detecÇÃo de genes de virulÊncia de staphylococcus …microrganismos utilizados e condições de...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
DETECÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Staphylococcus
aureus IDENTIFICADOS POR PCR EM AMOSTRAS DE LEITE DE VACAS
COM MASTITE CLÌNICA OU SUBCLÍNICA
Fernanda Antunha de Freitas
Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita
Goiânia
2014
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FERNANDA ANTUNHA DE FREITAS
DETECÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Staphylococcus
aureus IDENTIFICADOS POR PCR EM AMOSTRAS DE LEITE DE VACAS
COM MASTITE CLÍNICA OU SUBCLÍNICA
Dissertação apresentada para obtenção
do grau de Mestre em Ciência Animal
junto à Escola de Veterinária e Zootecnia
da Universidade Federal de Goiás
Área de Concentração:
Sanidade, Higiene e Tecnologia de Alimentos
Linha de Pesquisa:
Higiene, ciência, tecnologia e inspeção de alimentos
Orientador:
Prof. Dr. Albenones José de Mesquita-EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Antônio Nonato de Oliveira
Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau
Goiânia
2014
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iv
Aos meus pais e
minhas irmãs, por estarem
sempre ao meu lado.
Dedico.
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço, antes de tudo, a Deus, por estar sempre guiando meu
caminho.
Agradeço ao Prof. Dr. Albenones José de Mesquita, meu querido
orientador, pelos ensinamentos, paciência, apoio, atenção, carinho e incentivo
recebidos durante o mestrado.
Agradeço aos meus pais, Marcius Ribeiro de Freitas e Olivia Antunha
de Freitas, às minhas irmãs, Cláudia e Mônica, e ao Ronaldo, meu namorado.
Obrigada por acreditarem em mim e pelo carinho, atenção e compreensão que
me deram durante esses dois anos.
Agradeço ao meu co-orientador Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau, pela
amizade, confiança e apoio.
À Prof. Dra. Cíntia Silva Minafra e Rezende, pela paciência, amizade e
exemplo.
A todos os professores da Escola de Veterinária e Zootecnia, pelo
ensinamento, paciência e sabedoria. Em especial, aos professores e funcionários
do Centro de Pesquisa em Alimentos, que me acolheram durante minha vida
acadêmica e durante o mestrado.
Agradeço à Alana M. M. Di Calaça, minha amiga querida, por estar
sempre perto de mim me dando força e fazendo companhia.
À Marília Cristina Sola, pelos ensinamentos, dedicação, atenção e
companheirismo. Obrigada por me mostrar sempre o melhor caminho, e por me
ajudar e me dar força e coragem quando precisei.
Aos funcionários e amigos do Laboratório de Especialidades Biológicas
do CPA, Ervaldo, Jocyene, Keane, Iranilde e Leydianne, pelo apoio e ajuda
durante a execução do meu experimento. Obrigada por todos os momentos que
me deram força e acreditaram que ia dar certo.
Agradeço aos meus amigos da pós-graduação Maria Izabel, Natália,
Greice, Julierme, Angélica, Thiago, Édilon, Thais e todos os outros que tornaram
esses dois anos de mestrado divertidos e mais prazerosos.
Ao programa de Pós-graduação da Escola de Veterinária e Zootecnia
da Universidade Federal de Goiás.
vi
À CAPES, por fornecer apoio financeiro essencial para que eu pudesse
dedicar-me integralmente às atividades de Pós-graduação.
À FAPEG, pelo apoio financeiro para o desenvolvimento do projeto de
pesquisa.
Agradeço a todos que de um jeito ou de outro contribuíram para a
finalização do mestrado e torceram por mim.
vii
“Viver não é o bastante,
deve-se ter brilho, liberdade e uma
pequena flor”.
Hans Christian Andersen
viii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA..............................................................................4
2.1. Mastite por Staphylococcus aureus...............................................................4
2.2. Staphylococcus aureus.................................................................................6
2.3. Exoproteínas...............................................................................................10
2.3.1.1. Superantígenos estafilocócicos........................................................11
2.3.1.2. Toxina da síndrome do choque tóxico..............................................12
2.3.2. Toxinas Esfoliativas.....................................................................................14
2.3.3. Leucocidina Panton-Valentine.....................................................................15
3. OBJETIVOS......................................................................................................19
3.1. Geral............................................................................................................19
3.2. Específicos..................................................................................................19
4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................20
4.1. Microrganismos utilizados e condições de cultivo.......................................20
4.2. Detecção do DNA genômico e gene de exotoxinas de S. aureus pela
Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real................................................21
4.2.1. Extração do DNA genômico........................................................................21
4.2.2. Quantificação do DNA genômico................................................................22
4.3. Reação em Cadeia da Polimerase..............................................................22
4.3.1. Análise para detecção do DNA genômico de S. aureus pelo gene sodA...22
4.3.2. Análise de PCR em tempo real para detecção de gene de exotoxinas de
isolados de S. aureus de leite de vacas com mastite clínica ou subclínica...........24
4.4. Análises estatísticas....................................................................................25
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................26
5.1. Identificação do microrganismo S. aureus por meio da técnica de PCR em
tempo real..............................................................................................................26
5.2. Detecção do DNA de genes codificadores de exotoxinas de isolados de S.
aureus pela PCR em tempo real............................................................................30
6. CONCLUSÃO...................................................................................................37
REFERÊNCIAS......................................................................................................38
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Fluxograma de análise de identificação de S. aureus em leite.........20
FIGURA 2 – Representação das curvas de amplificação do DNA de S. aureus da
cepa ATCC 25923..................................................................................................26
FIGURA 3 – Representação da curva de linearidade da identificação do DNA de
S. aureus da cepa ATCC 25923............................................................................27
FIGURA 4 – Representação das curvas de dissociação do DNA dos isolados de
S. aureus de leite de vacas com mastite clínica ou subclínica..............................28
FIGURA 5 – Representação das curvas de amplificação do DNA dos isolados de
S. aureus de leite de vacas com mastite clínica ou subclínica..............................28
FIGURA 6 – Curvas de melt e de amplificação da análise para identificação do
gene tst..................................................................................................................31
FIGURA 7 – Curvas de melt e de amplificação da análise para identificação do
gene pvl..................................................................................................................31
FIGURA 8 – Curvas de amplificação e de melt da análise de identificação do gene
eta..........................................................................................................................32
x
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Frequência das variáveis de acordo com a amostra. Goiânia – GO,
2013.......................................................................................................................30
TABELA 2 – Distribuição percentual dos genes de exotoxinas segundo os
isolados positivos de S. aureus. Goiânia – GO, 2013............................................33
TABELA 3 – Comparação da variável PVL em relação à variável tipos de mastite.
Goiânia – GO, 2013...............................................................................................33
TABELA 4 – Comparação da variável TST em à variável tipos de mastite. Goiânia
– GO, 2013.............................................................................................................33
TABELA 5 – Comparação da variável ETA em relação à variável tipos de mastite.
Goiânia – GO, 2013...............................................................................................33
xi
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 – Iniciadores para amplificação do gene sodA para detecção do DNA
genômico de S. aureus..........................................................................................22
QUADRO 2 – Condições de amplificação do DNA de S. aureus por meio da
reação de PCR em tempo real...............................................................................23
QUADRO 3 – Iniciadores para amplificação de genes de exotoxinas
estafilocócicas........................................................................................................24
QUADRO 4 – Condições de amplificação dos iniciadores utilizados para detecção
de exotoxinas estaflocócicas.................................................................................25
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
% Porcento
µg Micrograma
µL Microlitro
agr Gene acessório regulador
ATCC American Type Culture Collection
et al. e colaboradores
ETA Toxina esfoliativa A
eta Gene codificador da toxina esfoliativa A
ETB Toxina esfoliativa B
etb Gene codificador da toxina esfoliativa B
IIM Infecções intramamárias
IL Interleucina
Kb Quilobase
kDa Quilodalton
Kg Quilograma
MHC Complexo maior de histocompatibilidade
mL Mililitro
MRSA Staphylococcus aureus meticilina resistente
N° Número
NaCl Cloreto de Sódio
pb Pares de bases
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
pH potencial hidrogêniônico
PMN Células polimorfonucleadas
pvl Gene codificador da leucocidina panton-valentine
PVL Leucocidina Panton – Valentine
SAgs superantígenos bacterianos
SE enterotoxinas estafilocócicas
xiii
SEl Toxina semelhante a enterotoxina estafilocócica
TCR Receptor de células T
TNF Fator de necrose tumoral
TSS Síndrome do choque tóxico
TSST -1 Toxina da Síndrome do choque tóxico
tst Gene codificador da toxina da síndrome do choque tóxico
US$ dólar americano
x g Força centrípeta
α Alfa
β Beta
ηg/µL Nanograma por microlitro
ηm Nanômetros
xiv
RESUMO
Staphylococcus aureus é capaz de produzir uma grande variedade de fatores de virulência associados à parede bacteriana ou secretados, entre eles as exotoxinas. Sua patogenicidade para o úbere bovino não está completamente elucidada, mas as exotoxinas estafilocócicas e suas combinações podem desempenhar papel no potencial patogênico do microrganismo. Levando em consideração que o conhecimento dos fatores de virulência de S. aureus fornece informações importantes para o estabelecimento de estratégias efetivas de controle de infecções intramamárias, objetivou-se detectar o DNA de S. aureus isolados de leite provenientes de vacas com mastite clínica ou subclínica e identificar genes codificadores de superantígenos bacterianos e exotoxinas. Para tanto, no presente estudo foram utilizados 55 isolados de S. aureus, obtidos a partir de amostras de leite provenientes de vacas com mastite clínica ou subclínica. Os isolados foram identificados eletrônicamente a partir da metodologia descrita pelo manual do equipamento Vitek 2®. O DNA genômico extraído utilizando o High Pure PCR Template Preparation Kit. As análises laboratoriais de detecção da espécie e dos genes codificadores das exotoxinas foram realizadas no Laboratório de Especialidades Biológicas do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (LEB/CPA/EVZ/UFG). Detectou-se o gene eta em 85,5% dos isolados, o gene pvl em 63,6% e o gene tst em 14,5%. O gene etb não foi isolados. Verificou-se que a técnica de PCR em tempo real para detecção do gene sodA, mostrou-se eficaz na identificação da espécie S. aureus, podendo se tornar uma ferramenta importante no diagnóstico dos microrganismos causadores de mastites bovinas. Os isolados de S. aureus de mastite carream genes de exotoxinas, como pvl, tst e eta, sendo que este último pode ter um papel importante na patogênese de mastites bovinas, visto que a maioria dos isolados se mostraram positivos para a sua presença.
