da biologia molecular à medicina: métodos comumente utilizados

DA BIOLOGIA MOLECULAR À MEDICINA: MÉTODOSCOMUMENTE UTILIZADOS EM FARMACOGENÉTICA

FROM MOLECULAR BIOLOGY TO MEDICINE: METHODS COMMONLY USED IN PHARMACOGENETICS

Mario Hiroyuki Hirata1, Vladimir Tavares2, Rosario Dominguez Crespo Hirata1

1Docentes. 2Doutor do Programa de Pós-Graduação em Farmácia – Analises Clinicas. Departamento de Análises Clínicas e Toxicoló-gicas. Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP.Correspondência: Prof. Dr. Mario H. Hirata. Av. Prof. Lineu Prestes, 580 B. 17,CEP 05508-900 São Paulo - SP. Tel.: (11) 3091-3634 - FAX: (11) 3813-2197 - E-mail: [email protected]

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC. Da biologia molecular à medicina: métodos comumente utilizados emfarmacogenética. Medicina (Ribeirão Preto) 2006; 39 (4): 522-34.

RESUMO: Nesta revisão, foram discutidos os procedimentos para obtenção, manuseio earmazenamento de amostras biológicas úteis em testes moleculares. Métodos para triagem edetecção direta de mutações e polimorfismos genéticos foram apresentados. Os princípios,estratégias, aplicações e limitações de variações da reação em cadeia pela polimerase (PCR),tais como eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE), polimorfismo de confor-mação de fita simples (SSCP), polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrição (RFLP),amplificação alelo oligonucleotídeo-específica (PCR-ASO), PCR em tempo real PCR, arranjosde DNA e outras técnicas moleculares, foram comentados.

Descritores: Farmacogenética. Reação em Cadeia da Polimerase. Polimorfismo Conforma-cional de Simples Fita. Polimorfismo de Fragmento de Restrição. DNA- Arranjos. Eletroforeseem Gradiente em Gel Desnaturante.

522

Medicina, Ribeirão Preto, Simpósio: FARMACOGENÉTICA39 (4): 522-34, out./dez. 2006 Capítulo II

ABREVIATURAS

PCR, reação em cadeia pela polimeraseSouthern blot, técnica de transferência de DNA

RFLP, polimorfismo de tamanhos de frag-mentos de restrição

SDS, duodecil sulfato de sódioDEPC, dietilpirocarbonatoDGGE, eletroforese em gel com gradiente de

desnaturaçãoSSCP, polimorfismo de conformação de fita

simplesHDA, análise de heteroduplexCCM, método da clivagem químicaPTT, teste da proteína truncada

PCR-ASO, amplificação alelo oligonucleotídeo-específica

1- INTRODUÇÃO

A procura pela terapêutica individualizada ecom o menor risco de efeitos indesejáveis ou colate-rais sempre foi uma meta dos médicos, farmacologis-tas, farmacêuticos. Para isso têm sido pesquisadasnovas formas e formulações farmacêuticas procuran-do aumentar a eficácia e reduzir a toxicidade dos me-dicamentos. No entanto, até recentemente, os estu-dos dirigidos com abordagem genética de pacientesforam pouco explorados. A descrição da seqüênciacompleta do genoma humano trouxe perspectivas deaplicações potenciais das informações do genoma,transcriptoma e proteoma para o estudo de novos al-vos terapêuticos e da possibilidade, em um futuro bre-ve, de uso da medicação individualizada.

A abordagem de métodos utilizados no estudo

523

Métodos moleculares em farmacogenética

da farmacogenética será realizada de forma sucinta eclara para facilitar a compreensão e estimular o leitor aampliar seu conhecimento procurando textos mais es-pecíficos e aprofundados em cada tema apresentado.Os assuntos estão divididos em tópicos que abrangemprocedimentos de obtenção de amostras, métodos ex-tração de ácidos nucléicos e métodos de triagem demutações e de estudo de polimorfismos genéticos.

2- PROCEDIMENTOS DE OBTENÇÃO DEAMOSTRAS

Os procedimentos de obtenção de amostras bi-ológicas são parte da fase pré-analítica dos estudosfarmacogenéticos. Nessa fase, são obtidas informa-ções sobre indivíduo que está participando do estudoque incluem o tipo de material biológico a ser coletado,horário de coleta, procedimento de coleta do material,forma de transporte e armazenamento da amostra, alémde dados pessoais como sexo, idade, etnia, dieta, usode medicamentos e outras características necessáriaspara análise dos resultados. Estas informações dire-cionarão a maneira que deve ser obtida e conservada,para que ao proceder a análise não se tenha dúvida doresultado que possa ser gerado nos processo analítico.

Na fase pré-analítica, é primordial que se verifi-quem os tipos testes a serem realizados e o ácido nu-cléico a ser isolado para utilizar os procedimentos maisadequados de conservação e armazenamento paramanter a integridade da amostra biológica1. É impor-tante ter em mente que os cuidados no processamentode amostras para obtenção de DNA são distintos dosutilizados para a extração de RNA. Para o isolamentode DNA, as amostras biológicas podem ser refrigera-das em temperaturas que variam entre 4 a 10°C. Poroutro lado, para a análise de RNA as amostras devemser imediatamente conservadas em temperatura ultra-baixa (-70 a -80 oC), exceto se a extração do RNA forrealizada imediatamente. Recomenda-se também aadição de um conservante de RNA na amostra a serarmazenada, geralmente fornecido comercialmente.

