coombs direto pesquisa de anticorpos irregulares prova de compatibilidade

COOMBS DIRETOPESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES

PROVA DE COMPATIBILIDADE

TÉCNICA DO COOMBS DIRETOTÉCNICA DO COOMBS DIRETO (CD) OU (CD) OUTESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRETO (TAD)TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRETO (TAD)

O Teste de Coombs direto (CD) ou teste da Antiglobulina humana direto (TAD), demonstra a presença de hemácias sensibilizadas por anticorpos ou frações do complemento “in vivo”.

É utilizado no estudo de diversas patologias: Doença Hemolítica do Recém-nato.Doença Hemolítica do Recém-nato.Anemias hemolíticas auto-imune (AHAI) Anemias hemolíticas auto-imune (AHAI) Reação hemolítica transfusionalReação hemolítica transfusional.

TÉCNICA DO COOMBS DIRETOTÉCNICA DO COOMBS DIRETO (CD) OU (CD) OUTESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRETO (TAD)TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRETO (TAD)

1. Coletar a amostra de sangue2. Preparar uma suspensão de hemácias à mais ou menos 3-5%.3. Colocar uma gota desta suspensão em um tubo de hemólise.4. Lavar três vezes com salina fisiológica.5. Adicionar 2 gotas da antiglobulina humana poli-específica (anti-IgG e

anti-C3d)6. Centrifugar 3400 rpm 15 segundos7. Ressuspender suavemente o botão de hemácias8. Observar a presença ou não de aglutinados9. Anotar os resultados

AGHAGHCtlCtl

Presença de aglutinação - Coombs direto positivoHemácias sensibilizadas “in vivo” por anticorpos ou fracões do Complemento

Ausência de aglutinação = Coombs direto negativo

Teste de Coombs diretoTeste de Coombs direto

AGH

IgG Complemento

AGH

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Ocorrendo ausência de aglutinação o teste é negativo – Teste de Coombs direto negativo

Ocorrendo aglutinação o teste é positivo - Teste de Coombs direto positivo

Ausência de aglutinação Falha Técnica Presença de aglutinação

Validação da reação

VALIDAÇÃO DA REAÇÃO COM ANTIGLOBULINA HUMANA

Sempre que a AGH for utilizada e necessário a realização do Controle de Coombs

10. Quando a reação for negativa adicionar 1 gota do Reagente Controle de Coombs.

11. Centrifugar e ler

O resultado deverá ser agora positivo caso contrário houve falha técnica

CAUSAS DE ERROCAUSAS DE ERRO NA INTERPRETAÇÃO QUANDO UTILIZA-SE A AGH NA INTERPRETAÇÃO QUANDO UTILIZA-SE A AGH

São causas de reação São causas de reação Falso-positivoFalso-positivo::• Vidraria mal lavada• Centrifugação excessiva• Salina contendo partículas de sílica coloidal

São causas de reação São causas de reação Falso-negativoFalso-negativo::• Lavagem inadequada das hemácias• Reagente AGH sem reatividade• Preparo inadequado das suspensões de hemácias • Sub-centrifugação

Considerações sobre o teste

O teste de Coombs direto positivo pode não estar associado a Anemia hemolítica auto-imune e ainda assim não ser falso-positivo.

3% dos pacientes que recebem penicilina e 15% dos que recebem alfa-metildopa podem desenvolver Coombs direto positivo mas só 1% destes indivíduos terão Anemia hemolítica Auto-imune.

6 a 8% dos pacientes internados em hospitais podem ter CD positivo sem manifestações clinicas de destruição acelerada das hemácias (Garratty G, Transfusion Medicine Review 1987; 1:47-57)

Com os reagentes atuais , cuja sensibilidade é maior para detectar moléculas de imunoglobulinas e Complemento, a possibilidade de encontrarmos teste de Coombs direto positivo sem hemólise é maior.

