UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTACÂMPUS DE JABOTICABAL

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE

unesp

Ecotoxicologia dos Agrotóxicos e Saúde Ocupacional

7a. Aula - Dinâmica ambiental dos agrotóxicos:

contaminação dos componentes abiótico

Dr. Joaquim Gonçalves Machado Neto

Prof. Titular - Responsável pela Disciplina – Set/2017

7ª. AULA – ECOTOXICOLOGIA DOS AGROTÓXICOS

Dinâmica ambiental dos agrotóxicos: contaminação dos

componentes abióticos.

1 – Introdução

2 – Dinâmica ambiental dos agrotóxicos: entrada, distribuição e destino

3 - Contaminação do componentes físicos: solo e água

4 – Testes de avaliação da toxicidade aguda de agrotóxicos para minhocas

PRÁTICA: Instalação de testes de avaliação de toxicidade aguda de agrotóxicos para organismos

do solo – minhocas e microrganismos do solo.

USO DE AGROTÓXICOS

- AMBIENTAL

RISCOS - OCUPACIONAL

- ALIMENTAR

UTILIZAÇÃO DE AGROTÓXICOS

APLICAÇÃO INTENCIONAL (DIRETA)

Planta e Solo

UTILIZAÇÃO DE AGROTÓXICOS

APLICAÇÃO INTENCIONAL (DIRETA)

Uso Domissanitário

Água

FONTES DE ENTRADA DE AGROTÓXICOS NA

ATMOSFERA

A – Prática de pulverização

- Mecanismos de aplicação das gotas

- Deriva

B – Volatização das plantas e dos solos

C – Erosão eólica

D – Evaporação da água na aplicação ou dos alvos

E – Processos de formulação e manufatura (fábrica)

F – Comercialização

G – Homem (urina, fezes, etc)

FONTES DE ENTRADA DE AGROTÓXICOS NO AMBIENTE

AQUÁTICO

A – Junto com poeiras ou na chuva

B – Junto com partículas de solo erodidas

C – Diretamente da aplicação D – Efluentes industriais

E – Água de esgotos F – Carreado com animais

1- PROCESSOS DE TRANSPORTE / PERSISTÊNCIA:

A. Transporte: 1. Coeficiente de Adsorção (Kd/Koc)

2. Coeficiente de Partição (Kow) 3. Pressão de Vapor

4. Solubilidade em Água (S)

B. Persistência: 1. Biodegradação 2. Fotólise 3. Hidrólise 4. Redox 5. Coeficiente

de Adsorção (Kd/Koc) : Kd = [solo] / [água] Koc = [C. org.] / {água]

2 – TOXICIDADE:

A - Organismos aquáticos C - Organismos do solo

B - Organismos aéreos - aves D - Mamíferos

Dados necessários à avaliação da ação de produtos

químicos no ambiente

PROCESSOS DE DISSIPAÇÃO DOS AGROTÓXICOS

NO SOLO

1. FÍSICOS: Volatilização Lixiviação pela água

Erosão junto com o solo por vento e água Deriva

2. QUÍMICO: Fotodecomposição

Adsorção nos colóides do solo

Reações químicas com os constituintes

dos solos

Retirada por plantas e microrganismos

3. MICROBIOLÓGICOS: Decomposição microbiana

PROCESSOS DE DISSIPAÇÃO DE AGROTÓXICOS NO

AMBIENTE

AGROTÓXICO:

Estrutura molecular

Solubilidade em água

Polarização

Fotodecomposição

Aditivos

Grau de ionização

Lipossolubilidade

Volatilização

Formulação

Dose aplicada

FATORES ENVOLVIDOS NA DISSIPAÇÃO NO SOLO

SOLO:

Textura

Extrutura

pH

Temperatura

Composição mineral

m.o.