Palavras-chave: Staphylococcus aureus, mastite, PCR em tempo real,
fatores de virulência
xv
ABSTRACT
Staphylococcus aureus can produce a wide variety of virulence factors secreted or associated with bacterial wall, among them the exotoxins. The pathogenicity of S. aureus to the bovine udder is not quite clarified, but the staphylococcal exotoxins and their combinations may play a role in the pathogenic potential of the microorganism. Considering that knowing the virulence factors of S. aureus provides an important information of the establishment of effective control strategies of intramammary infections we aimed to detect the DNA of S. aureus isolates from milk of cows with clinical or subclinical mastitis and identify genes encoding bacterial exotoxins and superantigens. For this purpose, in the present study were used 55 isolates of S. aureus, obtained from milk samples from cows with clinical or subclinical mastitis. The isolates were electronically identified using the methodology described by Vitek 2® device manual. Genomic DNA extracted using the High Pure PCR Template Preparation Kit. The laboratory analysis for detection of species and genes encoding the exotoxins were performed at the Laboratório de Especialidades Biológicas of Centro de Pesquisa em Alimentos of Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (LEB/CPA/EVZ/UFG). The gene eta was detected in 85,5% of the isolates, the pvl gene in 63,6% and the tst gene in 14,5%. The etb gene was not isolated. It was verified that the Real Time PCR technique for detection of sodA gene proved to be effective in identifying the species S. aureus, and may become an important tool in the diagnosis of the bovine mastits causing microorganisms. The isolates of S. aureus mastitis harbor genes exotoxins, such as pvl, tst and eta, which the last one may play an important role in the pathogenesis of bovine mastitis since the majority of the isolates showed to be positive for its presence.
Key words: Staphylococcus aureus, mastitis, real time PCR, virulence factors
1. Introdução
No ano de 2010 o Brasil foi classificado como o quinto maior produtor
de leite no mundo, com uma produção de mais de 31 milhões de toneladas de
leite, representando 5,3% da produção mundial (FAO, 2010), com produtividade
média de 1,70 mil Kg de leite/ vaca (USDA, 2012). O Estado de Goiás, nesse
mesmo ano, teve a quarta maior produção de leite no país, com um total de
3.193.713 mil litros produzidos, ficando atrás de Minas Gerais (8.388.039 mil
litros), Rio Grande do Sul (3.663.834 mil litros) e Paraná (3.595.775 mil litros),
representando 10,4% da produção do país e 72% da produção da Região Centro-
Oeste (IBGE, 2010).
De acordo com as projeções do agronegócio brasileiro, entre os anos
de 2012/2013 e 2022/2023, realizadas pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA), o leite foi considerado um dos produtos com maiores
possibilidades de crescimento, com uma taxa anual de 1,9%, correspondendo a
uma produção de 41,3 bilhões de litros de leite cru ao final do período das
projeções. O consumo de leite também deverá crescer à mesma taxa anual da
produção de leite do país (1,9%), mas como o consumo deverá estar em um nível
acima da produção, será necessário aumento do volume de importação ou
implantação de políticas públicas específicas para incentivar um maior
desenvolvimento do setor (BRASIL, 2013).
Levando em conta a importância da matéria-prima (leite) tanto para a
economia como para a indústria e consumidores, o MAPA editou a Instrução
Normativa de n° 51, de 2002, que estabeleceu parâmetros para avaliação da
qualidade do leite cru, como a contagem bacteriana total, contagem de células
somáticas, determinação da composição centesimal e de resíduos de
antimicrobianos em leite (BRASIL, 2002). Tais parâmetros foram escolhidos com
o intuito de se tornarem ferramentas indispensáveis na produção, beneficiamento
e industrialização, uma vez que fornecem informações relacionadas à qualidade
do leite, englobando a sanidade da glândula mamária, condições higiênicas de
obtenção do leite, valor nutricional, além de outros.
Na medicina veterinária a mastite bovina é considerada a doença de
maior ocorrência e importância econômica na atividade leiteira, acarretando
Aos meus pais,
Olívia e Marcius, e às minhas
irmãs, Mônica e Cláudia, por
estarem sempre ao meu lado
e me completarem.
2
graves prejuízos decorrentes principalmente da diminuição da produção láctea,
comprometimento na qualidade do leite e até da perda total da capacidade
secretora da glândula mamária (NADER FILHO et al., 2007; KOSKINEN, 2009).
Os prejuízos causados pela mastite bovina incluem os custos de diagnóstico
microbiológico, medicamentos, mão de obra, descarte de leite, entre outros
(SANTOS et al., 2011). Ao calcular o ICP/Leite do ano de 2012, índice que mede
a variação no custo de produção do leite, a Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA), reportou que mais de 36% dos custos da produção
está relacionado à sanidade do rebanho e à qualidade do leite, percentual
considerado alto quando comparado com mão-de-obra (14,01%) e produção e
compra de volumosos (9,87%) (BRASIL, 2012).
A mastite bovina pode ser causada por inúmeros microrganismos, mas
o patógeno Staphylococcus aureus é considerado o agente de maior importância
e de maior ocorrência nos rebanhos mundiais, sendo frequentemente isolado em
amostras de leite cru (NADER FILHO et al., 2007). Este patógeno é causador de
mastite do tipo contagiosa, sendo comumente disseminado de vacas infectadas
para vacas sadias durante a ordenha (MICHEL et al., 2011).
O S. aureus, microrganismo do gênero Staphylococcus spp., é capaz
de sobreviver como comensal da pele, membranas mucosas, fossas nasais e
outros sítios anatômicos de humanos e animais. Pode estar associado a
infecções em hospedeiros de forma localizada ou sistêmica, comumente
associado a infecções recorrentes, sendo assim, considerado um patógeno
importante tanto para a medicina humana quanto para a veterinária. Em animais
domésticos, o S. aureus está envolvido principalmente em infecções
intramamárias de fêmeas de produção leiteira, principalmente na forma subclínica
(SUTRA & POUTREL, 1993).
O potencial de virulência dos diferentes isolados de S. aureus é
determinado pela presença ou ausência de genes de fatores de virulência, como
genes que codificam enterotoxinas estafilocócicas, leucocidinas, exfoliatinas,
hemolisinas e outras exotoxinas (SPANU et al., 2012). Essas exotoxinas são
responsáveis por intoxicações alimentares e outros tipos de infecções em
humanos e animais. Sua função principal é inibir a resposta imunológica do
hospedeiro ao S. aureus contribuindo com a patogênese da doença, bem como
3
no desenvolvimento da enterotoxemia resultado da ingestão de toxinas
termoestáveis. Esses fatores de virulência podem ser produzidos tanto por
isolados de S. aureus de leite de vacas com mastite clínica como na forma
subclínica (ARGUDIN et al., 2010). A produção dos fatores de virulência está
envolvida com a patogenicidade do microrganismo, uma vez que contribui para a
invasão tecidual e para a resistência a determinados antibióticos.
Dessa forma, conhecer parte do perfil molecular dos isolados
causadores de mastite e sua distribuição assume papel fundamental no
entendimento dos mecanismos de instalação das infecções intramamárias,
auxiliando a elaboração de estratégias de controle e prevenção da mastite bovina.
4
2. Revisão de Literatura
2.1 Mastite por Staphylococcus aureus
A mastite, ou inflamação intramamária (IIM) ocorre quando um agente
infeccioso, químico, mecânico ou térmico, acomete a glândula mamária,
produzindo uma reação inflamatória e danos ao tecido glandular (FAGUNDES &
OLIVEIRA, 2004). A enfermidade em bovinos pode ser causada por
aproximadamente 137 espécies de microrganismos pertencentes a 35 gêneros,
sendo a bactéria com maior prevalência e de principal relevância é S. aureus, o
qual sua contaminação e disseminação ocorrem durante a ordenha, com o úbere
a principal fonte de infecção, sendo assim, um microrganismo causador de
mastites contagiosas (CAPURRO et al., 2010; MICHEL et al., 2011, KEEFE,
2012).
Uma vez que o reservatório primário da infecção é o gado infectado, o
foco de controle está relacionado à biossegurança do rebanho. O controle de
agentes patogênicos contagiosos é realizado pela diminuição de novas infecções
e redução do reservatório da infecção no rebanho. Rebanhos devem ser fechados
ou ter protocolos de biossegurança rigorosos para prevenir a introdução de novas
estirpes de patógenos causadores de mastite contagiosa. De acordo com KEEFE
(2012), os procedimentos de desinfecção dos tetos nos intervalos de pré e pós –
ordenha e a terapia da vaca seca auxiliam na diminuição da prevalência de
mastite. Há evidências de que a utilização de luvas de ordenha é uma parte
integrante do controle de mastite contagiosa e para a produção de leite de alta
qualidade.
