CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO 'IN VITRO" DE CEPAS DETRYPANOSOMA CRUZI, ISOLADA DE ANIMAIS SILVESTRES *

Dalva A. Mello **Monamaris M. Borges***Lúcia Helena Chiar ini ****

RSPUB9/531

MELLO, D. A. et al. Crescimento e diferenciação "In vitro" de cepas de Trypano-soma cruzi, isoladas de animais silvestres. Rev. Saúde públ., S. Paulo, 14:569-81, 1980.

RESUMO : Foram estudadas três cepas de T. cruzi isoladas de Didelphisalbiventris (R52, R64 e R65) e uma isolada de Calomys callosus (M226), quantoao comportamento "In vitro" no meio LIT. A evolução da população dostripanossomas com relação ao crescimento e morfogênese foi acompanhada porum período de 13 dias (312 horas), em intervalos regulares. As contagensdiferenciais, separando-se formas amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas,foram realizadas na câmara de Neubauer. Os resultados obtidos levaram àconclusão de que as 4 cepas estudadas têm comportamento distintos. O melhorcrescimento obtido ocorreu para a cepa M226, seguindo-se por ordem decrescentea R65, R52 e R64. Os picos das populações ocorreram como segue: M226,entre 192-264 horas; R65 entre 168-240 horas; R52 às 240 horas e R64 entre264-312 horas.

UNITERMOS: Trypanosoma cruzi, cepas silvestres. Didelphis albiventris. Calo-mys callosus.

* Trabalho realizado com auxílio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico eTecnológico (CNPq — PDE/02-1-06, FUB-CNPq, cadastro no 81.961).

** Do Departamento de Medicina Complementar da Faculdade de Ciências da Saúde da Uni-versidade de Brasília — 70910 — Brasília, DF — Brasil.

*** Bolsista do CNPq.**** Do Departamento de Estatística do Instituto de Ciências Exatas da Universidade de Brasília

— 70910 — Brasília, DF — Brasil.

INTRODUÇÃO

Chagas8 (1909), foi o primeiro autor averif icar morfogênese do Tripanosoma cruziem meio de cul tura acelular. Posteriormente,numerosos trabalhos foram realizados sobrecultivo de T. cruzi "In vitro" em diferentesmeios acelulares, sendo analisados váriosaspectos do comportamento deste protozoá-rio. Entre outros trabalhos sobre estesassuntos, chama atenção os de: Muniz e

Freitas11 (1946), Noble 12 (1955), Pick15

(1959), Camargo 6 (1964), Brener e C h i a r i 4

(1965), Castellani e col.7 (1967), Pan1 4

(1971), C h i a r i 9 (1974).

No que se refere particularmente a estu-dos com cepas de T. cruzi isoladas deanimais silvestres salientam-se os trabalhosde Norman e col.13 (1959) e de Ribeiro eBarretto1 6 (1975). O último autor tentou

relacionar o tipo de crescimento de cepasde T. cruzi, cultivadas no meio Warren,com o comportamento em animais e poli-morfismo das formas sanguícolas baseando-se nas observações realizadas por Brener2 , 3

(1965 e 1977), Brener e Chia r i 5 (1963) eAndrade1 (1976).

Com o objetivo de contribuir acrescen-tando novos dados experimentais aoassunto, este trabalho apresenta resultadosobtidos sobre crescimento e diferenciação"In vitro" de cepas de T. cruzi, isoladasde animais silvestres.

MATERIAL E MÉTODOS

As cepas utilizadas neste trabalho tiveramas seguintes origens: R52 foi isolada deuma fêmea de Didelphis albiventris (Mar-supialia) capturada no norte do municípiode Formosa, Goiás, em 17 de setembro de1975; R64 foi isolada também de uma fêmeade D. albiventris capturada no municípiode Mambaí, Goiás, em 20 de setembro de1975; R65 teve a mesma origem, data decaptura e procedência da R52; M226 foiisolada de uma fêmea de Calomys callosus(Rodentia) coletada também no norte domunicípio de Formosa em 10 de dezembrode 1975. Estas cepas eram mantidas emcamundongos albinos e em C. callosusnascidos em laboratório, através de inocu-lações com fezes positivas de barbeirosalimentados nestes animais.

Para os isolamentos em meio de culturaacelular e para os estudos sobre o cresci-mento e diferenciação dos tripanossomas,foi utilizado o meio LIT. O volume domeio de cultura em cada tubo foi de 8 ml.A proporção de antibiótico por tubo comLIT foi de 0,8 mg de estreptomicina e 800unidades de penicilina. As culturas erammantidas na estufa a 28°C.

O isolamento inicial das cepas no LITfoi feito a partir de animais que apresen-tavam níveis elevados de parasitemia. Esteseram anestesiados com éter e por punçãocardíaca em câmara assética retirava-sesangue destinado ao meio de cultura.

