influência do carbono orgânico dissolvido na ocorrência de...

XX Jornada de Iniciação Científica PIBIC INPA - CNPq/FAPEAM Manaus - 2011

Influência do carbono orgânico dissolvido na ocorrência de alterações histopatológicas em Paracheirodon axelrodi (Schultz, 1956) após exposição ao cobre

Kátia Teixeira de CASTRO1; Nislanha Ana dos ANJOS2, Marise Margareth SAKURAGUI2, Ronildo Oliveira FIGUEIREDO3; Karen Yuri Suguiyama da SILVA3, Salomão Pinheiro RIBEIRO4, Tariana Rosa de Jesus Passos Cordeiro MARTINS4, Adalberto Luis VAL5. 1Bolsista PIBIC/FAPEAM; 2Colaboradoras PÓS-DOC/CAPES/INPA; 3Colaboradores MESTRANDO/FAPEAM/NILTON LINS; Colaboradores 4Bolsista PIBIC/CNPq/CAPES/INPA; 5Orientador CPEC/INPA.

1. Introdução Na Amazônia são encontrados três tipos básicos de água: águas brancas, águas pretas e águas

claras, sendo que cada tipo possui suas próprias características físicas, químicas e biológicas. Ambientes de água preta, como o Rio Negro, possuem elevada concentração de substâncias húmicas originadas da decomposição da matéria orgânica vegetal e animal. Em decorrência disto, estas águas apresentam alta concentração de carbono orgânico dissolvido (COD) (Sioli, 1968). Na região amazônica há grandes focos de poluição, sendo que algumas destas fontes referem-se a altas concentrações de cátions metálicos diluídos nos corpos d’água, que podem originar-se principalmente de atividades industriais e garimpos (Silveira-Rodrigues, 2006). Os efeitos desses contaminantes em peixes podem se manifestar em vários níveis da organização biológica, incluindo disfunções fisiológicas, alterações estruturais em órgãos e tecidos e modificações comportamentais que podem levar ao prejuízo do crescimento e reprodução (Adams et al., 1990). Dentre estes metais esta o cobre que desempenha um papel importante na dieta e na respiração celular dos peixes, e em excesso desencadeia a formação de radicais livres no tecido onde o cobre se acumula (Laurén e McDonald, 1985). Desta forma, o presente trabalho avaliou se a presença de COD na água pode minimizar a ocorrência de alterações histológicas em peixes expostos ao cobre.

2. Material e Metódos

Os exemplares de cardinal, Paracheirodon axelrodi, foram obtidos em fornecedores de peixes ornamentais da região de Manaus e transportados ao Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular-LEEM/INPA. Os peixes foram aclimatados por 20 dias em um tanque de 500 L e alimentados durante 3 meses no período de pré-experimental. A alimentação dos animais foi suspensa 24 horas antes do início dos experimentos e durante os mesmos. As medidas das características físico-químicas da água foram efetuadas diariamente durante a execução dos experimentos. No presente experimento utilizamos oito aquários de 4 L, e em cada aquário foram expostos 4 exemplares de cardinal. A cada 24 horas foram coletadas amostras de água em todas as câmaras experimentais, para a determinação da concentração real de cobre por espectrofotometria de absorção atômica (Perkin Elmer modelo AAnalyst 800). O valor da CL50 96 horas para o cardinal exposto ao Cu2+ na água do poço do INPA foi de 45,87 µgCu+2/L, conforme determinado por Duarte et al. (2009) e Silveira-Rodrigues (2006). Nos tratamentos utilizando água do poço do INPA e COD este valor foi de 765,9 µg de Cu+2/L (Vilarinho, 2008). No presente experimento utilizamos o valor de 50% da CL50 96 horas, ou seja, a metade da CL50 determinadas por Duarte et al. (2009) e Silveira-Rodrigues (2006), que equivale a 22,93 µgCu+2/L na água de poço do INPA. No experimento em água do poço do INPA e COD a concentração do cobre foi de 382,95 µgCu/L, que equivale a metade da CL50 determinada por Vilarinho (2008) para a água do poço com adição de 10mgCOD/L. No período de 0, 24 e 96 horas foi retirado um indivíduo de cardinal e coletada amostras de tecido (fígado) para as análises histopatológicas. Os peixes foram anestesiados, sacrificados e tiveram as amostras de fígado fixadas em ALFAC. Após o período de fixação (24h), as amostras foram desidratadas em uma bateria de álcoois crescente, diafanizadas em xilol e incluídas em Paraplast. Foram efetuados cortes histológicos de 5 µm para confecção das lâminas, as quais, foram coradas com hematoxilina e eosina, e observadas em microscópio óptico para avaliação das lesões histológicas. A análise da ocorrência de alterações histopatológicas no órgão foi avaliada semiquantitativamente de duas formas: A primeira, com cálculo do Valor Médio de Alteração (VMA), com base na incidência de lesões, de acordo com Schwaiger et al. (1997). Para tanto, atribui-se um valor numérico para cada animal conforme a escala: grau 1 (ausência de alterações histopatológicas), grau 2 (ocorrência de lesões pontualmente localizadas) e grau 3 (lesões amplamente distribuídas pelo órgão), e a segunda analise semi-quantitativa foi através do Cálculo do Índice de Alterações Histopatológicas (IAH), com base na severidade de cada lesão (alterações de estágios I, II e III). O IAH foi calculado para cada peixe através da fórmula: IAH = 100ΣI + 101 ΣII + 102 ΣIII. Os valores de IAH maiores que 100 indicam danos irreparáveis no tecido