O National Mastitis Council – Estados Unidos (NMC) enumera 10
princípios básicos para o controle de mastite: (1) estabelecimento de metas para
a saúde do úbere, (2) a manutenção de um ambiente limpo, seco e confortável,
(3) procedimentos adequados de ordenha, (4) manutenção e uso adequado dos
equipamentos de ordenha, (5) boa manutenção dos registros, (6) apropriado
manejo de mastite clínica durante a lactação, (7) manejo eficaz da vaca seca, (8)
manutenção da biossegurança para patógenos contagiosos e para
comercialização de vacas cronicamente infectadas, (9) o acompanhamento
5
regular do estado de saúde do úbere, (10) revisão periódica do programa de
controle de mastite (KEEFE, 2012).
S. aureus é reconhecido mundialmente como um dos principais
patógenos causadores de mastite em vacas leiteiras, possuindo grande
importância econômica em fazendas leiteiras, sobretudo devido à diminuição da
qualidade do leite e da produção. É o responsável por mais de 80% de casos de
mastite subclínica bovina, o que pode resultar em perda de aproximadamente
US$300,00 por animal (KARAHAN et al., 2009). Os prejuízos causados pela
mastite incluem os custos de diagnóstico microbiológico, medicamentos, mão de
obra, descarte de leite, redução da produção de leite em razão da mastite clínica
e subclínica, descarte do animal ou perda do quarto, e risco de transmissão da
infecção para outras vacas, além do risco de transmissão em alimentos
(SANTOS et al., 2011, KEFEE, 2012).
S. aureus produz uma grande variedade de fatores de virulência,
associados à parede bacteriana ou secretados, entre eles incluem-se toxinas
superantigênicas, enzimas, citotoxinas, exotoxinas e toxinas esfoliativas, que
possuem como função principal transformar os componentes do hospedeiro em
nutrientes para o crescimento bacteriano. Contribuem com a patogenicidade e
são responsáveis pelos sintomas e severidade das infecções subclínicas e
crônicas (SRINIVASAN et al., 2006; L-SUNG et al., 2008; HWANG et al., 2010;
PINCHUK et al., 2010; SANTANA et al., 2010; FUSCO et al., 2011;
VASCONCELOS et al., 2011).
A patogenicidade de S. aureus para o úbere bovino não está
completamente elucidada, mas as exotoxinas estafilocócicas secretadas e suas
combinações podem desempenhar papel no potencial patogênico do
microrganismo (HAVERI et al., 2007).
S. aureus é capaz de produzir diversos fatores de virulência e toxinas
extracelulares que podem contribuir na patogenicidade de mastites subclínicas e
clínicas de vacas e pequenos ruminantes. As técnicas de análise moleculares
permitem a identificação de cepas com potencial para produção de determinadas
toxinas, já que nem sempre são expressas, permitindo a detecção de genes de
fatores de virulência de maneira rápida e confiável, com alta sensibilidade e
especificidade (SANTANA et al., 2010; VASCONCELOS et al., 2011). Muitos
6
estudos foram conduzidos com o intuito de identificar, por meio do diagnóstico
molecular, os genes codificadores de exotoxinas (SRINIVASAN et al., 2006;
UNAL et al., 2012).
2.2 Staphylococcus aureus
S. aureus, pertencente ao gênero Staphylococcus, é uma bactéria
esférica do grupo de cocos Gram – positivos, apresenta-se de diversas formas,
isolados, aos pares, em cadeias curtas ou agrupados irregularmente, como um
cacho de uva. Em geral, é considerado não encapsulado. É um microrganismo
com dimensões de 0,5 a 1,5µm de diâmetro, imóvel e não esporulado. Pode ser
aeróbio ou microaerófilo, quando sobrevive em baixas concentrações de oxigênio.
Produz a enzima catalase, permitindo degradar o peróxido de hidrogênio
(SNEATH et al., 1986; ROOIJAKKERS et al., 2005; SANTOS et al., 2007; SILVA
et al., 2007).
A identificação da espécie é baseada na variedade das características
fenotípicas, incluindo composição da parede celular, morfologia da colônia,
atividade e propriedades moleculares de enzimas, fermentação de carboidratos,
resistência à concentração de sal (NaCl), produtos do metabolismo da glicose,
resistência a certos antibióticos, requerimentos nutricionais e gás oxigênio, entre
outras (SNEATH et al., 1986; SANTOS et al., 2007).
É capaz de formar colônias amarelas em meio enriquecido além de
produzir α e ß-hemólise em placas de ágar sangue desfibrinado de carneiro a
5% (PINCHUK et al., 2010). É classificado como mesófilo, e possui temperatura
de crescimento que varia de 7 a 47,8°C. O pH ideal para desenvolvimento é de
7,0 a 7,5, mas é possível o crescimento microbiano em alimentos com pH de 4,2
a 9,3. Em relação à concentração de sódio, microrganismos do gênero
Staphylococcus tem a capacidade de sobreviver e multiplicar em concentrações
de até 15%. O valor mínimo de atividade de água é de 0,86 (SANTANA et al.,
2010). Possui a capacidade de fermentar lentamente muitos carboidratos,
produzindo ácido láctico, mas não produz gás (SANTOS et al., 2007; SILVA et
al., 2007). Apesar de possuir crescimento em meios comuns, como ágar e caldo
simples, em pH 7,0 e temperatura ótima de 37°C, a incubação de amostras em
7
ágar Baird Parker é um meio diagnóstico para a espécie, no entanto, para
isolamento em amostras clínicas como sangue, pus e fluidos, a primeira
inoculação deve ser feita em ágar sangue desfibrinado de carneiro a 5% a
temperatura de 37°C por 18 a 24 horas em condições aeróbias (SNEATH et al.,
1986; SANTOS et al., 2007; SILVA et al., 2007).
O microrganismo pode existir como um comensal do organismo
humano, integrando a microbiota da pele, de membranas mucosas e de outros
sítios anatômicos (ROOIJAKKERS et al., 2005; SANTOS et al., 2007). Também
é encontrado nas fossas nasais de pessoas saudáveis. Segundo KIM et al.,
(2012), 20 a 30% da população humana alberga o microrganismo na pele e vias
aéreas. Segundo FOSTER (2009), os hospedeiros colonizados pelo S. aureus
nas vias respiratórias de forma assintomática são os principais reservatórios do
patógeno.
É um patógeno associado a infecções adquiridas tanto no ambiente
doméstico como no ambiente hospitalar, também chamado nosocomial (FOSTER,
2009; SINHA & FRAUNHOLZ, 2010). O microrganismo pode sobreviver em
tecidos e sangue, provocando infecções de simples resolução até casos mais
graves da doença (ROOIJAKKERS et al., 2005; SANTOS et al., 2007). Alguns
microrganismos podem ser isolados de vários produtos de origem animal, tais
como carne, leite e derivados, e fontes ambientais, como ar, poeira e água.
(SNEATH et al., 1986).
S. aureus é considerado um dos principais patógenos humanos, mas
também está associado com uma variedade de doenças animais. Análises da
distribuição genotípica de cepas de S. aureus de origens diversas demonstrou
certa especificidade do hospedeiro, sugerindo a ocorrência de algumas linhagens
estafilocócicas restritas aos animais (L-SUNG et al., 2008; BYSTRÓN et al.,
2010). Assim, S. aureus associado à pecuária pode ser uma fonte subestimada
de cepas patogênicas. É capaz de causar e desenvolver infecção de forma bem
eficiente devido a sua capacidade de produzir alguns fatores de virulência e ainda
pela facilidade de obter resistência a antimicrobianos (NAKONIECZNA et al.,
2010). Sua virulência depende de uma grande variedade de fatores,
principalmente, proteínas extracelulares, como enzimas e exotoxinas, que
contribuem no desencadeamento da doença.
8
Cepas de S. aureus podem albergar diferentes genes de virulência que
codificam enterotoxinas estafilococicas (SEs), leucocidinas, esfoliatinas,
hemolisinas, toxinas da síndrome do choque tóxico 1(TSST-1) e alelos do gene
acessório regulador (agr), sendo que a presença ou ausência desses genes é
essencial para determinar o potencial de virulência das cepas. O padrão dos
genes de virulência e do polimorfismo genético pode ser usado para determinar o
“biovar” e a relação com a origem dos isolados (SPANU et al., 2012). Cada
linhagem de S. aureus tem uma única combinação de proteínas de superfície e
reguladores, chamados genes variáveis centrais (CV), e correspondem aos
complexos clonais (CCs), resultando em múltiplos recombinantes de genes CV
entre as linhagens. Além disso, todas as cepas são portadoras de uma variedade
de elementos genéticos móveis (MGE) que codificam genes de resistência e
virulência, e há muita variação dentro das linhagens, indicando frequente
transferência horizontal. (L-SUNG et al., 2008).
Dentre os vários fatores de virulência, S. aureus produz enzimas
responsáveis pela resistência contra o estresse oxidativo, como catalase e a
superóxido dismutase (Sod). As enzimas superóxido-dismutases são
metaloproteínas que catalisam a dismutação do oxigênio, a primeira produção de
ROS mediante a redução do oxigênio (KARAVOLOS et al., 2003). Tais enzimas
são capazes de converter o ânion superóxido (O2-) em peróxido de hidrogênio
(H2O2), um oxidante biológico menos potente que, posteriormente, é decomposto
pela catalase em água e oxigênio. A enzima Sod é produzida em resposta às
espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas de maneira endógenas como um
efeito do metabolismo do oxigênio, ou, exogeneamente produzido por neutrófilos
e macrófagos (NAKONIECZNA et al., 2010).