Uma outra observação importante nesta etapaé a escolha do material descartável a ser utilizado paraa conservação da amostra, se for conservada em ni-trogênio líquido, ou em congelador de ultra-baixa tem-peratura, os tubos a serem utilizados devem ser resis-tentes nessa temperatura e ter tampa de rosca comanel de vedação, de boa procedência, e isentos deRNAse e DNAses.

As amostras de tecidos a serem utilizadas paraestudos histológicos ou “in situ” devem ser congela-

das no criostato do micrótomo e imediatamente pro-cessadas e transferidas para tubos termo-resistentes,mantidos em gelo seco, se possível com conservantepara RNA. A seguir, os tubos devem ser armazena-dos a -80 oC. Caso a amostra tiver que ser emblocadaem parafina para estudos anatomo-patológicos, o ma-terial biológico deve ser mergulhado em formol (deboa procedência) tamponado com tampão fosfato empH=7,0 a 7,4, recém preparado. Ressalta-se a impor-tância da averiguação da pureza do formol, pois quan-do se encontra armazenado de forma inadequada, podeconter excesso de ácido fórmico que degrada os áci-dos nuclécos. Ao se utilizar a solução de formol, deve-se vaporizar nitrogênio dentro do frasco e fechar her-meticamente para aumentar a estabilidade do formol.

As amostras de células em cultura podem serarmazenadas para análise futura, em tubos termo-re-sistente, com uma prévia lavagem das células em tam-pão fosfato pH 7,4 e, posteriormente em tampão Tris-EDTA, pH 8,0.

Amostras de órgãos como fígado, rins, cora-ção, entre outros que retém volume de sangue relati-vamente grande devem ser rapidamente limpos porperfusão com salina tamponada gelada e o excessode salina e membranas aderidas devem ser rapida-mente retiradas. As amostras devem ser congeladasimediatamente em nitrogênio liquido e armazenadasem congelador -70 oC.

Amostras de sangue periférico podem ser co-lhidas com o anticoagulante EDTA ou citrato. Paraextração de DNA a amostra pode ser conservadaapenas em temperatura de 4 oC a 10 oC. Amostras decoágulo também podem ser utilizadas para extraçãode DNA, mas devem ser armazenadas a -20 oC antesdo processamento.

3- MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE ÁCIDOSNUCLEICOS

Os estudos genéticos requerem ácidos nucléicosíntegros e isento de contaminantes e interferentes quepossam prejudicar os testes moleculares. Métodoscomo a reação em cadeia pela polimerase (PCR), atécnica de transferência de DNA (Southern blot) eoutros utilizados no estudo de polimorfismo de tama-nhos de fragmentos de restrição (RFLP) podem so-frer interferências significativas se a obtenção do DNAestiver comprometida.

Os métodos de isolamento e purificação dosácidos nucléicos consistem de três etapas: (1) lise dascélulas e solubilização do DNA ou RNA; (2) método

524

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC

enzimático ou químico para remover as proteínascontaminantes e outras macromoléculas; e (3) preci-pitação alcoólica para isolamento do DNA2. Os pro-tocolos básicos geralmente são aplicáveis a uma am-pla variedade de materiais.

3.1- Extração de DNA genômico de leucócitos

A extração de DNA dos leucócitos humanostornou-se uma realidade nos laboratórios que estudamdoenças genéticas. Os métodos atualmente disponí-veis possibilitam recuperar o DNA de alto peso mole-cular, sendo simples, rápidos e econômicos com ren-dimentos adequados para uso rotineiro.

O protocolo mais adequado à rotina laboratorialpara avaliação de polimorfismos e mutações genéti-cas compreende a lise celular com detergentes, remo-ção das proteínas por precipitação com cloreto de só-dio concentrado (salting-out) e isolamento do DNAgenômico por precipitação etanólica3. A utilização dedetergentes, como Triton X-100 e duodecil sulfato desódio (SDS), evita o uso de solventes orgânicos peri-gosos e o alto custo e demorada digestão da proteínaseK. O rendimento e a integridade do DNA extraído sãoexcelentes quando comparados com os de outros mé-todos de extração. O DNA é apropriado para as téc-nicas moleculares como a PCR e RFLP. Atualmentesão utilizados produtos comerciais disponíveis no mer-cado que minimizam erros de procedimentos resultan-tes de reagentes produzidos no laboratório.

