da redução do

a z u 1 de me ti l e n o .

- A prova da redução do azul de meti leno mostrou ..

ser eficiente na estimativa do conteúdo bacte-

riano do leite, o que confirma a importânciade

sua utilização na rotina do Serviço de l Insp~

ção.Embora haja indícios de QUe contagens leu­

cocitãrias superiores a 2.500.000 leuc/ml,inte.!:_

firam na prova da redução do azul de metileno,

de modo a abre vi ar o tempo de redução, este fa

to não C8moromete a eficiência desta orova. t

muito pequena a probabilidade de aceitação de

um produto com numero de microrganismos :~súp~

rior ao permitido pelo Ministério da Agricultura.

-Dentre as provas utilizadas pelo Serviço de In~

peção na detecção da mastite bovina a nivel de

e s t a b e 1 e c i me n t o s i n d u s t r i a i s , a p r o v a de ~~h i te

side foi a que q.presentou maior. valor sensibi-

lidade e especificidade, capaz de revelar a ore

sença de leite anormal em rebanhos cuja preva­

lência desta doença foi igual ou superior a

7,0% das fêmeas ou 1,'7% dos quartos analisados.

A prova de pus, embora tenha apresentado menor

sensibilidade e especificidade que a prova de

71

Wh1teside, fo1 capaz de revelar a presença de

leite anormal em rebanhos cuja preval~ncia da

ma s· t i te f o i i g u a 1 o u s u p e r i o r a 1 6 , 4% das fê

me1s ou 4,1% dos quartos analisados. A pesqu!

sa ·do teor de cloretos mostrou pequena sensi­

bilidade e especificidade, sendo incapaz de

revelar a presença do leite anormal em todos

os rebanhos analisados. Entretanto, este fato

não invalida a utilidade de sua aplicação nas

anãlises de rotina do Serviço de Inspeção,pois

esta prova pode ser de fundamental · importâ~

cia na detecção de fraudes no leite.

- A prevalência da mastite bovina em até 2Q,O%

das fêmeas leiteiras ou em até 5,0% dos quar­

tos analisados, não foi suficiente para colo

caro produto fora dos padrões estabelecidos

pelo Ministério da Agricultura e,diante des

.tes achapos, acredita-se que estes padrões de

vam ser objeto de estudos posteriores.

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ANEXOS

·Meio"s: ·de 'étiltfvó ·u-tTlTta-dós: ·e ·s·e·u ·p·re·p·a·ro

Aga r p·ara· ·c:on·ta·ge·m· ·p·a·drã"ó ·e·m ·p-ra·c·as·

A-1

Eram adicionadas 23,5 gramas de meio em lOOOml de

igua destilada fria. Em seguida, aquecia-se a mistura at~ o

ponto de ebulição, de modo a dissolver o meio completamente

e, esterilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a 1219C.

O pH final do meio era de, aproximadamente, 7,0.

Agar StaphyZococcus 110 (Difco)

Adicionavam-se 149 gramas do meio em 1000 ml de

agua destilada fria. Em seguida, aquecia-se a mistura at~ o

ponto de ebulição, de modo a dissolver o meio completamente

e, esterilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a 1219C.

O pH final do meio era de,aproximadamente, 7,0. Apos sua. es

terilização e enquanto ainda quente, o meio era vertido em

placas de Petri em volume de, aproximadamente, 10,0 ml. Apõs

a solidificação do agar em temperatura ambiente, as 1 placas

eram mantidas em geladeira a 49C.

Agar Baird-Parker {Oxoid)

Adicionavam-se 63 gramas do meio em 1000 ml de

agua destilada fria. Em seguida, aquecia-se a mistura até o

ponto de ebulição, de modo a dissolver o meio com~létame~te

e, esterilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a 1219C. ·

Apõs a esterilização, o meio era resfriado a 509Ce, assépti­

camente,.adicionavam-se 50 ml de emulsão de gema de ovo a 50%

(- BAIRD-PARKER , 1962) e 3,0 ml de solução aquosa de

telurito de potãssio a 3,5%, esterilizada por filtração em

filtro Seitz. Apõs·a mistura, vertia-se o meio em placas de

Petri em volume de, aproximadamente, 10,0 ml. ApÕs a solifi-

A-2

caçao do agar em temperatura ambtente 1 as placas eram mantt

das sob refrigeração. O pH final do meio era de, aproxim6d~

mente, 6,8.

