cinÉtica espermÁtica e fertilidade

CINÉTICA CINÉTICA ESPERMÁTICA E ESPERMÁTICA E

FERTILIDADEFERTILIDADE

Isabel GuigonIsabel Guigon

Joana ResendeJoana Resende

Letícia MoraisLetícia Morais

Renato PhilomenoRenato Philomeno

Tatiany FernandesTatiany Fernandes

VET-182 Fisiopatologia da Reprodução e Processamento de sêmen

IntroduçãoIntrodução Avaliação de fertilidade de touros através de programas Avaliação de fertilidade de touros através de programas

de inseminação artificial, método caro e demorado.de inseminação artificial, método caro e demorado.

Métodos Métodos in vitroin vitro “simples” e confiáveis. “simples” e confiáveis.

Parâmetros cinéticos X métodos de análise X fertilidadeParâmetros cinéticos X métodos de análise X fertilidade

Motilidade, motilidade progressiva, vigor, morfologia, Motilidade, motilidade progressiva, vigor, morfologia, concentração, integridade da cromatina, status de concentração, integridade da cromatina, status de membrana, teste de penetração em muco cervical, membrana, teste de penetração em muco cervical, porcentagem de vivos e mortos, etc. porcentagem de vivos e mortos, etc.

Modelo desenvolvido por Gillan et al.(2008) correlacionando parâmetros cinéticos do sêmen e fertilidade. Foi utilizado análise de regressão stepwise em todos os testes de diagnóstico in vitro de modo a produzir um modelo combinando àqueles que possuem alta correlação com fertilidade.

PARÂMETROS CINÉTICOS DO PARÂMETROS CINÉTICOS DO SÊMENSÊMEN

MotilidadeMotilidade

Morfologia espermáticaMorfologia espermática

Concentração espermáticaConcentração espermática

MotilidadeMotilidade

Objetivo: fertilizar o ovócito;

Necessário: motilidade, energia, membrana acrossomal intacta, receptores, membrana plasmática que permita fusão, núcleo;

Movimentoatividade motora dos braços de Dineína;

Fonte: http://www.scielo.br/img/fbpe/jpneu/v27n5/a06fig1b.gif

DINEÍNA

Fonte:http://2.bp.blogspot.com/_8tRxq5DT_zI/SXOAMs8WIMI/AAAAAAAAB74/5IEIWfJTt54/s400/espermatogenese3.jpg

Fosforilação/Desfosforilação + Eventos em cascata;

Canais de cálcio;

Hipermotilidade;

O cálcio influencia na capacitação, reação acrossômica, motilidade e hipermotilidade.Fonte:http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.socesp.org.br/revistasocesp/imagens/i_edicoes/v13_n01_txt09_f03.jpg&imgrefurl

Critérios de avaliaçãoCritérios de avaliação

De acordo com Graham e Mocé (2008) existe uma De acordo com Graham e Mocé (2008) existe uma correlação entre fertilidade e motilidade. correlação entre fertilidade e motilidade.

Motilidade progressiva é o fator que mais se fideliza a Motilidade progressiva é o fator que mais se fideliza a fertilidade quando falamos em qualidade de sêmen para fertilidade quando falamos em qualidade de sêmen para fertilidade. (Druet, et al., 2008) fertilidade. (Druet, et al., 2008)

Ao contrário, Brahmkshhtri et. al. (1998) afirma que os Ao contrário, Brahmkshhtri et. al. (1998) afirma que os parâmetros convencionais, como a motilidade parâmetros convencionais, como a motilidade espermática individual, viabilidade e integridade espermática individual, viabilidade e integridade acrossômica são indicadores pobres da fertilidade acrossômica são indicadores pobres da fertilidade quando comparados com testes de bioensaio (SPB) do quando comparados com testes de bioensaio (SPB) do sêmen do touro .sêmen do touro .

CONSERVAÇÃOCONSERVAÇÃO

Efeitos na criopreservação do sêmen para a motilidade espermática.