Umidade, etc

CLIMA:

Chuvas

Temperatura

Ventos Luminosidade

Umidade relativa do ar

HOMEM

Qualidade da aplicação

Escolha certa – produto /dosagem

Conhecimento técnico

MICRORGANISMOS NO SOLO:

Bactérias - milhões/g solo

Actinomicetos – centenas de

milhões a alguns milhões

Fungos - ± 600 mil/g solo

Protozoários - ± 10 mil/g

Algas – 1 mil a 10 mil/g

PROCESSOS MICROBIOLÓGICOS NO SOLO

DECOMPOSIÇÃO MICROBIANA

Depende da ação catalítica de

enzimas específicas produzidas

pelo microrganismos

CONDIÇÕES ÓTIMAS:

Umid. solo: 50 – 100% cc

Boa aeração do solo

Tempertura: 27 ° – 32° C

pH: 6,5 – 8,0

m.o. > teor > atividade

ALTERAÇÕES MOLECULARES

Desalquilação

Desalogenação

Hidrólise

Hidrólise do anel aromático

Beta oxidação

Redução

Herbicida Persistência no solo Decomposição

Monuron 4-12 meses

Pseudomonas

Achromobacter

Flavobacterium

2,4-D 2-8 meses

Achromobacter

Corynebacterium

Flavobacterium

Dapalon 2-4 semanas Agrobacterium

Pseudomomas

MCPA 3-12 semanas Achromobacter

Mycoplana

TCA 2-9 semanas Pseudomonas

DECOMPOSIÇÃO MICROBIANA E PERSISTÊNCIA DE

HERBICIDAS NO SOLO

Valores gerais de persistência de agrotóxicos no solo (HURTING, 1972)

Agrotóxicos Persistência no solo

Inseticida hidrocarbonetos clorados + 18 meses

Herbicidas, ureia, triazinase picloran 18 meses

Herbicidas ácido benzóico e amida 12 meses

Herbicida fenoxix, toluidinas e nitridos 6 meses

Herbicidas carbamatos e alifáticos 3 meses

Inseticidas fosfatos 3 meses

Clordane + 5 anos

DDT + 4 anos

BHC, Dieldrin + 3 anos

Heptacloro, Aldrin + 2 anos

Diazinon + 12 semanas

Disulfoton 4 semanas

Forate 2 semanas

Malation, Paration - 1 semana

Propazine, Picloran 18 meses

Simazine 12 meses

Atrazine, monuron 10 meses

Linuron 3 meses

Difluamide 10 meses

2,4-D - 1mês

C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

CARACTERÍSTICAS INICIAIS INDICATIVAS DE RISCOS E DA

NECESSIDADE DA AVALIAÇÃO DE RISCO DOS COMPOSTOS QUÍMICOS .

- Alto potencial tóxico

- Grande facilidade de dispersão

- Persistência no meio ambiente

- Tendência de bioacumulação

- Produção e lançamento em grande

volumes no ambiente

2 – TOXICIDADE:

A – Organismos aquáticos: peixe, Daphnia, organismos inferiores

B- Organismos aéreos – aves: patos, cordonizes

C- Organismos dos solo: microrganismos, minhocas

D – Mamíferos: ratos, camundongos, cães, outros

Dados necessários à avaliação da ação de produtos

químicos no ambiente

C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

TOXICOLOGIA

É o estudo dos efeitos adversos dos produtos químicos sobre

os organismos vivos mediante o exame da natureza desses efeitos e

a determinação da probabilidade de sua ocorrência.

AREAS DA TOXICOLOGIA

- DESCRITIVA

- MECANÍSTICA

- REGULAMENTADORA

C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

TOXICOLOGIA DESCRITIVA – (Testes agudos/crônicos)

Trata diretamente dos testes de toxicologia, nos quais se

designam organismos experimentais para gerar informações que

possam ser utilizadas na avaliação de riscos, aos quais os seres

humanos e outras espécies de organismos ficariam expostos em um

meio ambiente com determinado produto .

