cinética da resposta imune inata induzida por diferentes … · 2018-11-20 · obrigado por tudo....

Universidade Federal de Ouro Preto - UFOP Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

Cinética da resposta imune inata induzida por diferentes adjuvantes vacinais

Fernando Augusto Siqueira Mathias

OURO PRETO, MG

Agosto, 2013

Fernando Augusto Siqueira Mathias

Cinética da resposta imune inata induzida por

diferentes adjuvantes vacinais

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas como parte das exigências para obtenção do grau de mestre na área de Imunobiologia de Protozoários pela Universidade Federal de Ouro Preto

Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis

Co-Orientadora: Dra. Cláudia Martins Carneiro

OURO PRETO, MG 2013

Mathias, F. A. S. Colaboradores

ii

Dra. Juliana Vitoriano de Souza I

Dra. Paula Melo de Abreu Vieira II

Dra. Nádia das Dores Moreira II

Ms. Bruno Mendes Roatt II

Ms. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares II

Ms. Jamille Mirelle de Oliveira Cardoso II

I - Instituto Butantan, São Paulo

II - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

(NUPEB/UFOP)

Mathias, F. A. S. Epígrafe

iii

Na vida, não vale tanto o que temos, nem tanto importa o que somos. Vale o que realizamos com

aquilo que possuímos e, acima de tudo, importa o que fazemos de nós! (Chico Xavier)

Mathias, F. A. S. Dedicatória

iv

À minha Família, que me apoiou em todos

os momentos de minha caminhada e me deu

força para cumprir mais uma etapa da minha

vida.

Mathias, F. A. S. Agradecimentos

v

A Deus, por iluminar meus passos, dar força, paciência, perseverança e felicidade para conduzir

esse trabalho em harmonia com tantas pessoas que me auxiliaram nesse processo.

A meus pais, inabaláveis, vocês foram minha força nessa caminhada, muito obrigado pelas

orações, apoio, conselhos, segurança e incentivo para seguir sempre em frente, sem vocês isso

jamais teria ocorrido, amo vocês.

A minha Irma, Maria Augusta, por todos os bons momentos vividos, por toda ajuda, carinho e

dedicação. Você é como uma segunda mãe, te amo. Ao meu irmão Luiz Augusto, pela amizade e

companheirismo.

A minha Tia Isaura, por sempre estar presente e acreditar em mim, me apoiar em todas as horas

desde o início de minha graduação em Ouro Preto. Obrigado por tudo.

A incrível e única Republica Vira Saia, que mais que uma casa, se tornou minha família em Ouro

Preto, com a qual sempre pude contar nos momentos mais difíceis e felizes nessa cidade. Meu

obrigado aos irmãos virassaianos que tornaram essa caminhada muito mais fácil.

Aos amigos de Guaratinguetá, que mesmo com a distância torceram por mim, e de certo modo

estão sempre presentes.

A Letícia, pelos anos de convivência, apoio e amizade, obrigado por tudo.

Ao meu orientador professor Alexandre Barbosa Reis por toda a confiança e oportunidade de

executar esse trabalho e participar de um grupo tão unido quanto o nosso. Obrigado por todos

ensinamentos, paciência e ajuda no decorrer de todos esses anos.

A professora Cláudia por todo auxilio, exemplo de seriedade, dedicação, amor à pesquisa e

profissionalismo desempenhado no laboratório, fazendo com que esse grupo seja o que é. Muito

obrigado.

Mathias, F. A. S. Agradecimentos

vi

A Dra. Juliana Vitoriano de Souza, que com muita paciência, amizade e dedicação auxiliou no

meu processo de formação desde a iniciação científica. Muito obrigado por ter confiado em mim

para dar continuidade a esse trabalho, pelas palavras amigas de incentivo e cobrança em todos os

momentos apesar da distância. Desejo a você toda felicidade do mundo e sempre que puder te

ajudar em algo pode contar comigo.

Aos colaboradores desse trabalho, em especial a Paula, Nadia, Bruno e Rodrigo, que além da

grande amizade e convívio que proporcionaram, arregaçaram as mangas e me ajudaram na hora

mais difícil desse trabalho. Não existem palavras para agradecer toda ajuda e ensinamentos

passados ao longo de todos esses anos. São exemplos de profissionais a serem seguidos. Muito

Obrigado.

Aos meus grandes amigos, irmãos, Jamille Mirelle e Levi Eduardo, que entraram junto comigo

nessa caminhada desde a iniciação científica nos tempos de autoclave e que continuaremos

juntos no doutorado. Obrigado por todas as risadas, ferrações, rocks e companherismo.

A todos os alunos de IC que ajudaram nesse trabalho, em especial a Mariana Trevisan que me

ajudou na confecção das laminas histológicas, aos domingos para preparar os animais para as

necropsias nos dias seguintes. Obrigado.

A Flávia, Wendel, Carol, Ana, Kátia, Sheler, Henrique, Rory, Gleise, Luísa, Aline, Lucilene,

Renata, Tânia, Maria, Laser, Leoneide e a todos os demais integrantes da família LIMP/LPC

pelo ótimo convívio, amizade e apoio.

A UFOP e ao NUPEB, pela oportunidade de realizar uma pós-graduação de qualidade.

Ao CCA e todos os seus funcionários pela disposição e alegria sempre, no cuidado e manutenção

dos animais fundamentais para a realização da pesquisa científica.

Aos camundongos utilizados nesse projeto, pequenos soldados da ciência, sem eles nada seria

possível.

Mathias, F. A. S. Resumo

vii

Adjuvantes são substâncias que atuam na resposta imune inata e quando combinadas a vacinas com antígenos específicos, são capazes de produzir uma resposta mais intensa ao antígeno alvo. Adjuvantes atuam de várias formas para apresentar um antígeno para o sistema imune. Podem atuar como um sistema de depósito para antígenos, apresentando o antígeno durante um longo período de tempo. Além disso, essas substâncias são extremamente atrativas para o desenvolvimento de novas formulações vacinais contra várias doenças como a leishmaniose visceral. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar a resposta imune induzida por uma dose única dos adjuvantes: Hidróxido de alumínio (Al(OH)3), Adjuvante Completo de Freund (ACF), Montanide Pet Gel A (MPGA), glicopiranosil lipídio A (GLA-SE) e Resiquimod (R-848) inoculados na pele de camundongos. Animais sensibilizados com salina foram utilizados como grupo controle. Os dados obtidos após a sensibilização com os adjuvantes demonstraram que todos adjuvantes foram capazes de promover alterações hematológicas nos leucócitos totais, bem como nas diferentes subpopulações. A análise fenotípica do sangue periférico mostrou que os animais imunizados com o adjuvante ACF (12h), GLA-SE e R-848 (24h) tiveram uma redução na subpopulação de linfócitos T CD4+, enquanto que os adjuvantes R-848 (12h) e MPGA (24h) apresentaram uma redução inicial de linfócitos T CD8+. A população de linfócitos B CD19+ também foi avaliada, na qual foi possível observar alterações em todos os grupos, contudo, os animais sensibilizados com os adjuvantes Al(OH)3 e GLA-SE apresentaram um aumento inicial em 24h. Em relação às células NK CD49b+, demonstraram distintos perfis nas diferentes imunizações com os adjuvantes, onde os animais dois grupos Al(OH)3 e R-848 reduziram nos tempos de 24h e 12h respectivamente. Os animais dos outros grupos apresentaram um aumento tardio: ACF (96h), MPGA (168h) e GLA-SE (168h). A população de monócitos CD14+ também foi avaliada, e os resultados mostraram que todos os adjuvantes, com a exceção do MPGA (96h) apresentaram um aumento recente. A avaliação dos níveis séricos de óxido nítrico induzido pelos distintos adjuvantes foi realizada nesse trabalho. Nossos resultados demonstram que os adjuvantes Al(OH)3 e ACF não foram capazes de induzir produção de NO, em contraste com os outros adjuvantes que mostraram um aumento em 1h e 12h (R-848), 48h (GLA-SE) e 168h e 336h (MPGA). O estudo histomorfológico foi realizado no local da imunização para avaliar a habilidade dos adjuvantes promover recrutamento celular. Os animais inoculados com o adjuvante Al(OH)3 não apresentaram diferenças entre os tempos da cinética, todavia, difere do grupo controle em toda análise. Os outros grupos demonstraram aumento já nos tempos iniciais. Os animais inoculados com o adjuvante ACF mostraram um aumento no recrutamento entre os tempos de 12h à 48h. Os animais inoculados com o adjuvante MPGA mostrou aumento na migração a partir de 48h, o grupo GLA-SE mostrou aumento entre os temos de 12h e 168h e finalmente os animais inoculados com R-848 mostraram grande recrutamento nos tempos de 1h, 24h e 48h. Assim, nossos dados demonstraram que os adjuvantes vacinais induziram recrutamento celular para o local do inóculo bem como mudanças nas células presentes no sangue periférico. Contudo, essas alterações apareceram em tempos distintos, provavelmente devido ao fato de eles terem diferentes constituições e, portanto, perfis de respostas imunes distintas que devem ser consideradas na sua seleção como adjuvantes vacinais. Esses dados nos estimulam a dar prosseguimento nos estudos a fim de compreender melhor esses mecanismos para poder implementar em futuras formulações vacinais seguras e efetivas.

Mathias, F. A. S. Abstract

viii

Adjuvants are substances that act in the innate immune response and when combined to vaccines with specific antigens, are capable of producing a more intense response to the target antigen. Adjuvants can act in various ways to present an antigen to the immune system. Can act as a depot system for the antigen, presenting the antigen over a long period of time. Therefore, these substances are extremely attractive for the development of new vaccine formulations against various diseases such as visceral leishmaniasis. Thus, the aim of this study was to evaluate the immune response induced by a single dose of the adjuvants: aluminum hydroxide (Al(OH)3), Freund's Complete Adjuvant (FCA), Montanide Pet Gel A (MPGA), glucopyranosyl lipid A (GLA-SE) and Resiquimod (R-848) applied to the skin of mice. Animals sensitized with saline were used as control group. The data obtained after sensitization with adjuvant demonstrated that all adjuvants were able to promote hematological alterations in total leukocytes levels, as well as in different subpopulations. Phenotypic analysis of peripheral blood showed that the animals immunized with adjuvant CFA (12h), GLA-SE and R-848 (24h) had a reduction in the subpopulation of CD4+ T lymphocytes, whereas the adjuvants R-848 (12h), and MPGA (24h) presented initial reduction of CD8+ T lymphocytes. The population of CD19+ B lymphocytes was also evaluated, in which it was possible to observe changes in all groups, however, the animals sensitized with adjuvant Al(OH)3 and GLA-SE presented an increase in recent time 24h. Regarding CD49b+ NK cells, distinct profiles in different immunizations with adjuvant were shown, where the animals of groups Al(OH)3 and R-848 were reduced in 24h and 12h respectively. The animals of the other groups showed an increase in late times: CFA (96h), MPGA (168h) and GLA-SE (168h). The population of CD14+ monocytes was also evaluated, and the results showed that all adjuvants except MPGA (96h) presented a recent increase. Evaluation of serum levels of nitric oxide induced by different adjuvants was made in this work. Our results showed that the adjuvants Al(OH)3 and CFA were not able to induce NO production, in contrast to the other adjuvants which showed an increase in 1h and 12h (R-848), 48h (GLA-SE) and 168h and 336h (MPGA). A histomorphological study was conducted at the site of immunization to evaluate the ability of adjuvants to induce promoting cell recruitment. The animals inoculated with adjuvant Al(OH)3 showed no difference in recruitment between the times of the kinetics, however, differ in the control group throughout the analysis. The other groups showed increases already in the early times. The animals inoculated with adjuvant CFA showed an increase in recruitment between the times of 12h to 48h. The animals inoculated with adjuvant MPGA showed increased migration from 48h, the GLA-SE group showed an increase between the times of 12h to 168h and finally the animals inoculated with R-848 showed greater recruitment in times of 1h, 24h and 48h. Thus, our data demonstrate that the adjuvant vaccine induced cellular recruitment to the site of inoculation as well as changes in the cells present in peripheral blood. However, these changes appeared at different times, probably due to the fact that they have different constitutions and hence different ways to induce immune responses that should be considered in their selection as vaccine adjuvants. These data encouraged us to continue studies to better understand these mechanisms in order to implement in future safe and effective vaccine formulations.

