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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DE SOLOS
RAFAEL THOMAZ DE AQUINO MOURA
RECIFE - 2007
RAFAEL THOMAZ DE AQUINO MOURA
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO
CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DE SOLOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Tecnologias Energéticas e
Nucleares – PROTEN. Departamento de
Energia Nuclear da Universidade Federal de
Pernambuco, para obtenção do título de Mestre
em Tecnologias Energéticas e Nucleares. Área
de concentração: Aplicação de Radioisótopos –
Fertilidade de Solos.
ORIENTADOR: PROF. DR. RÔMULO SIMÕES CEZAR MENEZES
RECIFE – 2007
M929c Moura, Rafael Thomaz de Aquino.
Comparação de métodos para quantificação do carbono da Biomassa microbiana de solos / Rafael Thomaz de Aquino Moura.- Recife: O Autor, 2007.
35 folhas, il : figs., tabs. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CTG.
Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares, 2007.
Inclui bibliografia. 1. Tecnologia Energia Nuclear. 2. Biomassa Microbiana. 3. Radiação
Gama. 4. Esterilização. I. Título. UFPE 621.4837 CDD (22. ed.) BCTG/2007-155
AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente ao meu orientador Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes que de
maneira singular me deu apoio, orientação, confiança, discussões, puxões de orelhas,
conselhos, risos e amizade em todo o momento, minha eterna gratidão.
Aos amigos Marlon da Silva Garrido e Carla Souza da Silva, pelo apoio, ajuda e
ensinamentos necessários para a realização deste trabalho.
Aos Professores Ignácio Salcedo e Everardo Sampaio, pelas contribuições e sugestões
necessárias durante a construção desta pesquisa.
Ao Departamento de Energia Nuclear (DEN) e ao PROTEN, pela oportunidade para a
realização deste trabalho.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudo.
Ao Inter American Institute for Global Change Research (IAI) e ao CNPq pelo apoio
financeiro.
A minha mãe Eliane Thomaz de Aquino, pelo exemplo de mãe e pela formação do meu
caráter e cobrança pela busca do saber.
Ao Meu pai Enilson Ferreira de Moura pelo apoio em todos os momentos da minha
vida.
Ao meu irmão e sempre amigo Anderson Souza de Moura por sempre acreditar e torcer
pelo meu sucesso.
Ao meu sobrinho Arthur (a “peitica” de titio) pelo simples fato de existir.
Ao meu tio Telmo Mendes pelo apoio e força na construção do conhecimento.
A minha família por todo amor dedicado a mim.
Aos amigos do Laboratório de Radioagronomia /Fertilidade do solo pelo imenso auxílio,
discussões, risadas e companhia, que fazem do trabalho uma alegria: Fabio, Marlon, Sandra,
Jackson, Romildo, Valdemir, Carla, Claudenice, Gilberto, Pedrinho, Clarindo, Tereza.
A grande amiga Mônica Reis de Farias por me dar apoio em tantos momentos difíceis e
me fazer perceber que nada dá errado para quem não está só.
A toda minha família e amigos, pois alguns serviram de exemplo, outros de auxílio, mas
todos me ofereceram o maior patrimônio, que é a amizade.
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO
DO CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DE SOLOS Autor: Rafael Thomaz de Aquino Moura
Orientador: Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes
RESUMO
A biomassa microbiana do solo (BMS) é o principal componente do sistema de
decompositores, que regula a ciclagem de nutrientes, o fluxo de energia, a produtividade
das plantas e dos ecossistemas. Sendo assim, estudos voltados ao entendimento do
funcionamento da microbiota do solo são importantes para a compreensão dos
processos de ciclagem de nutrientes. Os métodos utilizados para estimar a BMS
baseiam-se na esterilização do solo e posterior quantificação do carbono da biomassa
microbiana (Cmic). O método mais utilizado consiste na fumigação do solo com
clorofórmio em dessecador, mas outros métodos também são empregados, como a
esterilização através da aplicação direta de clorofórmio no solo, por irradiação
eletromagnética (microondas), ou através da radiação gama com o uso de uma fonte de 60Co. Muito ainda se discute sobre a adequação dos métodos comumente utilizados para
a quantificação do carbono da biomassa microbiana em condições edafoecológicas
diversas, seja pela confiabilidade dos resultados, seja pela pouca praticidade e
viabilidade de alguns dos métodos. Os objetivos do presente estudo foram: 1)
determinar a dose de radiação gama mais adequada para a esterilização de quatro solos
do semi-árido com teores crescentes de carbono (5, 10, 15 e 30 g kg-1); e 2) comparar,
nestes mesmos solos, os valores de carbono da biomassa microbiana e a eficiência de
esterilização após a utilização de quatro métodos (radiação gama, fumigação com
clorofórmio em dessecador, aplicação direta com clorofórmio e radiação por
microondas). Para determinar a dose de radiação mais adequada foram testadas as doses
de 15, 25, 35, 45 e 60 KGy. A quantificação do Cmic foi feita pelo método
colorimétrico, após extração com sulfato de potássio. Posteriormente, foi feita a
estimativa de microrganismos por método de contagem em placa para confirmar a
eficiência das doses e métodos testados. Doses, iguais ou maiores que 25 KGy
esterilizaram completamente os solos. O Cmic dos dois solos com teores mais baixos de
carbono total não diferiram entre os métodos de esterilização. No solo com 15 g kg-1 de
C, o Cmic foi maior após esterilização com radiação gama, enquanto no solo com 30 g
kg-1 de C a aplicação direta extraiu mais Cmic. Todas as metodologias apresentadas
obtiveram valores crescentes de Cmic com o aumento do carbono do solo. Doses acima
de 25 KGy continuaram extraindo carbono de outras frações e, portanto, não são
recomendadas pois podem superestimar o Cmic. As metodologias testadas mostraram
que os métodos de fumigação com clorofórmio em dessecador e a aplicação direta de
clorofórmio não são capazes de esterilizar completamente os solos. Apenas os métodos
com utilização de microondas e radiação gama realizaram a esterilização completa das
bactérias e fungos dos solos.
