claudenize pontes da silva leal - ufpr · 2011. 8. 25. · o uso de plantas para o preparo de...
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Claudenize Pontes da Silva Leal ISOLAMENTO E QUANTIFICAÇÃO DE MARCADORES QUÍMICOS
DE Centella asiatica L. E Cynara scolymus
Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre. Programa de Pós-Graduação em Química, Setor de Ciências Exatas, Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Brás Heleno de Oliveira
CURITIBA 2006
ii
Agradecimentos
A Deus, pela certeza que todo esforço vale a pena, pelo amparo e consolo e pelo caminho de luz
que sempre me guiou;
A meu esposo Moacyr Neto pelo amor, paciência e apoio incondicionais, pelas lágrimas
enxugadas e por sempre estar ao meu lado;
Aos meus pais Francisco e Mercedes e irmãos Claudecir e Claudinei pelas orações, incentivo e
apoio constantes à busca do crescimento e realização pessoal;
Aos meus sogros Moacyr e Maria Luiza, pelo apoio constante;
Aos meus demais familiares, pelo apoio e amor;
À amiga Elisa Perez pela ajuda em todos os sentidos e pela amizade incansável;
Aos amigos do laboratório pela ajuda, conversas a fio e, é claro, pelo café das 14:56h: Alexandre
A. de Oliveira, César A. M. Chornobai, Janaína F. Packer, Júlio César Stirmer, Maurício L. Belém
e Patrícia Zancanella;
Aos demais amigos de laboratório que também fizeram parte da minha história: Denise Zelak
Bastos, José Luiz F. da Trindade, Rodrigo L. Magalhães e Tiago Cavassin;
Ao professor Brás Heleno de Oliveira pela oportunidade, confiança e orientação;
Ao programa de pós graduação em Química da UFPR, principalmente à professora Jaísa
Fernandes Soares pelo auxílio incansável e ao secretário Marcelino Câmara;
À professora Beatriz Helena L. N. Sales Maia pelos conselhos, amizade e correções;
Às professoras Sônia F. Zawadski e Jacqueline A. Takahashi pelos conselhos e correções;
Aos colegas Anderson Barisson e Emmanoel Costa pela ajuda com os espectros de RMN;
À indústria Steviafarma de Maringá pelo envio das plantas;
Ao Lactec pelas análises de TGA e Distribuiçao Granulométrica a Laser.
Agradeço a todos que passaram por mim e que de uma forma ou de outra deixaram sua
lembrança. Neste período aprendi que uma amizade sincera pode surgir de onde menos
esperamos, que um “não” pode partir de quem mais acreditamos e que o amor é mais precioso
que qualquer conhecimento.
iii
Sumário
LISTA DE ESQUEMAS....................................................................................................VI
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... VII
LISTA DE TABELAS ....................................................................................................VIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................IX
RESUMO ............................................................................................................................ X
ABSTRACT .......................................................................................................................XI
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 1
1.1 FITOTERAPIA ................................................................................................................ 1 1.2 CENTELLA ASIATICA L., APIACEAE ............................................................................... 1 1.3 CYNARA SCOLYMUS L., ASTERACEAE ............................................................................ 5 1.4 CROMATOGRAFIA PREPARATIVA EM FASE ESTACIONÁRIA REVERSA ............................ 8
2 OBJETIVO................................................................................................................... 10
2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................................ 10 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 10
3 EXPERIMENTAL ....................................................................................................... 11
3.1 ESPECIFICAÇÕES GERAIS DOS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ...................................... 11 3.2 FASE ESTACIONÁRIA REVERSA QUIMICAMENTE LIGADA PC-18 ................................. 12 3.2.1 PREPARAÇÃO DAS FASES REVERSAS ........................................................................... 12 3.2.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE FASE REVERSA .................................................................... 12 3.2.3 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TGA) ..................................................................... 13 3.2.4 ANÁLISE DE DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA A LASER ............................................. 14 3.3 CENTELLA ASIATICA .................................................................................................... 14 3.3.1 MÉTODO DE EXTRAÇÃO ............................................................................................. 14 3.3.2 OBTENÇÃO DOS GLICOSÍDEOS - MÉTODO A................................................................ 15 3.3.3 CROMATOGRAFIA COM PC-18 “FLASH” EM MICRO-ESCALA...................................... 15 3.3.4 EMPACOTAMENTO DE COLUNAS PARA CLAE PREPARATIVA COM PC-18 ..................... 16
iv
3.3.5 OBTENÇÃO DOS GLICOSÍDEOS - MÉTODO B ................................................................ 16 3.3.6 CCDC E RECRISTALIZAÇÃO ....................................................................................... 17 3.3.7 QUANTIFICAÇÃO DO ASIATICOSÍDEO POR CLAE/UV.................................................. 17 3.3.7.1 Otimização do método de extração ........................................................................ 17 3.3.7.2 Otimização das condições analíticas ...................................................................... 18 3.3.7.3 Curva de calibração ............................................................................................... 18 3.3.8 PREPARAÇÃO DO EXTRATO SECO EM SPRAY DRYER ...................................................... 18 3.3.9 TEOR DE ASIATICOSÍDEO EM EXTRATOS COMERCIAIS .................................................. 19 3.4 CYNARA SCOLYMUS ...................................................................................................... 20 3.4.1 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO ........................................................................................... 20 3.4.2 CROMATOGRAFIA COM PC-18 “FLASH” EM MICRO-ESCALA...................................... 21 3.4.3 CROMATOGRAFIA COM PC-18 “FLASH” EM ESCALA PREPARATIVA ........................... 21 3.4.4 QUANTIFICAÇÃO DO ÁCIDO CLOROGÊNICO POR CLAE/UV......................................... 21 3.4.4.1 Otimização das condições analíticas ...................................................................... 21 3.4.4.2 Otimização do método de extração ........................................................................ 22 3.4.4.3 Curva de calibração ............................................................................................... 22
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................. 23
4.1 FASE ESTACIONÁRIA REVERSA QUIMICAMENTE LIGADA PC-18 ................................. 23 4.1.1 PREPARAÇÃO DAS FASES REVERSAS ........................................................................... 23 4.1.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE FASE REVERSA .................................................................... 23 4.1.3 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TGA) ..................................................................... 25 4.1.4 ANÁLISE DE DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA A LASER ............................................. 26 4.2 CENTELLA ASIATICA .................................................................................................... 28 4.2.1 OBTENÇÃO DA MISTURA DE GLICOSÍDEOS .................................................................. 28 4.2.2 OBTENÇÃO DO ASIATICOSÍDEO POR CCDC E RECRISTALIZAÇÃO ................................. 29 4.2.3 CARACTERIZAÇÃO DO ASIATICOSÍDEO ....................................................................... 30 4.2.4 QUANTIFICAÇÃO DO ASIATICOSÍDEO POR CLAE/UV.................................................. 33 4.2.4.1 Curva de calibração do asiaticosídeo ..................................................................... 33 4.2.4.2 Otimização das condições analíticas ...................................................................... 33 4.2.4.3 Otimização do método de extração ........................................................................ 35 4.2.5 PREPARAÇÃO DO EXTRATO BRUTO SECO NO SPRAY DRYER.......................................... 38 4.2.6 TEOR DE ASIATICOSÍDEO EM EXTRATOS COMERCIAIS .................................................. 41 4.3 CYNARA SCOLYMUS ...................................................................................................... 41 4.3.1 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO ........................................................................................... 41 4.3.2 CARACTERIZAÇÃO DO ÁCIDO CLOROGÊNICO .............................................................. 42 4.3.3 QUANTIFICAÇÃO DO ÁCIDO CLOROGÊNICO POR CLAE/UV......................................... 43 4.3.3.1 Curva de calibração para o ácido clorogênico ........................................................ 43 4.3.3.2 Otimização das condições analíticas ...................................................................... 44 4.3.3.3 Otimização do método de extração ........................................................................ 46
5 CONCLUSÕES............................................................................................................ 48
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 49
v
7 ANEXOS ...................................................................................................................... 54
7.1 ESPECTRO NO IV PARA O ASIATICOSÍDEO EM KBR .................................................... 55 7.2 ESPECTRO DE RMN DE
1H PARA O ASIATICOSÍDEO .................................................... 56 7.3 EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE
1H PARA O ASIATICOSÍDEO............................ 57 7.4 EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE
1H PARA O ASIATICOSÍDEO............................ 58 7.5 ESPECTRO DE RMN DE
13C PARA O ASIATICOSÍDEO ................................................... 59 7.6 EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE
13C PARA O ASIATICOSÍDEO........................... 60 7.7 EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE
13C PARA O ASIATICOSÍDEO........................... 61 7.8 ESPECTRO DE DEPT 135 PARA O ASIATICOSÍDEO ...................................................... 62 7.9 ESPECTRO DE HSQC PARA O ASIATICOSÍDEO ............................................................ 63 7.10 ESPECTRO DE HMBC PARA O ASIATICOSÍDEO ......................................................... 64 7.11 ESPECTRO NO IV PARA O ÁCIDO CLOROGÊNICO EM KBR......................................... 65 7.12 ESPECTRO DE RMN DE
1H PARA O ÁCIDO CLOROGÊNICO ........................................ 66 7.13 EXPANSÃO DO ESPECTRO DE RMN DE
1H PARA O ÁCIDO CLOROGÊNICO ................. 67
vi
Lista de Esquemas
ESQUEMA 1 - Rota biossintética simplificada para o asiaticosídeo....................................... 4 ESQUEMA 2 - Rota biossintética simplificada para o ácido clorogênico ............................... 7 ESQUEMA 3 – Preparação de extratos de Centella asiatica ................................................ 14 ESQUEMA 4 - Obtenção da mistura de glicosídeos............................................................. 15 ESQUEMA 5 - Cromatografia em fase reversa (PC-18 “CCD”) em escala preparativa para
obtenção dos glicosídeos .............................................................................................. 16 ESQUEMA 6 - Extração Realizada com a Cynara scolymus ................................................ 20 ESQUEMA 7 - Extração com solventes de polaridade crescente .......................................... 20 ESQUEMA 8 - Cromatografia em fase reversa (PC-18) em escala preparativa..................... 21
vii
Lista de Figuras
FIGURA 1 – Foto ilustrativa da planta Centella asiatica .............................................................. 2 FIGURA 2 - Estrutura dos componentes principais da Centella asiatica ............................... 3 FIGURA 3 - Foto ilustrativa da planta Cynara scolymus ........................................................ 5 FIGURA 4 - Estrutura dos componentes principais da Cynara scolymus ................................ 6 FIGURA 5 - Representação esquemática da reação de imobilização de PMODS em sílica