Mathias, F. A. S. Índice

ix

1. Introdução ................................................................................................................................. 1

2. Revisão da literatura................................................................................................................. 5

2.1. Adjuvantes vacinais ............................................................................................................. 6

2.2. Associação de antígenos e adjuvantes em diferentes formulações vacinais anti-

Leishmania .................................................................................................................................. 7

2.3. Adjuvantes e ativação do sistema imune ........................................................................... 10

2.4. A pele como principal via de imunização .......................................................................... 14

3. Justificativa .............................................................................................................................. 16

4. Objetivos .................................................................................................................................. 18

4.1. Objetivo Geral .................................................................................................................... 19

4.2. Objetivos Específicos......................................................................................................... 19

5. Material e Métodos ................................................................................................................. 20

5.1. Animais e grupos experimentais ........................................................................................ 21

5.2. Parâmetros Avaliados ........................................................................................................ 22

5.2.1. Parâmetros Hematológicos ......................................................................................... 22

5.2.3. Dosagem de óxido nítrico no soro .............................................................................. 23

5.2.4. Imunofenotipagem do sangue periférico .................................................................... 24

5.2.5. Análise fenotípica de células do sangue periférico ..................................................... 25

5.2.6. Processamento e avaliação histológica da pele ........................................................... 26

5.2.7. Análises estatísticas .................................................................................................... 27

6. Resultados ................................................................................................................................ 28

6.1. Cinética de leucócitos do sangue periférico em camundongos sensibilizados com os

adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848) .............................................. 29

6.2. Análise do perfil fenotípico das células mononucleares no sangue periférico:

Subpopulação de Linfócitos T (CD4+ e CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD49b+) e

monócitos (CD14+) em camundongos imunizados com diferentes adjuvantes vacinais

(Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). ............................................................................. 34

6.3. Análise dos níveis de Nitrato (NO-3) + Nitrito (NO-2) sérico de camundongos

sensibilizados com os diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-

848) ........................................................................................................................................... 45

Mathias, F. A. S. Índice

x

6.4. Quantificação do infiltrado inflamatório na pele de camundongos sensibilizados com os

diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848) ............................. 47

7. Discussão .................................................................................................................................. 50

8. Conclusão ................................................................................................................................. 61

9. Perspectivas ............................................................................................................................. 63

10. Referências Bibliográficas .................................................................................................... 65

11. Anexo ...................................................................................................................................... 78

Mathias, F. A. S. Lista de Quadros

xi

Quadro 1: Principais adjuvantes já empregados em vacinas anti-Leishmania associados a

diferentes antígenos vacinais. ....................................................................................................... 10

Mathias, F. A. S. Lista de Figuras

xii

Figura 1: Delineamento experimental ......................................................................................... 22

Figura 2: Análise da frequência de células NK, linfócitos T e B e monócitos CD14+ ................ 26

Figura 3: Avaliação longitudinal da população de linfócitos T CD4+ no sangue periférico de

camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 36

Figura 4: Avaliação longitudinal da população de linfócitos T CD8+ no sangue periférico de


Figura 5: Avaliação longitudinal da população de linfócitos B CD19+ no sangue periférico de


Figura 6: Avaliação longitudinal da população de células NK CD49b+ no sangue periférico de

camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes. ......................................................... 42

Figura 7: Avaliação longitudinal da população de monócitos CD14+ no sangue periférico de


Figura 8: Avaliação longitudinal dos níveis séricos de NO em camundongos sensibilizados com

os diferentes adjuvantes ................................................................................................................ 46

Figura 9: Avaliação longitudinal do infiltrado celular na pele de camundongos sensibilizados

com os diferentes adjuvantes ........................................................................................................ 48

Figura 10: Fotomicrografias de cortes histológicos representativas do infiltrado celular na pele

de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes. .................................................... 49

Mathias, F. A. S. Lista de Quadros

xiii

Tabela 1: Avaliação longitudinal de leucócitos totais circulantes no sangue periférico de


Tabela 2: Avaliação longitudinal da população de neutrófilos circulantes no sangue periférico de


Tabela 3: Avaliação longitudinal da população de eosinófilos circulantes no sangue periférico de


Tabela 4: Avaliação longitudinal da população de monócitos circulantes no sangue periférico de


Tabela 5: Avaliação longitudinal da população de linfócitos circulantes no sangue periférico de


Mathias, F. A. S. Lista de Abreviaturas

xiv

ACF/CFA: Adjuvante Completo de Freund AIF: Adjuvante incompleto de Freund Al(OH)3: Hidróxido de Alumínio APCs: células apresentadoras de antígeno AS03: emulsão de óleo em água de tocoferol AS04: Associação dos adjuvantes MPL e BCG: Adjuvante Bacillus Calmette-Guerin CD14: Marcador de superfície celular de monócitos CD19: Marcador de superfície celular de linfócitos B CD3: Marcador de superfície celular de linfócitos T CD4: Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T auxiliares/indutores CD49b: Marcador de superfície celular de células NK CD8: Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T citotóxico/supressores DTH: resposta de hipersensibilidade tardia EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FAD: flavina-adenina dinucleótido FML: Fucose-manose ligante FSC: Forward Scatter/tamanho GLA-SE: Adjuvante Glicopiranosil Lipídio em solução estabilizadora gp63 glicoproteína 63 HBV: Vírus da Hepatite B HE: Hematoxilina-Eosina HPV: Vírus do Papiloma Humano IFN-γ: Interferon Gama IFN-α: Interferon alfa IFN-ω: Interferon ômega Ig: Imunoglobulinas IL: Interleucina iNOS: Inducible Nitric Oxide Synthase LBSap: Antígeno LB e Adjuvante Saponina LBSapSal: Antígeno LB, Adjuvante Saponina e proteínas de glândula de Lutzomyia longipalpis

LE: extrato de promastigota de Leishmania LeIF: fator de iniciação de alongamento em Leishmania LiESAp: Antígeno secretado e excretado de promastigotas de L. infantum LPS: Lipopolissacarídeo MDP: Adjuvante muramyl dipeptídeo MPGA: Montanide Pet Gel A MPL: Monofosforil Lipídio A MPL-SE®: Monofosforil Lipídio A em Solução estabilizadora NaNO2: Nitrito de sódio NK: células Natural Killer NO: Óxido Nítrico NO-2: Nitrito NO-3: Nitrato OVA: Ovalbumina PBMC: Peripheral Blood Mononuclears Cells/ Células Mononucleares do Sangue Periférico PBS: Phosphate Buffer Saline pDC: células dendríticas plasmocitóides PRRs: receptores de reconhecimento padrão Q+BCG: Vacina proteína quimérica associada ao Adjuvante Bacillus Calmette-Guerin QA-21: Fração purificada de saponina QS-21: Fração purificada de saponina R-837: Imiquimod R-848: Resiquimod rHA: glicoproteína recombinante hemaglutinina SE: Solução estabilizadora SMF: sistema mononuclear fagocitário SSC: Side Scatter/granulosidade cellular TGF-β: Fator de transformação do crescimento beta TLRs: receptores Toll-Like TNF-α: Fator de Necrose Tumoral alfa Treg: Células T Reguladoras TSA: Proteína antioxidante tiol-específico

1. Introdução

Mathias, F. A. S. Introdução

2

As Leishmanioses são doenças causadas por protozoários pertencentes à ordem

Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania (Ross, 1903). Apresentam como

formas evolutivas do parasito promastigotas e paramastigotas no tubo digestivo do inseto vetor e

formas amastigotas, capazes de invadir o sistema mononuclear fagocitário (SMF) do hospedeiro.

A transmissão dessa doença ocorre através da picada de fêmeas hematófagas infectadas dos

gêneros Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo (Lainson & Shaw, 1987).

As Leishmanioses possuem uma apresentação clínica espectral cujos sintomas variam em função

das diferentes manifestações da doença: cutânea, cutaneomucosa, difusa e visceral, de acordo

com a espécie de Leishmania causadora da infecção (WHO, 2010).

A estimativa é de 1,6 milhões de novos casos anualmente, onde cerca de 500.000 são da

forma visceral da doença (90% deles ocorrendo em Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e

Sudão) (WHO, 2010). O Brasil é responsável por cerca de 90% dos casos em todo continente

americano (Desjeux, 2004; MS, 2006).

Inicialmente considerada como uma doença tipicamente rural apresentou, a partir da

década de 70, uma mudança desse cenário característico passando também a assumir um perfil

epidemiológico também em ambiente urbano (Alves & Bevilacqua, 2004), tornando-se endêmica

em várias regiões metropolitanas brasileiras na década seguinte (Werneck et al., 2008).

No Brasil, os cães são considerados o principal reservatório doméstico do parasito e

mantenedores do ciclo epidemiológico da doença tanto no ambiente rural quanto no urbano

(Deane & Deane, 1954; Reis et al., 2009). Pesquisas sobre a infecção por L. infantum em cães

sugerem que o controle da leishmaniose visceral humana (LVH) depende de um controle efetivo

da leishmaniose visceral canina (LVC) (Alvar et al., 2004; Dantas-Torres & Brandão-Filho,

2006; Costa, 2008; Reis et al., 2009; Reis et al., 2010). Do ponto de vista epidemiológico, a LVC

é considerada mais importante do que a doença humana, visto que apresenta maior prevalência e

que muitos animais assintomáticos de áreas endêmicas possuem elevado parasitismo cutâneo

(Marzochi et al.,1985; Reis et al., 2006).

Diante disso, o Ministério da Saúde (MS) preconiza um “tripé” de ações para o controle

da LV que consiste no combate ao vetor, eliminação dos cães soropositivos e tratamento

sistemático dos casos humanos. Contudo, em função da crescente mudança na relação homem-

cão na sociedade, onde esses animais fazem “parte” da família, eutanásia de cães soropositivos

muitas vezes sem qualquer sinal clínico da infecção, torna-se cada vez mais questionável e difícil


3

de se manter no programa de controle, uma vez que o Brasil é o único país do mundo que ainda

pratica a eutanásia de cães soropositivos (Palatnik et al., 2001).

Neste contexto, a imunoprofilaxia surge como uma alternativa promissora para o controle

da infecção. Alguns autores sugerem a aplicação de uma vacina anti-LVC, como uma importante

medida de controle, tanto para reduzir a incidência da infecção canina quanto humana (Marzochi

et al.,1985; Palatnik et al., 2001; Borja-Cabrera., 2002;. Fujiwara et al., 2005; Giunchetti et al.,

2008; Fernandes et al., 2008; Duthie et al., 2012).

No histórico de desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose no Brasil podemos citar:

Leishvacin®, composta por antígenos de promastigotas de L. amazonensis sonicadas, contra a

leishmaniose tegumentar americana (LTA) e que foi produzida pela extinta Biobrás (Mayrink et

al., 1996); Leishmune® produzida pela Fordog que se encontra ainda em testes e vem sendo

utilizada em clínicas veterinárias sob autorização do Ministério da Agricultura e Abastecimento

(Palatnik et al,. 2001) e Leish-Tec® uma vacina com proteína purificada de L. donovani

associada a saponina (Fernandes et al., 2008)

Nesta busca por potenciais vacinas protetoras, nosso grupo de pesquisa desenvolveu duas

vacinas, sendo uma constituída de antígenos heterólogos de L. braziliensis associada à saponina

como adjuvante (LBSap) em processo de transferência de tecnologia para Ouro Fino

Agronegócios e outra vacina que apresenta a associação de proteínas de glândula de Lutzomyia

longipalpis (LBSapSal) (Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Roatt et al., 2012).

Todas as vacinas contra leishmaniose desenvolvidas até hoje, têm como ideal a indução

de uma resposta imune protetora capaz de ativar tanto a imunidade celular quanto a humoral

(Reis et al., 2010). Desse modo, uma vacina efetiva contra a LVC é aquela capaz de induzir uma

resposta celular com aumento de citocinas do tipo 1 pró-inflamatórias como IFN-γ, IL-12 e TNF-

α e a diminuição da produção de citocinas do tipo 2 (imunomoduladoras) como IL-4, IL-10 e

TGF-β e ainda, o aumento da resposta humoral através da produção de IgG1 e IgG2. Além disto,

uma vacina ideal contra LVC também deveria induzir aumento da produção de óxido nítrico

proporcionando aumento da atividade microbicida em macrófagos bem como aumento de

linfócitos T CD4+ e de linfócitos T CD8+ Leishmania-específicos (Reis et al., 2010).

Contudo há muitas dificuldades para alcançar uma vacina ideal. Nesse sentido, há

necessidade do desenvolvimento e aprimoramento de vacinas anti-LVC ou anti leishmaniose

visceral humana (LVH), através da escolha de antígenos e adjuvantes efetivamente capazes de


4

ativar o sistema imune e direcionar a uma resposta desejada. Neste contexto, nosso grupo de

pesquisa iniciou a busca racional por novos possíveis componentes vacinais capazes de

proporcionar uma resposta mais rápida, efetiva, segura e duradoura.

Dessa forma, Vitoriano-Souza (2012) realizou um estudo cinético da resposta imune local

e sistêmica induzida pelos adjuvantes Saponina, Adjuvante Incompleto de Freund e Monofosforil

Lipídio A isolados ou associados ao antígeno total de Leishmania (Viannia) braziliensis como

componente antigênico da vacina LBSap. A partir dos promissores resultados obtidos nesse

trabalho, o presente estudo buscou dar continuidade a essa linha de pesquisa, contribuindo para o

desenvolvimento de uma plataforma de testes na pré-seleção de adjuvantes vacinais através da

avaliação da resposta imune desencadeada pelos seguintes adjuvantes: Hidróxido de Alumínio,

Adjuvante Completo de Freund, Glicopiranosil Lipídio A, Montanide Pet Gel A e Resiquimod.

Sendo assim, após observar qual tipo de resposta cada adjuvante induz isoladamente, seremos

capazes de fazer uma pré-seleção de futuros candidatos para serem utilizados isolados ou em

associação em novas composições vacinais anti-Leishmania. Em um futuro próximo

pretendemos avaliar a associação de adjuvantes na potencialização da resposta Tipo 1

verificando a capacidade destas associações apresentarem efeitos sinérgicos.

2. Revisão da literatura

Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura

6

2.1. Adjuvantes vacinais

Adjuvantes (do latim adjuvare = ajuda) são substâncias potencializadoras da resposta

imune capazes de serem utilizadas em combinação com um antígeno específico e produzirem

uma resposta imune mais intensa que o antígeno isoladamente (Ramon, 1926). Tem sido descrito

que a inclusão de um adjuvante na formulação de uma vacina apresenta vários benefícios como

amplificação da resposta imune, tornando-a mais eficaz e duradoura, melhora da memória

imunológica, diminuição da dose do antígeno, além da redução do número de doses,

repercutindo diretamente na queda do custo total na produção dessa vacina (Tritto et al., 2009).

Mais recentemente tem sido proposta, em algumas vacinas, a associação de mais de um

adjuvante visando alcançar o efeito desejado de imunização. Um exemplo recente são as vacinas

contra HPV e HBV comercialmente conhecidas como Cervarix® e Fendrix® (GlaxoSmithKline

Biologicals, Rixensart, Belgium) que consistem na associação dos adjuvantes hidróxido de

alumínio e MPL e fosfato de alumínio e MPL, respectivamente (Kundi, 2007; Schiller et al.,

2012; Garcia-Agudo et al., 2012) já licenciadas para uso em diverso países. Esta estratégia tem

sido usada no desenvolvimento de uma vacina contra malária a partir da associação dos

adjuvantes MPL e QS-21 (fração purificada da saponina) (Otsyula et al., 2013), caracterizando

uma tendência da vacinologia moderna.

Desde a descoberta da capacidade adjuvante dessas substâncias até os dias atuais,

passaram-se mais de 70 anos, sendo que a busca por substâncias capazes de amplificar a resposta

imune a antígenos tem se intensificado cada vez mais (O'hagan, Vaccines adjuvants: preparation

methods and research protocols, 2000), por meio de várias estratégias para melhorar a

imunogenicidade e segurança de candidatos vacinais.