Palavras-chave: Biomassa microbiana, radiação gama, esterilização
COMPARISON OF METHODS TO QUANTIFY SOIL
MICROBIAL BIOMASS CARBON
Author: Rafael Thomaz de Aquino Moura
Adviser: Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes
ABSTRACT
The microorganisms of the soil are the main component of the biota that regulate the
fluxes of nutrients and energy in ecosystems, therefore affecting the productivity of the
plants. For this reason, studies that investigate the functioning of the soil microbiota are
important for the understanding of the processes responsible for nutrient cycling. The
methods used to measure soil microbial biomass (SMB) are based on the sterilization of
the soil followed by the quantification of the microbial biomass carbon (Cmic). The
most traditional method to sterilize soils uses chloroform vapor to fumigate the soils
within a desecator, but other methods are also used, such as the direct application of
chloroform to the soil, the use of eletromagnetic radiation (microwave), or the use of
gamma radiation with a source of 60Co. However, there is much discussion to detemine
which is the most adequate method to measure SMB under varying environmental
conditions, either due to the reliability of the results or the high demand of labor and
infra-structure by these methods. The objectives of the present study were: 1) to
determine the most adequate dosis of gamma radiation to sterilize four soils from the
semi-arid region of NE Brazil with increasing levels of carbon (5, 10, 15 e 30 g kg-1);
and 2) to compare, for these same four soils, the values of Cmic and the sterilization
efficiency after using four sterilization methods (gamma radiation, fumigation with
chloroform, direct application of clororformium, and microwave radiation). The doses
of gamma radiation used were 15, 25, 35, 45 e 60 KGy. The Cmic was detemined by
colorimetry after extraction with potassium sulfate. The evaluation of the efficiency of
the sterilization was done by serial dilutions and pour plate techniques. The soils were
completely sterilized with doses of 25 KGy or higher. Values of Cmic of the two soils
with the two lowest levels of total carbon did not differ among sterilization methods.
For the soil with 15 g kg-1 of C, the Cmic was greater after sterilization with gamma
radiation, while for the soil with 30 g kg-1 of C the direct application of chloroform
extracted more Cmic. All methodologies resulted in increasing Cmic with increasing
total soil C. Doses greater than 25 KGy continued to extract carbon from other fractions
of the soil organic matter and, therefore, are not recommended because could
overestimate Cmic. Fumigation or direct application of chloroform did not sterilize the
soils, while the microwave and the gamma radiation eliminated completely the bacteria
and fungi of the soils.
Keywords: Microbial biomass, gamma radiation, sterilization
LISTA DE FIGURA
Figura 1. Comparação dos teores de carbono extraídos de quatro solos com
teores crescentes de carbono orgânico, após irradiação com cinco
doses de radiação gama. Barras verticais representam à diferença
mínima significativa.
25
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Caracterização química e física de quatro solos, com teores
crescentes de carbono orgânico total, provenientes da região semi-
árida do Nordeste brasileiro.
20
Tabela 2. Quantificação de bactérias e fungos presentes em quatro solos com
teores crescentes de carbono orgânico, após esterilização com
diferentes doses de radiação gama.
24
Tabela 3. Quantificação do carbono da biomassa microbiana de solos com
teores crescentes de carbono, utilizando-se diferentes metodologias
de esterilização.
27
Tabela 4. Quantificação de bactérias e fungos em solos com teores crescentes
de carbono, depois de submetidos os diferentes métodos de
esterilização.
29
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 12
REVISÃO DE LITERATURA................................................................................... 15
Microbiologia do solo................................................................................................. 15
Biomassa microbiana.................................................................................................. 16
Métodos de determinação da biomassa microbiana do solo....................................... 17
MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................ 19
Descrição dos solos utilizados.................................................................................... 19
Comparação de doses de radiação γ de 60Co para esterilização dos
microorganismos do solo............................................................................................
19
Comparação de metodologias de esterilização para quantificação do carbono
microbiano do solo......................................................................................................
21
Extração e quantificação da biomassa microbiana...................................................... 21
Quantificação de microrganismos............................................................................... 21
Análise estatística........................................................................................................ 22
RESULTADOS E DISCUSSÕES.............................................................................. 23
CONCLUSÕES........................................................................................................... 30
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 31
INTRODUÇÃO
As atividades agropecuárias da região semi-árida do Nordeste brasileiro têm
como um dos seus maiores problemas, além da deficiência hídrica, a baixa fertilidade
natural dos solos, o que limita a produtividade das principais culturas agrícolas, como o
milho e o feijão. Por estes motivos, o nível de renda dos agricultores é baixo, o que
impossibilita a compra de insumos externos para a melhoria da fertilidade dos solos
(Menezes e Salcedo, 1999, e Menezes et al., 2002). Sendo assim, a matéria orgânica do
solo consiste na principal fonte de nutrientes para o crescimento vegetal nas áreas
agrícolas e, conseqüentemente, a liberação de nutrientes devido à decomposição da
matéria orgânica é de vital importância para a manutenção da produção vegetal.
Os microrganismos do solo estão entre os principais responsáveis pelos
processos de ciclagem de nutrientes. Dessa forma, estudos voltados ao entendimento do
funcionamento da microbiota do solo são importantes para a compreensão dos
processos que controlam a disponibilidade de nutrientes para as plantas. Vários
parâmetros microbiológicos têm sido usados como indicadores para avaliar esses
processos no solo, mas nenhum tem se mostrado adequado a todas as situações, devido
à natureza dinâmica e complexa dos ecossistemas (Dick, 1992). Um bom indicador
necessita responder às perturbações do solo, avaliar com precisão o funcionamento do
sistema produtivo, indicar diferenças espaciais e temporais e ser relativamente rápido e
de baixo custo (Turco et al., 1994).