Após 8-20 dias seguidos ao semeio dosangue infectado, foi realizado o primeirorepique. Deste primeiro repique, procedia-se novos semeios semanais até se obter

um crescimento rico, sendo então iniciadosos estudos quantitativos. O inóculo paracada tubo variou entre 5.093-5.950 parasi-tos/ml; a idade das cepas após o primeiroisolamento fo i : R52 = 67 dias, R64 = 63dias, R65 = 50 dias e M226 = 37 dias.Foram utilizados para cada cepa cinco tu-bos com cultura. Antes de se proceder àscontagens os tubos eram bem homogenei-zados e o resultado f ina l correspondia amédia das cinco contagens para cada cepa.

A evolução da população dos tripano-somas, quanto ao seu crescimento numéricoe morfogênese, foi acompanhada atravésda contagem destes em câmara de Neu-bauer, como está descrito em Camargo6

(1964) com aumento de 500 (12,5x40).Estas contagens eram feitas separando-seas formas amastigotas, epimastigotas etripomastigotas. A evolução das quatrocepas de T. cruzi foi acompanhada durante13 dias (Tabela 1). Das culturas emdiferentes períodos foram feitas lâminascoradas com Giemsa-MayGrunwald e destaslâminas foram tiradas microfotografias comobjetiva x 100.

A análise estatística dos dados prendeu-se ao estudo do comportamento das curvas

de crescimento da população dos tripano-somas nas quatro cepas e formas. Paracada um dos fenômenos analisados, foiverificada a função que melhor se ajustavaàs observações e a taxa média de cresci-mento.

As taxas médias de crescimento foramcalculadas a partir de uma média aritméti-ca, média quadrática ou média geométricadependendo da função ajustante ser umareta, parábola do 2o grau, exponencial oulogística. Tais funções foram estimadasatravés do critério dos mínimos quadradosexceto a logística que foi ajustada a partirdo método dos pontos selecionados.

RESULTADOS

Análise qualitativa

As quatro cepas de T. cruzi estudadasneste trabalho sempre apresentaram nosrepiques iniciais, abundantes aglomeradosde formas amastigotas (Fig. 1). Quandoa população das cepas atingiam o pontode saturação no tubo de cultura, pratica-mente estes aglomerados desapareciam,cedendo lugar aos epimastigotas e tripo-mastigotas (Fig. 2), embora raros amas-tigotas livres ainda pudessem ser vistos.Em várias ocasiões foi possível constatartripomastigotas como se estivessem emprocesso de divisão (Fig. 3). Tais aspectosforam observados somente a partir da ele-vação da população destas formas. Amanutenção destas cepas "In vitro" no LIT,por um período de 12-13 meses após oisolamento inicial do T. cruzi do sangue,e sucessivos repiques (perfazendo um total

de 29), mostrou que havia um decréscimogradativo e substancial das formas amas-tigotas.

Análise Quantitativa

A Tabela l apresenta os resultadosobtidos sobre os níveis de crescimento nomeio LIT das quatro cepas de T. cruziestudadas neste trabalho.

Quanto à sobrevivência no LIT nãorenovado, os resultados encontrados foramdiferentes para cada cepa: R52 morria com41 dias de manutenção neste meio; R64morria com 31 dias; R65 com 60 dias; efinalmente M226 com 70 dias.

A cepa que apresentou melhor cresci-mento numérico total foi a M226, vindopor ordem decrescente a R65, R52 e R64(Tabela l e Fig. 4).

As Tabelas e Figs. 5, 6, 7 e 8 mostramos resultados sobre o crescimento numéricoe diferenciação de cada cepa estudada. Aprodução de amastigotas para a cepa R52(Tabela 2), durante o período de observa-ção em todo o tempo foi inferior a deepimastigotas e superior as de tripomasti-gotas até as 264 h. Para a R64 (Tabela3), o crescimento de amastigotas foi supe-rior às epimastigotas e tripomastigotas atéas 192 h se equilibrando numericamente aof i n a l das observações (288 h, 312 h e 336h). Com relação às cepas R65 e M226(Tabelas 4 e 5), verificou-se que aquelasmesmas formas tiveram um crescimentonumérico maior do que as epimastigotasaté as 96 h e 72 h respectivamente, sendoentretanto sempre superior as formas tripo-mastigotas.

Os picos de população das formas ecepas estudadas em relação ao tempo, en-contra-se na Tabela 6.

As curvas de crescimento para cada for-ma e cepa estão representadas nas Figs.5, 6, 7 e 8. As taxas de crescimento etipo de curvas obtidas estão apresentadasna Tabela 7.