Fonte: O’Conell et. al. (2002)

Fertilidade in vitroFertilidade in vitro

ComplicadoresComplicadores IndicaçõesIndicaçõesEstudosEstudos

CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICACONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA

Relacionada à produtividade dos touros doadores de Relacionada à produtividade dos touros doadores de

sêmen em centrais de inseminação artificial.sêmen em centrais de inseminação artificial.

Anzar et al. (2009) comparando técnicas convencionais Anzar et al. (2009) comparando técnicas convencionais e modernas para quantificar as células presentes em e modernas para quantificar as células presentes em amostras de sêmen. amostras de sêmen.

Hemocitômetro (Câmara de Newbauer), citometria de Hemocitômetro (Câmara de Newbauer), citometria de

fluxo e NucleoCounter SP-100.fluxo e NucleoCounter SP-100.

HEMOCITÔMETROHEMOCITÔMETRO

Contagem de células espermáticas na Câmara de Newbauer. São 25 grandes quadrados centrais. No interior de cada um destes tem-se 16 quadrados menores. Fonte: Adaptado de Anzar et al.(2009)

NucleoCounter SP-100NucleoCounter SP-100

É um método recente utilizado para este tipo de análise, É um método recente utilizado para este tipo de análise, baseado na análise da imagem produzida microscopia baseado na análise da imagem produzida microscopia por fluorescência. por fluorescência.

Utiliza-se sondas de iodeto de propídio que cora as Utiliza-se sondas de iodeto de propídio que cora as células com membrana comprometida, permitindo a células com membrana comprometida, permitindo a determinação do número de células presente na determinação do número de células presente na amostra, bem como determinar a porcentagem de amostra, bem como determinar a porcentagem de

células com lesões de membrana.células com lesões de membrana.

Citometria de fluxoCitometria de fluxo

Análise de milhares de células através do uso de sondas Análise de milhares de células através do uso de sondas fluorescentes a fim de verificar a viabilidade fluorescentes a fim de verificar a viabilidade espermática. espermática.

Iodeto de Propídio (PI), SYBR-14, FITC-PNA, PE-PSA, Iodeto de Propídio (PI), SYBR-14, FITC-PNA, PE-PSA, FITC-PSA e combinações entre eles (Celeghini et al., FITC-PSA e combinações entre eles (Celeghini et al., 2007) 2007)

Concentração espermática e integridade de membrana Concentração espermática e integridade de membrana

(Azar et al., 2009).(Azar et al., 2009).

Anzar et al. (2009)Anzar et al. (2009) obteve resultados significativamente obteve resultados significativamente correlacionados (P<0,01) para os três métodos na correlacionados (P<0,01) para os três métodos na análise de regressão. análise de regressão.

No teste de Tukey houve diferença significativa entre os No teste de Tukey houve diferença significativa entre os testes modernos e o convencional (P<0,01). testes modernos e o convencional (P<0,01).

Contudo entre a citometria de fluxo e NucleoCounter Contudo entre a citometria de fluxo e NucleoCounter SP-100 não obteve diferença significativa, para SP-100 não obteve diferença significativa, para (P<0,05).(P<0,05).

METÓDOS DE AVALIAÇÃO DE METÓDOS DE AVALIAÇÃO DE FERTILIDADEFERTILIDADE

CASACASABSLBSLFIVFIV

BIOSPECKLE LASERBIOSPECKLE LASER Luz laser Luz laser → alta → alta direcionalidade, permite a formação de direcionalidade, permite a formação de

uma imagem de interferência, chamada de uma imagem de interferência, chamada de specklespeckle..

O objeto iluminado apresenta algum tipo de atividade, O objeto iluminado apresenta algum tipo de atividade, este terá um comportamento de rede de difração este terá um comportamento de rede de difração dinâmica, provocando mudança na imagem formada ou dinâmica, provocando mudança na imagem formada ou

mudança no padrão de interferência.mudança no padrão de interferência. → → biospecklebiospeckle

Formação do fenômeno do speckle. Adaptado de Braga et al. (2003).

Câmara CCD (Câmara CCD (Charge Coupled detectorCharge Coupled detector). ).

