AULA PRÁTICA – CURVA PADRÃO DE GLICOSE

Determinação de açúcares redutores totais (MILLER, 1959)

Princípio:

As aldoses e cetoses com hidroxilas heterocíclicas livres são capazes de

reduzir soluções alcalinas de determinados compostos como por exemplo 3,5

dinitro salicílico a 3-amino 5-nitro salicilato e ácido aldônico (figura 8),

conferindo coloração amarela, cuja intensidade de cor aumenta

proporcionalmente ao aumento da concentração de açúcares.

Esquema da reação de oxido-redução de açúcares redutores e DNS.

Compoentes/características:

• Sal Rochelle: Não permite ao reagente dissolver O2; estabiliza a cor.

• Fenol: Aumenta a intensidade da cor (sensibilidade)

• Bissulfito: Estabiliza a cor obtida na presença de fenol.

Ácido 3,5-dinitrossalicílico

Açúcar redutor

Ácido 3-amino-,5-nitrossalicílico

Ácido aldônico

ENFERMAGEM E NUTRIÇÃO - ROTEIRO AULA PRÁTICA

ACADÊMICO(A): __________________________________________ MATRÍCULA:________________

TURMA: _______________ PROFESSORES: Fabiano Souza e Guilherme Nascimento

DISCIPLINA: BIOQUÍMICA

• NaOH: O poder redutor dos açúcares só atua em meio alcalino

Preparo da solução:

O reagente de DNS será preparado seguindo-se as concentrações

apresentadas na tabela 1. O ácido 3,5-dinitrosalicílico e o NaOH serão

previamente dissolvidos, posteriormente o sal e, à solução originada, será

adicionada os demais componentes.

Tabela 1. Composição do reagente de DNS

Componentes Quantidade

Ácido 3,5-dinitrosalicílico 10,6 g

NaOH 19,8 g

Sal de Rochele (tartarato duplo de sódio e potássio) 306,0 g

Fenol 7,6 mL

Metabissulfito de sódio 8,3 g

Água destilada 1416 mL

Procedimento:

Preparar curva padrão com solução de glicose 2g/L em concentrações

entre 0,1 e 1,4 g/L como indicado na tabela 2. Em microtubo Eppendorf (ou

tubos de ensaio) adicionar 100 µL de amostra ou padrão, 300 µL de DNS e

aquecer em banho-maria a 100°C por 5 minutos. Resfriar e adicionar 1,5 mL

de água, homogeneizar e ler em espectrofotômetro a 540 nm. Fazer um

branco nas mesmas condições, substituindo a amostra por água destilada.

Tabela 2. Proporção de soluções para construção de curva de

calibração com glicose

Concentração Volume de sln.2 g/L

Volume de água

(g/L) µL µL 1,40 70 30 1,20 60 40 1,00 50 50 0,80 40 60 0,60 30 70 0,4 20 80 0,20 10 90 0,10 5 95

Observação: realizar cada medida por triplicata

Determinação de Glicose por métodos enzimáticos

Glicose Oxidase

Princípio:

A glicose é determinada após oxidação enzimática na presença de

glicose oxidase (GOD). O peróxido de hidrogênio formado reage sob catálise de

peroxidase (POD) com fenol e 4-aminofenazona originando a quinoneimina que

é um cromôgeno vermelho-violeta.

Reações:

Glicose + O2 + H2O → Ácido glucônico + H2O2

2 H2O2 + 4-aminofenazona + Fenol → Quinoneimina + 4H2O

GOD

POD

Procedimento:

Preparar curva padrão com solução de glicose 2g/L em concentrações

entre 0,1 e 1,4 g/L como indicado na tabela 2. Em microtubo Eppendorf (ou

tubos de ensaio) adicionar 100 µL de amostra ou padrão, 1000 mL de G.O.D e

aquecer em banho-maria a 37°C por 5 minutos. Resfriar e adicionar 900 µL de

água, homogeneizar e ler em espectrofotômetro a 510 nm. Fazer um branco

nas mesmas condições, substituindo a amostra por água destilada.

ESTUDO DIRIGIDO

1. Pesquisar outras metodologias para quantificação de açúcares.

2. Ler o artigo Comparação de Métodos para Determinação de

Açúcares Redutores e Totais em Mel, disponível no link:

http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf

3. Quais as possíveis fontes de erro nas metodologias do artigo em

questão?

a. Qual a finalidade e o fundamento da técnica

espectrofotométrica?

b. O que significa a linearidade dos métodos colorimétricos e

como ela é determinada?

c. Que critério deve ser usado para selecionar determinado

comprimento de onda para uma técnica colorimétrica?

d. Qual o conteúdo e a finalidade do tubo “branco”?