(Poleksic e Mitrovic-Tutundzic, 1994).


3. Resultados e discussão As características físico-químicas da água do poço do INPA, da água do poço do INPA com

cobre (Cu), da água do poço do INPA com adição de carbono orgânico dissolvido (COD) e da água do poço do INPA com adição de carbono orgânico dissolvido (COD) e cobre (Cu) são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Valores médios das características físico-químicos da água utilizada nos experimentos.

Tratamento Temperatura °C

pH O2 Dissolvido Alcalinidade (mg.CaCO3. L-1)

Dureza (mg.CaCO3.L-1)

Água do poço 26,2±0,25 6,6±0,10 5,56±0,05 2,0±0 1,75±0,05

Água do poço + Cu 25,3±0,05 6,7±0,05 5,9±0,05 2,0±0 1,7±0,14

Água do poço + 10 mgCOD.L-1 26,1±0,15 6,6±0,05 5,6±0,11 2,5±0,7 1,8±0,07

Água do poço + 10 mgCOD.L-1 + Cu

26,0±0,05 6,6±0,05 6,1±0,05 2,0±0 1,9±0,14

Entre as importantes funções fisiológicas do fígado incluem-se o metabolismo intermediário de proteínas, carboidratos e lipídios, a síntese de proteínas plasmáticas e ovoalbumina, além da formação e secreção da bile. Além disso, é encarregado da detoxicação endógena e de produtos tóxicos exógenos como diferentes tipos de toxinas, drogas, metais de transição, e pesticidas em geral (Roberts 2001). Nesse último aspecto atua como biomarcador da poluição ambiental (Zelikoff, 1998). Neste trabalho, várias das lesões observadas conhecidas como hepatodistrofias, que incluem por exemplo, a hipertrofia de hepatócitos tanto do citoplasma quanto do núcleo (Figura 1), estão relacionadas aos processos de intoxicação sendo a extensão e gravidade da lesão proporcional ao tipo, duração, severidade da agressão e estado fisiológico da célula envolvida (Robbins e Cotran, 2005). O fígado dos peixes é especialmente susceptível à ação de produtos químicos graças à lentidão do fluxo sanguíneo em relação ao “output” cardíaco. Além disso, o fluxo biliar é cerca de 50 vezes mais lento que o de mamíferos, tornando mais vagarosa à depuração de produtos tóxicos (Dalich e Gingerich, 1982). Desta forma os elementos tóxicos que chegam ao fígado pela corrente sanguínea exercem seus efeitos nos hepatócitos por maior tempo do que o fariam em mamíferos. Talvez também seja válido afirmar que em peixes as substâncias tóxicas possam causar transtornos hepáticos em concentrações mais baixas do que as necessárias para mamíferos. Assim é sugestivo que as lesões encontradas sejam resultantes da contaminação por cobre. Outras alterações observadas com frequência foram atrofia celular e nuclear, núcleo na periferia da célula, vacualização, edema intracelular, deformação do contorno celular, desarranjo dos cordões hepáticos, infiltração, rompimento celular e estagnação biliar. Algumas dessas alterações estão identificadas na Figura 1, sendo uma das mais frequentes a vacuolização, a qual também foi encontrada em fígado de Oreochromis niloticus exposto ao cobre (Figueiredo-Fernandes et al., 2007). Poucos centros de melanomacrófagos (CMMs) foram observados no fígado (FIgura 