(adaptado de TONHI et al., 2002a)................................................................................. 9 FIGURA 6 – Sistema montado no equipamento a vácuo Vac Elut 20 para fracionamento da
mistura de corantes em coluna de sílica de fase normal e na respectiva PC-18 de fase reversa ......................................................................................................................... 13
FIGURA 7 - Estrutura dos corantes utilizados no teste de ação reversa das sílicas PC-18..... 24 FIGURA 8 - Foto ilustrativa mostrando a separação dos corantes nas sílicas de fase normal e
de fase reversa.............................................................................................................. 25 FIGURA 9 – Fórmula estrutural do polímero PMODS......................................................... 26 FIGURA 10 - Representação gráfica da distribuição granulométrica das sílicas antes e depois
de funcionalizadas........................................................................................................ 27 FIGURA 11 - CCD do fracionamento do extrato de Centella asiatica em CLAE Preparativa
com PC-18 “CCD”....................................................................................................... 29 FIGURA 12 - Correlações dadas pelo experimento de HMBC para o asiaticosídeo.............. 31 FIGURA 13 - Curva de calibração do asiaticosídeo.............................................................. 33 FIGURA 14 - Cromatograma de CLAE para o extrato bruto da Centella asiatica ................ 34 FIGURA 15 - Perfil no UV do asiaticosídeo e do mesmo no extrato bruto ........................... 34 FIGURA 16 - Extrações metanol 100% de 100 mg de Centella asiatica............................... 35 FIGURA 17 - Extrações metanol 70% de 100 mg de Centella asiatica ................................ 36 FIGURA 18 –Extrações metanol 100% de 50 mg de Centella asiatica................................. 36 FIGURA 19 - Extrações metanol 70% de 50 mg de Centella asiatica .................................. 36 FIGURA 20 - CCD das frações do extrato Cynara scolymus obtido com coluna PC-18
“FLASH” em escala preparativa*................................................................................. 42 FIGURA 21 - Fórmula estrutural do ácido clorogênico ........................................................ 43 FIGURA 22 - Curva de calibração do ácido clorogênico...................................................... 43 FIGURA 23 - Cromatograma de CLAE do extrato bruto da Cynara scolymus...................... 45 FIGURA 24 - Perfil no UV do ácido clorogênico e do mesmo no extrato bruto.................... 46
viii
Lista de Tabelas
TABELA 1 - Resultados da análise de TGA para as sílicas PC-18 “Flash” e PC-18 “CCD”. 25 TABELA 2 - Porcentagem de carbono nas sílicas PC-18 “Flash” e PC-18 “CCD”............... 26 TABELA 3 - Tamanho médio das partículas das sílicas antes e depois da funcionalização com
polímero....................................................................................................................... 27 TABELA 4 – Comparação dos dados práticos de RMN 13C para o asiaticosídeo com a
literatura (MAEDA et al., 1994)* ................................................................................. 32 TABELA 5 – Resultados do teste de resíduo seco (RS) para cada extração de asiaticosídeo
(mg/ml) da Centella asiatica ........................................................................................ 39 TABELA 6 – Rendimento (g) da secagem em spray dryer das diferentes extrações da
Centella asiatica .......................................................................................................... 39 TABELA 7 – Teor de asiaticosídeo nas diferentes extrações realizadas com a Centella
asiatica e nos respectivos extratos secos gerados no spray dryer .................................. 40 TABELA 8 – Teor de asiaticosídeo em amostras diversas* de Centella asiatica .................. 41 TABELA 9 - Teor de ácido clorogênico (mg) em extratos de Cynara scolymus (100 mg) após
três extrações sucessivas............................................................................................... 47
ix
Lista de Abreviaturas e Siglas
δ - deslocamento químico
µm - micrômetros
λmáx - comprimento de onda (nm) de absorção máxima
CCD - cromatografia em camada delgada
CCDC - cromatografia em camada delgada centrífuga
CLAE - cromatografia líquida de alta eficiência
d - dubleto
dd - duplo dubleto
D2O - água deuterada
D3COD - metanol deuterado
DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
Detector no UV - detector no ultravioleta
DPR% - desvio padrão relativo%
Espectro no IV - espectro no infravermelho
HMBC - heteronuclear multiple bond coherence
HSQC - heteronuclear single quantum coherence
Hz - hertz
J - constante de acoplamento
m - multipleto
Me – Grupo metila
MHz - megaHertz (um milhão de ciclos por segundo)
ppm - parte por milhão
Rf - razão de frente
RMN 13C - ressonância magnética nuclear de carbono-13
RMN 1H - ressonância magnética nuclear de hidrogênio
Rpm - rotação por minuto
s - singleto, t - tripleto
TMS – tetrametilsilano
x
Resumo
O uso de plantas para o preparo de medicamentos é uma prática antiga, porém o
aumento na comercialização dos mesmos fez aumentar a exigência no que diz respeito à
qualidade. Para avaliação da qualidade de fitoterápicos é necessário dispor de marcadores
químicos e, por isso, o isolamento desses é de grande interesse. Um dos objetivos deste trabalho
foi o de testar novas técnicas para obtenção de marcadores químicos, incluindo a preparação e
teste de uma sílica de fase reversa para uso em cromatografia de escala preparativa. Os
marcadores isolados foram o ácido clorogênico e o asiaticosídeo de duas plantas amplamente
usadas comercialmente, Cynara scolymus e Centella asiatica, respectivamente. Os padrões obtidos
foram, então, utilizados para o desenvolvimento de metodologia analítica por cromatografia
líquida de alta eficiência, para a quantificação deles em produtos fitoterápicos. Para o caso da
Centella asiatica foi também preparado um extrato seco, pelo uso da técnica de “spray drying”, e
alguns produtos comerciais de diferentes origens foram comparados. Os resultados mostraram
que eles continham teores significativamente diferentes do princípio ativo.
xi
Abstract
The use of plants for the preparations of medicines is an old practice. However the increase in
commercial availability of those products increased the demands concerning quality. The quality
assurance of phyto remedies requires the respective chemical markers. Therefore the isolation of
those compounds is of great importance. One of the objectives of this work was testing new
techniques for obtaining chemical markers, including the preparation and testing of a reversed
phase silica for preparative scale chromatography. The markers obtained were chlorogenic acid
and asiaticoside from two widely used plants, Cynara scolymus and Centella asiatica, respectively. The
standards obtained were then used for the development of high performance liquid
chromatography methodology, for their quantification em phyto remedies. A dry extract was also
prepared for Centella asiatica, using spray-drying technique, and a few commercial products of
different origin were compared. The results showed that they contained significantly different
concentrations of the active principle.
Introdução
1
1 Introdução
1.1 Fitoterapia
Os medicamentos de origem vegetal, denominados fitoterápicos, estão
relacionados com qualquer exploração tecnológica e econômica de vegetais empregados na
prevenção e no tratamento da cura de distúrbios, de disfunções ou de doenças do homem e
animais (SIMÕES et al., 2000). A utilização de plantas como medicamentos pela
humanidade é tão antiga quanto a história do homem. O processo de evolução da “arte da
cura” deu-se de forma empírica, em processos de descobertas por tentativas, de erros e
acertos. Neste processo, os povos primitivos propiciaram a identificação de espécies e de
gêneros vegetais bem como das partes dos vegetais que se adequavam ao uso medicinal
(CORDELL, 1995). No Brasil, com o pouco que se conhece sobre a biodiversidade das
florestas tropicais, como a da Amazônia, torna-se óbvio que o estudo de plantas medicinais
ainda é escasso.
O aumento na produção e no consumo de produtos fitoterápicos demandam
maior rigor relativo à qualidade destes produtos. No Brasil, a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária tem sido bastante rigorosa e a legislação vigente requer a detecção e a
quantificação dos chamados marcadores químicos que são compostos utilizados como
referência e podem ou não ser os compostos biologicamente ativos. Apesar de muitos deles
serem comerciais, seus preços são geralmente bastante elevados, por isso são importantes
os estudos de otimização da obtenção dos mesmos.
1.2 Centella asiatica L., Apiaceae
Popularmente conhecida como centelha, centella da asia, centela, pata-de-mula,
pata-de-burro ou pé-de-cavalo, a planta (Figura 1) é originária da Ásia Tropical, onde há
mais de 3000 anos os habitantes já a utilizavam no tratamento de lesões cutâneas. Ela
cresce muito bem no Brasil, principalmente nos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro,
São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. A planta prefere lugares úmidos e
Introdução
2
sombreados, sendo encontrada em quase todos os ambientes e é obtida por extrativismo
ou por importação (SIMÕES et al., 2000).
FIGURA 1 – Foto ilustrativa da planta Centella asiatica
Fonte: http://www.aquabase.com.br
A Centella asiatica tem sido usada como sedativo e para o tratamento de úlcera e
hanseníase (WANG et al., 2003), lúpus, varicoses e certos eczemas (KIM et al., 2005) além
de vasto uso em indústria cosmética, pois estudos farmacológicos comprovaram que os
extratos purificados de Centella asiatica estimulam a síntese de lipídios e
glucosaminoglicanos, principal constituinte da matriz intersticial e cartilagens.
Suas propriedades farmacológicas são atribuídas às saponinas e triterpenos (Figura
2) como os ácidos madecássico e asiático e seus glicosídeos madecassosídeo e asiaticosídeo
(SIMÕES et al. 2000).
Introdução
3
FIGURA 2 - Estrutura dos componentes principais da Centella asiatica
HO
HOHOH2C R
COOR`
Compostos R R’ Ácido asiático H H Ácido Madecássico OH H Asiaticosídeo H β-glucose-(6-1)-glucose-(4-1)-α-
L-ramnose Madecassosídeo OH β-glucose-(6-1)-glucose-(4-1)-α-
L-ramnose
O asiaticosídeo tem sido apontado como o componente mais ativo na planta e,
em particular, apresenta efeito anti-inflamatório. Ele é usado clinicamente como um agente
cicatrizante de feridas e possui a propriedade de imunomodulador (KIM et al., 2005).
Um esquema simplificado da rota biossintética para o asiaticosídeo está
representada a seguir (Esquema 1) e estudos afirmam (KIM et al., 2005) que a produção
dele na planta é influenciada pela enzima β-amirina sintase responsável pela produção da β-
amirina, um dos intermediários na biossíntese do asiaticosídeo.
Introdução
4
ESQUEMA 1 - Rota biossintética simplificada para o asiaticosídeo
SCoA
o
2 HO2C
OHO
SCoA
β-hidroxi-β-metilglutaril - CoA (HMG - CoA)
acetil-CoA
SCoa
OHHO
HO2C
H
OPP
H H
isopentenil pirofosfato (IPP)
acido mevalonico (MVA)
PPO
farnesil difosfato (FPP)
esqualeno
oxidoesqualeno
H
H
β-amirina
2,3
HO
H C
HO
CH2
H
OH
O
O
O
OH OH
HO
CH3
O
CH2HO
OH
O
H
O
CH2
OH
OH
O
H
H
asiaticosideo
O
Introdução
5
1.3 Cynara scolymus L., Asteraceae
Conhecida popularmente como alcachofra, esta planta (Figura 3) é originária da
região mediterrânea. Hoje, ela é difundida mundialmente principalmente com finalidades
alimentícias. No Brasil, a alcachofra é uma das plantas das quais se produz o maior número
de fitoterápicos.
FIGURA 3 - Foto ilustrativa da planta Cynara scolymus
Fonte: http://www.unioeste.br
Seus fitoterápicos são indicados para o tratamento contra hepatites B e C
(WITTEMER et al., 2003), pois são estimulantes da produção e excreção da bílis. Essas
atividades colerética e colagoga têm sido atribuídas à presença de substâncias antioxidantes
nas folhas de alcachofra (ADZET, 1985). São indicados também para o tratamento de
cálculos renais (SIMÕES et al., 2000). A ocorrência de dermatite alérgica de contato foi
relatada para alcachofra (YUNES et al., 2003) e essa ação é atribuída à presença de lactonas
sesquiterpênicas como a cinaropicrina (Figura 4).
Os componentes principais químicos da alcachofra (Figura 4) são compostos
fenólicos tais como o ácido cafeico, ácido clorogênico, cinarina e luteolina-7-O-glucosídeo
(cinarosídeo).
