Diferenciação Celular e Terapia Gênica

Martin Bonamino Divisão de Medicina Experimental – CPQ - INCA

1953 a estrutura do DNA foi descrita e com isso foi descrito logo

em seguida o mecanismo da duplicação do DNA, explicando como

ele era transmitido de uma geração para outra.

Replicação semi-conservativa

1966 – E.L. Tatum, no simpósio na Columbia University College of

Physicians and Surgeons in New York City intitulada: Reflections on

Research and the Future of Medicine:

“Finalmente nós podemos antecipar que os vírus serão usados

efetivamente para o benefício humano, em estudos com célula somática,

germinativas e possivelmente para terapia gênica. Nós podemos até ser

otimistas sobre a possibilidade de uma terapia baseada no isolamento ou

design, síntese e introdução de um novo gene em uma célula com um

gene defeituoso em um órgão em particular.”

1968 – New England Journal of Medicine recusa a publicação de um

artigo no qual French Anderson (pai da terapia gênica) teoriza a

possibilidade de atacar doenças hereditárias introduzindo no organismo o

gene correto ou substituindo aquele defeituoso.

“Com objetivo de inserir um gene correto em uma célula contendo

uma mutação, será primeiro necessário isolar o gene em questão de

um cromossomo normal. Então esse gene tem que ser duplicado para

se ter várias cópias. E finalmente, será necessário incorporar a cópia

correta no genoma da célula defeituosa”; explicação de Dr. Anderson.

Enquanto as discussões das possibilidades de se resolver os

problemas genéticos sejam somente especulações, um dos métodos

mais promissores seria o desenvolvimento de vírus não patogênicos

capazes de transferir o material genético para a célula defeituosa.

Esses vírus seriam usados para infectar células em cultura contendo o

gene normal. Teoricamente, os vírus iriam incorporar a seqüência de

DNA desejada. Então os vírus seriam re-isolados, multiplicados em

cultura em massa, purificado e guardados para administração em

pacientes que sofressem da doença genética em questão....Isso seria

usado em benefício da humanidade.”

F.Anderson, 1968

Histórico da Terapia Gênica Experimental:

1970 – Stanfield Rogers tratou 2 crianças com arginemia (falta de

arginase: altos níveis de arginina no sangue) – baseado na

observação que animais infectados com papiloma-vírus tinham níveis

reduzidos de arginina no sangue.

Premissas da terapia gênica: papiloma vírus – sem sucesso.

Conferência: “Ethical and Scientific Issues Posed by Human Uses of

Molecular Genetics" on May 15-16, 1975, in New York City

Artigo: Essas crianças eram epiléticas, tinham espasmos regulares,

eram grosseiramente retardadas, e progressivamente se tornavam

piores. Por essas razões, parece válido assumir o risco (que nós não

acreditávamos existir, de qualquer forma) da administração dos vírus

nessas crianças com o objetivo de substituir o gene da enzima

defeituosa.

1977 – M. Wingler e R. Axel – 1º experimento bem sucedido

de transferência in vitro do gene da timidina cinase em célula

de mamíferos (Cell, Vol 11, 223-232, May 1977).

1980 – Martin Cline (primeiro trangênico) – terapia gênica

experimental em humanos não aprovada EUA, para

pacientes com ß- talassemia: células de medula óssea

geneticamente modificadas com gene da cadeia ß da

hemoglobina e reinfundida nas pacientes.

QUESÕES ÉTICAS

Genes Dreams and Realities - (MacFarlane Burnet,

1971)

O estímulo para escrever esse livro veio da sensação de

que muito material sensacionalista têm sido escrito

sobre o futuro da medicina pelas descobertas da biologia

molecular.

A cada passo, pode se dizer que com o conhecimento

restrito que se tem, a terapia gênica é possível em

princípio, porém os problema práticos exigiriam um

exercito de brilhantes cientistas para supera-los. Na

minha opinião não existe nenhuma motivação que leve

ao financiamento do governo para pesquisas nesse

campo.

Final da década de 80 - 1º protocolo aprovado pelo NIH para teste de terapia

gênica em humano: objetivo de demonstrar transferência gênica eficiente.

Transferência de genes do sistema imune para um paciente em estágio

avançado de neoplasia maligna.

1990 – Primeira doença aprovada para terapia gênica em humanos. Terapia

somática (LINFÓCITOS): deficiência em adenosina deaminase:

imunodeficiência combinada – objetivo clínico-científico.

1992 – primeira terapia gênica direcionada à um órgão interno –

hipercolesterolemia familiar;

1992 - primeira terapia gênica utilizando vetores não virais diretamente em

tumores.