A fase inicial do desenvolvimento dos adjuvantes vacinais foi desencadeada através da

utilização, principalmente, de antígenos atenuados ou mortos como observado na vacinação

contra a varíola realizada por Jenner (Hackett, Vaccine adjuvants: Immunological and Clinical

Principles, 2006). Todavia, o estudo da toxidade mostrou ainda que essas vacinas apresentavam

toxicidade em sua aplicação. Posteriormente, em uma segunda fase, buscando diminuir os efeitos

da toxicidade causados pelas formulações na primeira fase, iniciou-se o estudo com compostos

minerais e emulsões como, por exemplo, sais de alumínio e óleo-água respectivamente (Hackett,

Vaccine adjuvants: Immunological and Clinical Principles, 2006).


7

Os sais de alumínio foram utilizados em vacinas humanas em 1920 e são os únicos

adjuvantes licenciados para uso nos Estados Unidos. Por outro lado, na Europa, na última

década, novos adjuvantes foram licenciados para sua utilização em vacinas humanas como

MF59, AS03 contra H5N1 e mais recentemente uma associação entre hidróxido de alumínio

Al(OH)3 e monofosforil lipídio A (MPL) chamado de AS04 utilizado nas vacinas contra HBV

(Fendrix®) e HPV (Cervarix®) (Tritto et al., 2009).

É importante salientar que muitos adjuvantes vacinais conhecidos e utilizados em

diferentes vacinas experimentais foram descobertos empiricamente, e o progresso de

compreensão dos seus mecanismos de ação tem se evoluído lentamente, explicando em parte o

baixo número de adjuvantes aprovados para uso humano (Calabro et al., 2011).

2.2. Associação de antígenos e adjuvantes em diferentes formulações vacinais anti-

Leishmania

As vacinas contra leishmaniose têm ganhado destaque nos últimos anos e tem sido cada

vez mais incentivado o seu uso como medida de controle contra essa doença. Durante essa busca

por novas vacinas, vários antígenos e adjuvantes vacinais foram utilizados, mostrando diferentes

níveis de proteção. Mayrink et al (1996) desenvolveram uma vacina para cães composta por

promastigotas de L. braziliensis associada ao BCG como adjuvante. A vacina foi considerada

segura e sua proteção, após desafio experimental com L. infantum foi de 90% (em um estudo

controlado de Fase II em canil fechado) a partir de esfregaços e de isolamento de parasitos em

cultura, ambos a partir de medula óssea (Mayrink et al., 1996). Molano et al (2003) avaliaram

uma vacina contendo adjuvante BCG, porém este foi associado a proteínas de ácido ribossomal

Lip2a, Lip2b, P0 e histona H2A (vacina quimérica - Q+BCG) e verificaram 50% de proteção nos

cães imunizados. A utilização de uma vacina composta por BCG recombinante expressando a

proteína de superfície de Leishmania gp63 levou a um aumento da resposta imune mediada por

células com uma proteção significante contra o desafio por L. major e L. mexicana em modelo

murino (Connel et al., 1993). Já Streit et al (2000) observaram que a utilização de uma vacina

contendo BCG expressando o antígeno LCR1de L. donovani resultou num aumento da resposta

do tipo 1 com produção aumentada de IFN-γ e redução de IL-10.


8

Na França, foi desenvolvida uma vacina composta de antígeno secretado e excretado de

promastigotas de L. infantum (LiESAp). Essa vacina induziu em ensaios in vitro aumento de

IFN-γ e dos níveis de óxido nítrico e, consequentemente, da proliferação de células

mononucleares e, por fim, da atividade leishmanicida por macrófagos ativados (Lemesre et al.,

2005). Este antígeno, (LiESAp) associado ao adjuvante muramyl dipeptídeo (MDP) produziu

aumento dos níveis de óxido nítrico levando ao aumento do efeito leishmanicida (Holzmuller et

al., 2005). Atualmente, esta vacina se encontra no mercado europeu sob o nome comercial de

CaniLeish® sendo produzida pela empresa Virbac na França e consiste na associação

LiESAp/QS-21 (fração purificada da saponina) (Moreno et al., 2012).

Outro adjuvante que foi utilizado no estudo de vacinas anti-Leishmania foi o Montanide

associado aos antígenos: histona de L. infantum (H1), proteína acilada hidrofílica B1 de

superfície de L. donovani (HASPB1), e a associação de ambos. Além disso, nesse estudo foi

utilizado o adjuvante MPL-SE® associado às proteínas TSA (antioxidante tiol-específico),

LmSTI1 (proteína 1 indutora de stress em L. major) e LeIF (fator de iniciação de alongamento

em Leishmania) (MML). A vacina H1 foi a que apresentou os melhores resultados com a

manutenção de baixo parasitismo em cães vacinados (Moreno et al., 2007).

A vacina anti-Leishmania, Leishmune®, foi desenvolvida a partir da preparação

glicoprotéica enriquecida de promastigotas de L. donovani, nomeado FML (fucose-manose

ligante) (Palatnik et al., 1993), antigênica para uso humano (Palatnik et al., 1995) e canino

(Borja-Cabrera et al., 1999), formulada com o adjuvante Quillaja saponaria saponin e passou

por ensaios de Fase I-III tornando-se licenciada no Brasil (Parra et al., 2007; Fort Dodge Saúde

Animal Ltda).

No Brasil, ainda existe outra vacina disponível para comercialização denominada Leish-

Tec® (Hertape Calier Saúde Animal S/A), licenciada no Ministério da Agricultura Pecuária e

Abastecimento (MAPA) para uso em cães. Esta vacina emprega a proteína recombinante de

amastigota A2 e o adjuvante saponina. Os resultados revelaram a indução de uma resposta imune

com a presença de IFN-γ, além de não converter os testes sorológicos que utilizam antígenos de

promastigotas, importante na discriminação entre os animais vacinados e infectados (Fernandes

et al., 2008).

Nosso grupo de pesquisa há mais de 20 anos ingressou nessa árdua tarefa de desenvolver

vacinas contra essa doença, e a partir do trabalho desenvolvido por Giunchetti (2007) que


9

possibilitou a elaboração de duas vacinas de primeira geração denominadas LBSap, constituída

por extrato de antígenos bruto de L. braziliensis associado ao adjuvante saponina e/ou associada

a saliva de Lutzomyia longipalpis (LBSapSal). Resultados preliminares demonstraram que a

vacina LBSap foi capaz de induzir uma forte atividade imunogênica após o processo vacinal,

particularmente relacionada a expansão de linfócitos T CD8+ circulantes e de linfócitos T CD8+

Leishmania-específicos (Giunchetti et al., 2007) (Quadro 1). Contudo, apesar desses resultados,

acreditamos que nossa tarefa de buscar uma vacina segura e eficaz dependa além do antígeno, da

escolha do adjuvante vacinal para alcançarmos uma resposta imune desejada. Portanto, a pré-

seleção de adjuvantes através da observação dos seus eventos imunológicos em camundongos é

fundamental para futuros testes de imunogenicidade e inocuidade de novas constituições vacinais

anti-Leishmania, podendo também ser aplicados na elaboração de outras vacinas, dependendo

dos resultados obtidos.


10

Quadro 1: Principais adjuvantes já empregados em vacinas anti-Leishmania associados a diferentes antígenos vacinais.

Autores/ Ano Adjuvante Antígeno/ Vacina Desafio Modelo Experimental

Mayrink et al., 1996 BCGL. braziliensis/

LeishvaccinL. infantum Cães

Molano et al., 2003 BCG

Lip2a, Lip2b, P0 e

histona H2A/ vacina

quimérica - Q+BCG

L. infantum Cães

Connel et al., 1993 BCG gp63 L. major e L. mexicana Camundongos

Streit et al., 2000

BCG expressando o

antígeno LCR1de L.

donovani

gp63 L. infantum Camundongos

Lemesre et al., 2005

Holzmuller et al, 2005

muramyl dipeptídeo

(MDP)

antígeno secretado e

excretado de

promastigotas de

L .infantum (LiESAp)

L. infantum Cães

Moreno et al., 2007 Montanide e MPL-SEH1, HASPB1, proteínas

TSA, LmSTI1, LeIFL. infantum Cães

Palatnik et al., 1993 SaponinaFML (fucose-manose

ligante)/ Leishmune®L. infantum Cães

Giunchetti et al., 2007 SaponinaL. braziliensis/

LBSapL. infantum Cães

Giunchetti et al., 2007 Saponina

L. Braziliensis

Saliva de Lutzomia

longipalpis/ LBSapSal

L. infantum Cães

Moretno et al., 2012 QA-21 LiESAp L. infantum Cães

2.3. Adjuvantes e ativação do sistema imune

Os adjuvantes podem apresentar comportamentos distintos dependendo da via de inóculo

escolhida para sua administração, do tipo de antígeno associado, assim como dos seus métodos

de preparação, natureza química ou sistema de entrega (dispersão em meio aquoso,

emulsificações ou mesmo encapsulados) (Guy, 2007). De forma geral, os adjuvantes têm seu

papel fundamental na ativação da resposta imune inata através de vários receptores de


11

reconhecimento padrão (PRRs) como os diversos receptores Toll-Like (TLRs). No entanto,

podem criar um microambiente celular adequado importante no direcionamento e diferenciação

de uma resposta imune adquirida tanto do Tipo 1 quanto do Tipo 2 (Korsholm et al., 2010).

Dentre os adjuvantes estudados, os sais de alumínio merecem destaque uma vez que estão

presentes na composição das vacinas humanas para tétano, difteria, poliomielite, hepatite A e B

entre outras (Lindblad, 2004). No entanto, muito pouco se sabe sobre os mecanismos de ação

relevantes na indução da resposta imune do tipo 2, com aumento na produção de IL-1, IL-4, IL-

5, IL-13 e IgE (Brewer et al., 1999). Acredita-se que os adjuvantes de alumínio não ativam o

sistema imune através de receptores Toll-like, mas sim por aumentar a estabilidade e

concentração do antígeno no local do inóculo (Schnare & Barton, 2001).

O BCG (Bacillus Calmette-Guerin) é um adjuvante capaz de induzir uma resposta mista,

mas predominantemente do Tipo 1, com produção de citocinas como IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-12,

entre outras (Wangoo et al., 2000; Luo et al., 2003). Este adjuvante esteve presente em diversas

formulações vacinais contra leishmaniose (Mauel, 2002; Ravindran & Ali, 2004), como

exemplificado anteriormente.

As saponinas são outra classe de adjuvantes pertencentes a um grupo de glicosídeos

triterpenos, obtidos na casa de árvores da espécie Quillaja saponaria, sendo muito utilizadas na

indústria de cosméticos e como fitoterápicos (Cox & Coulter, 1997; Sparg et al., 2004). Pode ser

utilizada nas formas de extrato cru, Quil A (parcialmente purificada) ou QS-21 (forma mais

purificada). Esse adjuvante apresenta um perfil de resposta mista com indução de uma resposta

do Tipo 1 (células TCD8+ e produção de IgG2a) além de uma resposta do Tipo 2 (Liu et al.,

2002).

Outro adjuvante clássico de grande importância é o Adjuvante Completo de Freund

(ACF), composto de bacilos mortos de Mycobacterium tuberculosis e uma emulsão água em

óleo. Amplamente utilizado em modelos experimentais para o estudo de doenças autoimunes

devido a sua grande capacidade imunogênica, ativando o sistema imune com consequente

recrutamento celular e produção de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, sabe-se que tanto

ACF quanto o AIF ativam o sistema imune via TLR-2 (Lim, 2002). A utilização do ACF leva a

uma resposta forte de longa duração com aumento nos níveis de anticorpos antígeno-específico

circulantes, aumento na resposta de linfócitos T, aumento na apresentação e ativação de células

dendríticas, devido aos componentes da parede celular de M. tuberculosis (Tsuji et al., 2000), e


12

uma resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) nos linfonodos drenantes, levando até a

formação de úlceras no local do inóculo. Além disso, tem sido demonstrada a formação de

granulomas nos tecidos tanto próximos quanto distantes do local do inóculo (Billiau e Matthys,

2001). Estudos com a utilização do Adjuvante Completo de Freund associado ao colágeno do

tipo II na imunização de camundongos DBA/1 mostraram que esse induz a produção das

citocinas IL-2, IFN-γ e IL-10 (Stasiuk et al., 1996).

Adjuvantes mais modernos também têm sido estudados e propostos na composição de

algumas vacinas. Nessa classe, o adjuvante Glicopiranosil Lipídio (GLA) surge como um

adjuvante sintético derivado de um Lipídio A Hexa-acilado, agonista de TLR4, induzindo uma

resposta do Tipo 1, principalmente a maturação de células dendríticas, com aumento na

expressão das moléculas CD40 e CD86 e concomitantemente a liberação de citocinas pró-

inflamatórias e quimiocinas (TNF-α, IL-6, IL-12p40, MCP-1, CCL5 e CXCL10) responsáveis

pelo tráfego celular (Coler et al., 2011). Esse adjuvante é análogo ao Lipopolissacarídeo (LPS),

todavia não apresenta sua toxicidade, um importante fator na escolha de um bom adjuvante.

Além disso, apesar de tanto o LPS quanto o Monofosforil lipídio A (MPLA) serem capazes de

induzirem uma resposta do Tipo 1, o GLA-SE que consiste na adição de uma emulsão óleo em

água estabilizadora (SE) apresenta uma resposta celular e humoral mais intensa (Pantel et al.,

2012).

Quanto ao seu uso em diferentes composições vacinais, o GLA-SE vem sendo estudado

na composição da vacina Fluzone® contra os vírus da Influenza (H1N1, H3N2) e tem

demonstrado resultados promissores tanto na resposta celular quanto na resposta humoral com a

produção de diversos anticorpos (Coler et al., 2010). Além disso, ele também vem sendo

empregado em associação com a glicoproteína recombinante hemaglutinina (rHA) na formulação

de uma vacina contra a gripe aviária (H5N1), onde observou-se novamente o aumento de uma

resposta do tipo 1 com proliferação de linfócitos TCD4+ produtores de interferons (Clegg et al.,

2012). Lambert e colaboradores (2012) realizaram um estudo em camubdongos comparando o

GLA apenas em emulsão aquosa com GLA-SE e observaram que apesar do último apresentar

uma resposta mais intensa, ambos ativaram TLR4 pelas vias de sinalização dependentes de

MyD88 e TRIF com aumento na expressão de genes para quimiocinas (CXCL9, CXCL10,

CCL2, CCL3 e MCP-1), além de citocinas como TNF-α e IFN-γ no sangue.