SENSIBILIZAÇÃO“IN VIVO”

COOMBS DIRETO MONOESPECÍFICO

IgG / IgM / IgA / Frações do Complemento

AUSÊNCIA DE SENSIBILIZAÇÃO

“IN VIVO”

SENSIBILIZAÇÃO NÃO DETECTADA

ELUIÇÃO DIRETA OBRIGATÓRIA NOS CASOS DE

REAÇÃO TRANSFUSIONAL

TESTE DE COOMBS DIRETO POLIESPECÍFICO

AUTO-ANTICORPOS

ALO-ANTICORPOS

NEGATIVOPOSITIVO

Sistemas de grupos sanguíneos, genes, localização cromossômica

NNoo SistemaSistema SímboloSímbolo GeneGene LocalizaçãoLocalização CromossômicaCromossômica

001001 ABOABO ABOABO ABOABO 9q34.1-q34.29q34.1-q34.2002002 MNSMNS MNSMNS GYPA,GYPA,

GYPB,GYPEGYPB,GYPE4q28-q314q28-q31

003003 PP P1P1 P1P1 22q11.2-qter22q11.2-qter004004 RhRh RHRH RHD,RHCERHD,RHCE 1p36.20-341p36.20-34005005 LutheranLutheran LULU LULU 19q12-q1319q12-q13006006 KellKell KELKEL KELKEL 7q337q33007007 LewisLewis LELE FUT3FUT3 19p13.319p13.3008008 DuffyDuffy FYFY FY (DARC)FY (DARC) 1q22-q231q22-q23009009 KiddKidd JKJK JKJK 18q11.1-q11.218q11.1-q11.2010010 DiegoDiego DIDI AE1 (SLC3AE1)AE1 (SLC3AE1) 17q12-q2117q12-q21011011 YtYt YTYT ACHEACHE 7q227q22012012 XgXg XGXG XGXG Xp22.32Xp22.32013013 SciannaScianna SCSC SCSC 1p36.2-p22.11p36.2-p22.1


NNoo SistemaSistema SímboloSímbolo GeneGene LocalizaçãoLocalizaçãoCromossômicaCromossômica

014014 DombrockDombrock DODO DODO 12p13.2-12p12.112p13.2-12p12.1015015 ColtonColton COCO AQP1AQP1 7p147p14016016 Landsteiner-WienerLandsteiner-Wiener LWLW LWLW 19p13.2-cen19p13.2-cen017017 Chido/RodgersChido/Rodgers CH/RGCH/RG C4A, C4BC4A, C4B 6p21.36p21.3018018 HhHh HH FUT1FUT1 19q1319q13019019 KxKx XKXK XKXK Xp21.1Xp21.1020020 GerbichGerbich GEGE GYPCGYPC 2q14-q212q14-q21021021 CromerCromer CROMCROM DAFDAF 1q321q32022022 KnopsKnops KNKN CR1CR1 1q321q32023023 IndianIndian ININ CD44CD44 11p1311p13024024 OkOk OKOK CD147CD147 10pter-p13.210pter-p13.2025025 RaphRaph RAPHRAPH MER2MER2 11p15.511p15.5


NNoo SistemaSistema SímboloSímbolo GeneGene LocalizaçãoLocalizaçãoCromossômicaCromossômica

026026 John Milton HagenJohn Milton Hagen JMHJMH SEMA7ASEMA7A 15q23-q2415q23-q24027027 II II CGNT2CGNT2 6p246p24028028 GlobosideGloboside GLOBGLOB LWLW 3q253q25029029 GILGIL GILGIL AQP3AQP3 9p139p13

CHOCHO

COOHCOOHNHNH22COOHCOOH

EndofacialEndofacial

NHNH22 COOHCOOH

NHNH22

NHNH22ABO HLea/Leb P1

P+ I,I*

MNSs KnopsGerbich LWIndian Xg Lutheran Kell

Rh DiegoDuffy ColtonKx Kidd

CromerYtDombrockJMH*

Inserção das Proteínas na Membrana EritrocitáriaInserção das Proteínas na Membrana Eritrocitária

Single-passSingle-passMultipassMultipass

GPI-linkedGPI-linked

ExofacialExofacial

ComplementControl

Fy

LW

Lu

Ina/Inb

(CD44)

Jk

Ureatransporter

Cytokinereceptor

Cell adhesionmolecules

Transportproteins

Surfaceenzymes

Xk Kell Yt(AChE)

Cromer(CD55,DAF)

Kn (CR1)

FyFy

PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARESPESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES(PAI)(PAI)

A Pesquisa de anticorpos irregulares é realizadaem doadores de sangue e na seleção pré-transfusional.

