Ministerio da Ciencia, Tecnologia, Inovaçdw e ComunicaçaeS Instituto Nacional de Pesquisas da AmazBnia

Coordenação de Capacitação Divisáo Apoio Técnico

PROGRAMA DE INICIAÇAO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL

ESTUDO CITOGENOTOXICO DO BIOMARCADOR ÉTER PROPIL

DILAPIOL EM Aedes (STEGOMYIA) Aegypti (DIPTERA: CULICIDAE DE

MANAUS AMAZONAS

BOLSISTA: LUANA JAQUELLINE SOUZA DA SILVA

ORIENTADOR (A): MIRIAM SILVA RAFAEL

Relatório Final apresentado ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, wmo requisito para a wnclusão como participante do Programa de Iniciação Científica do INPA.

Manaus - Amazonas 2017

Apoio Financeiro:

de!! -IC

Ministkrio da Ciência, Tecnologia, Inovaq3es e ComunicaçBes instituto Nacional de Pesquisas da AmaAnia

CoordenaçHo de CapaQta@o Di*o Apoio Técnico

Estudo citogenotóxico do biomarcador éter propil dilapiol em Aedes (Steg

Aegypti (Diptera: Culicidae) Manaus, Amazonas.

Resumo (250 a 400 palavras)

O Aedes aegypti é um mosquito de grande importância para saúde pública, devido ao seu papel vetor das enfermidades conhecidas como dengue, febre amarela, febre chikungunya e zika I

Para o controle de mosquitos de importância médica, como o A. aegypti, são utiliz principalmente inseticidas sintéticos, das classes piretróides e organofosforados. Entretanto, e classes de inseticidas vêm provocando resistência a diversas espécies de mosquitos veto, Compostos naturais à base de plantas como o dilapiol e seus derivados semissintéticos como o é propil dilapiol têm sido úteis como novas alternativas ao controle de insetos vetores. O objetivo des estudo foi analisar os efeitos genotóxicos e mutagênicos do composto éter propil dilapiol em núclec interfásicos e metafásicos de neuroblastos e ovócitos de A. aegypti por duas geraees consecutiva @?I e F2). Foram capturados larvas e ovos de A. aegypti no bairro São José 3, Manaus, AM (5 03°08'33.5" W 060°01'13.5"). Os mosquitos foram submetidos a bioensaio com o semissintético fiter propil dilapiol, para avaliar seu potencial genotóxico sobre larvas e adultos (gerações F1 e F2). As larvas de A. aegypti foram expostas a diferentes concentrações de Éter propil dilapiol20 pglmL e 40 pglmL(ensaio genotóxico), durante 4 horas. A genotoxicidade do Éter propil dilapiol foi analisada em preparações citológicas de cérebros de larvas e de ovários de fêmeas adultas, após exposição machos e fêmeas cruzaram, para formação das gerações (F1 e F2). No controle foi utilizado DMSO 0,05% em água potável. As análises das preparações citológicas apresentaram efeitos genotóxicos em núcleos interfásicos de neuroblastos e ovócitos (formação de micronúcleo, brotamentos, células poli nucleadas e outras más-formações), e em células metafásicas (quebras cromossômicas), essas anomalias mostraram resultados significativos quando comparado aos indivíduos, conforme o teste estatístico Tukey (One-way ANOVA). O aumento significativo na frequência de anomalias nucleares de A. aegypti mostrou, que o composto Éter propii dilapiol causou efeitos genotóxicos no genoma desse mosquito. Novos estudos são essenciais para esclarecer os mecanismos específicos de ação desse composto, visando a sua aplicação diretamente no campo, para o combate a esse principal vetor da Dengue no Brasil e no mundo.

Amio Financeiro:

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Ministério da Cikncia, Tecnologia, Inovaçóes e ComunicaçoeS instituto Nacional de Pesquisas da AmazBnia

CoordenaçHo de CapacitaçHo Divisão Apoio Técnico

Palavras Chave: A. aegvpti, Semissintético, Éter propil dilapiol e Bioensaio.

