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Desenvolvimento de métodos para quantificação de benzilpenicilina em medicamentos

veterinários e seus resíduos em leite bovino e caprino por UFLC-DAD

Alessandra Miranda Cabral

Tese de Doutorado Natal/RN, dezembro de 2015

Alessandra Miranda Cabral


veterinários e seus resíduos em leite bovino e caprino por UFLC-DAD

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Química da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, em cumprimento às exigências para

obtenção do título de Doutora em Química.

Orientadora: Profa Drª Maria de Fátima Vitória de Moura

Co-Orientador: Profo Drº. Djalma Ribeiro da Silva

NATAL/RN

2015

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN

Biblioteca Setorial do Instituto de Química

Cabral, Alessandra Miranda.


veterinários e seus resíduos em leite bovino e caprino por UFLC-DAD / Alessandra Miranda

Cabral. – Natal, RN, 2015.

237 f. : il.

Orientadora: Maria de Fátima Vitória de Moura.

Co-orientador: Djalma Ribeiro da Silva.

Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química.

1. Benzilpenicilina – Tese. 2. Medicamentos Veterinários – Tese. 3. Leite – Tese. 4.

Cromatografia Líquida Ultrarrápida Acoplada a Arranjo de Fotodiodos – Tese. I. Moura,

Maria de Fátima Vitória de. II. Da Silva, Djalma Ribeiro. III. Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. IV. Título.

RN/UFRN/BSE- Instituto de Química CDU 543.062:636.09 (043.3)

Dedico este trabalho

Ao Deus Criador do Universo,

A minha mãe,

Ao meu irmão.

AGRADECIMENTOS

Queria encontrar, oh Deus, palavras e expressões de louvor para te agradecer por tantas

vitórias, assim agradeço ao teu filho Jesus Cristo pelo presente da Vida e por ter me

proporcionado sabedoria e vigor para continuar minha caminhada, pois como disse João no

capítulo 1 versículo 3 da Bíblia Sagrada “Todas as coisas foram feitas por ele, e sem ele nada

do que foi feito se fez. ”

Agradeço à minha Mãe Maria de Fátima Miranda pelo apoio, incentivo, carinho, fé e

amor que não conhecem limites. Ao meu irmão Alciney Miranda pela fé em minha vocação

para Química. Ao meu Pai Antônio Dantas pelo incentivo e esforço.

Durante todo tempo dos meus estudos na pós-graduação, estive trabalhando ao lado de

pessoas que devo agradecimentos:

À Professora Maria de Fátima Vitória de Moura pela sua orientação, incentivo e

supervisão acadêmica. Ao Professor Djalma Ribeiro da Silva, pela orientação.

A equipe do Instituto de Química e Programa de Pós-Graduação da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte pela criação de um ambiente agradável, e de fácil transmissão

de conhecimento.

A todos os meus Queridos Professores que me ensinaram o valor da Ciência no Brasil.

A toda equipe técnica da Central Analítica que me auxiliaram nos períodos que

prolonguei as análises nos laboratórios de Cromatografia, Espectroscopia e Preparo de amostra.

A todos meus colegas pela boa convivência dentro dos laboratórios e em ambientes de

estudo.

"O investigador sofre decepções, os longos meses passados em uma direção errada, os

fracassos. Mas as falhas também são úteis, porque, se bem analisadas, podem levar ao

sucesso. E para o pesquisador não há alegria comparável à de uma descoberta, ainda que

pequena. ”

Alexander Fleming, Escócia (1943)

“Eu sei que tudo quanto Deus faz durará eternamente; nada se lhe deve acrescentar, e nada se

lhe deve tirar; e isto faz Deus para que haja temor diante dele. ”

Eclesiastes 3:14.

RESUMO

A Benzilpenicilina (PENG) é usada como princípio ativo em medicamentos veterinários, para

aumentar a produtividade pecuária, devido suas propriedades terapêuticas. Porém, quando são

de má qualidade e utilizados indiscriminadamente, resultam em resíduos nos alimentos

expostos ao consumo humano, principalmente, no leite que é essencial para dieta das

populações de crianças e idosos. Assim, é imprescindível que se desenvolvam novos métodos

capazes de detectar os resíduos nesse alimento, em níveis que são nefastos a saúde humana, a

fim de contribuir com a segurança alimentar dos consumidores e colaborar com as agências

reguladoras numa fiscalização eficiente. Neste trabalho foram desenvolvidos métodos para o

controle de qualidade dos medicamentos. Também foram validadas metodologias para

identificação e quantificação de resíduos do antibiótico no leite bovino e caprino. Para isso, o

controle analítico foi realizado em duas etapas. Na primeira, os grupos das amostras dos

medicamentos I, II, III, IV e V foram caracterizadas, individualmente, por Espectroscopia no

infravermelho médio (4000 – 600 cm-1). Além disso, 37 amostras, distribuídas nesses grupos,

foram analisadas por Espectroscopia no UV VIS NIR e Cromatografia liquida ultra-rápida

acoplada a arranjo linear de fotodiodos (UFLC-DAD). Os resultados das caracterizações

indicaram semelhanças, entre padrão de referência PENG e amostras, principalmente em

regiões de 1724 a 1818 cm-1 de ν C=O que indica presença de amidas primárias característica de

PENG. O método utilizando UFLC-DAD apresentou R de 0,9991. LD de 7,384 × 10-4 µg mL-

1. LQ de 2,049 × 10-3 µg mL-1. A análise mostrou que 62,16% das amostras apresentaram pureza

≥ 81,21%. O método utilizando espectroscopia na região do UV VIS NIR apresentou erro médio

≤ 8 – 12% entre as medidas de referência e experimental, indicando ser boa alternativa para

determinação rápida de PENG. Na segunda etapa, foi desenvolvido um método para extração e

isolamento da PENG por adição de tampão McIlvaine, utilizado para precipitação total das

proteínas em pH 4,0. Os resultados mostraram excelentes valores de recuperação de PENG,

sendo de 92,05% para amostras de leite bovino (método 1). Enquanto que, para amostras de

leite caprino (método 2) a recuperação de PENG foi de 95,83%. Os métodos por UFLC-DAD

foram validados em concordância com o limite máximo de resíduos (LMR) de 4 µg Kg-1

normatizado pela CAC/GL16. A validação do método 1 indicou R de 0,9975. LD de 7,246 ×

10-4 µg mL-1. LQ de 2,196 × 10-3 µg mL-1. A aplicação do método 1 mostrou que 12% das

amostras analisadas apresentavam concentração de resíduos de PENG > LMR. O método 2

indicou R de 0,9995. LD 8,251 × 10-4 µg mL-1. LQ de 2,5270 × 10-3 µg mL-1. A aplicação do

método mostrou que 15% das amostras estavam acima do tolerável. A análise comparativa entre

os métodos apontou melhores condições de validação para amostras LCP, devido à redução do

efeito de matriz, pois o tcalculado < ttabelado, ocasionado pelo aumento da recuperação do analito na

matriz. Desta forma, todos os procedimentos desenvolvidos apresentaram simplicidade,

rapidez, seletividade, reduzido tempo de análise e consumo de reagentes e solventes tóxicos,

sobretudo se comparados às metodologias já estabelecidas.

Palavras Chaves: Benzilpenicilina. Medicamentos Veterinários. Leite. Cromatografia Líquida

Ultrarrápida Acoplada a Arranjo de Fotodiodos.

ABSTRACT

The Benzylpenicillin (PENG) have been as the active ingredient in veterinary medicinal

products, to increase productivity, due to its therapeutic properties. However, one of unfortunate

quality and used indiscriminately, resulting in residues in foods exposed to human

consumption, especially in milk that is essential to the diet of children and the ageing. Thus, it

is indispensable to develop new methods able to detect this waste food, at levels that are toxic

to human health, in order to contribute to the food security of consumers and collaborate with

regulatory agencies in an efficient inspection. In this work, were developed methods for the

quality control of veterinary drugs based on Benzylpenicillin (PENG) that are used in livestock

production. Additionally, were validated methodologies for identifying and quantifying the

antibiotic residues in milk bovine and caprine. For this, the analytical control was performed

two steps. At first, the groups of samples of medicinal products I, II, III, IV and V, individually,

were characterized by medium infrared spectroscopy (4000 – 600 cm-1). Besides, 37 samples,

distributed in these groups, were analyzed by spectroscopy in the ultraviolet and near infrared

region (UV VIS NIR) and Ultra Fast Liquid Chromatograph coupled to linear arrangement

photodiodes (UFLC-DAD). The results of the characterization indicated similarities, between

PENG and reference standard samples, primarily in regions of 1818 to 1724 cm-1 of ν C=O that

shows primary amides features of PENG. The method by UFLC-DAD presented R on 0.9991.

LOD of 7.384 × 10-4 µg mL-1. LOQ of 2.049 × 10-3 µg mL-1. The analysis shows that 62.16%

the samples presented purity ≥ 81.21%. The method by spectroscopy in the UV VIS NIR

presented medium error ≤ 8 – 12% between the reference and experimental criteria, indicating

is a secure choice for rapid determination of PENG. In the second stage, was acquiring a method

for the extraction and isolation of PENG by the addition of buffer McIlvaine, used for

precipitation of proteins total, at pH 4.0. The results showed excellent recovery values PENG,

being close to 92.05% of samples of bovine milk (method 1). While samples of milk goats

(method 2) the recovery of PENG were 95.83%. The methods for UFLC-DAD have been

validated in accordance with the maximum residue limit (LMR) of 4 µg Kg-1 standardized by

CAC/GL16. Validation of the method 1 indicated R by 0.9975. LOD of 7.246 × 10-4 µg mL-1.

LOQ de 2.196 × 10-3 µg mL-1. The application of the method 1 showed that 12% the samples

presented concentration of residues of PENG > LMR. The method 2 indicated R by 0.9995.

LOD 8.251 × 10-4 µg mL-1. LOQ de 2.5270 × 10-3 µg mL-1. The application of the method

showed that 15% of the samples were above the tolerable. The comparative analysis between

the methods pointed better validation for LCP samples, because the reduction of the matrix

effect, on this account the tcalculs < ttable, caused by the increase of recovery of the PENG. In this

mode, all the operations developed to deliver simplicity, speed, selectivity, reduced analysis

time and reagent use and toxic solvents, particularly if compared to the established

methodologies.

Keywords: Benzylpenicillin. Medicinal Products for Veterinary Use. Milk. Ultra-Fast Liquid

Chromatography Coupled to an Arrangement of Photodiodes.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABAM Abamectina

ACN Acetonitrila

AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology

AMDUCA The Animal Medicinal Drug Use Clarification Act

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AOAC The association of Analytical Communities

ATR attenuated total reflectance

CAS Chemical Abstracts Service

CPVS Compêndio de Produtos Veterinários

CVMP Committee for Medicinal Products for Veterinary Use

CCRVDF Codex Committee on Residues of Veterinary Drugs in Foods

DOX Doxiciclina

EDSPLS derivative spectra partial least squares

EFPE Universidade Federal de Pernambuco

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

EMA European Medicines Agency

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

ENR Enrofloxacina

EURACHEM A focus for analytical chemistry in Europe

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

FS Fator de Segurança

FTIR Fourier transform infrared spectroscopy

GEN Gentamicina

HPLC High-performance liquid chromatography

IDA Ingestão Diária Aceitável

IF Infravermelho

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

IVERM Ivermectina

JECFA Expert Committee on Food Additives

LMR Limite Máximo de Resíduos

LB Amostras de Leite Bovino

LCP Amostras de Leite Caprino

MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento do Brasil

MERCOSUL Mercado Comum do Sul

MIR Medium infrared spectroscopy

NIR Near infrared spectroscopy

NOEL no observed effects levels

OMS Organização mundial da saúde

OTC Oxitetraciclina

OTCDII Diidrato de Oxitetraciclina

PCA Análise por Componentes Principais

PCR Principal Components Regression

PENG PROC Benzilpenicilina Procaína

PENG Benzilpenicilina

PLS Partial Least Squares

QuEChERS Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe

RMSEC Root Mean Square Error of Calibration

RMSEP Root Mean Squares Error of Prediction

SDBR-IR Spectral Database for Organic Compounds

SDX Sulfadoxina

SDZ Sulfadizina

SINDAN Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Saúde Animal

SMZ Sulfametoxina

TC Tetraciclina

TMP Trimetroprina

UEM Universidade Estadual do Maranhão

UFLC-DAD Ultra Fast Liquid Chromatograph coupled to linear arrangement photodiodes

UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

UFRPE Universidade Federal Rural de Pernambuco

UFRS Universidade Federal do Rio Grande do Sul

UFV Universidade Federal de Viçosa

UNESP Universidade Estadual Paulista

USP Universidade de São Paulo

UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography

UV ultravioleta

VICH International Cooperation on Harmonisation of Technical Requirements for

Registration of Veterinary Medicinal Products

VISAs Vigilância Sanitária

WHO World Health Organization

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1- Correlação entre os LMRs admitidos em principais subprogramas de

monitoramento e Controle dos Resíduos de Antibióticos em Leite........ 46

Tabela 3.1- Sumário dos métodos de preparo de amostras de leite para

determinação de resíduos de antibióticos utilizando HPLC-DAD.......... 69

Tabela 3.2- Descrição dos antibióticos questionados nos estudos recentes e

principais técnicas empregadas em diferentes matrizes alimentares…. 76

Tabela 3.3- Resumo das principais Normatizações e órgãos reguladores e

Aplicação de Controle de Contaminantes............................................. 86

Tabela 3.4- Comparação dos requisitos de validação preconizados para

quantificação dos resíduos em alimentos.............................................. 89

Tabela 4.1- Descrição dos medicamentos analisados, segundo CPV/SIDAN......... 95

Tabela 4.2- Amostragem dos medicamentos (misturas) para identificação e

quantificação.......................................................................................... 96

Tabela 4.3- Planejamento das condições do sistema cromatográfico para PENG.... 99

Tabela 4.4- Procedimento de modelagem para quantificação de PENG em

medicamentos de uso veterinário........................................................... 106

Tabela 4.5- Descrição das amostras de leite bovino................................................. 111

Tabela 4.6- Descrição das amostras de leite caprino................................................ 112

Tabela 4.7- Planejamento comparativo das condições do sistema cromatográfico

para PENG para análise das amostras controle de leite bovino (LB) e

leite caprino (LCP)................................................................................. 115

Tabela 5.1- Atribuição das bandas espectrais de absorção no FTIR para

antibióticos............................................................................................ 127

Tabela 5.2- Desempenho do método para quantificação de PENG em

medicamentos veterinários..................................................................... 132

Tabela 5.3- Precisão e exatidão do método para quantificação de PENG em

medicamentos veterinários, expressos pelo coeficiente de variação

(%CV).................................................................................................... 133

Tabela 5.4- Robustez do método para quantificação da PENG em medicamentos

veterinários, expresso pelo coeficiente de variação (%CV).................. 134

Tabela 5.5- Cálculo do teor de PENG nos medicamentos analisados por

cromatografia......................................................................................... 137

Tabela 5.6- Características dos modelos de calibração para determinação de PENG

em medicamentos................................................................................... 146

Tabela 5.7- Critérios utilizados para validação do método.....................................

149

Tabela 5.8- Desempenho dos métodos para quantificação de PENG em amostras

de leite bovino e caprino, expresso pela recuperação (%)..................... 155

Tabela 5.9- Comparação do desempenho dos métodos para quantificação de

PENG amostras de leite bovino e caprino............................................... 168

Tabela 5.10- Comparação da precisão e exatidão do Método para quantificação de

PENG em amostras de leite bovino e caprino, expresso pelo

coeficiente de variação (%CV)............................................................... 169

Tabela 5.11- Avaliação comparativa da robustez do método para quantificação de

resíduos de PENG em amostras de leite bovino e caprino, expresso

pelo coeficiente de variação (%CV)....................................................... 171

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1- Estrutura geral das penicilinas, com seus diferentes R............................ 31

Figura 2.2- Reação para formação do núcleo 6-APA................................................ 32

Figura 2.3- Degradação da Penicilina com abertura do anel por ação de enzima em

meio ácido (1) e hidrólise da amina da cadeia lateral em meio ácido (2) 33

Figura 2.4- Estrutura Química da PENG................................................................... 34

Figura 2.5- Frequência para recomendação do uso de antibióticos no Brasil............ 37

Figura 2.6- Tendência de Crescimento da cadeia produtiva dos medicamentos

usados para sanidade animal................................................................... 38

Figura 3.1- Ilustração da rotação óptica de um composto quiral biologicamente

ativo........................................................................................................ 54

Figura 3.2- Visualização de um dos Centros Quirais da Benzilpenicilina (A),

imagem em 3D (B)................................................................................. 55

Figura 3.3- Emprego dos diferentes detectores para análise por fármacos a base de

penicilinas.............................................................................................. 62

Figura 3.4- Frequências dos trabalhos científicos aplicados ao desenvolvimento de

novos métodos para quantificação de resíduos de antibióticos em leite,

durante período de 2010 a 2012.............................................................. 73

Figura 3.5- Tendência do avanço da literatura científica no período de 1983 a 2016

(fev) para quantificação de resíduos de penicilina, em função da

nacionalidade dos pesquisadores............................................................ 79

Figura 3.6- Citação do Brasil e aplicação de métodos para controle, em função do

número de publicação e países................................................................ 82

Figura 3.7- Distribuição do número de publicações em função da filiação dos

autores.................................................................................................... 83

Figura 4.1- Ilustração do Sistema UFLC-DAD......................................................... 93

Figura 4.2- Ilustração para testes com amostras externas.......................................... 107

Figura 4.3- Esquema resumido para testes com amostras externas........................... 108

Figura 4.4- Esquema simplificado do preparo das amostras de leite antes (A) e após

tratamento (B)......................................................................................... 114

Figura 4.5- Estratégia para validação dos métodos bioanalíticos.............................. 120

Figura 5.1- Espectros no UV de amostra contendo PENG e STR em cinco níveis

de concentração...................................................................................... 123

Figura 5.2- Espectros FTIR para grupos dos antibióticos das amostras e PENG

padronizado............................................................................................ 126

Figura 5.3- Perfil cromatográfico da penicilina (PENG) referente ao padrão

certificado............................................................................................... 129

Figura 5.4- Resultados do planejamento das condições cromatográficas.................. 130

Figura 5.5- Curva analítica para quantificação de PENG em medicamentos............. 131

Figura 5.6- Perfil cromatográfico das amostras de medicamentos em grupos........... 135

Figura 5.7- Espectros da PENG certificado e das amostras comerciais de

medicamentos......................................................................................... 138

Figura 5.8- Gráficos dos loadings para M1 – M12.................................................... 139

Figura 5.9- Gráficos dos loadings para M13 – M24.................................................. 140

Figura 5.10- Gráficos dos Scores M1 – M12............................................................... 142

Figura 5.11- Gráficos dos Scores M13 – M24............................................................. 143

Figura 5.12- Representação do erro médio entre os valores de referência e o método

UV VIS NIR para análise quantitativa das amostras Puras (E1 – E24)..... 147

Figura 5.13- Representação do erro médio entre os valores de referência e o método

UV VIS NIR para análise quantitativa das amostras tratadas................... 148

Figura 5.14- Cromatogramas obtidos para amostra controle LB (branco) e amostra

fortificada com PENG............................................................................ 151

Figura 5.15- Cromatogramas obtidos para amostra LCP controle (branco) e amostra

fortificada com PENG............................................................................ 152

Figura 5.16- Estudo da variação de tempo de retenção e área do pico da PENG.......... 157

Figura 5.17- Resultados das condições para análise de PENG em amostras controle

de leite bovino........................................................................................ 158

Figura 5.18- Resultados das condições para análise de PENG em amostras controle

de leite caprino........................................................................................ 159

Figura 5.19- Otimização da operação das bombas em função da pressão e dos

tempos de retenção da PENG.................................................................. 160

Figura 5.20- Perfil cromatográfico de PENG nas amostras controle de leite LB e

LCP fortificadas..................................................................................... 161

Figura 5.21- Perfil cromatográfico de PENG cromatogramas das amostras controle

de leite LB e LCP fortificadas em níveis com seus respectivos brancos.. 162

Figura 5.22- Efeito da concentração de PENG e perfis das curvas para o método 1.... 163

Figura 5.23- Efeito da concentração de PENG e perfis das curvas para o método 2.... 164

Figura 5.24- Curva analítica para amostras de leite LB fortificadas para estudo da

linearidade.............................................................................................. 166

Figura 5.25- Curva analítica para amostras de leite LCP fortificadas para estudo da

linearidade.............................................................................................. 167

Figura 5.26- Análise de leite bovino quanto à presença de resíduos de PENG............ 172

Figura 5.27- Análise de leite caprino quanto à presença de resíduos de PENG........... 173

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS................................................................ 22

1.1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 22

1.2 OBJETIVOS.................................................................................................. 25

1.2.1 Objetivos Gerais........................................................................................... 25

1.2.2 Objetivos Específicos.................................................................................... 25

CAPÍTULO 2

ANTIBIÓTICOS: Penicilina e Resíduos

2 ANTIBIÓTICOS: Penicilinas e Resíduos................................................. 28

2.1 DESCOBERTA DA PENICILINA.............................................................. 28

2.2 PENICILINAS: Grupos e Propriedades....................................................... 31

2.3 PRODUTOS VETERINÁRIOS: Designação e Faturamento....................... 36

2.4 OCORRÊNCIA, RISCO E CONTROLE DOS RESÍDUOS: Segurança

Alimentar...................................................................................................... 40

CAPÍTULO 3

MÉTODOS OFICIAIS E INDICADORES DOS AVANÇOS DA

LITERATURA CIENTÍFICA

3 MÉTODOS OFICIAIS E INDICADORES DOS AVANÇOS DA

LITERATURA CIENTÍFICA.................................................................. 49

3.1 REVISÃO DOS MÉTODOS APLICADOS AO CONTROLE DE

QUALIDADE DE TERAPÊUTICOS PARA USO VETERINÁRIO.......... 49

3.1.1 Determinação da rotação óptica de um antibiótico.................................. 53

3.1.2 Espectroscopia para identificação e quantificação de antibióticos em

terapêuticos de uso veterinário.................................................................. 57

3.1.2.1 Importância da Região no Ultravioleta e Infravermelho Próximo................. 58

3.1.2.2 Importância da aplicação da Espectroscopia no Infravermelho Médio......... 60

3.1.3 Considerações sobre a Aplicação dos Métodos Cromatográficos no

Controle de Qualidade de Formulações.................................................... 61

3.2 ANÁLISES DOS RESÍDUOS DE ANTIBIÓTICOS................................... 63

3.2.1 Preparo da amostra para quantificação de resíduos de antibióticos...... 65

3.2.1.1 Critérios para Preparo da Amostra................................................................ 67

3.2.2 Métodos Bioanalíticos e Testes Rápidos.................................................... 71

3.2.3 Emprego das Técnicas para Quantificação e Confirmação dos Resíduos

de Antibióticos.............................................................................................. 72

3.2.4 Plano de Controle e Monitoramento de Resíduos de Antimicrobianos

executados no Brasil................................................................................... 80

3.3 ESTRATÉGIAS PARA VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS.......................... 85

3.3.1 Características de um Método Validado................................................... 88

CAPÍTULO 4

METODOLOGIA

4 METODOLOGIA...................................................................................... 92

4.1 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA IDENTIDADE E

QUALIDADE DOS MEDICAMENTOS A BASE DE

BENZILPENICILINA................................................................................... 92

4.1.1 Reagentes e Solventes.................................................................................. 92

4.1.2 Instrumentação............................................................................................. 92

4.1.3 Outros materiais para Cromatografia........................................................ 93

4.1.4 Amostras de medicamentos......................................................................... 94

4.1.5 Espectroscopia no infravermelho médio.................................................... 97

4.1.6 Análises por Cromatografia líquida ultrarrápida acoplada em arranjo

linear de fotodiodos...................................................................................... 98

4.1.6.1 Preparo da solução padrão de PENG.............................................................. 98

4.1.6.2 Preparo de amostras........................................................................................ 98

4.1.6.3 Condições das análises cromatográficas......................................................... 99

4.1.6.4 Validação do Método...................................................................................... 100

4.1.6.4.1 Especificidade/Seletividade............................................................................ 100

4.1.6.4.2 Faixa de Trabalho e construção da curva analítica........................................ 100

4.1.6.4.3 Linearidade.................................................................................................... 101

4.1.6.4.4 Precisão.......................................................................................................... 101

4.1.6.4.5 Exatidão......................................................................................................... 101

4.1.6.4.6 Limite de detecção.......................................................................................... 102

4.1.6.4.7 Limite de quantificação.................................................................................. 102

4.1.6.4.8 Robustez......................................................................................................... 102

4.1.6.5 Identificação de PENG nas amostras.............................................................. 103

4.1.6.6 Cálculo das concentrações de PENG em amostras de medicamentos............ 103

4.1.7 Análise na região do UV VIS NIR................................................................ 104

4.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA IDENTIFICAÇÃO E

QUANTIFICAÇÃO DE PENG EM LEITE BOVINO E CAPRINO............. 109

4.2.1 Reagentes e Solventes................................................................................... 109

4.2.2 Instrumentação............................................................................................. 109

4.2.3 Outros materiais para Cromatografia........................................................ 109

4.2.4 Amostragem.................................................................................................. 110

4.2.4.1 Amostras de leite controle............................................................................... 110

4.2.4.2 Amostras de leite comerciais (externas).......................................................... 110

4.2.4.2.1 Amostras de leite bovino comercial (LB)........................................................ 110

4.2.4.2.2 Amostras de leite caprino comercial (LCP)................................................... 112

4.2.5 Preparo da solução padrão de PENG.......................................................... 113

4.2.6 Preparo da solução tampão McIlvaine pH 4............................................... 113

4.2.7 Preparo e limpeza das amostras de leite bovino e caprino.......................... 114

4.2.8 Condições para análise cromatográfica...................................................... 115

4.2.9 Validação do método.................................................................................... 115

4.2.9.1 Construção da curva Analítica........................................................................ 115

4.2.9.2 Linearidade..................................................................................................... 116

4.2.9.3 Recuperação................................................................................................... 116

4.2.9.4 Precisão (Repetabilidade)............................................................................... 116

4.2.9.5 Exatidão.......................................................................................................... 117

4.2.9.6 Limite de detecção (LD) ................................................................................ 117

4.2.9.7 Limite de quantificação (LQ) ......................................................................... 118

4.2.9.8 Seletividade..................................................................................................... 118

4.2.9.9 Robustez........................................................................................................ 118

4.2.9.10 Efeito da matriz............................................................................................. 118

4.2.9.11 Estratégias para validação.............................................................................. 120

4.2.10 Cálculo das Concentrações em amostras de leite comerciais..................... 121

CAPÍTULO 5

RESULTADOS E DISCUSSÃO

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 123

5.1 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA IDENTIDADE E

QUALIDADE DOS MEDICAMENTOS A BASE DE

BENZILPENICILINA....................................................................................... 123

5.1.1 Testes para identidade dos medicamentos.................................................. 123

5.1.1.1 Condições dos testes....................................................................................... 123

5.1.2 Análise por espectroscopia no infravermelho médio................................. 125

5.1.3 Quantificação de PENG por UFLC-DAD...................................................... 129

5.1.3.1 Estudo das condições de análise..................................................................... 129

5.1.3.2 Validação do método...................................................................................... 131

5.1.3.3 Identificação de PENG em amostras de medicamentos.................................. 135

5.1.3.4 Cálculo do teor de pureza dos medicamentos................................................. 136

5.1.4 Análise de PENG em medicamentos por UV VIS NIR............................... 138

5.1.4.1 Atribuição das bandas no UV VIS NIR e relevância para modelagem dos

dados.............................................................................................................. 138

5.1.4.2 Desempenho dos modelos de acordo com 17760/2009/EC e determinação

das concentrações de PENG........................................................................... 145


QUANTIFICAÇÃO DE PENG EM LEITE BOVINO E CAPRINO ............ 149

5.2.1 Otimização do preparo das amostras de leite controle bovino e caprino 151

5.2.1.1 Avaliando a recuperação do método.............................................................. 153

5.2.2 Estudo das condições cromatográficas para aplicação em amostras de

leite................................................................................................................. 157

5.2.3 Validação do método.................................................................................... 161

5.2.3.1 Correlação entre amostras de leite bovino (LB) e caprino (LCP).................... 161

5.3 CONSIDERAÇÕES FINAIS PARA QUALIDADE E SEGURANÇA DO

LEITE.................................................................................................................... 174

CAPÍTULO 6

CONCLUSÕES

6 CONCLUSÕES............................................................................................ 178

REFERÊNCIAS

REFERÊNCIAS........................................................................................... 182

APÊNDICES.................................................................................................. 216

ANEXOS........................................................................................................ 236

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

22

1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

1.1 INTRODUÇÃO

Medicamentos veterinários associados a Benzilpenicilina (PENG), são amplamente

utilizados a níveis terapêuticos para o controle de mastites em bovinos e caprinos. Porém, essas

substâncias podem ser acumuladas nos tecidos animais ou até mesmo transferidas para os

produtos alimentares em forma de resíduos, que em níveis acima do permitido, constituem um

risco potencial à saúde dos consumidores (AGUILERA-LUIZ et al., 2008; VARGAS

MAMANI; REYES REYES; RATH, 2009). Assim, a primeira etapa para prevenir a formação

de resíduos, é a utilização de medicamentos de qualidade e seu correto emprego, com relação a

sua eficiência, aplicabilidade, segurança e custo. Esses fatores requerem a aplicação das Boas

Práticas de uso, pois são importantes para promoção da qualidade dos alimentos (FILHO et al.,

2012).

Assim, a qualidade do leite reflete na sua valorização, enquanto matéria-prima, em toda

sua cadeia produtiva, pois é um dos produtos alimentícios mais importantes da agropecuária,

em razão da sua estratégia no balanceamento das dietas dos humanos e de seu relevante papel

socioeconômico. Segundo Albright, Tuckey e Woods (1961) e Chambers (1998) o leite

contaminado por resíduos é considerado adulterado e impróprio para o consumo, acarretando

prejuízos econômicos e tecnológicos na indústria de laticínios.

No Brasil, o Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite (PNQL), tem como

principal objetivo promover a melhoria da qualidade deste alimento, e consequentemente

garantir a saúde da população. Logo, as principais ações promovidas pelo órgão competente

são a detecção de fraudes e estímulos à produção de alimentos seguros (MAPA, 2011).

Segundo projeção do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), em 2014

foram produzidos, no Brasil, 37 milhões de litros de leite. Atrelado a essa produção, o

tratamento com antibióticos de doenças infecciosas desempenha um papel muito importante

garantindo o crescimento do setor (BRITO; NOBRE; FONSECA, 2009). Segundo estatísticas

do Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Saúde Animal (SINDAN), o faturamento

dos produtos veterinários chegou a 4,5 milhões de reais, 17% são de antimicrobianos.

A ausência de um adequado monitoramento pode resultar em altas concentrações de

resíduos no leite, principalmente se não forem utilizados de acordo com as indicações, e se não

for respeitado o período mínimo de eliminação do resíduo (SCHENCK; CALLERY, 1998). As

consequências da permanência dos resíduos pode causar prejuízos para o processo produtivo,

23

pois pode causar intolerância aos antibióticos, hipersensibilidade às penicilinas, reações

alérgicas e interferência no processo industrial dos derivados do leite, inviabilizando a produção

destes, em escala industrial, causando sérios prejuízos econômicos como, por exemplo, inibindo

fermentos lácteos que são culturas de microrganismos para produção de iogurtes, queijos e

outros derivados (BERENDSEN et al., 2010; BOHM; STACHEL; GOWIK, 2009; BOISON et

al., 1996; CHAMBERS, 1998; JONES; SEYMOUR, 1988; RAISON-PEYRON et al., 2001;

SEYMOUR; JONES; MCGILLIARD, 1988; SHERIDAN et al., 2008).

Por estas razões, as legislações no âmbito internacional como Codex Alimentarius, EC

(European Commission), FDA (Food and Drug Administration), inclusive no Brasil pelo

MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento do Brasil), limitam a quantidade

de antibióticos no leite e adotam métodos que garantam a disponibilidade de um alimento

seguro. Porém, para que esses critérios venham a ser satisfeitos é preciso que sejam

normalizados, cumpram requisitos e gerem bons resultados. Segundo Paschoal et al (2008)

estes procedimentos devem ser realizados como garantia da qualidade das medições químicas,

através da comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade. Entretanto, para o monitoramento

acontecer, é necessário estabelecer métodos analíticos simples e de confiança na identificação

e a determinação de resíduos, pois muitas vezes as análises efetuadas são no campo suspeito de

contaminação (PUCHADES; CHA, 2010). Com objetivo de satisfazer essas exigências, muitos

métodos cromatográficos em sistemas diversos têm sido elaborados e publicados para na

determinação de antibióticos betalactâmicos e macrolídeos em amostras de alimentos,

utilizando sistema HPLC-UV (BAILÓN-PÉREZ et al., 2009; GARCÍA-MAYOR et al., 2015;

SAMANIDOU et al., 2015). Alguns métodos utilizando espectrômetros tem sido reportados

(ALI AHMED; ELBASHIR; ABOUL-ENEIN, 2015; KUKUSAMUDE et al., 2012). Além

disso, incluem-se vários métodos preparativos de amostras quando são analisados

multirresíduos utilizando UPLC-MS (CEPURNIEKS et al., 2015; CHIESA et al., 2015; HAN

et al., 2015). A aplicação de detectores de fluorescência é muito comum para determinação de

tetraciclinas (MAIA; RATH; REYES, 2008; NI; LI; KOKOT, 2011; PENNACCHIO et al.,

2016; SEIFRTOVÁ et al., 2009; SPISSO et al., 2007).

Alguns métodos de rastreabilidade tem sido adotados para detecção desses resíduos,

como os microbiológicos (NOUWS, 1999), imune ensaios (HORMAZÁBAL; YNDESTAD,

2001; THORSEN et al., 2006), e adicionalmente, os cromatográficos, especialmente com

detector UV (FJ; PS, 1998; HERRERA-HERRERA et al., 2011).

24

O presente trabalho tem por objetivo desenvolver metodologias válidas, com base nas

normas legais em vigor, para o controle de qualidade dos medicamentos de uso veterinário. Os

testes de identidade pela caracterização por espectroscopia na região do infravermelho médio.

Também, propor metodologias e modelos capazes de identificar e quantificar PENG utilizando

UFLC-DAD e espectroscopia na região do UV VIS NIR. Integrado a essas análises, desenvolver

métodos limpos e verdes para a extração, isolamento e boa recuperação da PENG. Além disso,

validar metodologia para a identificação e quantificação dos resíduos de PENG por UFLC-

DAD baseado no LMR de 4µg Kg-1 para leite bovino e caprino, e consequentemente testar os

métodos nas amostras de leite pasteurizado.

25

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivos Gerais

Desenvolver métodos para quantificação de penicilinas contida em medicamentos

antimicrobianos, de uso veterinário, cuja composição esteja associada à Benzilpenicilina

Potássica (PENG K+), Benzilpenicilina Procaína (PENG PROC), Dihidroestreptomicina

(DHSTR), Estreptomicina (STR), Oxitetraciclina (OTC), Tetraciclina (TC), Enrofloxacina

(ENR), Sulfadoxina (SDX), Trimetoprina (TMP), Sulfametazina (SMZ) e Sulfato de

Gentamicina (GEN). Além de propor análises para identidade e controle de qualidade dos

antibióticos comercialmente distribuídos, todos registrados pelo MAPA. Entretanto, o principal

objetivo deste trabalho é desenvolver um método válido, conforme normas legais em vigor,

para identificar e quantificar resíduos de PENG em amostras de leite de origem bovina e

caprina. Além disso, são propostas condições ótimas, limpas e verdes para preparo de amostras

e leitura do resíduo de antibiótico sem prejuízo aos parâmetros de validação.

1.2.2 Objetivos Específicos

Realizar testes de qualidade dos medicamentos veterinários a base de Benzilpenicilina,

utilizando os métodos descritos nas Farmacopeias Brasileiras e Internacional.

Interpretar espectros dos medicamentos na região do infravermelho médio para

comprovar as principais bandas de absorção e vibrações características das moléculas em

estudo, comparando-as com os padrões registrados no banco de dados espectrais de compostos

orgânicos, bem como do padrão PENG certificado.

Desenvolver um método válido para identificação e quantificação desses terapêuticos,

utilizando análise cromatográfica em sistema UFLC-DAD. Aplicar os modelos em amostras

comerciais.

Desenvolver modelos multivariados utilizando espectroscópica na região do UV VIS

NIR para quantificação de PENG em medicamentos. Testar os modelos em amostras externas.

Validar método por cromatografia liquida de alta eficiência em sistema UFLC-DAD

para quantificação dos resíduos do antimicrobiano estabelecendo valores para seletividade,

robustez e sensibilidade. Considerando desde a metodologia de coleta e preparação das

amostras de leite caprino e bovino, bem como a metodologia para extração, preparo de soluções

26

das amostras, com redução significativa de reagentes e solventes tóxicos, mantendo a boa

recuperação do analito.

Aplicar o método válido para verificar a conformidade de algumas amostras de leite

bovino e caprino ultrapasteurizado quanto à presença de resíduos de Benzilpenicilina acima do

LMR de 0,004 µg mL-1. Testar as algumas amostras expostas ao consumo humano e

comercializadas em Natal/RN com origem em oito localidades do Brasil.

CAPÍTULO 2

ANTIBIÓTICOS: Penicilinas e Resíduos

28

2 ANTIBIÓTICOS: Penicilinas e Resíduos

2.1 DESCOBERTA DA PENICILINA

A introdução das sulfonamidas na década de 1930 e Benzilpenicilina na década de 1940

revolucionou completamente a medicina, através da redução da morbidade e mortalidade

provocadas por doenças infecciosas (HILDING, 1998). Os óbitos causados por infecções

durante a Primeira Guerra Mundial (1914 – 1918) impeliram Alexander Fleming,

bacteriologista em Londres, a descobrir substância capaz de matar ou inibir o crescimento de

bactérias (BERENDSEN et al., 2013; HARE, 1982; LIGON, 2004). O próprio Fleming relatou

no seu trabalho, em 1928, que enquanto estudava variantes de estafilococos, observou que uma

das culturas havia sido contaminada por um bolor, e que este provocara o desaparecimento das

bactérias na sua vizinhança (FLEMING, 1929). Fleming e seu colega, Dr. Pryce, identificaram

o fungo como sendo do género do Penicillium, e demonstraram que este produzia uma

substância responsável pelo efeito bactericida – a penicilina. Verificando o efeito desta

substância em diferentes culturas, foi possível constatar quais as espécies de bactérias sensíveis

à ação das penicilinas, que se provou serem apenas organismos aeróbios, gram-positivas não

produtoras de betalactamases (STEFFEE, 1992). Após a descoberta, Fleming, continuou a

estudar a penicilina em seu laboratório, mas não com aquele entusiasmo inicial. Ele nunca

desenvolveu um composto clinicamente útil, embora, em 1929, ele sugeriu que poderia ter

importantes aplicações clínicas, porque ele era um bacteriologista e não um químico. Logo,

Fleming não tentou purificar a penicilina. Foi Florey que desenvolveu a penicilina e a tornou

clinicamente aceita (ROSENTHAL, 1984). Estudos seguintes foram realizados para aplicações

clínicas (ABRAHAM; OXFD; INFIRMARY, 1941) e produção em larga escala.

Apesar de todo reconhecimento, alguns pesquisadores, como por exemplo, Ligon 2004

defendem a tese de que a história da função dos fungos e micologia, no desenvolvimento da

medicina tem sido bastante negligenciada. Logo, discute a história da micologia médica,

referindo-se a ao evento como uma “investigação fascinante”, pois os antibióticos são

disponíveis por causa do estudo dos micróbios (LIGON, 2004). Mas, pode-se afirmar que

Alexander Fleming passou um tempo considerável, durante os meados dos anos 1930,

investigando as infecções bacterianas e os micróbios.