A análise estatística pode-se obter o padrão do A análise estatística pode-se obter o padrão do specklespeckle correlacionando-o ao tipo de movimento detectado, correlacionando-o ao tipo de movimento detectado, sendo possível, enfim, determinar a atividade do objeto sendo possível, enfim, determinar a atividade do objeto iluminado.iluminado.

Amostra de baixa atividade

Amostra de alta atividade

Fonte:Adaptadas de Braga et al. (2003).

Durante a análise da imagem formada é possível obter Durante a análise da imagem formada é possível obter um índice chamado momento de inércia (MI), capaz de um índice chamado momento de inércia (MI), capaz de

mensurar a atividade biológica do material iluminado.mensurar a atividade biológica do material iluminado.

Valores médios de Motilidade (Mot), e Momento de Inércia (MI) das amostras de sêmen dos 6 touros testados.

Animais1Médias

Mot Vig IND MI

A 25,0 d 2,2 c 34,50 d 108,6 b

B 35,0 b 3,1 b 48,00 b 158,3 b

C 31,5 c 2,9 b 44,25 c 168,7 b

D 38,5 b 3,3 b 51,75 b 204,3 a

E 28,5 c 2,5 c 38,75 d 148,8 b

F 45,0 a 3,6 a 58,50 a 219,8 a

2EP 1,40 0,11 1,63 17,921Médias seguidas de mesma letra minúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott, com um nível nominal de significância de 5%. 2EP é o erro padrão das médias.

Fonte: Carvalho et al., (2009)

FIVFIV (FERTILIZAÇÃO (FERTILIZAÇÃO IN VITROIN VITRO))

Técnica como meio de investigação para as diferentes Técnica como meio de investigação para as diferentes etapas do processo de fertilização.etapas do processo de fertilização.

Tentativa de fazê-la como um método para predizer a Tentativa de fazê-la como um método para predizer a

fertilidade de touros doadores de sêmen.fertilidade de touros doadores de sêmen.

Grupos de animais a serem testados ele necessita Grupos de animais a serem testados ele necessita apresentar resultados na FIV superiores a 60% (Tanghe apresentar resultados na FIV superiores a 60% (Tanghe

et al., 2002).et al., 2002).

Método que simula a interação que ocorre entre os Método que simula a interação que ocorre entre os gametas, além de permitir um acompanhamento do gametas, além de permitir um acompanhamento do início do desenvolvimento embrionário.início do desenvolvimento embrionário.

Resultados controversos quanto a relação estabelecida Resultados controversos quanto a relação estabelecida entre fertilidade in vitro e fertilidade in vivo X exigência entre fertilidade in vitro e fertilidade in vivo X exigência da técnica em uma padronização entre os laboratórios.da técnica em uma padronização entre os laboratórios.

Relação oócito- espermatozóide estabelecida nos Relação oócito- espermatozóide estabelecida nos ensaios in vitro muitas vezes leva à avaliações não ensaios in vitro muitas vezes leva à avaliações não

fisiológicas (Rodriguez-Martinez, 2007).fisiológicas (Rodriguez-Martinez, 2007).

A técnicaA técnica Segundo Targlione et al. (2002) e Tanghe et al. (2002) Segundo Targlione et al. (2002) e Tanghe et al. (2002)

Coleta de folículos de 2-6mm, agulha

18.

Lavados com solução

tampão HEPES TALP

MATURAÇÃOTCM199 +

soro fetal bovino 20%5%CO2,

100%umidade, 38,5ºC

18-26 horas

OVÓCITOS + SPTZ JÁ CAPACITADOS.

5%CO2, 100%umidade,

38,5ºC, 20 HORAS.

Taxa de formação de pró-núcleos, correlacionando-os Taxa de formação de pró-núcleos, correlacionando-os com os métodos usualmente utilizados para predizer a com os métodos usualmente utilizados para predizer a fertilidade de touros. fertilidade de touros.

Puglisi et al. (2004) em um ensaio para avaliar a Puglisi et al. (2004) em um ensaio para avaliar a capacidade fecundante de amostras de sêmen de touros capacidade fecundante de amostras de sêmen de touros realizou dois experimentos relacionando FIV e realizou dois experimentos relacionando FIV e parâmetros cinéticos do sêmen de touros com alta e parâmetros cinéticos do sêmen de touros com alta e baixa fertilidade.baixa fertilidade.