TOXICOLOGIA MECANÍSTICA – (MECANISMO DE AÇÃO)

Busca elucidar os mecanismos pelos quais os produtos

químicos exercem seus efeitos tóxicos sobre os organismos. Os

resultados de seus estudos auxiliam a desenvolver testes com

prognósticos mais úteis na obtenção de informações para

determinar riscos.

C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

TOXICOLOGIA REGULAMENTADORA – (Registro )

É responsável pelas decisões sobre um produto químico, se

ele oferece ou não riscos ao ser comercializado dentro de fins espe-

cíficos, com base em dados obtidos em testes realizados pela

toxicologia descritiva.

Praticada por agências regulamentadoras nacionais e internacionais.

Remédios, cosméticos, aditivos em alimentos, agrotóxicos, etc.

Normas sobre o total permitido no ambiente, nas águas, no solo.

C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS AGRONÔMICAS TOXICOLÓGICAS

E ECOTOXICOLÓGICAS DOS COMPOSTOS QUÍMICOS E SEUS EFEITOS

REGISTRO DE AGROTÓXICOS NO BRASIL –

MODELO TRIPARTITE

MAPA

Avaliação da

eficiência

Agronômica IBAMA

Avaliação da

Ecotoxicidade - PPA

ANVISA

Avaliação da

Toxicidade

REGISTRO

SISTEMA DO IBAMA PARA A CLASSIFICAÇÃO DOS AGROTÓXICOS PELO PPA

Tabela IBAMA

PPA - IBAMA

• Termo “Ecotoxicologia” – criado em 1969 pelo Dr. Rene Truhaut;

• Ecotoxicologia: estudo dos efeitos adversos de substâncias

químicas com o objetivo de proteger espécies naturais e

populações (TRUHAUT, 1977).

• Ensaios ecotoxicológicos: São testes que utilizam

diferentes tipos de organismos vivos representativos do ambiente

para analisar os efeitos que substâncias podem ter sobre eles.

(RUBINGER, 2009).

ECOTOXICOLOGIA

Parte da toxicologia que estuda os efeitos adversos de

produtos químicos selecionados sobre a TOTALIDADE DO

ECOSSISTEMA, mediante a determinação dos riscos que os

produtos representam, tanto para a saúde humana quanto para

outros organismos.

C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS, também chamados

de BIOENSAIOS, são realizados para detectar a

toxicidade de efluentes, determinar o grau, ou o efeito

biológico, de novos produtos químicos (Ex.: Agrotóxicos,

farmacêuticos, etc.), a cada dia mais lançados no meio

ambiente, que podem causar nos indivíduos, nas comunidades

e populações, para se evitar as crises epidemiológicas e afins.

ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS: São realizados por métodos de

comparação entre uma substância "genérica" já conhecida e a nova

substância desconhecida, para identificar os efeitos que as mesmas

causam quando inseridas no meio de cultura de células vivas.

Na atualidade, substâncias químicas desconhecidas são produzidas

de forma intencional ou como subprodutos de determinadas atividades

produtivas e necessitam de análise.

OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.

Agudos: São "estudos experimentais feitos com

organismos-teste que determinam se um efeito adverso

observado ocorre em um CURTO PERÍODO DE TEMPO

(em geral até 14 dias) após administração de UMA ÚNICA

DOSE da substância testada ou após múltiplas dosagem

ADMINISTRADAS EM ATÉ 24 HORAS“

OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.

Crônicos São "os estudos em que os organismos-teste

sofrem EXPOSIÇÕES MÚLTIPLAS A DOSES

SUBLETAIS e são expostos observados durante uma

GRANDE PARTE DO TEMPO DE VIDA, e os EFEITOS

CRÔNICOS PERSISTEM POR UM LONGO PERÍODO DE

TEMPO, e podem ser evidentes imediatamente após a

exposição ou não“ .

RESOLUÇÃO Nº 420, DE 28 DE DEZEMBRO DE 2009

Dispõe sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo quanto à

presença de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento

ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de

atividades antrópicas.