1996 – fundação da primeira sociedade de terapia gênica (American Society

of Gene Therapy)

1º Janeiro 1999 – 1º Journal: Human Gene Therapy

1999 – Primeira morte devido a terapia gênica: Jesse Gelsinger (18 anos)

deficiência na ornitina transcarbamilase.

2000 – Primeira cura completa pela terapia gênica somática (stem

cells): tratamento da imunodeficiência combinada severa X-linked

(Bubble boy syndrome); 3 desenvolveram leucemia e 1 morreu

(2003).

2003 – Primeiro produto para terapia gênica aprovado para venda

em qualquer lugar do mundo, licenciado na China: vetor de

adenovírus contendo gene p53.

2004 – Mais de 3000 pacientes vêm sendo tratados por terapia

gênica pelo mundo e 619 novos protocolos de clinical trail foram

submetidos ao NIH/FDA.

2005 – Primeiro clinical trial para retinose pigmentar aprovado nos

EUA.

2006 – Primeiro clinical trial para distrofia muscular.

Procedimentos técnicos necessários à terapia gênica em humanos

(FDA):

• isolamento do gene e suas seqüências reguladoras

• determinar quais são as células afetadas

• dispor de um mecanismo eficiente (vetores)

para inserir o gene nas células especificadas.

• dispor de tempo para análise.

• que todos os procedimentos não apresentem

efeitos colaterais indesejáveis.

Os riscos da terapia gênica:

• Resposta imune a proteína produzida pelo gene inserido

causando inflamação.

• Mutação insercional.

• O gene saudável introduzido pode promover a síntese de muita

proteína, antes defeituosa, levando a outros problemas.

• Outros genes podem ser acidentalmente entregue as células.

• Os vetores pode atingir outras células não afetadas pelo defeito

genético, e então provocar algum problema.

• o vetor viral pode se tornar infectivo/ contagioso.

•Transferência

(em pacientes com mutação não funcional ou deleção de um gene )

•Correção

(reverter mutação específica em um gene alvo)

•Amplificação

(aumentar a expressão do gene alvo)

•Indução de morte

(introdução de gene “killer”)

•Silenciamento

(inibição da expressão de um gene)

Engenharia genética

Formas de aplicação do vetor na Terapia Gênica

In vivo:

# mais direto

# atinge diversas células

# promotores específicos

# direcionamento vetor

Ex vivo: # autólogo/ # seleciona somente célula com novo gene/ # - resp. imune

Vetores para Transferência

Gênica

Sistemas de entrega

Virais: Não virais:

Retroviruses Métodos físicos

Herpes simplex virus Métodos químicos

Adenovírus

Adenovírus associados

Vetores não virais

• Mais recentes na terapia gênica

• Não imunogênicos

• Uso repetido

• Sem mutação insercional

• Transdução in vivo limitada

Principais barreiras:

1. Entrada na célula

2. Degradação citoplasmática

3. Transporte até o núcleo

4. Entrada no núcleo

Métodos físicos:

Mecanismo de entrega dos vetores não virais

Injeção intracelular

ou microinjeção

Pequena

proporção de

células

Produção de

trangênicos

Injeção intramuscular

Vacinação para várias

doenças infecciosas:

gripe (1993), malária,

tuberculose, hepatite B,

HIV, ebola etc.

Expressão de 3 meses

Gene Guns 1980

DNA

Alta pressão de hélio -

Intradérmica

Vacinação

Expressão 1 mês

Mais dispendiosa

Eletroporação (1982 mamíferos): célula não incorporam DNA naturalmente

Não é usado em

humanos

Mecanismo de entrega dos vetores não virais

Métodos químicos

• Complexar e condensar o DNA

• Fosfato de cálcio

Complexação e condensação do DNA

Polímeros ou lipídeos catiônicos ou a mistura de polímeros com lipídeos

endocitados

Sistemas biomoleculares específicos de transferência,

recombinação e expressão gênica;

Vetores por excelência;

Vêm evoluindo há milhões de anos na natureza em

associação com bactérias, plantas e animais;

Principais barreiras dos vetores não virais:

1. Entrada na célula

2. Degradação citoplasmática

3. Transporte até o núcleo

4. Entrada no núcleo

Vetores

Doenças hereditárias

Doença

Gene relacionado

Tecido alvo

Vetor

Enfisema

pulmonar

a-1-antitripsina

Trato respiratório

Lipossomas

Fibrose

cística

CFTR

Trato respiratório

Adenovírus

Vírus Adeno-

associado

Lipossomas

(SCID)

Adenosina

desaminase

Linfócitos

Células progenitoras

hematopoiéticas

Retrovírus

Doenças adquiridas

Doença

Gene relacionado

Tecido alvo

Vetor

AIDS

Ribozimas

RNAm

Anticorpos

Linfócitos

Retrovírus

Câncer

Genes supressores de

tumores

HTK-ganciclovir

Pulmões,

Fígado

Cérebro

Retrovírus,

Adenovírus

Retrovírus

Parkinson

Dopamina (tirosina

hidroxilase)

Tecido nervoso

Vírus da herpes

Geração de Vetores Retrovirais para Terapia Gênica

Novos vetores retrovirais?