Eram adicionados 37 gramas de caldo desi:dratado

de infusão de c~rebro e coração em 1000 ml de ~gua destila

da. Apõs a homogeini zação, distribui a-se o me i o em . v,ól umes

de 2,0 ml em tubos de ensaio {l2xl20mm) e, em seguida, est~

rilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a 121QC. O pH

final do meio era de, aproximadamente, 7,4.

-Meio para o teste de oxidação e fermentação da glicose (o-n

FÕrmula:

triptona------------------------------------10 g.

extrato de levedura------------------------- 1 g.

glicose-------------------------------------10 g.

púrpura de bromocresol--------------------0,04 g.

agar-------------------------------------~ 2 g.

Preparo:

Estes ingredientes eram adicionados a 1000 ml de

agua destilada. Em seguida, aquecia-se a mistura ate o ponto

de ebulição, de modo a dissolver o meio completamente. Apõs

a agitação·, distribuia-se o produto em tubos de ensaio (lOx

150 mm)', enchendo-os a t~ dois terços de sua capa c i da de e, es

terilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a 121QC. O pH

do meio era de, aproximadamente, 7,0. Este meio, apos o seu

preparo era mantido sob refrigeração a 4QC.

A~af UN6se (Oxoid)

Eram adicionados 39 gramas do meio em 1000 ml de

agua destilada. Em seguida, aquecia-se a mistura ate o ponto

A-3

de ebulição, de modo a dissolver o meio completamente e, es

terilizava-se em autocla~e, durante 15 minutos a 1219C. O pH

final do meio era de,aproximadamente, 7)3. Depois da esteri­

lização, vertiam-se cerca de 10,0 ml do meio ainda quente, em

placas de Petrf, as quais, ap6s a solidific?çâo do ãgar em

temperatura ambiente, eram mantidas em geladeira a 4QC.

Agar ·manitol s·a·lgado (Difco)

Adicionavam-se 111 gramas do meio em 1000 ml de

agua destilada fria. Em seguida, aquecia-se a mistura até o

ponto de ebulição, de modo a dissolver o meio completamente

e , e s te r i 1 i z a v a - s e em a u to c 1 a v e--, d u r a n te 1 5 m i n u tos a 1 2 1 9 C .

o pH final do meio era de, aproximadamente, 7,4. Ap6s a este

rilizaçâo, vertiam-se cerca de 10,0 ml do meio ainda quente

em placas de Petri que,apõs·a solidificaÇão do agar em tempe­

ratura ambiente, eram mantidos em geladeira a 49C.

Agar sangue bãsico (Oxoid)

Dissolviam-se 40 gramas do meio em 1000 ml de

agua detilada. Em seguida, aquecia-se até o ponto de ebuli

çao, de modo a dissolver o meio completamente e, esteriliza-

·va-se em autoclave durante 15 minutos a 1219C. Apos a esterj_

lização,resfriava-se o meio base a 50QC e,adicionavam-se 5%

de sangue de carneiro desfribinado. Em seguida, efetuava-_se

a homogeinização do meio e a sua distrib~içâo em placas de

Petri, em volume de 10,0 ml, aproximadamente. Apos a solidi­

ficação do âgar em temperatura ambiente, as placas eram man

tidas em refrigeração a 4QC. O pH final do meio era de, aprQ_

ximadamente, 7,3.