PORTARIA Nº 84, de 1996 – IBAMA

PPA - 1- PROCESSOS DE TRANSPORTE / PERSISTÊNCIA

2 – TOXICIDADE: C- Organismos dos solo: microrganismos, minhocas

Tabela Classes Ensaios

Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA

Art. 3. A classificação quanto ao Potencial de Periculosidade Ambiental (PPA)

baseia-se nos parâmetros biocumulação, persistência, transporte, toxicidade

a diversos organismos, POTENCIAL MUTAGÊNICO, TERATOGÊNICO, CARCI-

NOGÊNICO, obedecendo a seguinte graduação:

Classe I – Produto altamente perigoso

Classe II – Produto Muito perigoso

Classe III – Produto Perigoso

Classe IV – Produto Pouco Perigoso

ANEXO IV

PARTE C – CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS

PARTE D – TOXICIDADE PARA ORGANISMOS NÃO-ALVO

PARTE E – COMPORTAMENTO NO SOLO

PARTE F – TOXICIDADE PARA ANIMAIS SUPERIORES

PARTE G – POTENCIAL GENOTÓXICO, EMBRIOFETOTÓXICO E

CARCINOGÊNICO

Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA.

Art. 4. Para efeito de classificação quanto ao PPA de agrotóxicos, seus

componentes e afins o interessado deverá apresentar a documentação

completa conforme estabelecida nos anexos I, III, IV, V e X.

D.1 – Microorganismos.

D.2 – Algas.

D.3 – Organismos do solo (minhocas)

D.4 – Abelhas.

D.5 – Microcrustáceos. D.5.1 – Agudo. D.5.2 – Crônico

D.6 -- Peixes. D.6.1 – Agudo. D.6.2 – Crônico.

D.7 – Bioconcentração em peixes.

D.8 – Aves. D.8.1 – Dose única.

D.8.2 – Dieta. D.8.3 – Reprodução.

IBAMA (1987) - PARTE D – TOXICIDADE PARA

ORGANISMOS NÃO-ALVO

IMPORTÂNCIA DAS MINHOCAS PARA O SOLO E VEGETAIS

RESTOS ORGÂNICOS NO SOLO

(ANIMAIS E VEGETAIS)

Nutrientes

Microrg.

úteis

Penetração de

ar no solo

Penetração e

retenção de

água no solo

VEGETAIS

GALERIAS FEZES CADAVER DECOMPOSTO

FATORES LIMITANTES DO

CRESCIMENTO DAS MINHOCAS

- Umidade

- Matéria Orgânica em decomposição

POPULAÇÃO DE MINHOCAS NOS SOLOS

DE BOA PASTAGEM (MEINICKE, 1993)

- ADULTAS – 800/m2 , Peso = 400 g/m2

- JOVENS – 20.000/m2 , Peso = 26 g/m2

TESTE PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE

AGROTÓXICOS PARA MINHOCAS

1. TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO

(OECD – Protocolo nº 207)

2 - TESTE DO SOLO ARTIFICIAL (OECD – Protocolo nº 207)

3. TESTE DO ARTISOL: OECD – Protocolo nº 207 e IBAMA, 1987.

4. NORMA ABNT NBR 15.537:2014 – Ecotoxicologia terrestre —

Toxicidade aguda — Método de ensaio com minhocas

(Lumbricidae).

Solo Artificial Tropical –SAT - solo composto de areia industrial

peneirada, caulim e pó da fibra de casca de coco peneirada.

5. ENSAIOS DE CAMPO

2 - TESTE DO SOLO ARTIFICIAL (OECD - Prot. nº 207)

SUBSTRATO TESTE: Substrato básico (10% de turfa (pH 6,0), finamente moída; 20%

de caolinita; 69% de areia de quartzo industrial, com + de 50% de part. de 0,05 - 0,2

mm ; e 1% CaCO3 pulverizado

UMIDADE: Água deionizada (25 - 42% peso. sub. básico).