Ao procedermos a PAI submetemos o soro ou plasma a testar a pelo menos 2 hemácias do Grupo “O” com perfil antigênico conhecido e documentado no Diagrama de antígenos incluso no Kit.

Devemos aplicar técnicas que revelem anticorpos sensibilizantes, aglutinantes e hemolizantes.

Em caso de positividade deveremos proceder a identificação destes anticorpos.

IIIIII

Lote: ------------- Validade: --------------------------

Observações: ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Diagrama de AntígenosDiagrama de Antígenos

Diagrama de antígenos

Rh-Hr Kell Kidd Duffy Lewis MNS P Lutheran

N. doador Genotipo D C E c e Cw K k Kpa Kpb Jsa Jsb Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb S s M N P1 Lua Lub I 206011 R1R1 + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + + 0 + + 0 + + + + + 0 0 + II 502858 R2r + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 + + 0 + + + + 0 +

auto Modo usual da reação Albumina /enzima/ Antiglobulina Antiglobulina Variável Frio

IIIIII

PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARESPESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARESTécnica de Coombs albuminosoTécnica de Coombs albuminoso

Fase Salina Imediata:Fase Salina Imediata:Esta fase revela anticorpos frios de natureza IgM em geral.Esta fase revela anticorpos frios de natureza IgM em geral. (anti-M, anti-P, anti-Le(anti-M, anti-P, anti-Leaa) )

1. Rotular dois tubos de hemólise como I e II;2. Nos dois tubos, colocar duas gotas de soro a ser testado;3. No tubo I, adicionar 1 gota de suspensão a 5% de hemácias de triagem I e no tubo II,

idem para hemácia de triagem II;4. Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos;5. Observar o sobrenadante para hemólise. 6. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para

aglutinação;

I

II

Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação);

I II

PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARESPESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES

Fase albumina imediataFase albumina imediataA albumina é uma proteína que atua aumentando a constante dielétrica do meio, diminui o potencial zeta e facilita a aglutinação. Nesta fase alguns anticorpos de natureza IgG já podem ser revelados. Detecta a presença de anticorpos para o sistema Rh e ocasionalmente anti-K e anti-Fya.

7. A cada um dos tubos I e II, adicionar duas gotas de Albumina bovina a 22%;8. Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos;9. Observar o sobrenadante para hemólise. 10. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e

ler macroscopicamente para aglutinação;AlbAlb



Fase TérmicaFase Térmica

Este artifício físico auxilia na revelação de anticorpos IgG. Quando os tubos são incubados a 370C, são revelados anticorpos, através de aglutinação (anti-D, anti-K) ou de hemólise (anti-Lea).

12. Incubar ambos os tubos durante 15 minutos, em banho-Maria a 370C;13. Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos;14. Observar o sobrenadante para hemólise. 15. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para

aglutinação;16. Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação);


Fase anti-globulina humana (Coombs indireto)Fase anti-globulina humana (Coombs indireto)Esta é uma fase onde através da antiglobulina humana que é um artifício imunológico se revela a

aglutinação de hemácias sensibilizadas por IgG. São revelados a maioria dos anticorpos ( anticorpos quentes).

17. Lavar as hemácias dos tubos I e II, em salina, por três vezes;18. Após a terceira lavagem, retirar todo o sobrenadante por inversão rápida dos tubos;19. Agitar bem e adicionar a cada tubo, duas gotas da anti-globulina humana 20. Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos;21. Observar o sobrenadante para hemólise. 22. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para

aglutinação;23. Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação);

Validação da AGH

24. Nos tubos negativos, adicionar uma gota do Reagente Controle de Coombs;25. Misturar bem, centrifugar adequadamente, ressuspender gentilmente o "botão de hemácias" e

ler macroscopicamente para aglutinação, a qual deverá forçosamente ocorrer.