Subhrea

Genética

Financiamento

(PIBIC/CNPq ou PAIC/FAPEAM)

Data: / 1

PSBU- da % a ,. Bolsista

Apoio Financeiro: Realim@o: -

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PROGRAMA DE INICIAÇÁO CIENT~FICA DO INPA RELAT~RIO FINAL

(1994). Os mosquitos identificados foram transferidos em casais para gaiolas, para cruzamento e obtenção da geração F1, submetidas a bioensaio com o semissintético éter propil dilapiol.

2. Obtençiio da Colônia Fi

Após identificação, as formas imaturas capturadas em campo foram colocadas em vasilhas

esmaltadas preenchida com 113 de seu volume com água potável. A alimentação das larvas foi

realizada com ração comercial para peixe, dosada de acordo com padronização do laboratório de

malária e dengue no INPA. As larvas ao atingirem o estágio de pupas foram separadas em bandejas

plásticas apenas com água e cobertas com tela. Os mosquitos adultos (machos e fêmeas) que

emergiram foram transferidos para gaiolas para cruzamento, onde os machos foram alimentados com

solução açucarada (10%) e a as fêmeas com sangue de hamster (Mesocricetus aureatus),

previamente. As fêmeas depositaram seus ovos em copos plásticos revestidos internamente com

papel filtro e preenchidos com água em 113 de seu volume. Desses ovos (geração FI) eclodiram

larvas, que ao atingirem o 3O estádio foram submetidas a bioensaio com a substância éter propil

dilapiol.

Bioensaio

No bioensaio com a colônia Fi foram utilizadas duas concentrações do semissintético éter

propil dilapiol em A. aegypti, previamente padronizadas (Santos, 2016). Um total de 160 larvas (3O

estádio) de A. aegypti com cinco réplicas, contendo dez larvas em cada uma foram expostas nas

concentrações de éter propil dilapiol(20 pg/mL e 40 pg/mL) em DMSO, além das amostras controle

negativo em água potável e DMSO (5%), por quatro horas. Após o bioensaio, cérebros de 20 larvas

de 3O estádio de cada concentração e de 20 larvas de cada amostra controle foram utilizados nas

preparações de cromossomos mitóticos. As demais larvas sobreviventes foram transferidas para

vasilhas esmaltadas com água potável e alimento.

O restante das larvas completou o seu desenvolvimento em água potável até a fase adulta, que

foram utilizadas pas confecçóes de lâminas (cromossomos meióticos).

Apoio F i n a n d

%PA -*- I COCP 'Oo"m.". ‘a .. -.c*.A-

PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL

2.4 Preparaçaes citológicas da geraçiio F1

Foram realizadas as preparações de cromossomos mitóticos, a partir de cérebros de larvas de

3" estádio (n=10) e fêmeas adultas (n=10) de cada bioensaio, e dos indivíduos controle, segundo

Imai et al. (1988).

Para os cromossomos meióticos, um total de 10 fêmeas adultas (do bioensaio) e 10 fêmeas

(controle) tiveram abdômen dissecado, para a preparação de lâminas de ovário.

2.5 Obtençiio da colônia Fz

Após as preparações citológicas, com os adultos que restaram do bioensaio (3.3) formaram

casais e foram transferidos para gaiolas, para cruzamento e oviposição. Os adultos (machos) foram

alimentados com solução açucarada (10%) e as fêmeas, com sangue de hamster (Mesocricetus

aureatus). Copos plásticos foram preenchidos com água em 113 de seu volume e revestidos

internamente com papel filtro, para deposição dos ovos pelas fêmeas. Os resultados dos cruzamentos

geraram ovos, que foram depositados em papel filtro originando a geração 2 (F2). A partir desses

indivíduos foi realizado o bioensaio éter propil dilapiol, conforme o item 2.3 (acima citado).