Eram adicionadas 8 gramas de caldo nutriente(Dif

co) em 1000 ml de âgua destilada, sendo este meio esteriliza

A-4

do em autoclave durante 15 minutos a 1219C. O pH final do

meio era de, aproximadamente, 6,8. Postet~iormente, a dada

100 m1 de _caldo nutriente, juntavam~se 5,0 gramas de clore-

to de sÕdio e ·1 ,5 gramas de âgar e) efetuava-se, a segui r ,

a esterili.zação em autoclave durante 20 minutos a 1219C.Apõs

a esterilização, adicionava-se, essépticamente, ao meio res

friado a 50QC, 1~0 ml de emulsão de gema de ovo a 50% (10,0

ml de gema adicionados a 10,0 ml de solição fisiológica fe

n i cada a O , 2%) . Em se g ui da , o me i o e r a di s t r i b ui do em p 1 ~

cas de Petri, as quais, apõs a solidificação do meio em tem

peratura ambiente, eram mantidas em refrigerador a 4QC.

· M~id d~ EdWafds (Oxoid)

Adicionavam-se 41 gramas do meio em 1000 ml de

agua destilada. Em seguida, a(]uecia-se até ·o ponto de ebul_!_

-çao, de modo a dissolver o meio completamente e, esteriliz~

va-se em autoclave, durante 20 minutos a 1159C. Apõs a est~

rilização, o meio era resfriado a 50QC e, assépticamente

a di c i o n a v a m- s e 5% de s a n g u e de c a r n e i r o de s f i b .~i n a do . Em s e

guida, efetuava-se a homogeinização do meio e a distribui

çao em placas de Petri, em volumes de 10,0 ml, aproximad~

mente. Apõs a solidificação do ãgar em temperatura ambiente,

as placas eram mantidas em geladeira a 4QC.

-Agar sangu~ atida bãsico (Difco)

Adicionavam-se 30 gramas do meio desidratado em

1000 ml de agua destilada. Em seguida, aquecia-se até o po~

to de ebulição, de modo a dissolver o meio completamente e,

~sterilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a .1219C.

Apõs a esterilização, o meio era resfriado a 50QC e, assép­

ticamente, adicionavam-se 5% de sangue de carneiro desfibr!

nado. Em seguida, efetuava-se a homogeinização do meio e a

A-5

distribuição em placas de Petri, em volume de 10,0 ml, apro­

ximadamente. Ap5s a solidificaçio do meio em temperatura ~m

biente, as placas eram mantidas em geladeira a 49C. O pH fi

nal do meio era de,aproximadamente, 7,2.

Meio ~~ra hidr5lise do hipurato de s5dio (BIER, 1975).

Adicionavam-se 0,8 gramas de caldo simples(Difc~

em 100 ml de ~gua destilada. Em seguida, aquecia-se at~ o

ponto de ebulição, de modo a dissolver o meio completamente

e, esterilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a 1219C.

Ap6s a esterilização, juntava-se a este meio, 1,0 grama de

hipurato de s5dio, sendo esta mistura submetida a esteriliza

ção através de membrana filtrante ( 11 Millipore"). Em seguida,

o meio era distribu1do em tubos de ensaio (lOxlOO mm), ·pr~

viamente esterilizados, os quais eram mantidos em geladeira

a 49C.

Meio p~ra hidr6lise da esculina (DEMETER, 1969)

F5rmula:

peptona-----------------------------------1,5 g.

bile--------------------------------------0,5 g.

esculina-------------------~--------------0, 1 g.

citrato de ferro--------------------------0,05 g.

Preparo:

Estes ingredientes eram adicionados a 100 ml de

agua destilada e, a mistura aquecida at~ o ponto de ebulição,

de modo a dissolver o meio completamente. Em seguida, esteri

lizava·-se este meio atrav~s de membrana filtrante ( 11 Millipo­

re11). Posteriormente, o meio era distribuido em tubos de en

saio (lOxlOO mm)_, previamente esterilizados, os quais eram

mantidos em geladeira a 49C.

