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1. Cristalização. Para

cristalizar uma

macromolécula temos que

levá-la a um estado de

supersaturação, que

favorece a formação de

cristais, como os mostrados

acima. Os cristais de

moléculas biológicas

normalmente apresentam

dimensões inferiores a 1 mm

de comprimento em cada

aresta.

2. Coleta de dados de difração de raios X. Os cristais

apresentam um arranjo ordenado de moléculas, como

uma pilha de tijolos ordenados. Na analogia, cada tijolo

representa uma molécula. As distâncias entre os átomos

são da ordem de 1 Å (0,1 nm ou 10-10 m), usando-se

raios X (com comprimento de onda da odem de Å )

teremos difração.

3. Interpretação do padrão de

difração de raios X. A figura

abaixo é o registro da difração de

raios X de um cristal. Os raios X

interagem com o cristal, o que

produz um padrão de difração. A

análise desta informação

possibilita a resolução de estrutura

3D.

4. Resolução da estrutura.

A partir da análise do

padrão de difração, é

possível gerar mapas de

densidade eletrônica (à

direita). A interpretação de

tais mapas gera a estrutura

3D de molécula.

5. Análise. A partir da estrutura

resolvida, procedemos a análise,

onde relaciona-se a estrutura 3D à

sua função biológica.

Etapas para resolução da

estrutura 3D de

macromoléculas biológicas

por cristalografia

2

Cristalografia

Para cristalizarmos uma macromolécula

biológica é necessário trazê-la a um

estado de supersaturação.

Consideremos uma proteína dissolvida

em um tampão. Para que a proteína seja

levada a formar cristais, é necessário que

as moléculas da proteína sejam trazidas a

uma situação onde as moléculas fiquem

relativamente próximas umas das outras.

Para levar a proteína a à supersaturação,

podemos aumentar sua concentração

(eixo vertical), ou aumentar a

concentração do sal presente na solução

da proteína. O diagrama ao lado ilustra as

diferentes regiões de solubilidade da

proteína.

3

Supersaturação

O processo de cristalização da proteína

normalmente deve ser lento, ou seja,

considerando-se a proteína inicialmente

numa região abaixo da curva de

solubilidade, devemos aumentar a

concentração salina, ou da proteína, de

modo a trazê-la na região de

supersaturação, de forma a propiciar um

arranjo ordenado das moléculas. De uma

forma geral, espera-se que o processo de

cristalização demore horas, dias ou até

meses. A partir o gráfico ao lado, vemos

que na região de supersaturação teremos

as moléculas da proteína próximas umas

das outras, o que, em casos favoráveis,

promoverá o aparecimento dos primeiros

núcleos cristalinos. Esses microcristais

servirão de base para o crescimento de

cristais maiores, adequados para

experimentos de difração de raios X. 4

Supersaturação

Para cristalizarmos proteínas,

normalmente usamos o método de

difusão de vapor. Uma gota de proteína

é colocada sobre uma lamínula. Na gota

adicionamos uma solução contendo sal,

ou outro agente precipitante, como

polietileno glicol (PEG). Colocamos a

lamínula sobre um poço, onde temos a

solução do precipitante. Ao fecharmos o

sistema, ocorrerá difusão de moléculas de

água da gota para o poço, levando a

proteína, em casos favoráveis, a um

estado de supersaturação, que pode levar

à formação dos primeiros núcleos

cristalinos.

5

Supersaturação

Fenômeno de salting-in. a)

Macromolécula biológica sem a

presença de íons dissolvidos na

solução. A atração eletrostática entre os

grupos carregados em duas os mais

macromoléculas causa a aglomeração e

precipitação. b) Íons blindam a interação

eletrostática entre as macromoléculas,

aumentando a solubilidade.

Diversos fatores interferem com a solubilidade da proteína, entre eles a concentração

salina. O aumento da solubilidade de uma macromolécula a baixa concentração salina

(<0,5M) é chamada salting-in. Segundo a teoria de Debye-Hückel para soluções

iônicas, um aumento na força iônica reduz a atividade dos íons em solução e aumenta

a solubilidade do composto iônico. Uma forma alternativa de se tratar o fenômeno é

considerar o salting-in como o resultado da competição entre grupos carregados na

superfície da macromolécula e os íons em solução. Na ausência de íons no solvente,

a macromolécula precipita devido à atração de eletrostática entre cargas opostas em

diferentes partes da macromolécula. Se os íons são adicionados à solução, esses

blindam os grupos carregados na macromolécula e aumentam a sua solubilidade.