29

A descoberta da penicilina, por Alexandre Fleming, ainda é tema de muitas discussões

no meio científico, por exemplo, Ali et al (2014) apresenta questões tal como: O que poderia

ter acontecido se Fleming não tivesse descoberto a penicilina? Chegando-se à conclusão de que:

o arsenal médico disponível, hoje, teria sido muito diferente e poderia ter se baseado,

unicamente, em variedades desenvolvidas de sulfonamidas ou agentes antibacterianos

sintéticos. Mas o fato é que, essa descoberta, conferiu a Fleming a oportunidade de salvar

milhões de vidas, ganhar um Prêmio Nobel em Fisiologia e tornar-se um dos mais honrados

cientistas da história (HARE, 1982, 1983; ROSENTHAL, 1984).

Quanto aos métodos de isolamento da penicilina a partir do fungo, não permitiram a

produção da penicilina em larga escala, pois a estrutura química não era conhecida, isso

inviabilizou a síntese. Nesta época Dorothy Hodgkin estava envolvida em projeto militar

desenvolvidos por químicos orgânicos renomados. Mas foi em 1941 que Hodgkin determinou

a estrutura da penicilina, utilizando cristalografia de Raios X (EDWALD, 2014; VARGAS,

2012).

Quanto à sulfonamidas, agentes antibacterianos relativamente eficazes, continuam a ser

utilizados na medicina moderna (BIAŁK-BIELIŃSKA et al., 2011; NEELAMKAVIL et al.,

2009). As primeiras sulfonamidas como medicamento foi utilizada durante meados de 1930, e

imediatamente teve um grande impacto no tratamento de infecções bacterianas, principalmente

septicemia e febre puerperal. Durante a idade de “ouro dos antibióticos” essa substância foi

usada mais amplamente. Sem dúvida, muito eficazes; estes compostos. Vale ressaltar que, um

grande compêndio do uso de antibióticos tem sido registrado para uso clínico das sulfonamidas.

Porém, a situação poderia ter sido diferente, se as sulfonamidas não tivessem sido

desenvolvidas, impediria o avanço dos antibióticos durante 1960, uma vez que a indústria

farmacêutica poderia ter argumentado que as sulfonamidas estavam desempenhando um bom

trabalho, logo havia pouca necessidade de se investir na extração de outros agentes

antibacterianos. No entanto, tinha sido feito um acordo para descobrir outros antibióticos e

desenvolvê-los no campo da biotecnologia. Se o compromisso não existisse, a indústria

farmacêutica não teria sido capaz de contar com a grande quantidade de financiamento do

Governo Britânico, principalmente pelo senso crítico de urgência em tempo de guerra, uma vez

que penicilina tinha sido descoberta em momento oportuno (HERSBACH, 1983).

30

Contrariamente, durante a Segunda Guerra Mundial, os alemães e seus parceiros

produziriam quantidades relativamente pequenas de penicilina, certamente nunca o suficiente

para satisfazer as suas necessidades militares; como resultado, eles tiveram que contar com as

sulfonamidas muito menos eficazes (WAINWRIGHT, 2004). Ainda durante Segunda Guerra

Mundial, o microbiologista russo naturalizado americano, Selman Waksman, vencedor do

Prêmio Nobel de Medicina de 1952, anunciou a descoberta da estreptomicina (WAKSMAN,

1952; ZUMLA; NAHID; COLE, 2013). A descoberta desse antibiótico levou à domesticação

da tuberculose. A estreptomicina foi igualmente eficaz no tratamento de várias outras doenças

infecciosas.

31

2.2 PENICILINAS: Grupos e Propriedades

Os Antibióticos são extremamente importantes para os seres humanos. Além disso, são

utilizados para sanidade animal, principalmente dos produtores de alimentos. Quimicamente,

são constituídos de vários grupos de diferentes funções orgânicas e atividades nos organismos.

No momento atual, estão identificadas quase 40 penicilinas, algumas são naturais, outras

semissintéticas. A composição da penicilina é constituída por um núcleo comum: o 6-APA

(Figura 2.1), que é responsável pela atividade dos compostos.

Figura 2.1-Estrutura geral das penicilinas, com seus diferentes R

OH

O

N

S

CH3

CH3

O

NHR

O

CH3

O CH3

CH3

NH2

CH3

O CH3

N

O

CH3CH3

R2

R1

Penicilina G

Penicilina V

Ampicilina (R = H)

Amoxicilina (R = OH) Nafcilina Oxacicilina (R1 = R2 = H)

Cloxacilina (R1 = Cl, R2 = H)

Dicloxacilina (R1 = R2 = Cl)

Ácido 6 - Aminopenicilínico (6-APA)

R

R

R

RR

Desenhada usando software ChemSketch ACD, 2015

Este núcleo é composto por anel tiazolidínico e por um anel betalactâmico, que está

ligado a um grupo amina iniciando a cadeia lateral nas penicilinas. A presença do grupo

carboxílico confere a todas as penicilinas – natureza ácida. Entretanto, as aminopenicilinas

possuem um grupo básico (amina), o que as torna moléculas anfotéricas. Eles são resistentes ao

ácido e pode ser administrada por via oral. Essas substâncias incluem ampicilina e amoxicilina.

32

As penicilinas podem ser classificadas em quatro grupos principais, com base na sua

capacidade bactericida.

A síntese de cada uma dessas penicilinas está relacionada com a cadeia lateral R, obtida

durante processos de fermentação. O radical R dá o nome da penicilina de acordo com a

apresentação contida na

, onde estão apresentados alguns exemplos. Além disso, a cadeia lateral determina as

características antibacterianas e farmacológicas de cada uma das substâncias.

A presença do anel betalactâmico é responsável pela designação geral destes antibióticos

e provém da ligação de dois aminoácidos: cisteína e valina (Figura 2.2).

Figura 2.2-Reação para formação do núcleo 6-APA

NH2CH3

O SH

+

CH3

OH

CH3

CH3

O

OH

O

N

S

CH3

CH3

O

NH2

Cisteína Valina


Quando as estruturas se unem, forma-se o núcleo bicíclico 6-APA (FREITAS;

BARBOSA; RAMOS, 2013). A Benzilpenicilina (penicilina G) foi o primeiro betalactâmico

purificado para utilização clínica a partir de culturas de Penicillium.

O sistema cíclico de quatro membros é muito reativo. A ligação da amida está sujeita a

uma forte tensão, que o torna sujeito ao ataque de reagentes nucleófilos, resultando a abertura

do anel (FREITAS et al., 2013).

Quanto à atividade antibacteriana, para que essa substância seja eficaz, é necessário que

seu grupo se mantenha estável. A ação metabólica ou ocorrência de reações nessa parte da

molécula ocasiona a perda da sua atividade.

Algumas penicilinas se hidrolisam com muita facilidade quando sofrem ataque de

ácidos, íons metálicos e bases, sendo desativadas principalmente sob a ação de enzimas

betalactamases, presentes naturalmente em microrganismos.

33

A acidez gástrica pode hidrolisar a amida da cadeia lateral e provocar a abertura do anel,

apresenta-se a degradação das penicilinas.

A Figura 2.3 mostra dois prováveis processos de hidrólise, no 1 ocorre a reação química

de quebra de ligação química da penicilina G em meio ácido, formando o ácido penicilóico,

este não apresenta atividade terapêutica, o que torna a administração por via oral inadequada.

O mesmo processo ocorre em 2, porém sob a ação de betalactamases.

Figura 2.3-Degradação da Penicilina com abertura do anel por ação de enzima em meio ácido (1) e hidrólise da

amina da cadeia lateral em meio ácido (2)

OH

O

N

S

CH3

CH3

O

NHR

O

OH

O

NH

S

CH3

CH3NHR

O

OH O

OH

O

NH

S

CH3

CH3NH2

OH O

+ R OH

1

2


Em contraponto, a penicilina V (fenoximetilpenicilina) apresenta uma maior resistência

ao ataque ácido, e pode ser administrada por via oral. Porém, a sua atividade é muito reduzida,

sendo apenas consideradas em bactérias gram-negativas.

34

A única penicilina natural é a penicilina G, mas a modificação de sua estrutura produziu

penicilina V. Esses antibióticos têm atividade semelhantes aos aminopenicilinas, mas tem maior

eficácia contra bactérias gram-negativas, e não estão incluídas na legislação relativa a produtos

veterinários (BABINGTON et al., 2012).

As penicilinas podem ser classificadas em seis grupos com base na sua atividade. A

PENG está apresentada na Figura 2.4, cujo registro no CAS é 113-98-4 e pKa [HA] é 2,7.

Figura 2.4-Estrutura Química da PENG

OH

O

N

S

CH3

CH3

O

NHO


A nomenclatura da PENG dada pela IUPAC é (2S,6R) -3,3-dimethyl-7-oxo-6-

[(phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid. A fórmula

molecular é C16H18N2O4S. A massa molecular é 334, 390 g moL-1 quando isolada.

Quanto ao espectro, ele pode ser estendido, uma vez que apresentam um grupo ácido

carboxílico ou éster de cadeia lateral variável (SCHATZ, 1984).

A PENG é o antibiótico mais indicado para tratar infecções causadas por organismos

gram-positivos (exceto estafilococos resistentes e enterococos). Ela é administrada via

intramuscular, pois a sua absorção ocorre lentamente.

Quanto à ação nos organismos, as betalactâmicos são completamente ionizadas no

plasma. Essa substância não atravessa membranas biológicas, mas são amplamente distribuídas

nos fluidos extracelulares. A eliminação é geralmente através dos rins.

As penicilinas de largo espectro como a ampicilina, que é ativa contra bactérias gram-

negativas, também são amplamente utilizadas em gado para tratar infecções.

35

Quando em forma de sal, a Benzilpenicilina potássica (PENG K+), é descrita como um

pó cristalino; inodoro ou com fraco odor característico, muito solúvel em água; praticamente

insolúvel em éter R, dextrorotatória e apresenta absorção no UV de 200 a 220 nm (MACNEIL,

1998; THE INTERNATIONAL PHARMACOPOEIA, 2015a).

Para estudar os compostos, quanto a sua atividade, devem-se determinar os parâmetros

que conferem suas características, sendo a sua dissociação expressa pela Equação 1.

HA ⇆ H+ + A− (1)

Dentre as características, podem citar a constante ácida do composto (pKa) que é

representado pelo Equação 2.

Ka =

[H+][A−]

[HA]

(2)

O pKa é descrito pela a Equação 3 que melhor expressa o Ka.

pKa = − log Ka (3)

Por convenção, o ácido fraco com pKa baixo, será pouco ionizável, e uma base fraca

com pKa baixo será altamente ionizável no pH do sangue. Segundo a equação de Henderson-

Hasselbalch, o pKa corresponde ao valor de pH ocorre quando [HA] = [A-], ou quando a espécie

se encontra cinquenta porcento ionizada.

pKa = pH + log[HA]

[A−] (4)

Em termos biológicos o pKa é importante para determinar como a molécula se

comportará em meio aquoso nos componentes do tecido.

36

2.3 PRODUTOS VETERINÁRIOS: Designação e Faturamento.

O artigo 2º do Decreto 1.662/95 do MAPA define os produtos da indústria veterinária,

como toda substância química, biológica, biotecnológica ou preparação manufaturada, cuja

administração seja aplicada de forma individual ou coletiva, direta ou misturada com os

alimentos, destinada à prevenção, ao diagnóstico, à cura ou ao tratamento das doenças dos

animais, incluindo os aditivos, suplementos, melhoradores de produção animal, antissépticos,

desinfetantes de uso ambiental ou equipamentos, pesticidas e todos produtos que, utilizados nos

animais e/ou no seu habitat, protejam, restaurem ou modifiquem suas funções orgânicas e

fisiológicas (MAPA, 2012). Neste contexto, os produtos citados no Decreto e comercializados

estão listados no compêndio de produtos veterinários (CPV), incluindo antimicrobianos,

medicamentos antifúngicos 51 e antiprotozoários, sendo que 14 são formulações a base de

benzilpenicilina e associadas a misturas que contenham a estreptomicina.

O objetivo principal dos medicamentos veterinários é de melhorar a sanidade dos

animais produtores de alimentos controlando diversas doenças (BELOTI et al., 2012), dentre

elas estão as mastites que é uma inflamação e infecção da glândula mamária, em geral

provocada pela presença de microrganismos, promovendo alterações na composição do leite,

aumentando as taxas de células somáticas e danificando irreversivelmente o tecido secretor

(PYÖRÄLÄ, 2003). Dentre os agentes etiológicos identificados desta doença estão:

Staphylococcus coagulase positiva e negativa, Streptococcus spp, Escherichia coli,

Micrococcus spp e Pasteurella spp (ANTANAITIS et al., 2015; GREEN et al., 2002; HOGAN;

SMITH, 2012; LAGO et al., 2011; PYÖRÄLÄ, 2003; ROBERSON, 2012). Essa infecção gera

graves prejuízos econômicos, que podem provocar grandes perdas na atividade leiteira,

prejudicando a qualidade do leite, descarte deste alimento, diminuindo a produção, aumentando

custos com tratamento, assistência veterinária, aumento de mão-de-obra, e causando a

eliminação involuntária de animais no rebanho, (ANTANAITIS et al., 2015; ROBERSON;

WARNICK; MOORE, 2004; SÁNCHEZ; CONTRERAS; CORRALES, 1999), além de ser um

problema de saúde pública (GREEN, 2012; KROGH; ENEVOLDSEN, 2014), por isso é

imprescindível, o bom controle dessas infecções por tratamentos com antibióticos específicos

para cada agente infeccioso.

Foi somente em 1950 que um grupo de cientistas descobriu que as adições de

antibióticos ao tratamento de gado poderiam melhorar a produtividade pecuária, pois

controlavam as infecções bacterianas. Em 2001, Union of Concerned Scientists constatou que

90% da utilização total de antimicrobianos nos Estados Unidos foram para fins não terapêuticos

37

na produção agrícola (HARE, 1999). Desta forma, o uso de antibióticos na agricultura tem

alcançado picos de crescimento, estes fatores têm gerado grandes preocupações por parte das

regulações. Como resultado, as empresas farmacêuticas desenvolveram formulação de dose

baixa de produtos antibióticos que poderiam ser adicionados à ração diária.

As indicações dos produtos utilizados na década de 1960 eram principalmente para

controle de Mastites. Atualmente, os antibióticos mais utilizados são os betalactâmicos, por

exemplo, penicilinas ou cefalosporina, tetraciclinas, fluroquinolona, aminoglicosídeos,

macrolídeos e sulfonamidas. A maioria do tratamento de gado leiteiro é por infusão

intramamária de antibióticos quando o controle é de mastites.

Os medicamentos mais frequentes nos tratamentos de bovinos e caprinos para infecções

são mostrados na Figura 2.5.

Figura 2.5-Frequência para recomendação do uso de antibióticos no Brasil

Dados do SIDAN, 2013

A administração dessas substâncias é por injeção (intravenosa, subcutânea, ou

intramuscular), por via oral nos alimentos e na água, por via tópica, e por infusão intramamária

ou intrauterina (BABINGTON et al., 2012; MITCHELL et al., 1998).

Neste gráfico confirma-se que os usos de antimicrobianos do grupo das tetraciclinas são

os mais assíduos antibióticos usados para fins terapêuticos, no Brasil.

TCs

34%

PENs

11%GEN

33%

NEO

11%

SMZ

11%

38

É importante citar que, a indústria farmacêutica veterinária é idêntica à farmacêutica

humana. Muitas indústrias de produtos veterinários são fabricantes de medicamento para uso

humano. De maneira que, o crescimento da produtividade do mercado do leite, exige que

produtores usem uma criação seletiva para manutenção da saúde animal, uma vez que garantirá

a prospecção da qualidade da matéria-prima e uma possível aceitação por parte dos

consumidores. Neste ponto, o Brasil é um dos cinco maiores mercados veterinários em todo o

mundo. O setor vem apresentando crescimento, principalmente, ao aumento das exportações de

produtos veterinários, uma vez que o Brasil é um centro de produção importante para as

multinacionais. (SINDAN, 2014).

Os dados do sindicato da Indústria provam a ascendência do comércio desses

antibióticos, principalmente durante ano de 2014, como mostra a Figura 2.6.

Figura 2.6-Tendência de Crescimento da cadeia produtiva dos medicamentos usados para sanidade animal

Dados do SIDAN, 2015

Este crescimento está atrelado ao fato de no Brasil haver o maior rebanho bovino

comercial do mundo, o faturamento do mercado de leite bovino chegou a produção de 37

milhões de litros de leite em 2014 (SIDAN, 2015), e também é um dos maiores exportadores

de carne bovina.

2.500

2.700

2.900

3.100

3.300

3.500

3.700

3.900

4.100

4.300

4.500

2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Fa

tura

men

to e

m m

ilh

ões

(R

$)

Período

39

A influência da produção de leite bovino no crescimento do mercado de antimicrobianos

é nítida, segundo indicadores do IBGE, o Estado do Rio Grande do Norte atingiu produção

67105 mil litros de leite industrializado e cru (IBGE, 2015) esses dados são do primeiro

trimestre de 2015.

O crescimento na produção da cadeia produtiva do leite exige que produtores usem uma

criação seletiva para manutenção da saúde animal, uma vez que garantirá a prospecção da

qualidade da matéria-prima e uma possível aceitação por parte dos consumidores. Esses fatores

contribuem para que os produtores estejam interessados em aumentar a produtividade,

acelerando o ganho de peso do animal e diminuindo o tempo de abate. Entretanto, para isso

acontecer o animal deve ser bem tratado, o que garante a sanidade do rebanho.

Além disso, um dos motivos para tal crescimento é a necessidade de prevenir o controle

da febre aftosa (CAPANEMA et al., 2007). Segundo o SINDAN, os principais clientes da

indústria veterinária são: Médicos Veterinários, Pecuaristas de Corte e Leite, Avicultores,

Suinocultores, Equinoculturas, Revendedores, e Produtores Rurais.

Essa participação de medicamentos para bovinos no faturamento da indústria veterinária

do país está muito associada ao tratamento de febre aftosa (SINDAN, 2014).

No âmbito internacional, atualmente, 100 mil substâncias químicas diferentes são

registadas na União Europeia (UE), dos quais 30 mil produtos são comercializados em

quantidades superiores a 1 tonelada. Entre eles, os compostos farmacêuticos tornaram-se uma

preocupação crescente nos últimos anos, uma vez que foram identificadas como contaminantes

ambientais emergentes (REEVES, 2011)

40

2.4 OCORRÊNCIA, RISCO E CONTROLE DOS RESÍDUOS: Segurança Alimentar.

O uso de substâncias com finalidades terapêuticas em animais produtores de alimentos

requer, de uma maneira permanente, investigação da persistência dos seus possíveis resíduos e

dos seus valores limitantes nos produtos, de forma que não constituam risco à saúde dos

consumidores (BERENDSEN et al., 2010; GILBERT; GARDNER; BIZEC, 2012; REGASSA

et al., 2015). Uma vez que, todas as vias de administração de antibióticos em animais produtores

de alimentos podem resultar no aparecimento destes resíduos nos alimentos, como por exemplo,

carne, ovos e leite.

A permanência dos resíduos no leite pode apresentar consequências danosas, desde a

intolerância aos antibióticos a interferências no processo industrial dos derivados do leite

(HARTLÉN, 1996; PAYNE et al., 2006). Para se ter ideia, em 1958 já se tinha registros de

consequências dos resíduos de penicilina, Vickers e Bagratuni (1958) relatam que a incidência

de sensibilidade a esses antibióticos chegava a atingir 5% da população mundial, sendo que de

12 a 15% apresentavam alergias múltiplas. Os pesquisadores argumentaram que os prejuízos

eram causados pela introdução da ordenha mecânica dos animais em estágio de lactação, pois

o tratamento com penicilina procaína era diretamente na glândula mamária, o resultado do

procedimento era: antibiótico no leite.

Todavia a grande problemática, de acordo com os pesquisadores Pengov e Kirbs (2009),

é que os veterinários da União Europeia estão autorizados a prescrever medicamentos, mas

depois não são obrigados a garantir que resíduos não entrem na cadeia alimentar. Logo, a

ausência de monitoramento e controle de qualidade desses fármacos resulta em altas

concentrações de resíduos no leite humano, que põe em perigo a saúde do ser humano (OLIVER

et al., 2004), principalmente quando a exposição é prolongada, pois podem induzir formação

de patógenos resistentes. (CHANG et al., 2014). A possibilidade de resistência aos antibióticos

pode ser evitada, se tomadas medidas necessárias para controlar as dosagens corretas do

medicamento. Considerando que, a contaminação direta, mais uma vez, pode ser causada pela

administração intramamária, intramuscular e intravenosa.

Contudo, para proteger os consumidores contra os riscos relacionados com os resíduos

de medicamentos, as regras legais, em muitos países, estabelecem limites de máximo de

resíduos (LMR) (COX; POPKEN, 2006; PERRON et al., 2015). Várias medidas são tomadas

a fim de proteger a saúde pública, logo as substâncias farmacologicamente ativas são

classificadas, com base na avaliação científica de sua segurança, na maioria dos países

europeus. Um exemplo são os betalactâmicos que são amplamente aplicados na agricultura,

41

sendo a principal razão de falhas, uma vez que são administrados para satisfazer requisitos de

controle leiteiro, quando são utilizadas como substâncias inibidoras, alguns estudos mostram a

ocorrência de resíduos dessas substâncias no leite (BABINGTON et al., 2012;

THAVARUNGKUL et al., 2007; YAMAKI et al., 2004). Assim, o aumento do uso de

antibióticos potentes ou em dosagens altas (uma prática ilegal na comunidade europeia), a

gestão agrícola é importante para ajudar a minimizar o uso de antimicrobianos, No entanto,

muitas vezes, é uma medida de precaução, não uma obrigatoriedade (AGENCY, 2013;

GOWIK, 2009).

Em 2013 nos Estados Unidos, o FDA emitiu restrições para uso de antibióticos, em

práticas agrícolas da região americana. Medidas para inspeções da conformidade, fiscalizações

e investigações criminais, como forma de controle de resíduos em alimentos de origem animal,

foram estabelecidas. O motivo pelo qual o FDA proibiu o uso de alguns antibióticos, é que

muitas dessas substâncias utilizadas em animais também são usadas para tratar os seres

humanos (USFDA, 2013). Logo a presença dos resíduos constitui-se um risco, pois não seria

possível, na rotina realizada pela legislação que protege a saúde do ser humano, controlá-los

(CHANG et al., 2014).

Para promover o crescimento ou para ajudar o produtor de forma eficiente na produção

de alimentos, alguns antimicrobianos são usados em baixas doses, sendo empregados,

rotineiramente, na ração ou na água de aves, suínos e bovinos, o objetivo é de convertê-los

principalmente em ganho de peso. Segundo Nisha (2008), as utilizações de aditivos alimentares

podem melhorar a eficiência alimentar de 17% em bovinos de corte, 10% em cordeiros, 15%

em aves e 15% em suínos.

De acordo com o Instituto de Saúde Animal, esses eventos podem estar associados ao

aumento substancial dos medicamentos na prática agrícola, contribuindo com cerca de 30% a

70% do peso do animal (KUEHN, 2010). Ainda, de acordo, com o órgão americano, entre os

antimicrobianos utilizados para promoção de crescimento, alguns apresentam maior uso que as

penicilinas e tetraciclinas. Nos Estados Membros da AMDUCA é proibido o uso de

cloranfenicol, furazolidona, sulfonamidas (sulfadimetoxina, sulfabromometazina e

sulfametoxipiridazina) em gado leiteiro no período de lactação e de quinolonas e glicopeptídeos

em animais produtores de alimentos. As inquietações são constantes, pois na maioria das vezes,

essa utilização terapêutica não é supervisionada por um médico veterinário, e sim esses

produtos são comprados livremente, no balcão pelos produtores. Muito embora, o uso

42

terapêutico de um número muito pequeno de antimicrobianos tem sido proibido, devido

principalmente às preocupações com a saúde pública.

Outras nações já proíbem algumas práticas para administração de antibióticos em

produtores de alimentos. A Dinamarca proibiu o uso de antimicrobianos em suínos e frangos

no final de 1990, a União Europeia proibiu o uso de algumas substâncias para promover o

crescimento do gado em 2006, uma delas é o cloranfenicol. No Canadá, este fenicol, seus sais,

derivados, bem como os compostos de nitrofuranos, foi coibida a venda. Na Austrália, o uso de

cloranfenicol, nitrofuranos (incluindo furazolidona e nitrofurazona), Fluroquinolones,

gentamicina, estreptomicina, sulfonamidas e vários não é permitida. De igual modo, o Reino

Unido vetou o uso de penicilina e tetraciclinas para a promoção do crescimento no início de

1970; outros países europeus seguiram o exemplo logo depois, tal como a Suécia que impediu

a utilização de todos os antibióticos para promover o crescimento, em 1986 (BARRETO et al.,

2012; HEALTH CANADA, 2012; KUEHN, 2010; REEVES, 2011; REZK et al., 2015;

VARGAS MAMANI; REYES REYES; RATH, 2009; VERA-CANDIOTI; OLIVIERI;

GOICOECHEA, 2010), Enquanto isso, no Brasil, o cloranfenicol tem sido banido (MAPA,

2003; REZENDE et al., 2012; REZENDE; FILHO; ROCHA, 2012). Todas essas restrições são

baseadas em ocorrências durante períodos de produção de alimentos, por exemplo, segundo

dados da prevalência de resíduos de antibióticos em vacas leiteiras de 2013 a 2014, nos Estados

Unidos, foram registrados 24,3% de permanência de penicilina em leite, e 10,02% de

sulfonamidas, esses dados são oficiais do Relatório de Programas Nacionais Trimestrais (FSIS,

2011). Consequentemente, as medidas tomadas para redução do uso de agentes antimicrobianos

na agricultura resultaram na supressão de alguns produtos.

Diante deste quadro e apesar do setor de produtos veterinários apresentarem ascenção

econômica (comprovado pelo item 2.3 deste Capítulo), afirma-se que os riscos do inadequado

uso de antibióticos em gado leiteiro, para prevenir e tratar infecções microbianas como mastite,

recebeu uma maior atenção por parte da saúde pública da maioria dos países emergentes, pois

é nitida a consciência de que essas substâncias podem acarretar na presença de resíduos e

metabólitos nos gêneros alimentícios, causando uma série de complicações, como infecções

difíceis de tratar, reações alérgicas nos seres humanos, pois são tóxicos pela presença de

bactérias resistentes aos antibióticos, podendo atingir o meio ambiente direta ou indiretamente

(BERENDSEN et al., 2010; BOHM; STACHEL; GOWIK, 2009; CHEN, G. L., AND FANG,

2011; KABIR et al., 2004; LOPEZ et al., 2008; OLIVER et al., 2004; SALMOND; WELCH,

2008; SAMANIDOU; NISYRIOU, 2008; SHERIDAN et al., 2008; WEBER et al., 2005).

43

Ainda há relatos que agentes antimicrobianos, na alimentação independentemente da

dosagem, podem ser potencialmente cancerígenos (KOESUKWIWAT, 2007b). No Brasil, para

garantir a segurança alimentar humana, o MAPA limita a quantidade de antibióticos no leite,

através da Portaria Ministerial nº 574, de 06 de dezembro de 1998 e Instrução Normativa nº 8,

de 29 de abril de 2010 e a de nº 42, de 20 de dezembro de 1999 que tratam do Plano Nacional

de Controle de Resíduos em Produtos de Origem Animal (PNCRC) que consiste em

monitoramento constante visando evitar violações dos limites máximos (LMR) destas

substâncias (MAPA, 1999; MAPA 2010). Essa limitação por LMR depende do composto e da

matriz afetada. De igual modo, no âmbito internacional, as legislações, como Codex

Alimentarius, EC (European Commission), FDA (Food and Drug Administration) também

limitam a quantidade de antibióticos no leite e adotam métodos que garantam a disponibilidade

de um alimento seguro.

O limite máximo de resíduos e contaminantes em alimentos é estabelecido com base na

análise toxicológica e farmacocinética da substância química, ou seja, do risco ou perigo que

ela possa representar para a saúde humana (ALIMENTARIUS, 2006; VICH, 2011) e é

calculado pela Equação 5. Esse risco toxicológico de resíduos, leva em consideração, a

probabilidade do aparecimento de um efeito adverso e a sua magnitude, que é calculado através

da IDA (mg Kg-1) do medicamento presente no produto de origem animal, ao qual se incorpora

um fator de segurança da ordem de até 100 vezes. Este fator é acionado visando atender às

demandas geradas pela variação individual de sensibilidade do consumidor às substâncias

químicas (idade, sexo, raça, estado de higidez, etc.).

LMR =IDA

FS

(5)

A IDA, por sua vez, é calculada a partir do valor NOEL de uma substância química, ao

qual se incorpora, também, um fator de segurança da ordem de 100 expresso pela Equação 6.

Entende-se por NOEL a maior dose de uma substância química que, se usada, não produz

efeitos adversos (FAO, 2013).

IDA =

NOEL P (60Kg)

FS (6)

44

Onde IDA é o valor de ingestão diária, FS é o fator de segurança e NOEL é o efeito não

observado. Sendo que, os valores deste último, advêm da avaliação crítica e sistemática da

literatura científica mundial a respeito da toxicidade das substâncias químicas. São, assim,

analisados considerando a oncogenicidade, genotoxicidade, teratogenicidade, toxicidade

reprodutiva, fetotoxicidade, toxicidade sistêmica aguda, prolongada e crônica (hepática, renal,

cardíaca, muscular, etc.) e os que promovem alergias. Em casos específicos dos

antimicrobianos, são exigidos ainda alguns ensaios ditos especiais e ligados a possíveis efeitos

dos mesmos sobre a microflora do trato gastrintestinal humano (FAO, 2013).

De maneira que, ao fixar-se o LMR, levam-se em conta riscos importantes das

substâncias químicas para a saúde pública, como, por exemplo, aqueles ligados à

oncogenicidade ou genotoxicidade, sendo que o limite de substâncias que alteram o material

genético deve ser zero, isto é, resíduos destes compostos não devem ser encontrados em

alimentos. No caso de antimicrobianos destinados à produção animal, exigem-se ainda para

análise de risco a realização de alguns testes ditos especiais. Assim, além do cálculo da IDA,

embasada em análises de toxicidade (como especificado acima), é também mandatário que se

busquem por possíveis efeitos destes agentes sobre a microflora do trato gastrintestinal humano;

mais que isto, exige-se a determinação da dose a partir da qual este antimicrobiano teria

condições de selecionar linhagens resistentes de bactérias.

Para a análise dos LMR de um antimicrobiano destinado à produção animal são

considerados dois valores de IDA: um dito toxicológico e derivado de cálculos de toxicidade e

outro, dito microbiológico (EMEA, 2002). Para fixar os valores desse limite máximo, a

Comissão do Codex Alimentarius analisa detalhadamente os níveis residuais do mesmo na

carcaça dos animais tratados, conforme a posologia recomendada para a medicação. Para esta

finalidade usam-se, geralmente, medicamentos marcados radiotivamente, medindo-se as

concentrações tissulares dos mesmos (músculo, gordura, fígado, rins e ovo ou leite) horas após

a interrupção do tratamento. Estima-se a quantidade real de resíduos de medicamentos

veterinários que pode ser ingerida pelo ser humano, antes de fixar os LMR (CODEX

ALIMENTARIUS, 2001). A União Europeia usa o mesmo tipo de procedimento para fixar

períodos de carência dos produtos destinados aos animais de produção. Assim, conhecendo-se

a quantidade real de resíduos torna-se possível deliberar sobre os períodos de carência para o

medicamento em análise (CHRISTODOULOU; SAMANIDOU, 2007; KANTIANI et al.,

2009; KARAGEORGOU; SAMANIDOU, 2011; PRUDEN, 2009; RAMBLA-ALEGRE et al.,

2011a; THORSEN et al., 2006).

45

Obviamente que, o estabelecimento de LMR e de períodos de carência para os

antimicrobianos não assegura um “risco zero” para os mesmos. Até porque “risco zero não é

risco, é certeza e certeza em ciência não existe”. No entanto, o uso de medidas conservadoras

como, por exemplo, o estabelecimento da IDA e LMR diminui consideravelmente a

possibilidade de que efeitos adversos venham a ocorrer em consumidores que ingerem

concentrações residuais de antimicrobianos nos gêneros de origem animal, ou seja, as

concentrações devem estar abaixo dos LMR fixados para os alimentos (NATIONS;

ORGANIZATON, 2000).

O intervalo de segurança é o tempo necessário para que o resíduo de risco toxicológico

atinja uma concentração segura, tal como definido pela tolerância, ou seja, é o intervalo de

tempo que o medicamento seja eliminado do organismo do animal, até que o momento do abate

ou ordenha seja permitido (a responsabilidade de executar essa medida é do produtor). Para tal,

a OMS estabelece a tolerância como sendo a concentração para que o a substância química

permaneça o tecido, até que a parte comestível seja considerada segura para consumo humano.

Logo, as tolerâncias são fixadas com base em extensos estudos toxicológicos de perigos

potenciais desse consumo (FAO/WHO, 1968; JOHNSTON, 1992; NISHA, 2008; WHO, 2006).

Desta forma, considera-se a detecção de níveis baixos de resíduos no leite, como sendo de

grande importância para a indústria, e para os agricultores; com a responsabilidade de garantir

que o leite contaminado não é expelido no meio ambiente (CODEX ALIMENTARIUS, 2009;

KANG’ETHE et al., 2005; KNECHT et al., 2004; NICOLICH; WERNECK-BARROSO;

MARQUES, 2006).

É importante citar que mesmo em baixas doses, mas por longos períodos, os antibióticos,

podem resultar em resistentes a microrganismos por isso que, nos Estados Unidos, o FDA e

órgãos estaduais monitorizam leite e outros alimentos para resíduos de drogas. Os antibióticos

aprovados pela FDA para o tratamento intramamária da mastite em vacas leiteiras estão listados

na Tabela 2.4, incluindo seus limites aos máximos permitidos.

No Brasil o PNCRC (já citado) visa garantir a saúde do consumidor, por meio de um

monitoramento da presença de resíduos de medicamentos veterinários e contaminantes

ambientais, em produtos de origem animal (carnes, leite, pescado e mel).

46

Um dos principais objetivos do monitoramento do MAPA é integrar o esforço destinado

à melhoria da produtividade e da qualidade dos alimentos e, secundariamente, proporcionar ao

país condições de se adequar, do ponto de vista sanitário, às regras do comércio internacional

de alimentos, preconizadas pela Organização Mundial do Comércio (OMC) e outros órgãos,

como FAO e Organização Mundial da Saúde (OMS) (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA

PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2007, 2011). Na Tabela 2.1 é apresentado um quadro

comparativo dos valores máximos de resíduos, baseados nos organismos legais, tais dados são

recomendados pelo MAPA e ANVISA. Os compostos analisados são apresentados.

Tabela 2.1- Correlação entre os LMRs admitidos em principais subprogramas de monitoramento e Controle

dos Resíduos de Antibióticos em Leite

Antibióticos LMR (µg Kg-1)

MAPA/PNCRC PamVet Codex FDA/FAO/JECFA EC/EMEA Japan

ABAM 10 NE NE NE NE 20

IVERM 10 NE 10 NE 15 10

PENG e PENV 4 4 4 4 4 4

CTO NE NE 100 100 NE 100

AMP 4 4 NE NE 4 20

TC 100 100 100 100 100 NE

OTC 100 100 100 100 100 NE

CTC 100 100 100 100 100 NE

DOX 100 NE 100 100 100 NE

SDX 100 NE 25 NE 100 60

SMZ 100 100 NE NE 100 NE

TMP 50 100 NE NE 50 50

STR NE NE 200 200 200 200

DHSTR NE 100 200 200 200 200

NEO NE 500 1500 1500 (bovinos) 1500 500

GEN NE NE 200 200 (bovinos) 100 200

ENR 100 40 NE NE 100 50

CLF 0,30 0 NE NE 10 NE

NE: não estabelecido neste no período correspondente

O Codex Alimentarius estabelece o LMR para leite segundo as espécies produtoras,

neste caso levou-se em consideração as de bovinos e caprinos. A comissão europeia também

utiliza o mesmo critério, porém a cada período é estabelecido limite de acordo com a ocorrência

de determinado resíduo. Esses limites são preconizados conforme a exposição de cada

população aos contaminantes, sendo cada país responsável por executar e elaborar os

subprogramas para monitoramento. Os valores não estabelecidos referem-se a dados que não

foram possíveis obter com os cálculos da IDA, por exemplo, o JECFA/FDA argumenta que não

obteve informações necessárias para avaliar a carcinogenicidade do cloranfenicol, bem como

os efeitos sobre a reprodução, principalmente porque o composto é genotóxico, assim não foram

47

obtidos valores de IDA e consequentemente do limite máximo. Apesar dessas dificuldades os

valores LMR, dentro dos subprogramas de monitoramento de resíduos, são renovados, a

exemplo do PamVet/ANVISA que teve sua última atualização em 2006.

Neste contexto, um desafio enfrentado pelos programas de monitoramento é de controlar

um número elevado de amostras de leite quanto à presença dos mais importantes resíduos dos

antimicrobianos, usando um método rápido e confiável, dentre eles os mais utilizados, para

rastreio, são os microbiológicos e imunológicos. Já os métodos cromatográficos são destinados

à determinação quantitativa de fármacos e/ou metabólitos nessas matrizes biológicas, sendo

classificados como métodos Bioanalíticos (ANVISA, 2003).

Algumas aplicações são concernentes à cromatografia liquida (BALIZS; HEWITT,

2003; RAMBLA-ALEGRE et al., 2011a, 2011b; RIEDIKER; DISERENS; STADLER, 2001;

STOLKER; BRINKMAN, 2005), eletroforese capilar (LARA et al., 2006), cromatografia

liquida acoplada a arranjo de fotodiodos UV, (BAILÓN-PÉREZ et al., 2009;

CHRISTODOULOU; SAMANIDOU, 2007), detecção fluorimétrica (RODRÍGUEZ-DÍAZ et

al., 2006) eletroquimioluminescência (GUO; GAI, 2011) e métodos espectroscópicos (NOUR

EL-DIEN et al., 2010) que vêm sendo mais recomendados para detecção simultânea de

antibióticos no leite. Todos os métodos, citados acima, são validados para que tenha a finalidade

de detectar os compostos, abaixo dos seus limites admissíveis, e avaliados de acordo com a

Diretiva do Conselho 2002/657/CE (EUROPEAN COMISSION, 1993).

O funcionamento desses programas é um desafio para muitas nações (GORRIS, 2005;

JACXSENS et al., 2010; KANG’ETHE et al., 2005; KUSSAGA et al., 2014; MA et al., 2012;

RAKOTOHARINOME et al., 2013; REDDING et al., 2014). Kang´ethe et al (2005) mostraram

os riscos de consumir leite comercializado contendo resíduos de antimicrobianos, para isso

foram realizados testes em 110 amostras de leite pasteurizados e 854 não pasteurizado, os

pesquisadores detectaram 16% das amostras continham resíduos de antibióticos em leite que

estavam sendo comercializado no sul do Quênia no continente africano, foi relatado um índice

de exposição até cinco vezes maior que o normal durante um mês.

Neste Contexto, é muito comum, em países pobres e tropicais, a ocorrência de resíduos

de antibióticos em alimentos, pois os respectivos orgãos legisladores, na maioria das vezes,

desconhecem a extensão de tais problemas, além de não haver programas para controlar a

qualidade dos alimentos. Além disso, pode acontecer de não haver proibição da venda desses

produtos contaminados. Desta forma, a ocorrência dos resíduos de antimicrobianos pode ser

atribuída a não observância dos períodos para sua eliminação, antes da venda dos alimentos.