Introdução
6
FIGURA 4 - Estrutura dos componentes principais da Cynara scolymus
Cafeico
COOH
OHOH
Ácido
ClorogênicoÁcido
C
OHOH
O O
OH
HO COOH
OH
OH
OHO
O
HOOH
COOH
O
Cinarina
HO
O
OH
HO
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
Luteolina o glucosídeo-7- -
OH
CH2O
O
O CH2
OH
CH2
CH2
O
A composição do extrato vegetal em ácidos fenólicos depende da forma de
secagem das folhas e de seu processo extrativo, devido à possibilidade de hidrólise e trans-
esterificações que podem ocorrer em meio aquoso. Por isso, a cinarina, citada usualmente
como componente principal, muitas vezes pode não ser detectada.
O ácido clorogênico é derivado do ácido cafeico e é um dos principais
antioxidantes existentes, encontrados em vários vegetais e frutos. Essas substâncias
auxiliam na prevenção de doenças degenerativas como câncer, doença de Parkinson e
Alzheimer, além de retardar o envelhecimento.
Um esquema simplificado da rota biossintética para o ácido clorogênico está
representado a seguir (Esquema 2). É chamada rota do chiquimato e nela o ácido cinâmico,
um dos intermediários na biossíntese do ácido clorogênico, sofre sucessivas hidroxilações e
metilações, de onde provém uma série de ácidos.
cinaropicrina
Introdução
7
ESQUEMA 2 - Rota biossintética simplificada para o ácido clorogênico
(PEP)
D
O
COOH
P
H
O
PO
HO
OH
DAHP
PO
HO
OH
OHH
COOH
O
Ácido Quínico
COOHHO
OHOHHO
Ácido
COOHHO
OOH
OH
3_ Deidroquínico
Ácido3 _ Deidrochiquímico
COOH
OHOHO
COOH
OHOHHO
Chiquímico
Ácido Ácido Chiquímico
COOH
OHOHPO
Fosfato3 _Éter Vinílico
COOH
COOH
OHOPO
COOH
Ácido Corísmico Ácido Prefênico
H
O
O
COOH
O
OH
Ácido Fenilpirúvico
COOH COOH
NH2
L Fenilalanina_
ÁcidoCinâmico
_p hidroxicinâmicoÁcido
COOH
OH
Cafeico
COOH
OHOH
ÁcidoÁcidoQuínico
OH
HO
HO COOH
OH
COOH
eritrose 4
Fosfoenolpiruvato(DE4P)( )
D arabino heptulosonico 7
Acido
fosfato
COOH
OHO
P
C
OHOH
O OHO
OH
OH
COOH
ÁcidoClrorogênico
Introdução
8
1.4 Cromatografia preparativa em fase estacionária reversa
Dentre as várias técnicas cromatográficas preparativas disponíveis algumas
tornaram-se clássicas, como cromatografia em coluna e em camada delgada. A fase
estacionária mais utilizada nestes casos é a sílica. Porém, a grande dificuldade do uso da
sílica é que, dos inúmeros constituintes de plantas, muitos são fortemente polares,
tornando a separação pouco eficiente devido à forte interação destes compostos com a
sílica. Por isso, nestes casos, são indicadas fases estacionárias de ação reversa obtidas
através da funcionalização da sílica. As mais comuns existentes no mercado são a sílica C-8
e a C-18, entretanto, a utilização das mesmas de separações em escala preparativa são
pouco viáveis devido seus altos custos.
As fases estacionárias para utilização como fase reversa são compostas de óxidos
polares utilizados como suporte com grupos orgânicos apolares introduzidos na sua
superfície. Existem várias formas de se obter as camadas orgânicas apolares sobre a
superfície dos diferentes óxidos. O método mais comum ocorre através da introdução de
monocamadas orgânicas, via reação com reagentes apropriados, produzindo as chamadas
fases quimicamente ligadas (TONHI et al., 2002).
Recentemente foi divulgada uma técnica simples de funcionalização de sílica, com
polímeros do tipo siloxano. Reagindo um polímero, como o polimetiloctadecilsiloxano
(PMODS - 18 carbonos), com um suporte como a sílica, obtêm-se uma fase estacionária
com propriedades semelhantes às de sílica C-18 comercial (Figura 5). A mesma reação pode
ser realizada com o polímero polimetiloctilsiloxano (PMOS - 8 carbonos). Este material foi
utilizado em escala analítica com excelentes resultados (BOTTOLI et al., 2002 e TONHI et
al., 2002a,b).
Pensou-se então que este material, se produzido com sílica de tamanho de
partícula apropriado, poderia então ser potencialmente útil em separações cromatográficas
em escala preparativa de compostos polares.
Introdução
9
FIGURA 5 - Representação esquemática da reação de imobilização de PMODS
em sílica (adaptado de TONHI et al., 2002a)
OSi OH
OSi OH
OSi OH
OSi OH
OSi OH
OSi OH
Silica
Si
O
C18H37H3C
Si
O
C18H37H3C
Si
O
C18H37H3C
Si
O
CH3H37C18
Si
O
C18H37H3C
Si
O
C18H37H3C
Si
O
CH3H37C18
O
Si
O
C18H37H3C
Polimero
OSi O
OSi OH
OSi OH
OSi OH
OSi OH
Si
O
C18H37H3C
Si
O
CH3H37C18
O
Si
O
C18H37H3C
Si
O
C18H37
Si
O
CH3H37C18
Si
O
C18H37
Si
O
C18H37H3C
Si
O
C18H37H3C
OSi CH2
Objetivos
10
2 Objetivo
2.1 Objetivo geral
Obter e quantificar marcadores químicos das plantas Centella asiatica e Cynara
scolymus.
2.2 Objetivos específicos
• Preparar uma fase estacionária reversa para uso em escala preparativa;
• Isolar e caracterizar marcadores químicos das duas plantas usando fase estacionária
reversa sintetizada, entre outros métodos cromatográficos;
• Otimizar metodologias para quantificar, por CLAE, os marcadores isolados nos
materiais vegetais;
• Otimizar a preparação de extrato seco da Centella asiatica em spray dryer;
• Quantificar o asiaticosídeo em diferentes materiais vegetais e no extrato seco.
Experimental
11
3 Experimental
3.1 Especificações gerais dos materiais e equipamentos
• Para as extrações e sistemas cromatográficos foram utilizados solventes de grau
comercial, os quais foram destilados.
• Para o uso em CLAE, foram utilizados metanol e acetonitrila (Merck. art. 2007) e
água ultra-pura obtida por purificador de água marca Millipore, modelo Simplicity
185, destilador de água tipo pilsen marca Fabbe, modelo 106 e destilador (vidro) de
água marca Marte, modelo MB 10.02;
• Sistema de CLAE analítico, marca Varian, composto de bomba quaternária
(modelo 9012Q), detector UV fotodiodo (modelo 9065), injetor automático
(modelo AI200) com coluna Varian Res Elut, fase estacionária C-18 de 150 x 4,6
mm de diâmetro interno, tamanho de partícula 5 mm e tamanho de poro 90 Å;
• Sistema CLAE preparativo marca Rainin (bomba modelo SD-200 e detetor UV
modelo UV-1); coluna C-18 Dynamax (8 um, 21.4 X 250 mm);
• O tipo da fase estacionária para as separações cromatográficas variou de acordo
com o tipo de separação:
• Sílica Si-60 (Merck, art.7744 e 7736), 40-63mm e sílica com partículas
menores que 40mm (Aldrich, 288500) para imobilização com PMODS;
• Para CCDC utilizou-se sílica Si-60 PF254 com sulfato de cálcio (Merck,
art.7749) e os rotores foram preparados com uma camada de sílica de
espessura de 1mm. O equipamento usado foi o Chromatotron®;
• Para CCD, utilizou-se como adsorvente Si-60 F254 (Merck, art.5554) com
espessura de 0,2mm.
• As visualizações dos cromatogramas em CCD foram feitas com ácido
sulfúrico/anisaldeído e o reagente NP-PEG (WAGNER, et al. 1995);
• A CCDC foi realizada em aparelho Chromatotron®, com velocidade de fluxo do
eluente igual a 1mL/min;
Experimental
12
• Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram registrados em aparelho Bruker
Avance 400 de 9,4 Tesla equipado com sonda de 5mm multinuclear, utilizando
como solvente D3COD e D2O tendo como padrão de referência interna o TMS.
Os deslocamentos químicos são indicados em ppm;
• Os espectros no IV foram registrados em aparelho Excalibur série Bio-Rad
FTS3500GX. As amostras foram preparadas na forma de pastilhas de brometo de
potássio e as absorções expressas em número de onda (cm-1);
• Os extratos secos de Centella asiatica foram preparados em mini spray dryer; Bϋchi
modelo B-290, com diâmetro de agulha igual a 0,7mm;
• Banho ultra-sônico (2) marca Unique, modelo USC700;
• Moinho tipo Willye marca Tecnal, modelo TE648 (Piracicaba, Brasil);
Microcentrífuga marca Labnet, modelo Force 7.
3.2 Fase estacionária reversa quimicamente ligada PC-18
3.2.1 Preparação das fases reversas
A sílica em fase reversa, denominada PC-18, foi obtida por meio de metodologia
adaptada (BOTTOLI et al., 2002 e TONHI et al., 2002a,b). Inicialmente a sílica (60 g) foi
ativada a 150º C. O polímero PMODS (40 g) foi dissolvido em hexano (500 mL) e a sílica
foi adicionada aos poucos, com agitação, por 3 horas. O solvente foi então evaporado à
temperatura ambiente e o pó branco obtido foi aquecido a 120º C por 4 horas. O excesso
de polímero foi removido com acetato de etila e depois metanol e o material foi então
deixado secar à temperatura ambiente e depois a 60º C.
3.2.2 Avaliação da ação de fase reversa
Foi preparada uma mistura dos corantes azul brilhante e vermelho ALLURA® na
concentração de 1mg/mL. Duas mini-colunas foram preparadas utilizando seringas de
vidro de 3 mL, uma com sílica fase normal (1 g) e outra com PC-18 (1 g) e as duas foram
adaptadas num sistema a vácuo Vac Elut 20 (Figura 6).
Experimental
13
A coluna de PC-18 foi condicionada com água (5 mL) e a coluna de sílica comum
com acetona (5 mL) e a mistura de corantes (500 mL) (BIDLINGMEYER et al., 1984) foi
aplicada em cada uma das colunas. A coluna de PC-18 foi inicialmente eluída com água (3
mL) e o eluato foi coletado em um tubo de ensaio; após a troca do tubo a coluna foi
novamente eluída com metanol (3 mL). A coluna de sílica comum foi eluída com
acetona/etanol 1:1 v/v (3 mL) e depois com etanol/metanol 1:1 v/v (3 mL) e as duas
frações foram igualmente coletadas em tubos de ensaio diferentes. A ordem de eluição foi
determinada através da comparação das cores dos eluatos.
FIGURA 6 – Sistema montado no equipamento a vácuo Vac Elut 20 para
fracionamento da mistura de corantes em coluna de sílica de fase normal e na respectiva
PC-18 de fase reversa
3.2.3 Análise termogravimétrica (TGA)
A análise termogravimétrica foi realizada de acordo com a literatura (AMERICAN
SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS, 1993), nas seguintes condições:
• Faixa de temperatura: 20 a 850º C;
• 20 a 550º C em atmosfera inerte (N2);
• 550 a 850º C em atmosfera oxidante (O2);
• Taxa de aquecimento: 20º C/min.
Experimental
14
O equipamento utilizado foi uma balança termogravimétrica modelo TG – 209,
fabricante NETZSCH.