13

Outro grupo de adjuvantes que vêm sendo estudados são os pertencentes a família

imidazoquinolina como o Imiquimod (R-837) e o Resiquimod (R-848), agonistas de TLR7.

Foram denominados de modificadores da resposta imune e foram descobertos em 1980 (Wu et

al., 2004). Esses adjuvantes são capazes de ativar células dendríticas plasmocitóides (pDC),

principais células produtoras de interferon no sangue como IFN-α e IFN-ω. Além disso, o

Resiquimod estimula as pDC a produzirem outras citocinas como TNF-α e IP-10, aumentando

também expressão de CCR7, marcadores de co-estimulação e a viabilidade dessas células

(Gibson et al., 2002). Ahonen et al também observaram que a utilização do Resiquimod leva a

um aumento da maturação das células dendríticas induzindo a expressão de moléculas de

superfície como CD83, CD80, CD86 e CD40, além da produção de citocinas pró-inflamatórias

(IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-α) e quimiocinas (IL-8, MIP-α, MCP-1), aumentando assim a

proliferação de linfócitos T (Ahonen et al., 1999). Dessa forma, Wagner e Ahonen (1999)

demonstraram que tanto o Imiquimod quanto o Resiquimod são adjuvantes que além de

direcionar para uma resposta imune do tipo 1 com a produção de IFN-γ e ativação de células

TCD4+ e TCD8+, atuam também como moduladores de uma resposta do tipo 2, com inibição na

produção de citocinas IL-4 e IL-5.

Recentemente, o adjuvante polimérico Montanide vem sendo testado para o uso

veterinário. Parker et al. (2009) conduziram um estudo avaliando a eficácia e segurança do

Montanide frente a imunização com diversos compostos antigênicos em vários modelos animais.

Esse adjuvante demonstrou-se seguro e sem reações intensas no local do inóculo (Parker et al,

2009), podendo exercer seu mecanismo de ação através de diversas formas, incluindo a liberação

lenta do antígeno, recrutamento e estimulação de APCs (Aucouturier et al., 2002)

Resultados do trabalho desenvolvido com a vacina contra o vírus da Hepatite C em

camundongos Balb/c utilizando os adjuvantes CpG ODN e Montanide ISA 720 (um adjuvante a

base de óleo e um agente emulsificador da família monoleato de manide) mostraram uma forte

produção de IFN-γ por células TCD4+ e altos títulos de anticorpos, principalmente IgG2a,

direcionando assim para uma resposta predominantemente do tipo 1 mais intensa do que o CpG

ODN separado (Qiu et al., 2008).

Contrário a outros trabalhos, durante a triagem clínica de fase 1 para o desenvolvimento

de uma vacina contra o vírus da AIDS (HIV) com o adjuvante Montanide foi demonstrado um

alto índice de reações inflamatórias de moderadas a intensas, com formação de granulomas em


14

alguns casos nos voluntários (Toledo et al., 2001), mostrando assim, que apesar de ser um bom

indutor de uma resposta celular e humoral, apresenta problemas quanto as reações inflamatórias

no local do inóculo.

Dentro desse contexto da seleção de novos adjuvantes para melhorar a composição e

eficácia de vacinas contra leishmaniose, nosso grupo de pesquisa iniciou os estudos nessa área

que culminou no trabalho de Vitoriano-Souza et al., (2012) no qual foram avaliadas a cinética do

recrutamento celular e a produção de citocinas na pele de camundongos sensibilizados com os

adjuvantes vacinais: Saponina, Adjuvante Incompleto de Freund (AIF) e MPLA. Nesse estudo

foi possível observar que todos os adjuvantes estudados promoveram um recrutamento celular

para o local do inóculo, principalmente de neutrófilos, macrófagos e linfócitos além da produção

de citocinas com o perfil Tipo 1 (IL-2, IL-6, IFN-γ e TNF-α), Tipo 2 (IL-4) e Tipo 17 (IL-17)

(Vitoriano-Souza et al., 2012). Contudo, apresentaram peculiaridades importantes para a pré-

seleção de algum adjuvante para ser associado aos antígenos de Leishmania patenteados pelo

nosso laboratório. Além disso, esses resultados descritivos nos incentivaram a continuar esta

linha de pesquisa, com a análise de outros adjuvantes vacinais visando avaliar os tipos celulares e

o microambiente imune induzidos individualmente por essas substâncias antes de testarmos

diferentes composições vacinais.

2.4. A pele como principal via de imunização

Como uma interface de proteção entre órgãos internos e o meio ambiente, a pele se

depara com uma série de toxinas, organismos patogênicos e estresses físicos. Para combater

esses ataques contra o microambiente cutâneo, a pele funciona mais do que como uma barreira

física, sendo um órgão imunológico ativo. Respostas imunes na pele envolvem um arsenal de

células imunocompetentes e modificadores de resposta imunobiológica, incluindo citocinas

(Salmon et al., 1994).

Dentre as rotas de imunização parenteral, a pele destaca-se por ser um local que funciona

como órgão imune. Além disso, proporciona uma conexão com os capilares linfáticos e veias que

levam até os órgãos periféricos do sistema imune, como os linfonodos (Puri et al., 2000).

A rota intradérmica apresenta a vantagem de entregar o antígeno e fatores para a

maturação das células dendríticas no compartimento que elas residem, tornando mais rápida a


15

apresentação de antígenos e consequentemente migração para o linfonodo drenante (Disis et al.,

1996). Puri e colaboradores demonstraram que a administração intradérmica de microesferas foi

primeiramente distribuída das camadas da derme e da epiderme, que contém inúmeras células

imunes como as células de Langerhans, queratinócitos, melanócitos, linfócitos, leucócitos

migrantes, mastócitos e macrófagos (Puri et al., 2000). Em conjunto, as células da epiderme,

atuam como um reservatório imenso de modificadores da resposta imune. As citocinas

produzidas na epiderme permitem recrutar e ativar uma grande variedade de células

inflamatórias (Salmon et al., 1994; Puri et al., 2000). Muitas destas citocinas são liberadas a

partir da epiderme quando a barreira cutânea é comprometida, seja por trauma direto, infecções

ou toxinas. A liberação local destas citocinas e a absorção sistêmica através do plexo vascular

superficial da derme superior servem como um sinal de início para o sistema imune do

hospedeiro que a barreira externa (pele) foi comprometida (Salmon et al., 1994). Dessa forma,

por ser um órgão imune de fácil acesso, a pele torna-se um local de imunização atrativo para

utilização em protocolos vacinais.

Visto que a escolha do adjuvante é importante no direcionamento da resposta imune

desejada em uma vacina, esse trabalho possui como proposta o estudo da resposta imune inata

induzida pelos adjuvantes vacinais: Adjuvante Completo de Freund (ACF), Resiquimod (R-848),

Glicopiranosil lipídio A (GLA-SE®), Hidróxido de Alumínio (Al(OH)3) e Montanide Pet Gel A

(MPGA). Deste modo, buscando avaliar possíveis alterações no perfil de células sanguíneas após

os diferentes tempos foi realizado leucograma do sangue e a contagem diferencial em esfregaços

sanguíneos. Além disto, fragmentos de pele foram coletados para confecção de lâminas e

subsequente análise histopatológica. Também foram avaliados os níveis de óxido nítrico sérico.

Esses dados contribuirão para o entendimento dos mecanismos inflamatórios da resposta imune

inata importante para o direcionamento da resposta imune adaptativa.

3. Justificativa

Mathias, F. A. S. Justificativa

17

Apesar de serem utilizados há mais de setenta anos em composições vacinais, ainda são

poucos os adjuvantes licenciados para o uso humano pelos órgãos reguladores, devido

principalmente ao fato de que em sua maioria foram descobertos de forma empírica e seus

mecanismos de ação ainda são pouco compreendidos e explorados. Além disto, ainda são

escassos os ensaios pré-clínicos e clínicos que determinam o grau de tolerância, inocuidade e

toxicidade dos adjuvantes.

Considerando essa escassez de estudos referentes aos mecanismos imunes induzidos por

adjuvantes, é de fundamental importância a compreensão sobre os processos pelos quais esses

atuam na ativação da resposta imune. Deste modo, torna-se relevante a observação dos eventos

de migração celular no local do inóculo através da análise do perfil celular induzido pelos

adjuvantes, essenciais na composição e no desenvolvimento de um microambiente imune. O

entendimento desses eventos auxiliará na compreensão desse microambiente que está

intimamente relacionado ao recrutamento celular e aumento da apresentação de antígenos

importantes na formação e direcionamento da resposta imune adaptativa, que dependendo do

adjuvante utilizado poderá apresentar um perfil do Tipo 1, Tipo 2 ou uma resposta mista. Sendo

assim, o presente estudo buscou elucidar, não só o envolvimento desses mecanismos, mas

também a busca racional através do rastreamento das ações dos adjuvantes no contexto in vivo e

ex vivo em aplicações vacinais por meio de ensaios pré-clínicos que permitirão seu futuro uso em

protocolos imunoterapêuticos.

4. Objetivos

Mathias, F. A. S. Objetivos

19

4.1. Objetivo Geral

Avaliar a cinética da resposta imune inata induzida por diferentes adjuvantes vacinais em modelo

murino.

4.2. Objetivos Específicos

Nos intervalos de 1, 12, 24, 48, 96, 168 e 336 horas após a sensibilização com os adjuvantes

vacinais:

• Quantificar e diferenciar as populações de leucócitos no sangue periférico;

• Analisar o perfil fenotípico das células mononucleares no sangue periférico: Linfócitos T

CD3+ (CD4+ e CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD49b+) e monócitos (CD14+);

• Quantificar os níveis de óxido nítrico (NO) sérico;

• Determinar as alterações histológicas na pele.

5. Material e Métodos

Mathias, F. A. S. Material e Métodos

21

5.1. Animais e grupos experimentais

Para realização deste estudo, foram utilizados 210 camundongos machos Mus musculus

albinos da linhagem Swiss com aproximadamente um mês de idade. Os animais utilizados nesse

trabalho foram obtidos no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro

Preto (UFOP). Durante os experimentos, os animais foram acondicionados em gaiolas

apropriadas e oferecidos água e ração comercial ad libitum, diariamente.

Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade

Federal de Ouro Preto/UFOP registrado sob o parecer N° 2011/26. Todos os procedimentos

foram realizados de acordo com os princípios éticos preconizados pelo COBEA (Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal).

No Fluxograma 1 encontra-se o delineamento experimental deste estudo. Os animais

foram inoculados pela via intradérmica na região dorsal com diferentes adjuvantes vacinais em

dose única e avaliados após 1, 12, 24, 48, 96, 168 e 336 horas. Os animais foram distribuídos em

seis grupos experimentais (n=5 por grupo/hora), além de um grupo controle inoculado com

solução salina estéril 0,9% por via intradérmica, conforme descrito abaixo.

Grupo CS (Controle Salina): inoculado com 50μL de solução salina estéril 0,9% (controle

salina);

Grupo ACF (Adjuvante Completo de Freund): inoculado com 50μL do adjuvante completo

de Freund (Sigma Chemical CO, St Louis, USA);

Grupo MPGA (Montanide Pet Gel A): inoculado com 50μL do adjuvante Montanide Pet Gel

A® (Seppic, Paris, França) ;

Grupo GLA-SE: inoculado com 50μL do adjuvante Glicopiranosil Lipídio A (Alexis

Biochemicals, San Diego, USA) (emulsão estável -GLA-SE) na concentração de 50μg por dose;

Grupo Al(OH)3: inoculado com 50μL do adjuvante Hidróxido de Alumínio (Sigma-Aldrich Co

St. Louis, MO, USA) na concentração de 180μg por dose;

Grupo Resiquimod (R-848): inoculado com 50μL do adjuvante Resiquimod (Sigma Chemical

CO, St Louis, USA) na concentração de 25μg por dose.


22

As doses inoculadas de cada adjuvante tiveram volume final estabelecido em 50μL, dose

recomendada para o modelo murino utilizando a via intradérmica para imunização, em

conformidade com o estabelecido pelo Guidelines for the Research Use of Adjuvants of Animal

Care na Use Staff (http://oacu.od.nih.gov/ARAC/freunds.pdf). As concentrações utilizadas dos

adjuvantes foram fundamentadas de acordo com trabalhos da literatura.

Para a coleta de sangue, os animais foram anestesiados pela administração intraperitoneal

de tiopental sódico 2,5% diluído conforme instrução do fabricante (Tiopentax – Cristalia®,São

Paulo, Brasil, 30mg/Kg). Posteriormente, os animais receberam uma dose letal do anestésico e

foram necropsiados para obtenção dos fragmentos de pele do local do inóculo.

Al(OH)3CS ACF GLA-SE MPGA R-848

210 camundongos Swiss

1 12 24 48 96 168 336 Horas

Coleta de Sangue

Contagem Global de Leucócitos

Contagem Diferencialde Leucócitos Ex vivo

Dosagem NO séricoImunofenotipagem de células sanguíneas

Necropsia

Pele

Histopatologia (HE)

Figura 1: Delineamento experimental

5.2. Parâmetros Avaliados

5.2.1. Parâmetros Hematológicos


23

A coleta de sangue foi realizada com o anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-

acético) pelo plexo orbital com auxílio de uma pipeta, onde 50mL do sangue foram processados,

para a realização do hemograma no aparelho Auto Hematology Analyzer (Mindray BC-2800Vet,

Hamburgo, Alemanha). Dentre os parâmetros do hemograma, decidiu-se avaliar apenas a global

de leucócitos (leucograma) determinado em número de leucócitos/mm3, pois não houve

alterações significativas em relação à série vermelha do sangue. A contagem diferencial de

células foi realizada utilizando aproximadamente 10ml de sangue para a confecção de esfregaços

sanguíneos corados com o corante Panótico Rápido InstantProv (Newprov®, Pinhais, Brasil) e

avaliada por microscopia óptica em objetiva de imersão. Desta forma, foi determinado o

percentual de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos, por meio da contagem de 100

leucócitos/lâmina. Cerca de 200μL de sangue coletado em EDTA foi utilizado para a realização

da imunofenotipagem das células mononucleares do sangue periférico, conforme será descrito

mais adiante.