CAPÍTULO 3

MÉTODOS OFICIAIS E INDICADORES DOS AVANÇOS DA

LITERATURA CIENTÍFICA

49

3 MÉTODOS OFICIAIS E INDICADORES DOS AVANÇOS DA LITERATURA

CIENTÍFICA

3.1 REVISÃO DOS MÉTODOS APLICADOS AO CONTROLE DE QUALIDADE DE

TERAPÊUTICOS PARA USO VETERINÁRIO.

Para que um medicamento veterinário venha ser distribuído, este deve obedecer alguns

requisitos de qualidade, isto é, os produtores e fornecedores devem garantir dados legítimos,

que compreendem a veracidade das propriedades físico-químicas, principalmente quanto a

descrição física, tais como: a solubilidade em solventes comuns (água, álcoois, clorofórmio,

acetona,), ao pH em meio aquoso (pH 1 a 8, a dose / volume de solubilidade), a distribuição de

tamanho de partícula, aos valores de pKa, as máximas absorção no ultravioleta (UV), a

absortividade molar, ao ponto de fusão, ao índice de refração (para um líquido) e ao coeficiente

de partição (FINGLETON, 2004; WETZSTEIN, 2000). Desta forma, a natureza química dos

medicamentos é descrita, pois contêm parâmetros que determinam o seu comportamento

farmacocinético (REEVES, 2011). Outra razão para tal averiguação deve-se ao fato de que, os

fármacos podem absorver impurezas, nas várias etapas do seu desenvolvimento, principalmente

no transporte e armazenamento. Esta influência pode causar riscos a sanidade animal e gerar

resíduos, nos produtos da cadeia produtiva (SIDDIQUI; ALOTHMAN; RAHMAN, 2013).

Por estas razões, os métodos desenvolvidos, neste trabalho, desempenham uma função

importante na averiguação da identidade dos antibióticos, pois as informações conferem a

certeza que esses produtos são eficazes (LIU; HU, 2011; PENNACCHIO et al., 2016;

WONGTANGPRASERT; PALAGA; KOMOLPIS, 2011; WUETHRICH; HADDAD;

QUIRINO, 2015).

As normas seguidas para qualidade das formulações injetáveis dos antibióticos

consistem de: medidas de pH, rotação óptica, absorção em ultravioleta visível e análise dos

espectros no infravermelho (VICH GL39, 2006). Os procedimentos para avaliação são

embasados nas normas 01/2008: 50300 e 2009/9/EC (EUROPEAN PHARMACOPOEIA

COMMISSION, 2008), além dos procedimentos oficiais descritas em Farmacopeia Japonesa

(JP XVI, 2007). Esta Farmacopeia tem sido uma das mais completas e versáteis, em termos de

aplicação dos métodos aos antibióticos, aceitas pela comunidade internacional. As prescrições

contidas nas Farmacopeias Brasileiras são respeitadas, a fim de garantir a confiabilidade dos

métodos desenvolvidos para amostras do Brasil (BRASIL, 2010).

Este trabalho considera a denominação pela União Internacional de Química Pura e

Aplicada (IUPAC), Chemical Abstracts Service (CAS), isto é, tem-se atenção à classificação

50

terapêutica, farmacológica, e a identidade quanto à fórmula estrutural, molecular, peso

molecular, grau de impureza, composição qualitativa e quantitativa, ponto de fusão, ponto de

ebulição, pressão de vapor, solubilidade na água e em solventes orgânicos a temperatura

determinada, densidade, rotação óptica, índice de refração e formulação do produto são

importantes como descreve Lawrence (2008) em seu trabalho.

A quantificação de resíduos de PENG em amostras complexas consiste em uma tarefa

difícil, pois se exige, sempre, um método válido que seja eficaz e robusto, porque as moléculas

de betalactâmicos, como é o caso da penicilina, apresentam natureza polar, anfotérica e são

suscetíveis às degradações (CASTRO-PUYANA; CREGO; MARINA, 2010; CHEN et al.,

2008; NOVÁKOVÁ; VLČKOVÁ, 2009; PÉREZ; RODRÍGUEZ; CRUCES-BLANCO, 2007).

Para minimizar esses efeitos, foram realizadas análises de identidade dos grupos de antibióticos,

que podem gerar resíduos em quantidades acima do LMR no leite.

Os valores de pKa são utilizados para delinear as propriedades físico-químicas dos

fármacos, pois o grau de ionização destes dissolvidos, está relacionado com seu valor intrínseco,

e a partir do pH da solução são planejadas as principais condições experimentais. Logo, o grau

de ionização para um fármaco controla a solubilidade, taxa de dissolução, cinéticas de reação,

complexação e as ligações com as proteínas (PRANKERD, 2007; REEVES, 2011).

As autoridades reguladoras exigem que sejam realizados testes de risco para novos

medicamentos e agentes antimicrobianos (produtos formulados) antes da autorização para

comercialização (KORAKIANITI; REKKAS, 2011; MANDENIUS et al., 2009; WHO, 2012).

Além disso, são realizados exames laboratoriais, que asseguram o tempo de prateleira, além da

verificação do tempo de armazenamento e condições de transporte adequadas (BARBER,

2005).

Essa qualidade é reafirmada pelas atividades técnicas e gerência do sistema de

padronização, que inclui a avaliação de produto, documentação até a qualidade do laboratório

realizador das medições (BAERT; DE SPIEGELEER, 2010; FENT; WESTON; CAMINADA,

2006; ORGANIZATON, 2007). Portanto, a finalidade da garantia da qualidade no apoio

farmacêutico é ajudar a certificar que o medicamento seja seguro, eficaz e adequado para o

“paciente”.

51

Alguns trabalhos mostram a importância do controle de qualidade para segurança e

eficácia dos produtos, um exemplo é o trabalho de Mazumder, Bhattacharya e Yadav (2011)

que oferecem uma ampla visão do conceito de gestão na indústria que leva à melhoria dos

atributos desses produtos.

A avaliação do risco considera o processo de fabricação (os perfis toxicológicos das

impurezas resultantes da síntese são de interesse particular), pureza e composição para garantir

a conformidade e o padrão de qualidade. Segundo os métodos descritos pela Farmacopeia

Japonesa (JP XVI, 2007), a composição do medicamento deve ser regida pela pureza mínima

do ingrediente ativo, a proporção de isômeros e de diastereisômeros (se for o caso), e a

concentração máxima de impurezas, incluindo aqueles de preocupação toxicológica.

A avaliação do risco global, conduzida pelas autoridades reguladoras, garante que

drogas antimicrobianas de várias naturezas, e para diferentes lotes de mesma manufatura, têm

perfis que são aceitáveis em termos de eficácia e segurança para sanidade animal, e

consequentemente a saúde pública e ambiental (ALTUNAIJI et al., 2012; DIOP et al., 2009;

EUROPEAN COMMISSION 37/2010/EC, 2009; HALEEM et al., 2014; JP XVI, 2007;

MANN, 2005; MONTGOMERY, 2009; NICOLAS, 2007; ZUCCATO et al., 2006).

Sabendo que, o progresso científico levou ao desenvolvimento de numerosos compostos

sintéticos, é imperativo desenvolver métodos analíticos para determinar essas substâncias tanto

na fase manufatura, e principalmente controlar de qualidade das formulações farmacêuticas e

sua determinação nos organismos. Para este fim, os métodos citados neste trabalho fornecem

uma boa estratégia para garantia da correta dosagem e avaliação da estabilidade dos

medicamentos.

As necessidades do controle de qualidade exigem também que as técnicas empregadas

sejam relativamente rápidas, a fim de minimizar o tempo de inatividade do produto. Como

consequência novos métodos têm sido desenvolvidos para quantificação de antibióticos em

medicamentos, um exemplo é o trabalho de Tan et al (2013) que aplicam um bioensaio

quantitativo para eritromicina em amostras obtidos por fermentação (Saccharopolyspora

erythraea). Os autores usaram como métodos de referência o HPLC e colorimétrico e a fim de

avaliar a exatidão dos métodos. Os resultados indicaram que o método é adequado, pois é

comparável aos resultados dos tradicionais. Segundo os autores foram alcançados um alto

rendimento para os compostos isolados, além disso, o custo foi bem reduzido e aplicável à

análise geral dos antibióticos.

52

Neste contexto, novas técnicas como a espectrometria de absorção atômica, eletroforese,

espectrofluorimetria, cromatografia líquida, espectrometria de massas, espectrometria de

luminescência, voltametria e polarografia têm sido utilizados para a determinação de compostos

farmacêuticos (DA SILVA et al., 2013; GUMUS; FILIK; DEMIRATA, 2005;

OZKORUCUKLU; SAHIN; ALSANCAK, 2011). A respeito disso, Siddiqui, Alothman e

Rahman (2013) destacam uma variedade de técnicas analíticas utilizadas na análise desses

produtos farmacêuticos.

Porém, algumas questões têm sido levantadas sobre tais métodos, em 2005, Görög

(2005) faz uma comparação entre os métodos das farmacopeias europeias e americanas,

avaliando-os de forma crítica. Os autores indagam o que justifica o crescente aumento dos testes

de impureza e dos métodos de ensaio na caracterização da qualidade de um fármaco. Os

pesquisadores discutem a maneira com que são realizados os cálculos dos teores de princípio

ativo a partir dos resultados dos ensaios.

Mas o fato é que os métodos cromatográficos têm sido amplamente utilizados e

recomendados. No entanto, estas técnicas necessitam de equipamentos complexos e de alto

custo, utilização de solventes, preparo de amostras, procedimentos intensivos e trabalhosos.

Apesar disso, a eficiência destas técnicas de separação depende, exclusivamente, do bom

planejamento das condições para identificação e determinação, usando cromatografia, uma vez

que são métodos oficiais de grande aceitação.

Aliado a crescente evolução das novas práticas, os métodos espectroscópicos têm sido

muito reportados para determinação simultânea dos compostos ativos. A aplicação desta técnica

é considerada uma ferramenta capaz de realizar análise quantitativa de misturas complexas de

forma precisa e exata, porém esse bom desempenho depende de um método de referência bem

consolidado (GERVAIN et al., 2011; KHOPTYAR et al., 2013; VETUSCHI et al., 2005).

Há de se falar que nas últimas décadas, a espectroscopia ganhou rapidamente aplicação

no domínio da análise farmacêutica, para superar o problema de interferência, devido a

substâncias que não são compostos de interesse, geralmente presentes nos fármacos

(KAWATA, 2007). Esta técnica associada à regressão multivariada e processamento de dados

tem recebido atenção, pelas indústrias de medicamentos, a fim de realizar medidas rápidas, sem

consumo de reagentes e principalmente diminuindo custos com mão de obra. (ALVARENGA

et al., 2008; BLANCO et al., 2006; CLARKE, 2004; KREMER, 2002; MARK, 1989;

STORME-PARIS et al., 2010; XIE et al., 2010).

53

3.1.1 Determinação da rotação óptica de um antibiótico

A Polarimetria consiste em um dos métodos para averiguação da qualidade dos

medicamentos (BRITISH PHARMACOPOEIA, 1983; JP XVI, 2007). A pureza óptica do

fármaco é determinada pela medição da rotação especifica [𝛼]𝐷200

e subsequente comparação com

os valores de referência, uma vez que cada composto, biologicamente, ativo tem sua quiralidade

(GILPIN; GILPIN, 2011). Essas avaliações são baseadas no pH, concentração da solução (g

mL-1), Temperatura (ºC) e absorção no ultravioleta visível (nm).

As propriedades dos antibióticos, enantiômeros tais como: ponto de fusão e índice de

refração é semelhante, mas difere na atividade óptica, esta apresenta capacidade de girar o plano

de polarização, quando é atravessado por um feixe de luz polarizada, evidencia a atividade do

fármaco, por isso tem-se executado esta medida (ISHII et al., 2008).

De acordo com método 01/2008: 20207 descrita na Farmacopeia Europeia, a rotação

óptica é a propriedade exibida por substâncias quirais, capazes de girar o plano de polarização

da luz polarizada. Substâncias (+) apresentam efeito dextrorotatoria, no qual o plano é girado

no sentido horário, enquanto que compostos (-) apresentam efeito levogiro no qual o plano de

luz polarizada é girado no senti anti-horário. A detecção é baseada na interação entre um centro

quiral no analito, e o incidência da radiação eletromagnética magnética polarizada

(EUROPEAN PHARMACOPOEIA COMMISSION, 2008).

Por convenção a rotação óptica para um líquido é descrita pelas Equação 7.

[∝𝑚]𝜆𝑡 = 0,1745 [∝]𝜆

𝑡 (7)

Onde: α é o ângulo de rotação, quando a 20 ºC, pode ser expressa pela Equação 8.

[∝𝑚]𝐷20 =

∝

𝑙. 𝑝20

(8)

Onde: l é a comprimento do tubo, p20 é a densidade do liquido. Para cálculo com

concentração de solução a Equação 9 é considerada.

[∝𝑚]𝐷20 =

1000 ∝

𝑙. 𝑐 (9)

54

De modo que a rotação óptica específica de um líquido é o ângulo α de rotação, expresso

em graus (°), do plano de polarização no comprimento de onda da linha D do sódio (λ = 589,3

nm) medido a 20 ° C no líquido a ser examinada, calculada com referência a uma camada de 1

dm e dividido pela densidade expressa em gramas por centímetro cúbico.

Quanto ao instrumento, o polarímetro é um dispositivo, simples que mede de forma não

destrutiva as propriedades ópticas de moléculas, através da detecção de mudanças de rotação

do plano da luz linearmente polarizada. Embora, as ondas de luz possam oscilar em planos ao

longo de três dimensões, a orientação rotacional desses planos é definida principalmente pelos

campos elétricos e magnéticos. O aparelho é constituído por dois prismas de Nicol, um atuando

como polarizador e o outro como analisador (LIMA, 1997). As medidas realizadas no

polarímetro apresentam capacidade de os produtos das reações químicas afetarem tais

orientações, sendo alteradas as estruturas moleculares dos compostos opticamente ativos. Logo,

o valor da rotação óptica observada é o resultado da forma e da concentração de qualquer

mistura de moléculas quirais presentes na amostra (LESNEY, 2004). A Figura 3.1 mostra o

plano de luz polarizada da amostra girado no sentido horário.

Figura 3.1-Ilustração da rotação óptica de um composto quiral biologicamente ativo

Adaptado de Prentice-Hall, Inc. A Pearson Company, 1995 – 2002. (Chiral Compound in Plane-Polarized Light)

Disponível em: http://wps.prenhall.com/wps/media/objects/724/741576/chapter_05.html

As rotações observadas de enantiômeros são opostas em cada direção, pois um dos

estereoisômeros rotaciona a luz polarizada numa direção dos ponteiros do relógio, denominado

dextrogiro, na ilustração acima, por exemplo, α pode ser -90º ou + 270º em vez de + 90º.

A desvantagem desta técnica é na quantificação dos compostos, pois para isso necessita-

se de quantidade de amostra na ordem de mg, o que para aplicação de antibióticos para

medicamentos é viável, mas não para análises de resíduos (LIMA, 1997). Assim, os métodos

empregados para quantificação dos fármacos nos medicamentos (GERGELY, 1989; S, 1985)

Métodos têm sido proposto para aperfeiçoar as medidas no instrumento, Kankare et al

(1986) demonstra quais as melhores condições para aumentar o desempenho do aparelho. Os

55

principais requisitos é que o limite da relação sinal/ruído que geralmente é alcançado em níveis

mais baixos de energia. Alguns métodos são mais sensíveis, por exemplo, Ng Linder (2003)

identifica os seis isômeros análogos da tetraciclina. De acordo com os pesquisadores cada

análogo apresenta uma rotação específica, entretanto todos os estes são semelhantes

estruturalmente, mas apresentam diferenças significativas nas rotações.

É fato, muitos compostos são, terapeuticamente, eficazes, pois são quirais, uma vez que

a estereoespecificidade está diretamente relacionada com a assimetria molecular sendo

determinante para sua atuação nos organismos (BARREIRO; FERREIRA; COSTA, 1997;

STALCUP, 2010). Os diastereisômeros e enantiômeros quirais têm significativamente

diferentes atividades biológicas. Um exemplo é a Benzilpenicilina que exibe três centros quirais

(oito formas opticamente ativas isto é 8 estereoisômeros): somente o estereoisômero 3S:5R:6R

apresenta atividade, na Figura 3.2 é apresentada um dos centros quirais da penicilina G. A

conformação dos esteriisômeros foram calculados usando o software ChemSkech. A Estrutura

foi otimizada pelo software.

Figura 3.2-Visualização de um dos Centros Quirais da Benzilpenicilina (A), imagem em 3D (B)

1 OH2

O3

4N5

6 S7

8 CH39

CH31011

12O13

NH14

15

161718

19

20

21

22

O23

S

*

R (A)

(B)

(C)


Embora os isômeros R e S apresentem os mesmos substituintes, esses dois enantiômeros

formam diferentes relações espaciais. Assim, somente em um isômero pode residir toda a

atividade farmacológica, no caso, os demais podem ser considerados impurezas, por serem

inativos.

56

Contrariamente dois isômeros são capazes de apresentar atividade farmacológica

qualitativa e quantitativa quase idêntica (ISLAM; MAHDI; BOWEN, 1997; LU, 2007;

RENTSCH, 2002). De acordo com Leffingwe (2003), 56% dos medicamentos, atualmente em

uso, são compostos quirais, e 88% destas drogas sintéticas quirais são utilizados

terapeuticamente como misturas racêmicas. Infelizmente, existem muitos enantiómeros, no

qual a estereoespecificidade inferem no metabolismo e efeitos farmacodinâmicos não são

conhecidos (RENTSCH, 2002). Ainda de acordo com Capozziello e Lattanzi (2003) a maioria

das propriedades das moléculas é invariante à reflexão.

Quando examinadas em um ambiente aquiral, os enantiômeros são idênticos em muitos

aspectos, tais como: na solubilidade, na densidade, no ponto de fusão, no tempo de retenção

cromatográfico e no comportamento espectroscópico (UEDA e al., 2007).

Quanto às propriedades de rotação eles mudam seu sinal (CAPOZZIELLO;

LATTANZI, 2003), porém é muito mais difícil produzir um único estereoisômero, embora

possa ser pouco complexo a obtenção de grandes quantidades quando entra em atividade o

Penicillum (HERSBACH, 1983), sendo outros compostos quirais provenientes de espécies

biológicas difíceis, ou mesmo impossíveis sua síntese química (BURNS, 1986;

ELMARROUNI et al., 2010; ISHIBASHI et al., 2005; UEDA et al., 2007).

57

3.1.2 Espectroscopia para identificação e quantificação de antibióticos em terapêuticos

de uso veterinário.

Neste trabalho foram utilizadas as regiões de UV e IF para identificação dos antibióticos

e confirmação de suas absorções. Com relação à espectrofotometria no UV é uma técnica para

medir o grau de absorção de luz entre os comprimentos de onda 200 nm a 800 nm, para

investigar a identidade e pureza das substâncias (JP XVI, 2007; SÁNCHEZ ROJAS; BOSCH

OJEDA, 2009; SPINELLI; GONZALEZ, 2007).

As medidas geralmente são realizadas quando luz monocromática passa por uma

substância em solução, a proporção de luz transmitida é I e a intensidade da luz incidente é I0,

expressas em transmitância; transmitância expressa em percentagem é denominada transmissão

T, e o logaritmo do inverso da transmitância são nomeados de absorbância (EUROPEAN

PHARMACOPOEIA COMMISSION, 2008; JP XVI, 2007; MOAN, 2001).

Nestas medidas, o espectro de absorção das substâncias presente na solução é

característico, dependendo da sua estrutura química.

Esta técnica tem sido aplicada para vários sistemas químicos, como produtos

farmacêuticos, alimentos, cosméticos e amostras ambientais (SHEN, 2011; VETUSCHI et al.,

2005; ZEITLER et al., 2007), bem como o tratamento de dados espectrofotométricos têm sido

abordadas, com o objetivo de extrair uma maior quantidade de informação analítica, a partir de

espectros de bandas não resolvidas (SÁNCHEZ ROJAS; BOSCH OJEDA, 2009).

Os recentes avanços em detectores sensíveis de fibra óptica de eletrônica de alta

velocidade e softwares poderosos tem-se destacado nesses trabalhos. Uma vez que, a utilização

de fibras ópticas, como orientadora da luz, permite uma grande modularidade e flexibilidade na

criação de um sistema de medição óptica. Estes novos espectrômetros usam dispositivos que

oferecem excelente desempenho e amplas aplicações da espectroscopia de UV a NIR. Esses

instrumentos são considerados de baixo custo e de ótima robustez, esses parâmetros têm

revolucionado a detecção na espectroscopia, devido à sua combinação única de sensibilidade

excepcional e de alta velocidade na coleta dos espectros.

58

3.1.2.1 Importância da Região no Ultravioleta e Infravermelho Próximo

Por um longo tempo, absorções na região do infravermelho próximo (NIR) na região de

750 – 2500 nm foram consideradas de interpretação complexa, contrariando o fato de que essas

absorções são harmônicas e apresentam bandas vibracionais do tipo C – H, N – H e S – H., e

como tais, não só são muito menos intensas, mas também é complexa a atribuição das principais

características dos grupos funcionais presentes nas amostras, como é realizado no

infravermelho médio (HOSHI, 2007; MARIN; MOORE, 2011; SIESLER et al., 2008;

WORKMAN, 1996).

Neste aspecto, Plugge e Van Der Vlie (1992) apresentam vantagens para aplicações

quantitativas são elas: as amostras podem ser medidas como tal na refletância ou de

transmissão, sem qualquer preparação e (adição de solventes ou qualquer outro diluente). Desta

forma, o NIR despontou como uma ferramenta útil em diferentes campos industriais onde se

exijam matérias primas de qualidade. Seu uso em análise farmacêutica é bastante comum como

método de rotina.

Vários comentários têm sido propostos incluindo variadas aplicações, tais como: a

identificação de matérias-primas, a determinação do tamanho de partícula e dos principais

componentes (BLANCO; PEGUERO, 2010; DUNN et al., 1998; LUYPAERT; MASSART;

VANDER HEYDEN, 2007; LYON et al., 2002; SARRAGUÇA; LOPES, 2009; SCAFI;

PASQUINI, 2001a).

As técnicas expectroscopias na região do UV VIS NIR, também tem sido utilizada para

determinações quantitativas de compostos específicos em matrizes complexas, como, por

exemplo, uma preparação farmacêutica (BARTON et al., 2002). As etapas podem incluir a

realização de procedimentos tradicionais como espectrometria no UV e emprego de métodos

colorimétricos (KARPIŃSKA; MIKOŁUĆ; PIOTROWSKA-JASTRZEBSKA, 1998). Porém

somente podem ser válidas se fundamentadas em métodos referência oficialmente

reconhecidos.

59

As principais fases para desenvolver o método incluem etapas como: divisão dos dados

em grupos de calibração (ou treino) e definição de um conjunto de dados. Neste aspecto, é

importante que o conjunto da calibração cubra a maior parte da variabilidade que é esperada a

partir de amostras externas (BODSON et al., 2006; SCAFI; PASQUINI, 2001b). Para isso os

espectros NIR das amostras de calibração devem ser matematicamente relacionados com a

propriedade de interesse (por exemplo, concentração). Através da utilização de ferramentas

quimiométricas, é possível construir os modelos, porém é necessário planejar as condições das

variáveis, a fim de chegar a um melhor ajuste entre a medida de referência das amostras de

calibração, e consequentemente dos valores previstos pelo modelo que são testados para

comprovação do desempenho (AGELET; HURBURGH, 2010; SAUER; KIM, 2011; SMALL,

2006; WORKMAN, 2007; ZHANG et al., 2015).

Logo, a aplicação do NIR para análise quantitativa exige o emprego de técnicas

multivariadas na calibração e cuidadosa seleção de amostras representativas, a fim de construir

modelos que representem a realidade, assim a regressão por quadrados parciais (PLS) tem sido

muito utilizada para desenvolvê-los com capacidade de previsão e adequada seleção de

variáveis (ABDI, 2003; BASTIEN; VINZI; TENENHAUS, 2005; RUDNITSKAYA et al.,

2013; STENBERG et al., 2010; TENENHAUS et al., 2005), uma vez que essas abordagens têm

sido ferramentas de simples execução, e principalmente rápidas na construção dos modelos de

calibração PLS.

Algumas das aplicações estão focadas na quantificação de medicamentos (GRÜNHUT

et al., 2008; KHOSHAYAND et al., 2008; TER LAAK; GEBBINK; TOLLS, 2006). Por

exemplo, Ali, Sherazi e Mahesar 2012 que desenvolveram um método para a quantificação de

eritromicina em comprimidos, usando espectroscopia em FTIR para análise de rotina. Neste

trabalho não houve preparo de amostra, exceto a formação de “sedimento” para análise (ALI;

SHERAZI; MAHESAR, 2012). Enquanto que os pesquisadores Li et al (2015), apresentaram

um método de modelagem baseado na técnica EDSPLS. Segundo os autores o procedimento

gerou resultados de predição muito robustos, pois a partir de experimentos com dois conjuntos

de dados, foram construídos bons modelos de calibração, sem aumentar a complexidade do

ponto de vista do analista, sendo um método adequado para validação externa. Esta ferramenta

é aplicada em espectros no NIR e MIR.

60

3.1.2.2 Importância da aplicação da Espectroscopia no Infravermelho Médio

A espectrofotometria na região do infravermelho médio é utilizada também como um

teste de identificação. O espectro de infravermelho é único para qualquer dado composto

químico com a exceção de isômeros óticos que possuem espectros idênticos em solução. Apesar

de a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massas (MS)

serem amplamente utilizados na indústria farmacêutica para a identificação de substâncias

medicamentosas, esta técnica pode ser aliada no fornecimento informação adicional quanto às

estruturas, tal como a presença de grupos funcionais característicos (STUART, 2004;

WHARTON, 2000).

Os dados obtidos por FTIR apresentam concordância com os obtidos por um método de

referência com base, por exemplo, em espectrometria de ultravioleta (BERTHOMIEU;

HIENERWADEL, 2009; HSU, 1997). Os procedimentos desenvolvidos oferecem uma boa

alternativa para identificação dos compostos (AMARIE; GANZ; KEILMANN, 2009; MOROS;

GARRIGUES; DE LA GUARDIA, 2007; ZEITLER et al., 2007). Outros procedimentos têm

sido relatados para quantificação de grupos fenólicos em matrizes alimentares (KYRALEOU

et al., 2015).

61

3.1.3 Considerações sobre a Aplicação dos Métodos Cromatográficos no Controle de

Qualidade de Formulações.

Os métodos cromatográficos permitem detecção, separação, identificação e

quantificação de impurezas orgânicas que podem estão presentes nos fármacos. Esses métodos

são seletivos e produzem resultados confiáveis (DEMIRALAY et al., 2012; SIDDIQUI;

ALOTHMAN; RAHMAN, 2013).

A cromatografia liquida de alta eficiência é uma técnica avançada que utiliza a separação

de uma mistura complexa presentes em sistemas químicos e/ou biológicos. Nesta técnica a

escolha do modo de detecção é fundamental para garantir que todos os componentes sejam

detectados (ALVAREZ-MUÑOZ et al., 2015; LIN et al., 2015).

Neste método a amostra é injetada em uma coluna, preparada com uma fase estacionária

e adequada para o meio de um líquido, este é usado como fase móvel e passa através da coluna,

de modo a separar a mistura dos seus componentes, fazendo uso da diferença de capacidade de

retenção (JP XVI, 2007). A mistura injetada na coluna é eluída com a fase móvel e estacionária,

e apresenta característica que representa a relação da distribuição de massa para cada

componente definido pela Equação 10.

K𝑝 = AFE

AFM

(10)

Onde: Kp coeficiente de partição, AFE quantidade do analito na fase estacionária e AFE

são a quantidade do analito na fase móvel.

Os sistemas HPLC disponíveis são muito uteis para controle de qualidade dos

medicamentos, tanto nas indústrias como para órgãos legais competentes (MORETA; TENA;

KANNAN, 2015). Entretanto, as limitações de HPLC incluem os custos das colunas, solventes

e ausência da reprodutibilidade desta em longo prazo.

Um dos detectores amplamente utilizados para HPLC é detector de UV, que é capaz de

monitorizar vários comprimentos de onda simultaneamente (SIDDIQUI; ALOTHMAN;

RAHMAN, 2013). Entre os detectores de LC o de fluorescência (FL) é um dos mais sensíveis,

segundo Ulu e Tuncel, 2012 sua sensibilidade chega a ser 10 vezes maior que o de UV quando

aplicados a materiais absorventes (ULU; TUNCEL, 2012).

Os detectores FL são amplamente utilizados como uma vantagem na medição de

espécies fluorescentes, sendo muito empregados para amostras de vitaminas e de resíduos de

62

antibióticos do grupo das sulfonamidas e quinolonas (AŠPERGER et al., 2014; HE; BLANEY,

2015; PENNACCHIO et al., 2016). As frequências da aplicação de diferentes tipos de detector

em HPLC são apresentadas na Figura 3.3. Neste quadro é exposto as principais aplicações,

durante período de 2009 – 2016, em análises de fármacos a base de penicilina, utilizando

sistema mais diversos sistemas compostos por HPLC.

Figura 3.3-Emprego dos diferentes detectores para análise por fármacos a base de penicilinas

Adaptado da base de dados Scopus 2015

Um dos detectores mais utilizados para análise simultânea é o de massas (DÍAZ-BAO

et al., 2015; REZK et al., 2015). Recentemente, Rodriguez et al (2015) desenvolveram um

método utilizando HPLC-MS/MS para avaliar os principais componentes em amostras de

medicamentos comerciais de uso humano a base de gentamicina. Os pesquisadores planejaram

as condições do sistema cromatográfico, de modo que o método exibiu excelente estabilidade

e linearidade. O desempenho do método foi avaliado através da análise de lotes de gentamicina

comerciais.

Algumas aplicações estão sendo reportadas para quantificação dos antibióticos em

matrizes muito complexas, como o sangue, utilizando sistemas UPLC-MS/MS. Os grupos de

terapêuticos mais expostos a discussão são os betalactâmicos, pois necessitam de controle e

monitorização nas concentrações plasmáticas (CARLIER et al., 2015). Outros estudos sobre os

efeitos dos compostos tóxicos como alterações fisiológicas ou químicas induzidas no corpo de

um mamífero têm sido reportados para quantificação inclusive de amoxicilina, utilizando

detector massas (SKOV et al., 2015).

MS/MS

34%

UV

33%

FL

11%

UV-FL-MS

22%

63

3.2 ANÁLISES DOS RESÍDUOS DE ANTIBIÓTICOS

A falta de um controle quanto à presença de resíduos, em algumas regiões, pode ser

atribuída aos custos das análises. Em muitos casos, esses recursos estão além do alcance da

maioria dos países de baixa renda. De forma que, as técnicas de bioensaio para determinação

rápida de resíduos de antibióticos têm sido aplicadas, devido ao custo e simplicidade de análises

(KNECHT et al., 2004; LAMAR; PETZ, 2007; SHERER, 2006).

Todavia, devido ao risco de falsos resultados, é necessário confirmar e quantificar esses

resíduos por métodos precisos e exatos. Visto que as metodologias relatadas não fazem

distinção entre as várias classes de antibióticos, apenas fornecem resultados semiquantitativos

(KINSELLA et al., 2009), por isso métodos cromatográficos são destinados à determinação

quantitativa de fármacos e/ou metabólitos em matrizes biológicas, sendo classificados como

bioanalíticos, visto que são ferramentas potencializadas que asseguram produtos enquadrados

nas determinações legais, já que as agências governamentais reguladoras exigem métodos que

respeitem os aspectos qualitativos e quantitativos, estabelecidos pelas agências locais de

vigilância sanitária (ANVISA, 2005; NICOLICH; WERNECK-BARROSO; MARQUES,

2006).

A cromatografia liquida (BALIZS; HEWITT, 2003; RAMBLA-ALEGRE et al., 2011a,

2011b; RIEDIKER; DISERENS; STADLER, 2001; STOLKER; BRINKMAN, 2005),

eletroforese capilar (LARA et al., 2006), cromatografia liquida acoplada a arranjo de fotodiodos

UV, (CHRISTODOULOU; SAMANIDOU, 2007; GARCÍA-MAYOR et al., 2006), detecção

fluorimétrica (RODRÍGUEZ-DÍAZ et al., 2006), eletroquimioluminescência (GUO; GAI,

2011) e métodos espectroscópicos (NOUR EL-DIEN et al., 2010) foram mais recomendados

para detecção simultânea de antibióticos no leite. Embora, a detecção por espectrometria de

massas seja considerada inadequada para uso rotineiro, em alguns laboratórios por seu alto

custo. Outros procedimentos utilizando HPLC-UV (ANDERSEN et al., 2005; CINQUINA et

al., 2003a; OKA; ITO; MATSUMOTO, 2000) e espectrometria de massas (BRUNO et al.,

2002) são reportados, para matrizes como leite e ovos.

Algumas aplicações para análises de sulfonamidas e tetraciclinas têm sido citadas (CUI

et al., 2006; GAMBA et al., 2009; HERMO et al., 2008; HOOF et al., 2005; KOESUKWIWAT;

JAYANTA; LEEPIPATPIBOON, 2007a, 2007b; LI et al., 2010; MARAZUELA; MORENO-

BONDI, 2004; RAMIREZ et al., 2003; UDALOVA; DMITRIENKO; APYARI, 2015).

Spisso et al (2007) validam metodologia usando HPLC acoplada à espectroscopia de

fluorescência, para confirmação de resíduos de tetraciclinas, o método teve bom desempenho.

64

Contudo, a cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas

(HPLC-MS) tem sido reportada para análise de rotina e triagem. Boyd et al (2007)

determinaram cloranfenicol e fenbendazole (aquele têm sido banido na maioria dos países) em

leite bovino, mel, urina e plasma. O limite de detecção (1000 – 4000 mg kg-1) estava acima do

permitido pela legislação europeia. Ainda no mesmo período, Raviolo et al (2007) identificaram

e quantificaram seis sulfonamidas (sulfacetamida de sódio, sulfamethizole, sulfaguanidina,

sulfametazina, sulfatiazol e sulfametoxazol) em leite pasteurizado, justificando o desempenho

do método pela redução do tempo de análise e valores de LMR abaixo dos relatados pela

legislação.

Após três anos, Berendsen et al (2010) confirmaram a presença de albendazol,

sulfametazine, fenilbutazona, difloxacina, espiramicina, tetraciclina, oxitetraciclina em leite

bovino integral e desnatado, destacando que apesar da desvantagem do efeito da matriz, os

limites de detecção estiveram entre 0,1 e 5,2 mg L-1. Uma vez que a análise de resíduos em

matriz complexa como o leite, exige uma investigação mais assídua quanto a natureza

quantitativa da amostra principalmente com relacão ao as proteína e gordura, este último

parâmetro tem sido enfatizado por Cabral, Moura e Da Silva (2012) quando avaliaram a

qualidade do leite em pó comercial e construíram modelos para determinação rápida de

gorduras totais. Esses parâmetros interferem nos procedimentos preparativos das amostras

(FLURER, 1999).

Aguilera-Luiz et al (2008) aplicaram a cromatografia liquida de ionização por

eletroespray para determinação de 12 antibióticos das classes sulfonamidas, macrolídeos e

tetraciclinas em leite integral e desnatado adquiridos do comércio local. Em seguida, Wang e

Li (2009) desenvolveram um método analítico para detecção rápida de clorafenicol, tianfenicol,

tetraciclina, oxitetraciclina, clortetraciclina, metacicline, doxiciclina, cefoperazona, ceftriaxona

e cefaclor em leite pasteurizado. Sendo que Vargas Mamani et al (2009) validaram um método

para confirmação de tetraciclina, oxitetraciclina, clortetraciclina, sulfametazina,

sulfaquinoxaline, sulfametoxazol e clorafenicol verificando que estavam abaixo do LMR em

leite bovino tipo A, B e C. comercializados no Brasil.

65

3.2.1 Preparo da amostra para quantificação de resíduos de antibióticos

O preparo da amostra interfere em todas as etapas seguintes de um ensaio analítico, e,

por conseguinte, é determinante para a identificação, confirmação, e quantificação correta dos

analitos (MATUSZEWSKI; CONSTANZER; CHAVEZ-ENG, 2003a; ZUBATA et al., 2002).

Ela inclui tanto o isolamento quanto a pré-concentração do composto de interesse, presentes

nas mais diversificadas matrizes, a partir da mesma os analitos são favoráveis à separação e

detecção. Esse procedimento analítico para amostras leva em torno de 70% do tempo de análise

total. Considerando que, são preferidos os métodos cromatográficos na análise de moléculas

orgânicas, a clean-up, a separação e isolamento do analito emprega a extração (líquido-líquido)

e extração em fase sólida. Com relação à análise cromatográfica ultra-rápida, esta envolve

várias etapas, o que demanda tempo e trabalho intensivo. Por estas razões, novas técnicas de

preparação de amostra têm sido desenvolvidas (BARROSO et al., 2012; DINIS-OLIVEIRA et

al., 2010; DUAN et al., 2011; REEVES, 2011).

Uma análise da literatura científica mostra, exatamente, 535 artigos (análise de resíduos

de medicamentos veterinários) publicados no período compreendido entre 2009 – 2016 (inicío),

sendo que procedimentos envolvendo extração líquido representam 61,49%, do total. As

abordagens incluídas, neste dado, são: extração líquido-líquido, micro-extração líquido-líquido,

extração em fase sólida, neste último estão incluídos os processos à base de absorventes como

micro-extração em fase sólida.

Porém, houve muitas mudanças na abordagem do preparativo de amostras causado,

principalmente, pela aplicação recente da espectrometria de massas. Desta forma, atualmente,

há uma tendência a se concentrar mais nas extrações e procedimentos de limpeza, a fim de

abranger um número razoável de antibióticos detectados presentes em matrizes alimentares

(BERENDSEN et al., 2010, 2013; CHEN et al., 2008; GUO et al., 2014; IGLESIAS et al.,

2012; JING et al., 2009; MACAROV et al., 2012; NEBOT et al., 2012a, 2012b; STOLKER et

al., 2010; STOLKER; BRINKMAN, 2005; YU et al., 2014), pois as técnicas acopladas a

detector MS permitem o simples uso dos métodos clean-up, seguida de remoção eficaz dos

interferentes, uma vez que estes podem afetar o desempenho do instrumento (KAUFMANN;

BUTCHER; MADEN, 2012; MADUREIRA et al., 2012; MIRANDA; RODRÍGUEZ;

GALÁN-VIDAL, 2009; TAKA; BARAS; CHAUDHRY BET, 2012; VAN ROYEN;

DUBRUEL; DAESELEIRE, 2014).

66

Ultimamente, tem-se uma direção importante, embora lenta, para aplicação das técnicas

de preparo de amostras automatizadas, que são poderosas ferramentas para a limpeza da

amostra, concentração e separação de analitos. Metodologias como esta, possibilitam uma

redução no tempo dos procedimentos, melhores limites de detecção e quantificação, precisão,

reprodutibilidade, e principalmente redução de custos (DONG; ZHANG, 2014; GAUDIN et

al., 2014; KANTIANI et al., 2009; KNECHT et al., 2004; PRAGST, 2007; STOLKER et al.,

2010).