+

- +

-+

- +

-

+

+

-

-

a) b)

6

Supersaturação

Sequência de eventos para a montagem de uma gota de cristalização: a)

Coloca-se 1-2l da solução da macromolécula biológica sobre a lamínula de vidro.

b) Adiciona-se 1-2l da solução do reservatório à gota com a solução da

macromolécula biológica. c) Ao final temos uma gota (2+2) com a solução de

macromolécula biológica mais a solução do reservatório.

Solução do poço

7

Método da Gota Suspensa (Hanging-drop)

Com o aumento do número de macromoléculas biológicas cristalizadas com

sucesso, tornou-se óbvio que muitas das condições de cristalização se

assemelhavam, ou seja, havia uma concentração de resultados positivos de

cristalização de macromoléculas biológicas usando-se número limitado de

precipitantes, tampões e aditivos. A partir da análise dos resultados positivos de

cristalização, foi possível a proposição de diversos métodos para obtenção de

cristais (Carter & Carter, 1979), onde um número limitado de reagentes eram

testados, usando-se pequenas quantidades da macromolécula biológica, geralmente

por volta de poucos miligramas.

8

0,5mm 0,5mm 0,5mm

Jancarik, J. & Kim, S. -H. (1991) J. Appl. Crystallogr. 24, 409-411.

Matriz Esparsa

A partir da observação dos resultados preliminares dos experimentos cristalização,

era possível determinar que tampão, aditivo e agente precipitante seriam os mais

favoráveis e a partir daí proceder-se a sucessivos melhoramentos até se conseguir

cristais adequados, ou ainda, em casos favoráveis, obter-se cristais adequados já na

primeira tentativa com as condições padrões. Em 1991, A Dra. Jaru Jancarick da

University of California, Berkeley propôs o método da matriz esparsa ( Jancarick &

Kim, 1991), onde diversas condições diferentes são tentadas para se cristalizar a

macromolécula biológica.

Jancarik, J. & Kim, S. -H. (1991) J. Appl. Crystallogr. 24, 409-411.9

0,5mm0,5mm0,5mm

Matriz Esparsa

Parâmetros da matriz de cristalização (Jancarik & Kim, 1991)

Agentes precipitantes

Não-Voláteis Sais Voláteis Mistura

MPD Tartarato de Na,K 2-Propanol Sulfato de NH4 + PEG

PEG 400 Fosfato de NH4 2-Propanol + PEG

PEG 4000 Sulfato de NH4

PEG 8000 Acetato de Na

Sulfato de Li

Formiato de Na

Fosfato de Na,K

Citrato de Na

Formiato de Mg

Faixa de pH: 4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5

Aditivos: Cloreto de Ca, Citrato de Na, Cloreto de Mg, Acetato de NH4, Sulfato de

NH4, Acetato de Mg, Acetato de Zn e Acetato de Ca.

10

Matriz Esparsa

Por tentativa e erro a matriz

multimensional foi simplificada

eliminando-se as condições que podem

ser parcialmente representadas por

resultados de outras condições, a

proposta original apresenta 58 condições.

Comercialmente a empresa Hampton

Research, (USA) simplificou o método

original, e disponibiliza um kit com 50

condições de cristalização.

Comercialmente há outros kits usando-se

como princípio a variação de pH, força

iônica e agentes precipitantes.

Imagem disponível em: <

http://www.hamptonresearch.com/products/ProductDetails.aspx?ci

d=1&sid=17&pid=1 >.

Acesso em: 8 de Abril de 2015.

11

Matriz Esparsa

http://www.hamptonresearch.com/products/ProductDetails.aspx?cid=1&sid=17&pid=1

Um dos sistema usados para cristalização de proteínas é a placa linbro, mostrada

acima. A placa apresenta 24 poços, que permite testarmos diversas condições de

cristalização. As lamínulas são colocadas sobre cada um dos poços, e vedadas com

graxa de vácuo.

