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RENATA MOLINA MONTEIRO

Caracterização de protozoários pertencentes à sub-família

Toxoplasmatinae pela análise molecular do gene codificador

de proteína do choque térmico (HSP70) e do espaçador

interno transcrito 1 (ITS-1)

São Paulo 2006

RENATA MOLINA MONTEIRO

Caracterização de protozoários pertencentes à sub-família

Toxoplasmatinae pela análise molecular do gene codificador

de proteína do choque térmico (HSP70) e do espaçador

interno transcrito 1 (ITS-1)

São Paulo 2006

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Medicina Veterinária Departamento: Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal Área de Concentração: Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Martins Soares

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.1757 Monteiro, Renata Molina FMVZ Caracterização de protozoários pertencentes à sub-família

Toxoplasmatinae pela análise molecular do gene codificador de proteína do choque térmico (HSP70) e do espaçador interno transcrito 1 (ITS-1) / Renata Molina Monteiro. – São Paulo: R. M. Monteiro, 2006. 105 f. : il.

Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, 2006. Programa de Pós-graduação: Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses. Área de concentração: Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Martins Soares.

1. Fezes. 2. Diagnóstico. Reação em cadeia pela polimerase. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: MONTEIRO, Renata Molina Título: Caracterização dos protozoários pertencentes à sub-família Toxoplasmatinae pela análise molecular do gene codificador de proteína do choque térmico (HSP70) e do espaçador interno transcrito 1 (ITS-1)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária

Data:____/____/____

Banca Examinadora Prof. Dr. _________________________ Instituição: __________________

Assinatura: _________________________ Julgamento: __________________

Prof. Dr. _________________________ Instituição: ___________________


Prof. Dr. _________________________ Instituição: ___________________


DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais

Edson e Sonia, pelo imensurável amor e apoio,

sempre me incentivando a seguir em frente,

E ao meu avô Alfonso (in memorian)

por seu imenso amor e carinho.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Rodrigo Martins Soares, pela orientação, amizade, incentivo e acima de

tudo, pela paciência.

À Profa. Solange Maria Gennari, pela amizade, ensinamentos, apoio e pela confiança

em mim depositada.

Ao Prof. Dr. Leonardo José Richtzenhain, que disponibilizou seus laboratórios de

Biologia Molecular e Sorologia para a realização de grande parte deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Sílvio Arruda Vasconcellos por ter aberto as portas do VPS e por toda ajuda

fornecida.

À Dra. Hilda Fátima de Jesus Pena pelos ensinamentos e apoio prestado sempre que

solicitado.

À pesquisadora Dra. Josete Garcia Bersano, do Laboratório de Doenças de Suínos do

Instituto Biológico de São Paulo, pela forte amizade, confiança, oportunidade, e por ter

me incentivado a dar os primeiros passos em direção à pesquisa científica.

Ao pesquisador Dr. Manoel Portugal, do Instituto Biológico, que não mediu esforços a

me incentivar a iniciar a pós-graduação e pela sua grande amizade.

Ao meu namorado Ivan, que conheci no decorrer deste trabalho, pelo amor, dedicação,

incentivo e por todo apoio que me foi imprescindível. E à Ana Luísa, sua irmã, pela sua

amizade e alegria.

Às minhas tias e primos que sempre estiveram presentes nos diversos momentos da

minha vida.

À amiga de pós-graduação e pesquisadora Vera Lettície A. Ruiz, do Instituto Biológico,

pela grande amizade que fizemos depois de apenas alguns dias de convivência.

Aos amigos que encontrei no VPS e na FMVZ, Tatiana, Guacyara, Lílian, Cristina Brito,

Leandro e Roberto.

Aos amigos do Laboratório de Doenças Parasitárias Alessandra, Mikaela, Iara, Aline,

Lúcia, Luciana, Eliana, Daniela Chiebao, Richard, Alexandre Ataliba, Sílvio, Ricardo,

Maurício, Adriano, Daniel, Alexandre Thomaz, pelos bons momentos de trabalho e

convivência.

Aos demais pós-graduandos Lara, Adriana, Janaina, Daniela Ribeiro, Cristiana, Leslie,

Patrícia, Gisele, Clarice e Sonia.

Às amigas de infância, Carolina e Priscilla, por todos os bons momentos que

compartilhamos.

Às amigas de graduação, Camila e Adriana, pelos 5 anos de convivência e que apesar

da distância continuam sempre presentes na minha lembrança.

Aos funcionários da Secretaria do VPS, Danival, Cristina e Virgínia por toda ajuda e

amizade.