2.6 Avaliaçilo da genotoxicidade

A avaliação da genotoxicidade foi feita a partir das frequências de anomalias nucleares

(interfásicos e metafásicos) encontradas em núcleos de neuroblastos e de ovócitos. A observação dos

núcleos foi realizada em microscópio de luz Axioplan Zeizz, por meio de objetiva de imersão de

100X, e as microf~togr~as serão realizadas pela AxioCam MRc.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Apoio Financeiro: 5

Realização:

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Em neuroblastos de larvas em 3O estádio e ovócitos de fêmeas adultas expostos ao Éter propil dilapiol

nas concentrações 20pglmL e 40pg/mL foi detectada a presença de núcleos interfásicos normais,

brotamento celular, células com formação de micronúcleo, núcleos segmentados e células

polinucleadas (Figura: 2).

Figura 2: Preparações cito16gicas de neuroblastos (B e C) e de ovócito (A e D) corados com Giemsa (pH 5,8) e orceína- lacto-acética (2%). A - Núcleos segmentados (seta); B - micronúcleo; C - célula com má-formação; D - brotamento (seta). Aumento: 1000 e 1600~.

Nos núcleos em divisão de neuroblastos e ovócitos, foi registrado a presenq de núcleos metafásicos normais nos indivíduos controle. Em contrapartida, os indivíduos expostos ao Éter propil dilapiol nas concentrações 20 pg/mL e 40 pg/mL foi observado quebras cromossômicas e pontes anafásicas. (Figura: 3).

Apoio Financeiro..

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Figura 5: Núcleos em divisão celular de neuroblastos (A, B e C) de Aedes aeaypi corados com Giemsa (pH 5,8) e orceina-lacto-acética (2%). A - núcleo metafásicos (normais); B e C - quebra cromossômica (seta). Aumento: 1000 e 1600x.

O gráfico (A- neuroblastos e B- ovócitos) mostra a frequência de anormalidades nucleares (%)

para os núcleos analisados por lâmina (n=1000). As letras diferentes a, b e c mostram variação

significativa dos tratamentos 20pgImL e 40pgImL do Eter propil dilapiol + DMSO em relação ao

controle negativo (água + DMSO). As letras que se repetem (letras iguais), indicam variação não

significativa segundo ANOVA e teste de Tukey @ > 0,05). A frequência média de anomalias variou

significativamente quando comparada ao controle negativo e entre os indivíduos tratados e as geraç6es.

7 Apoio F i n a n h . Reaiizaçâo:

PROGRAMA DE INICIAÇÃO cIENT~J?IcA DO iNPA RELAT~RIO FINAL

Estudos específicos acerca dos mecanismos de ação desse composto fazem-se necessários

para compreensão diretamente no campo considerando a importância de combate do A. aeavpti,

principal transmissor de dengue, febres amarelas e chikungunya e zika vírus.

REFERÊNCIAS

Belzile, A.-S.; Majerus, S.L.; Podeszfinski, C.; Guillet, G.; Durst, T.; Arnason, J.T. 2000. Dilapiol

Derivatives as Synergists: Structure-Activity Relationship Analysis. Pesticide Biochemistry and

Physiology. 66: 33-40 .

Consoli, R.A.G.B. Lorenp-de-Oliveira, R.L.D. 1994. Principais mosquitos de importância sanitária

no Brasil. Fiocruz, Rio de janeiro, Brasil, 225 pp.

Domingos, P. R. C; Pinto, A. C. Santos, J.M.M; Rafael, M. S. 2014. Insecticidal and genotoxic

potential of two semi-synthetic derivativesof dillapiole for the control of Aedes (Stegomyia) aegypti

@iptera:Culicidae). Mutation Research. 772: 42-54.

Forattini, O.P. 2002. Culicinae: Aedini. In: Culicidologia Médica. São Paulo: editora Da

Universidade de São Paulo, Vol. 2: 403-484.