1). A melanina destes pode absorver ou neutralizar radicais livres (Agius e Agbede, 1984; Hartley et al., 1996), cátions e outros agentes tóxicos, derivados da degradação de material celular fagocitado (Zuasti et al., 1998) e, tem importância na produção de compostos bactericidas especialmente peróxido de hidrogênio (Wolke et al., 1985). Peixes como os P. axelrodi, sujeitos ao ataque de agentes biológicos e químicos, apresentaram diferentes graus e tipos de lesões sugerindo a possibilidade dessas agressões. Como reação, o organismo pode estimular repostas de centros melanomacrófagos, justificando sua presença no fígado. Rocha et al. (2010) também relata não ter encontrado CMMs em abundância em todos os fígados analisados da espécie Brachyplatystoma rousseauxii, e que isso sugere nos fígados alterados, um dano tecidual agudo, comprometendo o mecanismo de defesa e podendo até levar à morte do peixe. A presença de alterações histopatológicas foram confirmadas pelo VMA para os grupos expostos por 24h e 96h (sem COD) sendo a classificação considerada como grau 2 com ocorrência de lesões pontualmente localizadas no fígado (Figura 2A), enquanto o IAH para os grupos controle e cobre (ambos sem COD) nos tempos de exposição 24 e 96h apresentaram valores médios em torno de 22,4±5,3 a 57,0±6,8 indicando danos moderados a severos no órgão. Os grupos controle com adição de COD tiveram valores médios de IAH entre 3,6±0,2 a 4,6±0,2 indicando funcionamento normal do órgão, enquanto que, os valores médios de IAH dos grupos expostos ao cobre com adição de COD por 24h e 96h ficaram entre 13,8±3,2 e 23,2±2,3, indicando assim, danos leves a moderados no órgão (Figura 2B). Valores maiores e significativos para o VMA e o IAH também foram observados para o fígado de Prochilodus lineatus quando exposto ao inseticida dimilin (Maduenho et al., 2007), demonstrando que danos e injúrias a esse órgão estão presentes quando os peixes são expostos a qualquer tipo de contaminante na água.


Figura 1. Histopatologia de fígado de Paracheirodon axelrodi. Em (A) Disposição normal dos hepatócitos, membrana citoplasmática (�) e membrana nuclear (*); (B) Presença de melanomacrófago; (C) Rompimento celular; (D) Vacuolização citoplasmática; (E) Núcleos na periferia da célula; (F) Hipertrofia celular.

Figura 2. A. Valores médios de alteração (VMA) e B. Índice de alteração histopatológica (IAH) do fígado de Paracheirodon axelrodi dos grupos controle e cobre sem adição de COD e com adição de COD nos tempos 0h, 24h e 96h. * - indica diferença significativa em relação ao grupo sem adição de COD (p<0,05).

4. Conclusão Os resultados histopatológicos mostraram que o cobre, causa lesões moderadas a severas com diferentes níveis de danos no fígado de cardinal tetra quando expostos a este contaminante. A adição

A B

C D

E F

*

�

�

*

*

*

*

A) B)


de COD na água diminui o dano causado pelo cobre evidenciado pelos valores menores tanto para o VMA como para o IAH nesse estudo. 5. Referências