CONDIÇÕES - Sala Climatizada (20 2°C), CLARO.

ANIMAIS – Adulto e com Clitélo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo.

Aclimatados por 24 h no substrato básico.

TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente

AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição.

SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.

RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)

VANTAGEM – Resultados são usados para se estabelecer as dosagens no teste de

avaliação de toxicidade crônica

3. TESTE DO ARTISOL OECD – Protocolo nº 207 e IBAMA, 1987.

SUBSTRATO TESTE: ARTISOL

- 1.425 g bolas de vidro (1,5 - 2,0 cm )

- 90 g sílica gel, em pó impalpável

- 215 mL água deionizada, com as concentrações do agrotóxico

TESTE PRELIMINAR: Faixa que causa 0 - 100% mortalidade

AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição

RESULTADOS: % Mortalidade: CL50 (mg/kg de sílica)

SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida

4. ORGANISMOS DO SOLO - OECD – Protocolo nº 207

IBAMA, 1987 – D. 5 - D.3.1. Toxicidade Aguda para Minhocas - Eisenia foetida)

FUNDAMENTO: Exposição de minhocas adultas por 14 dias, em substrato ARTISOL

SUBSTRATO ARTISOL: 1.425 g de bolas de vidro com 1 - 1,5 cm ; 90 g de sílica amorfa

- sílica gel em pó, impalpável; 215 ml de água destilada com a concentração da

substância dissolvida.

Misturar tudo em um cristalizador de vidro.

Colocar 10 Animais adultos, com clitélo, manter por 14 dias em sala climatizada, 20

2°C, ESCURO.

AVALIAÇÃO: CL(I)50, 14 dias – Conc. Letal Inicial Média.

CONTROLE DE QUALIDADE:

a. < 10% de Mortalidade na testemunha

b. CL(I)50, 14 dias para a CLOROACETAMIDA deve estar

entre: 35 a 160 mg/kg de sílica.

D.3.1. Toxicidade Aguda para Minhocas - Eisenia foetida

ABNT NBR 15537: 2014

ABNT NBR 15537: 2014

ABNT NBR 15537: 2014

ENSAIOS DE SENSIBILIDADE Eisenia foetida (cloroacetamida) - em substrato areia

1 2 3 4 5

CL50 10,24 10,03 10,57 10,47 8,43

Lim Sup 11,7 11,7 11,7 11,7 11,7

Lim Inf 8,2 8,2 8,2 8,2 8,2

Média 9,95 9,95 9,95 9,95 9,95

Ensaiosmg/kg

Areia

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

10,5

11,0

11,5

12,0

1 2 3 4 5

Cloroacetamida

CL(I)50 = 110,06 mg/kg

Controle de Qualidade

IBAMA (Sílica)

35 < CL(I)50 < 160 mg/kg

ICHINOSE, 1992)

CL (I) 50 (mg/kg)Intervalo de confiança

(mg/kg)

110,06 95,48 - 126,95

RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E

RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL

Ensaio com

SUBSTANCIA DE

REFERÊNCIA

para avaliar as

condições de

SANIDADE E

SENSIBILIDADE

do organismo-

teste.

ABNT NBR 15537: 2014

ABNT NBR 15537: 2014

TESTE PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE

AGROTÓXICOS PARA MINHOCAS

TESTE COM SUBSTRATOS DIVERSOS

AREIA

SOLOS COM DIFERENTES

TEXTURAS

Benomil

Substrato CL (I) 50 Int. Confiança

Artisol 8,06 c 4,60 – 14,57

Areia 0,58 d 0,31 – 1,21

Latossolo Ver. Escuro 13,06 b 9,26 – 18,54

Latossolo Roxo 10,82 bc 6,42 – 18,67

Litossol 45,40 a 26,73 – 78,77

ICHINOSE, 1992)