Aos demais funcionários, Sandra, Bispo, Carol, Sheila, Gisele, Pedrinho, Tonhão e

Alexandre (fininho).

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão

da bolsa de Mestrado e financiamento dos gastos do projeto de pesquisa.

E por fim, a todos aqueles que, direta ou indiretamente, participaram e auxiliaram-me no

desenvolvimento deste trabalho.

“As coisas são semelhantes: isto faz a Ciência possível; as coisas são diferentes: isto faz a Ciência necessária.” Levine e Lewontin, 1985

“ Completou-se uma jornada. Chegar é cair na inércia de um ponto final.

Na euforia da chegada, porém, há um convite irrecusável

para uma nova partida”

Helena Kolody

RESUMO

MONTEIRO, R. M. Caracterização de protozoários pertencentes à sub-família Toxoplasmatinae pela análise molecular do gene codificador de proteína do choque térmico (HSP70) e do espaçador interno transcrito 1 (ITS-1). [Characterization of protozoan belonging to sub-family Toxoplasmatinae through the molecular analysis from of heat shock protein (HSP70) coding gene and internal transcript spacer 1 (ITS-1)]. 2006. 105 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.

Os membros da sub-famíla Toxoplasmatinae conhecidos são Hammondia hammondi,

Toxoplasma gondii, Neospora hughesi, Neospora caninum e Hammondia heydorni. As

duas primeiras espécies têm os felídeos como hospedeiro definitivo, enquanto as duas

últimas têm desenvolvimento sexual em carnívoros da família dos canídeos. O ciclo

biológico de N. hughesi é pouco conhecido. Foi estudado a variabilidade nucleotídica de

seqüências intercaladas entre os genes codificadores das frações ribossômicas 18S,

5.8S (ITS-1). No entanto, como estas não permitem reconstruções filogenéticas com o

uso de grupo externo, em virtude da inconsistência dos alinhamentos produzidos,

pesquisamos uma seqüência codificadora de proteína sendo o marcador escolhido, o

gene codificador da proteína de choque térmico HSP70 (heat shock protein 70KDa).

Este gene é bastante utilizado para resolução de filogenias de outros organismos como,

por exemplo, aqueles pertencentes ao gênero Cryptosporidium. No presente trabalho,

amplificamos por PCR e seqüenciamos 951 pares de bases (pb) do gene codificador de

HSP70 de oocistos T. gondii-like (oriundos de fezes gatos), de oocistos Neospora-like

(de fezes de cães) e de taquizoitos de N. caninum, N. hughesi e T. gondii mantidos em

laboratório. Os primers foram desenhados a partir de seqüências consenso obtidas em

pesquisa de bancos de dados de seqüências EST de N. caninum e seqüências de

RNAm de T. gondii. Seqüências ITS-1 destes oocistos também foram determinadas

para a confirmação da espécie de parasito estudada. Os resultados mostram que os

táxons H. hammondi e T. gondii são monofiléticos e geneticamente muito próximos, mas

contrariando resultados anteriores, não foi demonstrada a monofilia entre os táxons H.

heydorni e N. caninum. De fato, a análise de diversidade nucleotídica de gene

codificador HSP70 mostra que a distância evolutiva entre H. heydorni e N. caninum é

tão grande quanto a distância de cada uma destas espécies com T. gondii. Em adição,

foi possível identificar dentre as amostras de oocistos, duas linhagens divergentes de H.

heydorni. Paralelamente ao estudo filogenético também foi possível desenvolver um

método diagnostico diferencial para oocistos tipo Hammondia. As seqüências de gene

HSP70 obtidas foram alinhadas e dois pares de primers internos a estas seqüências

foram desenhados. O primeiro par amplifica 771 pb de oocistos T. gondii-like e o

segundo 400 pb de oocistos Neospora-like. A clivagem do fragmento de 771 pb com

enzima de restrição Hin6I produz perfis eletroforéticos distintos para amostras de T.

gondii e H. hammondi. A clivagem do fragmento de 400pb com a enzima de restrição

MunI também produz perfis eletroforéticos distintos entre amostras de N. caninum e H.

heydornii. A diferenciação dos perfis de restrição pode ser feita em eletroforese em gel

de agarose a 2,5%.

Palavras-chave: Fezes. Diagnóstico. Reação em cadeia pela polimerase.