3.2.4 Análise de distribuição granulométrica a laser
As medidas da distribuição granulométrica foram efetuadas, em triplicata, em
equipamento marca CILAS modelo 1064 (limites de medida: entre 0,1 µm a 500 µm).
Uma alíquota foi adicionada ao porta-amostras do equipamento, previamente
dispersa mecanicamente com sonicação, em um dispersante. Para a sílica “Flash” (40-63
µm) e para a sílica “CCD” (95% <45 µm) foi utilizada água como dispersante. Já para a
PC-18 “Flash” e para a PC-18 “CCD” foi utilizado etanol comercial.
3.3 Centella asiatica
3.3.1 Método de extração
O pó da planta (20 g) foi deslipidificado com hexano (300 mL), seguido de
extração com metanol/água 7:3 v/v (600 mL; maceração por 24 h). Após filtração, uma
nova extração com metanol foi realizada nas mesmas condições, resultando duas extrações
da mesma tomada de amostra.
ESQUEMA 3 – Preparação de extratos de Centella asiatica
Resíduo (descartado)
Extrato hexânico (descartado)
Extrato hidrometanólico 5,515 g
Extração com Hexano 100%
Extração c/ metanol:água 7:3 v/v
Resíduo
20 g planta seca e moída
Experimental
15
3.3.2 Obtenção dos glicosídeos - Método A
O extrato hidrometanólico obtido no procedimento descrito anteriormente, teve
seu volume reduzido foi levado a partições com solventes de polaridade crescente para uma
pré-separação dos componentes do extrato (KIM, et al., 2002, US 6,417,349)
.
ESQUEMA 4 - Obtenção da mistura de glicosídeos
*Mistura de glicosídeos de interesse.
3.3.3 Cromatografia com PC-18 “FLASH” em micro-escala
Foram preparadas duas mini-colunas uma com sílica PC-18 “Flash” e outra com
PC-18 “FLASH” (500 mg) em seringas de vidro (3 mL) as quais foram adaptadas no
sistema à vácuo Vac Elut 20. Elas foram condicionadas com metanol (5 mL) e depois com
água destilada (10 mL). Aplicou-se a mistura de glicosídeos de interesse (12,5 mg)
dissolvidos em água e a coluna foi eluída com água/metanol nas proporções de 10:0, 90:10,
85:15, 80:20, 70:30, 60:40 e 50:50 v/v.
Concentrar volume e adicionar acetato de etila; levar à geladeira
Extrato hidrometanólico
Fração hidrometanólica Fração diclorometanica
Extrato n-butanólico
Lavar 3x 100 mL de n-butanol
Lavar 2x 200 mL de diclorometano
*Precipitação
Fração hidrometanólica
Experimental
16
3.3.4 Empacotamento de colunas para CLAE preparativa com PC-18
A fase estacionária PC-18 “CCD” (12,8 g) foi empacotada a seco em uma coluna
de aço inox 22 x 250 mm (Alltech, Part. 96511). Após a conexão dos terminais a um
sistema CLAE preparativa, a coluna foi condicionada através da passagem de água
utilizando a bomba do sistema cromatográfico.
3.3.5 Obtenção dos glicosídeos - Método B
No método B o extrato hidrometanólico, obtido através do procedimento
descrito no ítem 3.3.1, foi levado a uma coluna empacotada com sílica PC-18 “CCD” (ítem
3.3.4) e eluído com água, seguido de uma mistura água/metanol em diferentes proporções.
As condições do equipamento foram:
• Equipamento: CLAE preparativa com detector UV (210 nm);
• Vazão da fase móvel: 10 mL/min;
• Pressão do sistema: 500 psi.
ESQUEMA 5 - Cromatografia em fase reversa (PC-18 “CCD”) em escala
preparativa para obtenção dos glicosídeos
*Mistura de glicosídeos de interesse.
Extrato hidrometanólico (50 mg)
Coluna preparativa para CLAE com 12,8 g de PC-18 “CCD”
Fração 1 100% água
Fração 2 água:metanol
80:20 v/v
*Fração 3 água:metanol
60:40 v/v
Experimental
17
3.3.6 CCDC e recristalização
Estas duas metodologias foram aplicadas na tentativa de separar a mistura de
glicosídeos de interesse.
Para a CCDC: foi utilizada uma placa de vidro esférica contendo uma camada de
sílica de 1mm de espessura. Após aplicação da mistura de glicosídeos (100 mg),
previamente dissolvida em metanol, foi feita eluição com diclorometano/ácido
acético/metanol/água (60:16:6:4 v/v). As frações foram coletadas em tubos de ensaio e
analisadas por CCD.
Para a recristalização: a mistura de glicosídeos (50 mg) foi dissolvida em 50 mL de
diclorometano/acetona/metanol 8:1:1 (v/v), e a mistura foi deixada em repouso até
surgirem os cristais.
3.3.7 Quantificação do asiaticosídeo por CLAE/UV
3.3.7.1 Otimização do método de extração
Dois líquidos extratores diferentes foram testados: 100% metanol (VERMA, et al.,
1999) e metanol/água 7:3 v/v. Para cada replicata (n= 5) o material vegetal (100 mg) foi
pesado em microtubos de polipropileno e nele foi adicionado hexano (1,5 mL), levado a
agitação em vórtex® (1 min), sonicação (10 min) e centrifugação (5 minutos a 10.000 rpm).
O solvente foi retirado, descartado e foi adicionado mais hexano (1,5 mL), repetindo o
procedimento para garantir a total deslipidificação do material. Após isto, o líquido extrator
(1,5 mL) foi adicionado ao extrato insolúvel em hexano, o tubo foi levado a agitação em
vórtex® (1 min), sonicação (10 min) e centrifugação (5 minutos a 10.000 rpm). Uma
alíquota do sobrenadante (1 mL) foi retirada e injetada no cromatógrafo. O procedimento
foi repetido mais duas vezes para o mesmo material vegetal de cada replicata (n= 5),
totalizando três extrações.
O procedimento descrito acima foi repetido utilizando-se 50 mg do material
vegetal para verificar a influência da relação massa do material vegetal por volume de
líquido extrator sobre a eficiência da extração. Neste segundo procedimento, ao invés de
Experimental
18
três foram realizadas cinco extrações no total para o mesmo material vegetal de cada
replicata (n= 5). Os extratos obtidos foram, então, analisados por CLAE.
3.3.7.2 Otimização das condições analíticas
Diferentes proporções de acetonitrila em água (1:9 até 3:7 v/v) foram testadas, de
modo a produzir uma boa separação do analito no extrato bruto. O comprimento de onda
do detector foi fixado em 210 nm e o tempo de retenção e o espectro no UV do pico do
analito foram comparados com o do padrão, obtidos nas mesmas condições.
3.3.7.3 Curva de calibração
Uma solução-estoque de asiaticosídeo foi preparada em acetonitrila/água 1:1 v/v
na concentração de 1,16 mg/mL. A solução-estoque foi diluída no mesmo solvente de
modo a fornecer soluções nas concentrações de 870 mg/mL, 580 mg/mL, 290 mg/mL,
145 mg/mL e 72,5 mg/mL. Cada solução foi injetada no sistema cromatográfico em
triplicata e a curva de calibração foi automaticamente gerada pelo programa gerenciador
(Star versão 5.5), que forneceu também o coeficiente de correlação linear e o desvio-padrão
relativo.
3.3.8 Preparação do extrato seco em spray dryer
Para a preparação do extrato seco no spray dryer foram realizadas algumas
extrações em condições diferentes, partindo-se da mesma quantidade de líquido extrator,
(água, 600 mL) e mesma quantidade do pó da planta (20 g). As extrações foram realizadas
da seguinte forma:
• Extração A: sonicador (1 h), descanso (19 h), filtração a vácuo;
• Extração B: agitador magnético (1 h), descanso (21 h), filtração a vácuo;
• Extração C: agitador magnético a 50º C (1 h), descanso (22 h), filtração a vácuo;
• Extração D: maceração (24 h), filtração a vácuo;
Experimental
19
Uma extração feita nas mesmas condições da extração D, usando metanol/água
7:3 como líquido extrator (chamada de extração M), foi também realizada para verificar o
efeito da presença de solvente orgânico. Esta extração foi realizada com 400mL de líquido
extrator e não 600 mL como as outras extrações.
Para cada extração realizada, foram retiradas alíquotas (2 mL) para análise em
CLAE e 3 alíquotas (5 mL cada) do filtrado que foram colocadas em placas de Petri e secas
em estufa (105º C) para a obtenção do resíduo seco (RS).
Os extratos obtidos nas formas descritas acima tiveram então o solvente
evaporado no spray dryer, e as condições utilizadas no equipamento foram:
• Temperatura de entrada: 150º C;
• Temperatura de saída: 55º C;
• Vazão da bomba peristáltica: 15 mL/min;
• Aspirador: 38 m3/h.
3.3.9 Teor de asiaticosídeo em extratos comerciais
Duas outras amostras de Centella asiatica, provenientes de outros fornecedores e
regiões foram também quantificadas. A amostra SP, proveniente de São Paulo, foi
adquirida na forma de um fino pó, enquanto que a amostra CL, proveniente de Campo
Largo, em folhas secas que foram trituradas em moinho antes da extração. Além disso, foi
analisado também um medicamento comercial (amostra X), na forma de cápsulas,
contendo extrato seco padronizado da planta.
Para as três amostras, foi realizado o mesmo método de extração: o pó da planta
(50 mg) ou o extrato seco (no caso da amostra X) foram pesados em microtubos de
polipropileno, delipidificados com hexano (2 x 1,5 mL). Após isto, o líquido extrator (1,5
mL) foi adicionado ao extrato insolúvel em hexano e o tubo foi levado a agitação em
vórtex (1 min), sonicação (10 min) e centrifugação (5 minutos a 10.000 rpm). Uma alíquota
do sobrenadante (1 mL) foi retirada e injetada no cromatógrafo.
Experimental
20
Lavar 2x 100mL de n-butanol
Extrato Hidrometanólico
Fração Hidrometanólica Fração Diclorometânica
Fração Hidrometanólica
Lavar 2x 100mL de acetato de etila
Lavar 2x 100ml de diclorometano
Fração acetato de etila
Fração butanólica Extrato Hidrometanólico
3.4 Cynara scolymus
3.4.1 Métodos de extração
O pó da planta (20 g) foi deslipidificado com hexano (300 mL), seguido de
extração com metanol/água 7:3 v/v (600 mL; maceração por 24h). Após filtração, uma
nova extração com metanol foi realizada nas mesmas condições, resultando duas extrações
da mesma tomada de amostra.
ESQUEMA 6 - Extração Realizada com a Cynara scolymus
O extrato hidrometanólico “A” foi particionado com solventes de polaridade
crescente para uma pré-separação por classe de compostos (YUNES et al., 2003).
ESQUEMA 7 - Extração com solventes de polaridade crescente
20 g planta seca e moída
Resíduo Extrato hexânico (descartado)
Extrato Hidrometanólico “A” 5,7929g
Extração com hexano
Extração com metanol/água 7:3 v/v
Resíduo
Experimental
21
3.4.2 Cromatografia com PC-18 “FLASH” em micro-escala
O extrato hidrometanólico “B” foi fracionado em micro-escala, conforme
procedimento descrito no ítem 3.3.3. Aplicou-se o extrato hidrometanólico “B” (12,5 mg)
dissolvidos em água e a coluna foi eluída com água/metanol nas proporções de 10:0, 90:10,
85:15, 80:20, 70:30, 60:40 e 50:50 v/v.