Neste contexto, Chen et al (2008) apresenta comentários de extrema relevância,

mostrando a evolução dos métodos de preparo de amostras, os autores destacam 481 referências

a respeito das técnicas mais promissoras. Os pesquisadores incluem nos seus comentários todos

os tipos de amostras, incluindo as células, órgãos, tecidos e corpos maiores. Além disso, são

apresentadas estratégias para a integração de vários métodos complexos para preparo de

amostras contendo proteínas e estudos proteômica.

A respeito disso, Fumes et al (2015) argumenta que a análise dos compostos, químicos

presentes em concentrações muito baixas, em matrizes complexas, tais como: pesticidas e

antibióticos em carnes, leite, ovos dentre outros de origem animal, requer um preparo de

amostra adequado, que envolva um isolamento do analito e determinação qualitativa,

quantitativa e até a confirmação. Os autores apresentam os avanços e tendências dos métodos

verdes utilizados para técnicas de micro extração.

Enquanto que, Rejczak e Tuzimski (2015) apresentam uma revisão no qual são

abordadas as aplicações do método QuEChERS (rápidos, fáceis, baratos, eficientes, robustos e

seguros). Esta técnica envolve extração líquido-líquido, particionamento utilizando acetonitrila,

seguida de purificação por extração em fase sólida. Os autores relatam que QuEChERS foi

introduzido para a análise de resíduos de pesticidas em frutas e legumes, isto é, alimentos com

alto teor de umidade, porém tem sido empregado para análise de pesticidas, medicamentos

veterinários, micotoxinas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, corantes, filtros UV,

bifenóis e hormônios. As aplicações são em matrizes variadas até mesmo de origem animal

com o leite (AGUILERA-LUIZ et al., 2008; FILHO et al., 2012; KARAGEORGOU;

SAMANIDOU, 2011; MADUREIRA et al., 2012). Para executar tais procedimentos, em

concordância com os programas de controle de resíduos, tem-se atenção a natureza da amostra

analisada.

67

Atualmente, os resíduos de drogas veterinárias relatados incluem matrizes como fígado,

rim, músculo, gorduras, leite, ovos, mel e carnes. Os valores de LMR observados em gêneros

alimentícios de origem animal devem, obrigatoriamente, está abaixo do valor máximo. Reeves

et al (2011) e Reyes-Herrera et al (2005) afirma que matrizes desta natureza devem ser

avaliadas logo após o abate do animal. Um exemplo é o trabalho de Ruyck et al (2001) que

aperfeiçoa um método quantitativo utilizando LC-MS/MS para determinar o flubendazole e

seus metabolitos. Segundo os autores os componentes de foram extraídos, com acetato de etilo

após a alcalinização das amostras de músculo suíno.

Em outras matrizes são mostradas as dificuldades dos procedimentos, por exemplo, têm-

se registros que o resíduo de antibióticos é monitorado com frequência em ração animal e água

potável (KUKUSAMUDE et al., 2012; LI et al., 2013), porém na ração o método de preparo

das amostras é muito complexo, pois são matrizes que contém um alto teor de proteínas e

carboidratos, alguns exemplos são citados (BERENDSEN et al., 2010; BORRÀS et al., 2011;

GONZÁLEZ DE LA HUEBRA; VINCENT; VON HOLST, 2007; REDDING et al., 2014;

VAN HOLTHOON et al., 2010; WANG et al., 2008; WEI et al., 2011).

3.2.1.1 Critérios para Preparo da Amostra

Siqueira (2011) ressalta que o objetivo do preparo de amostras é isolar o analito de

interesse de uma matriz complexa. Desta forma, esta fase preparativa da amostra envolve os

procedimentos de extração, inclusive etapas de purificação (clean up), sendo adequada para

concentrar os analitos, em um nível apropriado, para detecção. Assim, o tratamento realizado,

previamente, nas amostras envolve remoção das proteínas por: precipitação, ultrafiltração e

diálise. O processo de desproteineização inclui: altas temperaturas, alteração da força iônica ou

osmótica ou pH, agentes orgânicos de precipitação e enzimas proteolíticas.

Os procedimentos podem ser alocados em etapas, assim, em uma primeira fase, realiza-

se a preparação das soluções, contendo os analitos de interesse, seguida de tratamento da

amostra controlando fatores como: ácido, agitação, centrifugação e filtração do sobrenadante

(ANVISA, 2005; EUROPEAN COMMISSION, 2010; KINSELLA et al., 2009).

Simplificadamente, as metodologias devem obedecer a um planejamento experimental, assim

os parâmetros são testados, a fim de obter o melhor extrato, a ser levado ao cromatógrafo, bem

como melhor mistura solvente, e o modo de eluição (se isocrático ou não), consequetemente os

parâmetros inerentes à análise cromatográfica, como velocidade de eluição, terão valores

ótimos. A segunda etapa é a escolha dos padrões de antimicrobianos, esta leva em consideração:

68

a utilização do medicamento, que pode deixar resíduos; dose, tempo de utilização, espectro de

utilidade na medicina veterinária/potencial de exposição ao consumidor e disponibilidade de

metodologia analítica reconhecida pelas organizações.

As etapas citadas garantem o bom desempenho dos métodos bioanalíticos, porém, há

relatos de que os problemas principais estão associados com a instabilidade de fármacos e

metabólitos, isto é, os antibióticos, em matrizes biológicas, podem ser afetados pela temperatura

de armazenamento, exposição a enzimas, pH, anticoagulantes e ciclos de congelamento e

descongelamento. Além disso, a volubilidade pode ocorrer durante qualquer um dos numerosos

passos da metodologia (DÍAZ-BAO et al., 2015; GOTO et al., 2005). Entretanto, um dos

principais objetivos consiste na remoção de qualquer efeito de matriz (BULDINI et al, 2002;

LALLJIE et al, 2007; CHEN et al, 2008). Certamente, os avanços dos processos de separação

e de técnicas de detecção aliados a procedimentos adequados garantem a eliminação desses

interferentes.

Durante muito tempo, a extração líquido-líquido combinado ou não com extração em

fase sólida foram empregadas, em diversos trabalhos (ANDERSEN et al., 2005; BOGIALLI;

DI CORCIA, 2009; CHRISTODOULOU; SAMANIDOU, 2007; SCHLÜSENER; BESTER;

SPITELLER, 2003), bem como tendências para o isolamento de medicamentos veterinários

também foram reportadas (KINSELLA et al., 2009; RIDGWAY; LALLJIE; SMITH, 2007). A

saber, de Sørensen e Snor (2000) que realizaram extração em fase sólida para determinação de

resíduos como cefazolina, cefoperazona, cefquinoma e ceftiofur em leite cru. Enquanto que

Holthoon et al (2010) analisaram o grupo das penicilinas em matrizes diferentes, relatando que

o procedimento de derivatização é um método eficaz, na prevenção da degradação dos resíduos

dos grupos betalactâmicos. De maneira mais ampla, Nebot et al (2012b) descreveram

metodologia para confirmação de sete agentes antimicrobianos em leite, três corticosteróides e

um antifúngico, o método foi validado, com base na Decisão 2002/657/CE da Comissão

Européia. Ele mostrou aplicabilidade e confiabilidade, justificado pelo número de amostras

(100) e coeficientes de regressão entre 0,980 e 0,998.

Diante dessa avaliação, o preparo de amostras tem sido determinante para validação de

métodos bioanalíticos. Uma vez que o HPLC continua a ser um método de escolha, pois tem

sido indicado para separar compostos com elevado e baixo peso molecular, sobretudo com

diferentes polaridades, sendo aplicados a inúmeras matrizes. Infelizmente, alguns os métodos

de preparo de amostra convencionais prejudicam a resolução dos picos, além de ser demorado.

69

De modo que, os métodos de preparo de amostras devem ser eficientes. Alguns são

apresentados na Tabela 3.1.

Tabela 3.1-Sumário dos métodos de preparo de amostras de leite para determinação de resíduos de antibióticos

utilizando HPLC-DAD.

Compostos Extração e Clean-up Referência

Tetraciclinas

Precipitação de proteínas totais com solução Mcvalline.

Diluição do sobrenadante, e centrifugação a 4000 rpm e 5 °C

durante 10 minutos. O sobrenadante foi submetido a extração

em fase sólida, adição de ácido tricloroacético e metanol

seguido de evaporação de solvente e filtração em filtro de

nylon de 0,22 µm.

(NAVRÁTILOVÁ;

BORKOVCOVÁ;

DRAČKOVÁ, 2009)

Penicilinas

Homogeneização das amostras (5g), adição de ácido

clorídrico em pH ajustado de 4,5 – 5 e mistura de

acetona/clorofórmio, agitação da solução durante 2 min e

centrifugação a 2500 rpm durante 10 min, evaporação do

solvente em rotavapor e diluição em água.

(SEN; FILAZI, 2014)

Sulfonamidas

Fortificação das amostras e agitação durante 5 minutos,

diluição das amostras e adição de ácido perclórico,

centrifugação a 10.000 rpm 25 ºC durante 10 min para

precipitação de proteína e filtração do sobrenadante em filtro

de nylon 0,45 µm.

(SHAO et al., 2014)

Aminoglicosídeo

A 50 ml de leite cru (ovelha e cabra) é adicionado HCl 2M e

ajustado o pH para 4,6, repouso à temperatura ambiente

durante 15 minutos, centrifugação a 2000 rpm durante 20

min. Diluição de 5mL do sobrenadante em tampão fosfato pH

de pH 6,7), seguida de filtração por membrana Millipore de

0,22 µm.

(ROMERO et al., 1996)

A 5 mL de leite é adicionada ácido tricloroacético 10%,

seguida de homogeneização das amostras em vortex durante

10 minutos a 3500 rpm a - 4 ºC, por fim, filtração do

sobrenadante em filtro nylon de 0,22 µm

(GHIDINI et al., 2007)

Macrolídeos

Homogeneização de 1mL de leite, fortificação com mistura

de padrão, adição de solução tampão fosfato e acetonitrila

para precipitação de proteínas. Agitação e centrifugação a

3500 rpm durante 10 min a 25 ºC, remoção da gordura pela

adição de NaOH 1M e 5mL de acetato de etila e

centrifugação nas mesmas condições durante 30 min, e

filtração da fase aquosa.

(GARCÍA-MAYOR et

al., 2006)

Fenicois

Adição de acetonitrila em leite, agitação em vortex e

sonicação durante 10 min, centrifugação a 3500 rpm durante

10 min, em seguida evaporação em banho de água a 35 º C e

dissolução dos resíduos. Tratamento com método MSPD

QuEChERS e homogeneização da amostra durante 10 min

em ultrassom seguido de adição de acetona 1%, água,

metanol e acetonitrila

(KARAGEORGOU;

SAMANIDOU, 2011)

Quinolonas

5g de leite e adição de 2,5 mL de ácido tricloroacético em

20% de metanol, centrifugação da amostra a 1500g durante

10 min, adição de tampão fosfato pH 7,4 agitação e

centrifugação durante 15 min, seguida de extração em fase

sólida C18, eluição em 1% de ácido tricloroacético e

acetonitrila.

(CINQUINA et al.,

2003b)

70

Este sumário tem sido incluído, a fim de tornar os procedimentos aplicados, neste

trabalho, adequadamente escolhidos, considerando, o tempo de extração, seletividade, o

número de etapas, o consumo de solvente e toxidade dos reagentes. Uma vez que tais métodos

têm sido desenvolvidos, para se melhorar a recuperação do analito. A exemplo de Fennell et al

(1995) que desenvolveram um método simples para extração das gentamicinas, a partir de

amostras de tecido e de leite. Estas foram fortificadas com o padrão e adicionado tampão de

pH 8,8, a solução foi homogeneizada e centrifugada as condições foram: 17000 rpm a 4 ºC

durante 30 min. Para aquelas, os pesquisadores realizaram infusão intramámaria nos animais e

coletaram o leite durante 48 horas, as condições de extração foram semelhantes. O método

mostrou recuperação > 90%.

Enquanto que, atualmente, Zhon et al (2009) aplicaram polímeros molecularmente

impressos magnéticos (MMIPs), como material de adsorção associado a extração em fase sólida

(MSPE). Os pesquisadores determinaram, simultaneamente, seis macrolídeos em amostras de

carne de porco, peixe e camarão, utilizando sistema HPLC-UV. As recuperações dos extratos

foram de 89,1%. Já Wang et al (2015), desenvolveram um método para quantificação de

betalactâmicos, macrolídeos, tetraciclina, sulfonamidas, e quinolonas, presentes em leite

bovino. O método empregado foi o QuEChERS, sendo que a recuperação dos analitos estiveram

entre 86,09 – 115,99%. Entretanto, os detalhes de procedimentos para rotina são mais

complexos, em trabalhos em sistema com detector MS, um exemplo é Aguilera-luiz et al (2008)

que realizaram extração com base, também, no QuEChERS. Os pesquisadores determinaram

sulfonamidas, macrolídeos e tetraciclinas em leite, garantindo recuperação de 70 – 110%. Ao

passo que, Ortelli et al (2009) quantificaram 150 resíduos de antimicrobianos veterinários,

utilizando UPLC-TOF/MS. Esses procedimentos consistiram em desprotenização total com

adição de solução ácido metanoico/ACN, seguida de ultrafiltração, evaporação e centrifugação,

porém, as recuperações dos analitos foram muito baixos devido à perda importante durante a

ultrafiltração. Turnipseed et al (2008) rastreiam e confirma presença de resíduos

betalactâmicos, sulfonamidas, tetraciclinas, quinolonas e macrolideos, utilizando sistema LC-

MS/MS. Os procedimentos foram realizados pela extração com ACN, ácido fórmico, clean-up

e filtração, o método garantiu recuperação > 70%, exceto para tetraciclinas que foi entre 50 –

70%, enquanto as penicilinas < 50%.

71

3.2.2 Métodos Bioanalíticos e Testes Rápidos

Esses testes são classificados como imunoensaio ou enzimáticos, conforme o seu

objetivo e princípio. As medições rápidas fornecem resultados qualitativos ou

semiquantitativos. Eles são testes portáteis e podem ser aplicados in situ. Além disso, eles

fornecem resultados, em tempo real, de acordo com a necessidade da análise. Geralmente, são

obtidos em um período de 30 min e não há necessidade de preparo de amostras (MAGALHÃES

et al., 2012; REEVES, 2011).

Ensaios microbiológicos, com base na inibição do crescimento de micro-organismos,

são relatados. Eles são específicos para os antibióticos, mas requerem longos períodos de

incubação. A exemplo de Peng et al (2013) que utilizam o método ELISA para a detecção de

antibióticos betalactâmicos, em diferentes matrizes, incluindo leite. Os pesquisadores

desenvolveram os testes como alternativa para ensaios semiquantitativo garantindo

recuperações entre 53,27 – 128,29% (ZENG K, ZHANG J, WANG Y, 2013). Enquanto que,

De Alburquerque Fernandes et al (2013), com objetivo de avaliar a ocorrências de resíduos

tetraciclinas, em amostras de leite pasteurizado, empregaram método de rastreio utilizando um

kit para triagem (Delvotest® SP-NT).

Não obstante, metodologias são aplicadas, para melhorar a quantificação da penicilina

G, utilizando Fluorescência. Este tipo de procedimento tem competido com os imunoensaios.

De maneira que, os pesquisadores argumentam que os métodos tradicionais aplicando HPLC-

DAD, HPLC-MS/MS, HPLC-FL apresentam algumas limitações tais como: demandam tempo,

requer a preparação de amostras complexas, manutenção dos equipamentos e exigem pessoal

treinado (PENNACCHIO et al., 2016).

Assim, alguns métodos imunoessaio (testes microbiológicos e biossensores) são

comentados em artigos de revisão, dentre eles está o trabalho de Puchades e Cha (2010), no

qual apresentam a evolução dos principais métodos de rastreio, especialmente resíduos de

antibióticos presentes em amostras de alimentos. Os autores concluem que os imunoensaios

com detecção por fluorometria são muito bem aceitos, por causa do tempo para identificação,

com vantagem dos níveis serem mais baixos, do que os LMRs estabelecidos pelas legislações.

Os métodos screening são empregados, sobretudo, quando há necessidade de monitorar

elevado número de amostras, este tipo de procedimento são mais preferidos, devido a

capacidade de rastreio e custos, relativamente, baixos (BITTENCOURT et al., 2012; HOFF et

al., 2012; PIKKEMAAT et al., 2009; STOLKER et al., 2010; WEAVER et al., 2013).

72

3.2.3 Emprego das Técnicas para Quantificação e Confirmação dos Resíduos de

Antibióticos

Recentemente, entre períodos de 2010 a 2012, a literatura científica revelou em torno de

300 artigos publicados, dos quais 20,66 % são relacionados a leite e derivados. Quanto ao

método de detecção, 52,33 % utilizam espectrometria de massas para confirmação; dentre estes,

pode-se citar os trabalhos de Léon et al (2012) que utiliza HPLC-MS/MS para rastreio rápido

e simultâneo de substâncias veterinárias ilegais e proibidas. Com objetivos semelhantes,

Gomez-Pérez et al (2012) desenvolveram um banco de dados análise simultânea 350 pesticidas

e drogas veterinárias, utilizando HPL-MS/MS.

Neste sentido, algumas publicações tratam da determinação de antimicrobianos

permitidos, mas com ressalva no LMR, dentre eles estão análises de sulfonamidas e

tetraciclinas, algumas aplicações são relatadas (CUI et al., 2006; GAMBA et al., 2009; HERMO

et al., 2008; HOOF et al., 2005; KOESUKWIWAT; JAYANTA; LEEPIPATPIBOON, 2007b;

LI et al., 2010; MARAZUELA; MORENO-BONDI, 2004; RAMIREZ et al., 2003;

RODRIGUEZ; MORENO-BONDI; MARAZUELA, 2011).

O avanço dos processos de separação e de técnicas de detecção tem se desenvolvido,

concomitantemente, aliados a procedimentos adequados de preparação de amostras, que visam

garantir a eliminação dos interferentes da matriz (BULDINI; RICCI; SHARMA, 2002; CHEN

et al., 2008; RIDGWAY; LALLJIE; SMITH, 2007). A saber, de Tsai et al (2009) que

desenvolveram um método para determinação simultânea de tetraciclina, clortetraciclina e

doxitetraciclina. Os autores mostraram otimos resultados, pois os parâmetros da curva tais

como: linearidade, LD, LQ foram condizentes com a validação e LMR.

Em 2010, Tsai et al (2010) desenvolveram um método para coprecipitação de foi

desenvolvido para determinação de tetraciclinas em amostra de água e leite utilizando HPLC

DAD. O método de extração consistiu em formar precipitados de hidróxido de magnésio e

separá-los por centrifugação e, em seguida, aplicaram uma etapa de dissolução por adição de

ácido. Segundo os pesquisadores o preparativo das amostras mostraram resultados satisfatórios

em condições ótimas, refletindo nos parâmetros da curva e recuperação do analito.

73

Durante período de 2010 a 2012 foram registrados avanços na literatura científica, os

dados e informações são apresentados na Figura 3.4. As informações foram coletadas do Portal

de Periódicos Capes; o mecanismo de busca foi veterinary and drugs and determination and

chromatography.

Figura 3.4-Frequências dos trabalhos científicos aplicados ao desenvolvimento de novos métodos para

quantificação de resíduos de antibióticos em leite, durante período de 2010 a 2012.

Adaptado da base de dados Scopus, 2015

A análise dos avanços é relevante, pois a partir dessa pesquisa são delineadas estratégias,

para rastreamento dos principais métodos aplicados a quantificação dos resíduos de

antibióticos, estudados neste trabalho. Atualmente, os fundamentais avanços são reportados por

vários pesquisadores (DÍAZ-BAO et al., 2015; LOCK; CHEN; VOLMER, 1999;

MATUSZEWSKI; CONSTANZER; CHAVEZ-ENG, 2003b; NICOLICH; WERNECK-

BARROSO; MARQUES, 2006; NONAKA et al., 2012; REZK et al., 2015; SCHLÜSENER;

BESTER; SPITELLER, 2003; ZHOU et al., 2015). Um dos exemplos é trabalho de Vargas

Mamani, Reyes Reyes e Rath (2009) que validaram um método, utilizando HPLC DAD, em

condições para determinação de tetraciclinas em leite comercializado em São Paulo/Brasil. Os

resultados mostraram LD e LQ condizentes com o LMR para matriz leite.

Journal of

Chromatography A

31%

Analytical and

Bioanalytical Chemistry

22%

Analytica Chimica Acta

14%

Journal of

Chromatography B

11%

Food Chemistry

9%

Chemosphere

5%

Science of The Total

Environment

3%

Biosensors And

Bioelectronics

Applied and

Environmental

Microbiology

Bioresource TechnologyJournal of Agricultural

and Food Chemistry

Chemical

Communications

Electrophoresis

TetrahedronOutra

5%

74

Outras aplicações têm sido descritas para análises, empregando procedimentos variados,

sendo classificados como pré-diagnóstico e análise quantitativa, tal como trabalho de

Navrátilová, Borkovcová e Dračková (2009) que desenvolveram método com objetivo de

detectar resíduos de tetraciclinas em leite bovino cru. Ao analisar grandes quantidades de leite

em tanques de armazenamentos. Os pesquisadores utilizaram kits para testes rápidos (citados

no item 3.2.2), cocomitantemente, com HPLC para confirmação dos resíduos. O sistema

cromatográfico utilizado, pelos pesquisadores, foi Waters em coluna C8 (3.9 × 150 mm, 4 μm).

Os resultados foram satisfatórios (rotina de indústria), uma vez que os valores apontados foram,

em sua maioria, menores que o LMR.

Em 2009, Shariati, Yamini e Esrafili (2009) desenvolveram um método para

preconcentração dos resíduos de tetraciclinas, utilizando microextração, sendo compatível com

as matrizes biológicas. Enquanto que, Bailón-Pérez et al (2009) desenvolveram um método

usando HPLC-DAD, para determinação de Penicilina G e V, o método foi aplicado em amostras

de água, leite bovino e humano e carnes. Os métodos também envolveu fase sólida,

concentração e clean up, o desempenho mostrou LD 0,80 – 1,40 µg L-1 compatível com

regulamentos por EC 2377/90. Ao passo que, Rodrigues el al (2010) apresentaram mesmo

método, porem envolvendo a extração e limpeza por dispersão, seguida de isolamento dos

analitos, em metanol acidificado. Assim as tetraciclinas eluídas foram determinadas,

simultaneamente, por meio de análise por injeção em fluxo com detecção por UV. Segundo os

pesquisadores, por comparação, os resultados entre HPLC e MSPE-SPE-HPLC não

apresentaram diferenças significativas.

Em 2011, Kishida (2011) elaboraram um método para determinação de tetraciclinas,

com base na preparação de amostra, que consistiu apenas na ultrafiltração e centrifugação. As

análises foram realizadas em sistema LC-10ADvp da Shimadzu acoplada à coluna Agilent (150

× 4.6 mmID). Os pesquisadores relataram vantagens, no que se refere a não requerer

preparação, principalmente, pela eliminação de reagentes tóxicos, sendo de simples execução

para o monitoramento de rotina em laboratórios.

Em 2013, Yang, Yang e Yan (2013) empregaram adsorvente em zeólita para extração

em fase sólida. O método apresentou vantagens quanto a simplicidade, rápidez e sensibilidade

para determinação de OTC, TC e CTC na água e em leite. As vantagens do adsorvente foram

descritas como: elevada área superficial, porosidade nanoescala permanente e boa estabilidade.

Comprovando este fato, Lv et al (2014) relata que esse tipo de extração tem sido uma ferramenta

poderosa para a separação eficiente e rápida, com base na preconcentração dos resíduos, em

75

amostras de leite. O sistema cromatográfico empregado, pelos pesquisadores, foi o HPLC-DAD

da Shimadzu aliado a coluna C18 (250 × 4.6 mm, 5 mm).

Anteriomente, Kantiani, Farré e Barceló (2009) fizeram uma revisão dos principais

métodos analíticos, que foram desenvolvidos, na última década, com enfoque nos resíduos das

penicilinas. Os pesquisadores incluem descrição das metodologias para detecção de penicilina

em amostras de leite e ração animal. São incluídas abordagens microbiológicas, e

cromatográficas, além dos biossensores.

Diante do grande compêndio de métodos, Bilandzi et al (2011a) validaram metodologia

para identificação rápida de penicilina G, durante três anos, utilizando ensaios microbiológicos

(protocolado pela comissão europeia 2002/657/EC). Posteriomente, os pesquisadores

confirmaram a presença desses antibióticos acima do limite máximo de resíduos, utilizando

HPLC DAD em 12 mg kg-1. Apesar dos resultados evidentes, os pesquisadores não

consideraram os dados um risco toxicológico, pois não afetavam a saúde pública.

Com relação a reportações e aplicações em amostras reais e biológicas, tem-se o trabalho

de Cámara et al (2013), que validaram método, utilizando HPLC DAD para determinação de

resíduos betalactâmicos, em leite de ovelha. Os resultados foram suficientes, pois as

recuperações dos analitos estiveram entre 79 e 96%.

Recentemente na Turquia, Sen e Filazi (2014) desenvolveram um método também em

HPLC DAD para determinação de resíduos de penicilinas, em amostras de leite comerciais.

Porém, o preparo das amostras consistiu em extração por desproteinização, ajustando o pH para

4,5 – 5, seguido por adição de mistura de acetona/clorofórmio, centrifugação e limpeza em filtro

de nylon 0,45 µm. Os resultados, também, foram muitos satisfatórios, abaixo do aceitável pelas

normas legais europeias.

Portanto, os métodos citados, neste capítulo, incluem, geralmente, procedimentos em

três etapas, como: ajuste das condições HPLC-detector (fonte de ionização, analisador,

aquisição dos dados), preparação das amostras e extração dos analitos, conforme os

procedimentos operacionais normatizados pelas legislações. As principais aplicações são

reportadas pela Tabela 3.2 pelos trabalhos mais atuais entre períodos (2007 – 2014).

76

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79

Para uma compreensão geral, durante período de 1983 a 2016 (início), foram registrados

progressos na literatura cientifica apresentados pelos Gráficos da Figura 3.5. Os dados são

coletados da Base de dados Scopus, a pesquisa foi realizada no ano de 2015.

Figura 3.5-Tendência do avanço da literatura científica no período de 1983 a 2016 (fev) para quantificação de

resíduos de penicilina, em função da nacionalidade dos pesquisadores.


Os dados e esclarecimentos são apresentados nos gráficos. consideraram a relação

publicação e país de origem dos autores (A), bem como a tendência dos trabalhos durante

períodos citados (B). As informações foram coletadas do Portal de Periódicos Capes; o

mecanismo de busca tem sido antibiotics in Milk by HPLC. Os dados mostram claramente que

os principais publicadores estão em países mais emergentes.

80

3.2.4 Plano de Controle e Monitoramento de Resíduos de Antimicrobianos executados

no Brasil

No Brasil, os Laboratórios do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

(Lanagros) atuam na realização de programas de vigilância, desenvolvem métodos analíticos,

proporcionam assessoramento técnico na elaboração de diretrizes e normativas e realizam

negociação internacional. Os Lanagros trabalham, segundo regulamentação ISO 17025, sendo

preparados para responder a surtos e crises, relacionadas à presença de resíduos e contaminantes

em alimentos, com disponibilidade, rapidez e confiabilidade que requer uma emergência (DE

QUEIROZ MAURICIO; LINS, 2012).

O Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC) assegura que o

produto que chega ao consumidor, tanto interno como externo, está livre de resíduos de

substâncias perigosas, em níveis não aceitáveis. Para isto, a qualidade e segurança do leite são

atestadas, pelas análises realizadas na Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários. No Brasil

há seis Lanagros localizados nas cinco regiões principais do país, estando no Sudeste (Pedro

Leopoldo/MG e Campinas/SP), no Sul (Porto Alegre/RS), no Centro-Oeste (Goiânia/GO), no

Nordeste (Recife/PE) e no Norte (Belém/PA). Desta forma, o PNCRC funciona do seguinte

modo: os contaminantes a serem analisados por técnicas de identificação quantificação e

confirmação são selecionados, de acordo com seu risco em potencial e pela disponibilidade das

metodologias. Todas as informações são registradas no cronograma de monitoramento e

renovadas anualmente. A saber, que os Limites Máximos de Resíduos de medicamentos

veterinários são harmonizados no MERCOSUL e seguem a Resolução GMC nº. 54/2000. Para

compostos cujos valores de LMR não estão estabelecidos pelo MERCOSUL, considerem-se os

valores da Codex Alimentarius (BRASIL., 2010).

Em 21 de Julho de 2015 o MAPA divulgou os subprogramas PNCRC para carnes, leite,

pescado, mel e ovos. Esta publicação foi mostrada na Instrução Normativa nº 13, exposta no

Diário Oficial da União. Os subprogramas estabelecem metas de análise de resíduos e

contaminantes nos alimentos de origem animal (MAPA, 2015). Esse monitoramento é tão

importante para o Brasil que, o plano amplia o rastreio de substâncias em ovos e lácteos, o que

garantir maior qualidade desses produtos e também permitir a exportação para determinados

mercados externos rigorosos (União Europeia) quanto ao rastreio de contaminantes nesses

alimentos.

81

Ainda com relação aos programas de monitoramento, no Brasil, também, tem-se o

Programa de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em Alimentos de Origem

Animal (PamVet), este foi estabelecido pela ANVISA, em 2002, a fim de complementar as

ações executadas pelo MAPA. Conforme determina a Lei n. 9.782, de 26 de janeiro de 1999 no

Art. 8º, § 1º, inciso II, o PamVet foi desenvolvido com o objetivo de operacionalizar sua

competência legal de controlar e fiscalizar resíduos de medicamentos veterinários em alimentos

(ANVISA, 2003). O principal objetivo é analisar os alimentos que são de consumo direto a

população brasileira, isto é criar um banco de dados sobre resíduos da ocorrência dos compostos

em alimentos, no Brasil, disponibilizando as informações à sociedade (ANVISA, 2005). Para

isso, a coleta das amostras é realizada em pontos de vendas e analisadas em laboratórios

credenciados pelas Vigilâncias sanitárias estaduais (VISA).

É necessário mencionar que, as técnicas de amostragem seguem as prescrições da Codex

Alimentarius, descritos nos guias de amostragem (CODEX ALIMENTARIUS, 1993). Sendo o

leite um alimento é o mais consumido pela população brasileira e de grande importância para

as crianças e idosos, a primeira matriz de análise pelo PamVet, foi este alimento mais exposto

a saúde pública.

3.2.4.1 Correlação entre os Métodos Aplicados no Controle de Resíduos no Brasil e as

Produções Científicas

Cada laboratório possui programas de análises, que utilizam métodos cromatográficos

válidos para detecção de contaminantes. Para resíduos de Avermectinas, as análises são

realizadas utilizando CLAE-FL e CLAE-EM/EM, executadas no Lanagro de MG. Alguns

resultados têm sido publicados, como é o caso de uma edição especial na Revista “Food

Additives and Contaminants”, nos quais são apresentados os principais resultados das análises

realizadas nos Laboratórios credenciados.

Alguns métodos Bioanalíticos são aplicados como testes rápidos. Tem-se registro do

trabalho de Hoff et al (2012) que aplicam o método FAST e Premium® test, utilizando uma

placa de Agar Muller-Hinton, contendo esporos de Bacillus megaterium, para inibição do

crescimento bacteriano, o teste revela positivo quando há presença dos resíduos. Segundo os

pesquisadores da Lanagro/RS o método Screening foi primeiro utilizado para rastrear amostras

de rim. Enquanto que O Premium® test tem sido aplicado para fluidos e tecidos.

82

Recentemente, os pesquisadores, da Universidade do Paraná, discutem o método de

rastreio de cloranfenicol, para análise de leite cru proveniente de uma indústria. Os

pesquisadores utilizaram o método ELISA (SIFUENTES DOS SANTOS et al., 2015).

Ainda de acordo com Trombete, Santos e Souza (2014), estudos relatam que é mais

provável a contaminação, por sulfonamidas e tetraciclinas no leite comercializado no país.

As Informações obtidas pela base de dados, Scopus, confirmam a tendência dos avanços

dos programas do Brasil para controle resíduo. Os dados foram coletados entre o período de

1990 a 2015. O mecanismo de busca tem sido “Antibiotics milk Brazil”.

Assim, os fatores apresentados na Figura 3.6, reflete em grandes preocupações com a

saúde dos consumidos, quanto a presença de resíduos.

Figura 3.6-Citação do Brasil e aplicação de métodos para controle, em função do número de publicação e países


Em 2005, Farina et al (2005) discutiram de forma comparativa as abordagens, para

controle de qualidade no leite para exportação. Os autores focaram no setor de processamento

de laticínios na Argentina e no Brasil, mostrando que entre década de 50 e 90 houve um avanço

no desenvolvimento de normas e programas, para garantir a segurança e higiene deste alimento.

Em 2012, os pesquisadores da Lanagro/MG, Nonaka et al (2012) descrevem a

importância das diretrizes, estabelecidas pela Codex Alimentarius para o PNCRC. Segundo

Argentina

2%

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República

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Estados Unidos

4%

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78%

Outra

6%

83

eles, em 2008 a 2009, foram investigados antibióticos dos grupos dos aminoglicosídeo, em

diversas matrizes animal, para tal foram utilizados testes rápidos e métodos cromatográficos

LC-MS/MS e UPLC-MS/MS. O monitoramento envolveu amostras provenientes de

matadouros e produtores.

Rezende et al (2012) desenvolveram um método, utilizando sistema UPLC-MS/MS,

para quantificação de resíduos betalactâmicos e tetraciclinas, presentes em músculo bovino, de

acordo com o regulamento 2002/657/CE. Os resultados foram satisfatórios, pois apresentaram

recuperações de analito entre 90 a 110%.

Na Figura 3.7 são apresentadas as filiações dos pesquisadores que desenvolveram

trabalhos na área de controle de resíduos. Os principais dados no Brasil foram pesquisados para

os anos de 1990 a 2015.

Figura 3.7-Distribuição do número de publicações em função da filiação dos autores


Assim, a busca pela melhoria da qualidade dos alimentos expostos ao consumo humano,

está de forma presente, principalmente, nos artigos de pesquisa proveniente de instituições

Acadêmicas. Dentre a distribuição proporcional das instituições acadêmicas, os principais

artigos publicados destacam-se em 16 % desenvolvido por pesquisadores da UNESP. O que

mais chama atenção, nesta busca, até o presente momento, é a ausência de publicações

EMBRAPA

6%UFV

6% Instituto de

Zootecnia SP

6%

UFRJ

8%

UFRS

8%

FIOCRUZ

8%

UFPE

8%

UFRPE

10%

UEM

10%

USP

14%

UNESP

16%

84

realizadas no Estado do Rio Grande do Norte, uma vez que este possui um aumento

significativo de produção e exportação de alimentos de origem animal.

85

3.3 ESTRATÉGIAS PARA VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS

A validação do método de análise visa diminuir ou controlar os fatores, que levam a

imprecisão ou inexatidão de um dado gerado (CHASIN et al., 1998). Assim, o procedimento

analítico tem como meta demonstrar que o mesmo é adequado aos objetivos propostos, ou seja,

que os parâmetros de desempenho avaliados atendem aos critérios de aceitação preconizados

(ANVISA, 2003). De maneira que, para um método ser válido, deve ter-se garantia da

confiabilidade das medidas analíticas, através de sua precisão, exatidão e robustez. Os guias de

orientação emitidos por legislações como a União de Química Pura e Aplicada (IUPAC) e

Eurachem, CAC, FDA, EC e MAPA compõe um cenário de organizações, que estabelecem

critérios e normas, para validação dos métodos analíticos, dos mais simples (testes rápidos) aos

mais robustos (cromatográficos).

O principal requisito para que métodos analíticos válidos sejam aplicados, no controlo

de resíduos de antibióticos, em alimentos: é que sejam incluídas nas normas e aprovadas, como

medida regulatória do medicamento, usados em produtores de alimentos. Geralmente, os

procedimentos são desenvolvidos e validados apenas para um composto, dependendo da

natureza do resíduo. Entretanto, para as autoridades responsáveis pela execução dos programas,

métodos individuais de resíduos, são muitas vezes limitados, pois sempre há vários

medicamentos da mesma classe, disponível para uso. Logo, são estabelecidos para análises de

rotinas.

Numerosas organizações são fontes de informação, porém apresentam exigências

diferentes, por isso a escolha de uma fonte apropriada de orientação, a seguir, é importante. As

fontes de orientação podem ser agrupadas em fontes científicas independentes, como a IUPAC,

Eurachem, e AOAC Internacional, e os elaborados pelas autoridades reguladoras nacionais e

regionais e organizações internacionais com interesse no estabelecimento de normas

internacionais reguladoras nacionais e práticas, tais como: CAC e o VICH, enquanto que para

organizações nacionais regulamentares sobre métodos incluem a EC, FDA e o MAPA. As

orientações fornecidas por organizações científicas independentes são, geralmente, aplicáveis

a uma grande variedade de procedimentos analíticos.

86

A função de cada organização no cenário atual de desenvolvimento de métodos de

validação, para o controle de contaminantes, em alimentos expostos ao consumo, são

apresentadas na Tabela 3.3 das seguintes laudas deste trabalho.

Tabela 3.3-Resumo das principais Normatizações e órgãos reguladores e Aplicação de Controle de

Contaminantes

Autoridade Competências Base Legal Aplicação

Técnica Referência

Codex

Alimentarius

Estabelece LMR, com base na

toxicidade e farmacocinética de

cada substância.

CAC/GL56-2005

CAC/MRL02-

2009

HPLCDAD

HPLC-FL

HPLC-MS

Método

enzimático

(IBARRA et al.,

2011; SANG et al.,

2013)

FDA

Estabelece LMR, com base na

toxicidade e farmacocinética de

cada substância.

57245–57248

HPLC-FL

HPLC-UV

HPLC-

MS/MS

(BOGIALLI et al.,

2007; MOATS;

HARIK-KHAN,

1995; MUSSER et

al., 2001)

CVMP

Apresenta Guias para validação

de método rápida para resíduos de

medicamentos veterinários

2002/657/CE HPLC-

MS/MS

(IGLESIAS et al.,

2012; NEBOT et

al., 2012a, 2012b)

MAPA

Estabelece programas e planos de

análises de resíduos de

antimicrobianos, em diversos

alimentos expostos ao consumo

humano um dos programas é o

PNCRC e o PamVet

Instrução

normativa nº 9, de

10 de abril de

2008

HPLC-UV

HPLC-MS

(NONAKA et al.,

2012; VARGAS

MAMANI; REYES

REYES; RATH,

2009)

Neste contexto, as instituições propostas pela FAO (como Codex) são muito

importantes, pois países menos desenvolvidos (como já citado neste trabalho), não têm a

capacidade, recursos e, em alguns casos, o conhecimento técnico para enfrentar os desafios do

comércio internacional de alimentos é indisponível. Sabendo que, é de extrema importância

reforçar as medidas de qualidade e segurança alimentar, a fim de melhorar a competitividade

no mercado internacional. Desta forma, a FAO implanta alguns projetos de assistência técnica

para melhorar a qualidade de alimentos (MIYAGISHIMA et al., 1995).

87

Com relação a isso, Boutrif (2003) e Horton (2001) relata que essa assistência é

constituída por: apreciações dos programas existentes de controle de alimentos nacional,

assistência no estabelecimento de legislação alimentar, inspeção dos alimentos, treinamento nas

boas práticas de fabricação, certificado de inspeção de qualidade, análise de alimentos, sistemas

de garantia de qualidade e de gestão em laboratório.