A-6

Meio basal tom vermelho de f~~ol· ·par~ ferm~~t~~âo de ·carbohi~

·dra"fos· e··árcooi.s (_Di.fco)_

Adicionavam-se 16 gramas do meio basal com verme

lho de fenol em 1000 ml de agua desti:lada. Em seguida, aque-

cia-se a mistura at~ o ponto de ebulição, de modo a Jdis

solver o me_io completamente e, distribuía-se em balões volu­

métricos de 100 ml. Poster·iormente, efetuava-se a· esteriliza

ção em autoclave, durante 15 minutos a 1219C. Apôs a esterj_

lização, adicionava-se l ,O ml das soluções de carbohidratos

e ílcoois (arabinose, maltose, sacarose, trealose, rafinose,

i nu l i n a , g l i c e r i na , ma n i to l , s o-rb i to l , s a l i c i na e a m i do) a

10% nos balões respectivos, sen~o estas soluções esteriliza­

das pr~viamente, atrav~s da filtração em membrana l'fi·ltrante

(11 Millipore 11

).

~gar eosina azul de metileno (Difco)

Adicionavam-se 27,5 gramas do meio em 1000 ml de

agua destilada friá. Em.seguida, aquecia-se a mistura at~ o

ponto de ebulição, de ~Qdo a dissolver o meio completamente

e, esterilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a l219C.

,O pH final do meio era de, aproximadamente, 7,0. Apos sua

esterilização e enquanto ainda ~uente, o meio era vertido em

placas de Petri em volumes de, aproximadamente, 10,0 ml.Apos

a solidificação do ãgar em temperatura ambiente,as nlacas eram manti­das a 49 C.: ~gar MacConkey (Difco)

Adicionavam-se 50 gramas do meio em 1000 ml de ãgua destila­

da fri·a. Em seguida, aquecia-se a mistura ate o ponto de eb_~

lição, de modo a dissolver o meio completamente e, esterili

zava-se em autoclave, durante 15 minutos ·a l219C. O pH fi"nal

do meio era de, aproximadamente, 7,1. Apôs sua esterilização

e enquanto ainda quente, o meio era vertido em placas de

Petri em volume& de, aproximadamente, 10?0 ml. Depofs da so

lfdfficaçâo do meio em temperatura am5iente, as placas eram

mantidas em geladeira a 4QC.

· ·Meio ·de ·lo·~ffl e r (Oi f co)

Adicionavam-se 80 gramas do meio em 1000 ml de

ãgua destilada aqueci da (42-45QC). Em segui da, retirava-se por

filtração, os componentes insolúveis do meio e, efetuava-se a

distribuição da mistura em tubos de ensaio rosqueâveis, os

quais eram colocados na autoclave em posição inclinada. Fecha

va-se a tampa e os orificios da ~autoclave, antes de dar o va

por, de modo a manter a mistura ·de ar a vapor, necessâria p~

ra a coagulação do meio, efetuadà durante 10 minutos sob uma

pressão de 10 libras. Posteriormente, purgava-se a mistura de

ar e vapor e, aumentava-se o vapor de modo a atingir 121QC,

sendo esta temperatura mantida durante 15 minutos. O resfria­

m e n t o e r a e f e t u a do n a p r õ p r i a a u to c 1 a v e . O p H f i n a l d o m é i: o

era de, aproximadamente, 7,2.

~gar dextrosé~proteose nQ 3 com sangue e telurito de potâssio

(Difco)

Adicionavam-se 40 gramas do meio em 1000 ml de

agua destilada fria. Em seguida, aquecia-se a mistura até o

ponto de ebulição, de modo a dissolver o meio completamente e,

esterilizava-se em autoclave, durante 15 minutos a 1219C.Apõs

a esterilização, o meio era resfriado a 50QC e, assépticamen­

t e , a .di c i o n a v a m- s e 5 , O m 1 de s o 1 u ç ã o de s a n g u e c o m te 1 u r i t o de

potãssio (sangue de bovino desfibrinado com 1% de telurito de

potãssio) ã cada 100 ml de meio âgar dextrose-proteose. Em

seguida, aquecia-se a mistura a 75-BOQC, até o aparecimento da

tonalidade do ãgar chocolate e, resfriava-se a 50QC. Apõs es

te resfriamento, vertia-se o meio em placas de Petri em vdlu

A-8

mes de~ aproximadamente, 10,0 ml, Depois da solidificação do

agar em temperatura ambiente, as placas eram mantidas em g~

ladeira a 4QC.