3.4.3 Cromatografia com PC-18 “FLASH” em escala preparativa
O extrato hidrometanólico “B” (50 mg), obtido através do procedimento descrito
no ítem 3.4.1, foi levado a uma coluna empacotada com sílica PC-18 “FLASH” (8 g) e
eluído com água, seguido de uma mistura água/metanol em diferentes proporções.
ESQUEMA 8 - Cromatografia em fase reversa (PC-18) em escala preparativa
• Coluna: seringa de 20 mL;
• Equipamento: sistema a vácuo Vac Elut 20.
3.4.4 Quantificação do ácido clorogênico por CLAE/UV
3.4.4.1 Otimização das condições analíticas
Extrato hidrometanólico “B” (50 mg)
Coluna preparativa com 8g de PC-18 “FLASH”
Fração 1 100% água
Fração 2 Água:metanol
90:10 v/v
Fração 3 água:metanol
80:20 v/v
Experimental
22
Diferentes proporções de metanol em água (1:1 até 1:4 v/v) foram testadas de
modo a produzir uma boa separação do analito no extrato bruto. O comprimento de onda
do detector foi fixado em 230 nm e o tempo de retenção e o espectro no UV do pico do
analito foi comparado com o do padrão obtido nas mesmas condições.
3.4.4.2 Otimização do método de extração
Diferentes proporções de metanol em água (7:3 até 10:0 v/v), além de água pura
foram testados como líquidos extratores. Para cada teste (n= 5) o pó da planta (100 mg) foi
pesado em microtubos de polipropileno, o líquido extrator (1,5 mL) foi adicionado e o
tubo foi levado a agitação em vórtex® (1 min), sonicação (10 min) e centrifugação (10 min.
a 10.000 rpm). Uma alíquota do sobrenadante (0,1 mL) foi retirada, diluída na fase móvel
definida no método (0,75 mL) e a solução foi injetada no cromatógrafo. O procedimento
foi repetido mais três vezes para o mesmo material vegetal.
3.4.4.3 Curva de calibração
Uma solução-estoque de ácido clorogênico foi preparada em metanol/água 1:1
v/v na concentração de 1 mg/mL. A solução-estoque foi diluída no mesmo solvente de
modo a fornecer soluções nas concentrações de 120 mg/mL, 60 mg/mL, 30 mg/mL, 15
mg/mL e 7,5 mg/mL. Cada solução foi injetada no sistema cromatográfico em replicata
(n=3) e a curva de calibração foi automaticamente gerada pelo programa gerenciador (Star
versão 5.5) que forneceu o coeficiente de correlação linear e o desvio-padrão relativo.
Resultados e Discussão
23
4 Resultados e Discussão
4.1 Fase estacionária reversa quimicamente ligada PC-18
4.1.1 Preparação das fases reversas
A modificação da superfície da sílica, com a introdução de uma camada
quimicamente ligada ao suporte, tem como objetivo principal unir, em um só material, as
propriedades químicas do polímero com a rigidez e a estabilidade térmica da sílica (TONHI
et al., 2002).
Para que tal reação aconteça, é importante fazer a ativação da sílica através de
aquecimento para remover as moléculas de água ligadas à superfície da mesma por ligações
de hidrogênio. Por isso, é importante também o uso de hexano anidro.
A funcionalização da sílica realizada através da reação térmica com
polimetiloctadecilsiloxano (PMODS) foi aplicada a dois tipos de sílica com tamanho de
partículas diferentes: sílica “Flash” (43-70 mm) e sílica para “CCD” (90% <40 mm). Após
funcionalizadas, as sílicas foram denominadas, respectivamente, PC-18 “Flash” e PC-18
“CCD”.
4.1.2 Avaliação da ação de fase reversa
Uma vez preparadas, foi necessário verificar se as fases estacionárias possuíam as
características de uma fase reversa. Um teste simples baseado na separação de corantes de
polaridades diferentes, o azul brilhante e o vermelho alluraâ (Figura 7) foram utilizados
(BIDLINGMEYER et al., 1984). Para isto, foram preparadas duas mini-colunas, uma com
a sílica de fase normal e outra com a respectiva PC-18 preparada.
Resultados e Discussão
24
FIGURA 7 - Estrutura dos corantes utilizados no teste de ação reversa das sílicas
PC-18
N N
HOOCH3
NaO3S
CH3
SO3Na
Os resultados mostraram que, na coluna de fase normal o corante azul foi eluído
primeiro e o vermelho ficou mais retido na sílica por ser mais polar. Na coluna de PC-18 a
ordem de eluição foi oposta confirmando que a fase obtida tinha as características
esperadas (Figura 8). O teste foi realizado com a PC-18 “Flash” e PC-18 “CCD”.
CH3CH2O NH
C
N
CH2CH3
CH2
SO3-
CH3
N CH2
SO3NaCH2
CH3
CH3
AZUL BRILHANTE
VERMELHO ALLURA®
Resultados e Discussão
25
FIGURA 8 - Foto ilustrativa mostrando a separação dos corantes nas sílicas de
fase normal e de fase reversa
4.1.3 Análise termogravimétrica (TGA)
As duas fases obtidas foram submetidas à análise termogravimétrica (TGA) para
determinar a porcentagem de carbono. O teor de carbono é uma variável importante em
sílicas funcionalizadas pois ele tem influência na eficiência das colunas preparadas a partir
delas. Os resultados, resumidos nas Tabelas 1 e 2, estão próximos daqueles descritos na
literatura para sílicas de 13 e 5 µm respectivamente: 20,7 e 14,5% (BOTTOLI et al., 2002 e
TONHI et al., 2002a).
TABELA 1 - Resultados da análise de TGA para as sílicas PC-18 “Flash” e PC-18
“CCD”
Amostras Água ou materiais voláteis (%) Material orgânico (%)
PC-18 “Flash” 2,21 31,37
PC-18 “CCD” 2,81 29,34
Obtida a porcentagem de material orgânico para cada fase e tendo como base a
estrutura do polímero (Figura 9) e seu peso molecular (11000 u.m.a.), foi possível calcular o
Fase Normal Fase Reversa
Fase Normal Fase Reversa
Resultados e Discussão
26
número de unidades contendo a cadeia lateral octadecila (n= 312) e a porcentagem de
carbono (Tabela 2).
FIGURA 9 – Fórmula estrutural do polímero PMODS
Si
CH3
H3C
CH3
O Si
CH3
C18H37
O Si
CH3
CH3
CH3
n
TABELA 2 - Porcentagem de carbono nas sílicas PC-18 “Flash” e PC-18 “CCD”
Amostras Carbono (%)
PC-18 “Flash” 22,79
PC-18 “CCD” 21,32
4.1.4 Análise de distribuição granulométrica a laser
Uma análise de distribuição granulométrica a laser também foi realizada com os
dois tipos de sílica antes e depois de funcionalizadas (Figura 10). O tamanho das partículas
da fase estacionária está relacionado com a eficiência dela. Quanto menor o tamanho da
partícula mais eficiente será a coluna. Além disso, a uniformidade do tamanho também é
importante; fases com distribuição granulométrica uniforme são mais eficientes. Isto
explica a grande eficiência das fases utilizadas em CLAE analítica, pois elas possuem
partículas de pequeno tamanho (5 mm) com distribuição muito uniforme em torno do
valor nominal.
Resultados e Discussão
27
FIGURA 10 - Representação gráfica da distribuição granulométrica das sílicas
antes e depois de funcionalizadas
TABELA 3 - Tamanho médio das partículas das sílicas antes e depois da
funcionalização com polímero
Amostras Tamanho Médio de Partículas (µµµµm)
SÍLICA “Flash” 56,12
PC-18 “Flash” 75,23
SÍLICA “CCD” 18,63
PC-18 “CCD” 50,56
Os resultados mostram que, nos dois casos, a funcionalização resulta em aumento
do tamanho médio das partículas. No caso da sílica “Flash”, a funcionalização resultou em
uma sílica PC-18 mais uniforme quanto à distribuição do tamanho das partículas. Do ponto
de vista cromatográfico este é um efeito positivo, uma vez que quanto mais uniforme o
SÍLICA “Flash” PC-18 “Flash”
SÍLICA “CCD” PC-18 “CCD”
100
0
0
100
500
500
Resultados e Discussão
28
tamanho das partículas, melhor será a homogeneidade do recheio de uma coluna e maior
sua eficiência.
A sílica “CCD”, após funcionalização resultou em uma sílica PC-18 menos
uniforme, ou seja, com uma maior variação de tamanho entre suas partículas, mas com
tamanho médio menor e, por este motivo, ela foi escolhida para o recheio das colunas
preparativas para CLAE.
As análises de TGA e de Distribuição Granulométrica a Laser foram realizadas
nos laboratórios do Lactec – Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento - em
Curitiba, Paraná no campos do Centro Politécnico da UFPR.
4.2 Centella asiatica
4.2.1 Obtenção da mistura de glicosídeos
Após a preparação do extrato bruto hidrometanólico da Centella asiatica, duas
metodologias foram utilizadas para a obtenção da mistura dos dois glicosídeos.
A primeira delas foi baseada em uma metodologia patenteada (KIM, K., et al.,
2002). Ao adicionar acetato de etila ao extrato butanólico concentrado final, houve
precipitação de cristais brancos que, em CCD, observou-se que, possivelmente, tratava-se
da mistura dos glicosídeos madecassosídeo e asiaticosídeo, sendo que o último encontrava-
se em maior quantidade. Porém, esta mistura continha ainda outras impurezas em menor
quantidade.
A segunda metodologia envolvia o fracionamento do extrato bruto
hidrometanólico em coluna de CLAE preparativa, empacotada com sílica PC-18 “CCD”.
Experimentos prévios em micro-escala foram realizados, com o objetivo de definir que
proporção de sílica deveria ser usada em relação ao extrato, bem como definir a
composição da fase móvel. Análises realizadas por CCD mostraram que a relação 1/40
(massa do extrato por massa de fase estacionária) era adequada e que a eluição com 1:9, 2:8
e 4:6 de metanol em água (v/v) era suficiente para separar os glicosídeos de outros
componentes do extrato bruto.
Ao analisar as frações coletadas com a fase móvel água/metanol 60:40 v/v,
observou-se que elas continham uma mistura provavelmente formada por madecassosídeo
Resultados e Discussão
29
e asiaticosídeo (Figura 11). O resultado mostrou, portanto, que a fase preparada foi
adequada para o fracionamento prévio do extrato bruto. Esta segunda metodologia
utilizada, mostrou-se mais eficiente tendo como principal vantagem o número menor de
etapas e a consequente rapidez para realizá-la, além de reduzir consideravelmente o uso de
solventes orgânicos.
FIGURA 11 - CCD do fracionamento do extrato de Centella asiatica em CLAE
Preparativa com PC-18 “CCD”
• MANCHA 1: Extrato bruto;
• MANCHA 2: Fração eluída com metanol 10%;
• MANCHA 3: Fração eluída com metanol 20%;
• MANCHA 4: Fração eluída com metanol 40%.
A substância presente na fração 2 eluída com água/metanol (1:9 v/v), foi
purificada e, quando analisada por RMN, apresentou apenas sinais de açúcares.
4.2.2 Obtenção do asiaticosídeo por CCDC e recristalização
A CCDC apresentou bons resultados na separação, porém a dificuldade
encontrada foi na evaporação da fase móvel, uma vez que ela continha uma grande
quantidade de ácido acético e, em se tratando de glicosídeos, o meio ácido pode facilmente
hidrolisá-los. Para contornar esta dificuldade o ácido acético das frações reunidas foi
imediatamente removido em rota-evaporador através da formação de mistura azeotrópicas
com tolueno (PERRIN et al., 1998) ou com hexano.