Dentre os indicadores de qualidade do solo comumentes adotados está a
biomassa microbiana. A biomassa microbiana do solo (BMS) é definida como a parte
viva da matéria orgânica do solo, incluindo bactérias, fungos, actinomicetos,
protozoários, algas e microfauna. Excluindo-se raízes de plantas e animais do solo
maiores do que 5 µm³, a biomassa microbiana contém, em média, de 2 a 5% do C
orgânico (Jenkinson e Ladd, 1981) e de 1 a 5% do N total do solo (Smith e Paul, 1990).
Muito ainda se discute sobre a adequação dos atuais métodos comumente utilizados
para a quantificação do carbono da biomassa microbiana em condições edafoecológicas
diversas, seja pela confiabilidade dos resultados, seja pela pouca praticidade e
viabilidade de alguns dos métodos. Dessa forma, é mais conveniente, sempre que
possível, a utilização de mais de um método para estudos sobre a biomassa microbiana
(Gama-Rodigues, 1999).
13
Vários métodos de quantificação do carbono da biomassa microbiana baseiam-
se em processos que causam a morte dos microrganismos e a desintegração total ou
parcial das suas células. Com a desintegração, parte dos constituintes celulares dos
microrganismos é facilmente extraível do solo por extratores fracos. Há diversos
métodos que causam a morte dos microrganismos do solo, para, em seguida, ser feita a
quantificação do carbono da biomassa microbiana. Atualmente, os métodos mais
comumente citados são: a fumigação em dessecador (Vance et al. 1987) e a irradiação
eletromagnética por microondas (Islam e Weil, 1998 e Brookes et al. 1982). Alguns
estudos utilizam uma adaptação do método da fumigação em dessecador, no qual o
clorofórmio é aplicado diretamente no solo (Witt et al., 1998). Além destes, também
tem sido utilizada a radiação gama (Powlson, e Jenkinson, 1975). O método mais
comumente adotado foi desenvolvido por Jenkinson e Powlson (l976), posteriormente
modificado por Vance et al. (1987), e consiste na fumigação do solo com clorofórmio
em dessecador, seguido da extração do carbono solúvel por sulfalto de potássio e
posterior quantificação desse carbono por titulação (Anderson e Ingram, 1993) ou
colorimetria (Bartlett e Ross, 1988).
A escolha do método a ser utilizado para a quantificação da BMS deve levar
em consideração fatores como a disponibilidade de recursos e infra-estrutura
laboratorial, mas também a eficácia e praticidade do método. Por exemplo, poucos
trabalhos avaliam a eficácia da esterilização de cada um dos métodos citados acima. Em
alguns casos, já se demonstrou que a fumigação em dessecador não elimina
completamente os microrganismos presentes no solo (Wolf et. al., 1989), além de
requerer equipamentos que limitam o número de análises que podem ser realizadas
simultaneamente. O método da aplicação direta de clorofórmio direto no solo, apesar de
ser frequentemente utilizado no Brasil, não foi avaliado cuidadosamente quanto à sua
eficácia na morte dos microrganismos.
A irradiação por energia eletromagnética (microondas), pela facilidade de
execução, pela disponibilidade do equipamento utilizado e pela eficiência na morte dos
microrganismos, é um método aconselhável. Outro método eficiente na morte dos
microrganismos é baseado no uso de radioatividade, sendo o solo levado a irradiadores
de fonte 60Co com emissão de raios gama (Powlson e Jenkinson, 1975). Após a
irradiação, é realizada a quantificação do carbono liberado. Vários trabalhos já foram
realizados utilizando este método (Wolf et. al., 1989; Cawse, 1969, 1975), mas, não há
dados disponíveis na literatura sobre uso da radiação gama para esterilização de solos da
14
região semi-árida do Nordeste do Brasil, particularmente em solos com distintos teores
de carbono.
Sendo assim, os objetivos deste trabalho foram: 1) determinar a dose de
radiação gama mais adequada para a esterilização de quatro solos do semi-árido com
teores crescentes de carbono (5, 10, 15 e 30 g kg-1); e 2) comparar, nestes mesmos
solos, os valores de carbono da biomassa microbiana e a eficiência de esterilização após
a utilização de quatro métodos (radiação gama, fumigação com clorofórmio em
dessecador, aplicação direta com clorofórmio e radiação por microondas).
15
REVISÃO DE LITERATURA
Microbiologia do Solo
Em sistemas tropicais, os solos, de maneira geral, apresentam-se bastante
intemperizados e lixiviados, possuindo uma baixa fertilidade natural. Nesta situação, a
matéria orgânica do solo representa a maior fonte de nutrientes para o crescimento
vegetal. Sendo assim, as taxas de decomposição da matéria orgânica e de liberação de
nutrientes são de vital importância para a manutenção da produção vegetal. Os
microrganismos do solo são os responsáveis pelo processo de ciclagem de nutrientes.
As bactérias e os fungos utilizam-se de aparatos enzimáticos, sendo os responsáveis por
diversos mecanismos de síntese e degradação no solo, ora promovendo a mineralização
de compostos orgânicos e a liberação de nutrientes, ora imobilizando-os em sua
biomassa (Seasted e Crossley, 1984). Os microrganismos imobilizam temporariamente
C, N, P, Ca, K, S, Mg e micronutrientes, que serão liberados após sua morte e
decomposição, podendo tornar-se disponíveis às plantas. A biomassa microbiana (BMS)
é definida como a parte viva da matéria orgânica do solo, incluindo bactérias, fungos,
actinomicetos, protozoários, algas e microfauna. Excluindo-se raízes de plantas e
animais do solo maiores do que 5 µm³, a biomassa microbiana contém, em média, de 2
a 5% do C orgânico do solo (Jenkinson e Ladd, 1981) e de 1 a 5% do N total do solo
(Smith e Paul, 1990). Apesar de sua grande capacidade de transformação química, os
microrganismos possuem mobilidade limitada. Sendo assim, a variabilidade espacial da
atividade dos microrganismos pode ser muito grande, apresentando-se ativos em
microsítios favoráveis e inativos em outros desfavoráveis.