No primeiro experimento este autor estabeleceu uma No primeiro experimento este autor estabeleceu uma relação de 3000 células espermáticas para cada oócito relação de 3000 células espermáticas para cada oócito por 5, 10, 15 e 18 horas pós inseminação (hpi).por 5, 10, 15 e 18 horas pós inseminação (hpi).

No segundo experimento a relação estabelecida foi de No segundo experimento a relação estabelecida foi de 1000 células por oócito durante 8 e 10 hpi. 1000 células por oócito durante 8 e 10 hpi.

Para 15 hpi e 8hpi houve resultado significativo (P<0, Para 15 hpi e 8hpi houve resultado significativo (P<0, 001). 001).

Os touros considerados com alta fertilidade obtiveram Os touros considerados com alta fertilidade obtiveram melhores resultados quando houve redução da relação melhores resultados quando houve redução da relação oócito:espermatozóide. oócito:espermatozóide.

PARÂMETROS CINÉTICOS PARÂMETROS CINÉTICOS DAS SUBPOPULAÇÕES DE DAS SUBPOPULAÇÕES DE

ESPERMATOZÓIDESESPERMATOZÓIDES

IntroduçãoIntrodução

Hoje já é aceito pela comunidade científica a existência de subpopulações espermáticas em ejaculados de mamíferos (Muiño et al. 2009 e 2008, Pérez-Llano et al. 2009, Ramió et al. 2008, Guillén-Rubio et al. 2007, Quintero-Moreno et al. 2004 e 2003).

Subpopulação EspermáticaSubpopulação Espermática

De acordo com Quintero-Moreno et al. 2004, podem ser De acordo com Quintero-Moreno et al. 2004, podem ser definidas por diferentes parâmetros:definidas por diferentes parâmetros:

Características de movimento;Características de movimento; Comportamento frente á citometria de fluxo;Comportamento frente á citometria de fluxo; Padrão específico de glicoconjugados de membrana;Padrão específico de glicoconjugados de membrana;

De acordo com Flores et al. 2009, podem ser definidas De acordo com Flores et al. 2009, podem ser definidas pela avaliação quantitativa de parâmetros morfométricos pela avaliação quantitativa de parâmetros morfométricos e de motilidade, utilizando o CASA e ASMA.e de motilidade, utilizando o CASA e ASMA.


Objetivos Objetivos

Demonstrar a presença de espermatozóides Demonstrar a presença de espermatozóides funcionalmente diferentes em um mesmo ejaculado;funcionalmente diferentes em um mesmo ejaculado;

Analisar as diferentes percentagens de cada Analisar as diferentes percentagens de cada subpopulação e sua relação com a capacidade de subpopulação e sua relação com a capacidade de fertilização de cada ejaculado;fertilização de cada ejaculado;


Guillén-Rubio et al. (2007), determinou três Guillén-Rubio et al. (2007), determinou três subpopulações com características morfométricas subpopulações com características morfométricas diferentes ejaculado. diferentes ejaculado.

Espermatozóides grandes, médios e pequenos.Espermatozóides grandes, médios e pequenos.


Subpopulação I: comprimento e diâmetro de cabeça Subpopulação I: comprimento e diâmetro de cabeça maior;maior;

Subpopulação II: menores dimensões de cabeça. Subpopulação II: menores dimensões de cabeça.

Amostras frescas: 8,7%Amostras frescas: 8,7%

Amostras descongeladas: 34%Amostras descongeladas: 34% Subpopulação III: dimensões médias de cabeça, sendo Subpopulação III: dimensões médias de cabeça, sendo

esse grupo mais representativo.esse grupo mais representativo.

Amostras frescas: 39%Amostras frescas: 39%

Amostras descongeladas: 50%Amostras descongeladas: 50%


Muiño et al. 2009 e 2008, determinou a existência de quatro Muiño et al. 2009 e 2008, determinou a existência de quatro subpopulações de acordo com seus parâmetros cinéticos.subpopulações de acordo com seus parâmetros cinéticos.