Assim, o lema do Codex é que os consumidores podem confiar na segurança e qualidade

dos produtos alimentares importados, uma vez que seguem padrões de qualidade legítimos e

oficiais (ELLIS, 2008; FAO, 2003; SECRETARIAT OF THE CODEX ALIMENTARIUS

COMMISSION, 2011). Essa Organização baseia-se em evidências científicas, valores

econômicos e sociais. Os documentos fornecem modelos para nações individuais, mas não são

vinculadas as políticas nacionais, isto é não é proveniente de nenhuma lei, instituída por

autoridades nacionais (RANDELL; WHITEHEAD, 1997; SOMOGYI et al., 2011). Nesta

coordenação existem três comitês nomeados responsáveis, pelas validações dos métodos de

resíduos, dentre eles está o de resíduos de medicamentos veterinários (CCRVDF)

(CRAWFORD; KUGLER, 1986). O objetivo é determinar prioridades para a consideração de

resíduos, recomendar LMR, desenvolver códigos de boas práticas, a considerar métodos de

amostragem e análise para a determinação de resíduos s em alimentos (DEMORTAIN, 2012).

A escolha dos critérios de adequação é estabelecida pelos guias de validação emitidos

por órgãos oficiais. De maneira que, a validação consistir, especialmente, no cálculo das figuras

de mérito tais como: precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação,

sensibilidade e robustez do método (ANVISA, 2009).

Em 2005, Stolker e Brinkman (2005) revisaram os principais métodos utilizados, para

as classes dos antibióticos entre eles os betalactâmicos. Chegando-se a conclusão que o HPLC-

MS/MS tem sido a técnica preferida, na maioria dos casos de confirmação dos resíduos. Os

autores ainda afirmam que, apesar de existirem muitas ferramentas analíticas, para atender as

demandas dos programas de fiscalização de amostras contaminadas, há várias questões

levantadas, no intuito de minimizar os problemas encontrados nos procedimentos de extração,

no que se diz respeito a recuperação dos compostos. Contrariamente, Repizo et al (2012)

enfatiza que a detecção, por ionização em espectrometria de massas apresenta desvantagem,

pois é suscetível a efeito de matriz. Como a resposta do padrão por espectrometria de massas

em cromatografia líquida pode diferir nos resultados, os pesquisadores, desenvolveram uma

estratégia para minimizar estes efeitos, comparando o sinal do analito, em matrizes dos analitos,

com o sinal de solvente puro, sendo possível gerar curvas analíticas referentes às matrizes puras.

88

3.3.1 Características de um Método Validado

Indiscutivelmente, as orientações e guias de validação estão em constante avanço,

porém, são as preconizações, descritas, que garantem o bom planejamento das condições para

validação das metodologias analíticas.

Alguns comentários têm sido reportados pela bibliografia científica para diversas

aplicações. A exemplo de Dadgar at al (1995) que fazem uma explanação sobre o estudo da

seletividade nos inter e intra-ensaios, onde são discutidos os tipos de interferentes, que podem

influenciar o estudo destas figuras, desde a presença de substâncias endógenas, produtos de

degradação e até mesmo a contaminação por interferentes do ar e ambiente. Com relação aos

parâmetros da curva analítica, os pesquisadores afirmam que o limite de quantificação deve ser

referenciado a partir do limite de detecção, sendo o LQ três vezes maior que o LD. Ainda,

segundo Chasin et al. (1998), o LD é a menor concentração ou quantidade de uma substância

que pode ser identificada, por um procedimento analítico com um nível de confiança

especificado sendo, estatisticamente, diferenciada do ruído. Van de Merbel (2008) mostra as

desvantagens para determinação quantitativa dos compostos endógenos, em amostras

biológicas, por técnicas cromatográficas e enfatiza o efeito de matriz. Neste ponto, Cassiano et

al.(2009) e Matuszewski, Constanzer e Chavez-et al (2003b) enfatizam que esse efeito ocorre

quando substâncias inerentes à matriz biológica concorrem com os compostos de interesse,

comprometendo os a eficiência dos métodos Bioanalíticos, tais como: HPLC/fluorescência,

HPLC/UV, e HPLC-MS/MS.

A ANVISA (2003) propõe um guia de validação, onde é expresso o cálculo das figuras

de mérito, o desenvolvimento de metodologia tem sido aceito em todo o país. Inicialmente, para

Shabir (2003), a robustez de um método consiste na capacidade de não ser afetado por pequenas

variações, deliberado pelos parâmetros dos procedimentos. De maneira que, esse parâmetro, na

cromatografia, é avaliado, variando-se as condições como: solvente orgânico, pH do tampão na

fase móvel, força iônica, colunas e temperatura. Shah et al (2000), mostra que uma validação

bem-sucedida, reúne critérios específicos de aceitação para a exatidão e precisão.

A Tabela 3.4 apresenta as principais características de um método bem executado, sendo

que esta descrição. Além disso, as instruções, sobre as figuras de mérito, presentes nos manuais

da Emea (2012a), Codex Alimentarius (2014), ICH (2005) e trabalhos de Bressole, Bromet-

Petit e Audran (1996).

89

Já o guia do FDA (2011) confirma que a avaliação da robustez deve ser considerada,

durante toda a fase de desenvolvimento do método, em estudo, mostrando a confiabilidade de

uma análise, considerando as variações em parâmetros do método.

Tabela 3.4-Comparação dos requisitos de validação preconizados para quantificação dos resíduos em alimentos

Características Norma legal praticada pelas organizações

CAC/GL 72-2009 2002/657/EC VICH GL 49

Estabilidade do

analito

É o estudo de

armazenamento por um

período que se estende até,

90 dias além do tempo

esperado, para o rastreio,

quantificação e

confirmação do analito.

Sempre que possível, usa-

se amostras reais. Quando

não, é utilizado a matriz

fortificada com a

substância. Análises são

realizadas a cada 1, 2, 4 e

20 semanas, as amostras

armazenadas a -20 ºC.

Controle do tempo de

armazenamento e suas

condições. Esta etapa é parte

do processo de validação.

Realização de um estudo de

estabilidade da matriz. As

amostras devem ser

fortificadas (3 dias).

Teste de

robustez

O teste utilizando o

controle dos pontos

críticos. Variando-se as

condições analítica tais

como: nos volumes de

reagentes,

concentrações, pH, tempo

de retenção, qualidade

reagente e lotes.

Avaliação dos métodos

incluem espécies, matrizes

e abertura de amostras

diferentes. A importância

das é avaliada, utilizando a

abordagem de Youden.

Induzir situações de

modificações ao longo do

tempo. As mudanças podem

incluir: lotes de reagentes,

composição e volume,

número de extrações, marca

coluna.

Curva Analítica

É a primeira etapa que

avalia a resposta dos

padrões, diante faixa de

trabalho. Estas

concentrações (mínimo de

cinco branco). Deve

recobrir o LMR

Para construção da curva

deve ser utilizada, pelo

menos, cinco níveis

(incluindo o zero).

Definindo o intervalo de

concentração, indicando a

equação da curva,

É determinada por toda a

faixa de trabalho da

concentração do analito na

matriz. A execução depende

de três tipos de metodologia:

padrões de solvente/tampão,

matriz de controle e adição

de padrões.

Linearidade

É determinada pela análise

de regressão linear

admitindo a resposta

linear.

NF

É por equação linear,

definida por relação

concentração versus a

resposta 5 níveis de

concentrações.

Teste de

robustez

O teste utilizando o

controle dos pontos

críticos. Variando-se as

condições nos volumes de

reagentes, concentrações,

pH, tempo de retenção,

qualidade reagentes.

Avaliação dos métodos

incluem espécies, matrizes

e abertura de amostras

diferentes. A importância

das é avaliada por Youden.

Induzir situações de

modificações, que podem

incluir: lotes de reagentes,

composição e volume,

número de extrações, marca

coluna analítica e lotes e

eluição HPLC

Sensibilidade

É a concentração mais

baixa à qual o analito pode

ser detectado, dentro de

limites estatísticos.

Calculado com adição de

padrão interno.

Simultaneamente com a

robustez.

90

Tabela 3.4-Comparação dos requisitos de validação preconizados para quantificação dos resíduos em alimentos

(continuação)

Características Norma legal praticada pelas organizações

CAC/GL 72-2009 2002/657/EC VICH GL 49

Seletividade

Capacidade de um

método identificar a

resposta de sinal do

composto, na presença

de outras substâncias.

É a capacidade de um

método distinguir o analito

de outras substâncias.

É a capacidade de avaliar o

analito na presença de

componentes endógenos,

produtos de degradação e

medicamentos veterinários. A

resposta deve ser LQ < 20%.

Exatidão

A precisão de uma

medição está relacionada

com erro sistemático

(bias método analítico) e

%recuperação. A

precisão deve ser,

cuidadosamente,

caracterizada em

concentrações de

0,5LMR e 2 LMR.

É o grau de concordância

entre o resultado do ensaio

e o valor de referência

aceito. É determinada

através da veracidade e da

precisão. O cálculo da

veracidade consiste no

quociente entre

concentração média

detectada corrigida pela

recuperação.


entre o valor real da

concentração de analito e o

resultado da média, obtido

através da aplicação dos

procedimentos.

%Recuperação. O critério é:

< 1 µg/kg (-50 a +20 %).

≥ 1 < 10 µg kg-1 (-40 a +20 %)

≥ 10 < 100 µg kg-1 (-30 a +10

%)

≥ 100 µg kg-1 (-20 a +10 %)

Precisão

É expresso, em termos da

variação, pela

repetabilidade e

reprodutibilidade. Sendo

descrita pelo desvio-

padrão ou coeficiente de

variação.


entre o resultado de um

ensaio e o valor de

referência aceito. É

determinada pela

veracidade e precisão


entre resultados de testes

independentes, deve incluir

arepetabilidade. O critério de

aceitação (%CV):

< 1 µg/kg 30 %

≥ 1 µg/kg < 10 µg/kg 25 %

≥ 10 µg/kg < 100 µg/kg 15%

≥ 100 µg/kg 10 %

Limite de

Detecção (LQ)

Pode ser determinado

pela leitura de amostras

representativas. Em

alguns casos é necessário

fortificar para obter

detecção aceitavel.

É estabelecido pelo Limite

de decisão (CCα) e

Capacidade de Detecção

(CCβ).

É a menor concentração

medida para o analito.

Limite de

Quantificação

(LQ)

Deve satisfazer os

critérios de precisão e

exatidão (recuperação).

Deve ser LQ ≤ LMR.

Deve ser 0,5 LMR.

É estabelecido pelo Limite

de decisão (CCα) e

Capacidade de Detecção

(CCβ).

É a menor concentraçã medida

do analito, a partir do qual a

determinação pode ser feita,

com o grau específico de

exatidão e precisão.

Não obstante, Rozet et al (2011) ressalta que as figuras de méritos não se restringem

apenas aos métodos cromatográficos, mas também aos imuno-ensaios. Os pesquisadores

enfatizam que a incerteza de medição, lembra aos analistas que o resultado é a estimativa real

da concentração, na amostra e ajuda na tomada de decisões.

.

CAPÍTULO 4

METODOLOGIA

92

4 METODOLOGIA

Todas as análises foram realizadas nas dependências da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte no Instituto de Química em Laboratórios da Central Analítica. As

metodologias foram aplicadas, exclusivamente, para fins Acadêmicos, satisfazendo todo o

cronograma para a execução desta Tese.

4.1 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA IDENTIDADE E QUALIDADE DOS

MEDICAMENTOS A BASE DE BENZILPENICILINA

4.1.1 Reagentes e Solventes

Acetona P A ACS (C3H6O), Álcool Etílico (C3H6O) da Synth (São Paulo, Brasil).

Os reagentes para análise em UFLC-DAD foram grau analítico. A acetonitrila foi

fornecida pela Merck (Darmstadt, Alemanha) com pureza de 99,9%. Água foi purificada do

sistema Millipore.

O padrão analítico certificado VENTRANAL™ foi a Benzilpenicilina Potássica

(C16H17KN2O4S) adquirido da Sigma Aldrich (Steinheim, Alemanha), conforme certificado de

análise (ANEXO I).

4.1.2 Instrumentação

Balança analítica de precisão Marte (Minas Gerais, Brasil). Aparelho de para banhos

ultrassônicos foi o USC1600 Unique Group (São Paulo, Brasil).

Espectrômetro no infravermelho de bancada da Perkin Elmer Spectrum 100 FT-IR

(Waltham, Massachusetts, Estados Unidos). As análises foram realizadas em FTIR. Os dados

espectrais foram recolhidos em 4000 a 650 cm-1 em software Spectrum 10. As medidas foram

processadas em ATR com cristal de seleneto de zinco (ZnSe)

Espectrômetro na região do UV e NIR da Cary 5000 UV-Vis-NIR da Agilent

Technologies (Santa Clara, Califórnia, Estados Unidos).

As análises cromatográficas foram realizadas utilizando sistema UFLC-DAD Shimadzu

(Kyoto, Japão) acoplado com detector de UV 254 nm, apresentado na Figura 4.1.

93

Figura 4.1-Ilustração do Sistema UFLC-DAD

O autor, 2015

Esse aparelho é constituído por um compartimento (rack) com capacidade para 61

amostras (A), injetor por loop com injeção máxima de 100 µL (B), bombas reguladoras de

pressão para fase A sistema LC- 20AD (C), Bombas reguladoras de pressão para fase B sistema

LC – 20AD (D), Forno da coluna com máxima temperatura de 40 ºC (E), Detectores por arranjo

de fotodiodos módulo CBM – 20 A (F), Frascos para fase móvel (G).

4.1.3 Outros materiais para Cromatografia

Coluna de fase reversa C18 (2,0 mm × 30 mm ID) Shim-pack XR-ODS (Kyoto, Japão).

Filtro de seringa nylon (13 mm × 0,45 µm) código 2204513500 adquiridos da Nova Analítica

Importação e Exportação LTDA (São Paulo, Brazil). Vials de âmbar de 2mL adquiridos

também da Nova Analítica código 10100209200.

As padronizações das soluções foram realizadas em balão volumétrico de 10 mL e 50

mL. Micropipetas de volumes máximo de 20 µL e 100 µL.

94

4.1.4 Amostras de medicamentos

As amostras foram adquiridas em comércios de produtos veterinários, localizados em

Natal/RN, no período entre 2013 – 2015. A escolha das amostras foi satisfeita, segundo a

utilização na agricultura brasileira para sanidade de animais produtores de leite (bovinos e

caprinos).

As amostras foram de doze marcas diferentes com origem em dois laboratórios do

Brasil. Um total de 37 amostras de medicamento foram utilizadas para calibração do método.

Todos os medicamentos utilizados para análises são registrados no CPV/SIDAN. Os

terapêuticos estão em conformidade com o Decreto nº 5.053, de 22 de abril de 2004 no Capítulo

VI Art. 39 quando trata do registro dos produtos de uso veterinário.

Assim, os produto comercializados a base de penicilina, seguiram as informações de

obrigatoriedades, principalmente, quanto a rotulagem que são: nome completo, legenda USO

VETERINÁRIO, descrição dos ingredientes ativos, indicação, doses por espécie do animal,

advertências, condições de armazenamento, período de carência, quando for o caso declaração

de receita, nome do órgão que registrou, número e data de registro, nome e CNPJ do

estabelecimento detentor do registro, nome e número do registro técnico do profissional,

codificação definida pelo MAPA, fabricação e vencimento.

95

A Tabela 4.1 apresenta as informações principais dos terapêuticos, tais como:

concentração, indicação e período para eliminação em animais lactantes (período de carência).

Tabela 4.1-Descrição dos medicamentos analisados, segundo CPV/SIDAN

Grupos Descrição da Fórmula Carência

(horas) Indicação Reg. MAPA

G1

PENG BEN (1.200.000 UI), PENG

PROC (600.000 UI), PENG K+

(600.000 UI), DIISTR (500 mg) STR

(500 mg) em solução de 6 mL

120

Mastitis causadas por

Streptococcus spp., Bacillus spp.,

Escherichia spp., Staphylococcus

spp.,

1.804 em

09/08/62

G2

PENG PROC (1.500.000 UI), PENG

K+ (1.500.000 UI) DIISTR (1.250 mg),

STR (1.250 mg) em solução 15 mL

96

Mastitis causadas por

Streptococcus spp., Bacillus spp.,

Escherichia spp., Staphylococcus

spp

6.330 em

13/03/98

G3 OTC (0,2 g mL-1) 96

Pneumonia (Pasteurella,

Corynebacterium, Klebsiella,

Haemophilus e Bordetella)

0801 em

29/11/78

G4 OTC (0,2 g ml) 96 Pneumonia causadas por

Pasteurella

1.630 em

04/08/60

G5 OTCDII 0,3 g ml NA

Pneumonia causadas por

Pasteurella, Corynebacterium,

Klebsiella

4834 em

09/09/94

G6 TC (2,00 g)

Ac. Ascorb (1,50 g) NA

Infecções Pulmonares causadas

por Mycoplasma sp

3681/91 em

16/04/1991

G7 IVERM (0,0225 g mL-1) ABAM

(0,0125 g mL-1) NA

Gastrintestinais e pulmonares

causadas por nematódeos 8691/03

G8 SMZ (0,020,0 g mL)

TMP (0,04,0 g mL)

72 (para

bovinos)

Respiratórias causadas por

Haemophilus sp, Bordetella sp, 5.366/95

G9 SDX (0,20,0 g mL)

TMP (0,04,0 g mL) 24

Mastites causadas por

Enterobacter aerogenes,

Staphylococcus aureus

7570/00

G10 GEN 3 mg mL-1 24 Metrites e endometrites

(Staphylococcus spp)

3.821 em

11/10/91

G11 ENR (0,05g mL-1) 120

Escherichia coli, Proteus spp.

Clostridium perfringes 6.665 em

5/01/99

G12 DOX 0,046 g mL-1 NA Clostridium tetani 8.528 em

10/04/2003

NA: lactantes não devem ser tratadas quando o leite for destinado ao consumo humano.

96

As amostras contendo PENG foram separadas e quantificadas por Polarimetria,

Cromatografia e UV VIS NIR. As informações das amostras são apresentadas na Tabela 4.2.

Tabela 4.2-Amostragem dos medicamentos (misturas) para identificação e quantificação

Amostra Grupos

Identificação Quantificação

Cromatogramas Espectros IF

médio Cromatografia

UV VIS

NIR

1 G1 A I A1 A1

2 G1 B I A2 A2

3 G2 B II A3 A3

4 G2 B II A4 A4

5 G2 B II A5 A5

6 G2 B II A6 A6

7 G2 B II A7 A7

8 G2 B II A8 A8

9 G2 B II A9 A9

10 G2 B II A10 A10

11 G2 B II A11 A11

12 G2 B II A12 A12

13 G2 B II B13 B13

14 G3, G4, G5, G6, G8, G9,

G10 e G7 D

I, II, III, IV, V e

VI B14 B14

15 G2 B II B15 B15

16 G2 B II B16 B16

17 G2 B II B17 B17

18 G3, G4, G5, G6, G8, G9,

G10 e G7 D

I, II, III, IV, V e

VI B18 B18

19 G3, G4, G5, G6, G8, G9,

G10 e G7 D

I, II, III, IV, V e

VI B19 B19

20 G2 B II B20 B20

21 G1 e G3 C I e II B21 B21

22 G1 e G4 C I e IV B22 B22

23 G1 e G5 C I B23 B23

24 G1 A VI B24 B24

25 G1 B VI B25 B25

26 G2 B VI B26 B26

27 G2 B VI B27 B27

28 G2 B VI B28 B28

29 G2 B VI B29 B29

30 G2 B VI B30 B30

31 G2 B VI B31 B31

32 G2 B VI B32 B32

33 G3, G4, G5, G6, G8, G9,

G10 e G7 C

I, II, III, IV, V e

VI B33 B33

34 G3, G4, G5, G6, G8, G9,

G10 e G7 C

I, II, III, IV, V e

VI B34 B34

35 G3, G4, G5, G6, G8, G9,

G10 e G7 C

I, II, III, IV, V e

VI B35 B35

36 G3, G4, G5, G6, G8, G9,

G10 e G7 C

I, II, III, IV, V e

VI B36 B36

37 G3, G4, G5, G6, G8, G9,

G10 e G7 C

I, II, III, IV, V e

VI B37 B37

97

4.1.5 Espectroscopia no infravermelho médio

As medidas foram realizadas seguindo o método 01/2008:202224 da European

Pharmacopoea (2008) e trabalho de Sivakesava e Irudayaraj (2002) para caracterização de

antibióticos por FTIR IV.

As amostras foram preparadas em concentração padrão de 2 mg mL-1 em balão

volumétrico de 10 mL. As soluções foram armazenadas em frascos de âmbar e refrigeradas a -

4 ºC.

Na execução das medidas as amostras foram dispostas no acessório de refletância

atenuada total (ATR), onde ocorre a transferência da radiação infravermelha que foi direcionada

para o cristal. Em seguida, o cristal foi, cuidadosamente, limpo com acetona entre sucessivas

medições, e colecionado espectros de branco, para garantir a ausência de resíduos.

As amostras de medicamentos contendo PENG foram preparadas, simultaneamente,

com o espectro de referência padrão.

Os dados espectrais foram coletados em software Spectrum 10. As análises estatísticas

foram realizadas em software OriginProLab 9.0.

98

4.1.6 Análises por Cromatografia líquida ultrarrápida acoplada em arranjo linear de

fotodiodos

4.1.6.1 Preparo da solução padrão de PENG

A solução estoque de PENG 300 μg mL-1 foi preparada por diluição em água ultrapura

Millipore em balão volumétrico de 10 mL, devidamente aferido. A solução foi sonicada durante

15 min e filtradas em filtro nylon millipore, armazenada em frasco de âmbar e mantida

refrigerada a - 20 °C. As soluções trabalho foram preparadas, diariamente, antes das medidas

cromatográficas, na faixa de 0,001 a 0,1 µg mL-1.

4.1.6.2 Preparo de amostras

As amostras medicamentosas foram preparadas segundo procedimentos descritos pelas

Farmacopeias Americana, Brasileira, Europeia, Japonesa e Britânica (BRASIL, 2010;

BRITISH PHARMACOPOEIA, 1983; EUROPEAN PHARMACOPOEIA COMMISSION,

2008; JP XVI, 2007; USP XXVIII). Este procedimento foi adotado para garantir a

aplicabilidade dos resultados gerados por este trabalho.

Todas as soluções injetáveis de medicamentos foram preparadas a partir da diluição com

água Millipore, exceto as amostras contendo Abamectina e Ivermectina insolúveis na fase polar,

sendo preparadas em solvente apolar, acetonitrila. Todas as amostras foram microfiltradas em

filtro de seringa nylon Millipore. Amostras contendo Penicilina (PENG) na sua composição

foram sonicadas durante 15 min.

As amostras padronizadas do grupo 1 e 2 das penicilinas (com referência em PENG K+)

foram preparadas em concentrações teóricas de PENG BENZ (4 – 0,0017µg mL-1), PENG

PROC e PENG K+ (0,71 – 0,0088 µg mL-1), DHSTR e STR (0,54 – 0,0069 µg mL-1). As

amostras do grupo 3, 4, 5 e 6 das tetraciclinas foram elaboradas com faixa de OTC (0,5 – 0,01

µg mL-1). As amostras do grupo 7 macrolídeos ABAM (0,5 – 0,01 µg mL-1) e IVERM (0,25 –

0,005 µg mL-1). As amostras do grupo 8 e 9 das sulfonamidas SMZ e SDX (0,53 – 0,0004 µg

mL-1), TMP (0,10 – 0,0009 µg mL-1). As amostras do grupo 10 aminoglicosídeo GEN (0,5 –

0,01 µg mL-1).

99

4.1.6.3 Condições das análises cromatográficas

Os procedimentos ocorriam sempre com previa desgaseificação das bombas A e B e

limpeza do solvente. A temperatura foi mantida em 25 ºC. A detecção no UV, nessas condições

ocorria, conforme a absorção máxima de cada família de antimicrobianos descritos na Tabela

4.1 pelos grupos das amostras isoladas (apresentadas nos APÊNDICES I – VI) sendo que para

G1 é de 264 nm; G2 de 264 nm; G3, G4, G5 e G12 de 203, 266 e 358 nm; G6 de 220, 370 e

450 nm; G7 de 190. 220 e 280 nm; G8 de 232 e 265 nm; G9 de 220, 254 e 270 mm; G10 de

254 nm; G11 de 190, 252, 257 e 264 nm. Porém o comprimento de onda para a análise foi

selecionado λmax de 220, 252, 254, 257 e 264 nm.

As medidas foram registradas em software LCsolution da Shimadzu (Kyoto, Japão). Os

tratamentos estatísticos foram realizados em software Effi Validation 4.0 (República Tcheca,

EU) versão gratuita.

As análises das melhores condições para identificação de PENG (0,1 µg mL-1) foram

realizadas segundo a descrição da Tabela 4.3.

Tabela 4.3-Planejamento das condições do sistema cromatográfico para PENG

Parâmetros Condição 1 Condição 2 Condição 3

Tempo da Corrida (min) 10 10 10

Tempo de Retenção (min) 4,431 4,327 4,222

Composição da Fase Móvel (H2O/ACN) 90/10 80/20 70/30

Injection Volume (µL) 10 10 10

Fluxo (mL min-1) 0,01 0,02 0,04

Pico da Area (mAU) 2020 2019 1866

A composição da fase móvel foi constituída por H2O millipore 90% e Na2HPO4 a 1% e

fase B ACN 10% para condição 1.

Em seguida, submeteu-se o método a pequenas variações na composição da fase móvel,

no fluxo e na pressão nas bombas A e B, simultaneamente, para verificar a robustez.

100

4.1.6.4 Validação do Método

A validação dos procedimentos seguiu as recomendações do Guia de Validação da

Emea (2006) sendo a norma ICH Q2 (R1) para medicamentos. Os procedimentos para validação

foram realizados por adição de padrão externo PENG. Os cálculos dos parâmetros de validação

foram realizados usando o software Effi Validation.

4.1.6.4.1 Especificidade/Seletividade

Para garantir a identidade de uma substância foram realizados testes de pureza para

comprovação do rendimento do método desenvolvido. O rendimento foi calculado por Equação

11.

%𝑅 =[𝑃𝐸𝑁𝐺]𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙

[𝑃𝐸𝑁𝐺]𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎

× 100 (11)

Este cálculo foi realizado em seis níveis de concentração sendo 0,001, 0,002, 004, 0,01,

0,02 e 0,04 µg mL-1 em 15 réplicas, obtendo-se as médias, desvio, coeficiente de variação

(%CV) e erros.

4.1.6.4.2 Faixa de Trabalho e construção da curva analítica

A adição do padrão externo foi realizada com PENG K+ descrito no item 4.1.4.

O modelo para identificação e quantificação da PENG é determinado pela construção

de curva analítica para determinação da concentração desconhecida de PENG em faixa de

trabalho de 0,001 a 0,1 µg mL-1.

As soluções padrões contendo 0,001; 0,002; 0,005; 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 e 0,1 µg

mL-1 de PENG foram preparadas e injetadas 10 µL, em triplicata, na coluna cromatográfica.

A curva analítica foi construída em função da área do pico de PENG e concentração (µg

mL -1) do padrão PENG.

101

4.1.6.4.3 Linearidade

A linearidade foi determinada com base nos parâmetros da curva analítica, sendo

aceitável quando R ≥ 0,999

A determinação da pureza através do ponto de calibração foi realizada preparando-se a

amostra em solução aquosa com concentração definida no item 4.1.4.

4.1.6.4.4 Precisão

A precisão foi determinada pela relação entre as concentrações teóricas e experimentais

obtidas pela Equação da curva analítica. O cálculo foi obtido pela repetitividade dos resultados.

Calculou-se a concentração do analito com base no sinal obtido pela área do pico (mAU).

Calculou-se as concentrações médias, desvios padrão e os coeficientes de variação para cada

nível de concentração.

Os critérios de aceitação foram obtidos baseado no CGL/SDA que normatiza coeficiente

de variação de 35% para C < 1 mg/kg, 30% para 1 mg/kg ≤ C < 10 mg/kg, 20% para 10mg/kg

≤ C < 100mg/kg, 15% para 100 mg/kg ≤ C < 1000 mg/kg, 10% para 1000 mg/kg ≤ C < 10000

mg/ kg, 7,3 % para 10 mg/kg ≤ C < 100 mg/kg, 5,3% para 100 mg/kg ≤ C < 1000 mg/kg, 3,7%

para 1000 mg/kg ≤ C < 10000 mg/ kg, 2,7% para10 g/kg ≤ C < 100 g/kg e 2% para 100 g/kg ≤

C < 1000 g/kg.

4.1.6.4.5 Exatidão

A exatidão foi determinada pela repetabilidade dos dados e expressos pelos coeficientes

de variação (%CV) em cada nível de repetição sendo 0,001, 0,002, 0,004, 0,01, 0,02 e 0,04 µg

mL-1. Foi expressa pela variância, o desvio padrão e coeficiente de variação da série de

medições.

102

4.1.6.4.6 Limite de detecção

A padronização das soluções em níveis de concentração de 0,001 – 0,1 µg mL-1 foi

preparada e injetada 10 µL em triplicata na coluna cromatográfica. A concentração foi

determinada correspondente ao sinal que equivalente a três vezes o ruído instrumental.

4.1.6.4.7 Limite de quantificação

O LQ foi determinado que é equivalente a 3,3 vezes o LD. O limite de quantificação de

um procedimento analítico foi determinado pela mais baixa quantidade de analito na amostra

determinada quantitativamente com precisão e exatidão. Nesta etapa, o LQ foi usado em para

determinar as impurezas bem como os produtos de degradação.

4.1.6.4.8 Robustez

A robustez foi determinada realizando variações nos parâmetros do método. Os

procedimentos foram mostrados na Tabela 4.3.

103

4.1.6.5 Identificação de PENG nas amostras

As amostras selecionadas para identificação da PENG foram apresentadas isoladamente

na Tabela 4.1. Porém são apresentadas as informações na Tabela 4.2 correspondentes as

amostras para análise no UV VIS NIR.

A identificação foi realizada com base no branco constituída pela fase móvel, foi

realizada a correlação entre as amostras.

4.1.6.6 Cálculo das concentrações de PENG em amostras de medicamentos

Para o cálculo das concentrações de PENG nas amostras foi utilizada a Equação 12.

𝐴𝑆

𝐴𝑅

= 𝐶𝑆

𝐶𝑅

(12)

Onde, As é a área do pico do PENG na amostra, Ar é a área do pico do padrão PENG,

Cr é a concentração do PENG na amostra e Cr é a concentração do padrão PENG.

Quando os parâmetros são rearranjados tem-se a Equação 14, no qual Cs é concentração

do analito da amostra determinada pela Equação 13.

𝐶𝑆 = 𝐶𝑅 × 𝐴𝑆

𝐴𝑅

(13)

Admitindo-se o LD e LQ do método desenvolvido, com base na Equação da curva

analítica.

104

4.1.7 Análise na região do UV VIS NIR e tratamentos de dados

As condições para medidas foram: velocidade de varredura de 109,091 cm-1 min-1 em

região de 200 a 2300 nm. Os dados espectrais foram coletados em software CaryWin foram

convertidos para software 32 GRAMAS (Galactic Industries Corporation, Salem, NH),

analisados usando software Unscrambler® X 10.3 (CAMO, Noruega) e plotados e apresentados

em software OriginPro 9 (OriginLab, Guangzhou, China). Os tratamentos matemáticos e

estatísticos foram: correção da linha de base, normalização, alisamento Savitsky Golay,

correção multiplicativa da luz (MSC) e cálculos derivativos.

A correção de linha de base (baseline) foi realizada pelo cálculo das médias em cada

variável do espectro, de maneira que os valores individuais foram substituídos pelas médias

espectrais.

Todos os dados espectrais foram normalizados em torno da média, usando a Equação

14 descrita, no qual a matriz (37 × 2100), que corresponde a 37 linhas referente as amostras e

2100 colunas referentes as variáveis expressas em comprimentos de onda (nm).

𝑋(𝑖, 𝑘) = 𝑋(𝑖, 𝑘)

|�̅� (𝑖,∎ )| (14)

A equação foi utilizada admitindo-se uma matriz para primeiro método (37 × 2100),

onde o número de linhas (i) representam as amostras e colunas (k) as variáveis espectrais

(comprimentos de onda).

Os espectros passaram por transformações constituída pelo cálculo do algoritmo de

Savitsky Golay que foi calculado e testado por uma Equação polinomial de 1ª e 2ª ordem, em

cada segmento foi obtida uma curva que substituíram os valores originais, testado em janela de

31 pontos.

Outra correção realizada foi a correção multiplicativa da luz (MSC) que consistiu em

construção de linha de regressão para cada espectro das amostras, que foi expressa pelo valor

médio para cada comprimento de onda, utilizada para corrigir os valores em cada espaço

amostras. O cálculo baseava-se na Equação 15.

𝑀𝑛𝑜𝑣𝑎 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑧(𝑖, 𝑘) = 𝑀(𝑖, 𝑘) − 𝑎

𝑏 (15)

105

Na Equação a e b representam os coeficientes da regressão.

Foram calculadas as derivadas de primeira e segunda ordem, as Equação 16 corresponde

a primeira ordem.

dA

dλ= a + 2cx (16)

Quando calculados derivadas de segunda ordem foi utilizada a Equação 17.

d2A

dλ2= 2C (17)

Nestas etapas do procedimento foi aplicado o método derivativo testando o número de

pontos nas janelas e avaliado os gráficos de loadings para determinação das variáveis que

apresentaram maiores influência no modelo.

Os métodos de regressão utilizados para calibração dos modelos foram o PCR e PLS,

estes utilizam as variáveis originais, tendo como critério como número de amostras deve ser

maior que o variáveis de respostas neste caso no comprimento de onda.

Para construção dos modelos no PCR foram utilizados os dados da matriz X (i) e

encontrados as combinações lineares para as variáveis. A Equação 18 descreveu o modelo.

X = TP𝑇 + E (18)

Onde X é a matriz original, E são os resíduos das análises. A resposta do variou de

acordo com o modelo utilizado, sendo que segundo a Equação 19 quando foi obtido o PLS.

𝑦 = 𝑇𝑃𝑇

𝑋 (19)

Neste modelo o critério foi Xcal, X val, Xprev, sendo que se fixou Xprev, enquanto que Xcal

foi a resposta do modelo, desta forma foi realizada a relação descrita pela Equação 20.

y = [1, Xcal] (20)

106

Na Tabela 4.4 são apresentadas a rotina para modelagem dos dados em duas regiões

espectral, uma compreende o UV ao NIR, a segunda compreende a região apenas do NIR. As

analises foram realizadas nos medicamentos puros (E1 – E37) em segunda etapa foram

analisadas as amostras tratadas (E1 – E37), incluindo as amostras para validação externa.

Tabela 4.4-Procedimento de modelagem para quantificação de PENG em medicamentos de uso veterinário.

Modelos Condições implementadas

Tratamentos Regressão Região Espectral

Medicamentos Puros com CPENG (0,01 – 0,3 mg mL-1)

M1 T1

PCR

200 – 2300

M2 T1+ 1st 31 pontos


M4 T1

PLS M5 T1+ 1st 31 pontos


M7 T1

PCR

750 – 2300



M10 T1



Medicamentos Tratados com CPENG (0,001 – 0,03 mg mL-1)

M13 T1

PCR

200 – 2300



M16 T1



M19 T1

PCR

750 – 2300



M22 T1



107

É necessário enfatizar que, os melhores modelos foram escolhidos de acordo com R, o

erro padrão de calibração (SEC), e repetabilidade para o conjunto de dados de calibração.

O desempenho do modelo de calibração foi avaliado por validação externa. Na Figura

4.2 são apresentadas as estratégias para seleção das amostras.

Figura 4.2-Ilustração para testes com amostras externas

Os valores do erro quadrático médio de validação cruzada são calculados utilizando a

Equação 21. Assim, foi utilizada a validação cruzada (LOOCV).

RMSEC = √1

N1

∑(CR − CP)2

N1

i=1

(21)

A precisão da validação foi verificada pelos valores de RMSEP e R. O erro quadrático

médio da previsão adicionados modelos descritos pela Equação 22.

RMSEP = √1

Nt

∑(CR − CP)2

Nt

i=1

(22)

Nas Equações 22 e 23 N1 e Nt são o número de amostras usados na validação cruzada e

validação externa, respectivamente. CR e CP são os valores de concentração de referência e

previsão, respectivamente.

1 2 3 4 5 6 7 8 91

01

11

21

31

41

51

61

71

81

92

02

12

22

32

42

52

62

72

82

93

03

13

23

33

43

53

63

73

83

94

05

75

94

14

24

34

44

54

64

74

84

95

05

15

25

35

45

65

55

8

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

Validação Externa (36%)

[M]

mg m

L-1

Amostras

Calibração (64%)

108

Os modelos de calibração foram desenvolvidos com espectros originais e Pretratados

conforme. Na Figura 4.3 são apresentadas as principais etapas realizadas para calibração do

método e validação externa com as 24 amostras puras e tratadas.

Figura 4.3- Esquema resumido para testes com amostras externas

O autor, 2015

Nestas etapas O número de variáveis e/ou componentes foi determinado, com base na

soma dos resíduos previstos e correlação (R).

109


QUANTIFICAÇÃO DE PENG EM LEITE BOVINO E CAPRINO

4.2.1 Reagentes e Solventes

Os reagentes utilizados foram: fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) P.A ACS Vetec

(São Paulo, Brasil) da Sigma Aldrich, Sódio, ácido cítrico (C6H8O7) P.A ACS, ácido

etilenodiaminotetracético (C10H16N2O8), fosfato de potássio dibásico anidro (K2HPO4) ACS

P.A, hidróxido de sódio (NaOH) PA ACS, ACS

Todos os reagentes empregados para análise por UFLC-DAD foram descritos no item

4.1.1.

4.2.2 Instrumentação

Os instrumentos para pesagens e dissolução dos reagentes foram descritos no item 4.1.2.

Foram utilizados outros instrumentos para preparo das amostras: Centrífuga Refrigerada

de Bancada Excelsa 4 Modelo 280R Fanem (São Paulo, Brasil), pHmetro digital MPA-210

Tecnopon (São Paulo, Brasil). As amostras foram agitadas em Agitador de tubos Phoenix P56

(São Paulo, Brasil).

4.2.3 Outros materiais para Cromatografia

Os procedimentos para identificação dos compostos foram alcançados, usando coluna

de fase reversa C18 (2,0 mm × 30 mm ID) Shim-pack XR-ODS (Kyoto, Japão). As amostras e

padrão PENG K+ foram microfiltradas em filtro de seringa nylon (13 mm × 0.22 mm) código

2202213500C adquirido da Analítica (São Paulo, Brasil). As padronizações das soluções foram

realizadas por aferição, em micropipetas de volumes máximo de 20 µL.

110

4.2.4 Amostragem

4.2.4.1 Amostras de leite controle

Amostras de leite bovino e caprino ausentes de resíduos de PENG foram usadas na

preparação da curva analítica e cálculo dos parâmetros de validação.

4.2.4.2 Amostras de leite comerciais (externas)

A amostragem foi realizada conforme técnicas do programa de regulação para controle

de resíduos veterinários em alimentos CAC/GL 16 – 1993. Esta norma preconiza que a seleção

das amostras é realizada aleatoriamente. Amostras de leite pasteurizado foram adquiridos de

supermercados localizados em Natal/RN, sendo 24 de leite bovino LB e 20 de leite caprino

LCP.

O procedimento para coleta e acondicionamento do leite até laboratório, onde foram

realizados os procedimentos de abertura, foi determinado por etapas, na 1ª cada amostra foi

homogeneizada durante, aproximadamente 3 min; na 2ª foi coletado 500 mL do leite e

acondicionados em frasco de polipropileno de 1º uso sem qualquer inscrição, isto e apenas

designação como descrita na Tabela 4.2 e 4.3, não completando todo o volume disponível do

frasco; na 3ª as amostras foram congeladas de forma a atingir o centro geométrico da amostra

a temperatura de -20 ºC.