Fonte: http://www.hamptonresearch.com

12

Matriz Esparsa

Cristais de proteínas são frágeis, assim diversos cuidados são tomados na

manipulação. Na coleta de dados de difração de raios X, uma forma possível de

manipularmos os cristais é deixando-os saturados de solvente e inseri-los num

capilar, como mostrado na figura acima. Os cristais, assim dispostos, podem ser

levados para coleta de dados de difração de raios X.13

Coleta de Dados de Difração de Raios X

Uma forma alternativa de coletarmos dados é transferir o cristal para uma solução

com protetor criogênico (Polietileno glicol, glicerol entre outros). O cristal é então

exposto a um fluxo de nitrogênio líquido e transferido para uma base metálica

(cabeça goniométrica). O cristal fica pronto para a coleta de dados. As temperaturas

criogênicas minimizam os dados causados pela radiação. 14


Fonte: http://www.hamptonresearch.com

Na figura da esquerda vemos uma base de cobre usada como suporte para o cristal.

À direita temos o cristal inserido num laço. A exposição ao nitrogênio líquido leva à

formação de um filme rígido e transparente que mantém o cristal no laço.15


Experimentos de cristalização no

espaço normalmente geram cristais

de melhor qualidade para estudos

de difração de raios X. As

condições de microgravidade do

espaço, propiciam um

empacotamento cristalino mais

ordenado, gerando cristais que

difratam à mais alta resolução. A

proteína uropesina (Canduri et al.,

2001) foi cristalizada em condições

de microgravidade na missão STS-

95 do ônibus espacial Discovery (

Disponível em: <

http://www.youtube.com/watch?v=N

9IFiQNY8mE >).

Fonte: http://www.aviationspectator.com/more-aviation-photos?page=405. Crédito: NASA

Cristal de uropepsina .16

Cristalização de Proteínas no Espaço

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11679720?ordinalpos=71&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum

http://www.youtube.com/watch?v=N9IFiQNY8mE

http://www.aviationspectator.com/more-aviation-photos?page=405

Uma etapa inicial importante na elucidação da estrutura tridimensional de proteínas, por

meio de cristalografia por difração de raios X, é determinação do conteúdo da cela

unitária. Uma vez tenhamos determinado os parâmetros da cela unitária: a, b, c, alfa,

beta e gama, temos que determinar quantas moléculas temos na unidade assimétrica.

Para isto precisamos, além dos parâmetros da cela unitária, o massa molecular da

proteína cristalizada. O método proposto por Matthews (1968) permite calcular o

número de moléculas por unidade assimétrica. Matthews determinou que para cristais

de proteínas a relação entre volume da cela unitária (Vcell) e a massa molecular da

proteína cristalizada fica na faixa de 1,7 a 3,5 Å3/Da, com a maioria dos valores em

torno de 2,15 Å3/Da. Tal volume é chamado de volume de Matthews (VM), e definido

pela equação abaixo:

onde Z é o número de moléculas na cela unitária, MW a massa molecular da proteína

cristalizada e Vcell o volume cela unitária, que para uma cela unitária qualquer é dada

por:

Vcell = a.b.c [1 + 2 cos cos cos - cos2 - cos2 - cos2]1/2

17

Caracterização de Cristais de Proteína

MWZ

VV cellM

.

A fração de volume ocupada por proteína (Vprotein) é dada por:

A fração de volume de solvente no cristal é dada por:

O Vprotein pode também ser determinado por:

18

Caracterização de Cristais de Proteína

M

proteinV

V23,1

M

solventV

V23,1

1

M

proteinV

V)/cmProteína(g da Específico Volume 3

Principais seções de um artigo de cristalização de proteínas:

1) Clonagem, expressão e purificação da proteína

2) Cristalização

3) Coleta de dados de difração de raios X

4) Outros (teste de atividade, sequenciamento, solução da estrutura e

refinamento cristalográfico parcial.

19

Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

20


The purifed MtCS was concentrated and

dialyzed against 50 mM Tris±HCl buffer pH 7.8

(Hampton Research, USA). The final protein

concentration was about 10 mg.ml-1.