VCL, velocidade curvilínea;VCL, velocidade curvilínea; VSL, velocidade retilínea;VSL, velocidade retilínea; VAP, velocidade média;VAP, velocidade média; LIN, percentagem de linearidade;LIN, percentagem de linearidade; STR, percentagem de retilinearidade;STR, percentagem de retilinearidade; WOB, coeficiente wooble;WOB, coeficiente wooble; ALH, amplitude lateral média de movimento de cabeça;ALH, amplitude lateral média de movimento de cabeça; BCF, frequencia de batimentos de cauda;BCF, frequencia de batimentos de cauda;


Subpopulação I: representada por espermatozóides com Subpopulação I: representada por espermatozóides com velocidade relativamente baixa (média VCL, VSL e velocidade relativamente baixa (média VCL, VSL e VAP), porém com alta progressividade (alta LIN, STR, VAP), porém com alta progressividade (alta LIN, STR, WOB E BCF e baixa ALH). Essa representou 23% do WOB E BCF e baixa ALH). Essa representou 23% do total de espermatozóides móveis.total de espermatozóides móveis.

Subpopulação II: continha espermatozóides altamente Subpopulação II: continha espermatozóides altamente ativos, porém não progressivos indicados por altos ativos, porém não progressivos indicados por altos valores de VCL e ALH juntos a baixos valores de LIN e valores de VCL e ALH juntos a baixos valores de LIN e STR, com valores moderados de BCF. Essa STR, com valores moderados de BCF. Essa representou 16% do total de espermatozóides móveis.representou 16% do total de espermatozóides móveis.


Subpopulação III: possuíam baixa motilidade e não Subpopulação III: possuíam baixa motilidade e não progressivos, indicado por valores menores de VCL, progressivos, indicado por valores menores de VCL, VSL, VAP, ALH e BCF junto com os menores LIN, STR VSL, VAP, ALH e BCF junto com os menores LIN, STR e WOB. Essa representou 35% do total de e WOB. Essa representou 35% do total de espermatozóides móveis.espermatozóides móveis.

Subpopulação IV: continha aqueles espermatozóides Subpopulação IV: continha aqueles espermatozóides altamente móveis e progressivos, com valores maiores altamente móveis e progressivos, com valores maiores de VCL, VSL, VAP e BCF juntos com os maiores LIN, de VCL, VSL, VAP e BCF juntos com os maiores LIN, STR e WOB e moderado ALH. Essa representou 25% STR e WOB e moderado ALH. Essa representou 25% do total de espermatozóides móveis.do total de espermatozóides móveis.


Quando analisado a frequencia de distribuíção das Quando analisado a frequencia de distribuíção das subpopulações antes e após o pro cesso de subpopulações antes e após o pro cesso de descongelamento observou-se que:descongelamento observou-se que:

As subpopulações mudam significativamente durante As subpopulações mudam significativamente durante esse processo;esse processo;

A motilidade espermática média total de sêmen fresco e A motilidade espermática média total de sêmen fresco e recém descongelado diminui à medida que se aumenta recém descongelado diminui à medida que se aumenta o tempo após o descongelamento;o tempo após o descongelamento;

Distribuição da freqüência relativa de espermatozóides móveis (percentegens Distribuição da freqüência relativa de espermatozóides móveis (percentegens médias; n=54) dentre as subpopulações (1: colunas pretas, 2: colunas brancas, 3: médias; n=54) dentre as subpopulações (1: colunas pretas, 2: colunas brancas, 3: colunas cinzas, 4: colunas pontilhadas) amostras frescos e descongeladas de sêmen. colunas cinzas, 4: colunas pontilhadas) amostras frescos e descongeladas de sêmen. Letras diferentes (a-c) dentro das colunas indicam diferenças significantes dentre as Letras diferentes (a-c) dentro das colunas indicam diferenças significantes dentre as subpopulações e tempo de avaliação (fresco, 0, 2 ou 4 horas após subpopulações e tempo de avaliação (fresco, 0, 2 ou 4 horas após descongelamento). Letras acima das colunas (a-c) indicam diferenças significativas descongelamento). Letras acima das colunas (a-c) indicam diferenças significativas na motilidade espermática total entre diferentes tempos de avaliaçãona motilidade espermática total entre diferentes tempos de avaliação..