ABSTRACT

MONTEIRO, R. M. Characterization of protozoan belonging to sub-family Toxoplasmatinae through the molecular analysis from of heat shock protein (HSP70) coding gene and internal transcript spacer 1 (ITS-1) [Caracterização de protozoários pertencentes à sub-família Toxoplasmatinae pela análise molecular do gene codificador de proteína do choque térmico (HSP70) e do espaçador interno transcrito 1 (ITS-1)]. 2006. 105 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006. Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora huguesi, Neospora caninum and

Hammondia heydorni are the known members of the sub-family Toxoplasmatinae. H.

heydorni and N. caninum use canids as definitive hosts whereas felids are the definitive

hosts from T. gondii and H. hammondi. The definitive host of N. hughesi is unknown.

Here, the nucleotide diversity at internal transcribed spacer (ITS-1) and heat shock

protein (HSP70 kDa) loci in the subfamily toxoplasmatinae were studied. The HSP70

coding genes are widely used for phylogenetic studies in a number of other organisms

specially within the genus Cryptosporidium. In the present study, it was amplified by PCR

and sequenced 951 bases pairs (bp) from HSP70 coding gene from oocysts T.gondii-like

(from cat), from oocysts N. caninum-like (from dog) and tachyzoites of N. hughesi grown

on cell cultures. The primers were designed based on consensus sequences within EST

sequences of N. caninum sequences and RNAm sequences of T. gondii. ITS-1

sequences amplified from oocysts were also obtained in order to confirm the species of

the parasites. The results showed that T. gondii and H. hammondi are monophyletic and

genetically very close, but the monophyletic status of H. heydorni N. caninum was not

demonstrated. In fact, the nucleotide diversity at the HSP70 locus has shown that the

evolutionary distance between H. heydorni and N. caninum is as high as that observed

between either H. heydorni or N. caninum and T. gondii., In addition, it was possible to

identify two distinct groups among the H. heydorni oocysts. Concomitantly to the

phylogenetic study it was also possible to standardize a diagnostic test capable of

differentiate the oocysts Hammondia-like was development a diagnostic method that

differ oocysts T. gondii-like and N. caninum-like. The sequences obtained from HSP70

coding gene were aligned and two new pair of PCR primers was designed. The first pair

amplifies 771bp from T. gondii-like oocysts, whereas the second pair amplifies 400 bp

from N. caninum-like oocysts. The restriction enzyme Hin6I used to cleave the 771 bp

amplicons generated distinct profiles with samples from H. hammondi and T. gondii. The

same occurred with the restriction of the fragments of 400bp cleaved by the enzyme

MunI used in N. caninum e H. heydorni samples. The profiles can be differentiated by

2.5% agarose gel electrophoresis.

Key words: Feaces. Diagnostic. Polymerase chain reaction.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Posições dos sítios de clivagem da enzima Hin6I no fragmento de 771 pb das amostras de felinos amplificadas com os primers HSP70-F e HSP70-R........................................................................

61

FIGURA 2 - Esquematização do padrão eletroforético das clivagens realizadas pela enzima Hin6I nos fragmentos de 771 pb das amostras de felinos amplificadas com os primers HSP70-F e HSP70-R.......................................................................................................

62

FIGURA 3 - Amplificação de amostras de taquizoítos em 7 diferentes temperaturas de hibridização para a observação da melhor temperatura de hibridização dos primers.........................................

67

FIGURA 4 - Número de amostras de protozoários da sub-família toxoplasmatinae seqüenciadas; isolados (Hhe: H. heydorni; Tgo: T. gondii; Nca: N. caninum; Nhu: N. hughesi; Hha: H. hammondi); espécie do parasito; origem dos isolados; e resultados de identificação molecular (alelo) das sequencias de HSP70 e ITS-1........................................................................................................

71

FIGURA 5 - Reconstrução filogenética com inferência pelo método Neighbor-joining e teste de bootstrap com 1000 réplicas. Modelo de substituição de nucleotídeos Kimura dois parâmetros. As amostras de Neospora caninum (NcaPR) e Neospora hughesi (Nhu). Utilização de 951 nucleotídeos do gene codificador de HSP70. Foi incluído apenas um representante de cada alelo de Hammondia heydorni. Árvore gerada com o programa MEGA...............................................................................................

71

FIGURA 6 - Reconstrução filogenética com inferência pelo método Neighbor-joining e teste de bootstrap com 1000 réplicas. Modelo de substituição de nucleotídeos Kimura dois parâmetros. Seqüências de Cyclospora colobi, C. cayetanensis e C. cercophiteci (Cco, Cca e Cce) foram utilizadas como outgroup. Utilização de 951 nucleotídeos do gene codificador de HSP70. Foi incluído apenas um representante de cada alelo de Hammondia heydorni. Árvore gerada com o programa MEGA........................................................