Coletou-se também sangue em um tubo sem anticoagulante, centrifugado a 10000xg por 10

minutos para obtenção das amostras de soro para as análises de óxido nítrico (NO).

5.2.3. Dosagem de óxido nítrico no soro

A dosagem de óxido nítrico foi realizada de modo indireto no soro de camundongos

(Green & Wagner, 1982), onde foram detectados os níveis de nitrito (NO2-) e nitrato (NO3

-).

Alíquotas de 50mL foram previamente descongeladas e transferidas para tubos de 500mL

para serem diluídas em 50mL de água destilada. Para a conversão de nitratos a nitritos, foram

adicionados às amostras 30mL de um coquetel contendo 10mL de FAD (flavina-adenina

dinucleótido) (Sigma-Aldrich Co St. Louis, MO, USA), 10mL de NADPH (Fosfato de

dinucleótido de nicotinamida e adenina) (Sigma-Aldrich Co St. Louis, MO, USA) e 10mL de

Nitrato redutase (Sigma-Aldrich Co St. Louis, MO, USA). As amostras foram incubadas

overnight a temperatura de 37ºC. Após o tempo de incubação foi realizado o processo de

desproteinização através da adição de 10mL de Sulfato de Zinco (ZnSO4) (Sigma-Aldrich Co St.

Louis, MO, USA) seguido por cinco minutos de centrifugação a 5000 rpm. Após essa etapa

foram adicionadas a placas de 96 poços, 50mL das amostras preparadas e 50mL da solução de


24

Griess, em duplicata, incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente. O reagente foi

preparado na hora do uso, misturando partes iguais de duas soluções A e B na proporção de 1:1.

A Solução A era composta de Sulfanilamida 1% em H3PO4 2,5% e a solução B composta por

Naftilenadiamino 0,7%. As leituras foram realizadas no leitor de ELISA (Molecular Devices, E

Max, Berkeley, Califórnia, USA) a 540nm. Os resultados expressos em mM foram determinados

após a extrapolação de valores obtidos de uma curva padrão utilizando nitrito de sódio (NaNO2)

nas concentrações de 0,78 a 100mM para cada placa.

5.2.4. Imunofenotipagem do sangue periférico

O perfil imunofenotípico das populações e subpopulações de células do sangue periférico

de camundongos foi avaliado por citometria de fluxo. Anti-CD3 (PE Hamster anti-Mouse CD3,

clone 145-2C11, Biolegend), anti-CD4 (PercP-CyTM 5.5 Rat anti-Mouse CD4, clone RM4-5,

BD PharmingenTM), anti-CD8 (FITC Rat anti-Mouse CD8a, clone 5H10, Catalg), anti-CD14

(FITC Rat anti-Mouse CD14, clone Sa2-8, eBioscience), anti-CD19 (FITC Rat anti-Mouse

CD19, clone 6D5, Catalg) e anti-CD49b (FITC Rat Anti-Mouse CD49b, clone DX5, BD

PharmingenTM) foram os anticorpos monoclonais utilizados nesse experimento.

Para a realização desta metodologia, foram colocados 5μL do anticorpo monoclonal

previamente diluído em PBS estéril e 10% de soro de rato, seguido pela adição de 25μL de

sangue periférico total coletado em EDTA (Sigma-Aldrich Co St. Louis, MO, USA) em cada

tubo. Estas amostras foram homogeneizadas em vórtex e incubadas por 30 minutos à temperatura

ambiente e ao abrigo da luz. Após o período de incubação, as amostras foram submetidas à lise

dos eritrócitos, adicionando-se 2mL de solução de lise (Facs lysing solution - Becton Dickinson,

San Jose, EUA) em constante homogeneização em vórtex, incubadas por 10 minutos a

temperatura ambiente e então submetidas à centrifugação (600xg por 7 minutos a 18°C). O

sobrenadante foi descartado e iniciou-se a etapa de lavagem dos leucócitos com 3mL de PBS-

Wash (pH 7,4), empregando-se as mesmas condições de centrifugação anteriormente citadas.

Na etapa final, os leucócitos foram fixados com 200μL de solução fixadora (10g/L de

paraformaldeído, 1 % de cacodilato de sódio, 6,67g/L de cloreto de sódio, pH 7,2) e os

parâmetros fenotípicos e morfométricos das células presentes em cada tubo foram determinados

no citômetro de fluxo (FACScalibur® Becton Dickinson, Moutain View, CA, USA). Um total de


25

15.000 eventos foi lido para cada amostra. O programa CELLQuest® (Franklin Lakes, NJ, USA)

foi utilizado para a aquisição dos dados. O programa Flow Jo (Flow Cytometry Analysis

Software 7.6, Tree Star, Inc. Ashland, USA) foi utilizado para análise de dados. Ligações

inespecíficas foram monitoradas através de isotipos marcados com fluorocromos combinados

para fornecer controles negativos confiantes. Houve monitoração da autofluorescência através de

um controle negativo de suspensão de células incubadas na ausência de anticorpos marcados

com fluorocromos, mas na presença de tampões de diluição e de lavagem.

5.2.5. Análise fenotípica de células do sangue periférico

A análise da frequência de células mononucleares foi realizada de acordo com o fenótipo

selecionado. A avaliação das células NK e linfócitos T e B foi realizada através de análise

convencional, onde a população celular de interesse (R1) (Figura 1A) foi estabelecida para

linfócitos em gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC).

Após a seleção da região de interesse, a frequência de populações celulares, dentro de R1, foi

obtida em gráficos bidimensionais de distribuição pontual de fluorescência (Figura 1B).

A análise de monócitos CD14+ foi realizada a partir da construção de gráficos de

fluorescência FL1/anti-CD-14 FITC versus granulosidade (SSC) (Figura 1C).


26

Figura 2: Análise da frequência de células NK, linfócitos T e B e monócitos CD14+. (A) Gráfico de distribuição pontual tamanho versus granulosidade utilizado para a seleção da população de linfócitos – R1. (B) Gráfico de distribuição pontual FL1 versus FL2 utilizado para quantificar o percentual de células T CD8+ e linfócitos em R1. (C) Gráfico de distribuição pontual FL1 versus granulosidade utilizado para quantificar o percentual de monócitos CD14+.

5.2.6. Processamento e avaliação histológica da pele

As biopsias foram realizadas na sala de procedimento do Centro de Ciência Animal da

Universidade Federal de Ouro Preto, onde foram retirados fragmentos de pele previamente

demarcados que indicavam o local do inóculo dos diferentes adjuvantes (CS, Al(OH)3 ACF,

Montanide Pet Gel A, GLA-SE e Resiquimod). O material coletado foi dividido de forma

simétrica em duas amostras, sendo uma congelada em freezer -80ºC para análises imunológicas e

1K

800

600

400

200

00 200 400 600 800 1K

Gra

nulo

sida

de

Tamanho

A

100 101 102 103 104

CD8 - FITC

100

101

102

103

104

CD

3 -P

E

B

1K

800

600

400

200

0

Gra

nulo

sida

de

100 101 102 103 104

CD14 - FITC

C

1K

800

600

400

200

00 200 400 600 800 1K

Gra

nulo

sida

de

Tamanho

A

100 101 102 103 104

CD8 - FITC

100

101

102

103

104

CD

3 -P

E

B

1K

800

600

400

200

0

Gra

nulo

sida

de

100 101 102 103 104

CD14 - FITC

1K

800

600

400

200

0

Gra

nulo

sida

de

100 101 102 103 104

CD14 - FITC

C


27

a outra fixada em formol 10% tamponado, e posteriormente, processada no histotécnico (OM

CM 69, Metal. OMA LTDA, São Paulo, Brasil) e incluída em parafina. Estes procedimentos

operacionais são padrões do laboratório de Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas (LIMP/NUPEB/UFOP).

Após o processamento histológico, o material foi cortado em micrótomo (5 mm) para a

obtenção de uma fita de tecido que foi depositada sobre uma lâmina de vidro e corada pelo

método de Hematoxilina/Eosina (HE) para avaliação das alterações histopatológicas, bem como

para quantificação do infiltrado inflamatório.

As células inflamatórias presentes na derme/epiderme foram quantificadas em 20

imagens aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 mm2). As imagens visualizadas pela

objetiva de 40x foram digitalizadas através da microcâmera Leica DM5000B acoplada ao

microscópio Leica e do programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1 Leica Microsystems-

Switzerland-Ltd). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado programa Leica QWin V3

(Leica Microsystems-Switzerland-Ltd). A escolha pela análise em 20 imagens foi devido a um

estudo prévio no laboratório onde foi realizada uma curva de estabilidade avaliando o número

necessário de campos que deveriam ser obtidos para que assim pudesse ser representativo do

todo.

5.2.7. Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prisma 5.0

(Prism Software, Irvine, CA, USA). Para a confirmação da normalidade dos dados foi utilizado o

teste Kolmogorov-Smirnoff. Posteriormente foi realizada a análise de variância (ANOVA one-

way) seguido do teste de Turkey para determinar as diferenças específicas entre os grupos em

relação ao infiltrado celular na pele, contagem diferencial e global de leucócitos no sangue

periférico e níveis de óxido nítrico no soro. Em todas as análises estatísticas as diferenças foram

consideradas significativas quando o valor de P<0,05.

6. Resultados

Mathias, F. A. S. Resultados

29

Os resultados obtidos nesse trabalho serão descritos inicialmente através de uma

abordagem longitudinal, ou seja, serão mostradas diferenças significativas obtidas dentro do

mesmo grupo experimental ao longo dos tempos da cinética. Posteriormente, será apresentada

uma análise comparativa dos grupos sensibilizados com os adjuvantes em relação ao grupo

controle.

6.1. Cinética de leucócitos do sangue periférico em camundongos sensibilizados com os

adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848)

Devido à capacidade de adjuvantes ativarem a resposta imune inata levando ao

recrutamento celular, decidiu-se avaliar o impacto gerado tanto na população de leucócitos totais

circulantes quanto nas distintas subpopulações (neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos)

durante a cinética (1h, 12h, 24h, 48h, 96h, 168h e 336h) após o inóculo com os diferentes

adjuvantes (Hidróxido de Alumínio - Al(OH)3, Adjuvante completo de Freund - ACF,

Montanide Pet Gel A-MPGA, Glicopiranosil Lipídio A-GLA-SE e Resiquimod - R-848).

Na análise longitudinal foi observado no grupo MPGA um aumento significativo de

leucócitos totais circulantes em 48h. Já nos grupos GLA-SE, R-848 e Al(OH)3 observou-se um

aumento mais tardio no tempo de 96h e no grupo ACF em 336h (Tabela 1). Quando os

adjuvantes foram comparados com o grupo controle ao longo da cinética observou-se nos grupos

GLA-SE e R-848 aumento significativo de leucócitos totais nos tempos de 48h e 96h, enquanto

no grupo MPGA aumento em 48h e no grupo Al(OH)3 foi observado aumento em 96h (Tabela

1).


30

Tabela 1: Avaliação longitudinal de leucócitos totais circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h

CS 2825±505,8 2980±766,2 2580±1078 2460±926,3 2540±1071 3420±1013 4040±1667

Al(OH)3 2280±788,7 2960±1403 2760±433,6 3220±1394 5740±867,8 5880±1535 3000±2166

ACF 2540±705,7 2800±620,5 3080±622,1 3500±547,7 2920±630,1 3360±1148 4560±1165

MPGA 1960±687,7 2080±719 3280±1599 4260±907,2 3520±1052 4120±1621 3900±935,4

GLA-SE 2920±1188 4860±2198 3500±1239 4520±1487 7260±1415 4950±1725 5500±761,6

R-848 2400±1056 2580±1057 3420±759,6 4760±1917 4940±1696 3860±929 5680±955

a,b,e

*

*

a,c *

a* a,b

a,b,c * a,b,c,d

a*

Após a análise de leucócitos totais circulantes foi avaliado os valores absolutos nas

populações de neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos.

A avaliação da cinética da população de neutrófilos circulantes mostrou aumento

significativo no período mais tardio de 336h no grupo ACF, enquanto que no grupo Al(OH)3

observou-se aumento nos tempos de 96h e 168h. Já o grupo estimulado com o adjuvante GLA-

SE apresentou um aumento dessa população inicialmente no tempo de 12h (Tabela 2). Na

comparação com o grupo controle, observou-se que os grupos GLA-SE e R-848 apresentaram

aumento significativo a partir de 12h que seguiu até os tempos tardios de 96h e 168h,

respectivamente. Além disso, nos grupos Al(OH)3 e MPGA observaram-se diferenças nos

tempos tardios de 96h e 168h, respectivamente (Tabela 2).


31

Tabela 2: Avaliação longitudinal da população de neutrófilos circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h

CS 728,3±123,6 432,8±130,4 537,6±211,3 487±131,3 563,6±192,1 653±272,7 1132±392,6

Al(OH)3 517,6±236,8 686,2±476,8 677±101 722,4±307,6 1784±394,2 1613±649,4 271,7±214,7

ACF 543,2±92,71 623,6±299,7 662,4±231,5 787,8±241,9 617,6±75,33 714,6±284,3 1330±633,1

MPGA 566,4±319,5 793±283,7 1195±656,1 1065±378,8 719,8±212,7 1350±491,2 1170±483,2

GLA-SE 787,2±400,9 3562±1801 1210±283,9 1698±751,6 2582±932,1 1834±1028 1438±444,9

R-848 642±329,7 1089±483,1 963,8±109,5 1215±390 1173±400,6 1176±358,1 1152±214,8

a,b,c,d,g * a,b,c,d,g

b,c,d,e

a,b,c,e

a,c,g *

* *

* *

* *

*

*

*

Em relação à população de eosinófilos, observou-se nos grupos GLA-SE e Al(OH)3

aumento no tempo de 96h e no grupo MPGA aumento em 168h. Quando foi realizada a

comparação com o grupo controle apenas o grupo GLA-SE apresentou aumento significativo no

tempo de 96h (Tabela 3).