Crystallization was performed by the hanging-

drop vapour-diffusion and sparse-matrix

methods (Jancarik & Kim, 1991) using tissue-

culture multiwell plates with covers (Linbro, ICN

Biomedicals, Inc, USA) at a temperature of 293

K. Each hanging drop was prepared by mixing 1

ml each of protein solution and reservoir

solution and was placed over 700 l reservoir

solution. Initial conditions were screened using

Crystal Screen I and II kits (Hampton Research,

USA).Hexagonal crystals of MtCS. Approximate

dimensions

are 0.30 0.25 0.25 mm.

21


Fonte: Dias MV, Ely F, Canduri F, Pereira JH, Frazzon J, Basso LA, Palma MS, de Azevedo WF Jr, Santos DS. Crystallization and

preliminary X-ray crystallographic analysis of chorismate synthase from Mycobacterium tuberculosis. Acta Crystallogr D Biol

Crystallogr. 2004; 60(Pt 11):2003-5.

A data set was collected at a wavelength of 1.427 Å

using a synchrotron-radiation source (Station PCr,

LNLS, Campinas- Brazil). The data set was collected

from a single MtCS crystal using a MAR CCD image-

plate system. The crystal was looped out from the

drop and flash-cooled. The PEG 400 present in the

crystallization conditions served as a cryoprotectant,

X-ray diffraction data were collected at a temperature

of 100 K under a cold nitrogen stream generated and

maintained with an Oxford Cryosystem. The crystal

was rotated through a total of 160o, with a 1o

oscillation range per frame, a crystal-to-detector

distance of 130 mm and an exposure time of 60 s.

Data were processed on a Silicon Graphics Octane2

computer using the programs MOSFLM (Leslie,

1990) and SCALA (CCP4, 1994).

A typical diffraction pattern of the MtCS

crystal with 1 oscillation range. The crystal

diffracts to 2.8 Å resolution.

22




Crystallogr. 2004; 60(Pt 11):2003-5.

Summary of data-collection statistics.

X-ray wavelength (A ° ) 1.427

Space group P6422 or P6222

Unit-cell parameters (Å ) a = 129.74, b = 129.74,

c = 156.77

Highest resolution shell (Å) 2.94–2.8

Asymmetric unit content 2 molecules

Total reflections measured 92610

Number of independent reflection 19341

Completeness (%) 97.9 (97.9)

Rmerge (%) 5.6 (16.5)

Values in parentheses are for the highest resolution shell (2.94–2.8 Å).

23




Crystallogr. 2004; 60(Pt 11):2003-5.

Aplicações

1) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da corismato sintase de

Mycobacterium tuberculosis (Dias et al., 2004). A partir dos dados de difração de

raios X foi determinado os parâmetros da cela unitária.

a = 129,74 Å

b = 129,74 Å

c = 156,77 Å

Grupo espacial: P6422 ou P6222

MW = 41,800 kDa

Para cela hexagonal: Vcell = a.b.c.sen ()

Vcell = 129,74. 129,74 . 156,77. sen(120o) = 2.285.290,31 Å3

24


Para determinarmos o conteúdo da unidade assimétrica, calcularemos o volume de

Matthews para diferentes possibilidades de unidade assimétrica e verificaremos qual

valor fica mais próximo da faixa de 1,7 a 3,5 Å3/Da, como segue:

Z VM(Å3/Da)

1 54,67

6 9,11

12 4,56

18 3,04

24 2,28

30 1,82

25


MWZ

VV cellM

.