Um maior aporte de matéria orgânica estimula o desenvolvimento de
microrganismos no solo, incluindo os microrganismos solubilizadores e fixadores que
são os principais responsáveis pela decomposição dos resíduos orgânicos, pela ciclagem
de nutrientes, pela fixação de nitrogênio e pelo fluxo de energia dentro do solo. Os
microrganismos exercem influência tanto na transformação da matéria orgânica, quanto
na estocagem do carbono e nutrientes minerais (Jenkinson e Ladd, 1981). Vários
parâmetros microbiológicos têm sido usados como indicadores para avaliar esses
processos no solo, mas nenhum é adequado a todas as situações, devido à natureza
dinâmica e complexa dos ecossistemas (Dick, 1992). Um bom indicador necessita
responder às perturbações do solo, avaliar com precisão o funcionamento do sistema
produtivo, indicar diferenças espaciais e temporais e ser relativamente rápido e de baixo
16
custo (Turco et al., 1994). Entre os indicadores comumente adotados estão à respiração
e a biomassa microbiana.
Biomassa Microbiana
A remoção da vegetação nativa de um ecossistema para fins agrícolas causa
uma quebra nos ciclos do carbono e dos nutrientes (Malavolta, 1987), os quais operam
graças à entrada fotossintética de carbono e à decomposição acelerada e contínua da
matéria orgânica do solo (MO), realizada pelos microrganismos. Nesse contexto, a
alteração da qualidade e da quantidade de matéria orgânica afeta os microorganismos do
solo. A biomassa microbiana do solo, definida por Jenkinson e Ladd, (1981) como o
componente microbiano vivo, é composta de fungos, bactérias, microfauna e algas, com
participação fundamental nos ciclos biogeoquímicos de interesse para a produtividade
agrícola.
A BMS é o principal componente do sistema de decompositores, que regula a
ciclagem de nutrientes, o fluxo de energia, a produtividade das plantas e dos
ecossistemas (Sparling, 1992), e, portanto, a medição deste compartimento e sua
atividade são relevantes para a conservação dos solos. Conforme as condições
edafoclimáticas, a velocidade de decomposição da serapilheira varia de acordo com os
teores de lignina, polifenóis, celulose, carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre, dentre
outros componentes. Altos teores de lignina, polifenóis e celulose estão relacionados
com a baixa taxa de decomposição, menor liberação de nutrientes e com maior acúmulo
de serapilheira (Swift et al., 1979).
Como a decomposição e a mineralização dos resíduos vegetais dependem da
atividade microbiana, a avaliação da biomassa microbiana fornece informações
importantes para o entendimento da ciclagem de nutrientes (Paul e Clark, 1989). Por
apresentar rápida ciclagem, este atributo microbiológico responde intensamente a
flutuações sazonais de umidade e temperatura, ao cultivo e ao manejo de resíduos,
sendo um indicador mais sensível das mudanças nos níveis de matéria orgânica do que
o teor de C orgânico total (Anderson e Domsch, 1989; Sparling, 1997). Contudo, mais
importante que o valor absoluto da biomassa microbiana é o estudo das relações entre a
biomassa e a atividade microbiana e atributos químicos para o melhor entendimento
sobre a funcionalidade do sistema solo-serapilheira.
Gama-Rodrigues et al. (1997), trabalhando com solo e serapilheira sob
diferentes coberturas florestais, nas quais a serapilheira com maiores teores de N
17
apresentaram menor quantidade acumulada, encontraram correlação negativa entre o N
da biomassa microbiana e o N da serapilheira (r = -0,52, P < 0,01), indicando que
quanto maior a taxa de decomposição menor o N acumulado na biomassa microbiana.
Nesse caso, a qualidade nutricional da serapilheira estaria determinando a maior taxa de
decomposição e, conseqüentemente, a imobilização de N pela biomassa microbiana.
Na região Nordeste do Brasil, Sampaio e Salcedo (1982), trabalhando com
incorporação de palha marcada com 14C no solo, concluíram que, as taxas de liberação
de CO2 são proporcionais às quantidades de palha adicionadas ao solo, indicando que a
quantidade de substrato disponível é que é limitante e não a atividade dos
microrganismos do solo que se ajusta em pouco tempo às possibilidades de
decomposição. Segundo Garcia et al. (1994), o baixo teor de matéria orgânica é a
principal causa da pouca atividade microbiana em solos de regiões semi-áridas.
Uma das principais limitações da quantificação da biomassa microbiana em
solos tropicais é a imprecisão no valor da constante de mineralização. Entretanto,
Sampaio et al. (1986), realizaram testes para encontrar valores mais precisos desta
constante e acharam valores bastante semelhantes aos obtidos para solos de zonas
temperadas e, portanto, sugeriram que estes poderiam ser generalizados para solos de
zonas tropicais.