A recristalização da mistura de glicosídeos apresentou melhores resultados, porém
a desvantagem é que apenas o glicosídeo encontrado em maior quantidade, o asiaticosídeo,
pode ser obtido na forma pura. Sua estrutura foi confirmada por comparação dos dados
espectroscópicos obtidos com os encontrados em literatura (MAEDA et al., 1994;
MATSUDA et al., 2001).
Resultados e Discussão
30
4.2.3 Caracterização do asiaticosídeo
O composto isolado caracterizou-se como um sólido branco, em forma de
agulhas, quando recristalizado em diclorometano/acetona/metanol 8:1:1 v/v.
O espectro de absorção na região do infravermelho (Anexo 7.1), mostrou bandas
em 1637 e 1619 cm-1, características de funções de éster carbonílico e olefina,
respectivamente, e bandas com fortes absorções em 3414 e 1096 cm-1 sugerindo uma
estrutura de um oligoglicosídeo (MATSUDA et al., 2001).
A análise dos espectros de RMN de uni e bidimensionais, evidenciou 48 carbonos,
sendo 7 metílicos (CH3), 11 metilênicos (CH2), 23 metínicos (CH) e 7 carbonos
quaternários, sendo um de éster carbonílico (d 178,0) e um olefínico (d 139,4)
A análise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, D3COD) mostrou sinais para
dois esqueletos glucopiranosila:
• d 5,29 (d, J = 8,1 Hz, 1’-H), e d 4,37 (d, J = 7,9 Hz, 1’’-H);
Um esqueleto raminopiranosila:
• d 1,27 (d, J = 6,3 Hz, 6’’’-H3);
Juntamente, com sinais compatíveis com a estrutura do asiaticosídeo (MAEDA et
al., 1994):
• d 0,97 (d, J = 6,9 Hz, 30-H3) e 0,89 (d, J = 6,2 Hz, 29-H3), 1,12, 1,28, 0,83, 0,69 e
1,05 (s, 27, 23, 26, 24 e 25 - H3), 2,23 (d, J = 11,3 Hz, 18-H), 3,57 (d, J =11,39 Hz,
3-H), 4,86 (m, 6-H2), 5,24 (dd, J = 3,4 e 3,7 Hz, H-12).
A estrutura oligoglicosídica e suas correlações com o esqueleto do ácido asiático
foram determinadas pelo experimento de HMBC (Anexo 7.6) e evidenciou correlações a
longa distância entre o hidrogênio 1’ e o C-28 (d 178,0 – COOR), entre o hidrogênio 1’’ e o
C-6’ (d 69,6) e entre o hidrogênio 1’’’ e o C-4’’ (d 72,3) (Figura 12).
A análise do espectro de RMN de 13C (100 MHz, D3COD), revela valores de
deslocamentos (Tabela 4) que foram comparados com valores da literatura (MAEDA et al.,
1994). Vale ressaltar que estes valores da literatura foram obtidos em equipamento também
de 100 MHz, porém usando piridina deuterada como solvente. Isto explica o fato de alguns
valores de deslocamentos serem diferentes.
Resultados e Discussão
31
A partir dos dados de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais juntamente dados da
literatura (MAEDA et al., 1994), confirma-se que o composto isolado é o asiaticosídeo.
FIGURA 12 - Correlações dadas pelo experimento de HMBC para o asiaticosídeo
HO
HO
CH2
OH
H H
C
O
H 1 '
H O
O
CH2O
H
O H
O H
O
CH2HO
O
H
OHO
C H3
O HO H
HO
28
1''
6'
1'''
4 ''
24
12
25
3
1213
8
6
27
26
23
22
21
30
29
15
17
19
18
20
179
5 7
25
14
11
10
Resultados e Discussão
32
TABELA 4 – Comparação dos dados práticos de RMN 13C para o asiaticosídeo
com a literatura (MAEDA et al., 1994)*
Carbono
Valores práticos
Valores da literatura*
Carbono Valores práticos
Valores da literatura*
C-1 46,5 47,8 Glucose’ Glucose’
C-2 68,9 68,9 C-1’ 95,8 95,6
C-3 80,5 78,1 C-2’ 73,7 73,9
C-4 42,7 43,6 C-3’ 77,9 77,9
C-5 49,2 48,1 C-4’ 70,6 70,9
C-6 18,5 18,4 C-5’ 78,1 77,1
C-7 32,8 33,1 C-6’ 69,6 69,3
C-8 39,7 40,2
C-9 47,6 48,0 Glucose’’ Glucose ‘’
C-10 38,3 38,3 C-1’’ 104,5 104,8
C-11 23,3 23,8 C-2’’ 76,7 75,3
C-12 125,4 126,0 C-3’’ 76,9 76,4
C-13 138,4 138,5 C-4’’ 72,3 78,6
C-14 42,3 42,5 C-5’’ 75,3 78,2
C-15 28,2 28,7 C-6’’ 61,9 61,3
C-16 24,4 24,5
C-17 48,2 48,4 Ramnose Ramnose
C-18 53,0 53,2 C-1’’’ 102,9 102,6
C-19 39,2 39,3 C-2’’’ 79,5 72,5
C-20 39,0 39,0 C-3’’’ 72,2 72,7
C-21 30,8 30,8 C-4’’’ 73,8 73,7
C-22 36,8 36,8 C-5’’’ 70,9 70,2
C-23 70,4 66,4 C-6’’’ 17,9 18,4
C-24 13,0 14,3
C-25 17,1 17,6
C-26 17,2 17,8
C-27 23,9 23,7
C-28 178,2 176,3
C-29 17,3 17,3
C-30 21,3 21,3
Resultados e Discussão
33
4.2.4 Quantificação do asiaticosídeo por CLAE/UV
4.2.4.1 Curva de calibração do asiaticosídeo
Para a curva de calibração (Figura 13), a equação da reta é y = 2,555782.102x –
1,754834.103, coeficiente de correlação 0,995197, desvio padrão relativo (RSD%) 4,472%.
O intervalo foi definido entre 20,53% e 246,38% da concentração teórica do teste, visto
que a concentração de asiaticosídeo na planta pode sofrer variações (sazonalidade,
estabilidade por exemplo).
FIGURA 13 - Curva de calibração do asiaticosídeo
4.2.4.2 Otimização das condições analíticas
A fase móvel escolhida foi água/acetonitrila 70:30 v/v pois esta proporcionou a
melhor resolução do pico com menor tempo de retenção (Figura 14).
Resultados e Discussão
34
FIGURA 14 - Cromatograma de CLAE para o extrato bruto da Centella asiatica
Os espectros no UV correspondentes aos picos do asiaticosídeo padrão e do
mesmo no extrato bruto (figura 15), confirmam a identidade dele bem como seu
comprimento de onda de absorção máxima (210 nm).
FIGURA 15 - Perfil no UV do asiaticosídeo e do mesmo no extrato bruto
ASIATICOSÍDEO NO EXTRATO BRUTO
ASIATICOSÍDEO PADRÃO
Resultados e Discussão
35
4.2.4.3 Otimização do método de extração
De acordo com a literatura (VERMA et al., 1999), dentre vários líquidos
extratores testados (clorofórmio, acetato de etila, metanol, etanol e água), a extração mais
eficiente do asiaticosídeo da planta teria sido com metanol. Naquele trabalho o
procedimento utilizado foi deslipidificação com hexano (3 x 20 mL) do pó seco da planta
(1 g) seguido de extrações com metanol (3 x 20 mL; 4h). O líquido extrator foi filtrado e
teve seu volume reduzido. O extrato foi re-suspendido em metanol (3 mL), novamente
filtrado e analisado em CLAE.
Para facilitar as operações de agitação, sonicação e centrifugação, foi reduzida a
escala da extração que foi feita em microtubos de polipropileno. Dessa forma o tempo
necessário para preparação das amostras foi menor do que aquele descrito em literatura.
Durante a extração do material vegetal para isolamento dos princípios ativos,
verificou-se que a mistura metanol/água 7:3 apresentava bons resultados. Por isso,
resolveu-se testar esta mistura de solventes para extração do asiaticosídeo e posterior
quantificação. Foram realizadas três extrações sucessivas do mesmo material vegetal (100
mg, n= 5) tanto com metanol puro (Figura 16) como com metanol/água 7:3 v/v (Figura
17).
FIGURA 16 - Extrações metanol 100% de 100 mg de Centella asiatica
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5
Replicatas
ug
de
as
iati
co
síd
eo
ex
tra
ído
de
10
0 m
g d
e
pla
nta
primeira
extração
segunda
extração
terceira
extração
Resultados e Discussão
36
FIGURA 17 - Extrações metanol 70% de 100 mg de Centella asiatica
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5
Replicatas
ug
de
as
iati
co
síd
eo
ex
tra
ído
de
10
0 m
g d
e
pla
nta
primeiraextraçãosegundaextraçãoterceiraextração
De acordo com os resultados acima, pode-se concluir que três extrações
sucessivas não são suficientes para fazer a extração completa do asiaticosídeo. Além disso,
o método não foi reprodutível, ou seja, os valores obtidos para a mesma extração nas cinco
replicatas foram muito díspares. Uma possível causa para estes valores erráticos, poderia ser
a relação entre a massa de material vegetal e o volume do líquido extrator. Na tentativa de
obter resultados mais reprodutíveis, a quantidade de amostra foi reduzida de 100 mg para
50 mg, mantendo-se a mesma quantidade de líquido extrator (1,5 ml). Foram realizadas
cinco extrações consecutivas de cada replicata (n= 5) (Figuras 18 e 19).
FIGURA 18 –Extrações metanol 100% de 50 mg de Centella asiatica
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5
Replicatas
ug
de a
sia
tico
síd
eo
extr
aíd
o d
e
50 m
g d
e p
lan
ta
FIGURA 19 - Extrações metanol 70% de 50 mg de Centella asiatica
Resultados e Discussão
37
0
50
100
150
200
250
300
350
1 2 3 4 5
Replicatasu
g d
e a
sia
tico
síd
eo
extr
aíd
o d
e
50 m
g d
e p
lan
ta
primeiraextraçãosegundaextraçãoterceiraextraçãoquartaextraçãoquintaextração
O teor de asiaticosídeo obtido nas cinco extrações realizadas com metanol/água
7:3 v/v foi de 1,06 mg% (DPR = 6,34 %), enquanto que o teor do analito em metanol
100% foi de 0,906 mg% (DPR = 2,81 %). Estes resultados indicam que as extrações
realizadas com metanol/água 7:3 v/v foram mais eficientes do que aquelas com metanol
puro. A primeira extração, das cinco realizadas com metanol/água 7:3 v/v, extraiu
aproximadamente 87% de todo asiaticosídeo da amostra e três extrações foram suficientes
para extrair todo o analito, diminuindo o número de etapas na metodologia. Já a primeira
extração, das cinco realizadas com metanol puro, extraiu aproximadamente 78% de todo
asiaticosídeo da planta, sendo necessárias quatro extrações para extrair todo o analito. O
procedimento testado, portanto, produziu melhores resultados do que aqueles descritos na
literatura (VERMA et al.,1999).
Os resultados acima mostram a importância de dois parâmetros para a extração de
metabólitos de matrizes vegetais. O primeiro é a relação massa da amostra/volume do
líquido extrator. Para que o analito seja solubilizado é necessário que haja uma boa difusão
do solvente para o interior da matriz. Caso o volume do solvente seja inferior ao ideal, o
contato com a matriz é prejudicado dificultando a solubilização do analito de forma
homogênea e reprodutível. A proporção 33,3 mg/ml, utilizada no segundo experimento,
foi a mais adequada.