Os valores dentro da caixa estão na faixa prevista por Matthews, contudo sabemos

que o grupo espacial é hexagonal primitivo, o que significa que temos 6 unidades

assimétricas, assim esperamos um número de moléculas múltiplo de 6, ou seja, 12,

18, 24, 30.., sendo o valor mais provável 24. Assim temos:

Vprotein = 1,23/VM = 0,5395 e Vsolvent = 0,4605

Z VM(Å3/Da)

1 54,67

6 9,11

12 4,56

18 3,04

24 2,28

30 1,82

26


27


C. roseum seeds were ground to a fine powder in a coffee mill. The powder was

stirred with 0.15 M NaCl [1:10(w:v)] at room temperature for 4 h and then centrifuged

at 10 000g for 20 min at 278 K. The resultant supernatant was applied onto a

Sepharose-4B-mannose column (0.5 10 cm) equilibrated with 0.15 M NaCl

containing 5 mMCaCl2 and 5 mMMnCl2. After removing unbound material, the lectin

was eluted with 0.1 M glycine, 0.15 M NaCl pH 2.6. Purified CRL was monitored by

SDS–PAGE as described by Laemmli (1970) and was used to perform further

characterization. N-terminal sequence analysis was performed using an Applied

Biosystems pulsed-liquid phase 477A protein sequencer with a 120A PTH aminoacid

analyzer, following the method described by the manufacturer.

28


Fonte: Cavada BS, Marinho ES, Souza EP, Benevides RG, Delatorre P, Souza LA, Nascimento KS, Sampaio AH, Moreno FB,Rustiguel JK, Canduri F, de Azevedo WF Jr, Debray H. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2006; 1(62): 235-7.

29



The lyophilized purified CRL was

dissolved to a concentration of 12 mg ml-1

in 20 mM Tris–HCl pH 8.0 containing 0.5

mM CaCl2 and MnCl2 and used for

crystallization trials. Crystallization

screening by the hanging-drop vapour-

diffusion method was performed in Linbro

plates at 293 K using Hampton Research

Crystal Screens I and II, SaltRx, Index and

PEG/Ion Screens (Hampton Research,

Aliso Viejo, CA, USA). The drops were

composed of equal volumes (2 ml) of

protein solution and reservoir solution and

were equilibrated against 500 ml reservoir

solution. An example of a crystal of CRL is

shown in Fig. 1(a).

30



A crystal was transferred to a

cryoprotectant solution consisting of 30%

glycerol in the crystallization reservoir

solution. Data were collected at 1.42 A °

wavelength at a synchrotron-radiation

source (beamline MX1, CPr station,

Laboratório Nacional de LuzSíncrotron–

LNLS, Campinas, Brazil) using a MAR

Research CCD imaging plate at a crystal-

to-detector distance of 70 mm. A set of

100 1 oscillation images was recorded

(an image is shown in Fig. 1b). Diffraction

data were indexed, integrated and scaled

using MOSFLM and SCALA (Collaborative

Computational Project, Number 4, 1994).

31



Summary of data-collection statistics for CRL.


Space group P212121

Unit-cell parameters (A° ) a = 67.82, b = 103.14, c = 122.09

Resolution limits (A ° ) 34.92–1.77

Asymmetric unit content 4 molecules

Total reflections measured 286361

Unique reflections measured 80568

Completeness (%) 97.00 (97.0)

Rmerge (%) 5.4 (32.5)

Values in parentheses are for the highest resolution shell (1.87–1.77 A ° ).

32



Aplicações

1) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da Lectina de Cymbosema

roseum seeds (Cavada et al., 2006). A partir dos dados de difração de raios X

foram determinados os parâmetros da cela unitária.

a = 67,82 Å

b = 103,14 Å

c = 122,09 Å

Grupo espacial: P212121

MW = 25kDa

Vcell = 67,82 . 103,14 . 122,09 = 854.014,03 Å3

33





Z VM(Å3/Da)

1 34,14

2 17,07

3 11,38

4 8,53

5 6,83

6 5,69

7 4,88

8 4,27

Z VM(Å3/Da)

9 3,79

10 3,41

11 3,10

12 2,85

13 2,63

14 2,44

15 2,28

16 2,14

Z VM(Å3/Da)

17 2,01

18 1,90

19 1,80

20 1,71

21 1,63

22 1,55

23 1,49

24 1,42

34


MWZ

VV cellM

.