72

FIGURA 7 - Reconstrução filogenética com inferência pelo método Parcimônia

e teste de bootstrap com 1000 réplicas. Foi gerada apenas uma árvore mais parcimoniosa com 497 passos (CI = 0.830986, RI = 0.892169). Seqüências de Cyclospora colobi, C. cayetanensis e C. cercophiteci (Cco, Cca e Cce) foram utilizadas como outgroup. Utilização de 951 nucleotídeos do gene codificador de HSP70. Árvore gerada com o programa MEGA............................................

73

FIGURA 8 - Reconstrução filogenética com inferência pelo método Neighbor-joining e teste de bootstrap com 1000 réplicas. Modelo de substituição de nucleotídeos Kimura dois parâmetros, excluindo a terceira posição dos codons. Seqüências de Cyclospora colobi, C. cayetanensis e C. cercophiteci (Cco, Cca e Cce) foram utilizadas como outgroup. Utilização de 634 nucleotídeos do gene codificador de HSP70. Foi incluído apenas dois representantes da espécie Hammondia heydorni (HheV2 e HheV5). Árvore gerada com o programa MEGA....................................................................

73

FIGURA 9 - Reconstrução filogenética com inferência pelo método Parcimônia e teste de bootstrap com 1000 réplicas, excluindo a terceira posição dos codons. Foi gerada apenas uma árvore mais parcimoniosa com 88 passos (CI = 0.931818, RI = 0.933333). Seqüências de Cyclospora colobi, C. cayetanensis e C. cercophiteci (Cco, Cca e Cce) foram utilizadas como outgroup. Utilização de 634 nucleotídeos do gene codificador de HSP70. Árvore gerada com o programa MEGA............................................

74

FIGURA 10 - PCR-RFPL das amostras de oocistos de cães frente as diferentes enzimas com os primers HSP400-F/HSP 400-R. As amostras tanto podem ser clivadas apenas com a enzima MunI, como podem ser utilizadas as enzimas que cortam apenas um dos organismos......................................................................................

75

FIGURA 11 - PCR-RFPL das amostras de gatos com os primers HSP70-F/HSP70-R e clivagem com a enzima Hin6I. Consultar Figura 2 para conferência dos fragmentos gerados.......................................

76

FIGURA 12 - Alinhamento das seqüências ITS-1 produzidas neste estudo. Não estão representadas as seqüências disponíveis em bancos de dados...............................................................................................

94

FIGURA 13 - Alinhamento das seqüências HSP70 produzidas neste estudo. Não estão representadas as seqüências disponíveis em bancos de dados. Não está representada neste alinhamento a seqüência originária de oocisto de T. gondii identificada como 76....................

99

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - Seqüência dos primers utilizados nas reações de PCR e seqüenciamento, seus respectivos tamanhos em pares de bases e dos produtos que amplificam.........................................................

52

QUADRO 2 - Fragmentação dos produtos de PCR dos protozoários frente às diferentes enzimas de restrição........................................................

60

QUADRO 3 - Diferença de número de nucleotídeos entre os alelos de HPS70 e ITS-1 nos de H. heydorni. O número entre parêntesis corresponde às diferenças entra as seqüências de ITS-1. O número fora dos parêntesis corresponde às diferenças entre os 951 nucleotídeos das seqüências do gene codificador HSP70....................................

70

QUADRO 4 - Número de amostras de protozoários da sub-família toxoplasmatinae seqüenciadas; isolados (Hhe: H. heydorni; Tgo: T. gondii; Nca: N. caninum; Nhu: N. hughesi; Hha: H. hammondi); espécie do parasito; origem dos isolados; e resultados de identificação molecular (alelo) das sequencias de HSP70 e ITS-1........................................................................................................

77

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DNA ácido desoxirribonucléico EDTA ácido etileno diamino tetracético g grama g gravidade terrestre HCl ácido clorídrico HSP heat shock protein – proteína do choque térmico ITS internal transcribed spacer– “espaçador interno transcrito” KCl cloreto de potássio M molar µg micrograma µL microlitro mL mililitro µm micrômetro mM milimolar NaCl cloreto de sódio PBS solução salina tamponada com fosfato PCR reação em cadeia pela polimerase pH potencial hidrogeniônico q.s.p quantidade suficiente para RFLP restriction fragment lenght polymorphism – “polimorfismo dos fragmentos

gerados por enzimas de restrição” SDS dodecil sulfato de sódio TE tampão Tris-EDTA v/v volume a volume

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 191.1 CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA DE Toxoplasma gondii E

Hammondia hammondi..........................................................................