Fonte: Muiño et al. 2008

(a-d) Distribuição de freqüência relativa de espermatozóides móveis (percentagens (a-d) Distribuição de freqüência relativa de espermatozóides móveis (percentagens médias; n=6) dentre as subpopulações (1: colunas pretas, 2: colunas brancas, 3: médias; n=6) dentre as subpopulações (1: colunas pretas, 2: colunas brancas, 3: colunas cinzas, 4: colunas pontilhadas) entre touros em sêmen fresco (a) e colunas cinzas, 4: colunas pontilhadas) entre touros em sêmen fresco (a) e descongelado após 0 (b), 2 (c), 4h (d) de incubação após descongelamento a 37°C. descongelado após 0 (b), 2 (c), 4h (d) de incubação após descongelamento a 37°C. Letras diferentes (a,b e c) dentro ou ao lado das colunas indicam diferenças Letras diferentes (a,b e c) dentro ou ao lado das colunas indicam diferenças significativas dentre as subpopulações entre touros. Letras diferentes (a e b) acima significativas dentre as subpopulações entre touros. Letras diferentes (a e b) acima das colunas indicam diferenças significativas na motilidade total entre touros.das colunas indicam diferenças significativas na motilidade total entre touros.

Fonte: Muiño et al. 2008

Valores médios ( e amplitudes) dos parâmetros cinéticos definido as quatro Valores médios ( e amplitudes) dos parâmetros cinéticos definido as quatro subpopulações identificadas em amostras de sêmen fresco e descongeladas de subpopulações identificadas em amostras de sêmen fresco e descongeladas de touros. As letras diferentes (a-d) indicam diferenças significativas entre touros. As letras diferentes (a-d) indicam diferenças significativas entre subpopulações (P<0.05).subpopulações (P<0.05).

Fonte: Muiño et al., (2008)

Em geral essas diferenças indicam que nas quatro Em geral essas diferenças indicam que nas quatro subpopulações, os parâmetros de velocidade subpopulações, os parâmetros de velocidade espermática (VCL,VSL e VAP) decresceram após espermática (VCL,VSL e VAP) decresceram após criopreservação e também durante a incubação após criopreservação e também durante a incubação após descongelamento.descongelamento.

Os autores também relataram que a trajetória do Os autores também relataram que a trajetória do movimento espermático mudou de maneira diferente movimento espermático mudou de maneira diferente dependendo da subpoppulação. dependendo da subpoppulação.

Nas subpopulações 2 e 4, as trajetórias espermáticas Nas subpopulações 2 e 4, as trajetórias espermáticas foram mais progressivas após descongelamento e foram mais progressivas após descongelamento e durante a incubação após o descongelamento (altos durante a incubação após o descongelamento (altos LIN, STR e BCF), e enquanto as subpopulações 1 e 3 LIN, STR e BCF), e enquanto as subpopulações 1 e 3 tiveram suas trajetórias espermáticas menos tiveram suas trajetórias espermáticas menos progressivas imediatamente após o descongelamento progressivas imediatamente após o descongelamento do que antes da criopreservação, e passou a oscilar do que antes da criopreservação, e passou a oscilar mais durante a incubação após o descongelamento.mais durante a incubação após o descongelamento.

Considerações finaisConsiderações finais

Os estudos dos parâmetros cinéticos do Os estudos dos parâmetros cinéticos do sêmen de bovinos são de suma sêmen de bovinos são de suma importância para o desenvolvimento e importância para o desenvolvimento e aprimoramento de tecnologias para aprimoramento de tecnologias para indústria de processamento de sêmen.indústria de processamento de sêmen.

MUITO OBRIGADO!!!MUITO OBRIGADO!!!

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cinÉtica espermÁtica e fertilidade

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