3.2- Extração de DNA genômico de tecidos ecélulas

O método básico compreende a ruptura do te-cido com um homogeinizador, a lise celular com o de-tergente iônico SDS, extração fenólica das proteínas(atualmente se substitui por cromatografia de afinida-de) e precipitação etanólica do DNA. Este método éútil para preparação de DNA genômico de muitasamostras de tecido ou de linhagens celulares, com ummínimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA ge-nômico produzido é adequado para amplificação pelaPCR ou para a digestão com enzimas de restrição eanálise de transferência de DNA. Uma quantidadesubstancial de RNA acompanha o DNA genômico, oque dificulta a quantificação por espectroscopia no UV.Para eliminar o RNA residual, a preparação deve sertratada com RNase isenta de DNAse que está pre-sente na maioria dos reagentes comerciais.

Outro método compreende a solubilização dostecidos ou células com SDS que inativa as DNAsesendógenas. A proteínase K é usada para digerir as

proteínas celulares, seguidas de digestão com RNasepara remover a maioria do RNA celular. O isolamen-to do DNA segue basicamente o princípio anterior.Este método é adequado para extrair DNA genômicopara análise de DNA por Southern blot ou constru-ção de bibliotecas genômicas. Porém não é adequadopara extrair DNA de tecidos, pois não há etapa deruptura do tecido conjuntivo.

3.3- Extração de RNA de células ou de amostrasbiológicas

A maioria dos métodos de extração de RNA ésemelhante aos utilizados na obtenção de DNA, excetoque 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineira-mente para precipitação do RNA. É essencial que todaágua usada diretamente ou nos tampões seja tratada comdietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases.

O método mais adequado para preparar RNAde boa qualidade envolve a solubilização simultâneado tecido ou células e inativação de RNases endóge-nas na presença de isotiocianato de guanidina, comsubsequente isolamento do RNA por centrifugação emgradiente de cloreto de césio. Dois outros métodosque não requerem ultracentrifugação podem ser utili-zados: (1) lise com detergente não-iônico para pro-porcionar um método rápido para preparação de amos-tras de RNA citoplasmático e (2) lise celular comisotiocianato de guanidina, remoção das proteínas pelaextração fenólica em pH ácido, seguida de precipita-ção do RNA2. O segundo método é freqüentementeutilizado para isolamento de genoma dos vírus RNA apartir de amostras biológicas.

A análise e quantificação de RNA total é parti-cularmente importante para os estudos com RNAm.É recomendável que se obtenha RNA com alto índicede pureza, ou seja razão OD260/OD280 igual ou maiorque 1,9 e sem contaminação por DNA2. Os métodosde extração de RNA que utilizam colunas de afinida-de para RNA e tratamento da amostra com DNaseisenta de atividade RNase fornecem RNA total comalto grau de pureza. O RNAm pode ser purificado apartir de preparações de RNA total por cromatogra-fia com oligo-dT celulose.

4- MÉTODOS DE TRIAGEM DE MUTAÇÕES

Vários métodos para a triagem de mutações deponto, pequenas deleções ou inserções foram descritos.Para a escolha de um destes métodos, algumas conside-rações devem ser observadas, tais como: o tipo de áci-do nucléico a ser utilizado, o tipo de material biológico

525


(sangue periférico, medula óssea, tecidos, secreçõesou excreções), o conhecimento ou não da mutação a serpesquisada, a confiabilidade do método a ser utilizadoe que método é mais rápido e economicamente viável.

Um dos métodos moleculares mais utilizados natriagem de mutações é a PCR, reação que possibilitaproduzir milhares de cópias de segmentos de ácidosnucléicos in vitro utilizando uma enzima DNA polime-rase termoestável4. A Taq DNA polimerase apresen-tando índice de erro de incorporação que varia de 10-4 a10-5 por nucleotídeo, sendo amplamente afetada pelascondições da reação (concentração do cloreto de mag-nésio, dNTPs, pH e temperatura). Dependendo dométodo a ser utilizado, os erros da DNA polimerasepodem reduzir a especificidade da PCR, particular-mente nos casos em que a freqüência de alelos rarosé baixa5. Embora a probabilidade seja baixa, os errospodem ser interpretados como mutações quando asanálises são realizadas com pequeno número inicial demoléculas de DNA molde (< 100 moléculas)5.

É importante ressaltar que os resultados dosmétodos de triagem de mutações devem ser confir-mados por seqüenciamento de DNA, pois é um méto-do definitivo para a detecção de mutações6.

4.1- Eletroforese em gel com gradiente de des-naturação (DGGE)

A triagem de mutações por DGGE (DenaturingGradient Gel Electrophoresis) é um método no quala dupla fita de DNA é submetida à eletroforese emgel de poliacrilamida em que utiliza um gradiente deagente desnaturante (uréia ou formamida) ou de tem-peratura7. Nestas condições, ocorre a separação dasmoléculas de DNA de acordo com sua temperaturade desnaturação ou melting temperature (Tm), emsegmentos denominados domínios. A dissociação dasfitas de DNA em tais domínios resulta em diminuiçãoda mobilidade eletroforética (Figura 1). A diferençade 1 par de bases entre as fitas de DNA (homoduplex)pode alterar a temperatura de desnaturação em 1 ºCou mais. A falta de complementaridade de bases en-tre as fitas de DNA (heteroduplex) leva a significan-te desestabilização desses domínios, resultando emdiferenças na Tm entre homo e heteroduplex acimade 6 ºC. Por esta razão, heteroduplex formadas en-tre fragmentos de alelos comuns e mutantes são ge-ralmente utilizados para a triagem de mutações deponto (Figura 2).