Os valores dentro das caixas estão na faixa prevista por Matthews, contudo sabemos

que o grupo espacial é ortorrômbico primitivo, o que significa que temos 4 unidades

assimétricas, assim teremos um número de moléculas múltiplo de 4, ou seja, 12, 16 ou

20, sendo o valor mais provável 16. Assim temos:


Z VM(Å3/Da)

1 34,14

2 17,07

3 11,38

4 8,53

5 6,83

6 5,69

7 4,88

8 4,27

Z VM(Å3/Da)

9 3,79

10 3,41

11 3,10

12 2,85

13 2,63

14 2,44

15 2,28

16 2,14

Z VM(Å3/Da)

17 2,01

18 1,90

19 1,80

20 1,71

21 1,63

22 1,55

23 1,49

24 1,42

35


36


The pheA gene (Rv3838c) encoding prephenate dehydratase from M. tuberculosis was

amplified by the polymerase chain reaction (PCR) from genomic DNA. The forward (5’-

TGCATATGGTGCGTATCGCTTACCTCGGTCC- 3’) and reverse (5’-

ACAAGCTTTCATGCTTGCGCCCCCTGGTCG- 3’) synthetic oligonucleotide primers

were based on the amino-terminal coding and carboxyterminal non-coding strands of

the pheA gene (Cole et al., 1998) containing 50 NdeI and 30 HindIII restriction sites,

respectively. The PCR product was cloned into pET-23a(+) expression vector

(Novagen) and the recombinant plasmid was sequenced to confirm the identity of the

cloned DNA fragment and to ensure that no mutations had been introduced by the

PCR amplification step. ...

Fonte: Vivan AL, Dias MVB, Schneider CZ, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst

Commun. 2006; F62: 357-60.

37


The supernatant was loaded onto a Q-

Sepharose Fast Flow (2.6 8.2 cm) anion-

exchange column (GE Healthcare) and

fractionated using a 0.0–0.5 M NaCl linear

gradient. The fractions were pooled and

ammonium sulfate was added to a final

concentration of 0.6 M; the mixture was

then loaded onto a HiLoad 16/10 Phenyl

Sepharose HP hydrophobic interaction

column (GE Healthcare). The active

fractions were loaded onto a Mono Q HR

16/10 anion-exchange column (GE

Healthcare) and eluted using a 0.0–0.5 M

NaCl linear gradient.

38



Commun. 2006; F62: 357-60.

Crystallization trials were initially

performed by the hanging-drop vapour-

diffusion method at 292 K. Hampton

Crystal Screen and Crystal Screen 2 kits

(Hampton Research) were used to

determine the initial crystallization

conditions. Hanging drops were prepared

by mixing 1 ml of a solution containing 10

mg ml1 recombinant protein in 50 mM

Tris–HCl pH 7.8 and 1 ml reservoir

solution. Crystals were obtained with a

reservoir solution containing 0.1 M

HEPES pH 7.5, 28%(v/v) PEG 400, 0.2 M

calcium chloride.

39



Commun. 2006; F62: 357-60.

The data set for recombinant M.

tuberculosis prephenate dehydratase was

collected at a wavelength of 1.438 Å using

a synchrotronradiation source (Station

MX1, LNLS, Campinas) and a MAR CCD

detector. The crystal was flash-frozen at

100 K in liquid nitrogen. The oscillation

range used was 0.8, the crystal-to-

detector distance was 150 mm and the

exposure time was 90 s. The crystal

diffracted to 3.2 Å resolution. All data were

processed and scaled using the programs

MOSFLM and SCALA from the CCP4

program suite (Collaborative

Computational Project, Number 4, 1994).

40



Commun. 2006; F62: 357-60.

Summary of data-collection statistics for M. tuberculosis prephenate dehydratase


Temperature (K) 100

Resolution range (A° ) 65.94–3.20 (3.37–3.20)

Total/unique reflections 71611/23215

Space group I222 or I212121

Matthews coefficient (Å3 Da-1) 2.7

Unit-cell parameters

a (Å) 98.26

b (Å ) 133.22

c (Å ) 225.01

Mosaicity () 0.43

Data completeness (%) 94.4 (97.2)

Average I/(I) 5.7 (1.5)

Multiplicity 3.1 (3.0)

Rmerge(%) 0.120 (0.434)

41



Commun. 2006; F62: 357-60.