Parathion methyl

Substrato CL (I) 50 Int. Confiança

Artisol 73,61 b 52,15 – 109,65

Areia 8,81 d 7,10 – 10,94

Latossolo Ver. Escuro 86,69 b 64,14 – 117,79

Latossolo Roxo 53,59 c 40,54 -- 86,51

Litossol 191,73 a 132,25 – 269,73

ICHINOSE, 1992)

Substrato CL (I) 50 Int. Confiança

Artisol 929,47 b 779,57 – 1.108,88

Areia 207,44 d 157,06 – 274,11

Latossolo Ver. Escuro 783,43 c 658,12 – 934,54

Latossolo Roxo 752,65 c 631,27 – 899,35

Litossol 1.458,80 a 1.316,01 – 1.618,26

ICHINOSE, 1992)

ICHINOSE, 1992)

AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE

AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992)

TOXICIDADE AGUDA

CL50

Con. Ambiental Estimada

CAE

RELAÇÃO

CL50 : CAE

CL50< 10 x CAE

10 x CAE < CL50< 100 x CAE

CL50 > 100 x CAE

80 < 10 x 10

Testes subletais

Testes de campo

10 x 10 < 500 < 100 x 10

Estudos de efeitos

sobre o peso, etc

2.000 > 100 x 10

Provavelmente

baixo Risco

ABNT NBR lS8 17512-1 :2011

TESTES DE TOXICIDADE CRÔNICA

SOLO: ARTIFICIAL / ARTISOL / CAMPO

CONCENTRAÇÕES SUBLETAIS

Avaliação de efeitos sobre

Crescimento (peso)

Reprodução - produção de jovens

- produção de casulos

Comportamento

Fisiologia, Morfologia

TESTES DE CAMPO

1. AMOSTRAGEM DE SOLO DA CAMADA SUPERFICIAL

Avaliação da população através da Coleta de amostras de solo com volumes de 60 x

60 x 15 cm, por exemplo, e coletar todas as minhocas.

2. USO DE FORMOL / FORMALINA

50 ml de formol / formalina (40%) em 9 L de água.

Marcar áreas de 0,25 a 1,0 m2 e distribuir uniformemente.

Coletar, identificar, classificar e contar os animais que saltarem do solo.

PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos para

minhocas

1 - Pesar 1 kg de substrato: Areia / Solo Argiloso / Solo orgânico em sacos plásticos.

2 - Colocar caldas com agrotóxicos, volume suficiente para manter 80% de

umidade areia e solo orgânico - solo argiloso - * tratamentos

3 - Misturar a calda com o substrato dentro do saco plástico

4 - Colocar 10 minhocas, previamente pesadas, na superfície do substrato

5 - Fechar a “Boca” do saco plástico com arame plastificado

6 - Furar a parte de cima do saco plástico com estilete, para trocas de ar.

Tratamentos

METHYL PARATHION (Folisuper®)AREIA

1 – TESTEMUNHA2 – 6 mg/kg substrato3 – 12 mg/kg substrato4 – 18 mg/kg substrato5 – 24 mg/kg substrato

Tratamentos

METHYL PARATHION (Folisuper®)ARGILOSO6- TESTEMUNHA7 – 60 mg/kg substrato8 – 120 mg/kg substrato9 – 180 mg/kg substrato10 – 240 mg/kg substrato

Tratamentos

METHYL PARATHION (Folisuper®)SOLO ORGÂNICO10- TESTEMUNHA11 – 60 mg/kg substrato12 - 80 mg/kg substrato13 – 160 mg/kg substrato14 – 240 mg/kg substrato15 – 320 mg/kg substrato

PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos

para minhocas

AVALIAÇÃO - 14 DIAS DE EXPOSÇÃO

1 - Abrir os sacos plásticos e despejar o substrato sobre uma folha de

jornal

2 - Procurar e separar as minhocas vivas – contar

3 - Pesar as minhocas vivas encontradas em cada saco plástico.

4 - Calcular a CL(I)50 e a redução no peso médio dos animais.