Selvagem Mutado

Fragmentos amplificados pela PCR

Selvagem

+

Mutante

Moléculas heteroduplex

Selvagem Mutante HeteroduplexT

C

G

A

T

A

G

CGel com gradiente de desnatura ção

Eletroforese

Selvagem MutadoFragmentos

amplificados pela PCR

Selvagem

+

Mutante

Moléculas heteroduplex

Selvagem Mutante HeteroduplexT

C

T

C

G

A

T

A

T

A

G

C

G

CGel com gradiente de desnatura ção

Eletroforese

Figura 1. Esquema da triagem de mutações por eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE).

526


Para detecção no DGGE, os produtos da PCRsão marcados com substâncias radioativas7. Atualmen-te, esse sistema foi substituído por coloração dos pro-dutos com brometo de etídeo ou nitrato de prata.

No método DGGE, podem ser feitas modifica-ções para aumentar o número de domínios a seremanalisados. Uma estratégia é o acoplamento seqüên-cias ricas em GC em um dos oligonucleotídeos na PCR(GC clamp), conseqüentemente, mais mutações sãodetectadas por DGGE para diferentes finalidades8,9.

O tamanho do produto da PCR submetido aoDGGE é de aproximadamente 1000 pares de bases(pb). Com o aumento do número de domínios, a mobi-lidade diminui, por isto, a fração de mutações detecta-das diminui com o aumento do tamanho do fragmen-to. O limite de detecção do DGGE parece não serinfluenciado pela baixa freqüência de alelos mutantesna presença de alta frequencia de alelos comuns.

4.2- Polimorfismo de conformação de fita sim-ples (SSCP)

O SSCP (Single-Strand Conformation Poly-morphism) é um método de triagem de mutações quepermite detectar alterações na mobilidade eletroforé-tica de fitas simples de ácidos nuclécos em condiçõesnão-desnaturantes10 (Figura 3). As fitas simples de áci-

1 2 31 2 3

Figura 2. Autorradiograma de produtos da PCR separados porDGGE para a triagem de mutações.

1- Selvagem, 2- Heteroduplex, 3- Mutante

dos nucléicos formam estruturas secundárias em so-lução que dependem da composição/seqüência de ba-ses e do tamanho da fita simples. Mudança em umabase na seqüência do ácido nucléico amplificado pelaPCR pode ser detectada por SSCP. Os perfis de SSCP

CCC

GGG

CCC

GGG

CCC

GGG

TTT

AAA

CCC

GGG

TTT

AAA

SelvagemSelvagemSelvagem MutanteMutanteMutante

CCC

PCRPCR

AAA

TTT

EletroforeseEletroforese

SS MM

CCC

GGG

GGG

CCC

GGG

CCC

GGG

CCC

GGG

CCC

GGG

CCC

GGG

CCC

GGG

TTT

AAA

TTT

AAA

CCC

GGG

CCC

GGG

TTT

AAA

TTT

AAA

SelvagemSelvagemSelvagem MutanteMutanteMutante

CCCCCC

PCRPCR

AAAAAA

TTTTTT

EletroforeseEletroforese

SS MMSS MM

CCC

GGG

CCC

GGG

GGGGGG

Figura 3. Esquema de triagem de mutações por polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP).

527


podem ser detectados por autorradiografia marcan-do-se os produtos da PCR com substâncias radiativas.Atualmente são utilizados os sistemas de detecção porcoloração dos géis de eletroforese com nitrato de pra-ta (Figura 4).

O SSCP foi inicialmente descrito para analisarDNA, entretanto, a análise do RNA também é possí-vel11. Estruturas secundárias distintas são formadascom maior freqüência pelo RNA do que por molécu-las de DNA e fragmentos maiores podem ser analisa-dos. As mutações detectadas por SSCP devem serconfirmadas por sequenciamento de DNA6. Além dis-so, em várias aplicações, sistemas eletroforéticos comgéis de tamanhos menores são utilizados em substitui-ção aos sistemas eletroforéticos padronizados paraseqüenciamento de DNA12.

A sensibilidade de detecção de mutações porSSCP é maior quando os tamanhos dos produtos daPCR são de 150 a 200 pb13. O número de mutaçõesdetectáveis diminui quando fragmentos maiores sãoanalisados. A triagem de mutações de produtos maio-res sem prejudicar significativamente a sensibilidadedo método pode ser alcançada utilizando-se RNA-SSCP11.

A eletroforese é realizada em gel de poliacrila-mida não-desnaturante. Dependendo da concentraçãoda poliacrilamida, do tamanho do fragmento e da pre-sença de glicerol no gel, o tempo de separação variade 2 a 6 horas. A resolução é maior em sistemas degéis especiais comercialmente disponíveis14. A análi-se de um fragmento sob diferentes condições podeaumentar o índice de detecção de mutações, sendoque as condições ideais devem ser determinadas em-piricamente. O limite de detecção depende do tama-nho do produto da PCR (< 200 pb) e da execução daeletroforese em pelo menos duas temperaturas ou doistampões de eletrodos no sistema eletroforético. Nes-sas condições 80 a 90% de mutações são detectáveispor SSCP15.