S. aureus tem dois genes codificadores de Sod, sodA e sodM
(KARAVOLOS et al., 2003; BALLAL & MANNA, 2009). Os produtos desses genes
combinam e formam três zonas ativas de Sod, dois homodímeros e um
heterodímero. Em estudos in vitro, o homodímero sodA é responsável pela
maioria dos efeitos da atividade de Sod pelo S. aureus
Entre os fatores que contribuem para a virulência deste patógeno, a
resistência a antibióticos possui um importante papel. Cepas de S. aureus podem
9
ser caracterizadas como resistentes a uma única ou a várias drogas,
representando a principal ameaça para a saúde pública, como é o exemplo das
cepas de Staphylococcus aureus meticilina-resistentes (MRSA) (SPANU et al.,
2012), patógeno importante na medicina humana, mas que também pode
colonizar e causar infecções em várias espécies animais (FEBLER et al., 2010).
Em relação ao MRSA, este é um assunto de importância para a saúde pública, já
que a cepa MRSA encontrada em bovinos parece agir de maneira similar de
outras cepas (KEFEE, 2012).
O uso generalizado de antibióticos em animais pode levar a seleção e
a resistência antimicrobiana por cepas bacterianas. A detecção de patógenos
resistentes a antibióticos, especialmente aqueles resistentes a meticilina, é
importante não somente para fins terapêuticos, mas também para monitorar a
propagação de cepas resistentes (UNAL et al., 2012). O genótipo bacteriano
também pode afetar a capacidade de espécies e estirpes em adquirir resistência,
influenciando na habilidade da bactéria em adquirir genes de resistência através
da transferência horizontal (BARLOW et al., 2011).
A identificação de S. aureus por PCR tem sido amplamente estudada,
principalmente por este ser um microrganismo importante tanto para medicina
humana quanto para medicina veterinária. Este patógeno causa enfermidades em
diversas espécies animais de difícil cura, sobretudo em decorrência a alta
resistência a antimicrobianos. Os principais genes que são utilizados como
sequência alvo para iniciadores específicos para identificação de S. aureus são:
nuc, femA, 16S rRNA, 23S rRNA, Sa442, entre outros. Todos esses alvos
genéticos permitem uma rápida identificação da espécie com alta sensitividade e
especificidade (MARTINEAU et al., 1998; ANNEMUELLER et al., 1999;
AKINEDEN et al., 2001; STEPHAN et al., 2001; THOMAS et al., 2007; UL-
HASSAN et al., 2008; ZAFALON et al., 2009; KILIC & BASUSTAOGLU, 2011;
PILLA et al., 2013). No presente estudo foi utilizado o gene sodA
Atualmente a cultura bacteriana é o método de referência para a
identificação dos microrganismos causadores de mastite em amostras de leite
cru, porém esta técnica possui algumas limitações, como a demora na liberação
dos resultados, sendo superior a 48 horas em média, e casos de análises no qual
não ocorre o crescimento bacteriano, devido a muitas causas, como concentração
10
pequena de patógeno, presença de substâncias endógenas inibitórias no leite que
diminui a viabilidade do crescimento bacteriano, entre outras (KOSKINEN et al.,
2010).
A técnica da PCR em tempo real tem sido importante para muitas
aplicações em testes clínicos. Esta técnica apresenta as vantagens sobre o
método bacteriológico convencional para o diagnóstico dos patógenos das IIMs,
como rapidez, objetividade e automação dos resultados, bem como alta
sensibilidade na detecção bacteriana. O teste da PCR em tempo real é uma
técnica muito promissora como complemento de métodos tradicionais de
diagnóstico de mastite (KOSKINEN et al., 2010; ZAKARY et al., 2011).
2.3 Exoproteínas
S. aureus é produtor de diversos fatores de virulência, dentre eles as
proteínas extracelulares, ou exoproteínas, que auxiliam na patogenicidade em
infecções em organismos humano e animal além de serem responsáveis por
surtos de intoxicação alimentar (UNAL et al., 2012). As exotoxinas são
representadas por enzimas e citocinas como as hemolisinas, nucleases,
proteases, lípases, leucocidinas, hialuronidases e colagenases. Alguns
microrganismos ainda são capazes de produzirem enterotoxinas estafilocócicas
(SEs), toxinas esfoliativas (ETs) e toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1)
(BALABAN & RASSOLY, 2000; UNAL et al., 2012).
As principais funções das exotoxinas são: mediar aderência do
microrganismo ao tecido lesionado, a matriz tecidual ou à superfície das células
do hospedeiro; facilitar a destruição tecidual e a disseminação do microrganismo;
promover a captura do ferro; auxiliar na evasão de anticorpos e respostas imunes
mediadas pelo sistema complemento, incluindo a ação dos fagócitos; e promover
lise da célula do hospedeiro, além da inibição da resposta imune frente ao S.
aureus, contribuindo na patogênese da mastite bovina (GRUMANN et al., 2013).
Sabe-se que S. aureus isolados de mastite clínica ou subclínica podem produzir
enterotoxinas termoestáveis, responsáveis pelo desenvolvimento de
11
enterotoxemia devido a ingestão destas, inclusive em leite pasteurizado (BARRIO
et al., 2006; ARGUDIN et al. 2010; UNAL et al., 2012).
2.3.1 Superantígenos Estafilocócicos
Superantígenos bacterianos (SAgs) são proteínas secretadas com
peso molecular entre 22 e 29 kDa. São considerados potentes estimuladores de
células imunes, as quais possuem a função principal de ativação de elevados
números de células T de uma maneira não convencional (McCORMICK et al.,
2001; KAPPLER et al.,1989; VAISHNANI, 2009; XU & McCORMICK, 2012). Os
fatores de virulência e os SAgs podem ser considerados um agente importante na
patogênese da mastite bovina, uma vez que esses são capazes de deprimir as
atividades bactericidas das células polimorfonucleadas (PMNs), principais células
de defesa do sistema imunológico contra patógenos invasores, levando a
infecções crônicas e persistentes (MULLARKY et al., 2001; HAVERI et al., 2007;
FIJALKOWSKI et al., 2012).
Os SAgs podem ser produzidos por bactérias, vírus e micoplasmas,
sendo encontrados principalmente em S. aureus e Streptococcus pyogenes, mas
também podem ser observadas em algumas outras espécies ß-hemolíticas de
Streptococcus, Staphylococcus coagulase negativos, Mycoplasmas arthritidis e
Yersínia pseudotuberculosis (XU & McCORMICK, 2012). Os SAgs incluem as
SEs, as proteínas semelhantes à enterotoxinas (SEIs) e a TSST-1 (LINA et al.,
2004; XU & McCORMICK, 2012).
O sistema imune humano é capaz de reconhecer e delimitar patógenos
e seus antígenos, entretanto SAgs representam os únicos fatores de virulência
conhecidos que possuem como papel principal a ativação do sistema imune
adquirido e ainda são um dos mais potentes mitógenos de células T humanas;
sendo considerado um contrassenso devido aos inúmeros fatores de virulência de
S. aureus com funções designadas para a subversão e evasão imune
(VAISHNANI, 2009; XU & McCORMICK, 2012). Os SAgs, apesar de não
possuírem atividade direta na fagocitose, são capazes de estimular seletivamente
a morte de neutrófilos, aumentando em até 30% a atividade de linfócitos T
12
(SCHUBERTH et al., 2000; FIJALKOWSKI et al., 2012). Muito pouco se sabe
sobre a importância dos SAgs na patogênese das IIMs bovinas, porém mais de
60-70% dos isolados de S. aureus de origem bovina produzem toxinas ou
carreiam os respectivos genes (HAVERI et al., 2007).
Os genes de SAg podem existir em diferentes tipos de elementos
genéticos móveis como fagos, plasmídeos ou clusters, denominados ilhas de
patogenicidade (SaPI), como por exemplo o locus egc. Genes de virulência ou
elementos gênicos podem, também, estar associados a determinantes de
resistência e hipervirulência (HAVERI et al., 2007).
2.3.1.1 Toxina da Síndrome do Choque Tóxico
A toxina da síndrome do choque tóxico -1 (TSST-1) é reconhecida
como a principal causa de síndrome do choque tóxico (TSS), caracterizada por
febre, hipotensão, congestão de múltiplos órgãos e choque em humanos
(BERGDOLL et al., 1981; TAKEUCHI et al., 1998; LERICHE et al., 2012). A
toxina possui muitas propriedades biológicas em comum com outras exotoxinas
pirogênicas, incluindo a habilidade de induzir febre, de aumentar o choque
endotóxico, estimular a proliferação não específica das células T, e em induzir a
liberação de IL-1 e TNF- α (TAKEUCHI et al., 1998).
A TSS foi primeiramente relatada em 1978, por TODD et al. (1978)
associada com uma doença sistêmica não invasiva de S. aureus em crianças e
adolescentes (SCHLIEVERT et al., 1981; DINGES et al., 2000; KIMBER et al.,
2013). No início dos anos 80 uma epidemia de TSS ocorreu nos Estados Unidos
em mulheres jovens. Quase todos os casos de TSS foram associados com
menstruação, uso de tampões e colonização vaginal ou cervical de S. aureus.
TSST-1 foi a primeira toxina identificada como causadora de TSS, e esta toxina é
aceita como a causa de 100% dos casos de TSS associados com menstruação,
já que em estudos prévios de casos de TSS, não foi observado bacteremia,
sugerindo que a TSS fosse ocasionada por intoxicação por produtos previamente
elaborados por S. aureus (SCHLIEVERT et al., 1981; BERGDOLL &
SCHLIEVERT, 1984; DINGES et al., 2000).
