cmi 003 - análise de coliformes

5/16/2018 CMI 003 - An lise de Coliformes - slidepdf.com

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PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO PADRÃO - POP

TÍTULO: ANÁLISE DE COLIFORMES TOTAIS ETERMOTOLERANTES POR MEMBRANA FILTRANTE

CONTROLE

MICROBIOLÓGICO

P.O.P. N°.: CMI – 003

DATA: 15/10/10

PÁG.: 1/7

ELABORADO:

Stelamaris B. RibeiroControle Microbiológico

REVISADO:

Patricia C. BeneliControle Microbiológico

APROVADO CHEFIA:

Antonio C. A. Canabarro

Reginaldo Schiavi

SUBSTITUI A:

NOVO

1. OBJETIVO

Definir um procedimento para a análise de coliformes totais e termotolerantes pela técnica demembrana filtrante.

2. ALCANCE

Este procedimento se aplica a análise de coliformes pelo Laboratório de Controle de QualidadeMicrobiológico.

3. POLÍTICA

É política da empresa cumprir com as Boas Práticas de Laboratório.

4. RESPONSABILIDADES

É responsabilidade da Chefia de departamento e da Chefia de setor orientar seus funcionários para acorreta execução deste procedimento.É responsabilidade dos funcionários do Controle de Qualidade Microbiológica cumprirem com oestabelecido neste procedimento.É responsabilidade de quem o elabora e de quem o revisa atualizar e manter vigente esteprocedimento.

5. DEFINIÇÕES

Coliformes totais: bacilos Gram - negativos, oxidase negativos, capazes de crescer na presença de

sais biliares ou agentes tensoativos (como lauril sulfato de sódio) e de fermentar a lactose a 35-37°C,com produção de gás e aldeído, em 24 horas. A maior parte das bactérias do grupo coliformepertencem aos gêneros Escherichia, Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Podem ocorrer no meioambiente, fezes humanas, em águas com alta concentração de matéria orgânica, solo ou vegetação emdecomposição.

Coliformes termotolerantes( ou fecais): microorganismos capazes de fermentar a lactose a 44-45°Csendo representados principalmente pela Escherichia coli (fecal), e algumas bactérias dos gênerosKlebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Somente Escherichia coli dentre estes microorganismos é deorigem exclusivamente fecal, estando presente em densidades elevadas nas fezes humanas,





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APROVADO CHEFIA:


Reginaldo Schiavi

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mamíferos e pássaros, sendo raramente encontrada na água ou no solo que não tenham recebidocontaminação fecal. Os demais, podem estar presentes com alto teor de matéria orgânica (efluentesindustriais), ou em material vegetal ou solo em decomposição.

6. MATERIAL E EQUIPAMENTO

- alça plástica estéril (loop)- bandejas de plástico ou aço inox- béquer 50mL, 100mL- bico de Bunsen ou similar- bolsas plásticas para coleta das amostras 120 mL- bomba à vácuo- caixa para esterilização de ponteiras- cilindros inox para esterilização de placas de Petri- equipamento ou sistema de filtração- estantes de inox para tubos de ensaio- estantes revestidas de PCV para bolsa plástica de coleta- estojo inox para esterilização de pipetas- frascos para água de lavagem 100mL, 250mL, 300mL, 500mL, 1000mL- frascos para coleta das amostras de 250mL- hastes de madeira esterilizadas- incubadora bacteriológica ( 35°C ± 2°C)- micropipetador 100 a 1000µL- microscópio estereoscópico binocular, com iluminação fluorescente- papel alumínio- pinças de aço inox com extremidades arredondadas- pipetas graduadas de 1mL, 5mL- placas de Petri 60 x 15 mm- placas de Petri descartáveis 60 x 15 mm

- ponteiras universais 100 a 1000µL- provetas graduadas de 100mL, 250mL- membranas filtrante estéreis, brancas, quadriculadas, com 47 mm de diâmetro e porosidade 0,45µm(para a determinação de coliformes totais)

6.1. Reagentes- água destilada estéril, confrome CMI-005- água fosfatada uso esterilizada, conforme CMI 005- álcool etílico 95%





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- álcool etílico a 70%- caldo EC Medium preparado conforme CMI 001- caldo lactose ou caldo lauril sulfato com púrpura de bromocresol , concentração simples, conformeCMI 001- caldo verde brilhante com 2% de bile, confome CMI 001- placas de Petri contendo o meio M-Endo Agar Les preparadas conforme CMI 001- testes descartáveis com o meio M-Endo (Nutrient pad sets)

- tiossulfato de sódio 1,8%

7. DIAGRAMA DE FLUXO





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Amostra

Lactose / Lauril Sulfato

24h-48h/ 35ºC

Filtração

M-Endo Agar Les35°C / 24 horas

Ausência de gás – Testenegativo para coliformes

Caldo Verde Brilhante e Bile

35°C / 24h -48h

Meio EC – 44,5ºC / 24h

Colonias típicas(com brilho metálico)

Ausência de colôniateste negativo p/ coliformes

Colônias atípicasAusência de coliformes

Produção de gás

Produção de gásTeste positivo

para Coliformestotais

Ausência de gásTeste negativopara Coliformes

totais

Produção de gásTeste positivo

para Coliformestermotolerantes

Ausência de gásTeste negativopara Coliformestermotolerantes





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8. PROCEDIMENTO8.1. Preparação:

8.1.1 Antes de iniciar a análise desinfete a bancada de trabalho com álcool a 70%.8.1.2. Disponha na bancada de trabalho o equipamento de filtração com porta filtro, placas dePetri de de 60 x 15 mm contendo meio M-Endo Agar Les (para determinação de coliformestotais), identifique-as com o número da amostra ou a identificação da amostra e a data, disponha

também a água de lavagem estéril, contida em frascos, para enxágüe, pinças com asextremidades arredondadas, podendo flambá-las com álcool etílico contido em um béquer. Deixepróximo também as membranas filtrantes estéreis, brancas, quadriculadas, com 47 mm dediâmetro e porosidade de 0,45µm. Os bicos de Bunsen, acesos próximos, permitem manter umambiente asséptico e efetuar a flambagem das pinças utilizadas.NOTA: Esta análise pode ser realizada em câmara de segurança biológica classe II sem o usode bico de Bunsen, as pinças estéreis, se disponíveis em número suficiente, podem serutilizadas individualmente por ponto de coleta.8.1.3. Quando utilizadas as placas de testes descartáveis com o meio M-Endo (Nutrient padsets), disponha na bancada as placas, água destilada estéril, pipetas, pêra ou ponteiras emicropipetador para hidratá-las. A hidratação deve seguir as orientações do fornecedor. Nãoinverta estas placas para a incubação.

8.2. Análise:

8.2.1. Homogenize a amostra, no mínimo 25 vezes, inclinando o frasco até formar um ângulo de45° entre o braço e o antebraço, e coloque 100 mL de água a ser filtrada.NOTA: Caso o porta filtro não seja graduado, há necessidade de dosagem prévia do volume aser filtrado, nesta situação utilize uma proveta graduada estéril (100 mL), com a aberturarecoberta pelo papel alumínio da esterilização, e marque o filtro para as próximas amostras.8.2.2. Retire a parte superior do porta-filtro e, com uma pinça flambada e esfriada, coloque, nabase do suporte do filtro, uma membrana estéril, com a face quadriculada voltada para cima.8.2.3. Recoloque a parte superior do porta filtro, tendo o cuidado para não danificar a membrana.

Ajuste e rosqueie.8.2.4. Verta cuidadosamente no porta-filtro o volume da amostra a ser examinado, evitando quea água respingue nas paredes do filtro.NOTA: Se o volume da amostra a ser filtrado for inferior a 20 mL, é necessário adicionar aoporta-filtro 20 mL a 30 mL de água de diluição estéril, antes de adicionar o volume da amostra.8.2.5. Proceda à filtração da amostra, ligando a bomba à vácuo.8.2.6. Enxágüe a membrana com porções de 20 a 30 mL de água de diluição estéril.8.2.7. Desligue a bomba à vácuo, ao finalizar a operação. Evite a secagem excessiva damembrana filtrante.





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8.2.8. Com o auxílio da pinça flambada e fria, retire a membrana do filtro, tomando o cuidadopara que a pinça toque apenas a parte periférica da membrana.8.2.9. Obedecendo aos cuidados de assepsia, coloque a membrana sobre o meio de cultura M-Endo Agar Les, evite a formação de bolhas de ar entre a membrana e o meio de cultura, poispode prejudicar o crescimento das colônias de bactérias.8.2.10. Lave o filtro com 20 a 30 mL de água de diluição, antes de colocar a próxima membranapara filtrar outra amostra.

NOTA: Cada unidade de filtração deve ser usada até no máximo para 30 amostras de água,sucessivamente. Quando o intervalo, entre uma amostra e outra, ultrapassar 30 minutos, usarnova unidade de filtração.8.2.11. Após a filtração das amostras, coloque as placas em posição invertida, em bandejasforradas com papel toalha umedecido.8.2.12. Incube as placas, em estufa de incubação, a 35º ± 2°C por 24 + 2 horas.8.2.13. Após a incubação, faça a leitura das amostras.

8.3. Resultados:

8.3.1. Uma placa que não apresente formação de colônias na membrana significa ausência paracoliformes totais.8.3.2. Uma placa que apresente formação de colônias atípicas (incolores até vermelho escuras,sem brilho metálico em sua superfície), ausência de coliformes totais.8.3.3. Uma placa que apresente formação de colônias típicas (de coloração rosa a vermelhoescuro, com brilho verde metálico superficial recobrindo toda colônia ou parte dela), presença decoliformes totais.8.3.4. Para confirmar se dentre estes coliformes totais existem coliformes termotolerantesproceda à confirmação das colônias.

8.4. Confirmação da presença de termotolerantes:

8.4.1. Passe o inóculo da placa com colônias típicas para o caldo lactosado, incube por 24 a 48horas a 35º + 2°C.8.4.2. Na ausência de formação de gás o teste é negativo para coliformes.8.4.3. Se houve produção de gás passe o inóculo do caldo lactosado para o meio EC e incube a44,5º C por 24 horas, passe o inoculo do caldo lactosado para o meio Verde Brilhante e Bile eincube por 24 a 48 horas a 35º C.8.4.4. No caldo verde brilhante e bile: se houve produção de gás o teste é positivo paracoliformes totais, na ausência de gás o teste é negativo para coliformes totais.





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8.4.5. No caldo EC: se houve produção de gás o teste é positivo para coliformes termotolerantes,na ausência de gás o teste é negativo para coliformes termotolerantes.

9. ANEXOS

Não se aplica.

10. BIBLIOGRAFIA

Procedimento elaborado pelo Controle de Qualidade Microbiológico da ETA Cerrado do SAAESorocaba de acordo com o manual:

___ CETESB ___ Técnicas de Análises Microbiológicas da água Membrana Filtrante. São Paulo,2001.

cmi 003 - análise de coliformes

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