4.3- Análise de heteroduplex (HDA)

A HDA (Heteroduplex Analysis) se funda-menta na separação de fitas híbridas de DNA por sis-tema eletroforético não-desnaturante16. As fitas du-plas de DNA (produtos da PCR) de amostras commutação são desnaturadas por aquecimento e, a se-guir, são hibridizadas com amostras sem mutação, for-mando-se hibridos homoduplex e heteroduplex. Asmoléculas híbridas são separadas por eletroforese emgel poliacrilamida não-desnaturante, sendo que as mo-léculas homoduplex e heteroduplex apresentam di-

ferentes migrações eletroforéticas (Figura 5). A de-tecção desses produtos pode ser realizada por colora-ção com brometo de etídeo ou nitrato de prata.

A resolução de HDA pode ser aumentada uti-lizando-se géis especiais (MDE© gel) que estão dis-poníveis comercialmente17. Melhor definição das ban-das pode ser obtida pela separação das mesmas napresença de uréia (15%). O tamanho do produto dePCR detectado por HDA varia entre 200 a 600 pb,entretanto, a detecção de mutações para produtos comtamanho acima de 900 pb tem sido realizada15.

O limite de detecção de mutações por HDAdependente principalmente da posição e do tipo de baseque não apresenta complementaridade. Foram des-critas diferentes mutações através da aplicação destametodologia, com o poder de detecção variando emtorno de 80%16. O limite de detecção depende da in-tensidade do sinal e da separação das heteroduplexe homoduplex.

O tempo de eletroforese em gel de poliacrila-mida não-desnaturante pode variar entre 14 a 30 ho-ras, dependendo do tamanho do produto da PCR. Otempo pode ser reduzido utilizando-se eletroforese emcapilar18.

4.4- Método da clivagem química (CCM)

O método CCM (Chemical Cleavage Method)se fundamenta na clivagem de seqüências específi-cas de DNA heteroduplex por agentes químicos. Osprodutos da PCR em heteroduplex formados entreamostras com e sem mutação apresentam desparea-mento no ponto da mutação que é vulnerável a modi-

1 2 3 41 2 3 4

Figura 4. Perfis de SSCP de produtos da PCR separados poreletroforese em gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata.

1- MUTANTE2- MUTANTE

3- NORMAL4- NORMAL

528


ficações químicas (por exemplo, hidroxilamina modi-fica citosina não pareada). Os híbridos DNA:DNAformados são clivados pela piperidina em sítios demodificação química (Figura 6). Os pontos de muta-ção geram fragmentos de clivagem são analisados poreletroforese19,20.

Originalmente o método foi descrito para anali-se de DNA:DNA (heteroduplex), porém, pode tam-bém ser aplicado para a analise de DNA:RNA(heteroduplex)20. A CCM permite analisar produtoscom tamanho superior a 2 kb. Utilizando-se substân-cias fluorescentes, uma célula mutante pode ser de-tectada em dez células normais19. O sistema de de-tecção inicialmente proposto era por marcação dosfragmentos com 32P ou 35S. Quando pequenas quanti-dades de alelos mutantes são analisadas na presençade grandes quantidades de alelos comuns, a sensibili-dade pode ser aumentada pela separação e detecçãode fragmentos marcados com substâncias fluorescen-tes e detectados num aparelho para seqüenciamentoautomático21.

A vantagem do método CCM é que todos ospontos de mutação são detectados quando as fitas

sense e antisense são analisadas. As desvantagenssão a utilização de substâncias tóxicas para fazer aclivagem e a limitação do potencial de automação.

4.5- Teste da proteína truncada (PTT)

O seqüenciamento do genoma humano desper-tou grande interesse na área da proteômica. Sistemasde expressão livre das células podem ser utilizadoscomo ligação entre genômica e proteômica pela con-versão de seqüências de ácidos nucléicos em proteí-nas. A aplicação destes sistemas de expressão in vi-tro para a detecção de mutações é referida como PTT(Protein Truncation Test)22. Este método é útil paraa detecção de mutações que alteram a fase de leitura(reading frame) da proteína expressa e que gera umproduto protéico menor.

O método PTT envolve a transcrição reversa(RT) onde o RNA é utilizado para produzir cDNA(DNA complementar). A seguir, utilizando-se da PCRcom um oligonucleotídeo sense que inclui sinal apro-priado para transcrição e tradução, é produzido umproduto que codifica uma proteína funcional. Acoplan-do os produtos da PCR com um sistema transcrição e

Selvagem (wild-type)

G C T A

Mutante

+

G A T C

G C T A

Heteroduplex

Homoduplex

Desnaturação

Hibridização

SS MM

Eletroforese

Selvagem (wild-type)

G CG C T AT A

Mutante

+

G AG A T CT C

G CG C T AT A

Heteroduplex

Homoduplex

Desnaturação

Hibridização

SS MMSS MM

Eletroforese

Figura 5. Esquema de triagem de mutações por análise de heteroduplex (HET).