O segundo parâmetro importante é a natureza do líquido extrator. A mistura
metanol/água utilizada, mais polar, foi mais eficiente do que metanol puro para a extração
do asiaticosídeo, que é uma substância muito polar.
Resultados e Discussão
38
4.2.5 Preparação do extrato bruto seco no spray dryer
A técnica do spray dryer é um método mecânico no qual uma solução ou dispersão
é atomizada em uma câmara de evaporação, causando a rápida solidificação da superfície
das gotículas atomizadas originando partículas (GONÇALVES, 1999). Muito utilizada
industrialmente a técnica é também empregada na microencapsulação de moléculas
bioativas como enzimas e fármacos (ALVES et al., 2004). Trata-se de um método de fácil
manejo, inclusive para obtenção de extrato seco de plantas, na forma de um fino pó,
provenientes de extração com solvente. Neste caso, a padronização do pó é facilitada, visto
que a matéria-prima é sólida e livre dos componentes da matriz vegetal podendo, inclusive,
apresentar maior prazo de validade, auxiliando na fabricação de medicamentos.
Para a preparação do extrato seco da Centella asiatica, foram realizadas quatro
extrações do seu pó usando água como solvente. As extrações foram feitas com métodos
distintos e tinham como objetivo analisar qual método extrairia mais asiaticosídeo (Tabela
6). Em paralelo, foi realizada também, uma extração com metanol/água 7:3 v/v (chamada
de extração M), porém antes de levá-la à secagem no spray dryer foi necessário retirar todo o
metanol, uma vez que o equipamento utilizado não comporta o uso de solventes orgânicos.
Resultados e Discussão
39
TABELA 5 – Resultados do teste de resíduo seco (RS) para cada extração de
asiaticosídeo (mg/ml) da Centella asiatica
Replicatas (n= 3) Extração A
Extração B
Extração C
Extração D
Extração M
1 13,90 11,46 12,10 14,120 49,643
2 13,94 11,48 13,40 14,440 49,641
3 13,66 11,68 12,20 14,180 49,637
Total extraído (média) 13,833 11,540 12,567 14,247 40,640
Os resultados mostram que a extração M apresentou maior rendimento do
resíduo seco gerado, contendo maior quantidade de substâncias polares, como açúcares,
por exemplo. Entretanto, isto não significa que o asiaticosídeo estará em maior quantidade
na extração M.
O rendimento da secagem no spray dryer (Tabela 7) foi calculado através de
comparação da massa de extrato seco obtido e o valor teórico. Este parâmetro é
importante, pois durante o processo de spray dryer há perda de pó. O valor teórico foi
calculado a partir da determinação do resíduo seco (RS), que é obtido através da
evaporação, até peso constante, de um volume determinado de extrato aquoso. O
experimento foi realizado em replicata (n=3) (Tabela 6).
TABELA 6 – Rendimento (g) da secagem em spray dryer das diferentes extrações
da Centella asiatica
Extrações Valor Teórico Spray dryer
A 8,301 4,3524
B 6,924 5,5278
C 7,540 5,6682
D 8,547 5,5395
M 16,256 2,4490
Resultados e Discussão
40
Os resultados mostram que, apesar da extração M ter apresentado um maior
rendimento no teste do resíduo seco, ela foi a extração que apresentou mais perdas durante
o processo do spray dryer. Uma explicação possível para o fato é que esta metodologia
possivelmente extraiu mais lipídeos que as outras e os mesmos permanecem mais
“grudados” na vidraria do equipamento.
Para verificar em qual das extrações existe mais asiaticosídeo e para verificar a
estabilidade do mesmo quanto às condições utilizadas no spray dryer (150 ºC), o glicosídeo
foi quantificado antes e após a obtenção dos extratos secos (Tabela 8).
TABELA 7 – Teor de asiaticosídeo nas diferentes extrações realizadas com a
Centella asiatica e nos respectivos extratos secos gerados no spray dryer
Teor de Asiaticosídeo (mg%) Extrações
Antes do spray dryer Depois do spray dryer
A 0,721 0,206
B 0,773 0,198
C 0,622 0,231
D 0,657 0,246
M 1,297 0,786
Estes resultados mostram que, dentre as metodologias utilizadas, a metodologia
da extração M é a mais adequada para a extração do asiaticosídeo e que todos os extratos
secos gerados após a secagem em spray dryer, apresentaram uma perda no teor de
asiaticosídeo: nas extrações aquosas a perda, em média, foi de 68% e na extração com
metanol 70% (extração M) a perda foi de aproximadamente 20%. Essa diminuição pode
estar relacionada com a instabilidade do analito frente a altas temperaturas, uma que no
processo do spray dryer, ela foi mantida a 150 ºC.
Resultados e Discussão
41
4.2.6 Teor de asiaticosídeo em extratos comerciais
A análise de três amostras comerciais de Centella asiatica permitiu avaliar o método
analítico e comparar o teor de asiaticosídeo em amostras de origens diversas.
Dentre as três amostras (SP, CL e X) usadas para quantificação, a amostra X,
obtida na forma de cápsulas, contendo extrato seco padronizado da planta apresentava em
cada cápsula 50,47 mg de extrato seco sendo 6 mg uma mistura de asiaticosídeo e
madecassosídeo. Os valores do teor de asiaticosídeo encontrado em cada uma estão
apresentados a seguir (Tabela 5).
TABELA 8 – Teor de asiaticosídeo em amostras diversas* de Centella asiatica
Amostras Teor de Asiaticosídeo (mg%)
SP 0,097
CL 0,582
X 4,689
*SP= fino pó; CL= planta seca; X = cápsulas contendo extrato seco padronizado
Comparando estes valores com os da literatura (VERMA et al.,1999) que é de
0,36% e com o obtido neste trabalho (1,06%), pode-se concluir que o teor de asiaticosídeo
na planta depende da sazonalidade, bem como do método de secagem, uma vez que o
método de extração foi o mesmo aplicado nas diferentes amostras. Um outro fator a ser
levado em conta é a contaminação do material vegetal com o princípio ativo.
4.3 Cynara scolymus
4.3.1 Métodos de extração
O extrato hidrometanólico “A” da Cynara scolymus foi submetido a partição com os
solventes de polaridade crescente (YUNES et al., 2003). Após análise das frações por CCD,
foi possível concluir que o ácido clorogênico estava presente, em maior quantidade, na
Resultados e Discussão
42
fração hidrometanólica “B”. Esta fração foi concentrada e fracionada em uma coluna de
fase reversa PC-18.
Foram realizados experimentos iniciais em micro-escala, com o objetivo de definir
as condições a serem utilizadas em escala preparativa.
Analisando a CCD (Figura 20) da separação realizada em escala preparativa pode-
se observar que a eluição com 100% água produziu o ácido clorogênico quase puro. O
produto obtido foi refracionado, nas mesmas condições, o que levou ao isolamento do
ácido clorogênico (7 mg) como um sólido amarelado.
FIGURA 20 - CCD das frações do extrato Cynara scolymus obtido com coluna PC-
18 “FLASH” em escala preparativa*
• Mancha 1: extrato bruto;
• Manchas 2-4: frações eluídas com água;
• Manchas 5-6: frações eluídas com
água/metanol 9:1.
* fase estacionária= sílica; fase móvel = acetato de
etila/água/ácido acético/ácido fórmico 10:2,3:1,1:1,1;
visualização = UV 365 nm.
4.3.2 Caracterização do ácido clorogênico
O espectro no IV (Anexo 7.7) mostrou bandas largas em 3414 e 3172 cm-1,
características de estiramento de ligação O-H de ácidos carboxílicos, e uma forte absorção
em 1600 cm-1 típica de deformação axial de ligação C=O. Observou-se ainda bandas em
1400 e 1357 cm-1 típicas de sistema aromático, assim como bandas de estiramento de
ligação C-O em 1278, 1158 e 1121 cm-1 (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRIL, 1994).
A análise do espectro de RMN de 1H evidenciou, quando comparado com dados
da literatura (BERREGI et al., 2003), conformidades com os deslocamentos químicos do
composto ácido clorogênico (Anexo 7.8). Os sinais do ácido clorogênico são indicados na
região do espectro expandido (anexo 7.9), pelos deslocamentos químicos de d 7.19, 6,93 e
Resultados e Discussão
43
7,12 (m, 2, 5 e 6-H), d 6,37 (d, J = 15,58 Hz, 2’-H) e d 7,67 (d, J = 15,58 Hz, 1’-H). Valores
iguais de deslocamento químico para os dois dubletos dos hidrogênios 1’ e 2’, indicam que
estes hidrogênios da ligação dupla estão acoplando um com o outro e valores de
deslocamento químico da ordem de 15 indicam que estão na posição E.
FIGURA 21 - Fórmula estrutural do ácido clorogênico
C
OHOH
O OHO
OH
OH
COOH
ÁcidoClrorogênico
A partir dos dados de RMN de 1H, espectro no infravermelho juntamente com
dados da literatura, verificou-se que o composto isolado trata-se do ácido clorogênico
(ácido 5-O-cafeoilquinico).
4.3.3 Quantificação do ácido clorogênico por CLAE/UV
4.3.3.1 Curva de calibração para o ácido clorogênico
Para a curva de calibração (Figura 22), a equação da reta é de y = 3,785778.103 x –
7,275649.103, coeficiente de correlação 0,999644, e RSD = 9,105%. O intervalo foi
definido entre 14,62% e 233,88% da concentração teórica do teste, visto que a
concentração de ácido clorogênico na planta pode sofrer variações (sazonalidade,
estabilidade por exemplo).
FIGURA 22 - Curva de calibração do ácido clorogênico
2’
2
1’
6
5
Resultados e Discussão
44
Com os dados acima foi possível calcular a concentração de ácido clorogênico na
planta. Este valor é 0,654% enquanto que na literatura (SCHUTZ et al., 2004) o valor
encontrado foi 0,314%.
4.3.3.2 Otimização das condições analíticas
De acordo com a literatura (SUÁREZ et al., 2005) a fase móvel utilizada para
quantificação de polifenóis, incluindo o ácido clorogênico, é água/metanol em gradiente
linear de metanol/água 0:100 a 45:55 v/v em 55 minutos e em seguida no modo isocrático
por 20 minutos. Nestas condições, o tempo de retenção do ácido clorogênico é de
aproximadamente 40 min.
Como um dos objetivos do presente trabalho era a quantificação do ácido
clorogênico, a fase móvel escolhida foi água/metanol 77:23 v/v. A escolha dela baseou-se
na melhor resolução do pico do analito com o menor tempo de retenção,
aproximadamente 7 minutos (Figura 23). A otimização do tempo de retenção é muito
importante, pois além de proporcionar menor tempo de análise, favorece também uso de
menor quantidade de solvente.
Resultados e Discussão
45
FIGURA 23 - Cromatograma de CLAE do extrato bruto da Cynara scolymus
Os espectros no UV correspondentes aos picos do ácido clorogênico padrão e do
mesmo no extrato bruto (Figura 24) confirmam a identidade dele bem como seu
comprimento de onda de absorção máxima (330 nm).