32

Tabela 3: Avaliação longitudinal da população de eosinófilos circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848) . Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h

CS 49,75±18,15 37,60±23,29 42,60±26,49 32,40±25,90 26±11,14 45,80±14,50 43,33±23,07

Al(OH)3 26,60±9,91 45,20±34,20 57,20±33,24 23±2,64 106,8±56,51 55,50±15,55 33,33±17,39

ACF 42,80±17,87 53,60±27,52 28,75±4,85 34,25±6,02 35±14,32 42,20±26,53 45,60±11,65

MPGA 24,40±8,44 20,80±7,19 27,75±13,07 40±8,04 35,20±10,52 48,20±19,98 35±3,16

GLA-SE 39,20±23,16 48,60±21,98 26,33±4,04 48,75±13,12 255±91,64 49,50±17,25 67,25±21,50

R-848 39,80±9,23 38,20±32,28 28,67±0,57 52,50±31,14 49,40±16,96 56±17,31 53,25±6,13

a,d

a,b

a,b,c,d,f,g *

A análise da população de monócitos circulantes, evidenciou que os grupos R-848 e

GLA-SE apresentaram aumento desta população em 48h, sendo que no grupo GLA-SE este

aumento se manteve até o fim da cinética. No grupo Al(OH)3 houve aumento significativo em

96h e 168h e nos grupos ACF e MPGA no tempo de 336h. Na comparação com o grupo controle

observou-se que no tempo de 1h os grupos ACF e Al(OH)3 apresentaram redução significativa,

seguido de aumento no tempo de 96h. Já nos grupos R-848 e GLA-SE se observou aumento no

tempo de 48h, sendo que o último também apresentou aumento no tempo de 336h (Tabela 4).


33

Tabela 4: Avaliação longitudinal da população de monócitos circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h

CS 132,7±32,88 86,60±38,78 86,25±31,12 88,40±48,71 135,8±36,54 121,5±63,69 94±55,44

Al(OH)3 57,60±16,68 136,6±52,97 109,5±37,65 140,6±60,67 285,8±53,30 231,4±56,88 111±89,84

ACF 93,40±45,85 138,3±38,46 97,50±17,06 77,40±30,62 51,60±22,73 84,40±66,87 240,6±85,18

MPGA 82,75±38,69 44,80±33 39,60±22,52 71,20±21,51 47±31,59 83±40,63 151,3±35,70

GLA-SE 59,40±21,76 119,5±88,15 78,40±42,70 195±67,15 274,3±67,74 251±81,50 242±31,08

R-848 99,20±25,96 118±46,80 142,4±65,23 231,8±103,3 224±110,1 167,3±55,23 165,8±46,80

a,b,c,d,g * a,c

a,c,d,e,f *

b,c,d,e

a * a,b,c a,c a,c *

*

*

*

a *

A análise longitudinal da população de linfócitos mostrou aumento no grupo R-848 em

48h, 96h e 336h enquanto que nos grupos GLA-SE e Al(OH)3 apresentaram aumento a partir do

tempo de 96h. Em relação às análises comparativas entre os diferentes adjuvantes e o grupo

controle foi observado uma redução significativa em 12h nos grupos GLA-SE e ACF., sendo que

no grupo GLA-SE observou-se aumento posteriormente em 96h e no grupo ACF houve aumento

em 48h. Já o grupo MPGA mostrou aumento em 48h enquanto os grupos R-848 e Al(OH)3 em

96h apenas (Tabela 5).


34

Tabela 5: Avaliação longitudinal da população de linfócitos circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h

CS 1942±468,3 2423±613,8 1889±910,6 1739±592,9 1784±817,5 2619±837,6 2880±1115

Al(OH)3 1678±628,2 2092±899,5 1942±399,3 2280±937,8 3564±554,9 3948±854,4 1585±1415

ACF 1861±617,2 2007±486,2 2273±365,4 2585±320,7 2216±673,2 2519±831,7 2943±543,4

MPGA 1300±348,1 1249±395,7 2002±1003 3071±596,6 2700±851,5 2638±1148 2551±570,7

GLA-SE 2034±827,4 1149±465,3 2117±862,7 2564±1024 4227±539,5 2858±716,8 3753±405,6

R-848 1247±288,8 1344±580,2 2237±542,7 3225±1445 3689±1085 2479±563,2 4277±853

a,b,c,d * b a,b,c

a,g * a,b,c,g

a,b a,b * a,b,c,f

*

*

*

*

6.2. Análise do perfil fenotípico das células mononucleares no sangue periférico:

Subpopulação de Linfócitos T (CD4+ e CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD49b+) e

monócitos (CD14+) em camundongos imunizados com diferentes adjuvantes vacinais

(Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848).

Após observar que os adjuvantes induziram alterações nas populações de leucócitos

circulantes, decidiu-se realizar uma análise imunofenotípica a fim de caracterizar melhor quais

subpopulações celulares estavam aumentando ou diminuindo ao longo do tempo (1h, 12h, 24h,

48h, 96h, 168h e 336h). Os resultados encontram-se representados em gráficos de linhas nas

Figuras 2, 3, 4, 5 e 6 que estarão representando as subpopulações de linfócitos T (CD4+), T

(CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD49b+) e monócitos (CD14+), respectivamente.


35

Ao avaliar a subpopulação de linfócitos T CD4+ foi possível observar que o grupo ACF

induziu redução no percentual dessas células no sangue já no tempo inicial de 12h, enquanto que

no grupo GLA-SE e R-848 observou-se redução dessa população em 24h. Ainda no grupo R-848

observou-se redução também em 48h. Já o grupo MPGA apresentou redução no período tardio

(96h) (Figura 3).

Na análise comparativa dos adjuvantes com o grupo controle, notou-se que no tempo de

12h, o grupo ACF apresentou redução significativa de linfócitos CD4+ enquanto que o grupo

GLA-SE demonstrou aumento (p<0,05) no mesmo tempo. Além disso, o grupo R-848 mostrou

redução significativa em relação ao grupo controle no tempo de 48h. O grupo MPGA apresentou

redução dessa população no tempo de 96h enquanto que o grupo Al(OH)3 demonstrou aumento

no mesmo tempo (Figura 3).


36

Al(OH)3

ACF MPGA

GLA-SE R-848

0

40

80

0

40

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Figura 3: Avaliação longitudinal da população de linfócitos T CD4+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

A subpopulação de linfócitos T CD8+ também foi avaliada neste estudo. Na análise

longitudinal, o grupo R-848 apresentou redução significativa (p<0,05) no tempo de 12h. No

grupo MPGA houve redução de linfócitos T CD8+ a partir de 24h. Por fim, apenas no último

tempo da cinética (336h) o grupo GLA-SE apresentou redução em relação ao seu tempo inicial

(1h).


37

Em relação às análises comparativas, no tempo de 24h observou-se no grupo GLA-SE

aumento significativo em relação ao controle. Já o grupo MPGA apresentou redução

significativa em 96h enquanto que o grupo R-848 demonstrou aumento no mesmo tempo (Figura

4).


38

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20

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1 12 24 48 96 168

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**

*

Figura 4: Avaliação longitudinal da população de linfócitos T CD8+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

Após as avaliações em relação às subpopulações de linfócitos T, realizaram-se as análises

da população de linfócitos B CD19+. Os grupos GLA-SE e Al(OH)3 apresentaram aumento


39

significativo (p<0,05) de linfócitos B a partir do tempo de 24h, sendo que o primeiro durou até o

final da cinética enquanto que o segundo se manteve até 48h. O grupo ACF mostrou aumento

dessa subpopulação em 24h enquanto que o grupo MPGA o aumento foi observado nos tempos

de 48h e 96h. Já o grupo R-848 apresentou uma redução inicial (12h) dessa população. (Figura

5).

Ao comparar os grupos que receberam os diferentes adjuvantes vacinais com o grupo

controle, observou-se que já no tempo de 12h o grupo R-848 mostrou redução significativa,

enquanto que o grupo ACF apresentou redução em 24h com posterior aumento em 48h. Além

disso, o grupo GLA-SE mostrou aumento no tempo de 48h quando comparado ao grupo

controle, assim como o grupo Al(OH)3 que também apresentou no tempo mais tardio de 336h

(Figura 5).


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1 12 24 48 96 168

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)

Tempo (horas)

Figura 5: Avaliação longitudinal da população de linfócitos B CD19+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

Após as análises das populações e subpopulações de linfócitos (T e B) foi realizada a

imunofenotipagem da população de células natural killer (NK) CD49b+. Durante as análises


41

longitudinais foi evidenciado no grupo Al(OH)3 uma redução dessa população nos tempos de

24h 96h e 168h (Figura 6). Além disso, o grupo R-848 mostrou aumento no tempo de 1 hora.

Por outro lado, o grupo ACF apresentou redução tardia dessa população no tempo de 96h

enquanto os grupos MPGA e GLA-SE apresentaram comportamentos similares, com aumento da

população de células NK no tempo de 168h.

Nas análises comparativas entre os grupos imunizados com diferentes adjuvantes e o

grupo controle, com exceção dos grupos ACF e Al(OH)3, todos os outros grupos apresentaram

diferenças significativas (p<0,05) no tempo de 1h. O grupo Al(OH)3 apresentou aumento no

tempo inicial de 12h seguido de uma redução no tempo de 24h que persistiu até o tempo tardio

de 168h. Já o grupo GLA-SE mostrou níveis percentuais menores de células NK durante toda

cinética avaliada com diferenças significativas em relação ao controle também nos tempos de 1,

12 e 96h. Os animais sensibilizados com o adjuvante MPGA apresentaram reduções também nos

tempos de 1, 24, 48 e 96 horas quando comparado ao controle, enquanto que os que foram

sensibilizados com o grupo R-848, após o aumento no tempo de 1h, apresentaram redução no

tempo inicial de 24h. Por fim, o grupo ACF apresentou também redução significativa em relação

ao controle no tempo de 168h (Figura 6).


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1 12 24 48 96 168

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%)

Tempo (horas)

Figura 6: Avaliação longitudinal da população de células NK CD49b+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados são expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

No presente estudo também foi avaliada a população de monócitos CD14+ circulantes.

Na análise longitudinal observou-se que os grupos ACF e R-848 mostraram aumento inicial no

tempo de 12h, enquanto que o grupo Al(OH)3 mostrou esse aumento no tempo de 24h e 96h. Já


43

o grupo GLA-SE mostrou aumento da população de monócitos no tempo de 48h que seguiu até

168h. Além disso, o grupo MPGA mostrou aumento mais tardio no tempo de 96h.

Quando foi realizada a comparação entre os grupos que foram sensibilizados com

diferentes adjuvantes com o grupo controle, observou-se já no tempo de 1h que o grupo R-848

apresentava diferença significativa. O grupo GLA-SE apresentou redução no tempo de 24h com

posterior aumento em 96 horas enquanto que o grupo R-848 demonstrou aumento em relação ao

controle nos tempo de 12h e 168h. Além disso, os animais sensibilizados com o adjuvante

MPGA apresentaram redução nos tempos de 24 e 48, seguido por aumento em 96 horas. No

grupo Al(OH)3 observou-se aumento significativo nos tempos de 24, 96 e 168 horas (Figura 7).


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Tempo (horas)

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Figura 7: Avaliação longitudinal da população de monócitos CD14+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.


45

6.3. Análise dos níveis de Nitrato (NO-3) + Nitrito (NO-2) sérico de camundongos

sensibilizados com os diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-

848)

Após a análise dos leucócitos totais e das diferentes populações celulares do sangue

periférico, foi avaliado se os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848)

são capazes de induzirem alterações nos níveis de óxido nítrico (NO) sérico após o sensibilização

durante toda a cinética (1h, 12h, 24h, 48h, 96h, 168h e 336h).

Neste contexto, os animais sensibilizados com o adjuvante R-848 apresentaram aumento

de NO nos tempos de 1 e 12 horas enquanto que o grupo GLA-SE apresentou um pico no tempo

de 48h. O grupo MPGA apresentou aumento dos níveis séricos de NO nos tempos mais tardios

de 168h e 336h (Figura 8). Todavia, quando as análises comparativas foram realizadas em

relação ao grupo controle, observou-se que o grupo GLA-SE apresentou aumento significativo

desde o tempo de 1h até o tempo de 96h enquanto que o grupo MPGA apresentou aumento em

168h (Figura 8).


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Figura 8: Avaliação longitudinal dos níveis séricos de NO em camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.


47

6.4. Quantificação do infiltrado inflamatório na pele de camundongos sensibilizados com os

diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848)

Neste trabalho, também foi realizada a quantificação do infiltrado inflamatório no local

do inóculo, gerados pelos diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-

848). Foi realizada esta quantificação, visto que esse recrutamento é essencial para a formação de

um microambiente celular que posteriormente irá direcionar a resposta imune adaptativa.

Sendo assim, nas análises longitudinais, observou-se que o adjuvante R-848 induziu um

aumento significativo no número de células inflamatórias presentes no local do inóculo no tempo

de 1h que persistiu até o tempo de 96h. Já o grupo ACF mostrou aumento significativo no

recrutamento celular para o local do inóculo em 12h, 24h e 48h. O grupo GLA-SE induziu

aumento no infiltrado celular de 12h até 168h. O grupo MPGA apresentou aumento significativo

no tempo de 48h que persistiu até o último tempo da cinética (Figura 9), todavia esse adjuvante

levou a formação de úlceras no local do inóculo a partir do tempo de 24h (dados não mostrados).

Na análise comparativa, observamos que os grupos ACF e MPGA apresentaram

diferenças significativas em praticamente todos os pontos avaliados da cinética, com exceção do

tempo de 168h para o grupo ACF. Os grupos GLA-SE e Al(OH)3 apresentaram diferenças no

intervalo entre os tempos de 12h e 168h. Por fim, o grupo R-848 apresentou diferenças nos

tempos de 1h, 24h e 48 horas quando comparado ao grupo controle (Figura 9).


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Figura 9: Avaliação longitudinal do infiltrado celular na pele de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.


49

A B

C D

E F

G H

Figura 10: Fotomicrografias de cortes histológicos representativas do infiltrado celular na pele de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes: grupo controle (A), hidróxido de alumínio (B); adjuvante completo de Freund nos tempos iniciais de 12, 24 e 48 horas (C) e nos tempos mais tardios de 96, 168 e 336 horas (D); Montanide Pet Gel A no tempo de 1h (E) e nos tempos posteriores (F); Glicopironasil Lipídio A nos tempos de 12 a 168 horas (G); Resiquimod (H) em toda cinética. Hematoxilina-Eosina. Barra=50μm.