529


tradução in vitro, que inclui RNA polimerase, amino-ácidos marcados por radiativos, ribossomos e tRNAs,são produzidos peptídeos marcados a partir dos pro-dutos da PCR moldes (Figura 7). Os peptídeos mar-cados são separados por sistema de eletroforese emgel de poliacrilamida com desnaturante (SDS). A de-tecção de uma banda, na eletroforese, com menor pesomolecular que a proteína natural indica a presença deum polipeptídio truncado que corresponde a uma mu-tação de fase de leitura que introduziu um códon deparada na seqüência de DNA. A mutação poderá serconfirmada por sequenciamento de DNA.

O método pode iniciar com a transcrição reversado RNAm e o cDNA resultante amplificado pelaPCR. Rearranjos grosseiros e mutações que afetamo processamento do RNA também podem ser detec-tados pela análise dos produtos da RT-PCR23. O ta-manho do produto de PCR pode variar entre 4 e 5 kbcom bom desempenho nas reações subseqüentes detranscrição e tradução23.

O método PTT é particularmente adequado paragenes nos quais a maioria das mutações (> 80%) re-sulta em proteínas truncadas23. Até o momento, não

se conhece qual a relação entre alelos mutantes enormais que pode ser analisada.

Neste sistema poderão aparecer bandas adici-onais, provavelmente devido a isoformas que podemcomplicar a interpretação dos resultados. Portanto,diferenças na mobilidade eletroforética de proteínastruncadas e não truncadas podem ser analisadas visu-almente. Desde que PTT envolve certo número depassos (RT-PCR, transcrição e tradução in vitro eeletroforese), um controle positivo interno deve serincluído.

5- MÉTODOS DE ESTUDOS DE POLIMOR-FISMOS GENÉTICOS

A detecção direta de mutações e polimorfis-mos genéticos de nucleotídeo único (SNPs) é realiza-da por métodos que permitem a identificação da se-qüência de DNA alterada. Esses métodos são tam-bém utilizados para confirmação de mutações detec-tadas por métodos de triagem. Algumas das estraté-gias mais utilizadas nos estudos de polimorfismos ge-néticos são descritas neste tópico.

CCC

GGGAAA

TTT

Selvagem (Wild-type) Mutado

AAA

GGG

M

SHeteroduplex 1

M

SHeteroduplex 2

(marcada)

+

Eletroforese

CC

TT*

*

*

*Somente os fragmentos marcados são detectados

CCC

GGGAAA

TTT

Selvagem (Wild-type) Mutado

AAA

GGG

M

SHeteroduplex 1

M

SHeteroduplex 2

(marcada)

+

Eletroforese

CC

TT*

*

*

*Somente os fragmentos marcados são detectados

Figura 6. Esquema de triagem de mutações por Clivagem Química.

530


5.1- Polimorfismo de tamanhos de fragmentos derestrição (RFLP)

O RFLP (Restriction Fragment LenghtPolymorphysm) é um método que utiliza enzimas derestrição para detecção de mutações e polimorfismosgenéticos24. As enzimas de restrição reconhecem síti-os específicos na seqüência do DNA que é clivadasomente quando o sítio está presente, gerando frag-mentos de vários tamanhos que são separados e ana-lisados por eletroforese.

Os tamanhos de fragmentos gerados são muitovariáveis. Originalmente este método foi utilizado noSouthern Blot para detecção de grandes fragmentosde DNA. Nesta aplicação, o DNA genômico é frag-mentado utilizando-se enzimas de restrição e os frag-mentos são separados por eletroforese em gel de aga-rose de alta resolução. Posteriormente os fragmentosde DNA são transferidos a uma membrana de nylon ehibridizados com sondas marcadas que contem seqüên-cias complementares ao loco gênico a ser estudado.Os fragmentos hibridizados são identificados porautorradiografia ou outro sistema de detecção.

Com o advento da PCR e do conhecimento edisponibilidade das seqüências de DNA em bancos ge-nômicos, o método passou a ser utilizado no formato dePCR-RFLP (Figura 8) que permite analisar fragmentosde tamanhos menores25. Quando as mutações ou poli-morfismos não estão presentes em sítios de restrição,podem ser criados sítios artificiais utilizando-se oligonu-cleotídeos modificados na PCR. Esta estratégia é de-nominada mutagenese sitio-dirigida mediada pela PCR26.

Os fragmentos gerados no RFLP podem serdetectados por eletroforese e transferência de DNAcomo é o Southern blot. No caso da PCR-RFLP, osfragmentos são separados por eletroforese em gel deagarose ou acrilamida e detectados diretamente pelacoloração com brometo de etídeo ou outro corantefluorescente como o SYBR Gold ou ainda por colo-ração com nitrato de prata. O limite de detecção daPCR-RFLP é de uma célula mutante pode ser detec-tada entre cinqüenta a cem células normais27.