Adams, S.M, Shugart, L.R, Southworth, G.R Hinton, D.E. 1990. Application of bioindicators in assessing the health of fish populations experiencing contaminant stress. In: Mccarthy, J.F.; Shugart, L.R. (Ed.). Biomarkers of environmental contamination. Boca Raton: Lewis Publishers, p. 333-353. Agius C, Agbede SA. 1984. An electron microscopical study on the genesis of lipofuscin, melanin and haemosiderin in the haemo-poietic tissues of fish. Journal of Fish Biology, 24:471–488. Dalich, G.M., R.E. Larson and W.H. Gingerich. 1982. Acute and chronic toxicity studies with monochlorobenzene in rainbow trout. Aquatic Toxicology, 2:127-142. Duarte, R. M; Menezes, A. C. L; Rodrigues, L. S; Almeida-Val, V. M. F; Val, A. L. 2009. Copper sensitivity of wild ornamental fish of the Amazon, Ecotoxicology and Environmental Safety, 72: 693–698. Figueiredo-Fernandes, A.; Ferreira-Cardoso, J.V.; Garcia-Santos, S.; Monteiro, S.M.; Carrola, J.; Matos, P.; Fontainhas-Fernandes, A. 2007. Histopathological changes in liver and gill epithelium of Nile tilapia, Oreochromis niloticus, exposed to waterborne copper. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 27, p. 103-109. Hartley, W.R.; Thiyagarajah, A.; Treinies, A.M. 1996. Liver lesions in the Gar Fish (Lepisosteidae) as biomarkers of exposure. Marine Environmental Research, v. 42, n. 1-4, p. 217-221. Laurén, D. J. & MacDonald D. G. 1985. Effects of copper on branchial ionoregulation in the rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. Journal of Comparative. Physiology, vol. 155(B). Maduenho L. P., Mendes Jaqueline P., Martinez C. B. R. 2007. Anais do VIII Congresso de Ecologia do Brasil, 23 a 28 de Setembro de 2007, Caxambu – MG, p.1-2. Poleksic, V., Mitrovic-Tutundzic, V. 1994. Fish gills as a monitor of sublethal and chronic effects of pollution. In: Muller, R., Lloyd, R. Sublethal and Chronic Effects of pollutants on Freshwater fish. Published by arrangement with the Food and Agriculture Organization of the United Nations by Fishing News Books, (30) 339-352. Robbins, S.; Cotran, R.S. 2005. Patologia – Bases Patológicas das Doenças – Eds. V. Kumar, A.K. Abbas, N. Fausto. Elsevier, Rio de Janeiro, 1592p. Roberts, R.J. 2001. Fish Pathology. 3rd ed. Eds. R.J. Roberts W.B. Saunders. London, 472p. Rocha R. M., Coelho R. P., Montes C. S., Santos S. S. D., Ferreira M. A. P. Avaliação Histopatológica Do Fígado de Brachyplatystoma rousseauxii (Castelnau, 1855) da Baía do Guajará, Belém, Para. 2010. Ciência. Animal. Brasil., Goiânia, v. 11, n. 1, p. 101-109. Sioli, H., 1968. Hydrochemistry and geology in the Brazilian Amazon region. Amazoniana, 1: 267-277. Silveira-Rodrigues, L. 2006. Efeitos tóxicos do cobre no cardinal tetra (Paracheirodon axelrodi Schultz, 1956). Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais – mestrado de Biologia de Água doce e Pesca Interior, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA. 47p. Schwaiger, J., Wanke, R., Adam, S., Pawert, M., Honnen, W., Triebs Korn, R. 1997. The use of histopatological indicators to evaluate contaminant-related stress in fish. Journal Aquatic Ecosystem Stress and Recovery, 6: 75-86. Vilarinho, G.C.C. 2008. Toxicidade do cobre em altas concentrações de carbono orgânico dissolvido em Paracheirodon axerolrodi (Schultz, 1956), 61ª Reunião Anual da SBPC. Zelikoff, J.T. 1998. Biomarkers of immunotoxicity in fish and other non-mammalian sentinel species: predictive value for mammals? Toxicology, v.129, n.1, p.63-71. Zuasti, A.; Jimenez-Cervantes, C.; Garcia-Boron, J.C; Serrer, C. 1998. The melanogenic system of Xenopus laevis. Archives Fur Histologie and Cytologie, v.61, p.305-316. Wolke, E.R.; Murchelano, R.P.A.; Dickstein, C.; George, C.J. 1985. Preliminary evaluation of the use of macrophage aggregates (MA) as fish health monitors. Bulletin of Environmental Contamination and toxicology, v.35, p.222-227.

influência do carbono orgânico dissolvido na ocorrência de...

Documents