Clonagem de genes e fragmentos

de DNA de interessea

Clonagem

Produzir cópias de uma molécula de DNA

Criação de uma molécula recombinante e sua propagação

Definições• Clonar : fazer cópias idênticas

• Isolamento de uma célula a partir de uma população maior, permitindo então sua reprodução de forma assexuada, para gerar muitas células geneticamente idênticas;

• Tecnologia de DNA recombinante: o uso de procedimentos de manipulação de DNA para produzir múltiplas cópias de um simples gene ou de um segmento de DNA;

Clonagem

Restrição Enzimática

Clonagem

Restrição Enzimática

Clonagem

Complementariedade

entre os finais gerados

pela enzima de restrição

Fazer uma molécula de DNA recombinante

Para quê?

Propagação de um

DNA de interesse

Fazer uma molécula de DNA recombinante

Para quê?

Fazer uma molécula de DNA recombinante

Para quê?

Produção de um

produto de interesse

Ex. insulina

Outras aplicações:

Estudar genes do

desenvolvimento,

genes relacionados a

doenças...etc.

Fazer uma molécula de DNA recombinante

Para quê?

Transgênicos

Planta de tabaco

produzindo luciferina

Fazer uma molécula de DNA recombinante

Para quê?

Transgênicos

Aplicações da

tecnologia do DNA

recombinante

Animal transgênico produzindo

proteína de interesse no leite

(Ativador de Plasminogênio

tecidual)

Clonagem

1. Criação de uma molécula recombinante (vetor de propagação +

gene/DNA de interesse)

2. Inserção do vetor recombinante em uma célula hospedeira

3. Seleção das células recombinantes

Plasmídio - molécula de DNA extracromossômica circular que se replica dentro dacélula bacteriana

limite de clonagem: 100 to 10.000 pares de bases

Vetores de clonagem

Fago – Clonagem de fragmentos de DNAde até 20 kb

Vetores de clonagem

Cosmídio - molécula de DNA extracromossômica circular que possuicaracterísticas de plasmídeos e de fagos

limite de clonagem: 35-50 kb

Vetores de clonagem

BAC (Bacterial Artificial Chromosome) - cromossomo artificial baseado emplasmídeos bacterianos

limite de clonagem: 75-300 kb

Vetores de clonagem

YAC (Yeast Artificial Chromosome) - cromossomo artificial que contém telômeros,origem de replicação, centrômero e um marcador para sua identificação em célulasde levedura

limite de clonagem: 100-1000 kb

Vetores de clonagem

Vetores de expressão

Inserção de vetores recombinantes em uma células hospedeiras

Transformação - a célula hospedeira é tornada competente para o vetor de

clonagem ser introduzido

Transfecção - quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a

célula hospedeira pode ser transfectada para inserir a molécula

recombinante

Microprojéteis - partículas cobertas com DNA são projetadas contra uma

célula e penetram em sua membrana

Eletroporação - a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que

pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por

onde o DNA pode ser inserido

DNA (produto de

digestão ou PCR)

Plasmídeo

(pBS, pUC, pGEM)

Criação de uma

molécula recombinante

DNA (produto de

digestão ou PCR)

Plasmídeo

(pBS, pUC, pGEM)

Ligação - a molécula de DNA purificado é ligada a um vetor de clonagem

(plasmídeo, fago, cosmídeo, BAC, YAC)

Transformação - o DNA inserido no plasmídio é introduzido dentro de uma

célula hospedeira apropriada (bactérias competentes)

Célula bacteriana

Plasmídeo

Cromossomobacteriano

Isolamento dosplasmídeos recombinantes

DNA (produto de

digestão ou PCR)