A especificidade do método é de 100% quandoa enzima de restrição apropriada é utilizada. Para ocontrole de qualidade, amostras de DNA contendoalelos mutantes e comuns devem ser incluídos na aná-

RNA

Transcri ção reversa

cDNA

PCR

MOLDE – transcri ção/tradu ção

Transcri ção/tradu ção in vitro

Produtos protéicos

Separação das proteinas – SDS-PAGE

Selvagem

Mutado

Autorradiografia

RNA

Transcri ção reversa

cDNA

PCR

MOLDE – transcri ção/tradu ção

Transcri ção/tradu ção in vitro

Produtos protéicos

Separação das proteinas – SDS-PAGE

Selvagem

Mutado

Autorradiografia

Figura 7. Esquema de triagem de mutações por Teste da Proteína Truncada (PTT).

531


lise. O método também deve ser ajustado para condi-ções que não permitam que resultados falsos positi-vos sejam obtidos quando quantidade variável e dife-rentes proporções de DNA mutante e selvagem este-jam sendo analisadas. Resultados questionáveis de-verão ser confirmados por repetição dos testes e se-qüenciamento de DNA.

5.2- Amplificação Alelo Oligonucleotideo-Espe-cífica (PCR-ASO)

A PCR-ASO (Allele Specific OligonucleotideAmplification) é um método de detecção direta demutações, também conhecido como ARMS(Amplification Refractory Mutation System). Nes-te sistema, é utilizado um par de oligonucleotídeos comseqüência específica na extremidade 3´ para cada alelopresente no lócus gênico28,29. As reações são realiza-das separadamente para cada par de oligonucleotí-deos (iniciadores da PCR) e apenas os iniciadores quecontem a seqüência 100% complementar ao alelomutante ou comum possibilitam gerar o produto dePCR específico. A detecção dos produtos da PCR érealizada por eletroforese em gel de agarose. Hetero-zigotos e homozigotos podem ser discriminados emum único ensaio da PCR quando diferentes alelos sãoamplificados utilizando-se marcados com diferentesfluorocromos como é o caso da PCR em tempo real30.

A especificidade da reação é influenciada porvariações nas concentrações dos reagentes (magné-sio, oligonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, DNAe DNA polimerase), temperatura e tempo de hibridi-

zação e número de ciclos31. A adição de formamidapode reduzir a geração de produtos inespecíficos. Condi-ções de baixa estringência na PCR propiciam a hibri-dização e extensão dos iniciadores nas seqüências deambos os alelos que levam a geração de resultadosincorretos. A especificidade é crítica quando a fre-qüência do alelo mutante é baixa ou desconhecida.

A possibilidade de resultados falso-positivo oufalso-negativo é a principal limitação do método. Fal-

1 2 3 4 5

104158199303

1 2 3 4 5

104158199303

Figura 8. Perfis de RFLP obtidos por eletroforese em gel deagarose a 2% corado com brometo de etídeo de produtos de PCRdigeridos com a enzima NIa III. Produto de PCR (coluna 2).Genótipos: CC (coluna 3); CT (coluna 4) e TT (coluna 5). Marcadorde pares de bases de DNA de 50 bp (coluna 1).

Alelo “A”

Alelo “B”

Amplificação

Oligonucleotídeo comum

Ponto de mutação

Oligonucleotídeo específico para o alelo “A”

1 2 1 2 1 2

M MN N

1 – Oligonucleotídeo específico para o alelo “M”

2 – Oligonucleotídeo específico para o alelo “N”

Grupo sanguíneo MN

Alelo “A”

Alelo “B”

Amplificação

Oligonucleotídeo comum

Ponto de mutação

Oligonucleotídeo específico para o alelo “A”

1 2 1 2 1 2

M MN N

1 – Oligonucleotídeo específico para o alelo “M”

2 – Oligonucleotídeo específico para o alelo “N”

Grupo sanguíneo MN

Figura 9. Esquema de detecção de mutações pela PCR Alelo Oligonucleotideo-Específico (PCR-ASO).

532


so-positivo pode resultar de contaminação ou de ex-tensão incorreta pela DNA polimerase. Para a exclu-são de resultados falsos, as condições de reação de-vem ser otimizadas e a concentração do DNA de in-teresse deve ser definida e precisamente controlada.A utilização de controles deve ser realizada para ex-cluir resultados indesejados. A utilização de controleinterno na PCR-ASO é importante para excluir resul-tados falsos negativos principalmente para a identifi-cação de heterozigotos.

5.2- PCR em tempo real

Na PCR em tempo real (Real-time PCR) sãoutilizadas pequenas sondas de DNA marcadas nas ex-tremidades 5‘ e 3‘com compostos fluorescentes de-nominados reporter (marcador) e quencher(bloqueador), respectivamente32,33. As sondas sãoconstruídas de maneira a hibridizar perfeitamente comum alelo especifico em um determinado lócus, porém,de forma incompleta com outro alelo.