Enquanto as cepas R52 e R65 apresenta-ram um crescimento exponencial para astrês formas, a cepa R64 só o apresentoupara as epimastigotas e tripomastigotas. Aforma amastigota desta cepa apresentou umcrescimento representado por uma parábolado segundo grau. Para cepa M226 as for-mas amastigotas, epimastigotas e tripomas-tigotas mostraram, respectivamente, umcrescimento representado por uma reta, umalogística e uma reta.

A maior taxa média de crescimento dasformas amastigotas deu-se na cepa M226,seguida pela R65, R52 e R64. Para asepimastigotas a cepa R65 foi a que apre-

sentou a maior taxa média de cresc imento ,seguindo-se as cepas R52, M226 e R64.Finalmente, as tripomastigotas, que apre-sentaram a maior taxa média de crescimentoforam as da cepa M226, seguindo-se asR65, R64 e R52.

COMENTÁRIOS E CONCLUSÕES

Norman e col.13 (1959) estudando setecepas de T. cruzi isoladas de animais sil-vestres em meio bifásico, ver i f icaram quetodas elas apresentavam formas amastigotasque apareciam entre o 4° e 10° dia apósincubação. O número destas formas de-pendia, segundo estes autores, da quant i -dade do inóculo . A par t i r do 14° dia ascul turas apresentavam as formas epimasti-gotas. Os tripomastigotas só eram obser-vados em baixo número, após várias trans-ferências e em cul turas com 28 dias deidade. Das sete cepas estudadas, apenasuma, isolada de Procyonlotor, apresentou

m u d a n ç a s de c o m p o r t a m e n t o d u r a n t e osexperimentos.

Brener e C h i a r i 2 (1965), ao estudar ocomportamento "In vitro" no meio LIT, dequatro cepas isoladas de casos humanose três isoladas de Triatoma infestans, veri-f i c a r am diferentes comportamentos. Ascepas isoladas de triatomíneo cujas formassanguícolas eram bem largas deram origemnos repiques inic ia is a massas coloniais deamastigotas puras ou com epimastigotas.Estas cepas, após repiques a cada 10 diaspor um período de dois meses, apresenta-vam gradual desaparecimento das amasti-gotas, sendo substi tuídas por epimastigotas.Nas cepas de origem humana, cujas formassanguícolas eram predominantemente delga-das (Y e Berenice) , as amastigotas rapida-mente desapareciam e após dez dias deincubação só havia epimastigotas livres ouem rosetas. As outras duas cepas, deorigem humana (ABC e PNM), com formassanguícolas largas, embora apresentassem

"In vitro" epimastigotas em dominância,no entanto raras massas de amastigotaspoderiam ainda ser encontradas. Concluíramesses autores que a presença ou ausênciadas amastigotas estaria relacionada dire-tamente com características intrínsecas dascepas.

Ribeiro e Barretto 16 (1975) estudaramcomportamento "In vitro" no meio Warren,de 10 cepas de T. cruzi de diferentes origenscomparando-o com infecções experimentaisem camundongos. Evidenciaram estes auto-res comportamentos diferentes, que levou-osa inserir estas cepas em três grupos: I —(uma amostra isolada de D. azarae e umade Triatoma infestans) as formas sanguí-colas dominantes nos camundongos infec-tados eram largas; na cultura as colôniasde amastigotas persistiam após quatro sub-culturas e praticamente desapareciamdando lugar às formas flageladas; II —(duas amostras de Tadarida laticaudata eduas humanas, Indio e Y) nestas raramenteencontravam-se amastigotas; III — (trêsamostras de roedores Akodon sp. e Sciu-rus sp. e uma de Cebus apella) morfologiasanguícola heterogênea; as culturas recentesapresentavam amastigotas grupadas ouisoladas, as quais desapareciam paulatina-mente para dar lugar só às formas epimas-tigotas e tripomastigotas.

Os resultados de Ribeiro e Barretto16

(1975) apresentaram concordância em partecom os de Brener e Chiar i 4 (1965) no quese refere aos aspectos da morfologia dasformas sanguícolas e o comportamento "Invitro", discordando entretanto no que serefere a patogenicidade.

Ao se analisar do ponto de vista qualita-tivo, os dados obtidos neste trabalho, veri-fica-se que o comportamento das amastigo-tas no LIT foi homogêneo para as quatrocepas estudadas. Todas apresentaramaglomerados numerosos de formas amasti-gotas nas culturas jovens, os quais dimi-nuiam progressivamente nos repiques suces-sivos para ceder lugar às epimastigotas etripomastigotas (Figs, l e 2). Chama atençãoo encontro das tripomastigotas aos pares

como se estivessem em divisão (Fig. 3).Achado similar está relatado no trabalhode Camargo 6 (1964). As quatro cepast inham formas sanguícolas predominante-mente largas sendo pouco patogênicas paracamundongos e Calomys callosas (Mello ecol.10 1979). Pode-se concluir portanto,referindo-se ao comportamento das amasti-gotas, ao tipo das formas sanguícolas e àpatogenicidade, que os resultados aqui obti-dos não seguem os mesmos padrões da-queles encontrados por Brener e Chiari4

(1965) e Ribeiro e Barretto16 (1975).