13
A TSS pode ser dividida em duas formas: menstrual (mTSS) e não
menstrual (nmTSS) (LAPIN & FERGUSON, 2009; LERICHE et al., 2012), esta
resultado de uma infecção estafilocócica inicial ou pela colonização por cepas S.
aureus produtoras de toxinas. Pode ocorrer após lesão da pele ou membrana
mucosa, em associação com abscessos, ou até mesmo após procedimentos
cirúrgicos, embora nenhuma fonte de infecção foi confirmada (LAPIN &
FERGUSON, 2009). De acordo com o Centre for Disease Control and Prevention
(CDC), nos Estados Unidos, foram estabelecidos cinco critérios para determinar o
estabelecimento da TSS em um paciente, sendo que um caso positivo é aquele
que atende os cinco critérios, e caso provável é aquele com quatro critérios. Os
critérios são: febre acima de 38,9°C; eritema macular difuso; descamação após
uma a duas semanas do aparecimento do eritema; hipotensão; e
comprometimento múltiplo dos órgãos (CDC, 2011; LERICHE et al., 2012).
A TSST-1 atua como um SAg, no qual a toxina possui a habilidade de
ativar excessivamente e de forma não convencional células T e inibindo,
consequentemente, a ativação de outras células, além de estimular a liberação de
citocinas e quimiocinas. Os SAgs identificados são proteínas de cadeia única
expressas como moléculas precursoras, que após passarem por clivagens,
liberam a toxina extracelular funcional. A TSST-1 é capaz de formar uma ponte
entre o TCR e as moléculas de MHC II, sem que estes dois componentes do
sistema imune do hospedeiro se interajam diretamente, compondo uma interação
similar á interação convencional TCR-MHC II, tornando um ativador celular
potente (LAPIN & FERGUSON, 2009).
A TSST-1 é codificada pelo gene tst presente no cromossomo
bacteriano em um elemento genético móvel de 15,2 kb conhecido como ilha de
patogenicidade 1 (DINGES et al., 2000). A proteína é formada por um polipeptídio
de cadeia única com peso molecular igual a 22 kDa e um ponto isoelétrico de 7,2.
Possui uma alta porcentagem de aminoácidos hidrofóbicos, mas é altamente
solúvel em água. A toxina é resistente ao calor e proteólise, ficando estável e não
alterando sua atividade biológica mesmo após permanecer uma hora em ebulição
ou após exposição prolongada à tripsina (DINGES et al., 2000). O gene tst, que
codifica o SAg TSST-1 é comumente encontrado em S. aureus isolados de
14
mastites bovinas, geralmente associado com as enterotoxinas SEC e SEB
(PETON & LELOIR, 2013).
A presença do gene tst está associada com alguns genes para
enterotoxinas, como o gene para enterotoxina J, enterotoxina G, e,
principalmente, o gene para enterotoxina C (sec). Nos estudos de AKINEDEN et
al. (2001) e STEPHAN et al. (2001), realizado com 103 e 34 isolados de S. aureus
de leite de vacas com mastite bovina, respectivamente, os autores verificaram
que todos os isolados positivos para a presença do gene tst, foram também
positivos para o gene sec. Contudo, GUNAYDIN et al. (2011), identificaram que
apenas um dos sete isolados de S. aureus que carreava o gene tst estava
associado a presença do gene sec. A presença do gene tst associado com gene
para as enterotoxinas estafilocócicas indica a possibilidade do gene estar
associado com o aumento da patogenicidade dos isolados, bem como com a
patogênese da mastite (KARAHAN et al., 2009).
2.3.2 Toxinas Esfoliativas
As toxinas esfoliativas (ETs) são fatores de virulência secretados de S.
aureus. São isoformas de enzimas de serina-proteases que possuem alta
especificidade pelo substrato, e tem a função de clivar caderinas desmossomais
nas camadas da pele, facilitando a invasão bacteriana neste órgão, tornando-se
responsáveis pelas manifestações clínicas da doença em humanos denominada
de Síndrome Estafilocócica da Pele Escaldada (SSSS - Staphylococcal Scalded
Skin Syndrome) (BUKOWSKI et al., 2010; GRUMANN et al., 2013). As ETs,
quando estão purificadas, possuem peso molecular de aproximadamente 30 kDa,
e são divididas em três, ETA, ETB e ETD (BUKOWSKI et al., 2010).
Os mecanismos de ação das ETs são incertos, no entanto uma teoria
sobre o modo de ação da toxina foi desenvolvida simultaneamente com os
esforços de demonstrar sua atividade proteolítica. Baseado na informação de
outras toxinas estafilocócicas, foi proposto que as ETs funcionassem como
superantígenos, porém os resultados iniciais em relação a atividade
superantigênica de ETs foram confusas e contraditórias (VAISHNANI, 2009;
BUKOWSKI et al., 2010). Alguns estudos indicaram que ETs são superantígenos,
15
e que as atividades mitogênicas são independentes da atividade proteolítica, no
entanto as duas toxinas demonstraram ter efeitos menores que os SAgs clássicos
(MONDAY et al., 1999; BUKOWSKI et al., 2010).
Pelo fato das lesões de SSSS não demonstrarem evidências de
recrutamento de células, é presumido que a superantigenicidade das ETs não
está envolvida na patogênese da doença, uma vez que é sugerido que a atividade
proteolítica independe da atividade mitogênica. Com isso, a atividade proteolítica
das ETs parece ser responsável pela exfoliação da pele na SSSS, no entanto a
atividade mitogênica não está associada com as manifestações da doença,
podendo ter atuação fisiológica ou ser observada em condições particulares de
experimentos (BUKOWSKI et al., 2010).
As ETs são exotoxinas altamente espécie-específicas, assim como
algumas cepas de S. aureus. A adaptação da atividade das ETs de acordo com
as diferentes estruturas das desmogleínas, proteínas alvo das ETs, de cada
espécie indica a transferência horizontal e troca de genes entre cepas, permitindo
assim a troca de hospedeiros. Tal transferência é possível devido ao fato da
localização dos genes de ETs ser em elementos genéticos móveis, já que o gene
codificador de ETA é um fago, denominado ΦETA; o gene de ETB, etb, é
codificado por plasmídeo, o pETB, codificador de outros genes de fatores de
virulência, e o gene de ETD está localizado em ilhas genômicas (BUKOWSKI et
al., 2010, GRUMANN et al., 2013).
2.3.3 Leucocidina Panton-Valentine
As leucotoxinas são uma família de proteínas “formadoras de poros”,
são proteínas com peso molecular entre 32 e 35 kDa e constituídas de duas
classes de proteínas, a classe S e a classe F, codificadas por genes do núcleo do
genoma, o core-genoma, ou por fagos, podendo ser adquiridos por transferência
horizontal. A subunidade S tem como função se ligar à célula do hospedeiro,
ativando assim a sua junção a cadeia F, facilitando a formação de ligações
hexaédricas ou octaédricas, motivando ações biológicas, como a elaboração de
uma estrutura em forma de poro (BARRIO et al., 2006; GRUMANN et al., 2013;
YOONG & TORRES, 2013). A associação da leucocidina à célula alvo
16
desencadeia a formação de canais de cálcio e de poros transmembrana
permeáveis à íons monovalentes, levando a destruição celular (PRÉVOST et al.,
2001; BARRIO et al., 2006). Foram descritas cinco classes das subunidades F
(HlgB, LukF-PV, LukD, LukF’-PV e LukG) e seis classes de subunidades S (HlgA,
HlgC, LukSPV, LukE, LukM e LukH) (GRUMANN et al., 2013).
Estão relacionadas à eventos de lise de células da linhagem mielóide
(monócitos, macrófagos e neutrófilos), mas também possuem ação citotóxica em
células como eritrócitos, trombócitos e linfócitos, sendo prováveis responsáveis
por interferir na defesa imune. São consideradas toxinas importantes para a
evasão de S. aureus ao sistema imune. Além disso, leucotoxinas são capazes de
induzir fagócitos a liberarem grande quantidade de mediadores inflamatórios e
levar a sua degranulação (SIQUEIRA et al., 1997; BARRIO et al., 2006;
VENTURA et al., 2010; DUMONT et al., 2011; FIJAKOWSKI et al., 2012;
GRUMANN et al., 2013; YOONG & TORRES, 2013).
Apresentam distribuição epidemiológica e associação com doença
clínica em humanos ou em mastites em bovinos leiteiros. Isolados de S. aureus
produtores de Leucocidina Panton-Valentine (PVL) estão associadas com casos
de piodermites e pneumonias necrosantes. A leucocidina LukE/D foi relatada em
isolados de diarreia, após tratamento com antibióticos. Já os genes LukM/LukF’-
PV foram encontrados em isolados de mastite de ruminantes (PRÉVOST et al.,
2001; RAINARD et al., 2003; FUEYO et al., 2005; BARRIO et al., 2006).
Em um estudo realizado por HAVERI et al. (2007), no qual foram
pesquisados genes de exotoxinas e suas combinações em isolados de S. aureus
de mastite clínica e subclínica bovina foi observada alta frequência de genes
lukED, o que indica que tais genes são importantes para a patogênese de IIMs
estafilocócicas bovina. Outros genes de leucocidinas importantes na patogenia de
mastites bovinas são os genes das leucotoxinas LukM/LukF’-PV e da c-
hemolisina (PETON & LELOIR, 2013).