No sistema TAqMan, o fluoróforo bloquea-dor está próximo do marcador, bloqueando a emissãodo sinal fluorescente32. Na fase de extensão da PCR,a atividade exonuclase 5’ e 3’ da DNA polimerase éresponsável pela digestão da sonda, o marcador é li-berado distanciando-se do bloqueador e a fluorescên-cia é emitida (Figura 10). As seqüências de iniciado-res e sondas, assim como as condições de PCR de-vem ser muito bem estabelecidas para evitar parea-mentos incorretos durante as etapas de hibridização eextensão na PCR em tempo real.

5.3- Arranjos de DNA

Os arranjos de DNA (DNA Arrays) foram con-cebidos para ampliar e agilizar as análises genômicas.O microarray é a forma miniaturizada de arranjosem que os fragmentos de genes estão fixos em umalâmina de vidro34. Também é conhecido como bioshipou ship biológico35.

As análises das atividades gênicas e a identifi-cação de mutações e polimorfismos são realizadas deforma sistematizada usando o princípio da hibridiza-ção de DNA. As seqüências de genes que contemmutações conhecidas são fixadas na matriz de vidro(sondas de captura). Produtos da PCR são geradosutilizando-se iniciadores específicos marcados comfluoróforos. A seguir os produtos da PCR são hibridi-zados com as sondas capturadas na matriz de vidro eos arranjos de sinais fluorescentes são medidos utili-zando-se um sistema ultra-rápido de detecção de fluo-rescência e a intensidade de cada ponto é determina-da. A localização do ponto associado com a sua inten-sidade determina a seqüência e a quantidade de ma-terial presente na amostra. Estes dados são processa-dos por programas sofisticados de computadores quepossibilitarão a analise refinada dos resultados.

A possibilidade de se colocar milhares de se-qüências em uma única lâmina de arranjo possibilita aobtenção de informações do genoma inteiro em umúnico ensaio, identificando milhões mutações e poli-morfismos simultaneamente35. Comercialmente já es-tão disponíveis, em bioships, conjuntos de polimorfis-

F Q

3’ 5’

5’

3’ 5’

F Q

Alelo “A” Alelo “A”

Alelo “B”

3’ 5’

5’

Alelo “B”

3’ 5’

F

Q F

Q

5’

5’

F Q

3’ 5’

5’

3’ 5’

F Q

Alelo “A” Alelo “A”

Alelo “B”

3’ 5’

5’

Alelo “B”

3’ 5’

F

Q F

Q

5’

5’

Figura 10. Esquema de detecção de mutações pela PCR em tempo real.

533


mos e ou mutações para fins de estudos farmacoge-néticos do sistema citocromo P450 para cada grupode fármacos potencialmente importantes, assim comopara diagnóstico de alterações genéticas de utilidadeterapêutica na clinica médica36.

6- CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nesta revisão foram abordados métodos mole-culares que podem ser utilizados nos estudos farma-cogenéticos. Foram apresentados os métodos utiliza-dos na obtenção de ácidos nucléicos e na detecçãomutações e polimorfismos genéticos, indicando suasespecificações, aplicações e limitações.

Alguns desses métodos podem ser aplicadospara estudos de alterações genéticas em larga escala.A análise do enorme conjunto de resultados geradospor esses métodos é dependente da Bioinformática

que tornou-se uma ciência imprescindível no desen-volvimento da tecnologia molecular com a integraçãodas ciências da saúde, biológicas e da computação.A simulação “in silico” é uma ferramenta potencial-mente importante na formulação de reações e deinterações medicamento-proteína, proteína-DNA, me-dicamento-DNA e outras possibilidades que estãoenvolvidas na eficácia e na segurança terapêutica dosmedicamentos.

Com os avanços crescentes da tecnologia mo-lecular e bioinformática tem sido possível aplicar osconhecimentos gerados pelos estudos farmacogenô-micos, transcriptômicos e proteômicos na investiga-ção de novos alvos terapêuticos. Esses conhecimen-tos permitirão, em futuro próximo, aplicação da tera-pia individualizada que melhorarão significativamentea atenção médica e farmacêutica e, conseqüentemen-te, a qualidade de vida das pessoas.

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC. From Molecular Biology to Medicine: methods commonly used inpharmacogenetics. Medicina (Ribeirão Preto) 2006; 39 (4): 522-34.

ABSTRACT: In this review, we discussed the procedures for obtaining, handling and storageof biological samples useful in molecular tests. Methods for screening and direct detection ofmutations and gene polymorphisms were presented. Principles, strategies, applications andlimitations of polymerase chain reaction (PCR) variations, such as denaturing gradient gelelectrophoresis (DGGE), single strain conformational polymorphism (SSCP), restriction fragmentlength polymorphism (RFLP), allele oligonuleotide-specific amplification (PCR-ASO), Real timePCR, DNA arrays and other molecular techniques, were commented.

Keywords: Pharmacogenetics. Polymerase Chain Reaction. Polymorphism, Single-StrandedConformational. Polymorphism, Restriction Fragment Length. DNA Arrays. Denaturing GradientGel Electrophoresis.

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da biologia molecular à medicina: métodos comumente utilizados

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