MLV x Lentivírus

Integra em células em proliferação Não necessita proliferação

Amplamente testados em trials clínicos

Mutagênese insercional

Pouco testados em trials clínicos

Mutagênese insercional?

HIV-1

POL

VPR VPU

VIF

TAT

REV

NEF GAG ENV

Y

U3RU5

GA

RRE

RU5

PROM TRANSGENE

RU5 Y

Vetor de transferência

LTR LTR

RRE

NEF U3RU5

SD SA

Vetores lentivirais derivados do HIV-1

Células 293T Rev

Empacotador

Envelope (VSV, RD114)

Transferência (EF1a-PPT-GFP / EF1a-PPT-CD20 )

Vetor Viral

Transfecção para geração de

vetores virais

Procedimentos Caros – Estrutura complexa

Produção dos vetores

Validação dos produtos

Verificação da inserção do gene

Gene funcional

Número de cópias/célula

RCR

SCID

SEVERE COMBINED

IMMUNODEFICIENCY

• Severe Combine Immunodeficiency Disease (SCID) is a disorder characterized by a marked deficiency of both B-lymphocyte and T- lymphocyte function.

• Patients get all kinds of infections

• Lots of very different genetic defects

• Half of cases are X-linked

• In humans with XSCID T cell are defective but B cells are normal.

• One form of the autosomal recessive disease is due to a deficiency of Adenosine Deaminase.

• Bone marrow transplantation is very effective but the chances of a successful transplant depend in part on the degree of infection and/or failure to thrive present at the time of transplantation.

SCID can result from defects in the IL-2 receptor subfamily:

(A) defective expression of the common chain, or

(B) defective receptor signaling due to a missing tyrosine kinase

40-50% of SCID cases

T- B+ phenotype

Rare

T- B- SCID

• Adenosine Deaminase Deficiency (ADA) – ADA is an enzyme in the purine salvage pathway

• pathway is important for T& B-cell development & differentiation

• T- B- phenotype

– Accounts for about 20% of all SCID cases

– Autosomal recessive

– Treatment • Bone marrow transplant

• Continuous enzyme supplement

• Gene Therapy

Purine nucleoside phosphorylase deficiency and recombinase

deficiencies (RAG-1 and -2) also cause SCID of the T-B- phenotype

X-linked

agammaglobulinemia

(XLA)

• Patients make normal (or even increased) amounts of IgM

• But can’t make IgG, IgA, or IgE!

• defective CD-40L expression

• X-linked in most cases

• Patients also have a defect in cell-mediated immunity

• Patients have recurrent bacterial infections and infections with intracellular pathogens (Pneumocystis jiroveci)

Hyper-IgM Syndrome

T cell

B cell

Immunodeficiency Syndromes

Immunodeficiency Syndromes

Immunodeficiency Syndromes

• SCID:“Imunodeficiência combinada severa”

• “bubble boy disease”

• Doença genética recessiva

• Mutação no gene para a adenosina deaminase (ADA)

• Morte de precursores hematopoiéticos: falência do sistema imunológico

SCID

Imunodeficiências: Vetores retrovirais Transdução estável do transgene

Results from First Human Gene Therapy Clinical Trial

Two years after receiving their last infusions of genetically altered cells to boost their

weakened immune systems, the first patients ever to undergo gene therapy are still

healthy and benefiting from the treatment.

According to a historic research paper published today in Science, the two girls still

have white blood cells bearing copies of the replacement ADA gene. Patient 1, whose

health improved significantly following gene therapy, has maintained a normal white

blood cell count as well as measurable levels of the ADA enzyme, which was almost

nonexistent prior to the treatment. Both girls also have developed stronger immune

systems, showing improved immune reactions in a battery of tests conducted over the

course of the four-year study.

Sustained Correction of X-Linked Severe Combined Immunodeficiency by

ex Vivo Gene Therapy

Hacein-Bey-Abina, Salima; Le Deist, Francoise; Carlier, Frederique; Bouneaud,

Cecile; Hue, Christophe; De Villartay, Jean-Pierre; Thrasher, Adrian J.;

Wulffraat, Nicolas; Sorensen, Ricardo; Dupuis-Girod, Sophie; Fischer, Alain;

Cavazzana-Calvo, Marina.

