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-PCR (Reação em cadeia da Polimerase)
GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Profa. Fabiana K. Seixas
PCR Polymerase Chain Reaction
Amplificação in vitro de uma
seqüência específica de DNA
* replicação in vitro
Kary Mullis (1983)
Prêmio Nobel Química (1993)
Revolucionou genética
pesquisa genética
medicina forense
genética molecular
HISTÓRIA DA PCR
DNA molde
Oligonucleotídeos (primer)
dNTP’s
DNA Polimerase
Magnésio
Tampão
Água
COMPONENTES DA REAÇÃO
Thermus aquaticus -Estável a temperaturas
de 177 graus;
Temperatura Ótima:
72 graus
DNA POLIMERASE
Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park”
de onde foi isolado o Thermus aquaticus
TERMOCICLADOR
EQUIPAMENTO
PCR se constitui hoje no método de rotina para isolar
rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura
complexa de seqüências genômicas
ou de cDNAs.
PCRReação em Cadeia da Polimerase
Programa
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
ET
APA
S Extração de DNA
Desenho dos Primers
Reação de PCR
Análise dos Resultados
EX
TR
AÇ
ÃO
DO
DN
A
DELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos / primers) são a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR.
-Tamanho dos primers;
- Estabelecimento das temperaturas corretas a
serem utilizadas;
National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
ANELAMENTO E POLIMERIZAÇÃO
ETAPAS D
A P
CR
DESNATURAÇÃO
ANELAMENTO
POLIMERIZAÇÃO
ELETROFORESE
ELETROFORESE
VISUALIZAÇÃO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 0.8%
RESULTADOS
RESULTADOS
• Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas
• Amplificação de genes para posterior clonagem e
expressão
• Determinação de variabilidade genética
• Deteção de OGMs
• Sexagem de embriões
• Estudo da expressão gênica
APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR
Construção do DNA Recombinante
Molécula de DNA de
um plasmídeo circular
Clivagem com
enzima de
restrição
Molécula de DNA de um plasmídeo
linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligação covalente
pela DNA ligase
Molécula de DNA
plasmidial contendo
o inserto
Inserção em
uma célula
hospedeira
APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR
Extração do DNA da amostra é crítica
Alguns compostos podem inibir a polimerase
Condições específicas para cada reação
Falsos resultados positivos devido a contaminação.
Falsos resultados negativos.
Análises conduzidas em laboratórios especializados.
LIMITAÇÕES