Métodos de Determinação do Carbono da Biomassa Microbiana do Solo
Até o início da década de 90, os trabalhos sobre BMS tratavam,
principalmente, de ajustes metodológicos (Gama-Rodrigues, 1999). Neste sentido,
deve-se distinguir a biomassa de sua atividade (Siqueira et al., 1994), visto que a BMS
não é uma estimativa da atividade dos microrganismos do solo, mas da massa
microbiana viva total do solo, com base na concentração de algum elemento ou de
alguma substância celular, considerando-se a população microbiana como uma entidade
única (De-Polli e Guerra, 1999). Ressalva-se que as atividades de algumas enzimas
podem ser relacionadas com a BMS e são auxiliares na interpretação da condição
funcional da BMS total ou de algum compartimento (Marchiori Júnior e Melo, 1999;
Taylor et al., 2002; Matsuoka et al., 2003).
O aumento do interesse em microrganismos de solo e, paralelamente, a
necessidade de isolamento, identificação e enumeração desses agentes transformadores
da matéria orgânica do solo, resultaram na criação e diversificação de muitas técnicas.
18
Inicialmente, as investigações em bacteriologia de solo foram realizadas com métodos
desenvolvidos em bacteriologia médica: amostras de solo eram diluídas com água
esterilizada, disseminadas em placas com gelatina e, após incubação, determinava-se o
número de bactérias (Grisi, 1984). Posteriormente, foi introduzido o método de diluição
em placas para contagem de bactérias do solo. Nessa técnica, diluições da amostra do
solo são adicionadas a tubos contendo meio liquefeito e resfriado, e posteriormente o
conteúdo desses tubos é distribuído em placas de Petri, e a partir do número de colônias
desenvolvidas na placa, é calculado o número de organismos vivos por unidade de
massa do solo (Jackson e Raw, 1975; Pelczar Jr. et al., 1996; Melloni et al., 2001). Em
seguida, por adaptação, foi introduzida a técnica de plaqueamento para isolamento de
fungos de solo (Jackson e Raw, 1975; Grisi, 1984). O método de plaqueamento por
gotas é recomendado por Jahnel et al. (1999) para determinação do número mais
provável de fungos e bactérias do solo. O desenvolvimento de técnicas microscópicas
para exame de microrganismos provenientes de amostras dos ambientes naturais
ocorreu no início do século XX. Os primeiros métodos utilizados consistiam na
contagem do número de células microbianas pela observação direta de lâminas de solo
ao microscópio, sendo introduzido depois o uso de corantes vitais, bem como o cálculo
da biomassa através da determinação dos volumes celulares e da densidade média das
estruturas vivas (Grisi, 1984; Grisi e Gray, 1985). Na impossibilidade da obtenção de
uma medida quantitativa exata da população microbiana total em um ecossistema, por
métodos culturais ou por meio da observação microscópica direta, foram desenvolvidas
outras técnicas capazes de avaliar a massa dos microrganismos, ou seja, a BMS (Pelczar
et al., 1980; Haubensak et al., 2002).
Diversos trabalhos sobre a fumigação de solos, especialmente com vapores de
clorofórmio (CHCl3), realizados na década de 70, notadamente pelo grupo de D.S.
Jenkinson, na Estação Experimental de Rothamsted, na Inglaterra, levaram à proposição
do método da fumigação-incubação (Jenkinson e Powlson, l976), desencadeando um
grande número de trabalhos que propiciaram consideráveis avanços neste campo.
Posteriormente, foi proposto o método da fumigação-extração (Vance et al. 1987). A
diferença deste último para o método da fumigação-incubação é que o material celular
liberado pelo rompimento da parede celular após a fumigação é recuperado com um
extrator fraco, como o K2SO4, em uma relação solo extrator de 1:4 ou 1:2,5 (Tate et al.
1988), logo após a fumigação, eliminando-se os 10 dias de incubação, nas quais se
calculava a liberação de CO2 produzido pela respiração dos microrganismos inoculados,
19
consumindo o carbono dos microrganismos anteriormente mortos. Os dois trabalhos
acima citados (Vance et al. 1987 e Tate et al., 1988) detalham com clareza as etapas e
cuidados metodológicos necessários.
Alguns trabalhos para solos inundados realizados recentemente têm usado o
método da aplicação direta de clorofómio no solo, em substituição ao método da
fumigação com dessecador (Witt et al., 1998). Neste caso, uma alíquota de clorofórmio
é adicionada diretamente ao solo, em frascos depois hermeticamente fechados por 24 h
e posteriormente colocados na capela para volatilização do clorofórmio, depois da qual
é feita a determinação da biomassa após extração com K2SO4.
Outro método utilizado é a irradiação por microondas, que consiste na
utilização de energia eletromagnética (microondas), causando efeito na transferência de
energia e temperatura, levando ao rompimento celular e à liberação dos compostos
intracelulares (Brookes et al. 1982 e Islam e Weil, 1998).
Além dos métodos baseados na utilização do clorofórmio e da irradiação por
microondas, também se pode usar a radiação gama para a esterilização do solo. Esse
método é baseado no uso de radiação nuclear, sendo o solo levado a irradiadores de
fonte 60Co, com emissão de raios gama (Powlson, e Jenkinson, 1975).
Após a esterilização, o carbono da biomassa microbiana é extraído com um
extrator fraco, como o K2SO4, e titulado com sulfato ferroso amoniacal (Vance et al.,
1987, Anderson e Ingram, 1993) ou colorimetria (Bartlett e Ross, 1988) para a
determinação do carbono que foi liberado da biomassa microbiana.
MATERIAL E METODOS
Descrição dos solos utilizados
Foram utilizados quatro solos com teores de carbono crescentes, variando
entre 4,8; 9,9; 15,8; 29,2 g kg-1. Os solos foram provenientes de municípios do Agreste
paraibano, coletados em áreas sob uso agropecuário, com exceção do solo com maior
teor de carbono, que foi coletado em área de mata nativa (Floresta Atlântica de
Altitude). Em cada área foram coletadas vinte amostras simples na profundidade de 0-
20 cm, as quais foram agrupadas formando uma amostra composta. As características
químicas e físicas dos quatro solos são apresentadas na Tabela 1.