Um profago variante de PVL, LukF’M, produtor da toxina lukM/lukF’ –
PV, foi identificado de isolados bovinos de S. aureus. Esta toxina é uma
leucocidina altamente citotóxica para células polimorfonucleadas (PMNs), como
neutrófilos, de bovinos, capaz de provocar a lise de tais células do organismo de
bovinos, possuindo assim papel importante na indução de mastites clinicas e
17
subclínicas. O gene lukM está presente em isolados de mastite de cabras,
ovelhas e vacas, sendo considerado mais prevalente em isolados de S. aureus
bovinos (RAINARD et al., 2003; BARRIO et al., 2006). Cepas de S. aureus que
possuem lukM em seu genoma são capazes de predominar em infecções
intramamárias persistentes, quando comparadas com cepas que não possuem tal
gene (HAVERI et al., 2007; SCHLOTTER et al., 2012; GRUMANN et al., 2013;
PETON & LELOIR, 2013).
Em estudos realizados com S. aureus isolados de mastites, o gene
lukM/lukF’-PV foi associado a ocorrência de mastite gangrenosa em cabras
leiteiras, devido à grande produção de α- hemolisina e leucocidina LukM/LukF’-PV
(RAINARD et al., 2003; LEMARECHAL et al., 2011). Entretanto, na administração
experimental da leucotoxina LukM/LukF’-PV purificada não foi observada a forma
gangrenosa da mastite em bovinos (FROMAGEAU et al., 2011), sugerindo que
para a ocorrência dos sintomas mais severos seja necessária a associação da
leucocidina com outros fatores de virulência (PETON & LELOIR, 2013).
A Leucocidina Panton-Valentine (PVL; lukF-PV + lukS-PV) está
associada com infecções recorrentes e crônicas de pele e de tecidos moles
ocasionadas por S. aureus (SSTIs – skin and soft tissue infections) -
exemplificadas por furunculoses e abscessos - doenças comuns causadas pelo
microrganismo fora do ambiente hospitalar; além de estar implicado também em
pneumonia necrosante (GRUMANN et al., 2013; SHALLCROSS et al., 2013). Esta
exotoxina produzida por S. aureus é responsável pela destruição de leucócitos e
necrose tecidual (ARGUDIN et al. 2010; UNAL et al., 2012).
Em casos de mastite bovina, a toxina PVL é capaz de formar poros nas
membranas das células, provocar mudanças pró-inflamatórias em células
mamárias, inativar o sistema imunológico, levar à degradação dos tecidos, prover
a bactéria de nutrientes necessários à multiplicação e à disseminação para novos
sítios (HAVERI et al., 2007). Outra função importante é a atividade leucocítica,
ocasionando imunossupressão nos hospedeiros (HAVERI et al., 2007).
Diante do exposto, a investigação da distribuição dos fatores de
virulência de S. aureus fornece informações importantes para estabelecimento de
estratégias efetivas de controle de infecções (HWANG et al., 2010; SANTANA et
al., 2010). Os produtos do gene associados com a especificidade do hospedeiro
18
poderiam ser alvos ideais para agentes terapêuticos visando prevenir o
carreamento e infecções em animais ou humanos, reduzindo a morbidade,
letalidade ou perdas na agricultura (L-SUNG et al., 2008).
19
3 Objetivos
3.1. Geral
Empregar a técnica de PCR em tempo real na identificação de S.
aureus isolados de amostras de leite provenientes de vacas com mastite clínica
ou subclínica, coletadas em propriedades rurais do Estado de Goiás.
3.2. Específicos
Isolar e identificar S. aureus em amostras de leite de vacas com
mastite clínica ou subclínica empregando os métodos bacteriológico
convencional e molecular
Padronizar um ensaio de PCR em tempo real para detectar S.
aureus em baixos níveis de concentração de DNA.
Empregar a técnica de PCR em tempo real na identificação do gene
sodA de isolados de S. aureus oriundos de leite de vacas com
mastite clínica ou subclínica.
Identificar genes codificadores de exotoxinas e superantígenos em
S. aureus isolados de leite de vacas com mastite clínica ou
subclínica.
20
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Microrganismos utilizados e condições de cultivo
Os 55 isolados de S. aureus utilizados nesse estudo fazem parte da
bacterioteca do Laboratório de Especialidades Biológicas do Centro de Pesquisa
em Alimentos da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de
Goiás (LEB/CPA/EVZ/UFG). Os isolados foram obtidos a partir de amostras de
leite provenientes de vacas com suspeita de mastite clínica ou subclínica oriundas
de propriedades rurais do Estado de Goiás.
O processamento das amostras, bem como o isolamento e a
identificação dos microrganismos causadores de mastite, foi realizado segundo o
manual do equipamento Vitek 2® (FIGURA 01).
FIGURA 01 – Fluxograma de análise de identificação de S. aureus em leite
Para o preparo de estoques, cada UFC foi inoculada em 150µL de
solução salina a 0,45% e, em seguida, alicotados em microtubos contendo glicerol
esterilizado e conservados a -80°C.
UFCs inoculadas no cartão Vitek 2®l
Identificação eletrônica do microrganismo
UFCs selecionadas a partir da Coloração de Gram, padrão de hemólise e morfologia
Incubação em ágar sangue desfibrinado de carneiro a 5%
Incubação a 37°C por 24 horas
Inoculação de 10µL das amostras de leite
Ágar sangue desfibrinado de carneiro a 5%
Incubação a 37°C por 24 horas
21
4.2. Detecção do DNA genômico e gene de exotoxinas de S. aureus pela
reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real
4.2.1. Extração do DNA genômico
O DNA genômico foi extraído utilizando o High Pure PCR Template
Preparation Kit® (Roche Diagnostics GmbH ®, Mannheim, Alemanha). Os isolados
criopreservados foram inoculados em 10 mL de caldo cérebro – coração (BHI -
Brain Heart Infusion) e incubados a 37°C por 18 a 24 horas. Após esse período foi
realizado o procedimento de extração em acordo com o manual do fabricante do
kit de extração.
Foram adicionados 200µL dos caldos BHI de cada amostra, em
microtubos de 1,5mL livre de nuclease e centrifugados por 5 minutos a 3.000x g.
Em seguida os pellets foram ressuspensos em 200µL de tampão fosfato-salino
(phosphate buffered saline – PBS), adicionado 5µL de lisozima e incubados em
banho-maria a temperatura de 37°C, por 15 minutos. Em seguida, foram
adicionados 200µL de solução Binding Buffer e 40µL de proteinase K
reconstituída, sendo posteriormente homogeneizados em agitador do tipo vortex e
incubados a temperatura de 70°C por 10 minutos. Adicionou-se 100µL de
isopropanol, seguido de agitação em vortex. As soluções das amostras foram
então transferidas para tubos com filtros inseridos em tubos coletores e
centrifugados a 8.000x g por 1 minuto. Os tubos coletores foram descartados,
seguindo-se as etapas de lavagem e eluição.
As etapas de lavagem foram realizadas pela adição de tampões aos
tubos coletores das amostras e subsequentes centrifugações a 8.000x g por 1
minuto e descarte dos tubos coletores. Primeiramente foram adicionados 500µL
de solução Inhibitor Removal Buffer, seguido da adição de 500µL de solução de
Wash Buffer. Após a centrifugação da segunda adição do Wash Buffer, os tubos
com filtros foram inseridos em microtubos de 1,5mL, adicionou-se 200µL da
solução Elution Buffer, centrifugou-se os microtubos por 1 minuto a 8.000x g e os
22
tubos com filtros foram descartados, finalizando os procedimentos de extração do
DNA genômico.
4.2.2. Quantificação do DNA genômico extraído
A determinação da concentração do DNA extraído foram avaliadas por
meio do equipamento Nanophotometer (Implen GmbH®,Munique, Alemanha), no
qual foi realizada a leitura espectrofotométrica nos comprimentos de onda de 260
a 280ηm em 4µL do DNA extraído de cada amostra. As amostras que tiveram
resultado de concentração de DNA de pelo menos 20ηg/µL foram selecionadas
para a realização das análises de PCR em tempo real.
4.3. PCR em tempo real
4.3.1. Análise para detecção do DNA genômico de S. aureus pelo gene
sodA
Para a realização das análises de PCR em tempo real para a detecção
do DNA genômico de S. aureus isolados de amostras de leite cru provenientes de
vacas com suspeita de mastite clínica e subclínica foram utilizados iniciadores
previamente desenhado e avaliado pelo LEB/EVZ/CPA/UFG e sintetizado pela
empresa Invitrogen®.
O par de iniciadores utilizados para a identificação de S. aureus foi
desenhado com base nas sequências de DNA genômico da cepa de referência
NCTC 8325, incluídas nos bancos de dados do GenBank (número de acesso NC_
007795.1)
QUADRO 1 - Iniciadores para amplificação do gene sodA para detecção do DNA
genômico de S. aureus
Gene Iniciadores Sequência dos nucleotídeos Fragmento alvo Inserção
sodA Forward AGCTGCACGCTTTGGTTC 180 pb
1567379
sodA Reverse CCAATGTAGTCAGGGCGTTT 1567200
23
Todos os isolados criopreservados de S. aureus obtidos de amostras
de leite provenientes de vacas com mastite clínica ou subclínica foram
submetidos à confirmação da espécie por meio da identificação do gene sodA,
codificador da proteína superóxido dismutase, empregando-se iniciadores
específicos para identificação de S. aureus. Como controle positivo foi utilizado a
cepa ATCC® 25923.
A sensibilidade analítica e o limite de detecção dos iniciadores foram
avaliados previamente por meio da realização de diluições decimais seriadas e
sucessivas do DNA de S. aureus cepa American Type Culture Collection (ATCC)
25923, a partir da diluição 100 em uma amostra com concentração de DNA igual
a 20ηg/µL. O teste de linearidade dos iniciadores foi realizado pelo software do
equipamento “Step One Plus – Real Time PCR System” da Applied Biosystems,
USA.