I II

IIII

DD

D CtlCtl

FASE ANTI-GLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO)FASE ANTI-GLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO)

AGHAGH


PROVA DE COMPATIBILIDADE PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR MAIOR (PC(PCMM))

Técnica Coombs albuminoso em tuboTécnica Coombs albuminoso em tubo

A Prova de Compatibilidade (PC) ou Prova Cruzada consiste em, antes da transfusão, colocar em contacto o soro do receptor com os GV do doador (PCM-maior) e o soro do doador com os GV do receptor (Pcm-menor), afim de assegurar ao receptor um sangue compatível.

A técnica utilizada deve revelar anticorpos sensibilizantes, aglutinantes e hemolizantes

Separar uma amostra do segmento da bolsa selecionada ABO compatível

Preparar uma suspensão de hemácias de a 5% adicionando em um tubo de hemólise:

1 gota do concentrado de hemácias + 19 gotas de salina

PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIORPROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR

Fase de leitura imediata:Fase de leitura imediata:

1. Para cada unidade de sangue a testar, identificar um tubo como PC 12. Colocar duas gotas de soro do paciente, e 1 gota de GV a 5% da bolsa

selecionanda;3. Centrifugar o tubo a 1.000 rpm por um minuto ou 3.400 rpm por 15

segundos;4. Observar a presença de hemólise ou aglutinação.

PC1


PC 1

FASE ALBUMINA IMEDIATAFASE ALBUMINA IMEDIATA

AlbAlb

5. Adicionar duas gotas de Albumina bovina a 22%;

6. Centrifugar o tubo a 1.000 rpm por um minuto ou 3.400 rpm por 15 segundos;

7. Observar a presença de hemólise ou aglutinação.


PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIORPROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR

FASE TÉRMICAFASE TÉRMICA

8. Incubar em banho-Maria a 370C durante 15 minutos, no mínimo;9. Centrifugar o tubo a 1.000 rpm por um minuto ou 3.400 rpm por 15 segundos;10. Observar a presença de hemólise ou aglutinação. Anotar o resultado;

FASE DA ANTIGLOBULINA HUMANAFASE DA ANTIGLOBULINA HUMANA

11. Preencher o tubo com salina, centrifugar a 3.400 rpm durante 1 minuto e 30 segundos e decantar o sobrenadante.

12. Repetir essa lavagem por 3 vezes e após a última lavagem decantar o sobrenadante o mais completamente possível;

13. Adicionar duas gotas de AGH, homogeneizar bem;14. Centrifugar a 3.400 rpm por 15" ou a 1.000 rpm por um minuto. Examinar macroscopicamente para

aglutinação. Anotar os resultados;

Validação da AGH

15. Sendo ausente a aglutinação, colocar no tubo, uma gota do Reagente Controle Coombs;A reação com o Controle de Coombs deverá ser positiva.

PC 1

PC PC 11

DD

D CtlCtl

FASE ANTI-GLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO)FASE ANTI-GLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO)

AGHAGH

PC 1

Ausência de aglutinaçãoPROVA COMPATÍVEL

Presença de aglutinaçãoPROVA INCOMPATÍVEL

PC 1

AnticorpoAnti-DAnti-CAnti-cAnti-EAnti-eAnti-Cw

Anti-KAnti-kAnti-Jka

Anti-Jkb

Anti-Jk3Anti-Fya

Anti-Fyb

Anti-Fy3

Natural Imune Não SimNão Sim Não Sim Sim Sim Não Sim Sim SimNão Sim Não SimNão Sim Não Sim Não SimNão Sim Não Sim Não Sim

PositivoPositivo PositivoPositivoPositivoPositivoPositivoPositivoPositivoPositivoPositivoPositivoPositivoPositivo