Resultados e Discussão
46
ÁCIDO CLOROGÊNICO PADRÃO
ÁCIDO CLOROGÊNICO NO EXTRATO BRUTO
FIGURA 24 - Perfil no UV do ácido clorogênico e do mesmo no extrato bruto
4.3.3.3 Otimização do método de extração
Dentre os líquidos extratores testados, a água foi a que apresentou maior tamanho
de pico com menor número de interferentes. Observou-se que a primeira extração retirou
aproximadamente 80% do ácido clorogênico e a partir da quarta extração não foi
visualizado mais o pico do composto. O teor de ácido clorogênico extraído por extração e
por replicata (n= 3) estão expressos na tabela a seguir.
Resultados e Discussão
47
TABELA 9 - Teor de ácido clorogênico (mg) em extratos de Cynara scolymus (100
mg) após três extrações sucessivas.
Replicatas 1a Extração 2a Extração 3a Extração Total
1 0,5443 0,0949 0,0359 0,6752
2 0,5173 0,0882 0,0321 0,6376
3 0,5621 0,1061 0,0315 0,6997
4 0,4837 0,0994 0,0328 0,6160
5 0,5049 0,1063 0,0310 0,6422
Média 0,5225 0,0990 0,0327 0,6542
Desvio Padrão 2,4436 0,6022 0,1519 2,5974
Desvio Padrão
Relativo% 5,9631 7,7540 5,9249 5,0623
Conclusões
48
5 Conclusões
Os resultados descritos neste trabalho mostraram que é viável a preparação de
uma fase estacionária reversa, PC-18, utilizando infra-estrutura simples. A aplicação bem
sucedida da fase preparada foi confirmada no isolamento de dois metabólitos secundários,
o asiaticosídeo e o ácido clorogênico de Centella asiatica e Cynara scolymus, respectivamente,
pois além das substâncias isoladas apresentarem propriedades químicas diferentes
(polaridade, grupo funcional, etc), o método utilizado em cada caso também foi
diferenciado e ambos apresentaram ótimos resultados. Vale ressaltar também que
utilizando a PC-18 para isolamentos, diminuiu-se o uso de solventes orgânicos, uma vez
que a fase móvel utilizada baseia-se na água como fase móvel.
A metodologia analítica, principalmente com relação ao método de preparação da
amostra, desenvolvida para a quantificação do asiaticosídeo em Centella asiatica, mostrou-se
superior àquela descrita em literatura, uma vez que através dela foi possível quantificar
produtos de diferentes origens por uma metodologia que requer um menor número de
etapas, uso de menor quantidade do material de partida e solvente mais adequado para
extração do princípio ativo, tornando a análise mais rápida e com menores custos. Os
produtos de diferentes origens analisados, apresentaram teores significativamente
diferentes de asiaticosídeo.
Além da metodologia para isolamento do ácido clorogênico ter apresentado
ótimos resultados, pois trata-se de um composto de alta polaridade e de grande interesse
comercial, a metodologia analítica empregada para a quantificação do mesmo em Cynara
scolymus também foi muito satisfatória, principalmente no que diz respeito a fase móvel
utilizada, pois a mesma pode oferecer um menor tempo de retenção do que os encontrados
em literatura apresentando uma boa definição do pico, o que garante uma análise mais
rápida, evitando o uso excessivo de solvente orgânico grau HPLC diminuindo também o
custo do processo.
Referências Bibliográficas
49
6 Referências Bibliográficas
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Disponível em: http://www.aquabase.com.br. Acesso em 18jun. 2006
Disponível em: http://unioeste.br. Acesso em 18jun. 2006
Anexos
55
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
10
20
30
40
50
60
70
472
611
1096
1384
1619
1637
2920
34823552
3414
% t
ransm
itância
número de onda (cm-1)
7.1 Espectro no IV para o asiaticosídeo em KBr
HO
HO
CH2
O H
H H
C
O
H 1 '
H O
O
CH2O
H
OH
OH
O
CH2HO
O
H
O HO
CH3
OHOH
HO
28
1''
6'
1 '''
4''
24
12
25
3
1213
8
6
27
26
23
22
21
30
29
15
17
19
18
20
179
5 7
25
14
11
10
C=O C=C
O-H
C-O
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
10
20
30
40
50
60
70
472
611
1096
1384
1619
1637
2920
34823552
3414
% t
ransm
itância
número de onda (cm-1)
C=O C=C
O-H
C-O
Anexos
56
p p m ( f1 )0 .01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .0
5.3
00
0
5.2
79
9
5.2
52
3
5.2
44
0
4.6
17
2
4.3
81
1
4.3
61
4
3.5
16
7
3.4
84
3
3.4
78
9
3.4
56
2
3.4
33
2
3.4
03
5
3.3
13
8
3.3
09
8
3.3
05
7
3.3
01
7
3.2
97
6
1.3
46
4
1.2
96
5
1.2
84
9
1.2
72
6
1.2
57
0
1.1
23
4
1.0
52
8
0.9
72
9
0.9
06
6
0.8
90
6
0.8
31
1
0.6
93
3
3.0
0
2.7
83
.69
3.8
32
.90
3.1
9
2.3
33
.79
13
.53
5.9
6
1.4
0
10
.80
2.4
0
7.2
7
1.1
71
.13
1.0
4
1.2
71
.16
0.9
1
7.2 Espectro de RMN de 1H para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 400 MHz.
HO
HO
CH2
O H
H H
C
O
H 1 '
H O
O
CH2O
H
OH
OH
O
CH2HO
O
H
O HO
CH3
OHOH
HO
28
1''
6'
1 '''
4''
24
12
25
3
1213
8
6
27
26
23
22
21
30
29
15
17
19
18
20
179
5 7
25
14
11
10
Anexos
57
7.3 Expansões do espectro de RMN de 1H para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 400 MHz.
ppm (f1 )1 .001.50
1.3
46
4
1.2
96
5
1.2
84
9
1.2
72
6
1.2
57
0
1.1
23
4
1.0
52
8
0.9
72
9
0.9
06
6
0.8
90
6
0.8
31
1
0.6
93
3
3.0
0
2.7
8
3.6
9
3.8
3
2.9
0
3.1
9
2.3
3
3.7
9
13
.53
Anexos
58
7.4 Expansões do espectro de RMN de 1H para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 400 MHz.
ppm (f1 )4 .505 .00
5.3
00
0
5.2
79
9
5.2
52
3
5.2
44
0
4.6
17
2
4.3
81
1
4.3
61
4
1.0
4
1.2
7
1.1
6
0.9
1
Anexos
59
7.5 Espectro de RMN de 13C para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 100 MHz.
HO
HO
CH2
O H
H H
C
O
H 1 '
H O
O
CH2O
H
OH
OH
O
CH2HO
O
H
O HO
CH3
OHOH
HO
28
1''
6'
1 '''
4''
24
12
25
3
1213
8
6
27
26
23
22
21
30
29
15
17
19
18
20
179
5 7
25
14
11
10
ppm (f1)050100150200
21
0.2
0
17
7.9
9
13
9.3
6
12
6.9
6
10
4.4
8
10
2.8
8
95
.84
79
.50
78
.18
77
.90
76
.86
76
.71
75
.29
73
.80
73
.76
72
.44
72
.23
70
.98
70
.65
69
.71
69
.63
66
.29
61
.90
54
.10
49
.45
49
.23
49
.02
48
.81
48
.59
44
.15
43
.42
40
.98
40
.42
40
.25
39
.01
37
.63
33
.61
31
.72
30
.72
29
.30
25
.26
24
.55
24
.03
21
.61
19
.11
18
.09
17
.95
17
.87
14
.01
C-28
C-13
C-29
C-12 C-1’
C-1’’
C-1’’’
Anexos
60
7.6 Expansões do espectro de RMN de 13C para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 100 MHz.
p p m (f1 )1 5 .02 0 .025 .030 .03 5 .04 0 .045 .0
44
.15
43
.42
40
.98
40
.42
40
.25
39
.01
37
.63
33
.61
31
.72
30
.72
29
.30
25
.26
24
.55
24
.03
21
.61
19
.11
18
.09
17
.95
17
.87
17
.69
14
.01
C-25
C-29
C-27
C-24
C-26 C-6’’’
Anexos
61
7.7 Expansões do espectro de RMN de 13C para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 100 MHz.
ppm ( f1 )55 .06 0 .06 5 .07 0 .075 .080 .0
79
.50
78
.18
77
.90
76
.86
76
.71
75
.29
73
.80
73
.76
72
.44
72
.23
70
.98
70
.65
69
.71
69
.63
66
.29
61
.90
54
.10
C-23 C-6’’
C-6’
C-3
C-2 C-4’’
Anexos
62
7.8 Espectro de DEPT 135 para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 100 MHz.
C-11
21
ppm (f1)050100
12
6.9
5
10
4.4
7
10
2.8
7
95
.83
79
.45
78
.14
77
.89
76
.85
76
.70
75
.28
73
.78
73
.75
72
.44
72
.21
70
.94
70
.64
69
.70
69
.60
66
.22
61
.88
54
.09
48
.89
48
.15
48
.10
40
.41
40
.25
37
.62
33
.60
31
.72
30
.72
29
.29
25
.25
24
.55
24
.03
21
.61
19
.09
18
.08
17
.95
17
.87
17
.70
14
.02
-0.0
00
00
C-6’’ C-6’ C-22 C-23
C-1 C-6
7
15
16
Anexos
63
7.9 Espectro de HSQC para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 100 MHz.
p p m (f2 )1 .0 01 .5 02 .0 0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
p p m ( f1 )
Anexos
64
7.10 Espectro de HMBC para o asiaticosídeo
Espectro adquirido em metanol deuterado a 100 MHz. As correlações estão em destaque.
p pm ( f2 )0 .01 .02 .03 .04 .05 .0
0
50
10 0
15 0
20 0
pp m ( f1 )
H-1’/C-28
H-1’’/C-6’ e C-1’’
H-1’’’/C-4’’ e C-1’’’
Anexos
65
7.11 Espectro no IV para o ácido clorogênico em KBr
C
OHOH
O OHO
OH
OH
COOH
ÁcidoClrorogênico
3900 3600 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1500 1200 900 600
20
30
40
50
60
70
80
90
100
604
672
775
985
1121
11
58
127
8135
71
400
160
0
3172
341
4
número de onda (cm-1)
% tra
nsm
itâ
ncia
2’
2
1’
6 5
O-H
C-O
C=O
Anexos
66
7.12 Espectro de RMN de 1H para o ácido clorogênico
Espectro adquirido em água deuterada a 200 MHz.
C
OHOH
O OHO
OH
OH
COOH
ÁcidoClrorogênico
5
pp m ( f1 )0 .02 .55 .07 .5
7.6
72
4
7.6
33
1
7.1
95
9
7.1
53
4
7.1
35
3
7.1
19
8
6.9
50
6
6.9
45
6
6.9
35
0
6.4
13
3
6.3
74
7
1.0
0
2.6
9
1.3
5
0.8
0
2’
2
1’
6 5
2 2’ 1’ 6
Anexos
67
p p m ( f1 )6 .0 06 .2 56 .5 06 .7 57 .0 07 .2 57 .5 07 .7 58 .0 0
7.6
72
4
7.6
33
1
7.1
95
9
7.1
53
4
7.1
35
3
7.1
19
8
6.9
50
6
6.9
45
6
6.9
35
0
6.4
13
3
6.3
74
7
1.0
0
2.6
9
1.3
5
0.8
0
2’
2
1’
6 5
1’ 2 6
5 2’
7.13 Expansão do espectro de RMN de 1H para o ácido clorogênico
Espectro adquirido em água deuterada a 200 MHz.
C
OHOH
O OHO
OH
OH
COOH
ÁcidoClrorogênico