4.2.4.2.1 Amostras de leite bovino comercial (LB)

As amostras LB analisadas foram de 11 marcas distintas de origem em seis regiões

diferentes do país comercializadas na cidade do Natal. As amostras são classificadas como

integral e desnatado. As informações principais de amostras são descritas na Tabela 4.5.

As descrições quanto à procedência das amostras foram coletadas das embalagens e

confirmadas pelo Banco de Dados do MAPA disponível para consulta pública dos

estabelecimentos produtores com base no selo de inspeção Federal (Sifs).

111

Tabela 4.5-Descrição das amostras de leite bovino

Amostras Origem*

Algumas das Informações Declaradas por Rotulagem dos

produtos Data da abertura

das amostras (%) Lipídios (%) Proteínas Estabilizantes

LB1 Fortaleza/CE 8 11 citrato de Sódio 29/07/2014

LB2 Fortaleza/CE 0 8 citrato de Sódio 30/07/2014

LB3 MG 11 8

Citrato de sódio,

tripolifosfato de sódio e

fosfato trissódico

07/02/2014

LB4 MG 0 8 citrato de sódio 08/02/2014

LB5 Jaborandi/BA 14 9 citrato de Sódio 29/07/2014

LB6 Jaborandi/BA 5 14 citrato de Sódio 30/07/2014

LB7 Garanhuns/ PE 6 6 citrato de Sódio 29/07/2014

LB8 Garanhuns/ PE 0 6 citrato de Sódio 30/07/2014

LB9 Governador

Valadares/MG 1 8

citrato de sódio e fosfato

de sódio 29/07/2014

LB10 Governador

Valadares/MG 1 8

citrato de sódio e fosfato

de sódio 30/07/2014

LB11 Goiânia/GO 11 8

citrato de sódio,

tripolifosfato de sódio,

pirofosfato ácido de sódio

e fosfato monossódico

29/07/2014

LB12 Goiânia/GO 0 9

citrato de sódio,


pirofosfato ácido de sódio

e fosfato monossódico

30/07/2014

LB13 Patos de

Minas/MG 11 8 citrato de Sódio 29/07/2014

LB14 Patos de

Minas/MG 0 8 citrato de Sódio 30/07/2014

LB15 Itambuiá/GO 11 8

citrato de sódio,

monofosfato de sódio,

difosfato de sódio e

trifosfato de sódio

29/07/2014

LB16 Itambuiá/GO 0 8

citrato de sódio,




30/07/2014

LB17 Corumbaíba/GO 11 8

citrato de sódio, trifosfato

de sódio, monofosfato

monossódico e difosfato

dissódico

29/07/2014

LB18 Corumbaíba/GO 2 8

citrato de sódio, trifosfato

de sódio, monofosfato

monossódico e difosfato

dissódico

30/07/2014

LB19 Ponta Grossa/PR 11 8

citrato de sódio,




29/07/2014

LB20 Ponta Grossa/PR 0 8

citrato de sódio,




30/07/2014

LB21 Macaiba/RN 11 8 NA 29/07/2014

LB22 Macaiba/RN 0 6 NA 30/07/2014

LB23 Muribeca/SE 11 9


pirofosfato de sódio e

fosfato monossódico

07/02/2014

LB24 Muribeca/SE 0 9


pirofosfato de sódio e

fosfato monossódico

07/02/2014

*Todas as informações contidas quanto à origem referem-se às usinas de beneficiamento das respectivas amostras de leite,

NA e não se aplica.

112

4.2.4.2.2 Amostras de leite caprino comercial (LCP)

As amostras LCP analisadas foram de duas marcas distintas e origem em duas regiões

diferentes do país. Na Tabela 4.6 são apresentadas as amostras de leite caprino.

Tabela 4.6-Descrição das amostras de leite caprino

Amostras Origem*

Algumas das Informações Declaradas por Rotulagem dos

produtos Data da abertura

das amostras (%) Lipídios (%) Proteínas Estabilizantes

LCP1 Porto Alegre/RS 9 1

Monofosfato de sódio,



29/07/2014

LCP2 Porto Alegre/RS 9 1 29/07/2014









LCP11 Macuco/RJ 13 8

Citrato de sódio e/ou

difosfato de sódio

29/07/2014

LCP12 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

LCP13 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

LCP14 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

LCP15 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

LCP16 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

LCP17 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

LCP18 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

LCP19 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

LCP20 Macuco/RJ 13 8 29/07/2014

*Todas as informações contidas quanto à origem referem-se às usinas de beneficiamento das respectivas amostras de leite,

NA e não se aplica

As amostras apresentadas na Tabela 4.6 estão com teor gordura > 9%, segundo as

recomendações dos fabricantes são produtos integrais.

113

4.2.5 Preparo da solução padrão de PENG

A solução estoque de PENG 300 μg mL-1 foi preparada por diluição com água ultrapura

Millipore em balão volumétrico de 10 mL, devidamente aferido. Esta solução foi filtrada em

filtro Millipore. Em seguida a solução foi sonicada durante 15 min, armazenada em frasco

âmbar e refrigerada a - 20 °C.

As soluções foram preparadas, diariamente, antes das medidas cromatográficas seguida

de procedimento de filtração. A faixa de trabalho utilizada foi de 0,002 – 0,1 µg mL-1.

4.2.6 Preparo da solução tampão McIlvaine pH 4

O tampão Mcllvaine pH 4 foi preparado em balão volumétrico de 1000 mL (aferido) a

partir da mistura de 100 mL de ácido cítrico 0,1 mol L-1, 62,5 mL de fosfato de potássio dibásico

anidro (K2HPO4) 0,2 mol L-1 e 3 g de ácido etilenodiaminotetracético (C10H16N2O8). O ajuste

de pH foi realizado com solução de hidróxido de sódio padronizado a 0,1 mol L-1.

114

4.2.7 Preparo e limpeza das amostras de leite bovino e caprino

O método desenvolvido não utiliza extração por solvente, apenas aplicação de solução

tampão McIlvaine adaptada, seguida de agitação e centrifugação, de acordo com a norma

CAC/GL 16. Os procedimentos adotados para extração e isolamento do analito são descritos na

Figura 4.4.

Figura 4.4-Esquema simplificado do preparo das amostras de leite antes (A) e após tratamento (B)

O autor, 2015

O método envolveu precipitação total das proteínas. Inicialmente, 5 g de amostra

equivalente a 15 mL de leite foi diluída em tampão Mcllvaine pH 4, a mistura foi agitada em

vórtex. Em seguida, foi centrifugada a - 4 ºC a 500 rpm durante 10 min. A fase aquosa foi

filtrada e recolhida para repetição do processo até a precipitação da proteína total seguido de

diluição em balão volumétrico de 50 mL. Em seguida a fase aquosa foi diluída em água

Millipore e filtrada em filtro de nylon (13 mm × 0,22 µm).

115

4.2.8 Condições para análise cromatográfica

As condições instrumentais utilizadas seguem as descrições do item 4.1.6.3, que trata

da corrida cromatográfica do padrão certificado PENG 300 µg mL-1. A fase móvel foi

constituída por H2O millipore 90% e Na2HPO4 a 1% e fase B ACN 10% para condição 1.

O planejamento das condições para análise de leite bovino foi realizado pela adição de

padrão PENG 300 µg mL-1 as amostras controle. Os dados seguem descritos pela Tabela 4.7.

Tabela 4.7-Planejamento comparativo das condições do sistema cromatográfico para PENG para análise das

amostras controle de leite bovino (LB) e leite caprino (LCP)

Parâmetros Condição 1 Condição 2 Condição 3

Tempo da Corrida (min) 10 10 10

Composição da Fase Móvel (H2O/ACN) 90/10 80/20 70/30

Injection Volume (µL) 10 10 10

Fluxo (mL min-1) 0,01 0,02 0,04

4.2.9 Validação do método

A linearidade, recuperação, precisão, exatidão, limite de detecção (LD) e quantificação

(LQ), seletividade, robustez e efeito da matriz foram calculadas para validar todo o processo,

de acordo com a Comissão Europeia 2002/657/CEE e Guia de Validação da ANVISA para

quantificação de resíduos de antibióticos (BARRETO et al., 2012; CHRISTODOULOU;

SAMANIDOU, 2007; DUBREIL-CHÉNEAU et al., 2014; KARAGEORGOU;

SAMANIDOU, 2011; LOPES et al., 2011; REPIZO et al., 2012).

O método foi validado as amostras controle fortificadas com a solução e adição de

padrão interno PENG 300 μg mL-1.

4.2.9.1 Construção da curva Analítica

A curva analítica foi construída, em triplicata, relacionando a concentração de PENG

(μg mL-1) versus área do pico de PENG. As amostras LB e LCP controles foram fortificadas

(separadamente) em oito níveis de concentração sendo 0,002; 0,005; 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08

e 0,1 µg mL-1. A construção desta curva baseou-se no LMR de 0,004 μg mL-1.

O padrão interno PENG foi adicionado em concentração de 300 μg mL-1 em cada um

dos níveis de concentração descritos.

116

4.2.9.2 Linearidade

A análise da linearidade e sensibilidade foi realizada com base na regressão linear dos

dados expressos pela curva analítica.

A linearidade foi avaliada pelo coeficiente de correlação (R) da curva analítica para a

matriz leite fortificado em dez e oito níveis de calibração 0,002 – 0,1 µg mL-1 para LB e LCP,

respectivamente. Sendo obtida correlação entre as matrizes e os brancos das amostras. O critério

para aceitação o método ser linear é correlação (R) > 0,999, conforme recomendações da

Comissão Europeia 2002/657/EC.

4.2.9.3 Recuperação

O cálculo da recuperação foi realizado a partir das matrizes de leite controle fortificada.

Inicialmente 15 alíquotas de cada amostra LB e LCP foram fortificadas em três grupos de 0,002;

0,005 e 0,01 µg mL-1 obedecendo critérios da 2002/657/CEE cujos valores devem ser 0,5LMR;

1LMR e 1,5LMR. Em seguida, calculou-se a concentração presente em cada amostra. A

Equação 23 foi utilizada para cálculo para cálculo de recuperação:

%Recuperação = CM

CR

× 100 (23)

Onde CM e CR são os valores de concentração medidas e de referência do padrão,

respectivamente.

Os critérios para aceitação dos valores de concentração seguiram a CAC/GL 16. Para C

≤ 10 µg mL-1 deve ser de 50 – 120%, para C ≥ 1≤ 10 µg mL-1 deve ser de 70 – 110%, para C ≥

1≤ 100 µg mL-1 deve ser de 80 – 120% e para C ≥ 100 µg mL-1 deve ser 80 – 110%.

4.2.9.4 Precisão (Repetabilidade)

Preparou-se um grupo de amostras fortificadas com PENG de modo a obter

concentrações de 0,002; 0,005 e 0,01 µg mL-1, no qual cada nível de análise foi realizada com

seis réplicas. Foram preditas as concentrações, calculando o desvio padrão e coeficiente de

variação (%CV). Calculou-se a concentração média global para cada amostra fortificada.

O critério de aceitação da precisão é definido pela repetabilidade. Desta forma, para

LMR ≤ 10 µg mL-1 o intervalo deve ser de 60 – 120% com variação de – 50 a 20%, para LMR

117

≥ 1≤ 10 µg mL-1 deve ser de 70 – 110% com variação de – 40 a 20%, para LMR ≥ 1≤ 100 µg

mL-1 deve ser de 80 – 110% com variação de – 30% a 20% e para LMR ≥ 100 µg mL-1 deve

ser de – 20 a 10%.

4.2.9.5 Exatidão

Para avaliar a exatidão do método, os estudos de recuperação foram realizados em seis

níveis de concentração (0,001, 0,002 e 0,004, 0,01, 0,02 e 0,04 µg mL-1). A repetabilidade

(precisão intradia) foi calculada nos mesmos níveis de concentração dos estudos de

recuperação. A exatidão foi calculada usando a Equação 24 e expressa em %CV.

% Exatidão = Cpredita

CReferência

× 100 (24)

Os estudos de recuperação foram realizados em níveis de (0,002, 0,005 e 0,01 µg mL-1)

pela adição das amostras fortificadas em branco em cada nível.

4.2.9.6 Limite de detecção (LD)

O limite de detecção foi estimado utilizando o desvio padrão a partir dos dados de

regressão linear da curva analítica, segundo os critérios incluídos no guia ICH Q2(R1) da Emea

(2006). O LD foi calculado pela Equação 25.

LD =(3,3 x SD)

m (25)

Onde SD é o desvio padrão do branco que deve ser ≤ 20% para resíduos; m é a inclinação

da curva analítica. A aceitabilidade da precisão é definida por LQ < MRL (VARGAS

MAMANI; REYES REYES; RATH, 2009).

118

4.2.9.7 Limite de quantificação (LQ)

O limite de quantificação foi determinado pelo cálculo descrito pela Equação 26,

utilizando também a resposta da inclinação da curva e desvio padrão das medidas do branco.

LQ =(10 x SD)

m (26)

4.2.9.8 Seletividade

A seletividade do método foi avaliada através da análise de amostras de controle

(branco). Além disso, mostrou-se que houve precauções para garantir a resolução, e pureza dos

picos cromatográficos. Os testes apresentados na Tabela 4.7 e detecção no comprimento de

onda específico demonstrou que o pico é atribuído a um só componente.

4.2.9.9 Robustez

A avaliação da robustez foi realizada durante o estudo da otimização das condições

cromatográficas. Na análise foi avaliada se as medidas eram suscetíveis a variações nas

condições cromatográficas. As condições 1, 2 e 3 são descritas na Tabela 4.3 do item 4.1.6.3.

4.2.9.10 Efeito da matriz

O efeito da matriz foi determinado utilizando os cálculos para cada nível i da

concentração (fortificação) comparando-se amostras não-matrizadas e matrizadas (ANVISA,

2003), expresso pelo teste F da Equação 27.

Fcalc,i = SDi,1

2

SDi,22 (27)

Onde 𝑆𝑖,12 𝑒 𝑆𝑖,2

2 são as variâncias das réplicas das amostras não-matrizadas (branco) e

matrizadas (fortificadas), em cada nível de concentração, com a maior variância no numerador.

Uma vez calculados os valores de F, adotou-se um nível de significância α= 0,05 (5%)

ou nível de confiança 1 – α = 0,95 (95%).

119

As variâncias desse nível de concentração foram consideradas iguais, isto é, se a matriz

não tivesse efeito importante sobre a precisão do procedimento, nesse nível de fortificação, i

seria considerado.

Logo, se o t calculado for menor que o tcrítico α,ν, concluiu-se que a matriz não afeta o

ensaio no i nível de fortificação. Os valores para teste foram calculados seguindo a Equação 28.

tcalc,i = |x̅i,1 − x̅i,2|

√s2 (1

ni,1+

1ni,2

)

(28)

O SD dos dois grupos de análises foi agrupado e a igualdade das médias dos dois

conjuntos de amostras foi testada com a distribuição t de Student. O desvio foi definido pela

Equação 29.

s2 = (n1 − 1)s1

2 + (n2 − 1)s22

(n1 + n2 − 2) (29)

Para que ser aceito que a matriz não afete as medidas o cálculo do t-student deve mostrar

que o tcalculado< ttabelado.

120

4.2.9.11 Estratégias para validação

As Estratégias para a validação completa (KARNES; SHIU; SHAH, 1991) seguem a

recomendação de Hartmann et al (1998). Na Figura 4.5 são apresentados o esquema de

validação.

Figura 4.5-Estratégia para validação dos métodos bioanalíticos

Adaptado de Hartmann et al (1998)

O desempenho do método empregado foi verificado segundo a recuperação e precisão.

Os principais requisitos obedecidos foram: quanto à curva analítica calibração que conteve no

mínimo cinco níveis de concentração; para cálculo de recuperação e precisão foram

121

determinadas em três níveis de concentração segundo o LMR, cada nível foi analisado, em seis

réplicas de acordo com Guia de Validação (ANVISA, 2003).

4.2.10 Cálculo das Concentrações em amostras de leite comerciais

A partir da validação e cálculo dos parâmetros foi possível obter a Equação e modelo

que define o método, desta forma foi calculado a concentração de resíduos de PENG ([PENG])

nas amostras de leite pasteurizado tipo bovino (LB) e caprino (LCP). Considerando o método

e a recuperação das amostras.

O cálculo foi realizado obedecendo a Equação 30.

𝐴𝑝𝑖𝑐𝑜 = 𝑚[𝑃𝐸𝑁𝐺] + 𝑏 (30)

Onde APICO é a área do pico, m é a inclinação e b intercepto da curva analítica. Quando

calculado a concentração a Equação foi rearranjada para Equação 31 da curva analítica.

[𝑃𝐸𝑁𝐺] = 𝐴𝑝𝑖𝑐𝑜

𝑚− 𝑏 (31)

O critério para classificação foi baseado no LMR e concentração dos resíduos. Quando

a [PENG] < LMR e [PENG] = LMR ou [PENG] ≤ LMR as amostras são classificadas como

conformes. Quando [PENG] > LMR as amostras são classificadas como não conforme.

CAPÍTULO 5

RESULTADOS E DISCUSSÃO

123

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA IDENTIDADE E QUALIDADE DOS


5.1.1 Testes para identidade dos medicamentos

A proposta desta etapa é desenvolver um modelo para controle de qualidade dos

medicamentos veterinários, segundo as preconizações das Farmacopeias Brasileira (2004) e

British Pharmacopea (1983).

5.1.1.1 Condições dos testes

Para realização das medidas instrumentais foram analisadas as condições de pH,

concentração na solução e absorção da PENG em medicamentos associados a STR e DHSTR.

Na Figura 5.1 são apresentados espectros no UV das amostras contendo penicilina e

estreptomicina.

Figura 5.1-Espectros no UV de amostra contendo PENG e STR em cinco níveis de concentração

200 250 300 350 400 450 500 550 600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Ab

s

Comprimento de Onda (nm)

PENG1: 3 mg mL-1

PENG2: 2,7 mg mL-1

PENG3: 2,4 mg mL-1

PENG4: 2,1 mg mL-1

PENG5:1,8 mg mL-1

Através da comparação do espectro da amostra, no intervalo de comprimento de onda

especificado, com o espectro de referência e/ou espectro de referência padrão foi possível

identificar PENG em 200 nm e DHSTR em 290 nm, estes resultados estão condizentes com

alguns trabalhos (BOSCH OJEDA; SANCHEZ ROJAS, 2004, 2013; UPSTONE, 2000).

124

Os testes de solubilidade confirmam que os medicamentos contendo PENG são solúveis

em água, por isso a solução é preparada pela simples dissolução seguida de sonicação, a fim de

promover a protonação do sal da PENG e diminuição da formação de depósitos.

Os testes do pH das soluções indicam que grupo das penicilinas que apresentam pH

experimental entre 6 e 7, na faixa de concentração referenciado, tem influência na capacidade

de absorção na região do UV, como mostram os resultados (BEAUSSE, 2004).

Segundo Grenfell e Means (1945) a rotação específica da PENG é + 298, conferindo

um caráter dextrorotatória à substância. As absorções no IV para esses compostos são

condizentes com a norma 1272/2000/EC da União Europeia, exceto quando esses compostos

estão isolados há um erro de ± 10. Com relação ao pH nas mesmas condições a PENG isolada

condiz com a norma 1907/2000/EC, porém quando estão associadas a STR e DHSTR formando

MIXPENG o pH aumenta ocasionado pelo deslocamento do equilíbrio.

A leitura do ângulo de rotação específica, [𝛼]𝐷200

evidencia a pureza dos enantiômeros.

De maneira que, sob condições de pH 5 – 7, as penicilinas apresentam capacidade de girar o

plano de luz para a direita, por isso são dextrogiras. Logo, segundo Prankerd (2007) a estrutura

básica da Benzilpenicilina lhe confere pKa de [HA] 2,7, esse fator altera o curso do fármaco no

organismo, e influenciam na formação de resíduos.

125

5.1.2 Análise por espectroscopia no infravermelho médio.

A espectroscopia na região do infravermelho é utilizada, como teste de identificação dos

medicamentos. O espectro de infravermelho fornecem medidas dos compostos químicos, com

a exceção dos isomeros ópticos. Apesar disto, esta técnica tem sido muito aplicada e

recomendada para controle de qualidade (BRASIL, 2010; BRITISH PHARMACOPOEIA,

1983; EUROPEAN PHARMACOPOEIA COMMISSION, 2008; JP XVI, 2007).

Considerando que as medidas no IV dos medicamentos fornecem impressão digital de

todos os principais componentes do PENG, ABAM/IVERM, GEN, OTC e SMZ, os espectros

das amostras foram comparados com o espectro da substância de referência preparada,

concomitantemente, com espectro padrão. Além disso, os dados são adquiridos

simultaneamente com os de referência, reconhecidos pelas normatizações, apresentados na

Tabela 5.1.

Sabe-se que existem bancos de dados, que mostram informações espectrais, a respeito

das substâncias terapêuticas, como é o caso dos antibióticos. No entanto, não existem tais

bancos sem quaisquer erros ou enganos. Assim, foram realizadas medidas no FTIR, segundo as

preconizações das Farmacopeias legítimas, pois garantem a veracidade das medidas

Assim, os testes desenvolvidos mostram o melhor produzido para a identificação dos

compostos, se comparados bancos de dados internacionalmente disponíveis, como é caso do

SDBS organizado pelo Instituto nacional de avanços na ciência e tecnologia do Japão (AIST).

Na Figura 5.2 são apresentados os espectros da solução padronizada PENG e dos

medicamentos isolados e utilizados em associação com a PENG que são OTC, SMZ/TMP,

SDX/TMP, ABAM/IVERM, GEN e PENG/STR.

As bandas de absorção são atribuídas na região de 4000 a 667 cm-1. As regiões de maior

frequência estão entre 3333 a 2941 cm-1 e está relacionada à deformação axial de O – H

associado de água.

126

Figura 5.2-Espectros FTIR para grupos dos antibióticos das amostras e PENG padronizado

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

60

80

100

60

80

100

60

80

100

60

80

100

60

80

100

60

80

100

60

80

100

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

Número de Onda (cm-1

)

SDX/TMP

%T

GEN

PENG/STR

(I)

PENG padronizado

ABAM/IVERM

SMZ/TMP

(V)

(V)

(IV)

(III)

(II)

OTC

Na Tabela 5.1 indicam as semelhanças entre o padrão e os grupos funcionais presentes

nos medicamentos.

127

Tabela 5.1-Atribuição das bandas espectrais de absorção no FTIR para antibióticos

Medicamento Estiramento Principais Bandas de Absorção (cm-1)

Referência Espectral Experimental* WHO, 2015 e SDBR-IR

PENG

ν O-H 3010 – 2961 3370 – 2923

IR-NIDA-34211

δCH3CH2 1453 – 1382 1578 – 1384

ν S=O 1325 1334 – 1317

ν C-O 1272 1255 – 1215

δ C-H 880 – 804 761 – 750

PENG/STR

δ O-H 3310 3370 – 2923

IR2009-87820TK e IR-NIDA-

34211

ν C-H 2212 2923

ν C=O 1657 1674

δ CH3CH2 1457 – 1375 1461

ν C-O 1325 e 1270 1377

δ C-H 894 – 803 862 e 721

GEN

ν O-H 3321 3423 e 3407

IR-NIDA-61009

ν C-H 2898 bNR

ν C=O 1650 1617

δ CH3CH2 1452 – 1379 1510, 1463,1404 e 1393

ν C-O 1325 1285

ν C-O 1272 bNR

ν C-O 1090 1116

ν C-O 1044 1051

δ C-H 879 984 e 877

δ C-H 803 671

ABAM /IVERM

νO-H 3310 3463

IR2011-88378TK

νC-H 2961 – 2881 2967 e 2932

δCH3CH2 1462 – 1382 1716 e 1455

ν C-O 1323 1379

ν C-N 1245 bNR

ν C-N 1086 986 e 935

δ C-H 881 e 802 908,869,833 e 761

SDX/TMP

ν O-H 3680 – 2813 3500, 3401, 3200 e 3000

aBR033532

ν C=O 1698 – 1537 1700, 1600 e 1400

ν C-O 1243 – 1191 1200

SMZ/TMP δ O-H 3739 – 2756 3468 – 3114

IR-NIDA-63731 ν C=O 1744 – 1514 1698 – 1471

OTC

ν O-H 3091 – 2724 3700 – 2500

aBR000704

ν C=O 1705 – 1545 1600

δ CH3CH2 1487 – 1387 1400

ν C-O 1316 – 1244 1300

δ C-H 994 900

δ C-H 687 700

* Medidas Realizadas em ATR; ** Medidas Referenciadas em disco de KBR, *** Código da Referência da Base

de Dados SDBR-IR para Compostos Orgânicos, aobtido no laboratório da Bio-Rad/Sadtler IR e bNão

Referenciado.

128

Os resultados indicam semelhanças, entre padrão de referência PENG e amostras de

ABAM/IVERM, GEN e PENG As similaridades estão, principalmente, na região de 2857 a

3300cm-1, que mostra presença de O – H associado. A região entre 3030 a 2770 cm-1 é

denominada banda dos alcanos, aparece bem fina.

Quanto ao espectro PENG (padronizado) foram utilizadas, a fim de evidenciar

carbonilas de amida e os cromóforos nos antimicrobianos, à base de penicilina. Estes dados são

característicos, em regiões de 1724 a 1818 cm-1 de ν C=O que denota presença de Amidas

primárias, bem como regiões de 1538 a 1776 cm-1 que é correspondente a ν C-O refletindo a

presença de ácido carboxílico, éteres, álcoois primários de secundários. As bandas entre 1538

a 1724 cm-1 são referentes à amida e aparecem no espectro de todos os compostos, em alguns

casos, as intensidades desloca a banda, porém não altera os resultados, confirmando as

vibrações do grupo carbonila. A região entre 1613 a 1724 cm-1 é referente a estiramento da

ligação das carbonilas, ν C=O, associado a amidas secundárias que aparecem em anéis de

lactamas, a absorção está sujeita a efeitos de conjugação e sofrem deslocamentos para

frequências inferiores que alteram o valor de 1923 a 2380 cm-1, para SDX/TMP, SMZ/TMP e

OTC. As regiões entre 1388 a 1515cm-1 estão presentes em todos os compostos e são específicas

para vibrações de δ CH3CH2. As bandas de 1086 e 1244 cm-1 referentes à ν C-N que distingui aminas

alifáticas de aromáticas, respectivamente. As regiões entre 800 e 885 cm-1, de vibração da

ligação dupla de C = C fora do plano (R1 (R2) C = C) e R1CH = CHR2, indica a formação de

isômeros cis e trans, respectivamente. Em 802 cm-1 aparece uma banda atribuída a presença de

anel benzeno orto substituído, no espectro referente a ABAM/IVERM. Na região espectral entre

2755 e 3740 cm-1 de SMZ/TMP e SDX/TMP aparecem bandas que apontam a formação de

quelato, pelo estiramento δ O-H.

129

5.1.3 Quantificação de PENG por UFLC-DAD.

Esta análise foi selecionada para quantificação da PENG nos medicamentos, pois é

estabelecida com referência pelos organismos legais de controle de qualidade e apresentam

vantagens, principalmente, relacionado ao tempo, a confiabilidade, a sensibilidade, a

especificidade, ao consumo reduzido de solvente e robustez na identificação de grupos ativos

de fármacos.

5.1.3.1 Estudo das condições de análise

Para o estudo das melhores condições de identificação da PENG foram preparadas

soluções padrão e realizado a leitura dos cromatogramas em 220, 252, 257 e 264 nm para

identificar o betalactâmico como é mostrado na Figura 5.3.

Figura 5.3-Perfil cromatográfico da penicilina (PENG) referente ao padrão certificado

0 2 4 6 8 10

0

200

400

600

800

1000

1200

264 nm

257 nm

252 nm220 nm

I. P

(m

AU

)

T.R (min)

A identificação da PENG foi realizada por método isocrático descrita no cromatograma

e a solução padrão foi preparada com ausência de solução tampão. A fase móvel apresentou

melhor composição na condição 1. O fluxo foi de 0,1 mL min-1, devido o diâmetro do poro da

coluna, onde ocorre a separação ser bem reduzido de 2,0 mm. A detecção ocorreu em quatro

comprimentos de onda selecionados previamente, assim foram identificados por bandas de

130

absorção no ultravioleta e referenciados pela International Pharmacopoeia (2015b) para

análises de penicilinas e trabalho de Cámara et al (2013). Os betalactâmicos têm afinidade por

colunas de fase reversa, por isso foi utilizada uma C18.

As análises em condições planejadas o valor máximo considerado foi de 220 nm, pois

apresentavam intensidade e resolução da PENG condizentes. Sabendo que, o bom desempenho

deste método deve-se muito ao estudo preliminar das características físico-químicas e

composição das substâncias, pois parâmetros como o pH influenciam na interação dos

compostos com a fase móvel e estacionária da coluna como é descrito por Hoff et al (2012),

Luo et al (2015) e Zeng et al (2014). Logo, o estudo influenciou na escolha dos antibióticos

que mais se adequavam a separação de penicilinas em corridas de 10 min.

Neste procedimento considerou-se que os parâmetros de desempenho da coluna de

separação, tais como: número de pratos teóricos, fator de retenção, resolução e fator de simetria

refletem nas melhores condições para análise. A Figura 5.4 apresenta a correlação entre os

parâmetros de otimização do método (resolução e seletividade) para cada condição testada.

Figura 5.4-Resultados do planejamento das condições cromatográficas

1,6411,538

1,434

1,7591,863

1,968

1 2 3

0

1

2

3

CC

Pa

râm

etro

s

Condições

Resolução

Seletividade

C

Para todas as condições utilizadas o resultado de resolução do pico da PENG é aceitável.

Segundo as monografias Europeias e Americana o fator de simetria deve estar entre 0,8 e 1,5;

os números de pratos devem ser maiores que 2000 para HPLC; fator de retenção deve ser maior

que 2 (EUROPEAN COMISSION, 1993; EUROPEAN COMMISSION, 2006; LOPES et al.,

2011).

131

As melhores condições de identificação da PENG foram alcançadas, tais como: a

minimização dos efeitos de interferentes e sobreposição de picos, a minimização da adsorção

da penicilina e do padrão externo na coluna cromatográfica, por formação de picos de

simétricos comprovado pelo fator de simetria e cálculos da robustez. Estes fatores foram

descritos pelos pesquisadores Vargas Mamani, Reyes Reys e Rath (2009).

5.1.3.2 Validação do método

Segundo o Guia de Validação da Emea (2006), os procedimentos analíticos devem

descrever, detalhadamente, as etapas necessárias para executar cada teste.

Assim, os dados foram obtidos com nove níveis de concentração, sendo a faixa de

trabalho para PENG de 0,001 a 0,01 µg mL-1 são submetidos a regressão linear, o resultado é

apresentado na Figura 5.5. Estes dados oferecem resultados analíticos quando testados em

amostras externas mostram o conteúdo real de PENG presente nas amostras.

Figura 5.5-Curva analítica para quantificação de PENG em medicamentos

Os resultados são comparados ao padrão aceitável de precisão, por adição de padrão

descrito por Mantovani et al (2012) cujas condições experimentais descritas devem apresentar

curvas lineares entre 95,99 e 99,99% para PENG.

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

A.P

(m

AU

)

[PENG] (g mL-1

)

132

Na Tabela 5.2 são apresentados os resultados dos parâmetros calculados para validação

do método.

Tabela 5.2-Desempenho do método para quantificação de PENG em medicamentos veterinários

Parâmetros de Validação Resultados para PENG K+

Linearidade (R) 0,9991

LD (µg mL-1) 7,384 × 10-4

LQ (µg mL-1) 2,0941 × 10-3

Rendimento médio (%) 72,51%

Equação APico = 2059× CPENG + 93,43

Eq: Equação que representa a curva analítica: LD: limite de detecção, LQ: limite

de quantificação.

Para cada 10 µL da amostra e padrão injetado foram avaliados os erros das medidas que

foram de 10,54 a 15,14 %. Esses valores estão dentro do limite aceitável de 20 %, segundo a

VICH GL40 da Emea (1999). A resposta do detector foi registrada em toda faixa ampla do UV,

porém os cromatogramas das amostras são apresentados em 220 nm, uma vez que este valor

tem sido considerado para quantificação de PENG, em diferentes matrizes, inclusive em

métodos desenvolvidos por Babington et al(2012), Bailón-Pérez et al (2009), Rambla-Alegre

et al (2011b) e da JP XVI (2007).

A capacidade do sistema cromatográfico foi investigada, com objetivo de resolver os

picos PENG de suas principais misturas. Durante a amostragem, os compostos com diferentes

formulações de PENG, foram armazenados ao abrigo da luz, do calor e consequente oxidação,

por isso as ótimas condições dos sinais analíticos são garantidas. A especificidade demonstrou

que a OTC interferiu na resolução do pico da PENG, porém este fator não prejudica a

seletividade do método, pois as resoluções dos picos estão no intervalo de dois, como

recomendado por manual de validação do ICH (2005).

Segundo Épshtein (2004), a determinação do LQ, a partir da curva analítica, é um dos

requisitos para aceitabilidade da reprodutibilidade do método. Sendo assim, o LD e LQ refletem

na sensibilidade do método desenvolvido, pois estão condizentes com a curva analítica e

apresentam relação sinal/ruído bastante reduzido.

133

A precisão e exatidão do método foi determinada por ensaio intradia. Os resultados de

precisão são apresentados na Tabela 5.3.

Tabela 5.3-Precisão e exatidão do método para quantificação de PENG em medicamentos veterinários,

expressos pelo coeficiente de variação (%CV)

Adição padrão externo (µg mL-1) Precisão e Exatidão (n=3 × 15)

0,0010 14,48

0,0020 15,52

0,0040 14,51

0,0100 16,55

0,0200 10,35

0,0400 11,46

A especificidade do método foi determinada por observação de interferentes nos

componentes, presentes nas formulações (medição dos brancos). Os resultados dos testes têm

sido comparados com os resultados do padrão de referência. Confirmando que, os antibióticos

associados à PENG não interferem no desempenho do método.

134

Os resultados para robustez são apresentados na Tabela 5.4, variando-se as três

condições.

Tabela 5.4-Robustez do método para quantificação da PENG em medicamentos veterinários, expresso pelo

coeficiente de variação (%CV)

Adição de padrão externo (µg mL-1) Robustez (%CV)

Condição 1 Condição 2 Condição 3

0,001 14,48 14,54 14,61

0,002 15,52 15,56 15,59

0,004 14,51 14,17 14,18

0,01 16,55 16,56 16,57

0,02 10,35 10,36 10,36

0,04 11,46 11,47 11,47

Os resultados mostraram que o método é aplicável para determinar PENG, na presença

dos produtos de degradação, sendo confiável para a rotina, pois foram variadas as condições de

análises e o método apresentou-se robusto.

135

5.1.3.3 Identificação de PENG em amostras de medicamentos

As amostras de medicamentos descritas na Tabela 4.2 foram selecionadas para

identificação de PENG nos medicamentos. Os perfis cromatográficos dos grupos de

medicamentos são apresentados na Figura 5.6.

Figura 5.6-Perfil cromatográfico das amostras de medicamentos em grupos

0 2 4 6 8 10

0

1000

2000

3000

4000

Tempo de Retenção (min)

Extraído - 220nm, 4nm (1) (Branco)mAU

0 2 4 6 8 10

0

1300

2600

3900

5200

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

0

270

540

810

1080

Extraído - 220 nm, 4nm (1)

TR (min)

PENG

mAU

(A)Extraído - 220 nm, 4nm (1)

TR (min)

PENG

mAU

0 2 4 6 8 10

0

1300

2600

3900

5200

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,00,0

9,4

18,8

28,2

TR (min)

PENG

Extraído - 220 nm, 4nm (1)mAU

DHSTR

STR

(B)

TR (min)

PENG

Extraído - 220 nm, 4nm (1)mAU

0 2 4 6 8 10

0

400

800

1200

1600

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

110,4

112,8

115,2

117,6

120,0

TR (min)

PENGExtraído - 220 nm, 4 nmmAU

(C)

TR (min)

OTC

PENG

Extraído - 220 nm, 4 nmmAU

0 2 4 6 8 10

0

1200

2400

3600

4800

3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6

8,2

12,3

16,4

20,5

TR (min)

PENG

mAU

(D)

TR (min)

PENG GENT ABAM

OTC

SMZ

mAU

O estudo dos cromatogramas mostrou que resolução dos cromatogramas em todos os

níveis é alta, entre 2,33 a 9,67, cobrindo uma faixa ampla de concentração.

136

Os ensaios de adequação, para cada parâmetro foram realizados. Os espectros das

amostras foram registrados, separadamente, para confirmação dos picos, onde ocorrem as

máximas absorções no UV. A solução padrão de PENG K+ foi injetada seis vezes e as áreas dos

picos foram registradas.

A Figura 5.6B mostra o perfil do cromatograma do grupo de amostra, contendo PENG,

evidenciando as principais associações de STR e DHSTR. O tempo de retenção (TR) PENG foi

de 3,17 min.

Os picos cromatográficos da PENG apresentaram boa resolução, expondo, inicialmente,

que PENG está livre de interferência de impurezas (Figura 5.6B). A Figura 5.6.C apresenta

cromatogramas para PENG, contendo OTC, em tempos de retenção de 0,82 e 2,82 min,

respectivamente. Os picos apresentaram boa resolução para OTC, enquanto PENG tem sido

sobreposto. O mesmo ocorre com na Figura 5.6.D, porém o tempo de retenção ocorre em 4,11

min para PENG e SMZ, OTC, GEN e ABAM está em 1,29, 1,66, 5,74 e 7,74, respectivamente.

Além disso, essa ralação prova que o grupo de amostra, contendo mistura de PENG e

estreptomicinas, apresentou resolução de pico equivalente a 3,31. Assim, as estreptomicinas,

também, influenciaram na retenção de PENG 1,61 min, em comparação com padrão (Figura

5.3).

5.1.3.4 Cálculo do teor de pureza dos medicamentos

A Tabela 5.5 apresenta os resultados das análises quantitativas de PENG em

medicamentos. O método apresentou 72,51% de rendimento. A substância foi detectada

aplicando o método com LD de 7,384 × 10-4 µg mL-1.

137

Tabela 5.5-Cálculo do teor de PENG nos medicamentos analisados por cromatografia

Amostras

Concentração predita pelo método

(µg mL-1) com rendimento de

72,51%

Concentração Referência

(µg mL-1)

Pureza de PENG

predita pelo método

(%)

B35 0,00053 0,001 52,58

B33 0,00065 0,001 64,52

A9 0,01460 0,020 73,02

B34 0,00074 0,001 73,98

A8 0,00768 0,010 76,75

B13 0,00077 0,001 76,75

B16 0,00154 0,002 76,75

A10 0,01535 0,020 76,77

A12 0,03071 0,040 76,77

A6 0,00768 0,010 76,79

B26 0,01537 0,020 76,86

B29 0,03074 0,040 76,86

B30 0,03078 0,040 76,95

B18 0,00211 0,002 79,04

B14 0,00081 0,001 81,21

B17 0,00162 0,002 81,21

B22 0,00812 0,010 81,22

B25 0,01628 0,020 81,37

B28 0,03255 0,040 81,38

B36 0,00083 0,001 83,36

B32 0,00084 0,001 83,82

B37 0,00086 0,001 86,39

A2 0,00089 0,001 88,89

A5 0,00889 0,010 88,88

A7 0,00889 0,010 88,91

A11 0,03556 0,040 88,91

A4 0,00178 0,002 88,96

B20 0,00363 0,004 90,64

B21 0,00943 0,010 94,26

B23 0,00943 0,010 94,26

B19 0,00384 0,004 95,94

A1 0,00096 0,001 96,44

A3 0,00194 0,002 96,80

B15 0,00972 0,010 97,16

B24 0,00972 0,010 97,17

B31 0,00097 0,001 97,16

B27 0,01957 0,020 97,87

Os resultados mostraram que as amostras B33 e B35 apresentaram teores muito abaixo

do que o referenciado estando entre 53 – 65%. As amostras A9, B34, A8, B13, B16, A10, A12,

A6, B26, B29, B30 e B18 apresentaram pureza de 73 – 80%. As 12 amostras B14, B17, B22,

B25, B28, B36, B32, B37, A2, A5, A7, A11 e A4 apresentaram pureza de 81 – 89%. Enquanto

que dez amostras sendo B20, B21, B23, B19, A1, A3, B15, B24, B31 e B27 apresentaram teores

aceitáveis de 90 – 98%. Estes resultados indicam que apenas duas amostras não se adequam

aos critérios de aceitabilidade.

