ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO

DE UM GENE

ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO

DE UM GENE

• Importância da Engenharia Genética

• Diversidade biológica X Diversidade gênica

•Etapas básicas da Clonagem

•Escolha e amplificação do gene

•Digestão do DNA com Enzimas de Restrição

•Escolha e Estrutura dos plasmídeos

•Ligação dos Insertos

•Transformação de um organismo

•Selecionar os organismos modificados

Importância da Engenharia Genética

Análises de DNA (paternidade, forense, predisposição a doenças).

Melhoramento de culturas e maior produtividade de alimentos (transgênicos).

Produção de Vacinas e Medicamentos Imuno-Biológicos.

Melhoramento de Processos Industriais (áreas de energia, meio ambiente etc)

Volume 409 Number

6822

Pages 745-964

15 February 2001

Vol 291, Issue

5507,

Pages 1145-1434

16 February 2001

Quebra-cabeças de

bilhões de peças...... que montam uma

peça.

Homo sapiens Arabidopsis thaliana Mus musculus Caenorhabitis elegans Drosophila melanogaster

Mycobacterium leprae Vibrio cholerae Plasmodium falciparum Mycobacterium tuberculosis Neisseria meningitidis

Helicobacter pyroli Xylella fastidiosa Bacillus subtilis Chlamydia pneumoniae Pseudomonas aeruginosa

E. coli Saccharomyces cerevisiae Yersinia pestis Salmonella enterica Schizosaccaromyces pombe

Div

ers

idad

e B

ioló

gic

a

Diversidade Biológica X Diversidade gênica

(HAR1) Human Accelerated Region 1

A região HAR1, assim como 98,5% do

nosso genoma, não codifica nenhuma

proteína

Em 6 milhões de anos a evolução

mudou 1% do genoma

Etapas básicas da Clonagem

Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão).

Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA capaz de auto replicar-se).

Essas moléculas geralmente são plasmídios ou DNA viral.

Ligar, covalentemente, estes 2 fragmentos de DNA. A enzima que faz esta ligação

entre o vetor de clonagem e o DNA a ser clonado é a DNA ligase. Esse DNA

composto de moléculas de origem diferente é chamado de DNA recombinante ou

DNA quimérico.

Transferir o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula hospedeira

que emprestará sua maquinaria enzimática para a replicação deste DNA.

Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contém o DNA recombinante.

Etapas básicas da Clonagem

Escolhas Iniciais e Preparação

mRNA

•Purificar o mRNA

•Transcrição reversa (mRNA → cDNA)

DNA

•Purificar o DNA

Amplificação da região ou gene de interesse

DNA

•Purificar o DNA

Digestão do DNA

Clonagem de genes ou trechos de DNA Clonagem de todo o DNA

Transcrição Reversa

•Molde a ser transcrito reversamente (mRNA)

•Transcriptase reversa

•Primer (oligonucleotideo dT = TTTTTTTTTTTT)

•dNTPs (ATP, CTP, TTP, GTP)

•Tampão adequado

Amplificação de DNA(PCR – Reação em cadeia da polimerase)

•Molde de DNA a ser copiado

•DNA polimerase

•Primers (senso e anti-senso)

• dNTPs (ATP, CTP, TTP, GTP)

•Tampão adequado

Digestão de DNA(Endonucleases)

•DNA a ser digerido

•Endonuclease

•Tampão adequado

Análise de fragmentos de DNA(eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida)

•DNA já digerido ou produto de amplificação

•Tampão adequado

•Aplicação no gel e início da corrida (corrente

elétrica)

•Visualização usando molécula fluorescente à luz

UV que liga no DNA (brometo de etídeo)

Análise de fragmentos de DNA(eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida)

Southern e Northern Blot(Identificação de DNA e mRNA em membranas de nylon)

Fragmentos de DNA (ou RNA) separados por peso molecular usando-se eletroforese

em gel são transferidos para membranas.

• A técnica, quando usada para DNA, é chamada de Southern Blot

• A técnica, quando usada para RNA, é chamada de Northern Blot

Southern e Northern Blot

Fingerprint de DNA

Relembrando as etapas iniciais da clonagem

mRNA

•Purificar o mRNA

•Transcrição reversa (mRNA → cDNA)

DNA

•Purificar o DNA

Amplificação da região ou gene de interesse (PCR)

Conferência usando eletroforese

DNA

•Purificar o DNA

Digestão do DNA

Conferência usando eletroforese (só se oriundo de 3)

Clonagem de genes ou trechos de DNA Clonagem de todo o DNA

1 2 3

Etapas seguintes da clonagem

Digestão do DNA Digestão do plasmidio

Ligação

Transformação

Seleção

Ligação(escolha do vetor - plasmídeo)

Ligação(pontas coesivas e não coesivas)

Transformação e Seleção(inserção dos vetores em outros organismos)

As bactérias ainda são os

organismos mais usados para

clonar DNA heterólogo

A seleção pode ser feita pela

habilidade de sobreviver a

antibióticos ou crescer em meios

de cultura pobres em algum

aminoácido ou nutriente

Outras Técnicas: Biblioteca genômica

Uso de

bacteriófagos como

vetores: o fago λ

tem DNA de dupla

fita

Outras Técnicas: Microarrajo de DNA

Outras Técnicas: Microarrajo de DNA

Array de 1046 cDNAs testado

com cDNA marcado de feito de

mRNA de medula óssea. O

nível de hibridização segue as

cores do espectro, com

vermelho sendo a maior

expressão e azul a menor