7. Discussão

Mathias, F. A. S. Discussão

51

O estudo e o desenvolvimento de vacinas iniciou-se com o uso de patógenos vivos

atenuados ou inativados. Contudo, desde o início até hoje, o estudo com essas vacinas se deparou

com grandes obstáculos como dificuldades quanto à sua utilização frente a doenças desafiadoras

como a hepatite C ou a AIDS devido a fatores como o risco de infecção de indivíduos normais e

imunossuprimidos ou ainda, efeitos colaterais causados pela imunização com organismos totais,

sendo assim, seu uso foi proibido por questões éticas (Singh & O’Hagan, 1999).

A busca por vacinas seguras e eficazes prosseguiu através de novas abordagens como a

utilização de proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, DNA plasmidial. Contudo, essas

vacinas, apesar de não apresentarem os mesmos problemas das primeiras formulações vacinais,

mostram-se ainda pouco imunogênicas, necessitando da presença de outras substâncias

adjuvantes em suas formulações para obtenção de resultados mais consistentes e confiáveis

(Singh & O’Hagan, 2002; Reed, 2009).

Sendo assim, a escolha de adjuvantes para melhorar a resposta imunogênica dos

antígenos vacinais que são co-administrados, estimulando a imunidade celular e humoral, tem

sido uma abordagem importante no desenho das vacinas de última geração (Singh & O’Hagan,

1999; Tritto et al., 2009). Inicialmente, o estudo de adjuvantes foi conduzido de forma mais

empírica. Nos dias atuais, existe uma necessidade de desenvolver novos adjuvantes de forma

racional em função do progresso recente da compreensão da resposta imune, principalmente da

resposta imune inata (Guy, 2007). Acredita-se que estas substâncias são a chave para os eventos

imunes como a entrega dos antígenos vacinais para os tecidos linfoides bem como sua influência

na ativação de células apresentadoras de antígenos (Schijns, 2000). Além da escolha do

adjuvante, outras características como, a dosagem e a rota de imunização também podem

influenciar nos padrões de reconhecimento de epítopos bem como, nos perfis de resposta imune

adquirida no âmbito dos compartimentos celular e humoral (Hu et al., 1990).

Sendo assim, o perfil celular da pele possui alta relevância em estudos de imunização

vacinal, uma vez que esta pode atuar como órgão imune. O tecido linfoide associado à pele

contém células especializadas capazes de aumentar a resposta imune como os queratinócitos que

produzem imunomediadores como IL-1 e TNF-α hábeis na ativação de linfócitos, macrófagos e

células dendríticas. O espaço intercelular no interstício da pele proporciona um ambiente que

favorece a ligação com o sistema linfático e vasos que terminam nos órgãos imunes periféricos

como os linfonodos e o baço (Kupper, 1990; Yokoyama et al., 1997; Puri et al., 2000).


52

Nesse contexto, esse trabalho analisa de forma descritiva e experimental os diversos

elementos da resposta imune na pele e sangue após a sensibilização com os adjuvantes:

Hidróxido de Alumínio, Adjuvante Completo de Freund, Montanide Pet Gel A, Glicopiranosil

Lipídio A e Resiquimod através de uma única imunização pela via intradérmica em

camundongos Swiss.

Para esta finalidade, primeiramente avaliou-se a resposta sistêmica induzida no sangue

periférico desses animais durante a cinética (1h, 12h, 24h, 48h, 96h, 168h e 336 horas). Nossos

dados mostraram através da análise do quadro hematológico pelo leucograma que todos os

adjuvantes promoveram alterações nos níveis de leucócitos totais bem como nas diferentes

populações avaliadas. Todavia, cada adjuvante se comportou de forma diferente, devido ao fato

das suas diferentes composições serem capazes de atuar na ativação do sistema imune de forma

distinta (Gupta et al., 1995; Vogel, 1995). Estas diferenças nos permitiram discriminar quais

adjuvantes apresentaram uma resposta mais precoce ou mais tardia após a sensibilização.

De forma mais detalhada, nossos resultados em relação à população de neutrófilos

mostraram que camundongos imunizados apenas com o adjuvante GLA-SE apresentaram

aumento precoce (12h) desse tipo celular, enquanto que camundongos imunizados com os

adjuvantes Al(OH)3 e ACF mostraram elevação no número absoluto de neutrófilos apenas nos

tempos mais tardios (96h e 336h, respectivamente). É importante frisar que estas células compõe

a primeira linha de defesa da imunidade inata contra patógenos, além de atuarem como

imunoreguladores na produção de citocinas (IL-12, IL-10, TNF-α, IFN-γ) formando uma ligação

entre a imunidade inata e adquirida (Nathan, 2006; Appelberg, 2007). Aparentemente, o

adjuvante GLA-SE possui mecanismos próprios capazes de estimular o sistema imune mais

precocemente que os demais adjuvantes testados. Vitoriano-Souza et al.(2012), em um estudo

similar observaram recrutamento na pele e uma mobilização no sangue periférico de neutrófilos

induzidos pelos adjuvantes Monofosforil lipídio A, adjuvante incompleto de Freund e Saponina

principalmente no tempo de 12 horas, enfatizando a importância dessas substâncias na ativação

da resposta imune inata.

Camundongos vacinados com distintos antígenos poliproteicos associados ao GLA-SE e

posteriormente desafiados com L. major apresentaram aumento no número de neutrófilos no

local do desafio (Peters et al., 2012).


53

Outro dado interessante observado em nosso trabalho foi a presença da população de

eosinófilos nos animais sensibilizados com os adjuvantes Al(OH)3, GLA-SE e MPGA

respectivamente em alguns pontos da cinética. O aumento de eosinófilos induzido por Al(OH)3

já foi descrito anteriormente em outros trabalhos como em um estudo utilizando camundongos

Balb/c, no qual foi demonstrado que seis dias após serem sensibilizados com Al(OH)3 observou-

se aumento na população de eosinófilos produtores de IL-4, responsáveis pela ativação de

linfócitos B (Wang & Weller, 2008). Sabe-se que estas células estão ligadas principalmente ao

direcionamento de uma resposta do Tipo 2, na qual o hidróxido de alumínio é sabidamente um

importante indutor (Brewer et al., 1996). Além disso, Sano et al. (1999), comparando os

adjuvantes Al(OH)3 e ACF, observaram que ambos eram capazes de promover inflamação

desencadeada por eosinófilos, sendo que o segundo apresentava níveis bem menores no

infiltrado inflamatório devido a presença de Mycobacterium tuberculosis na composição do

adjuvante, que também é responsável pelo direcionamento de uma resposta pró-inflamatória do

tipo 1. Todavia de forma inesperada, foi observado aumento dessa população em 96 horas em

quatro dos cinco animais do grupo sensibilizado com o adjuvante GLA-SE que sabidamente

direciona para uma resposta do Tipo 1. Ainda não sabemos qual seria o real papel destes

eosinófilos nos animais sensibilizados com GLA-SE e acreditamos que estudos posteriores

poderão elucidar que tipo de modulação esta população estará realizando nos animais

imunizados com este adjuvante.

Os resultados referentes à população de monócitos mostraram aumento dessa população

nos grupos de camundongos imunizados com os adjuvantes R-848 e GLA-SE em 48h, sendo que

no último, perdurou até o tempo de 336h. Já nos grupos de animais sensibilizados com Al(OH)3,

ACF e MPGA essas alterações foram observadas mais tardiamente. A análise da população de

monócitos é extremamente relevante, uma vez que estes diferenciam-se em macrófagos e células

dendríticas, após a sua migração para os tecidos periféricos (Auffray et al., 2007; Domínguez &

Ardavín, 2010). Além disso, estas células pertencem ao sistema mononuclear fagocitário (SMF),

atuando na imunidade inata, sendo responsáveis pela remoção de detritos e infecções

microbianas e produção de citocinas como interferons, interleucinas, quimiocinas e fatores de

crescimento (Serbina et al., 2008). Sendo assim, o aumento dessa população sugere a capacidade

dos adjuvantes GLA-SE e R-848 ativarem mais precocemente o sistema imune inato através de

células fundamentais, permitindo assim a fagocitose e processamento do antígeno vacinal bem


54

como a modulação do sistema imune e consequentemente o combate de patógenos intracelulares.

Essas alterações no perfil de leucócitos do sangue provavelmente refletem algumas das

diferentes mudanças ocorridas no local do inóculo após a sensibilização com distintos

adjuvantes.

De forma interessante, ao avaliar ainda no sangue, o perfil imunofenotípico por

citometria de fluxo de Linfócitos T, mais especificamente Linfócitos T CD4+, observou-se já nos

tempos iniciais da cinética que os grupos de camundongos imunizados com ACF (12h), GLA-SE

e R-848 (24h) apresentaram redução desta subpopulação de linfócitos T, enquanto que o grupo

MPGA apresentou essa redução apenas mais tardiamente. Ao analisar a subpopulação de

linfócitos T CD8+ os grupos que apresentaram redução dessa população nos tempos iniciais

foram R-848 (12h) e o MPGA (24h). Essas reduções provavelmente estão ligadas ao processo de

migração celular para o local do inóculo por ação dos adjuvantes. Em um estudo semelhante,

Lambert e colaboradores (2012) observaram que o adjuvante GLA-SE apresenta já no tempo de

24h um infiltrado moderado de neutrófilos e linfócitos no local do inóculo, além de promover

aumento tanto de células dendríticas quanto de linfócitos T totais nos linfonodos drenantes.

No trabalho de Xu et al. (2006) foi demonstrado que a utilização do adjuvante R-848

induz ao aumento da expressão de TLR8 em células dendríticas derivadas de monócitos. Estas

por sua vez produzem altos níveis de IL-12 que ativam tanto linfócitos T CD4+, a produzirem

citocinas pró-inflamatórias, quanto linfócitos T CD8+, aumentando sua sensibilidade para o

reconhecimento de antígenos, bem como sua atividade funcional. Qiu et al. (2008) observaram

que a associação dos adjuvantes MPGA e CpG ODN promoveu maior ativação de linfócitos T

CD4+ do que quando utilizado isoladamente .

Em outro estudo, buscando avaliar a resposta dos adjuvantes Al(OH)3, ACF, Montanide®

ISA 720 e GLA-SE em camundongos C57BL/6 empregando diferentes protocolos vacinais foi

demonstrado que o grupo vacinado com hidróxido de alumínio foi o que menos induziu a

ativação de linfócitos TCD4+ e TCD8+ enquanto que ACF e Montanide apresentaram níveis

semelhantes de ativação entre si, superiores ao anterior, mas inferior ao GLA-SE, que apresentou

os níveis mais elevados de ativação dessas subpopulações de linfócitos T (de Cassan et al.,

2011). Estes resultados diferem um pouco dos nossos pela intensidade da resposta imune obtida,

muito provavelmente devido ao fato de que nesse estudo além de os animais serem de uma

linhagem diferente da nossa, receberam mais de uma dose de uma vacina composta pelo


55

adjuvante associado a outros antígenos. Todavia, nossos resultados mostram que esses

adjuvantes de fato, apesar de uma única dose, seguem um padrão em seu modo de ação.

Jahnisch et al. (2013) observaram em uma abordagem in vitro que células dendríticas

previamente sensibilizadas com o adjuvante R-848 ao serem co-cultivadas com células T

promoveram a proliferação de linfócitos T CD4+ e T CD8+, além do aumento dos níveis de IL-12

e IFN-γ. É importante ressaltar que os linfócitos T CD4+ desempenham um papel fundamental no

desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa, auxiliando no recrutamento e ativação de

outras células imunes como linfócitos T CD8+, linfócitos B, macrófagos, monócitos, neutrófilos

e eosinófilos. Além disso, as citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4+ são capazes de

direcionar o sistema imune para uma resposta Th1, Th2, Th17 ou Treg (Zhu & Paul, 2010;

O’Shea & Paul, 2010). O fluxo de linfócitos T entre o sangue e os órgãos linfoides periféricos

requer que essas células sejam móveis e sensíveis a estímulos específicos do tecido (Miller et al.,

2003). Além disso, células T efetoras são essenciais para a eliminação de patógenos no local da

infecção, assim como as células T citotóxicas (T CD8+) atuam na eliminação de patógenos

através da liberação de grânulos líticos e opsonização com receptores pró-apoptóticos. Por outro

lado, as células T CD4+ auxiliares sinalizam através da sinapse imunológica para que as células

infectadas sejam envolvidas por sinais efetores e produzam citocinas e quimiocinas para o

recrutamento de outras células (Muller et al., 2012).

Em relação ao perfil de células B CD19+ também avaliada em nosso estudo, observou-se

que os grupos sensibilizados com os adjuvantes Al(OH)3 e GLA-SE apresentaram aumento mais

recente dessa população no tempo de 24h enquanto os outros grupos apresentaram aumento nos

tempos de 48h. Esta população é responsável pela produção das diversas classes de

imunoglobulinas (Ig) na resposta humoral. Além disso, tem sido demonstrado seu papel na

apresentação de antígenos nos linfonodos, principalmente apresentando antígenos solúveis para

linfócitos T CD4+ específicos (Garside et al., 1998). Após essa interação, as células B antígeno-

específico recebem sinais das células T, levando a sua proliferação e mudança de classe de

isotipo (MacLennan et al., 1997; Pape et al., 2003).

Diferentes trabalhos da literatura tem avaliado a presença de células B induzidas por

adjuvantes. Em relação aos adjuvantes a base de alumínio, estes são conhecidos por direcionar

para uma resposta imune do tipo 2, com aumento na ativação e proliferação policlonal de células

B produtoras de IgG1 e IgE, além de citocinas como IL-4 e IL-5 (Grun & Maurer, 1989; Brewer


56

et al., 1997). Korsholm e colaboradores (2010) evidenciaram que a utilização do adjuvante

Al(OH)3 gerava aumento de linfócitos B após 26h na cavidade intraperitoneal onde foi realizado

o inóculo. Em outro trabalho, Jordan e colaboradores (2004) observaram que a utilização do

alum (hidróxido de alumínio) levava a ativação e proliferação de células B em camundongos

C57BL/6 independentemente de sua associação ao antígeno. Esses resultados corroboram com os

que foram encontrados em nosso trabalho, demonstrando que o hidróxido de alumínio sozinho é

capaz de prover sinais da imunidade inata, ativando assim esta população celular.