20
21
Comparação de doses de radiação γ de 60Co para esterilização dos
microorganismos do solo
Três sub-amostras contendo 20 g de cada um dos solos estudados foram acondicionadas
em sacos de polietileno, umedecidas até atingir 40% da capacidade de campo e, em
seguida, incubadas por 72h. Após esse período, as amostras foram colocadas em um
irradiador de 60Co (GammaCell 220 Excel) e irradiadas por períodos de 1,5; 2,5; 3,5; 4,5
e 6
22
Tabela 1. Caracterização química e física de quatro solos, com teores crescentes de carbono orgânico total, provenientes da região semi-árida do Nordeste brasileiro.
Solo C N P K Ca Mg Na pH (H2O) Densidade Areia Silte Argila
---g kg-1--- mg kg-1 -------- cmolc. kg solo-1 -------- g cm-3 --------------- % ---------------
1
4,8 0,46 0,6 0,18 1,75 1,10 0,14 6,4 1,20 83,0 11,0 6,0
2 9,9 0,85 6,0 0,13 2,08 1,35 0,13 5,8 1,16 73,3 13,4 13,3
3 15,8 1,27 3,1 0,16 2,25 1,28 0,14 5,5 1,08 66,3 12,6 21,1
4 29,2 2,38 1,9 0,18 1,27 1,18 0,08 4,6 0,94 47,0 10,0 43,0
h, de maneira a atingir doses de 15, 25, 35, 45 e 60 KGy, respectivamente. Essa metodologia
foi proposta por Powlson e Jenkinson (1975).
Os valores de carbono da biomassa microbiana das amostras irradiadas e do solo
controle não irradiado foram determinados de acordo com a metodologia descrita em Vance et
al.(1987).
A quantificação do carbono microbiano foi feita utilizando-se o método da oxidação
do carbono pelo permanganato de potássio, como agente oxidante, e a quantificação por
colorimetria em espectrofotômetro com comprimento de onda de 495 nm (Bartlett e Ross,
1988).
Para avaliar a eficiência de esterilização do solo pelas doses de radiação, foram
realizadas quantificações de fungos e bactérias, tanto nas amostras irradiadas com nas não
irradiadas. Para isso, sub-amostras de 10g de solo foram pesadas, transferidas para
Erlenmeyers, contendo 90 ml de solução salina de NaCl a 0,85%, e homogeneizadas em
agitador orbital por 1 hora. Posteriormente, foram realizadas diluições seriadas (10-1 a 10-5)
das suspensões obtidas, e alíquotas de 100µL foram distribuídas com o auxílio de alça de
Drigalsky, em placas de Petri, contendo meio de cultura Sabourand com ciclohexamida, na
concentração de 100 mg mL-1, para isolamento e quantificação de fungos, e meio de cultura
TSA com estreptomicina, na concentração de 100 mg.mL-1, para bactérias, conforme o
método descrito por Korn-Wendisch e Kützner (1992). Todo o procedimento foi realizado em
câmara de fluxo laminar. Após o plaqueamento, as placas foram incubadas a 30°C, em
câmara de crescimento tipo B.O.D., durante 24 h para bactérias e 48 a 72 h para fungos. As
colônias crescidas foram quantificadas com auxílio de um contador eletrônico de colônias.
Comparação de metodologias de esterilização para quantificação do carbono
microbiano do solo.
Antes de serem submetidas à esterilização e extração do carbono microbiano, as
amostras dos solos utilizados foram incubadas para recuperação do crescimento microbiano e
aumento da biomassa microbiana. Para isso, seis amostras contendo 20g de cada um dos
quatro tipos de solos foram acondicionadas em sacos de polietileno, umedecidas até atingir
40% da capacidade de campo e em seguida incubadas por 72 h. Para esterilização dos solos
foram comparados os métodos de fumigação com clorofórmio em dessecador, aplicação
direta de clorofórmio, radiação gama e radiação por microondas, conforme detalhado a seguir.
23
1) Fumigação em dessecador: consiste na esterilização dos microrganismos do solo com a
utilização do vapor do clorofórmio. Em um dessecador foi colocado um vidro de extrato,
contendo 20 g da amostra de solo úmido para ser fumigado, juntamente com um becker com
25 ml de clorofórmio e outro becker com água para manter a umidade. O dessecador foi
fechado e submetido o vácuo durante 2 a 5 minutos, até o borbulhamento do clorofórmio. Em
seguida, as amostras foram mantidas por 24 h no dessecador. Após esse período, foram
retirados os beckers contendo água e clorofórmio e fez-se novamente vácuo para retirar o
excesso do fumigante do solo (Vance et al., 1987; De-Polli e Guerra, 1999).
2) Aplicação direta de clorofórmio: foi aplicado 1 ml de clorofórmio diretamente nos frascos
contendo 20 g de solo, que em seguida foram vedados e incubados por 24 h. Após esse
período, os frascos foram abertos por 20 minutos em uma capela de exaustão para eliminação
do fumigante (Witt et al., 1998).
3) Radiação gama: As amostras foram irradiadas por 2,5 h, de maneira a atingir uma dose de
25 KGy (Powlson e Jenkinson, 1975).
4) Radiação por microondas: Amostras contendo 20g de solo foram irradiadas em aparelho de
microondas com tempo pré-determinado pelo cálculo da potência do aparelho de microondas
(Islam e Weil, 1998).
O carbono da biomassa microbiana foi determinado de acordo com a metodologia
descrita na seção anterior, com base em Vance et al. (1987) e a quantificação do carbono
microbiano foi feita utilizando-se o método descrito em Bartlett e Ross (1988). A
quantificação de fungos e bactérias foi realizada conforme o método descrito anteriormente,
baseado em Korn-Wendisch e Kützner (1992).