A análise de PCR em tempo real teve como volume final da amostra
20µL, sendo 18µL da solução de Master Mix (KAPA SYBR® fast qPCR kit Master
Mix (2X) Universal, iniciadores senso e anti-senso, corante Rox alto e água para
biologia molecular) e 2 µL do DNA genômico extraído. As condições de
amplificação do fragmento alvo estão descritas no Quadro 2.
QUADRO 2: Condições de amplificação do DNA de S. aureus por meio da reação
de PCR em tempo real
Etapa Temperatura Duração Ciclos
Ativação da enzima 95°C 3 minutos
Desnaturação 95°C 3 segundos 40
Anelamento/Extensão 60°C 20 segundos
Dissociação/ curva de melt
95°C
60°C
95°
15 segundos
1 minuto
15 segundos
24
Os iniciadores utilizados para a detecção dos isolados por SYBR Green
foram selecionados com a finalidade de otimizar os resultados da amplificação.
Após o término da análise, os dados obtidos da amplificação e os gráficos
emitidos pelo software foram analisados pelo equipamento “Step One Plus – Real
Time PCR System” da Applied Biosystems, USA. A identificação do produto da
PCR em tempo real foi realizada pela determinação da temperatura de melt (Tm)
do produto da amplificação.
4.3.2. Análise de PCR em tempo real para detecção da presença de genes
de exotoxinas e superantígenos em isolados de S. aureus
Foram utilizados quatro pares de iniciadores para a amplificação de
genes produtores de exotoxinas (Quadro 3). Os iniciadores foram desenhados a
partir de iniciadores de literatura, mas foram adaptados visando diminuir o
tamanho do amplicon gerado na análise de PCR em tempo real com o corante
SYBR Green (média de 70 a 150 pb) e evitar a formação de dímeros.
QUADRO 3: Iniciadores para amplificação de genes de exotoxinas estafilocócicas
Na análise de PCR em tempo real para detecção de genes de
exotoxinas foi utilizado um volume final de 20µL de solução, contendo 2µL de
DNA genômico extraído e 18µL de Master Mix (KAPA SYBR® fast qPCR kit
Master Mix (2X) Universal, iniciadores senso e anti-senso, corante Rox alto e
Iniciador Exoproteína Sequência (5’ – 3’) Tamanho
dos fragmentos
Número de Acesso
(GenBank) Inserção
PVL – F Leucocidina Panton-Valentive
CCCCCATTAGTACACAGTGGTT 80 pb AB678712.1
679
PVL – R TCACTTGTATCTCCTGAGCCTT 758
TST – F Toxina da síndrome do choque tóxico
TAAGGCTGATGCTGCCATCT 94 pb EF531615.1
263
TST – R AGTAGTGGGTCTGACGCTTT 170
ETA – F Toxina esfoliativa A
ATTCAAATATCAACGTGAGGGCT 124 pb L25372.1
128
ETA – R TTGTTAATTCCACTCAATAGTTCCC 251
ETB – F Toxina esfoliativa B
TCACAGTGGTAAAGGCGGAC 110 pb M17348.1
1115
ETB – R TCGTTCCCCAAAGTGTCTCC 1225
25
água para biologia molecular). As condições de amplificação de cada par de
iniciador estão detalhadas no Quadro 4.
Após a finalização das reações de PCR em tempo real os dados
obtidos foram analisados pelo equipamento “Step One Plus – Real Time PCR
System” da Applied Biosystems, USA, em conjunto com os gráficos gerados por
cada análise.
QUADRO 4: Condições de amplificação dos iniciadores utilizados para detecção
de exotoxinas estaflocócicas
Etapa Temperatura Duração Ciclos
Ativação da enzima 95°C 3 minutos
Desnaturação 95°C 3 segundos
40 Anelamento/Extensão – pvl, tst, eta
Anelamento/Extensão - etb
60°C
61°C 20 segundos
Dissociação/ curva de melt
95°C
60°C
95°
15 segundos
1 minuto
15 egundos
4.4. Análises estatísticas
Foi utilizado o programa Microsoft® Excel 2007 para tabulação,
organização e apresentação dos dados por meio de tabelas e quadros
(distribuição de frequências e porcentagens para variáveis qualitativas). A análise
estatística foi realizada pelo programa SPSS® for Windows®, versão 16.0, sendo
empregado o teste Exato de Fisher para avaliar a influência entre as variáveis
qualitativas. Foi utilizado como nível de significância o valor 5% (p<0,05).
26
5. Resultados e Discussão
5.1. Identificação do microrganismo S. aureus por meio da técnica de PCR
em tempo real
A análise de PCR em tempo real para identificação da espécie S.
aureus utilizando iniciadores específicos para o gene sodA apresentou
sensibilidade e especificidade de 100% quando se comparou a cepa controle de
S. aureus ATCC® 25923 e microrganismos de diversas espécies diferentes. A
identificação dos isolados de S. aureus de amostras de leite com mastite bovina
pela técnica de cultura convencional confirmou os resultados obtidos pela técnica
de PCR em tempo real, apresentando 100% de conformidade.
Foram preparadas três diluições decimais (10-1, 10-2, 10-3) que, quando
submetidas à PCR em tempo real, revelaram amplificação, demonstrando 100%
de sensibilidade (FIGURA 02). A análise de linearidade, realizada pelo
equipamento de PCR em tempo real, teve como resultado R²= 0,997 (FIGURA
03).
FIGURA 02: Representação das curvas de amplificação do DNA de S. aureus da
cepa ATCC 25923
27
FIGURA 03: Representação da curva de linearidade da identificação do DNA de
S. aureus da cepa ATCC 25923
A temperatura de melt – resultado da amplificação das amostras
durante a análise de PCR em tempo real para identificação do microrganismo S.
aureus – visualizada na curva de melt (FIGURA 04), variou de 78°C a 79°C. A
curva de amplificação das amostras (FIGURA 05) se iniciou no ciclo 15 e terminou
no ciclo 23.
28
FIGURA 04: Representação das curvas de dissociação do DNA dos isolados de
S. aureus de leite de vacas com mastite clínica ou subclínica
FIGURA 05: Representação das curvas de amplificação do DNA dos isolados de
S. aureus de leite de vacas com mastite clínica ou subclínica
29
BANADA et al (2012) avaliaram a detecção do microrganismo S.
aureus em amostras de sangue pela análise de PCR utilizando-se dois diferentes
alvos genéticos, nuc e sodA. Apesar dos dois ensaios possuírem 100% de
especificidade, quando testados com uma cepa controle (ATCC 25923), os
resultados das análises das amostras de sangue foram significantemente
melhores quando se pesquisou o gene sodA, que apresentou sensibilidade e
especificidade de 89% e 100%, respectivamente, enquanto que o gene nuc
apresentou sensibilidade e especificidade de 57% e 96,5%, respectivamente. O
melhor desempenho na identificação do gene sodA foi atribuído ao tamanho do
amplicon produzido na análise de PCR, ou seja, o produto era menor que o obtido
com o gene nuc, 79pb e 128pb, respectivamente. A especificidade do gene sodA
também foi maior (BANADA et al., 2012).
Os resultados do estudo de POYART et al. (2001), revelaram que
diferentes espécies de Staphylococcus spp. podem ser identificadas pela técnica
de PCR tendo como sequência alvo o gene sodA, revelaram também que este
gene constitui uma sequência alvo altamente discriminativa para diferenciar
espécies bacterianas intimamente relacionadas.
Os resultados obtidos no presente estudo corroboram com os obtidos
por BANADA et al. (2012) e POYART et al. (2001), embora, estes autores tenham
trabalhado com amostras de sangue, a identificação de S. aureus isolados de
mastite bovina por PCR em tempo real pode ser uma ferramenta importante e de
baixo custo a ser utilizada na rotina de laboratórios, principalmente porque a
análise pode ser realizada diretamente em amostras de leite, evitando a cultura
bacteriológica prévia, proporcionando assim, resultados mais rápidos e com alta
confiabilidade.
30
5.2. Detecção do DNA de genes codificadores de exotoxinas de S. aureus
pela PCR em tempo real
A frequência de detecção do DNA dos genes da toxina da síndrome do
choque tóxico (tst), das toxinas esfoliativas A e B (eta e etb) e da leucocidina
Panton-Valentine (pvl) de isolados de S. aureus de leite de vacas com mastite por
PCR em tempo real está descrita na Tabela 1.
TABELA 1- Frequência dos diferentes genes de exotoxinas em isolados de S.
aureus oriundos de leite de vaca com mastite clínica ou subclínica. Goiânia – GO,
2013
A análise da PCR revelou que 51 dos 55 (92,72%) isolados de S.
aureus foram positivos para um ou mais genes de exotoxinas. Ao avaliar as
curvas de melt e de amplificação dos resultados pode-se observar que oito
isolados foram positivos para a presença do gene da TSST-1 (14,5%) (FIGURA
06); 35 isolados para a presença do gene pvl (63,6%) (FIGURA 07); 51 isolados
para a presença do gene eta (85,5%) (FIGURA 08), e nenhum para a presença do
gene etb (TABELA 3).
Gene Número de isolados positivos Porcentagem (%)
ttst
8 14,5
eeta
48 85,5
eetb
0 --
ppvl
35 63,6
TOTAL 51 100
31
FIGURA 06: Curvas de melt e de amplificação da análise para identificação do
gene tst
FIGURA 07: Curvas de melt e de amplificação da análise para identificação do
gene pvl
32
FIGURA 08: Curvas de amplificação e de melt da análise de identificação do gene
eta
As associações das presenças dos genes de exotoxinas e
superantígeno nos S. aureus isolados de leite de vacas com mastite podem ser
observadas na Tabela 4.