Plasmídios como vetores de clonagem

Bactérias competentes + vetores recombinantes submetidos a um choque térmico

(estimula a inserção do plasmídeo na bactéria competente hospedeira)

recombinant plasmidE.coli host cell

transformed cell

Plasmídios como vetores de clonagem

Transformação e

propagação de

vetores

recombinantes

Plasmídios como vetores de clonagem

Confirmação da transformação

• Crescimento em meio seletivo contendo

antibiótico

• Análise de restrição de DNA plasmidial

• PCR direto da colônia

• Hibridização com uma sonda específica

• Sequenciamento do DNA plasmidial

overnight growth

white colonies

vector + insert

blue colonies

vector

ampicilin-resistance colonies

Seleção das células recombinantes: presença de inserto no plasmídio

Verificar presença de recombinantes - digestão enzimática

DNA (produto de

digestão ou PCR)

Plasmídeo

(pBS, pUC, pGEM)

Criação de uma

molécula recombinante

Criação de uma molécula recombinante

Criação de uma molécula recombinante

DNA (produto de

digestão ou PCR)

Plasmídeo

(pBS, pUC, pGEM)

Bibliotecas:

Genômica e de

cDNA

Construção de bibliotecas de DNA

• DNA genômico

– pode ser adquirida comercialmente ou de outros

laboratórios

– gera um número muito grande de clones (fragmentos

randomicos) ~800.000

– restrição parcial - fragmentos muito largos são difíceis

de serem clonados ou amplificados por PCR

– bibliotecas subgenômicas

– vetores fago lambda, YAC, BAC

Construção de bibliotecas de cDNA

• Isolamento da fração de RNAm de um certo

tecido em uma determinada condição

• Conversão a cDNA pela ação da

transcriptase reversa

• Clonagem em vetor apropriado

• Propagação em bactéria

• Seleção dos clones de interesse (screening)

Isolando o DNA de interesse

• A partir de uma biblioteca genômica

• A partir de uma biblioteca de cDNA

– seleção direta

– PCR - primers

Seleção dos clones de interesse

“Screening”

• Imunológico: detecção da proteína expressa

• sonda de DNA: informações incompletas ou

obtidas a partir de bancos de DNA

– oligonucleotidio

– produto de PCR

– clone incompleto

Sondas de DNA

• Produto de PCR

• oligonucleotídio sintético

• fragmento de restrição de DNA

• clone de cDNA

• sonda de RNA a partir de transcrição in vitro

• São utilizadas em:

• screening de bibliotecas

• southern blotting

• northern blotting

• dot blotting

Desenho de sondas a partir da sequência

de aminoácidos de uma proteína

N-Gly - Leu - Pro - Trp - Glu - Asp - Met - Trp -Phe - Val - Arg-C

GGA TTA CCA TGG GAA GAC ATG TGG TTC GTA AGA

GGC TTG CCC GAG GAT TTT GTC AGG

GGT CTA CCT GTT CGA

GGG CTC CCG GTG CGC

CTT CGT

CTG CGGRegião de degeneração mínima

Sonda sintética TGG GAA GAC ATG TGG TTC GT

G T T

Seleção de uma biblioteca

• Hibridização com sondas de oligonucleotídios

marcadas

– A sequência do DNA de interesse hibridiza a uma

sonda marcada. Influência de Tm

• Seleção com anticorpos

– Expressão de uma proteína que pode ser

reconhecida por um anticorpo

Seleção de uma biblioteca

• DNA genômico: cerca de 500.000 clones

precisam ser analisados para se localizar

uma sequência gênica.

• cDNA: se for feita de um tecido que

expressa fortemente aquele gene, as chances

de encontrar o clone correto são maiores.

– 1 em 20 até 100.000 poli(A)+ RNA

Seleção de uma biblioteca

• Amplificação da biblioteca na célula

hospedeira

• Transferência para uma membrana de

nitrocelulose

• Desnaturação e neutralização. Cross-linking

• Hibridização. Lavagens para retirada da

sonda não ligada

• Revelação e isolamento dos clones

Southern Blotting

Southern blot

Vetor de expressão

Análise do produto