138

5.1.4 Análise de PENG em medicamentos por UV VIS NIR

5.1.4.1 Atribuição das bandas no UV VIS NIR e relevância para modelagem dos dados

As bandas foram atribuídas pela comparação dos grupos de medicamentos, à base de

PENG, das amostras puras e pretratadas. As regiões espectrais utilizadas, para construção dos

modelos, são determinantes no fornecimento da informação estrutural da PENG, por isso

considerou-se o mínimo de interferência nas soluções. Os espectros são apresentados na Figura

5.7.

Figura 5.7-Espectros da PENG certificado e das amostras comerciais de medicamentos

230 460 690 920 1150 1380 1610 1840 2070 23000.000

0.011

0.022

0.033

0.044

0.055

0.066

0.077

0.088

0.099

Amostras

PENG (padronização) 1mg mL-1

Ab

s

Comprimento de Onda (nm)

A região de 200 a 2300 nm foi selecionada, para construir os modelos finais, baseados

na aplicação da biblioteca utilizada pelos trabalhos recentes, principalmente o de Chong et al

(2009a). A região correspondente ao 2º Overtone em 1100 – 1200 nm refere-se a vibrações de

CH, CH2 CH3, = CH e ArH. Duas regiões de 1300 a 1600 nm correspondem ao 1º Overtone

referente a vibrações de O – H e N – H, enquanto que em 1650 – 1800 e 1877 a 2000 nm são

específicos para CH, CH2CH3, =CH e ArH. Por fim, em 2000 a 2300nm, mais próxima do

infravermelho médio, são observadas combinações vibracionais de O – H, N – H e C – H. Os

estudos anteriores para construção de um modelo levaram em consideração faixas produzidos

139

por estiramento das ligações N – H e O – H, nas análises dos componentes principais. Segundo

Chong et al (2009b) Essas regiões relacionadas a amostras betalactâmicos são afetadas pelo

teor de água, por este fato, os modelos são produzidos por toda região do NIR, porém as

vibrações que fornecem as melhores características para os medicamentos são as produzidas

por vibração de ligação C – H

Os tratamentos dados dos espectros foram constituídos por suavização utilizando o

alisamento de Savitsky-Golay com janela de 31 pontos, normalização, seguidos de cálculos de

primeira e segunda derivada. Na Figura 5.8 são apresentados os gráficos dos loadings

calculados para cada modelo implementado do M1 – M6.

Figura 5.8-Gráficos dos loadings para M1 – M12

Das análises é possível constatar que os cálculos derivativos realizados em M5 e M6

reduz o peso das variáveis e informações espectrais, isso não ocorre no modelo M1 onde não

são realizados tratamentos derivativos, o que significa a presença de regiões espectrais com

maiores informações.

140

Assim, as análises multivariadas foram realizadas, cuidando para que não houvesse

resultados falso-positivos, e/ou o analito fosse confundido com outros produtos. Neste aspecto,

os outliers podem ser gerados por uma amostra que seja diferente do conjunto das amostras

calibradas. O funcionamento do incorreto do instrumento promove falhas no método de

referência, erros de transcrição ou até mesmo erro do analista. Logo, este resultado pode não

ser considerado falso positivo, mas exerce influência no modelo, aumentando o erro do método.

Na Figura 5.9 são apresentados os gráficos dos loadings para modelos do M7 – M12,

onde são analisadas as variáveis que mais influenciam na modelagem quando se aplica os

tratamentos matemáticos descritos anteriormente.

Figura 5.9-Gráficos dos loadings para M13 – M24

As análises dos gráficos dos loadings mostraram que aplicação de tratamentos em

espectros dos modelos M13 –16 e M19 – M23 mostram informações nas regiões 1300 – 2280

nm.

Diante disto, recentemente, uma versão da Farmacopeia Europeia tem normatizado pela

EMEA/CHMP/CVMP/QWP/17760/2009 descrito em Emea (2012b) a quantificação das

substâncias terapêuticas, utilizando a região do NIR. Esta análise quantitativa foi revisada,

segundo o desempenho analítico do método, considerando a validação pelos cálculos de

141

precisão, linearidade, precisão, especificidade e robustez. Deste modo, o cumprimento dos

critérios tornam aceitos os procedimentos, pois podem ser comparados aos cromatográficos,

enquanto quantitativos como reporta Hartauer e Guillory (1989).

O método desenvolvido na região próximo do visível, permite a análise rápida dos

compostos, contidos nos medicamentos, e que estão envolvidos em toda cadeia do processo de

qualidade (CHONG et al., 2009a, 2009b; HARTAUER; GUILLORY, 1989; LIU; HU, 2011;

MBINZE et al., 2015; SIVAKESAVA; IRUDAYARAJ, 2002). A principal vantagem é a

eliminação dos reagentes tóxicos das medidas analíticas, pela construção de modelos preditivos

para determinação rápida da PENG.

Segundo os autores Liu e Hu (2011) a análise dos espectros da amostra, com base nos

espectros de referência, para identificar e extrair a informação espectral geram ótimos

resultados preditivos. A saber, de Chong et al (2009a) que desenvolveram e aplicaram um

modelo nessas regiões espectrais para identificação de 26 tipos de cefalosporina (grupo de

antibióticos beta lactâmicos), em medicamentos injetáveis. Desta forma, diante desses ótimos

resultados da literatura, o presente trabalho apresenta nova forma de construção do modelo para

determinação de PENG presente nos medicamentos em uma região mais ampla comparada aos

trabalhos citados. As análises mostram que são aptos para análise rápida, sobretudo a respeito

da variabilidade das amostras a base de penicilinas.

Cada medida espectral pode conter fontes de variabilidade associada às influências

externas, tais como: lotes, local e diferença nos tempos de armazenamento. Para minimizar

esses efeitos, os espectros foram coletados em dias diferentes (dia 1, dia 2 e dia 3) e obtidos

médias e desvios. Retifica-se que, a escolha das amostras, para calibração e validação externa,

seguiu a recomendação da EMEA/CVMP/961/01 da Emea (2012b), para quantificação de

PENG nessas regiões espectrais. Na Figura 5.10 são apresentados os scores obtidos pela análise

dos componentes principais.

142

Figura 5.10-Gráficos dos Scores M1 – M12

143

Figura 5.11-Gráficos dos Scores M13 – M24

144

Esses resultados são legitimados principalmente pela amostragem, pois constituiu uma

etapa onde controlou-se as condições para obtenção das medidas. A análise por PCA mostrou

que não houve agrupamento entre as amostras utilizando todos os 24 modelos.

Logo, as amostras de medicamentos são selecionadas, conforme sua concentração de

PENG rotulada e quantificada pelos métodos de referências, principalmente o UFLC-DAD.

Adicionalmente, é realizada análise comparativa com trabalhos atuais e métodos normatizados,

para que não haja anomalias.

145

5.1.4.2 Desempenho dos modelos de acordo com 17760/2009/EC e determinação das

concentrações de PENG

Neste trabalho, a Quimiometria tradicional é fundamental, pois envolve o conjunto de

dados de calibração que utiliza a técnica de validação cruzada, para avaliar a adequação do

modelo aos parâmetros

As amostras selecionadas para validação externa, que foram excluídas do processo de

modelagem, têm sido incluídas para validar os modelos ideais. É importante citar que, o erro

quadrático médio da calibração (RMSEC) e a raiz quadrada média do erro da validação cruzada

(RMSECV) são correlacionados ao número de fatores (componentes principais e/ou variáveis

latentes) e utilizadas para determinação do melhor número de variáveis para modelagem dos

dados. Como RMSEC é sempre decrescente quando se aumenta o número de fatores, ele

fornece a estimativa mais otimista do desempenho do modelo de calibração PLS, isto é, mostra

a capacidade de ajustar-se aos dados observados no conjunto de calibração. Então, além de um

conjunto externo de dados, não envolvidos no grupo de amostras calibradas, esse procedimento

é utilizado, para previsão externa, do conjunto de dados que não fazem parte desse sistema.

O desempenho do método foi averiguado pelo cálculo (RMSEP). Para desenvolver os

modelos de Regressão, contidos na Tabela 5.6, foram considerados três grupos comuns às

amostras isoladas. Os espectros de calibração colecionados, a partir da média, foram utilizados

para gerar os espectros de referência.

As atribuições das bandas espectrais, do Padrão de Referência (PENG), são

minimizadas as condições de interferências dos outros componentes. Os resultados

apresentados na Tabela 5.6 mostraram que o processamento mais adequado é constituído por:

normalização da área, correção da linha de base e por tratamentos de primeira derivada.(DE

BLEYE et al., 2012).

146

Tabela 5.6-Características dos modelos de calibração para determinação de PENG em medicamentos.

Modelos Calibração (Validação Cruzada) Validação Externa

PC R RMSEC EQ1 R RMSEP EQ2

Modelos para Amostra Puras (E)

M1 10 0,5092 0,0589 0,2593 CR + 0,0545 0,1627 0,0825 0,0806 CR + 0,0706

M2 10 0,4195 0,0622 0,1760 CR + 0,0606 0,6341 0,0525 0,3128 CR + 0,0444

M3 10 0,3138 0,0651 0,0984 CR + 0,0663 0,3846 0,0622 0,1139 CR + 0,1139

M4 10 0,2754 0,0766 0,0758 CR + 0,0777 0,2461 0,0747 0,0681 CR + 0,0834

M5 1 0,4054 0,0626 0,1643 CR + 0,0614 0,4265 0,0613 0,0776 CR + 0,0675

M6 10 0,3489 0,0642 0,1218 CR + 0,0646 0,2932 0,0623 0,0777 CR + 0,0665

M7 4 0,8494 0,0421 0,7215 CR + 0,0234 0,7967 0,0461 0,6341 CR + 0,0374

M8 6 0,9952 0,0067 0,9905 CR + 0,0007 0,9948 0,0064 0,9962 CR + 0,0005

M9 5 0,996 0,0061 0,9921 CR + 0,0006 0,9954 0,0063 1,0045 CR + 0,0008

M10 5 0,8408 0,0431 0,7069 CR + 0,0246 0,7385 0,0516 0,5918 CR + 0,0416

M11 5 0,9903 0,0094 0,9807 CR + 0,0014 0,9912 0,0098 0,9442 CR + 0,0080

M12 6 0,9975 0,0047 0,9951 CR + 0,00036 0,9963 0,0056 0,9808 CR + 0,0031

Modelos para Amostras Diluídas (E)

M13 2 0,6803 0,0084 0,4629 CR + 0,0037 0,8105 0,0094 0,4113 CR + 0,0032

M14 2 0,6342 0,0088 0,4022 CR + 0,0041 0,7324 0,0104 0,3437 CR + 0,0032

M15 6 0,6998 0,0082 0,4897 CR + 0,0035 0,6511 0,0107 0,4004 CR + 0,0041

M16 3 0,8178 0,0066 0,6689 CR + 0,0022 0,9232 0,0054 0,8289 CR + 0,0018

M17 1 0,6619 0,0086 0,4382 CR + 0,0038 0,7763 0,0098 0,3980 CR + 0,0029

M18 1 0,7205 0,0079 0,5191 CR + 0,0033 0,7987 0,0094 0,4267 CR + 0,0031

M19 1 0,6638 0,0086 0,4406 CR + 0,0038 0,8119 0,0096 0,3806 CR + 0,0039

M20 3 0,7974 0,0069 0,6358 CR + 0,0025 0,9105 0,0059 0,7676 CR + 0,0028

M21 5 0,8126 0,0066 0,6603 CR + 0,0023 0,9814 0,0029 0,8815 CR + 0,0015

M22 2 0,8034 0,0068 0,6456 CR + 0,0024 0,9119 0,0059 0,7538 CR + 0,0024

M23 1 0,7061 0,0081 0,4986 CR + 0,0034 0,8552 0,0087 0,4599 CR + 0,0034

M24 3 0,8417 0,0062 0,7083 CR + 0,0021 0,9841 0,0026 0,9316 CR + 0,0011

Os resultados da Tabela 5.6 apresentam valores baixos de RMSEP, em ambos os

modelos PCR e PLS em regiões que compreendem o UV VIS NIR (200 a 2300 nm), indicando

que os métodos têm sido adequados para quantificação de PENG.

Na Figura 5.12 são apresentadas as variações do erro entre as concentrações referência

e as medidas nas 24 amostras do conjunto de amostras puras e externas pelo método UV VIS

NIR.

147

Figura 5.12-Representação do erro médio entre os valores de referência e o método UV VIS NIR para análise

quantitativa das amostras Puras (E1 – E24)

Estes resultados mostram que as condições de processamento das amostras atribuídas

aos modelos M1, M2, M3, M3, M4, 5, M6, M7, M8, M9, M10 e M11 e M12 forneçam modelos

de previsão bem correlacionados, porém os erros nas amostras modeladas em M6, M7, M9 e

M10 estão entre 8 – 12%. Porém, as amostras E15 e E16 do modelo 7, 10 e 5 apresentaram

erros altos até 12%, mas é considerado aceitável.

Essas condições foram aceitas para melhorar o desempenho dos modelos, pois nestes

modelos foram reduzidas as interferências instrumentais. Desta forma, a variação do método

foi minimizada pelo desvio e erro médio. Como as correlações (R) dos modelos são

desenvolvidas a partir de métodos de regressão cada um dos modelos é apresentado em duas

faixas de concentração de PENG, que sugere o pretratamento das amostras

Os métodos desenvolvidos necessitaram de menor número de variáveis latentes e

componentes principais. Apesar dos erros, os modelos construídos, na região de 200 a 2300 nm

e 750 a 2300 nm para amostras puras e pretratadas. Na Figura 5.13 são apresentados a variação

do erro médio entre as concentrações das 24 do conjunto de amostras pretratadas e externas.

148

Figura 5.13-Representação do erro médio entre os valores de referência e o método UV VIS NIR para análise

quantitativa das amostras tratadas

Estes resultados mostraram que as condições de processamento das amostras atribuídas

nos modelos M13, M14, M15, M16, M17, M18, M19, M20, M21, M22, M23 e M24 forneceram

modelos de previsão bem correlacionados, uma vez que os erros entre as amostras são menores

que 9%.

Com base nos resultados de ambos os métodos apresentados tanto a calibração,

validação cruzada e validação externa importante, pois na literatura científica há relatos das

aplicações dos modelos multivariados na região (750 a 2500 nm), para controle de qualidade

das soluções injetáveis a base de gentamicinas, dos comprimidos e das cápsulas dos

medicamentos (BROAD et al., 2000; PARISOTTO et al., 2005).

Os modelos mostram que a validação externa, do conjunto composto por 24 modelos de

medicamentos injetáveis, apresentou bom desempenho. Assim, são cumpridos os critérios das

diretrizes Q2R1 da ICH (2005).

149


QUANTIFICAÇÃO DE PENG EM LEITE BOVINO E CAPRINO

Um método para quantificação de PENG foi desenvolvido, considerando os requisitos

descritos no Guia de Validação da ANVISA, CGAL/SDA e norma 2002/657/CE para resíduos

de antibióticos, a fim de estabelecer critérios para bom desempenho. O conjunto de três normas

foi utilizado para validação, pois forneceu melhores condições e informações completas para

análise dos dados. Na Tabela 5.7 são apresentadas as estratégias obtidas pela correlação entre

os principais parâmetros de validação dos procedimentos utilizados para quantificação dos

resíduos de PENG nas amostras de leite.

Tabela 5.7-Critérios utilizados para validação do método para quantificação de PENG no leite

Parâmetros ANVISA CGAL/SDA

MAPA 2002/657/CE

EMEA/VICH

Q2

CAC/GL

71-2009

Seletividade/especificidade AC AC AC AC AC

Exatidão AC AC AC AC AC

Precisão AC AC AC AC AC

LD AC AC AC AC AC

LQ AC AC AC AC AC

Linearidade AC AC NR AC AC

Robustez AC AC AC NR AC

Sensibilidade AC AC AC NR AC

Recuperação NR AC AC NR AC

Faixa de trabalho AC AC (n = 6) AC NR AC

Adição de padrão NR NR AC NR AC

LMR AC AC AC AC AC

Efeito de matriz NR AC NR NR AC

Apresenta critérios de aceitação (AC); não referenciado nos procedimentos (NR)

O método desenvolvido foi empregado para amostras de leite independente da origem

e procedência. É necessário mencionar que o LMR da PENG em leite é fixo para as normas

descritas acima.

As estratégias utilizadas para validação mostram que são considerados todas as etapas,

com exceção do efeito da matriz e recuperação, sobretudo porque não seguiram as etapas de

amostragem.

A norma CGAL/DAS do MAPA foi considerada, uma vez que se correlacionavam com

as demais em todos os parâmetros, exceto com relação ao procedimento de adição de padrão.

De igual modo a 2002/657/EC da comissão europeia, não foram analisados a linearidade e

efeito da matriz, uma vez que não havia referência nos guias.

150

Os critérios da Emea não foram relatados para robustez, sensibilidade, recuperação e

faixa de concentração, pois não são reportados os critérios de aceitação.

Quanto as referências contidas no guia para validação da Codex Alimentarius pela

norma CAC/GL 71-2009 são admitidos todos os cálculos dos parâmetros, pois apresentam

justificativas para aceitação das matrizes Alimentarius com suspeita de contaminação por

antimicrobianos.

É necessário enfatizar para construção do método de quantificação dos resíduos de

PENG considerou-se a análise do tempo de retenção, área dos picos e concentração de PENG

em amostras fortificadas.

151

5.2.1 Otimização do preparo das amostras de leite controle bovino e caprino

Esta etapa foi primordial para o bom desempenho do método. O preparo de amostra foi

eficaz, robusto e simples, além de utilizar mínimas quantidades de solventes e reagentes tóxicos,

a fim de garantir a segurança dos procedimentos.

Como as etapas visam a eliminação de interferentes, extração e concentração adequada

da PENG são apresentados na Figura 5.14 os cromatogramas referentes as amostras controle

Figura 5.14-Cromatogramas obtidos para amostra controle LB (branco) e amostra fortificada com PENG

0

300

600

900

1200

1500

1800

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

300

600

900

1200

1500

1800

mAU

Branco da amostra controle LB

T.R (min)

mAU

[PDA Multi Chromatograma (Ch2)], Ti (min) 0, Tf (min) 10.016, comprimento de onda (nm) 220

Amostra fortificada 0,002 g mL-1

com PENG

O principal objetivo da análise da extração dos componentes interferentes foi de

proporcionar a identificação e quantificação dos possíveis resíduos de PENG, em matrizes

biológicas e complexas, dentro dos limites estabelecidos pelos termos legais para PENG no

leite de 0,004 µg mL-1, uma vez que preparar amostras de origem animal, como é o caso do

leite, é uma difícil tarefa, podendo ser até exaustiva, principalmente devido as quantidades de

macromoléculas.

152

Para resolver este problema foram utilizados informações preconizadas pela

Farmacopeia Europeia, Japonesa e Brasileira, pois indicam métodos eficazes para a retirada das

macromoléculas, que influenciam na quantificação de antibióticos, utilizando HPLC como

reporta muitos pesquisadores (KHOR; TEE, 1996; MAMANI et al., 2006; VARGAS

MAMANI; REYES REYES; RATH, 2009).

Os cromatogramas referentes as amostras de leite caprino (LCP) controle e fortificada

com PENG estão apresentados na Figura 5.15.

Figura 5.15-Cromatogramas obtidos para amostra LCP controle (branco) e amostra fortificada com PENG

0

300

600

900

1200

1500

1800

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

300

600

900

1200

1500

1800

mAU

Branco da amostra controle LCP

T.R (min)


mAU

Amostra fortificada 0,002 g mL-1

com PENG

A eficiência das identificações foi justificada pelo planejamento do método de preparo

das amostras que consistiu na precipitação das proteínas totais por tratamento com tampão

Mcllvaine (adaptado) e remoção por ultrafiltração. Este último tem sido um procedimento

adequado, comparados com outros de separação, tais como: líquido-líquido, extração em fase

sólida e evaporação por solvente, pois são demorados, exigem muito trabalho repetitivo,

permitem ocasião para erros, principalmente, devido à recuperação incompleta do analito e

degradação da PENG antes que seja detectada.

153

5.2.1.1 Avaliando a recuperação do método

Uma das maiores dificuldades para extrair e isolar a PENG das amostras comerciais de

leite está associada com a presença de proteínas e lipídios (macromoléculas). Segundo

informações fornecidas pelos fabricantes, em 200 mL de leite: as proteínas totais correspondem

a 14% para amostras de leite bovino integral e 0 a 5% para amostras de leite desnatado. Em

amostras de leite integral bovino o teor de proteínas é mantido, enquanto que o teor de lipídios

varia de 0 a 5%. Para leite caprino integral os teores de lipídios variam de 9 – 13% e proteínas

de 1 – 8%.

É importante ressaltar que, as quantidades de macromoléculas dependem de inúmeros

fatores como raça, genética, alimentação do animal produtor e condições climáticas onde são

criados, como reporta alguns pesquisadores Reeves et al, 2011 e Nebot et al (2012b), por isso

o preparo das amostras de leite cru (controle) dos procedimentos apresentaram maior

complexidade e as amostras não passaram por processamento, pois as repetições das etapas

foram maiores em 3 vezes para cada amostragem.

As amostras de leite de cabra possuem propriedades diferentes com relação a fração

lipídica. Porém, o teor total de gorduras no leite em média é semelhante ao encontrado em

outras espécies de ruminantes, estes fatores tornam as dificuldades similares.

Como este trabalho tem como objetivo construir modelos válidos para determinar os

resíduos de PENG em amostras expostas a comercialização, considera-se uma média desses

valores. Logo, segundo instrução normativa nº 62 de 2011 que dispõe de regulamento técnico

para leite cru e refrigerado bovino, em 100g de leite no mínimo 3g deve ser de lipídio total e no

mínimo 2,9 g deve ser de proteína total, esses valores são específicos para leite de vaca.

Para minimizar esta dificuldade, as etapas preparativas das amostras de controle e

amostras de LB e LCP (comerciais) foram cuidadosamente planejadas. Inicialmente, foi

escolhido o método desenvolvido por Wang e Yuan-Qian (2009) para determinação de

betalactâmicos em amostras de leite por UPLC, pois foram encontrados ótimos resultados de

recuperação para PENG em amostras que apresentaram 52,2 – 68,3%; 70,1 – 81% e 76,2 –

101% em níveis de concentração de 0,1; 0,5 e 2,5 µg mL-1, respectivamente. Estes valores

expressam um grande esforço para o planejamento das condições, pois eles têm grande

influência na recuperação do analito.

154

Assim, o método original para extração e isolamento do analito, empregado pelos

pesquisadores citados acima e recomendados pelas Farmacopeias, foi modificado de forma a

escolher e incluir agentes precipitantes à solução de McIlvaine, tendo cuidado em corrigir e

manter o pH em 4, uma vez que a PENG se degrada rapidamente em condições muito ácidas e

alcalinas antes que seja identificado ou quantificada por cromatografia.

Os resultados deste método indicaram que o preparo das amostras de leite apresenta

qualidade na remoção das Proteínas Totais, uma vez que 6% da matéria proteica foi removida,

assim como os lipídios totais que ficaram na fase apolar sobrenadante, enquanto que a fase

aquosa tem sido microfiltradas em filtro com diâmetro de 13mm e poro de 0,22 µm para

remoção das impurezas que se injetadas na coluna cromatográfica diminui a vida da mesma.

Outra razão para o emprego das condições foi devido à natureza iônica das penicilinas

que tendem a ionizar-se, ficando carregadas negativamente, por causa dos baixos valores de

pKa do grupo carboxílico (COOH). As etapas de extração e isolamento foram otimizadas para

evitar a hidrólise ácida da PENG, a fim de evitar a quebra do anel betalactâmico e

consequentemente degradação do composto.

Para manter a recuperação e aceitabilidade, os métodos físicos empregados foram de

baixa rotação para centrifugação de 500 rpm a uma temperatura de -4 ºC. Para reforçar a

influência do pH Kukusamude et al (2012) estudaram o efeito do pH entre 2 – 8 usando tampão

fosfato 10 mmol L-1. Os resultados obtidos pelos pesquisadores revelaram que o pH da solução

tem forte efeito sobre a extração das penicilinas. Os pesquisadores relatam que a eficiência de

extração permaneceu constante quando variou o pH de 2 a 6, houve um aumento significativo

quando se elevou o pH a 8, resultando numa maior eficiência de extração.

155

Os resultados na Tabela 5.8 confirmam o melhor desempenho do método Mcllvaine

adaptado para boa recuperação do analito, comparado aos dos pesquisadores Jing et al (2009)

e Shi et al (2011).

Tabela 5.8-Desempenho dos métodos para quantificação de PENG em amostras de leite bovino e caprino,

expresso pela recuperação (%).

Nível de concentração (µg mL1) Método 1 Leite bovino (LB) Método 2 Leite Caprino (LCP)

0,002 89,71 ± 10,11 95,01 ± 4,256

0,005 86,28 ± 4,852 96,64 ± 2,369

0,010 99,25 ± 6,671 95,02 ± 2,936

Os resultados apresentados evidenciam a eficiência do preparo das amostras controle,

uma vez que as recuperações ≥70% são aceitáveis como indica a norma CAC/GL 16 que para

concentrações de analito ≤ 0,01 µg mL-1 a recuperação em intervalo de 50 -120% com erro de

até 20% é aceito. Os erros apresentados em cada nível de concentração também são aceitáveis

até 20%. Para o método 1 o erro é de 9,304 e para o método 2 é de 1,201. Esses valores

diferentes para cada conjunto de amostras de leite bovino e caprino deve-se ao fato deste

apresentar pouca variabilidade nos teores totais de proteínas e lipídios como mostra a Tabela

4.5 e 4.6, respectivamente.

É importante citar que para o cálculo das concentrações reais de PENG em amostras

comerciais admitiu-se a média das recuperações nos três níveis de concentração (C) de

0,5LMR; LMR e 1,5LMR, isto é, quando C < LMR, C = LMR e C ≥ LMR.

Outra vantagem deste método é eliminação de solventes e produtos químicos tóxicos,

que são perigosos, não só para o analista, mas também para o meio ambiente. Comparando- se

com o trabalho de Sen e Filazi (2014) que desenvolveram um método para a quantificação de

penicilina por adição de reagentes e solventes tóxicos, neste caso os pesquisadores usaram

tratamento ácido e extração por solvente, seguido por centrifugação. O método proposto

apresentou recuperação de 96,47 – 104,86% para cloxacilina (CLO) e 97,76 – 104,86% para

dicloxacilina (DICLO) em leite bovino.

156

Furusawa (2000) validou um método, utilizando adição de solvente (etanol), seguido

por reação com mercúrio e cloreto, obtendo a recuperações de 86 % para PENG, os

pesquisadores não indicaram o tipo de leite analisado. Desta forma, comparando este último

trabalho com o método desenvolvido para preparo de amostra, os % Recuperações do novo

método > método Furusawa, com melhores vantagens de serem mais limpos e verdes.

Assim, o método desenvolvido foi acessível, considerando o desempenho e extração do

analito de interesse. É necessário relembrar que os procedimentos adotados se basearam nas

recomendações Farmacopeias (BRASIL, 2010; USP XXVIII, 2007; 2011). Optou-se pela

utilização de uma solução tamponada, em conformidade com as condições prescritas na

Farmacopeia internacional, e dentro das expectativas apresentadas por Bildini, Ricci e Sharma

(2002) quando fazem uma revisão dos recentes avanços dos métodos comentados em 2002.

O método desenvolvido apresenta muitas vantagens, tais como: confiabilidade,

sensibilidade, especificidade, reduzido consumo de solventes , que será refletido nos resultados

de robustez na identificação de grupos, principalmente porque o composto apresenta atividades

farmacológicas conforme mencionado por Gumustas et al (2013) e Maquio Fiorentino et al

(2014), comparados ao trabalho de Sen e Filazi (2014) que desenvolveram um método para a

quantificação de penicilina no leite bovino usando HPLC-DAD e C18 em coluna de fase reversa

(250 mm × 4.6 × 3.5 µm). Apesar de ótimos resultados, o tempo de execução foi de 55 minutos,

o analito apresentou eluição entre 25 e 45 min. O pesquisador Furusawa (2000), também,

desenvolveu um método de validação, usando HPLC-DAD, com tempo de análise 40 min e

recuperação entre 86,4 e 91, 2%.

157

5.2.2 Estudo das condições cromatográficas para aplicação em amostras de leite

A vantagem deste método é a facilidade de: atingir o ponto de equilíbrio e

homogeneidade na adsorção, pois a composição da fase móvel não prejudicou a

reprodutibilidade na eluição.

O planejamento das condições em três estágios 1, 2 e 3 evidencia a resolução dos

cromatogramas no modo isocrático.

Na Figura 5.16 são apresentadas as respostas dos tempos de retenção (R.T) e área do

pico da PENG para planejamento dos procedimentos para leite bovino (LB) e de caprino (LCP).

Figura 5.16-Estudo da variação de tempo de retenção e área do pico da PENG

84

112

140

168

196

224

252

280

C1 C2 C3

3,06

3,09

3,12

3,15

3,18

3,21

3,24 T.R LB

T.R LCP

T.R

(m

in)

Condições

A.P LB

A.P LCP

A.P

(m

AU

)

A análise das respostas foi semelhante com erros médio entre amostras LB e LCP.

Quando analisadas os tempos de retenção para amostras de LB os valores estiveram entre 3,081

– 3,195 min, enquanto que amostras LCP estiveram em 3,096 – 3,186 min. Quando analisadas

as áreas dos picos houveram diferenças em 34,766% para amostras LB com erro de ± 0,0987%.

As medidas apresentaram um intervalo de confiança de 95%, aceitável.

158

Nos dados apresentados, a variação dos tempos de retenção e resolução são necessários,

pois esses têm relatado fluxos para fase móvel muito baixos, principalmente, porque o diâmetro

dos poros, da coluna ser pequeno.

Na Figura 5.17 são apresentados os resultados da resolução dos picos e seletividades

obtidos para as condições correspondentes aos métodos 1.

Os resultados são apresentados também o ajuste para as condições de leitura de amostras

controle de leite bovino (branco) fortificada.

Esses resultados de resolução forneceram uma medida quantitativa da eficiência da

coluna em identificar a PENG.

Figura 5.17-Resultados das condições para análise de PENG em amostras controle de leite bovino

0,1952 0,1949

0,1801

0,2092 0,2089

0,1934

1 2 3

0,0

0,1

0,2

0,3

CC

Pa

râm

etro

s

Condições

Resolução

Seletividade

C

A análise apresentada mostra que o método desenvolvido que apresenta melhores

vantagens consiste de: eluição por isocrático, fase móvel constituída de H2O: ACN (90:10, v/v)

e fluxo de 0,1 mL min-1 referente a condição 1, pois apresenta maior seletividade.

Com relação a seletividade dos métodos, ao mudar a polaridade da fase móvel há

variação na seletividade da separação.

159

A análise mostra que a composição da fase móvel tem grande influência na seletividade

e eficiência da eluição da PENG. Assim, a mudança das condições para ambos os métodos 1 e

2 muda os parâmetros cromatográficos. Logo, a identificação da PENG é conduzida

isotermicamente, isto é, a temperatura no forno da coluna que foi mantida em 40º C, pois a

PENG em 106 ºC – 110 ºC sofre decomposição.

Na Figura 5.18 são apresentados os resultados da resolução dos picos e seletividades

obtidos para as condições do método 2, correspondentes ao ajuste de amostras controle de leite

caprino (branco) fortificada como PENG nas mesmas condições utilizadas no método 1, com

objetivo de comparar o desempenho dos métodos.

Figura 5.18-Resultados das condições para análise de PENG em amostras controle de leite caprino

0,06770,0636

0,0587

0,07260,0771

0,0711

1 2 3

0,00

0,05

0,10

CCC

Pa

râm

etro

s

Condições

Resolução

Seletividade

A coluna de fase reversa, e composição de fase móvel utilizada e propostas, estão muito

adaptadas para quantificação de resíduos de penicilinas, no leite, conforme relata Bilandžić et

al (2011b). Apesar da polaridade moderada deste tipo de coluna, em 80% dos casos, a fase

reversa, é mais utilizada em compostos não iônicos. Essa aplicação, quase universal, permite a

análise de substâncias hidrossolúveis, iônicas, e até as lipofílicas, como reportam os

pesquisadores Rambla-alegre et al (2011b), Vera-Candioti, Olivieri e Goicoechea (2010) e

Wang e Li (2009) em seus trabalhos.

160

As análises e planejamento das condições foram realizados para simulação das

condições considerando o tempo de retenção do analito nas amostras.

A vazão das bombas foi mantida constante em 0,1 mL min-1, consequentemente a

avaliação da pressão é muito importante, pois o tempo de retenção não poderia variar entre as

análises dos parâmetros.

Na Figura 5.19 são apresentadas as medidas para controle do fluxo, vazão das bombas

através da pressão em função do tempo de retenção (min) da PENG durante as análises.

Figura 5.19-Otimização da operação das bombas em função da pressão e dos tempos de retenção da PENG

Os ajustes das condições foram necessários, uma vez que em sistemas isocrático

utilizando coluna de fase reversa os procedimentos típicos baseiam-se na adequação da

composição da fase móvel, considerando a fixação da temperatura, o ajuste do pH quando o

analito possui caráter ácido ou básico, equilíbrio do solvente e injeção de 10 µL de cada

amostra.

Análise mostra que a vazão das bombas nos dois métodos desenvolvidos mostrou-se

condizentes com as condições planejadas, uma vez que a pressão se mantinha constante a partir

de 4 min, logo foram necessários maior tempo de corrida para atingir as condições ideais.

161

5.2.3 Validação do método

5.2.3.1 Correlação entre amostras de leite bovino (LB) e caprino (LCP)

Os resultados obtidos para identificação da PENG foram possíveis, pois houve a

minimização da adsorção do analito na coluna cromatográfica, justificada pela formação de

picos simétricos e bem resolvidos em todos os níveis de concentração apresentados usando

método de 95,99 % de recuperação.

Na Figura 5.20 são apresentados os cromatogramas das amostras do leite bovino

fortificada, em níveis de 0,002 – 0,1 µg mL-1. O tempo de retenção (T.R) médio da PENG é de

4,33 com intervalo de confiança de 95 % e desvio padrão médio de ± 0,0216.

Figura 5.20-Perfil cromatográfico de PENG nas amostras controle de leite LB e LCP fortificadas

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

125

250

375

500

625

750

875

1000

1125

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

6

12

18

24

T.R(min)

mAU[PDA Multi Chromatograma (Ch2)], Ti (min) 0, Tf (min) 10.016, comprimento de onda (nm) 220

LB2

T.R(min)

Branco

LB1

LB2

LB3

LB4

LB5

LB6

LB7

LB8

LB9

LB10

mAU[PDA Multi Chromatograma (Ch2)], Ti (min) 0, Tf (min) 10.016, comprimento de onda (nm) 220

As condições cromatográficas descritas são selecionadas pelo bom desempenho do

método, pois os erros experimentais são aceitáveis, considerando a normatização CAC/GL16

da Códex Alimentarius (1993).

Quanto a análise, a linha base dos cromatogramas refere-se ao branco das amostras de

leite controle. Os erros experimentais do sinal analítico estão entre 3,0833 – 7,9692 % para leite

bovino (método 1), esses valores são aceitáveis, considerando o Regulamento 37/2010/EC da

European Commission (2009).

162

Para obtenção das medidas no gráfico da Figura 5.21, foram medidas a absorção no UV

da PENG, no intuito de identificá-las em 220 nm.

A instabilidade da PENG, a temperaturas elevadas, é o principal motivo dessas medidas

serem realizadas à temperatura constante, sendo iniciado em 25° C e atingido o equilíbrio em

40º C, pois segundo Kantiani, Farré e Barceló (2009) estas condições não alteram o desempenho

dos resultados, que exigidos pelas monografias de farmacopeias, a exemplo da JP XVI (2007).

Logo, a identificação de PENG foi possível pela comparação entre o tempo de retenção da

PENG K+ (padrão certificado) e as amostras fortificadas com esse padrão.

Na Figura 5.21 são apresentados os cromatogramas do método 2 para amostras controle

de leite LCP fortificadas em oito níveis de 0,002 – 0,1 µg mL-1.

Figura 5.21-Perfil cromatográfico de PENG cromatogramas das amostras controle de leite LB e LCP

fortificadas em níveis com seus respectivos brancos.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

280

560

840

1120

1400

1680

1960

2240

T.R (min)

Branco

LCP1

LCP2

LCP3

LCP4

LCP5

LCP6

LCP7

LCP8

mAU

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

22

44

66

88

T.R (min)

CP 2

mAU



Os erros experimentais do sinal analítico são 3,6009 – 8,3884% (método 2) para leite

caprino. Esses valores são também são aceitáveis pela CAC/GL 16. O tempo de retenção nesta

análise para PENG é de 4,81 min.

No que diz respeito aos parâmetros de validação do sinal analítico, a resolução do pico

foi garantida, principalmente, pela ausência de misturas interferentes, evidenciado pela

ausência de picos sobrepostos ao composto analisado. As interferências avaliadas, diz respeito

ao efeito em branco representado pela linha base presente nos respectivos cromatogramas.

163

Os resultados indicaram que não há diferença significativa (nível de confiança de 95%),

entre os resultados deste trabalho e os recomendados pelos métodos oficiais, pois seguem

critérios de aceitação.

A seletividade (Especificidade/Aplicabilidade) do método foi avaliada por amostras

representativas do branco (amostras matrizadas) de leite bovino e caprino, respectivamente.

Logo, a análise demonstrou minimização dos interferentes que gerasse resultado falso-positivo,

na identificação. A correlação foi obtida por brancos e amostras controle fortificadas.

Com relação aos efeitos das matrizes foram avaliados separadamente o leite bovino e

caprino. Na Figura 5.22 estão apresentadas as correlações entre esses efeitos calculados pela

concentração ([PENG]) versus a área do pico (AP) nos oito níveis de concentração.

Figura 5.22-Efeito da concentração de PENG e perfis das curvas para o método 1

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10

0

1000

2000

3000

4000

Amostra 2L Branca Fortificada

Amostra 2L Branca

Padrão PENG

Efe

ito

na

A.P

Efeito de [PENG]

O cálculo do t-student mostrou que a matriz não afeta as medidas, uma que o tcalculado foi

de 4,402 e ttabelado foi de 4,785. Logo o tcalculado< ttabelado.

As amostras em branco apresentaram correlação com a adição de padrão PENG em

todos os níveis, como indica a análise dos efeitos da área do pico versus concentração de PENG.

164

Na Figura 5.23 são apresentadas as correlações entre esse efeito calculados pela

concentração [PENG] versus a área do pico (AP) em oito níveis para o método 2.

Os valores encontrados para a área da curva para amostras fortificadas foram mais

intensos do que aqueles observados na curva do padrão PENG. Este fato é explicado pois a

matriz leite, proporciona determinada ionização, quando comparada apenas com a fase móvel.