TABELA 2 – Distribuição percentual dos genes de exotoxinas segundo os
isolados positivos de S. aureus. Goiânia – GO, 2013
Na comparação entre as variáveis pvl, tst, eta, e tipos de mastite
(TABELAS 03, 04 e 05) não foi encontrada diferença significativa ao teste exato
de Fisher (p > 0,05), provavelmente em função do reduzido espaço amostral.
TABELA 3- Comparação da variável pvl em relação à variável tipos de Mastite.
Goiânia – GO, 2013
Genes Número de isolados positivos Porcentagem
tst + eta 3 5,88% tst + pvl + eta 4 7,85%
tst + pvl 1 1,96% Eta 13 25,49%
eta + pvl 28 54,9% Pvl 2 3,92%
Total 51 100%
33
Pvl Negativo Positivo
p n % n %
Mastite
Clinica 7 35,0 17 48,6
Subclínica 13 65,0 18 51,4
Total 20 100,0 35 100,0 0,403
Teste Exato de Fisher
TABELA 4- Comparação da variável tst em relação à variável tipo de Mastite.
Goiânia – GO, 2013
Teste Exato de Fisher
TABELA 5- Comparação da variável eta em relação à variável tipos de Mastite.
Goiânia – GO, 2013
Eta Negativo Positivo
p n % n %
Mastite
Clinica 3 37,5 21 44,7 Subclínica 5 62,5 26 55,3 Total 8 100,0 47 100,0 1,000
Teste Exato de Fisher
Os resultados de JOHNSON et al. (1991), AKINEDEN et al. (2001),
STEPHAN et al. (2001), HAVERI et al. (2007), KARAHAN et al. (2009), FEBLER
et al. (2010), PICCININI et al. (2010), OTE et al. (2011) e UNAL et al. (2012)
ratificam os resultados do presente estudo, que não detectou a presença do gene
etb em nenhum isolado de S. aureus de leite de vacas com mastite clínica ou
subclínica. Em estudos realizados com isolados de S. aureus de amostras clínicas
Tst Negativo Positivo
p n % n %
Mastite
Clinica 19 40,4 5 62,5
Subclínica 28 59,6 3 37,5
Total 47 100,0 8 100,0 0,276
34
humanas (NHAN et al., 2011), isolados de ratos (VANCRAEYNEST et al., 2006) e
de isolados de queijo artesanal de ovelhas (SPANU et al., 2012) também não foi
possível identificar o gene etb.
Por outro lado, os resultados das frequências do gene eta em isolados
de S. aureus de leite com mastite obtido no presente trabalho discordam daqueles
obtidos em estudos prévios uma vez que 85,5% dos isolados apresentaram
resultados positivos para a presença do gene eta, sendo 43,75% provenientes de
mastites clínicas e 56,25% provenientes de mastite subclínica. A maioria dos
estudos realizados com isolados oriundos de animais o gene eta não foi
encontrado (AKINEDEN et al., 2001; STEPHAN et al., 2001; VANCRAEYNEST et
al., 2006; HAVERI et al., 2007; KARAHAN et al., 2009; DELGADO et al., 2010;
FEBLER et al., 2010; PICCININI et al., 2010; SPANU et al., 2012; UNAL et al.,
2012). No entanto, OTE et al. (2011) relataram que 18,3% dos isolados de S.
aureus de leite de vacas com mastite possuíam o gene eta, contrastando também
com os resultados da literatura. Por sua vez, HAVERI et al., (2007) sugerem que
isolados de IIMs de bovinos que possuem os genes eta e etb são de origem
humana, e HAYAKAWA et al., (2000) relatam que a produção de toxinas
esfoliativas entre isolados de S. aureus de leite vacas com mastite é rara.
Diversos estudos relatam a presença do gene tst em isolados de S.
aureus de leite com mastite clínica ou subclínica, variando de 3,3% a 64,7% dos
isolados são positivos para a presença do gene na análise de PCR (AKINEDEN et
al., 2001; STEPHAN et a., 2001; SMYTH et al., 2005; HAVERI et al., 2007;
KARAHAN et al., 2009; OTE et al., 2011). No estudo de SPANU et al. (2012),
realizado com isolados de S. aureus de queijo artesanal de ovelha, foi observado
que 29% apresentaram o gene tst. Apesar da presença do gene tst não indicar a
produção da toxina TSST-1, a presença de S. aureus no leite indica a
possibilidade da estirpe avaliada a produzi-la.
O presente trabalho avaliou a presença do gene tst em isolados de S.
aureus de leite de vacas com mastite clínica ou subclínica. Constatou-se que
14,5% dos isolados de S. aureus foram positivos para a presença do gene tst,
sendo que, 62,5 % eram provenientes de leite de vacas com mastite clínica e
37,5% provenientes de leite de vacas com mastite subclínica. Esses resultados
encontram respaldo em HAVERI et al. (2007), que detectaram o gene tst em 10,3
35
% dos isolados de S. aureus de leite de vacas com mastite clínica e em 3 % dos
isolados de leite de vacas com mastite subclínica. São corroborados por
SRINIVASAN et al., (2006) que encontraram o gene tst em 20 de 78 (25, 6%) dos
isolados de S. aureus de leite de vacas com mastite.
KARAHAN et al. (2009), ao estudar 92 isolados de S. aureus de
mastite subclínica de bovinos na Turquia, encontraram a presença do gene tst em
apenas 3,3% das amostras. Em outro estudo, a porcentagem de identificação do
gene tst em amostras de leite de vacas com mastite foi de 10% (DELGADO et al.,
2010). OTE et al. (2011) encontraram o gene tst em 27,5% do isoladas de S.
aureus de leite de vacas com mastite. SMYTH et al. (2005) identificaram genes
para enterotoxinas e para TSST-1 em 191 de isolados S. aureus de animais
(vacas, ovelhas, cabras, frangos e rato), destas 26,7% foram consideradas
positivas para a presença do gene tst, e entre os 99 isolados de bovinos, 19
(19,2%) foram positivos a esse gene.
A ausência do gene tst também foi relatada em estudos que se
propuseram a identificação deste gene em isolados de S. aureus de leite de
ruminantes (YOUNIS et al., 2003; FEBLER et al., 2010; PICCININI et al., 2010;
UNAL et al., 2012).
O gene da leucocidina Panton-Valentine frequentemente está
associado com isolados MRSA, em particular em casos de pneumonia e
infecções de peles e tecidos moles (YOONG & TORRES, 2013). No entanto, por
ser a leucocidina uma citotoxina que causa a destruição e necrose tecidual e tem
como principal função a inibição da resposta imunológica do hospedeiro, pode
contribuir na patogênese da mastite (BARRIO et al., 2006; ARGUDIN et al., 2010),
principalmente em casos de mastites subclínicas (WANG et al., 2011; UNAL et al.,
2012).
De acordo com UNAL et al., (2012), 66,6% dos isolados de S. aureus
de mastite de pequenos ruminantes possuem o gene pvl. Estes resultados são
corroborados pelos obtidos no presente estudo, uma vez que 63,6% (35) dos
isolados de S. aureus de leite de vacas com mastite foram positivos para a
presença do gene, sendo 18 isolados de casos de mastite subclínica e 17 de
casos de mastite clínica. Resultado semelhante foi também encontrado em outro
estudo realizado com 69 isolados de S. aureus isolados de leite de vacas com
36
mastite clínica e subclínica, no qual o gene pvl foi encontrado em 47 (68,11%) dos
isolados positivos, sendo 37 de mastite subclínica e 10 de casos de mastite
clínica (WANG et al., 2011) ,ratificando assim a hipótese de que o gene pvl pode
contribuir na patogênese da mastite subclínica (WANG et al., 2012; UNAL et al.,
2012).
BENHAMED & KIHAL, (2013) obtiveram resultados diferentes dos
anteriormente relatados. Esses autores encontraram apenas um (9%), de um total
de onze isolados de S. aureus de leite de vacas com mastite positivo para a
presença do gene pvl. OTE et al. (2011) também observaram a presença do gene
em um isolado de leite de vacas com mastite. Por outro lado, FUEYO et al.
(2005), FEBLER et al., (2010), DELGADO et al. (2010), HUBER et al. (2010),
PICCININI et al. (2010), SPANU et al. (2012) não encontraram o gene pvl em
isolados de S. aureus em leite de vacas com mastite.
Apesar da importância das toxinas secretadas por S. aureus na
patogênese da mastite ainda permanecer incerta, sugere-se que os
superantígenos e as leucotoxinas possuam um papel importante no
estabelecimento da infecção e no progresso da mastite bovina, devido à
habilidade em regular o sistema imune (FIJALKOWSKI et al., 2012). O fato de
microrganismos isolados de mastites bovinas possuírem genes de fatores de
virulência envolvidos em enfermidades humanas faz do leite de vacas com
mastites um perigo em potencial para a saúde humana, ressaltando o perigo
quanto ao consumo de leite cru e a necessidade de higiene em seu
processamento (OTE et al., 2011).
37
6. Conclusões
A técnica de PCR em tempo real permitiu detectar, de forma confiável e
rápida, o DNA de S. aureus isolados de leite provenientes de vacas com
mastite clínica ou subclínica, podendo assim constituir uma ferramenta
importante no diagnóstico de agentes causadores de mastite.
O gene sodA, responsável pela codificação da proteína superóxido
dismutase, pode ser utilizado como sequência alvo na identificação da
espécie S. aureus em análises pela técnica de PCR em tempo real.
Staphylococcus aureus isolados de leite provenientes de vacas com
mastite carream genes de exotoxinas e superantígenos, como pvl, eta e tst.
O gene eta pode ter um papel importante na patogênese de mastites
bovinas, visto que a maioria dos isolados se mostraram positivos para a
sua presença.
38
REFERÊNCIAS
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