Lambert e colaboradores (2012) realizaram um estudo onde observaram que o adjuvante

GLA-SE era capaz de induzir aumento na expressão da quimiocina CXCL13, quimiocina

responsável pelo recrutamento de linfócitos B, com um pico em 24h e se manteve elevada até

96h, indo de encontro dessa forma com os resultados obtidos em nosso trabalho. Baldwin e

colaboradores (2009) demonstraram que camundongos vacinados com um lipídio A hexacilado

sintético derivado do GLA emulsificado em uma solução estabilizadora (SE) apresentaram

aumento nos títulos de IgG2a, demonstrando assim que as células B são também capazes de

direcionar para um perfil de resposta imune do Tipo 1.

Já em relação ao adjuvante completo de Freund (ACF) estudos demonstram que,

dependendo da via de inoculação, apresenta uma intensidade de resposta distinta. Todavia, tanto

em animais imunizados pela via intraperitoneal quanto pela via subcutânea apresentaram uma

resposta mista Tipo1/Tipo2 (Oscherwitz et al., 2006). Resultados semelhantes foram encontrados

por Habjanec e colaboradores (2010) onde comparando o ACF a outros adjuvantes associados ao

antígeno OVA (ovalbumina), este mostrou-se como um forte indutor tanto de IgG1 quanto de

IgG2a, sendo que dentre as combinações testadas apresentou a menor razão Tipo1/Tipo2, ou

seja, uma resposta preferencialmente mista.

Por outro lado, o adjuvante Montanide® vem sendo testado no desenvolvimento de uma

vacina e em terapias contra o câncer, devido sua elevada capacidade de ativar linfócitos B

produtores de anticorpos (Montero et al., 2009). Contudo, nossos resultados demonstraram um

aumento ao longo da cinética dessa população, todavia sem apresentar diferenças com o grupo

controle. Esse resultado pode ser atribuído a diversos componentes como a dose utilizada,

ausência do antígeno vacinal, além do fato do adjuvante utilizado em nosso estudo apresentar

uma diferença na formulação que consiste em uma emulsificação de óleos minerais ou não

associados a água em suas possíveis combinações (Montanide ISA 51) ao invés de uma


57

emulsificação em gel (Montanide Pet Gel A®) que forma um sistema de depósito,

proporcionando uma liberação gradual de um possível antígeno associados (www.seppic.com

acessado em 23 março de 2013).

De forma interessante, camundongos imunizados com o adjuvante R-848 apresentaram

uma redução inicial no tempo de 12h da população de linfócitos B seguido de um aumento e

normalização dos seus níveis em 48h que seguiu até o fim da cinética. Estudos in vitro

demonstraram que o R-848 é capaz de ativar células B que se transformam em plasmócitos e

começam a produzirem anticorpos como IgM (North et al., 2010). Jahnmatz e colaboradores

(2013) observaram em um estudo in vitro que tanto o adjuvante R-848 quanto a citocina IL-12

são capazes de ativar células B produtoras de IgG, todavia, a combinação de ambos levaram a

uma ativação muito mais intensa de duradoura.

Outra população avaliada no presente estudo foi a de células natural killer (NK) que

desempenham importante papel no sistema imune inato e são capazes de identificar com acurácia

células infectadas, neoplásticas de células normais (Bellelis et al., 2013). As células NK são

células citotóxicas efetoras capazes de lisar as células alvo sem a necessidade de uma exposição

prévia ao antígeno (Sikora et al., 2011). Além da atividade citotóxica essas células possuem a

habilidade de secretar citocinas e sua população no sangue periférico leva cerca de três a cinco

dias após a infecção para aumentar antes que se inicie a imunidade adaptativa (Ferlazzo & Munz,

2004). Os resultados demonstraram que animais sensibilizados com os adjuvantes ACF (96h),

MPGA (168h) e GLA-SE (168h), seguiram esse padrão de aumento dessa população no sangue

periférico após as imunizações, enquanto que os adjuvantes Al(OH)3 e R-848 apresentaram

redução de células NK nos tempos de 24h e 12h, respectivamente.

Estudos recentes comparando a resposta dos adjuvantes MPL e Al(OH)3 demonstraram

que no tempo de 26h que o primeiro adjuvante apresentou um aumento na expressão de CD69

(marcador de ativação) da população de células NK enquanto que o segundo uma redução

significativa desta população celular (Korsholm et al., 2010).

A utilização do ACF em trabalhos avaliando seu efeito contra doenças autoimunes como

diabetes do tipo 1, demonstraram ativação de células NK, que são essenciais na proteção contra a

doença no modelo murino (Lee et al., 2004). Estudos posteriores demonstraram que o adjuvante

completo de Freund foi capaz de ativar as células NK através da ação de células NK T (Lee et

al., 2011). Tanto o grupo MPGA quanto o grupo GLA-SE, apesar de apresentarem um aumento


58

em 168 horas apresentaram menores níveis dessa população em diversos pontos da cinética

quando comparado ao grupo controle. Provavelmente pode estar ocorrendo uma migração de

células NK para os tecidos linfoides, todavia, são necessários mais estudos para confirmar essa

hipótese. Em um estudo com o GLA-SE in vitro avaliando seu efeito em PBMCs de indivíduos

novos e velhos demonstrou que este adjuvante induz um pequeno aumento dos níveis de IFN-γ

devido sua ativação direta de células NK (Behzad et al., 2012). Ikeda et al. (1993) avaliaram a

resposta de um lipídio sintético A análogo ao GLA em diversas linhagens de camundongos e

observaram o aumento da atividade das células NK e, consequentemente, da atividade citolítica,

mesmo em camundongos imunodeficientes.

Em outro estudo, os pesquisadores avaliaram o efeito do adjuvante R-848, entre outros

como o ACF, e foi demonstrado que no segundo dia pós-imunização o adjuvante apresentou um

elevado recrutamento de células NK provenientes do sangue periférico para os linfonodos

drenantes ao contrário do adjuvante de Freund (Martin-Fontecha et al., 2004). Esses resultados

corroboram com os nossos, onde é possível observar uma diminuição significativa já em 12h no

sangue, devido provavelmente à migração preferencial dessas células aos linfonodos drenantes.

Por fim, a última avaliação imunofenotípica realizada foi a da população de monócitos

CD14+. Conforme dito anteriormente, essas células são importantes componentes do sistema

fagocitário mononuclear, atuam na imunidade inata auxiliando na remoção de detritos e

infecções microbianas. Nossos resultados mostraram que praticamente todos os adjuvantes, com

exceção do MPGA (96h) apresentaram um aumento recente dessa população no sangue

periférico.

A utilização do Al(OH)3 promove a ativação de monócitos em 48h após sua

sensibilização que começam a se diferenciar em células dendríticas com aumento na expressão

de MHC IIhigh, CD86high e CD83+, e consequentemente sua maturação (Ulanova et al., 2001).

Todavia, quando utilizadas culturas puras (95 a 99%) de monócitos CD14+, o hidróxido sozinho

não é capaz de promover essa diferenciação, demonstrando assim a importância das células T

nesse contexto (Ulanova et al., 2001).

Em relação ao adjuvante completo de Freund, Brack et al. (2004) demonstraram que em

24h, 48h e 96h após a imunização de ratos Wistar, ocorreu aumento na ativação da população de

monócitos que migraram para o local do inóculo. Um estudo comparando distintos adjuvantes

agonistas de receptores do tipo Toll como MPL (TLR4), R-848 (TLR7/8) e CpG (TLR9)


59

observou que apesar de todos promoverem a expansão de monócitos CD14+, os dois últimos

foram os que apresentaram ativação mais rápida, intensa e duradoura (Kwissa et al., 2012).

Nossos resultados demonstraram que o R-848 promoveu aumento recente em 12h dessa

população enquanto que o GLA-SE, agonista TLR4, apresentou um aumento em 48h, de modo

similar aos resultados obtidos por Kwissa et al., (2012).

A capacidade que um imunógeno possui de induzir a produção de óxido nítrico é

considerada um fator fundamental, pois também indica sua capacidade de produção de citocinas

do tipo 1, fundamentais no estabelecimento de uma resposta imune protetora contra patógenos

intracelulares. Dessa forma, a produção de NO pela iNOS possibilita que os macrófagos ativados

eliminem diversos patógenos intracelulares (Rivera et al., 2001). Dessa forma, nossos resultados

demonstram que o adjuvante Al(OH)3 não foi capaz de induzir nenhuma alteração na produção

de NO, concordando com o que é descrito na literatura, pois, se trata de um adjuvante que induz

uma resposta do tipo 2. Guerra et al. (2011) demonstraram que a utilização do adjuvante

Al(OH)3 associado a extrato de promastigota de Leishmania (LE) para induzir uma resposta do

tipo 2 polarizada não foi capaz de produzir níveis de NO diferentes do grupo controle salina,

bem como a utilização do ACF + LE. Todavia quando utilizado a combinação ACF + LE foi

observado diferença significativa na produção de NO quando comparado ao grupo imunizado

apenas com LE (Guerra et al., 2011). Esses resultados corroboram com os obtidos em nosso

trabalho, onde, o ACF apesar de apresentar um pequeno aumento da produção de NO, não

apresenta diferenças em relação ao grupo controle.

Em um trabalho recente avaliando a eficácia do tratamento contra leishmaniose visceral

utilizando a associação de uma droga ao adjuvante R-848, Duong et al. (2013) observaram que

com o aumento da concentração do adjuvante ocorria o aumento dos níveis de NO .

Finalmente decidiu-se avaliar quais alterações locais seriam as responsáveis pelas

modificações sistêmicas apresentadas anteriormente. Uma vez que é relatado que a expressão de

genes pró-inflamatórios e mediadores inflamatórios no local do inóculo dos adjuvantes vacinais

induz a migração de células a partir da circulação sanguínea para o local de imunização (Mosca

et al., 2008).

Tomando em conjunto os resultados obtidos no presente estudo que demonstraram que

todos adjuvantes foram capazes de promover recrutamento celular para o local do inóculo. Essa

capacidade de induzir inflamação local é uma importante característica compartilhada pela


60

maioria dos adjuvantes conhecidos e está intimamente relacionada à imunogenicidade dessas

substâncias (Schijns, 2000). No entanto, pode-se observar que cada adjuvante induziu esse

processo inflamatório de modo particular discriminando assim o modo de ação de cada um e sua

respectiva eficiência.

Sendo assim, nossos resultados demonstraram que o adjuvante Al(OH)3 apesar de não ter

apresentado variações ao longo de toda a cinética, demonstrou uma migração celular superior ao

grupo controle. O grupo ACF por sua vez, apresentou um intenso recrutamento celular nos

tempos iniciais de 12h à 48h com uma redução posterior no tempo de 96h, todavia superior ao

grupo controle. O grupo MPGA durante toda a cinética apresentou aumento em relação ao grupo

controle, sendo a partir do tempo de 48h aumento significativo em relação aos tempos anteriores

que seguiu até o fim da cinética. Contudo esse adjuvante já no tempo de 24h apresentou a

formação de úlceras no local do inóculo, que seguiram até o fim da cinética. Os animais

sensibilizados com o adjuvante GLA-SE apresentaram uma cinética interessante, com aumento

recente do infiltrado celular em 12h que permaneceu até o tempo mais tardio de 168h. Por fim, o

grupo imunizado com o adjuvante R-848 apresentou aumento discreto do infiltrado celular,

todavia superior ao grupo controle nos tempos iniciais de 1h, 24h e 48h.

É importante ressaltar que esse recrutamento celular é essencial para a formação de um

microambiente imunocompetente favorável ao processamento de antígenos, apresentação e

subsequente estimulação da resposta imune celular onde serão produzidas citocinas, quimiocinas

atrativas para outras populações celulares (Medzhitov & Janeway, 1997; Kensil et al., 2004;

Vitoriano-Souza et al., 2012).

Todavia, são necessários mais estudos que visem avaliar a resposta desses adjuvantes

(isolados ou combinados), principalmente os que direcionam para uma resposta do tipo 1

associados a antígenos de interesse como o de Leishmania spp. para o desenvolvimento de novas

formulações vacinais anti-Leishmania.

61

8. Conclusão

Mathias, F. A. S. Conclusão

62

O conjunto de dados obtidos no trabalho intitulado: “Cinética da resposta imune inata

induzida por diferentes adjuvantes vacinais” nos permite concluir que todos os adjuvantes

vacinais induziram recrutamento celular para o local do inóculo bem como alterações nas células

presentes no sangue periférico. Todavia, demonstraram diferenças em relação ao tempo de ação,

por apresentarem diferentes constituições e, consequentemente, perfis de respostas imunes

distintas que devem ser consideradas na sua seleção como adjuvantes vacinais.

Essa cinética estudada nos permite selecionar o(s) melhor(es) adjuvante(s) que

apresentam uma resposta mais rápida para futuros testes vacinais anti-Leishmania.

Sendo assim, observou-se que os adjuvantes GLA-SE e R-848 apresentaram resultados

promissores, tanto no sangue, onde inclusive foram capazes de estimular a produção de NO

sérico, importante característica da resposta imune do tipo 1, como na pele no local do inóculo,

com aumento no recrutamento celular nos tempos iniciais.

9. Perspectivas

Mathias, F. A. S. Perpectivas

64

A partir da realização deste trabalho foi possível obter importantes informações sobre o

contexto da resposta imune inata desencadeada por estes adjuvantes tanto no local do inóculo

quanto no sangue periférico. Além disso, a identificação dos adjuvantes que apresentam resposta

do tipo 1 mais adequada para sua utilização em futuras formulações anti-Leishmania. Neste

sentido, a continuidade desse trabalho tem como principais objetivos, avaliar:

• A resposta desses adjuvantes associados ao antígeno de Leishmania;

• A expressão de mRNA de receptores do tipo Toll, quimiocinas e citocinas

envolvidas nesta resposta;

• Tráfego celular in vivo através da técnica microscopia intravital na pele a fim de

verificar os eventos de recrutamento (rolamento e adesão) celular promovidos

pelos adjuvantes em alguns pontos pré-determinados da cinética;

• Principais populações celulares presentes no local do inóculo pela técnica de

microscopia confocal.

10. Referências Bibliográficas

Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica

66

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11. Anexo

Mathias, F. A. S. Anexo

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cinética da resposta imune inata induzida por diferentes … · 2018-11-20 · obrigado por tudo....

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