Análise estatística
Para a comparação das doses de radiação gama foi usado um delineamento
experimental inteiramente casualizado em esquema fatorial 5x4, sendo cinco doses de
radiação gama e quatro tipos de solo. Para a comparação dos métodos de esterilização de
microrganismos do solo foi utilizado um delineamento experimental inteiramente casualizado
em esquema fatorial 4x4, sendo quatro métodos de esterilização e quatro tipos de solo. Os
24
dados de contagem foram transformados em 1+x (Banzatto e Kronka 1992), e foram feitos
desdobramentos das interações entre os fatores, análises de variância e a comparação das
médias pelo teste de Tukey a 5% de significância. Para o fator dose foram realizadas análises
de regressão e ajustadas às equações com maior coeficiente de determinação. Os dados foram
analisados com o programa estatístico SISVAR Versão 4.6 (Ferreira, 2000).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Comparação de doses de radiação γ de 60Co
A radiação gama provocou a morte da maior parte dos microorganismos do solo já a
partir da dose mais baixa utilizada no presente estudo. O plaqueamento do extrato dos solos
irradiados demonstrou que a dose de 15 KGy foi capaz de reduzir em cerca de 99% as
unidades formadoras de colônias (UFC) nas placas incubadas, tanto fungos quanto de
bactérias, mas não esterilizou completamente os solos (Tabela 2). A dose de 25 KGy,
recomendada por Powlson e Jenkinson (1975), causou a completa esterilização dos solos,
independente dos teores de carbono, pelo menos no que diz respeito ao crescimento de
colônias de bactérias ou fungos. Como era de se esperar, também não houve formação de
colônias de bactérias e fungos nos extratos de solo das amostras irradiadas com doses acima
de 25 KGy, ou seja, 35, 45 e 60 KGy. Wolf et al. (1989) quando utilizaram doses entre 50 e
60 KGy observaram esterilização total de fungos e bactérias em solos com diferentes teores
de carbono total. É interessante mencionar que, nas amostras de solo não irradiadas, o solo 3,
apesar de não apresentar o maior valor de carbono total, foi o que apresentou maior número
de UFC dentre os solos estudados (Tabela 2).
Os valores de carbono microbiano dos quatro tipos de solos foram crescentes com o
aumento das doses de radiação gama aplicadas (Figura 1). Para os solos 1 e 3, as equações de
segundo grau foram as que melhor ajustaram as doses crescentes de radiação, apresentando
pontos da máxima de 53 e 60 KGy, respectivamente. No caso dos solos 2 e 4, as equações de
primeiro grau foram as que mais se ajustaram. Os valores de carbono microbiano obtidos com
a dose de 25 KGy foram, aproximadamente, 16, 62, 119 e 86 mg C kg-1 para os solos 1 a 4,
respectivamente. Observou-se que o solo 3 foi o que apresentou significativamente maior teor
de carbono microbiano após a irradiação com 25 KGy de radiação gama (Figura 1). Este
resultado é coerente com os resultados do plaqueamento (Tabela 2), que demonstram um
25
Tabela 2. Quantificação de bactérias e fungos presentes em quatro solos com teores crescentes de carbono orgânico, após esterilização com diferentes doses de radiação gama.
* UFC – Unidade Formadora de Colônias
Solos Teores de carbono no solo Doses de radiação gama (KGy)
0 15 25 35 45 60
----g kg-1---- -------------------- UFC* x 103 gss-1 --------------------
Bactérias
1 4,8 243 0,063 0 0 0 0 2 9,9 650 0,050 0 0 0 0 3 15,8 850 0,078 0 0 0 0 4 29,2 300 0,037 0 0 0 0
Fungos
1 4,8 3 0,013 0 0 0 0 2 9,9 28 0,017 0 0 0 0 3 15,8 28 0,015 0 0 0 0 4 29,2 8 0,010 0 0 0 0
26
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 10 20 30 40 50 60 70
Doses de Radiação (KGy)
Car
bono
(m
g kg
-1)
Solo1Solo2Solo3Solo4
Figura 1. Comparação dos teores de carbono extraídos de quatro solos com teores crescentes de carbono orgânico, após irradiação com cinco doses de radiação gama. Barras verticais representam à diferença mínima significativa.
27
maior crescimento de colônias para o solo 3, em comparação com os demais solos. Essa
diferença na relação entre o carbono total e o carbono microbiano é exatamente o parâmetro
que faz da biomassa microbiana um indicador útil para a avaliação da qualidade de diferentes
tipos de manejo ou de solo.
Nas doses acima de 25 KGy, observaram-se liberações crescentes de carbono,
indicando que a radiação gama poderia estar disponibilizando para extração frações de
carbono do solo que não a da biomassa microbiana, já que os microrganismos foram mortos
na dose de 25 KGy (Tabela 2). Esses resultados merecem uma análise mais cuidadosa, uma
vez que os dados obtidos indicam que doses acima de 25 KGy podem superestimar os valores
de carbono microbiano do solo. Em decorrência disso, é também possível que a radiação
gama venha a ser uma ferramenta útil para extrair frações lábeis da matéria orgânica do solo,
além do carbono da biomassa microbiana. Por exemplo, no caso do solo 1, essa extração
adicional em doses acima de 25 KGy foi relativamente menor (182% a mais de carbono para
a dose de 60 KGy), talvez pelo fato desse solo ter sido intensamente cultivado por vários
anos, ter menor quantidade de carbono total e, conseqüentemente, menos carbono lábil a ser
extraído pelas doses adicionais de radiação. Comportamento semelhante foi observado para o
solo 3, mas com extração de carbono superior à do solo 1 (203% a mais de carbono para a
dose de 60 KGy). Já nos solos 2 e 4, os valores de carbono não se estabilizaram após a dose
de 25 KGy e cresceram linearmente até a última dose, de 60 KGy (375 e 398% a mais de
carbono, respectivamente), indicando que ainda seria possível extrair mais carbono com doses
maiores que 60KGy. Entretanto, são necessários estudos adicionais mais detalhados para
testar a hipótese do uso da radiação gama para a extração de frações lábeis da matéria
orgânica do solo.