Imai, H.T.; Taylor, R.W.; Crosland, M.W.J.; Crozier, R.H.; 1988. Modes of spontaneous

chromosomal mutation and karyotype evolution in ants with referente to the minimum interaction

hypothesis. Jpn. J: Genet., 63:159-185.

Kuhn, R.J.; Zhang, W.; Rossmann, M.G.; Pletnev, S.V.; Comer, J.; Lenches, E.; Jones, C.T.;

Mukhopadhyay, S.; Chipman, P.R.; Strauss, E.G.; Baker, T.S.; Strauss, J.H. 2002. Structure of

Dengue Vinis: Implications for Flavivinis Organization, Maturation, and Fusion. Cell. 108: 717-725.

Luna JED, Martins MF, Anjos AI?, Kuwabara EF, Navarro-Silva MA. Susceptibilidade de A. aegypti

aos inseticidas temephos e cipermetrina, Brasil. Rev.saude publica 38: 842-843,2004, Maciel MAM,

Pinto AC, Veiga Jr VF, Grynberg NF, Echevarria A. Plantasmedicinais: a necessidade de estudos

multidisciplinares. Quim. Nova 25: 429-438,2002.

Apoio Financeiro:

8 3 -r-

PROGRAMA DE INICIAÇAO CIENT~FICA DO INPA R E L A T ~ ~ ~ I O FINAL

Ministério da Saúde. 2017. Boletim epidemiol6gico, 48:2

(http:/ /portalarquivos.saude.gov.br/ images/pdf/2017/mai0/25/Monitor~e-

febre-de-chikunguny a - e - f e b r e - p e l o - v i r u s - Z s s o em

14/06/2017.

Ministério da Saúde. 2014. Guia de vigilância epidemiol6gica/Fundaçiio Nacional de Saúde, Brasil. C

Polanczyk RA, Garcia MO, Alves SB. Potencial de Bacillus thuringiensis Berliner no controle de A.

aegypti. Rev. Saúde Pública 37: 813-816,2003.

Pinto, A.C.S. 2008. Desenvolvimento de substâncias semi-sintéticas e bioativas a partir de 4-

nerolidilcatechol e dilapiol. Tese de Doutorado. Biotecnologia, área de Saúde, Universidade Federal

do Amazonas, 296p.

Pohlit, A.M.; Quignard,E.LJ.; Nunomura, S.M.; Tadei, W.P.; Hidalgo, k D e F.; Pinto, A.C.Da S.;

Dos Santos, E.V.M.; De Morais, S.K.R.; Saraiva, R.De C.G.; Ming, L.C.; Alecrim, A.M.; Ferraz,

A.De B.; Pedroso, A.C. Da S.; Diniz, E.V.; Finney, E.K.; Gomes, E.De O.; Dias, H.B.; De Souza,

K.Dos S.; De Oliveira, L.C.P.; Don, L.De C.; Queiroz, M.M.A.; Henrique, M.C.; Dos Santos, M.;

Lacerda Júnior, O.Da S.; Pinto, P.De S.; Silva, S.G.; Graça, Y.R. 2004. Screening of plants found in

the State of Amazonas, Brazil for larvicidal activity against Aedes aegypti larvae. Acta Amazonica.

34(1): 97 - 105.

Rafael, M.S. & Tadei, W.P. 1998. Metaphase karyotipes of Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi

Root and A. (N) nuneztovari Galbadón @iptera:Culicidae). Genetics and Biology. 21 (4): 351- 354.

Rafael, M.S.; Hereira-Rojas, W.J.; Roper, JJ.; Nunomura, S.M.; Tadei, W.P. 2008. Potential control

of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) with Piper aduncum L. (Piperaceae) extracts demonstrated by

chromosomal biomarkers and toxic effects on interphase nuclei. Genetics and Molecular Research.

7(3): 772-781. C

Ross, T.M. 2010. Dengue Vinis. Clin Lab Med, 30,149-160.

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