CD34+ bone marrow cells from five boys

with X-linked severe combined

immunodeficiency were transduced ex vivo

with the use of a defective retroviral vector.

Integration and expression of the (gamma)c

transgene and development of lymphocyte

subgroups and their functions were

sequentially analyzed over a period of up to

2.5 years after gene transfer.

Resultados do protocolo de Terapia

Gênica para X-SCID

• Viviam normalmente em casa sem necessidade do ambiente estéril (“bolha”) ;

• Possuiam contagens normais de células T nos compartimentos CD4 e CD8;

• Responderam a várias imunizações infantis, incluindo difteria, tétano e pólio produzindo células T e anticorpos específicos contra os patógenos.

• A produção de anticorpos apresentava níveis que permitiam evitar as infusões periódicas de imunoglobulinas.

3,5 anos após a Terapia Gênica

14 das 15 crianças com X-SCID tratadas:

Alain Fischer, Necker Hospital, Paris

Mutagênese insercional causada por vetores retrovirais

Ativação cis

Interferência com elementos de

controle da expressão gênica

Ativação cis

Alteração do produto gênico

MLV LMO2

•Translocações envolvendo LMO2: leucemia T

•c: vantagem seletiva aos clones corrigidos

•Ambiente linfopênico:

Expansão exaustiva dos clones transduzidos?

Indução de expansão clonal?

•LMO2: hotspot para integração dos MLV, especialmente pela expressão na linhagem T

Cada patologia e protocolo de terapia gênica tem sua particularidade

Causa das leucemia

Risco:

- Mutagênese insercional

Prevenção:

- Refinamento dos protocolos de transdução

(número de cópias próvirus/célula), menos

estímulo e tempo de cultura

- Menor número de células transduzidas

Risco:

- Terapia ineficaz por baixo número de progenitores?

RISCO / BENEFíCiO: TERAPIA GÊNICA x TMO APARENTADO

Phagocyte Dysfuncions

Leukocyte Adhesion Deficiencies

-leukocyte interaction with vascular

endothelium is disrupted

Diminished intracellular killing

of organisms, resulting from

defective lysosomes

Diminished intracellular killing

of organisms, resulting from

defective respiratory burst

Prevents adhesion and

migration

Respiratory burst defect,

chronic TH1 stimulation

Respiratory burst defect

Respiratory burst defect

Vesicle fusion defect

Defects in phagocytic cells

Atividade antimicrobiana

•Expansão clonal de células

Corrigidas com inserções próximas

a genes promotores de proliferação

•Contagem celular normal: células

Modificadas sujeitas à regulação

fisiológica

•O percentual de células com o

transgene nos compartimentos T e B

manteve-se baixo

Terapia gênica

Imunodeficiências:

Correção funcional de genes alcançada

Desafios:

Aumentar o número de patologias tratadas

Melhorar os protocolos terapêuticos para minimizar os riscos

• novos vetores

• melhor regulação gênica

• melhores transduções

• sistema de segurança (gene suicida?)

Jesse Gelsinger

Tratamento com vetor adenoviral:

- Falência múltipla de órgãos

- Toxicidade hepática devido à carga de vetores virais administrada

- Tropismo do vetor viral pelo fígado

- Possível recombinação do vetor utilizado

Terapia Gênica: Riscos dos protocolos in vivo

Adenovírus – resposta imune

Washingtonpost:

Teen Dies Undergoing Gene Therapy

By Rick Weiss and Deborah Nelson

Washington Post Staff Writers

Wednesday, September 29, 1999; Page A1 Jesse Gelsinger

• Distúrbio metabólico de origem genética – deficiência da ornitina

descarboxilase – não metabolização da amônia

• 1/40.000 - fatal após 72hs de vida

• JG – forma parcial do distúrbio, controlado por medicamentos

• Convidado a participar do “clinical trial phase I” - 6.000.000.000

adenovírus/kg – artéria hepática. Falecimento 4 dias após injeção.