Comparação de metodologias de esterilização para quantificação do carbono microbiano do
solo
O teor de carbono orgânico total do solo teve influência significativa sobre a
comparação dos métodos de esterilização do solo e determinação do carbono da biomassa
microbiana. No caso do solo com menore teor de C total (solos 1), não foi observado
diferença nos teores de carbono microbiano entre os métodos testados (Tabela 3). No entanto,
para o solo 3, o teor de carbono da biomassa microbiana foi significativamente maior após
esterilização do solo com radiação gama do que com os métodos de fumigação em
dessecador, a aplicação direta de clorofórmio e com o método radiação por microondas.
28
Tabela 3. Quantificação do carbono da biomassa microbiana de solos com teores crescentes de carbono, utilizando-se diferentes metodologias de esterilização.
1Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Letras maiúsculas comparam dentro de cada linha e minúsculas dentro de cada coluna.
Metodologias
Solo Teores de Carbono
Fumigação direta
Fumigação em dessecador Microondas Radiação
gama
---g kg-1---
---------------------------- mg C kg solo-1 ----------------------------
1
4,8
14,8 Ab1
16,1 Ac
22,5 Ac
22,6 Ac
2
9,9
69,4 Aa
46,0 Bb
64,7 ABb
74,03Ab
3
15,8
63,6 BCa
56,5 Cb
81,6 Bab
107,3 Aa
4
29,2
71,8 Ba
85,3 ABa
92,8 Aa
97,1 Aa
29
De uma maneira geral, os métodos de esterilização do solo foram capazes de
detectar as diferenças dos teores de carbono microbiano dos quatro solos com valores
crescentes de carbono orgânico total.
Os resultados do plaqueamento mostraram claramente que os métodos do
microondas e da radiação gama foram capazes de eliminar completamente os fungos e
bactérias dos solos estudados, enquanto os dois tratamentos com clorofórmio não foram
eficazes na eliminação dos microrganismos do solo (Tabela 4). Wolf et al. (1989) também
realizaram o plaqueamento após a esterilização dos microrganismos com diferentes métodos e
observaram esterilização total de fungos e bactérias, quando utilizaram entre 50 e 60 KGy de
radiação com uma fonte de 60Co em solos com diferentes teores de carbono total, enquanto a
fumigação em dessecador não foi capaz de eliminar os fungos e bactérias.
Comparando-se a esterilização entre os dois tratamentos com uso de clorofórmio,
observaram-se significativamente mais UFC de bactérias no método de utilização de vapor de
clorofórmio em dessecador, enquanto houve mais UFC de fungos após a utilização da
aplicação direta do clorofórmio ao solo (Tabela 4). Contrário ao esperado, após a aplicação
direta, observou-se um maior número de UFC de bactérias para o solo 1, e não para os demais
solos, que continham maior UFC no solo não esterilizado (Tabela 4). No caso dos fungos,
observaram-se mais UFC no solo 2, para os dois tratamentos com fumigação, mas o solo não
esterilizado mostrou maior UFC para os solos 2 e 3. Observou-se uma deficiência de
informações sobre os reais efeitos de diferentes métodos de esterilização do solo, pois a
maioria dos trabalhos emprega a quantificação do carbono da biomassa microbiana como
indicativo de qualidade destes métodos de esterilização, sem posteriormente proceder à
quantificação dos microrganismos para verificar a sua eficácia.
30
Tabela 4. Quantificação de bactérias e fungos em solos com teores crescentes de carbono, depois de submetidos os diferentes métodos de esterilização.
Metodologias
Solo
Teores de Carbono
Não Esterilizado
Fumigação Direta
Fumigação Dessecador Microondas Radiação
gama
---g kg-1--- --------------------------- UFC* x 103 gss-1 ---------------------------
Bactérias
1 4,8 243 23 Ba1 42 Aa 0 Ca 0 Ca 2 9,9 650 11 Bb 37 Aa 0 Ca 0 Ca 3 15,8 850 13 Bab 33 Aa 0 Ca 0 Ca 4 29,2 300 11 Bb 32 Aa 0 Ca 0 Ca
Fungos
1 4,8 3 5 Ac 0,5 Bb 0 Ca 0 Ca 2 9,9 28 10 Aa 3 Ba 0 Ca 0 Ca 3 15,8 28 7,5 Ab 0,5 Bb 0 Ca 0 Ca 4 29,2 8 7,5 Ab 0,5 Bb 0 Ca 0 Ca
1Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Letras maiúsculas comparam dentro de cada coluna e minúsculas dentro de cada linha. * UFC – Unidade Formadora de Colônias
31
CONCLUSÕES
1. A dose de radiação gama mais adequada para esterilização dos solos utilizados no
presente estudo foi de 25 KGy, independente do teor de carbono dos solos. Doses de
radiação gama superiores a 25 KGy, aparentemente extraíram carbono de outros
compartimentos do solo, o que poderia superestimar os valores do carbono microbiano do
solo.
2. Os métodos de radiação em microondas e radiação gama mataram completamente os
fungos e bactérias nos solos estudados, independente do teor de carbono, enquanto os
métodos de fumigação com clorofórmio em dessecador e aplicação direta de clorofórmio
não esterilizaram completamente os solos.
3. O método de radiação por microondas parece ser o mais prático e viável, em virtude da
maior acessibilidade aos equipamentos e menor tempo de execução que o método de
radiação gama.
32
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