Commun. F62, 357-360, 2006

42


Aplicações

1) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da MtPD. A partir dos dados de

difração de raios X foi determinado que os parâmetros da cela unitária.

a = 98,26 Å

b = 133,22 Å

c = 225,01 Å

Grupo espacial: I222 ou I212121

MW = 33,6 kDa

Vcell = 98,26 . 133,22 . 225,01 = 2.945.425,3 Å3




Z VM(Å3/Da)

1 87,66

8 10,96

16 5,48

24 3,65

32 2,74

40 2,19

48 1,83

43


MWZ

VV cellM

.

Os valores dentro das caixas estão na faixa prevista por Matthews, contudo sabemos

que o grupo espacial é ortorrômbico com centragem I, o que significa que temos 16

unidades assimétricas, assim teremos um número de moléculas múltiplo de 16, ou

seja, 16, 32,…, sendo o valor mais provável 32. Assim temos:


Z VM(Å3/Da)

1 87,66

8 10,96

16 5,48

24 3,65

32 2,74

40 2,19

48 1,83

44


Artigo indicado

Segue um artigo de revisão sobre cristalografia de proteínas:

Canduri F, de Azevedo WF. Protein crystallography in drug discovery. Curr Drug

Targets. 2008; 9(12):1048-53.

45

Material Adicional (Artigo Indicado)

Canduri F, de Azevedo WF. Protein crystallography in drug discovery. Curr Drug Targets. 2008; 9(12):1048-53.

Cavada BS, Marinho ES, Souza EP, Benevides RG, Delatorre P, Souza LA, Nascimento KS, Sampaio AH, Moreno FB, Rustiguel

JK, Canduri F, de Azevedo WF Jr, Debray H. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2006; 1(62): 235-7.

Dias MV, Ely F, Canduri F, Pereira JH, Frazzon J, Basso LA, Palma MS, de Azevedo WF Jr, Santos DS. Crystallization and


Crystallogr. 2004; 60(Pt 11):2003-5.

Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: Springer-Verlag.

Moreno FBMB, Delatorre P, Freitas BT, Rocha BAM, Souza EP, Facó F, Canduri F, Cardoso ALH, Freire VN, Lima Filho JL,

Sampaio AH, Calvete JJ, De Azevedo Jr. WF, Cavada BS. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the lectin

from Canavalia gladiata seed. Acta Cryst. 2004; D60: 1493-5.

Moreno FBMB, Martil DE, Cavada BS, de Azevedo Jr. WF. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of an anti-H(O)

lectin from Lotus tetragonolobus seeds. Acta Cryst. 2006; F62: 680-3.

Rhodes, G. (2000). Crystallography Made Crystal Clear. 2nd ed.San Diego: Academic Press.

Stout, G. H. & Jensen, L. H. (1989). X-Ray Structure Determination. A Practical Guide. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons.

Vivan AL, Dias MVB, Schneider CZ, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.

2006; F62: 357-60.

Última atualização em: 30 de agosto de 2018.

46

Referências

Calcule o volume de Matthews (VM), a fração de volume ocupada por proteína (Vprotein),

a fração de volume de solvente no cristal (Vsolvent) e o número de moléculas de

proteína na cela unitária para os cristais descritos nos seguintes artigos:

1) Moreno FBMB, Martil DE, Cavada BS, de Azevedo Jr. WF. Crystallization and

preliminary X-ray diffraction analysis of an anti-H(O) lectin from Lotus

tetragonolobus seeds. Acta Cryst. 2006; F62: 680-3.

2) Moreno FBMB, Delatorre P, Freitas BT, Rocha BAM, Souza EP, Facó F, Canduri F,

Cardoso ALH, Freire VN, Lima Filho JL, Sampaio AH, Calvete JJ, De Azevedo Jr.

WF, Cavada BS. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the

lectin from Canavalia gladiata seed. Acta Cryst. 2004; D60: 1493-5.

Indique o desenvolvimento do cálculo, como mostrado na aula de hoje, onde é

calculado o VM para diversos valores de Z e selecionado aquele que se encontra

dentro da faixa esperada de VM de 1,7 a 3,5 Å3/Da.

Data da entrega: 14 de setembro de 2018. 47

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cristalização de proteínas - azevedolab.net · normalmente usamos o método de ... sequência de...

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