• University of Pennsylvania and Genova (Dr.James Wilson)

• 691 eventos adversos pré-clínicos não publicados

Gene transfer of a regulated ß-globin gene in

HSCs would reduce the imbalance between a-

and ß-globin chains in erythroid cells

Transplantation of autologous, genetically

corrected HSCs would represent an alternative

therapy for thalassemic patients lacking a suitable

bone marrow donor

Gene therapy for ß-thal

Gene therapy for ß-thal

Beta Thalassemias

• Result from Point Mutations on genes

• Severity depends on where the hit(s) lie

b0-no b-globin synthesis;

b+ reduced synthesis

• Disease results in an overproduction of a-

globin chains, which precipitate in the cells

and cause splenic sequestration of RBCs

• Erythropoiesis increases, sometimes

becomes extramedullary

21_11.jpg

Patient

Purification of CD34+ cells

Transduction

ß-globin vector

TERAPIA GENICA DELLA ß-TALASSEMIA

Infusion of genetically-corrected cells

Gene therapy for ß-thalassemia

efficient gene transfer into target cells

adequate level of transgene expression

persistence of gene expression

regulation of gene expression

tolerance to transgene product

safety

The success of gene therapy is based on:

ß-globin locus

LCR

gag

pro pol env Frame 2

Frame 3

Frame 1

ORFs

vif

vpr

tat vpu

rev

nef

RRE

PPT PBS

Genomic RNA Y

SD SA SA CAP U3 R R U5

Proviral DNA RRE

PBS PPT

(A)n

U3 R U5 U3 R U5

SD SA R

3’LTR

U3

5’LTR

RRE GA PROMOTER TRANSGENE

U5 U5 R

Lentiviral vectors (1996)

Y

GAG

PRO POL

RRE

TAT

REV

VIF

U

R

ENV NEF

3’LTR 5’LTR

HIV-1 DNA

Lentiviral vectors in GT:

the French trial

Terapia Celular/Terapia Gênica

Science, 2007

Terapia Celular/Terapia Gênica

Science, 2007

Uso de células

autólogas – Não

há rejeição

imunológica

Indução das iPS

com os mesmos 4

genes, mas c-myc

desligado depois

para prevenir

tumores.

Reversão do fenótipo

Possibilidades Infinitas

• Qualquer doença com uma única mutação genética

pode ser tratada

• Regeneração tecidual

• Testes de toxicidade in vitro

• Testes de iPS para terapia estão em andamento

Zinc Finger Nucleases – Inserção sítio dirigida

Reconhecer o tumor…..

… poupar tecidos saudáveis

Imunoterapia – O papel dos linfócitos T

Enxerto: Precursores hematopoiéticos + Linfócitos (T)

Transplante de precursores hematopoiéticos

Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro (DECH)

x

Enxerto Contra Leucemia (ECL)

Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro

Os linfócitos T estão intimamente

ligados ao efeito antitumoral e à

Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro

Eliminar os linfócitos T do enxerto

evita a DECH, mas impede o efeito ECL

Enxerto contra Leucemia (ECL)

Appelbaum, 2001

Enxerto contra Leucemia (ECL)

Appelbaum, 2001

Enxerto contra Leucemia (ECL)

Appelbaum, 2001

Enxerto contra Leucemia (ECL)

Appelbaum, 2001

Gene suicida para o tratamento da DECH aguda

Cell culture

Gene

transfer

Collect donor

PBMC

Select transgene

Positive T cells

For Infusion GVHD

Drug treatment

for transgene-positive

T cell elimination

Activation of T cells

BMT Recipient

Sistema de gene suicida HSV-TC

HSV

TC

HSV

TC

Cinases

Celulares

Bonini et al, Science 1997

Limitações

Timidina

Cinase

Proteína imunogênica Seleção de mutantes não funcionais da proteína TC Ganciclovir - uso no pós transplante

Terapia Gênica para tumores com defeitos em p53

Terapia gênica e Câncer

Explorando o sistema imunológico

Imunoterapia

Transferência adotiva de células T

Transferência adotiva de células T

Transferência adotiva de células T

Evasão Tumoral

Reconhecimento de Tumores

Antígenos Tumorais

129

Tumor Infiltrating Lymphocytes

Terapia Gênica na Imunoterapia?

Recurrent colorectal cancer

labeled with a monoclonal

antibody conjugated to a

radioisotope. Tumor as red

spots located in the pelvic

region, while blood vessels

are outlined by circulating

antibody (green).

Anticorpos Monoclonais

Redirecionamento de linfócitos para a eliminação de tumores

Receptor quimérico de antígeno (CAR)

• Reconhecimento independente de MHC

• Alta afinidade pelo antígeno

•Dispensa seleção de clones reativos do paciente

Ativação da Célula T

A estimulação de células T requer múltiplos sinais

CD19

Biagi et al, 2005

Kershaw et al, 2005

CD20

CD3z

Resposta anti-CD20

NIH3T3

NK92

Brentjens et al, 2007

Blood, Julho 2010

D+143

Pule et al, Nature Medicine 2008

Neuroblastoma em pacientes pediátricos

CAR anti GD2