Com base nestes dados, a recuperação foi calculada considerando-se os valores

encontrados na curva da amostra fortificada, pois representam a intensidade da substância a

analisar, avaliando o efeito de matriz, mas sem prejuízo às etapas de preparo das amostras.

Desta forma, o cálculo do t-student mostrou que não há efeito de matriz nas medidas,

uma que o tcalculado foi de 1,958. Logo o tcalculado< ttabelado.

Figura 5.23-Efeito da concentração de PENG e perfis das curvas para o método 2

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10

0

1000

2000

3000

4000

Amostra LCP Branca Fortificada

Amostra LCP Branca

Padrão PENG

Efe

ito

na

A.P

Efeito de [PENG]

Analisando comparativamente as amostras LB e LCP, tem-se que o efeito da matriz se

mostrou mais acentuado em amostras de leite bovino. Este fato é justificado pela melhor

recuperação para o método 2 (amostras LCP).

O desempenho do método para quantificação da PENG foi verificado através do estudo

de validação, conforme os critérios de descritos pela Tabela 5.7. Desta forma, o método foi

validado, de acordo com os parâmetros: precisão, linearidade, limite de quantificação e

especificidade, pois o sucesso destes depende do bom planejamento seguindo as

recomendações por normas legais (EMEA, 2006; ICH, 2005; MEDICAL, 2011; SHAH et al.,

165

2000; US FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 1996) já descritas no capítulo 3 deste

trabalho.

Nesse processo, os fatores que influenciaram foram: pH da solução para precipitação

total dos interferentes, e as condições cromatográficas. O objetivo de verificá-los foi de avaliar

possíveis alterações nos procedimentos adotados. Para comprovar a importância de pequenas

alterações do pH da solução tampão, definiu-se pH de 4 a 8, foi observado que, nesta faixa,

houve alterações dos resultados, se comparados com método já estabelecido.

Os métodos de validação propostos, neste trabalho, seguiram duas etapas: a primeira

consistiu na validação inicial, no laboratório, com a padronização de todas as soluções

envolvidas; a segunda etapa fundamenta-se na transferência e preparo das amostras, em

condições reais, e em fortificação das matrizes, que foi acelerado por uma sequência de

injeções, sendo averiguado seu desempenho pela recuperação do analito.

Desta forma, a padronização foi realizada, de modo que o método apresentasse

veracidade nos testes externos quando aplicados em ensaios interdia, porém em condições

semelhantes, para alcançar resultados comparáveis.

Sabendo que a aceitação dos critérios de validação, sendo normatizados de acordo com

CAC/GL 72-2009, descreve o grau dos dados produzidos a partir das medições, logo os

resultados aqui apresentados, provam pelos cálculos dos parâmetros, que o método é apto para

ser utilizado na quantificação de resíduos de PENG. Além disso, os critérios são aceitos, a fim

de garantir que os métodos sejam capazes de fornecer resultados robustos.

A linearidade foi determinada pela avaliação do coeficiente de regressão linear (R),

medido para PENG pela satisfação dos critérios. Os resultados seguiram a prescrição da

Decisão 2002/657/EC adotados por trabalhos recentes (BERENDSEN et al., 2013; BOHM;

STACHEL; GOWIK, 2009; CRISTOFANI et al., 2009; GAUDIN et al., 2014;

KARAGEORGOU; SAMANIDOU, 2011; LARA et al., 2006).

166

O novo método 1 para amostras de leite LB é apresentado pela Figura 5.24, os valores

são bem correlacionados para curva analítica dos modelos usados para quantificação da PENG.

Este gráfico foi construído, através da representação da área de pico, em função da

concentração da adição de padrão interno (0,002 – 0,1 µg mL-1).

Figura 5.24-Curva analítica para amostras de leite LB fortificadas para estudo da linearidade

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10

0

520

1040

1560

2080

2600

3120

3640

4160

4680

Áre

a d

o P

ico (

mA

U)

[resíduos PENG] (g mL-1)

LM

R

As concentrações foram medidas oito vezes, em cada nível (n = 8), para o leite bovino;

o LD instrumental foi calculado como 3,3 vezes o desvio padrão (DP) da área do pico (ou

proporção entre as áreas dos picos com o IS) do analito, em três réplicas da solução de menor

concentração padrão para cada composto definido pela faixa de 0,002; 0,005;0,01 µg mL-1,

dividido pelo declive da curva de calibração; o LQ foi calculado pelo quociente entre 10 × SD

e inclinação da curva analítica.

Os dados quantitativos estão abaixo dos limites legais, de LMR. Como a quantificação

requer dependência entre a resposta medida e a concentração de analito, já conhecida, a

linearidade da resposta cromatográfica foi testada com curvas usando pontos de calibração em

concentrações incluídas nos critérios de aceitação para 0,5LMR, LMR 1,50LMR.

167

O método 2 para amostras de leite LCP é apresentado na Figura 5.25, ele indica valores

bem correlacionados para curva analítica dos modelos para quantificação da PENG. A curva

analítica foi plotada, em função da concentração versus área do pico. Os resultados da regressão

linear indicaram correlação R condizente com os critérios estabelecidos pelas legislações.

Figura 5.25-Curva analítica para amostras de leite LCP fortificadas para estudo da linearidade

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10

0

520

1040

1560

2080

2600

3120

3640

4160

4680

Áre

a d

o P

ico

(m

AU

)

[Resíduos de PENG] (g mL-1)

LM

R

Este gráfico também foi construído, através da representação da área de pico, em função

da concentração da adição de padrão interno (0,002 – 0,1 µg mL-1).

Os resultados do ajuste linear para ambos os métodos 1 e 2 indicam excelente

desempenho da linearidade para leite caprino, pois a linearidade apresenta critério de

aceitabilidade, onde o coeficiente de correlação (R) deve ser ≥0,99.

O estudo da recuperação para PENG foi realizada dividindo-se a inclinação da curva

analítica, correspondente a cada matriz investigada. As recuperações absolutas foram

analisadas pela comparação, entre as amostras fortificadas.

168

Na Tabela 5.9 são apresentados os resultados comparativos dos parâmetros de validação

para amostras LB e LCP.

Tabela 5.9-Comparação do desempenho dos métodos para quantificação de PENG amostras de leite bovino e

caprino

Parâmetros Resultados da Validação

LB LCP

LD (µg mL-1) 7,246 × 10-4 8,251 × 10-4

LQ (µg mL-1) 2,196 × 10-3 2,500 × 10-3

%Recuperação 92,05 95,83

Equação APico = 40103 × CPENG + 168,7 APico = 4425 × CPENG ˗ 44,87

R 0,9975 0,9995

Os resultados correspondentes ao desempenho de ambos os métodos (LD e LQ) são

mostrados na Tabela 5.10. Nesta etapa do método, são considerados os valores de Recuperação

≥ 70%, recomendados pela Decisão 2002/657 / CE da European Comission (1993). As médias

de recuperação de PENG são expressas em três níveis 0,002, 0,005 e 0,01 µg mL-1.

169

A precisão do método é verificada por sua repetabilidade, usando injeções, em três níveis

em 15 repetições, para cada amostra, conforme resultados da Tabela 5.10.

Tabela 5.10-Comparação da precisão e exatidão do Método para quantificação de PENG em amostras de leite

bovino e caprino, expresso pelo coeficiente de variação (%CV).

CPENG (µg mL-1) Precisão do Método CV (%)

LB LCP

0,002 9,411 4,665

0,005 6,186 3,486

0,01 10,78 4,129

Os resultados foram satisfatórios a partir de dados do intra-ensaio, e as recuperações

médias para amostras de leite caprino foram maiores do que 95,83%, com coeficientes de

variação (%CV) entre 3,4861 e 4,6647; para leite bovino estes valores foram de 92,05 % com

coeficientes de variação (%CV) entre 9,41 e 10,78, os valores são aceitáveis pelos critérios

Q2R1 da Emea (2006). Essa diferença entre os parâmetros está associada ao efeito da matriz,

como já mencionado anteriormente.

170

Os picos de PENG estão em conformidade com a relação sinal/ruído > 5). Os valores

de LQ estão em concordância com o LMR (0,004 µg mL-1).

A recuperação média satisfaz os critérios de aceitação da Codex Alimentarius (1993),

e o valor LQ estava abaixo do LMR, em conformidade com a CGAL/DAS, isto é, muito inferior

à concentração da substância detectada.

Os métodos desenvolvidos são de simples execução e capazes de quantificar este

antibiótico, em concentrações inferiores às preconizadas pelo MAPA, pois o LQ é inferior ao

LMR para resíduos de PENG para métodos 1 e 2.

A seletividade foi examinada pela análise das amostras matrizadas e em branco. Além

disso, a ausência de picos sobrepostos, acima da relação sinal/ruído, com os tempos de retenção

de PENG, mostrou que o método é livre de substâncias interferentes.

A curva analítica foi ajustada pela adição do padrão, nas concentrações citadas, os

mesmos procedimentos de fortificação, para avaliar a precisão e exatidão foram mantidos, em

ambas as amostras.

Os resultados indicaram que o método é apto para quantificação dos resíduos de PENG

presentes em amostras leite (tipo bovino e caprino).

Comparando-se os resultados com a literatura científica, temos que, Han et al (2015)

consideraram o método desenvolvido como seletivo e rápido, pois foi capaz de determinar,

simultaneamente, 38 resíduos de antibióticos veterinários em leite, dentre ele a PENG,

utilizando UPLC-MS/MS. O método desenvolvido pelos pesquisadores apresentaram

recuperações entre 68 – 118% para resíduos de PENG e precisão intradia, expresso em (%CV),

inferior a 15%, o LQ entre 0,03 – 10 µg kg-1. Se o método desenvolvido for comparado aos

resultados obtidos, pelos pesquisadores, citados acima, que apresenta LQ e valores de

recuperações acima de 70%, e sabendo que a técnica utilizada foi UFLC-DAD, considera-se

que resultados, no presente trabalho, foram bem satisfatórios para aplicação em amostras reais

de leite ultrapasterizado bovino e caprino.

O bom desempenho do método é justificado, também, pelas condições ótimas do preparo

das amostras, que envolve extração dos resíduos de PENG, através de desproteinização,

utilizando tampão McIlvaine pH 4, agitação, centrifugação e limpeza da amostra. Assim foi

possível obter boa recuperação do analito. A saber, de Cámara et al (2013) que utiliza a

precipitação de proteínas totais associado a solvente ACN, centrifugação, seguido de extração

em fase sólida, obtendo níveis para recuperação de betalactâmicos entre 79% a 96%, e (%CV)

entre 0,5% e 4,9%, o LQ, estiveram na faixa de 3,4 – 8,6 µg kg-1, que são inferiores LMR

171

estabelecidos pela União Europeia para os betalactâmicos estudados no leite. Assim os

pesquisadores concluiram que os resultados descritos, tornavam o método adequado para a

análises de rotina, aplicado a amostras de leite de ovelha. Logo por comparação, os resultados

apresentados, no presente trabalho, tem sido análogos aos métodos avançados e divulgados,

recentemente. A saber, de Jank et al (2012), pesquisadores da Lanagro de Porto Alegre/RS, que

desenvolveram método de validação para quantificação dos resíduos betalactâmicos, dentre eles

PENG, em leite bovino, utilizando uma extração líquido-líquido rápido (LLE) para a preparação

de amostras, seguido por LC-MS/MS, sendo que os resultados mostraram recuperação de

54,2% para PENG e LD de 4,7 µg L-1.

A robustez do método descreve a estabilidade dos procedimentos adotados para análises

cromatográficas de PENG. A robustez foi avaliada mediante a análise do coeficiente de

variação (%CV) em cada nível de concentração de 0,002; 0,005 e 0,01 µg mL-1, cada um desses

níveis nas amostras (controle) foram analisadas em três condições cromatográficas diferentes.

Na Tabela 5.11, estão inseridos os resultados que comprovam a robustez do método.

Tabela 5.11-Avaliação comparativa da robustez do método para quantificação de resíduos de PENG em

amostras de leite bovino e caprino, expresso pelo coeficiente de variação (%CV).

Adição de Padrão Robustez do Método CV (%)

LB LCP

CPENG (µg mL-1) C1 C2 C3 C1 C2 C3

0,002 9,411 10,87 10,88 4,664 4,259 4,263

0,005 6,679 6,684 6,688 3,486 3,487 3,489

0,01 10,78 9,302 9,305 4,129 4,098 4,099

C corresponde às condições

Nestes resultados mudanças na composição da fase móvel, bem como variação do fluxo

dos solventes nas bombas e pressão do sistema como modo isocrático alterou minimamente os

valores de tempo de retenção da PENG e da área do pico.

Pode-se observar que para análises das condições 1 (C1) foram apresentadas menos

variação, pois os erros entre as medidas foram reduzidos para método 1 o erro médio foi de ±

1,187%, enquanto que para o método 2 o erro médio foi ± 0,9629. Quando analisados nas três

condições todas apresentaram erros inferiores a 20%, conferindo ao método robustez, pois os

valores são aceitáveis pelas normas CGAL/DAS.

172

A Figura 5.26 apresenta os resultados obtidos da análise de 24 amostras LB tipo integral

e desnatado quanto a presença de resíduos de PENG.

Figura 5.26-Análise de leite bovino quanto à presença de resíduos de PENG L

B1

6

LB

2

LB

1

LB

3

LB

4

LB

5

LB

6

LB

9

LB

10

LB

11

LB

12

LB

13

LB

14

LB

15

LB

17

LB

19

LB

20

LB

21

LB

22

LB

23

LB

24

LB

18

LB

7

LB

8

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

[PENG] > LMR (12%)

[PE

NG

]

g m

L-1

[PE

NG

]< L

MR

(8%

)

[PENG] LMR (79%)

Conforme (87 %) Não conforme (12 %)

Amostras LB UHT analisadas

>

Aplicando Método 1: LD de 1, 79 × 10-6 µg mL-1 para LMR de 0,004 µg mL-1

Analisando os dados do gráfico foi verificado que apenas 12,5% das amostras de leite

bovino analisadas estavam não conforme, isto é, com concentração de PENG muito acima do

tolerado pela legislação chegando à 0,0116; 0,013 e 0,014 µg mL-1, respectivamente. O erro

médio das medidas é de ±1,001%.

Estes resultados indicam que as boas práticas de uso de antimicrobianos em animais

produtores de leite estão sendo seguidas, observando o período de carência do medicamento e

descarte do leite, bem como a administração intramuscular correta das penicilinas.

173

A Figura 5.27 apresenta os resultados obtidos da análise de 24 amostras LCP tipo

integral quanto a presença de resíduos de PENG.

Figura 5.27-Análise de leite caprino quanto à presença de resíduos de PENG

CP

17

CP

18

CP

15

CP

16

CP

20

CP

2

CP

5

CP

1

CP

3

CP

4

CP

8

CP

11

CP

14

CP

7

CP

9

CP

6

CP

10

CP

19

CP

13

CP

12

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

[PE

NG

]

g m

L-1

Não Conforme (15 %)

[PENG] > LMR (15 %)

[PENG] < LMR (40 % )

[PENG] < LMR (50 %)

Amostras CP UHT analisadas

Conforme (90 %)

Aplicando Método 2: LD de 2,67 × 10-6para LMR de 0,004 µg mL-1

Analisando os dados do gráfico foi verificado que apenas 15% das amostras de leite

caprino analisadas apresentavam-se não conforme, com concentração de PENG muito acima

do tolerado pela legislação chegando à 0,0116; 0,013 e 0,014 µg mL-1, respectivamente. O erro

médio das medidas é de ± 0,2963%.

Quando comparados os resultados obtidos pelo método 1 e 2, pode-se afirmar que as

condições para boas práticas no uso de antibióticos a base de benzilpenicilina são similares,

uma vez que os erros entre os valores medidos e de referência são próximos.

174

5.3 CONSIDERAÇÕES FINAIS PARA QUALIDADE E SEGURANÇA DO LEITE

A presença de resíduos PENG, nos gêneros alimentícios, constitui um risco potencial

para a saúde humana. Atualmente, os resíduos de antibióticos são reconhecidos como um

problema ambiental, além de reduzirem a qualidade do leite e causar prejuízos econômicos para

o mercado de produção leiteira, isto é, gerando perdas importantes de renda monetária em

matérias-primas exportadas. Para resolver este problema, são desenvolvidos métodos oficiais

validados e revalidados. O desempenho dos métodos tem sido comparável ao

MET/LRM/PL/020 preconizado pelo MAPA, que trata da análise de multiresíduos de

betalactâmicos, em músculo utilizando UPLC-MS/MS.

Os procedimentos devem assegurar a execução dos testes de qualidade dos

medicamentos descritos na Instrução Normativa de n° 4, de 19 de fevereiro de 2008 que aprova

as Normas Técnicas para a Fiscalização da Produção, Controle, Comercialibzação, Modo de

Utilização de Produtos de uso veterinários destinados a diagnosticar Doenças dos Animais

(GILBERT; GARDNER; BIZEC, 2012; MAPA, 2012). Consequentemente, os métodos levam

em consideração, que formulações injetáveis para os animais produtores de alimentos expostos

ao consumo humano têm sido mais complicadas do que para humanos, principalmente, pela

tolerância no local da aplicação, pois essas injeções podem, também, impactar a saúde humana,

pela segurança alimentar. Assim, os procedimentos estabelecidos fornecem a garantia da

ausência de resíduos de PENG no leite, conforme os limites aceitáveis pelo MAPA.

Apesar da comercialização, dos produtos veterinários, ser livre segundo Art.64 requisito

III Decreto nº 5.053, de 22 de abril de 2004 (MAPA, 2012), o conhecimento da qualidade dos

medicamentos, comercialmente distribuídos, para tratamentos de infecções nos bovinos e

caprinos, é essencial, pois os veterinários no Brasil são autorizados a prescrever medicamentos,

de acordo com a necessidade dos tratamentos, mas não estão obrigados a assegurar que os

resíduos não entrem na cadeia alimentar. No caso dos tratamentos de mastites são, geralmente,

intramusculares em ovelhas leiteiras e os antibióticos concebidos são autorizados. Porém,

devido às diferenças entre espécies de bovinos e caprinos, os dados disponíveis não podem ser

utilizados com os mesmos métodos de injeção e dosagens. Mas o fato é que, há uma grande

disponibilidade de produtos alimentícios em todo comércio, de leite e laticínios, e apesar dessas

diferenças, as normas legais devem ser, obrigatoriamente, asseguradas.

O presente trabalho desenvolveu métodos sensíveis e confiáveis utilizando UFLC-DAD.

Os procedimentos apresentaram bons desempenhos, sendo adequados para aplicação na rotina

de laboratórios, que executam os métodos de validação. Logo, o processo para tratamento

175

necessitou de controle de todas as variáveis, que influenciam, potencialmente, na adsorção da

PENG na coluna cromatográfica a exemplo do pH natural do meio contendo os analitos. Desta

forma, o processo de extração foi planejado utilizando a padronização das soluções, que podiam

ser incompatíveis com as amostras reais, devido a uma diferença acentuada do pH, por isso que

várias estratégias têm sido desenvolvidas para melhor recuperação da PENG.

A quantificação dos resíduos de PENG, através do controle de qualidade do leite servido

na mesa do consumidor do estado do RN foi a principal meta deste trabalho. De maneira que,

chegaram-se à conclusão de que o UFLC-DAD associado às análises complementadas neste

trabalho é uma ferramenta poderosa para controle de qualidade dos medicamentos e do leite.

Quanto às análises dos espectros no infravermelho médio, este teste é classificado como

de identidade e qualidade. Utilizou-se leitura e interpretação dos espectros no FTIR para

verificar as principais bandas de absorção dos compostos presentes nos medicamentos. Todas

as amostras registradas isoladamente, inclusive as de interesse, apresentavam espectros padrão

experimental e valores do padrão referenciados pelo SDBS. Quanto às absorções que

representam os compostos, os resultados indicaram semelhanças entre padrão de referência

PENG e amostra de ABAM/IVERM, GEN e PENG. Os espectros PENG (padronizado) tem

sido de muita importância, como referência, para averiguação da presença do carbonilas de

amida e cromóforos nos medicamentos à base deste terapêutico. O teste de identidade tem sido

aplicado com sucesso, exceto quanto à ausência de informações da presença de isômeros.

As medidas cromatográficas foram realizadas com as amostras individuais, seguida das

amostras contendo PENG nas soluções. Os resultados para quantificação de PENG em 37 de

amostras (externas) de medicamentos, em melhores condições de robustez, apresentaram

valores condizentes com os indicados na rotulagem de cada medicamento, pois o CV era de

10,4319%, admitindo-se erro aceitável de ≤ 20% para traços, segundo preconização

CAC/GL16. Os resultados foram satisfatórios, pois os parâmetros da curva indicaram R 0,9991,

LD 7,384 × 10-4µg mL-1 e LQ 2,094 × 10-3µg mL-1. O rendimento do método foi de 72,51%.

Fazendo uma correlação entre os dados obtidos no sistema cromatográfico, em questão, e

resultados das análises espectrais multivariadas, sem dúvida, a Cromatografia líquida de alta

eficiência, apesar da redução do número de amostras é uma técnica mais aceita e estabelecida,

conhecida pelas legislações internacionais, pois emprega dados reais e experimentais, podendo

até ser estabelecida com método de referência para técnicas mais recentes. Logo, se confirma a

consolidação da HPLC para quantificação dos antimicrobianos, pois apresenta seletividade,

robustez e sensibilidade.

176

A segunda etapa deste trabalho é para validação de metodologia de identificação e

quantificação de resíduos de PENG, em leite bovino e caprino. Também foram propostas novas

metodologias de extração e preparo de amostras com redução significativa de reagentes e

solventes tóxicos, mantendo a boa recuperação do analito.

O método desenvolvido para amostras LB apresentou LD e LQ condizentes com o LMR

e a curva analítica. A aplicação do método mostrou que de 24 amostras comercias analisadas,

12% foram consideradas não conforme, pois o [PENG] > LMR.

O método desenvolvido para amostras LCP apresentou LD e LQ condizentes com o

LMR e a curva analítica. A aplicação do método mostrou que de 20 amostras comercias

analisadas 15% foram consideradas não conforme, pois o [PENG] > LMR.

Quando comparados com os resultados das mais recentes publicações (apresentados no

Capítulo 3 desta tese), este trabalho apresenta procedimentos simples, seletividade,

sensibilidade e redução, importante, no consumo de reagentes tóxicos.

A análise dos recentes programas de monitoramento no Brasil indicou que são

frequentes as preocupações das normas legais do Brasil, quanto à presença de contaminantes

em alimentos, pois são elaborados programas de controle e monitoramento de resíduos, esses

dados foram mostrados no Capítulo 3 no item 3.2.4. Assim, as aplicações das Lanagros são

inúmeras conforme a necessidade, pois esses contaminantes comprometem, em determinada

quantidade, a saúde da população brasileira. Isto pode ser comprovado pela edição especial, em

2012, na Revista Food Additives & Contaminants: Part A no volume 29, indexado no Qualis

da Capes, que tratam da importância dos laboratórios oficiais e análises realizadas nos mesmos.

Porém, observa-se que as publicações, em periódicos, indexados na capes, quanto à

presença de PENG no leite, utilizando análise por HPLC-DAD, tem sido reduzido de 1983 a

2016 (início), pois os pesquisadores filiados a instituições brasileiras não estão no rancking dos

que mais publicam trabalhos usando esta técnica, comprovados por pesquisas realizadas

presentes na Figura 3.6, considerando que o Brasil é um dos maiores de produtores produtos

veterinários, destacando-se os tratamentos à base de penicilinas na produção leiteira.

CAPÍTULO 6

CONCLUSÕES

178

6 CONCLUSÕES

As conclusões deste trabalho são mostradas em dois blocos. No item 6.1 são

apresentadas as conclusões referentes aos resultados obtidos para medicamentos à base de

benzipenicilinas e que integram a parte 1 deste trabalho. Os resultados dos modelos para

quantificação dos medicamentos veterinários, e caracterizações por métodos e técnicas que

asseguram a verificação da qualidade desses terapêuticos foram alcançados.

Diante do panorama dos programas de monitoramento dos resíduos, em alimentos pelas

normatizações legais no âmbito internacional e nacional, têm sido frequentes as preocupações

da legislação brasileira, quanto à presença de contaminantes em alimentos, pois são tomadas

medidas para elaborações de subprogramas de controle e monitoramento de resíduos, em

alimentos de origem animal. Desta forma, a segunda etapa, deste trabalho, foi realizada a

validação de metodologia para a identificação e quantificação de resíduos de PENG, em leite

bovino e caprino, no qual os resultados satisfatórios e aptos para detecção desses resíduos,

comparados com os das mais recentes publicações, pois apresentou simplicidade, redução de

reagentes tóxicos, seletividade e sensibilidade. Um exemplo é o Trabalho 8, disponível em

Apêndice IV. Assim, no item 6.2 apresentaram-se os resultados para o desenvolvimento do

método para quantificação de PENG em amostras de leite ultrapasteurizado bovino e caprino e

que integram a parte 2.

6.1 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS PARA IDENTIDADE E QUALIDADE DOS


Verificou-se a partir da coleta das amostras que os medicamentos de uso veterinário

estão disponíveis para livre comercialização, isto é, alguns medicamentos registrados pelo

MAPA não apresentam obrigatoriedade de receituário médico veterinário, conforme Decreto

nº 5.053, de 22 de abril de 2004 do MAPA.

As análises dos espectros no infravermelho médio mostraram absorções que

representavam os compostos a base de PENG e indicou semelhanças entre padrão de referência

PENG e amostra de ABAM/IVERM, GEN e PENG.

Os espectros de PENG (padronizado) tem sido de muita importância, como referência,

para averiguação da presença do carbonilas de amida e cromóforos nos medicamentos à base

deste terapêutico.

179

Foram desenvolvidos métodos para controlar a qualidade das formulações injetáveis,

quanto à identificação de princípios ativos, dentre eles a PENG presentes nas marcas dos

produtos, utilizando sistema UFLC-DAD.

Os métodos validados mostraram resultados satisfatórios. Os trabalhos contidos nos

APÊNDICES I e II comprovam aceitação deste tipo de método. As produções evidenciaram a

identificação dos principais compostos ativos, em soluções injetáveis de pesticidas (usados para

controle de neomáteos em bovinos).

Os resultados da aplicação do método mostraram que as amostras A33 e A35

apresentaram teores muito abaixo do que o referenciado estando entre 53 – 65%. As amostras

A9, B34, A8, B13, B16, A10, A12, A6, B26, B29, B30 e B18 apresentaram teores de 73 – 80%.

As amostras B14, B17, B22, B25, B28, B36, B32, B37, A2, A5, A7, A11 e A4 apresentaram

teores entre 81 – 89%. Enquanto que dez amostras nomeadas como B20, B21, B23, B19, A1,

A3, B15, B24, B31 e B27 apresentaram teores aceitáveis de 90 – 98%. Os resultados foram

obtidos através do método com rendimento de 72,51%, LD 7,384 × 10-4 µg mL-1e LQ de 2,0941

× 10-3 µg mL-1.

Integrado a esses estudos quantitativos, foram construídos modelos no UV VIS NIR. Os

modelos desenvolvidos para amostras puras foram eficientes para quantificação de PENG em

95% de confiança. O erro médio do método para determinação em amostras puras foi de ±

1,337%, enquanto que o erro para determinação em amostras tratadas foi de ± 1,035%.

Comparando-se os resultados obtidos no sistema cromatográfico e os resultados das

análises espectrais multivariadas mostram, sem dúvida, que a Cromatografia líquida de alta

eficiência, apesar da redução do número de amostras, mostrou-se mais eficiente.

6.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DE PENG EM

AMOSTRAS DE LEITE BOVINO E CAPRINO

No preparo das amostras controle, obtiveram-se ótimas valores de recuperação, ficando

superiores a 70% para amostras de leite bovino e caprino. Porém, as recuperações foram

melhores para quantificação principalmente pela reduzida variedade de leite. Além disso, os

erros dos métodos foram inferiores a 20% estando de acordo com as normas legais para análise

de resíduos de antimicrobianos.

As condições cromatográficas foram adequadas para análises das amostras de leite

bovino e caprino com tempo de corrida para cada medida em 10 min.

180

Os parâmetros calculados para validação do método 1 e método 2 foram eficientes, uma

vez que o LD e LQ foram condizentes com LMR de PENG para o leite.

A partir das análises usando o método 1 validado foi verificado que 87 % de 24 amostras

externas comerciais estavam em conformidade e 12% eram não conforme, com erro de ±

1,001%.

O método 2 indicou diferenças significativas entre as amostras. De 20 amostras de leite

caprino analisadas 90% estavam entre em conformidade com o LMR e 15% não conforme com

limite de tolerância de resíduos de PENG muito acima do permitido no leite, com erro de ±

0,2963%.

A análise comparativa mostrou que as amostras de leite bovino com maior frequência

de resíduos de PENG estão acima do tolerado pelas legislações.

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ZUMLA, A.; NAHID, P.; COLE, S. T. Advances in the development of new tuberculosis

drugs and treatment regimens. Nature reviews. Drug discovery, v. 12, n. 5, p. 388–404,

2013.

APÊNDICES

216

APÊNDICE I

PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA EM EVENTO INTERNACIONAL E REVISTA DE

CIÊNCIA ABERTA

ARTIGO 1

CABRAL, A. M. et al. The original method for identification of abamectin and ivermectin in

pharmaceutical formulations used in producing animals, using liquid chromatography coupled

to ultra efficiency photodiodes: Risk assessment of pesticide residues in dairy products.

ScienceOpen Posters, p. 1–2, 2014.DOI: 10.14293/P2199-8442.1.SOP-CHEM.PCAOVO.v1

https://www.scienceopen.com/document_file/f6c0bb25-ae42-44d1-99aa-

0e9e5bb51332/ScienceOpen/Poster_Cabral.pdf

TRABALHO 1

CABRAL, A. M. et al. Original method for identification of abamectin and ivermectin in

pharmaceutical formulations used in producing animals, using liquid chromatography coupled

to ultra efficiency photodiodes: Risk assessment of pesticide residues in dairy products. ACS

National Meeting and Exposition, v. 248, p. 258, 2014. http://acselb-529643017.us-west-

2.elb.amazonaws.com/chem/248nm/program/view.php

http://dx.doi.org/10.14293/P2199-8442.1.SOP-CHEM.PCAOVO.v1

https://www.scienceopen.com/document_file/f6c0bb25-ae42-44d1-99aa-0e9e5bb51332/ScienceOpen/Poster_Cabral.pdf

https://www.scienceopen.com/document_file/f6c0bb25-ae42-44d1-99aa-0e9e5bb51332/ScienceOpen/Poster_Cabral.pdf

http://acselb-529643017.us-west-2.elb.amazonaws.com/chem/248nm/program/view.php

http://acselb-529643017.us-west-2.elb.amazonaws.com/chem/248nm/program/view.php

217

APÊNDICE II

RESUMO EXPANDIDO EM CONGRESSO NACIONAL

TRABALHO 2

CABRAL, A. M.; DE MOURA, M. DE F. V.; DA SILVA, D. R. Uma Abordagem original

sobre aplicação da cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a arranjo fotodiodos para

identificação de oxitetraciclina em medicamentos veterinários. Congresso Brasileiro de

Quimica, v. 53, p. 3379, 2013. http://www.abq.org.br/cbq/2013/trabalhos/4/3379-16313.html

TRABALHO 3

CABRAL, A. M.; DE MOURA, M. DE F. V.; DA SILVA, D. R. Identificação de

gentamicina em medicamento veterinário utilizando cromatografia líquida de ultra eficiência

acoplada a fotodiodos. Reunião Anual da SBQ, v. 37, p. 1, 2009.

http://www.sbq.org.br/37ra/cdrom/resumos/T1364-1.pdf

TRABALHO 4

CABRAL, A. M.; DE MOURA, M. DE F. V.; DA SILVA, D. R. Identificação de

Benzilpenicilina G Benzatina em formulações injetáveis: Um diagnóstico preliminar para

análise dos resíduos β-lactâmicos em leite. Congresso Brasileiro de Quimica, v. 53, p. 3385,

2013. http://www.abq.org.br/cbq/2013/trabalhos/10/index.html

TRABALHO 5

CABRAL, A. M.; DE MOURA, M. DE F. V.; DA SILVA, D. R. IDENTIFICAÇÃO

CROMATOGRÁFICA DE OXITETRACICLINA, TRIMETOPRIM, GENTAMICINA,

SULFADOXINA E BENZILPENICILINA G BENZATINA UTILIZADOS EM BOVINOS

PRODUTORES DE LEITE. Congresso Brasileiro de Quimica, v. 54, p. 4959, 2014.

http://www.abq.org.br/cbq/2014/trabalhos/10/4959-16313.html


http://www.sbq.org.br/37ra/cdrom/resumos/T1364-1.pdf

http://www.abq.org.br/cbq/2013/trabalhos/10/index.html


218

APÊNDICE III

RESUMO EXPANDIDO EM CONGRESSO NACIONAL

TRABALHO 6

CABRAL, A. M.; DE MOURA, M. DE F. V.; DA SILVA, D. R. IDENTIFICAÇÃO DE

TETRACICLINA EM MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS A BASE DE ÁCIDO

ASCÓRBICO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE RÁPIDA EFICIÊNCIA

ACOPLADA A ARRANJO DE FOTODIODOS. Congresso Brasileiro de Quimica, v. 54, p.

5287, 2014. http://www.abq.org.br/cbq/2014/trabalhos/4/5287-16313.html

TRABALHO 7

CABRAL, A. M.; DE MOURA, M. DE F. V.; DA SILVA, D. R. COMPLEXATION OF

OXYTETRACYCLINE WHITH OF DRUGS VETERINARY : IDENTIFICATION IN GEL

ELETROFORESIS. XIX ENAAL e V Congresso Latino Americano de Analistas de

Alimentos, p. 146, 2015. http://www.abq.org.br/cbq/2014/trabalhos/4/5287-16313.html



219

APÊNDICE IV

RESUMO EXPANDIDO EM EVENTO LATINO AMERICANO

TRABALHO 8

CABRAL, A. M.; DE MOURA, M. DE F. V.; DA SILVA, D. R. PERFORMANCE METHOD

LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR DETERMINATION OF PENICILINN G RESIDUES

IN COW MILK. XIX ENAAL e V Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos,

v. 5, p. 36, 2015.

http://media.wix.com/ugd/7225cb_16d11a7f0ca7499fa5d5ad7b1f5a624e.pdf

TRABALHO 9

CABRAL, A. M.; DE MOURA, M. DE F. V.; DA SILVA, D. R. COMPLEXATION OF

OXYTETRACYCLINE WHITH OF DRUGS VETERINARY : IDENTIFICATION IN GEL

ELETROFORESIS. XIX ENAAL e V Congresso Latino Americano de Analistas de

Alimentos, p. 146, 2015.




220

APÊNDICE IV

TRABALHOS ACEITOS EM EVENTOS INTERNACIONAIS

TRABALHO 9

CABRAL, A. M. et al. Screening of Penicillin and Aminoglycoside in Therapeutic Drugs Used

in Milk - producing Animals Employing Ultrahigh Performance Liquid Chromatography Diode

Array Detector. World Congress of Food Science & Technology, v. 17, p. 4.7.6, 2014.

http://iufost2014.org/files/IUFoST-detailed-program-2014-08-01.pdf

TRABALHO 10

CABRAL, A. M. et al. New Method Development for Quality Control of Veterinay Drugs the

Basis of Sulfadoxin and Trimethoprim to Guarantee Milk Safety. World Congress of Food

Science & Technology, v. 17, p. 308, 2014. http://iufost2014.org/files/IUFoST-detailed-

program-2014-08-01.pdf




221

APÊNDICE V

ARTIGOS ACEITOS PARA PUBLICAÇÃO

Alessandra Miranda Cabral, Maria de Fátima Vitória de Moura, Djalma Ribeiro da Silva.

Trends of Analysis of Antibiotic Residues in Milk: A Review. Science Journal of Analytical

Chemistry. Special Issue: Analytical Methods for Control & Guarantee Safety Foods. Vol. X,

No. X, 2016, pp. XX-XX. doi: 10.11648/j.XXXX.2016XXXX.XX

Alessandra Miranda Cabral, Maria de Fátima Vitória de Moura, Djalma Ribeiro da Silva.

Development of Method for Quantification of Benzylpenicillin in Goat and Cow Milk by

UFLC-DAD. Science Journal of Analytical Chemistry. Vol. x, No. x, 2016, pp. x-x. doi:

10.11648/j.xxx.xxxxxxxx.xx

222

APÊNDICE VI

CORRIDAS CROMATOGRÁFICAS DOS MEDICAMENTOS UTILIZADOS PARA

CALIBRAÇÃO DOS MODELOS

CORRIDA 1: AVALIAÇÃO DA RESOLUÇÃO DO PICO PENG NA PRESENÇA DE OTC

223

APÊNDICE VI


CALIBRAÇÃO DOS MODELOS (Continuação)

CORRIDA 2. VISUALIZAÇÃO DOS TEMPOS DE RETENÇÃO DE SMZ E TMP

224

APÊNDICE VI



CORRIDA 3: VISUALIZAÇÃO DE TEMPO DE RETENÇÃO DE SDX E TMP

225

APÊNDICE VI



CORRIDA 4: VISUALIZAÇÃO D ETEMPO DE RETENÇÃO DE GEN NA PRESENÇA

DE BMX E BEN

226

APÊNDICE VI



CORRIDA 5: VISUALIZAÇÃO DO TEMPO DE RETENÇÃO DE PENG EM

MEDICAMNETO ISOLADO (MODO GRADIENTE)

227

APÊNDICE VII

CROMATOGRAMAS DOS MEDICAMENTOS UTILIZADOS PARA CALIBRAÇÃO

DOS MODELOS CONSIDERANDO AS ABSORÇÕES NO UV

CROMATOGRAMA 1: PERFIL CROMATOGRÁFICO DE ABAM/IVERM

CONSIDERANDO LMR EM LEITE (MODO ISOCRÁTICO)

228

APÊNDICE VII


DOS MODELOS CONSIDERANDO AS ABSORÇÕES NO UV

AVALIAÇÃO 1: PERFIL CROMATOGRÁFICO MIX DE PENG, SMZ, GEN E OTC COM

EM NÍVEIS DE INJEÇÃO 1uL

229

APÊNDICE VII


DOS MODELOS CONSIDERANDO AS ABSORÇÕES NO UV (Continuação)

AVALIAÇÃO 1: PERFIL CROMATOGRAFICO MIX DE PENG, SMZ, GEN E OTC COM

EM NÍVEIS DE INJEÇÃO 2 uL

230

APÊNDICE VII





231

APÊNDICE VII





232

APÊNDICE VIII

PADRONIZAÇÃO DA PENG

ESTUDO 1: PERFIL CROMATOGRÁFICO PENG CERTIFICADO (ABSORÇÃO NO UV

190, 220, 252, 257 e 264 nm)

233

APÊNDICE VIII

PADRONIZAÇÃO DA PENG

ESTUDO 2: ADIÇÃO DE PADRÃO INTERNO PENG À MATRIZ LEITE BOVINO

CONSIDERANDO ABSORÇÃO DE 220 nm

234

APÊNDICE VIII

PADRONIZAÇÃO DA PENG (continuação)

ESTUDO 3: ADIÇÃO DE PADRÃO INTERNO PENG À MATRIZ LEITE CAPRINO

CONSIDERANDO ABSORÇÃO DE 220 nm

ANEXOS

236

ANEXO I

Certificado de análise do padrão PENG K+

237

ANEXO I (continuação)

Certificado de análise do padrão PENG K+

desenvolvimento de métodos para quantificação de … · 2017-11-02 · the benzylpenicillin...

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