Camargo 6 (1964), estudando o comporta-mento de cepa Y no meio LIT, verif icouque havia uma fase de crescimento quecorrespondia a um período de quatro dias.O número de metacíclicos se desenvolvia nofinal da fase exponencial e atingia o maiornúmero na fase estacionaria. Quando esteautor mantinha as culturas com índicelogarítimo permanente obtido em subcultu-ras, o pico metacíclico jamais ocorria. Afase logarítimica caracterizava-se por umapredominância de epimastigotas.

Castellani e col.7 (1967) mostraram quea diferenciação de epimastigotas em tripo-mastigotas seria estimulada por acumulaçãode ácidos orgânicos no meio, no f ina l docrescimento exponencial. Esses resultadosforam confirmados por Pan1 4 (1971), aoestudar o comportamento de cepa Brasil emdois meios diferentes com três variações detemperatura (24,5°C, 29,5°C e 35°C). Con-cluiu esse autor que a composição do meioé que seria importante na produção numé-rica e diferenciação do parasito.

Chiari9 (1974) analisou crescimento ediferenciação nos meios LIT e HIL, dascepas humanas de T. cruzi, Y e MR, man-tidas "In vitro" por diferentes períodos detempo após isolamento do hospedeiro. Estascepas haviam sido estudadas anteriormentepor Brener e C h i a r i 5 (1963), Camargo6

(1964) e Brener e Ch ia r i 4 (1965). Notrabalho de Ch ia r i 6 (1974) os resultadosencontrados não mostraram diferençassignificantes quanto ao crescimento das

duas cepas guardadas por longo tempo. As

modificações observadas referiam-se a

metaciclogênese.

Do ponto de vista quantitativo, os resul-tados aqui obtidos mostraram diferenças decrescimento estatisticamente significantespara cada cepa e forma (Tabelas 2, 3, 4,5 e 7). Comparar estes resultados comaqueles de Camargo6 (1964) e Chiari4

(1974) em relação aos aspectos quanti ta-tivos, seria discrepante urna vez que ascepas aqui estudadas foram isoladas recen-temente do hospedeiro vertebrado (37-67dias). Comentários entretanto poderiamser conduzidos no que se refere ao tipode crescimento obtido com estas cepas deT. cruzi. Como mostra as Figs. 5, 6, 7 e8 e a Tabela 7, as curvas de crescimentonem sempre foram as mesmas para todasas formas e cepas. Embora as cepas R52e R65 tenham tido diferenças de cresci-mento distintas, evoluiram entretanto dentro

de um mesmo padrão, i.e., as curvas decrescimento obtidas foram do tipo exponen-cial (Tabela 6 e Figs. 5 e 7). As formasamastigotas da cepa R64 evoluiram segundouma parábola do segundo grau, enquantoas epimastigotas e tripomastigotas segundouma exponencial (Tabela 6, Fig. 6). Asformas amastigotas e tripomastigotas dacepa M226 deram uma reta enquanto asepimastigotas deram uma logística.

Os resultados obtidos na pesquisa aqui

realizada levaram a conclusão de que asquatro cepas de T. cruzi estudadas têmcomportamento distintos. Estes resultadosdevem no entanto ser encarados conside-rando que: estas cepas foram isoladas dehospedeiros vertebrados silvestres; foramestudadas logo depois de isolamento "Invitro"; têm pouca patogenicidade para ca-mundongos (Mello e col.10 1979), e as for-mas sanguícolas são predominantementelargas.

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MELLO, D. A. et al. [Growth and differentiation "In vitro" of strains of Trypa-nosoma cruzi isolated from wild animals.] Rev. Saúde públ., S. Paulo, 14;569-81, 1980.

ABSTRACT: In the course of this work, four strains of sylvatic Trypanosomacruzi were studied in regard to their growth and differentiation in LIT medium.R52, R64, and R65 were isolated from individual Didelphis albiventris (Marsu-pialia) and M226 from Calomys callosus (Rodentia). The evolution of thenumerical incresase and morphogenesis of the trypanosome populations in theculture was observed at regular intervals during a period of 312 hours. Diffe-rential counts were made of amastigotes, epimastigotes, and trypomastigotesin Neubauer chambers. Results showed that the four strains had characteristicbehavior patterns. M226 increased the most and was followed by R65, R52, andthen R64.

UNITERMS: Trypanosoma cruzi, wild strains. Didelphis albiventris. Calomyscallosus.

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Recebido para publicação em 02/09/1980

Aprovado para publicação em 22/09/1980