AumentaAumentaAumentaAumentaAumentaAumentaPode AumentarPode Aumentar AumentaAumentaAumentaDiminuiDiminuiAumenta

Reatividade Temperatura Fase de Enzima4ºC 20ºC 37ºC Coombs 37ºC

Especificidadedo

Natureza do Ac

Ao analisarmos um painel também e importante termos em mente o COMPORTAMENTO DO ANTICORPO de determinados anticorpos. Assim são importantes a temperatura ideal, a melhor técnica de revelação e o comportamento dos antígenos correspndentes frente ao tratamento enzimático.

= Reatividade aumenta com o aquecimento

AnticorpoAnti-SAnti-sAnti-MAnti-NAnti-UAnti-Lea

Anti-Leb

Anti-Lex

Anti-Lua

Anti-Lub

Anti-P1

Anti-PAnti-Tja

Natural Imune Sim SimNão Sim Sim Alguns Sim Sim Não Sim Sim NãoSim NãoSim NãoSim Raro Raro Sim Sim NãoSim NãoSim Não

Reatividade Temperatura Fase de Enzima4ºC 20ºC 37ºC Coombs 37ºC

PositivoPositivo Pos/ NegPos/ Neg PositivoPos/ NegPos/ Neg Pos/ NegPos/ Neg PositivoPositivoPositivoPositivo

DiminuiDiminuiDiminuiDiminuiAumentaAumentaAumentaAumentaVariávelVariávelAumentaDiminuiAumenta

COMPORTAMENTO DO ANTICORPO

Especificidadedo

Natureza do Ac

= Reatividade diminui com o aquecimento

= Reatividade aumenta com o aquecimento

-PAINÉIS ESPECIAIS-TÉCNICAS QUE AUMENTAM A ATIVIDADE DOS ANTICORPOS-TITULAÇÃO DE ANTICORPOS

ANTICORPO CONTRA ANTÍGENO PÚBLICO

-PAINÉIS ESPECIAIS-FENOTIPAR O PACIENTE

PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES POSITIVA + AUTO-CONTROLE NEGATIVO

TODAS REAÇÕES POSITIVAS COM MESMA

INTENSIDADE E FASE

REATIVIDADE COM ALGUMAS CÉLULAS

PARECENDO ELIMINAR TODAS ESPECIFICIDADES

SOMENTE UMA CÉLULA DO PAINEL POSITIVA OU

SOMENTE A PROVA CRUZADA INCOMPATÍVEL

BAIXA REATIVIDADE DO ANTICORPO OU

EFEITO DE DOSE

ANTICORPO CONTRA ANTÍGENO PRIVADOSOMENTE UMA CÉLULA DO PAINEL POSITIVA

BOLSA COM COOMBS DIRETO POSITIVOSOMENTE A PROVA CRUZADA INCOMPATÍVEL

-PAINÉIS ESPECIAIS-COOMBS DIRETO DA BOLSA

O fluxograma abaixo fornece diretrizes para a interpretacao de paineis de hemacias

Ao definirmos as especificidades envolvidas na interpretação de painéis de hemácias, é importante termos conhecimento da IMPORTÂNCIA CLINICA DESTES ALO-ANTICORPOS:

ANTICORPOS CLINICAMENTE SIGNIFICANTES Os anticorpos dos Sistemas ABO , RH , KELL , KIDD , DUFFY e contra os antígenos SsU devem ser respeitados no caso de necessidade transfusional.

ANTICORPOS QUE PODEM SER SIGNIFICANTES Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Lea , M , N , P1, Lua , Lub podem ocasionalmente determinar reação transfusional

ANTICORPOS QUE RARAMENTE SÃO SIGNIFICANTESOs anticorpos dirigidos contra os antígenos Leb , Cha , Rga , Xga e os dirigidos contra antígenos de alto titulo e baixa afinidade ( HTLA ) dificilmente estão envolvidos em problemas transfusionais

coombs direto pesquisa de anticorpos irregulares prova de compatibilidade

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