21

1.2 CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA DE Neospora caninum E

Hammondia heydorni.............................................................................

26

1.2.1 Hammondia heydorni........................................................................... 271.2.2 Neospora caninum............................................................................... 34

1.3 Marcadores Moleculares para Estudos Filogenéticos da Sub-Família

Toxoplasmatinae....................................................................................

38

2 OBJETIVOS........................................................................................... 443 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 453.1 AMOSTRAS ANALISADAS.................................................................... 45

3.2 PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS......................................................... 46

3.3 EXTRAÇÃO DE DNA DOS OOCISTOS................................................ 46

3.4 PURIFICAÇÃO DOS TAQUIZOÍTOS DE N. caninum/ T. gondii............ 48

3.5 EXTRAÇÃO DE DNA DOS TAQUIZOÍTOS DE N. caninum E T.

gondii......................................................................................................

48

3.6 DESENHO DOS PRIMERS................................................................... 49

3.7 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR).............................. 52

3.7.1 Temperatura de Hibridização dos Primers........................................ 533.7.2 Ciclo da Reação em Cadeia pela Polimerase.................................... 543.8 DETECÇÃO DO PRODUTO AMPLIFICADO......................................... 55

3.9 PESQUISA DE SÍTIOS DE RESTRIÇÃO.............................................. 56

3.10 SEQÜENCIAMENTO............................................................................. 63

3.10.1 Purificação dos Produtos Amplificados............................................ 633.10.2 Quantificação dos Produtos de PCR Purificados............................. 633.10.3 Reação de Seqüenciamento............................................................... 643.10.4 Precipitação do DNA............................................................................ 643.10.5 Eletroforese de Seqüenciamento....................................................... 653.10.6 Análise das Seqüências...................................................................... 65

4 RESULTADOS....................................................................................... 664.1 TEMPERATURA DE HIBRIDIZAÇÃO DOS PRIMERS......................... 66

4.2 ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS............................................................... 67

4.3 PCR-RFLP............................................................................................. 74

5 DISCUSSÕES........................................................................................ 786 CONCLUSÕES...................................................................................... 85 REFERENCIAS...................................................................................... 86 APÊNDICE............................................................................................. 94

19

1 INTRODUÇÃO

O Filo Apicomplexa consiste de um grupo diversificado de protozoários, caracterizado

pela presença de uma estrutura intracelular, denominada complexo apical, formada por

organelas especializadas e localizada na extremidade anterior da célula parasitária

(LEVINE, 1970). Este complexo apical está vinculado à invasão do parasito na célula

hospedeira (SOLDATI et al., 2001; TOMLEY et al., 2001).

Neste filo, o grupo de organismos mais numeroso é aquele formado pelos coccídios,

termo usualmente aplicado para a categoria classe ou sub-classe (LEE et al., 2001;

TENTER et al., 2002). As hierarquias taxonômicas ulteriores são tradicionalmente

definidas com base em traços fenotípicos, como caracteres morfológicos das formas de

vida e características de ciclo biológico dos organismos (TENTER et al., 2002).

Entre os coccídios são descritas desde espécies homoxenas de estrita especificidade de

hospedeiro até outras heteroxenas envolvendo grande amplitude de hospedeiros

intermediários para o desenvolvimento de seu ciclo de vida (TENTER et al., 2002).

A Família Sarcocystidae (sub-ordem Eimeriorina, Ordem Eucoccidiorida, sub-classe

Coccidiasina, segundo LEVINE, 1988) compreende cerca de 200 espécies de coccídios

heteroxenos que formam cistos teciduais em hospedeiros intermediários. Esta Família é

subdividida em duas sub-famílias denominadas Sarcocystinae e Toxoplasmatinae.

Enquanto a sub-família Sarcocystinae vem sendo considerada monogenérica com mais

de 180 espécies descritas, a sub-família Toxoplasmatinae é composta por quatro

20

gêneros: Toxoplasma (uma espécie), Neospora (duas espécies), Hammondia (duas

espécies) e Besnoitia (seis espécies) (TENTER; JOHNSON, 1997).

Integrantes da sub-família Toxoplasmatinae desenvolvem-se assexuadamente nos

tecidos dos hospedeiros intermediários em duas fases. Na primeira fase, taquizoitos

multiplicam-se aceleradamente em diversas células por penetração ativa ou fagocitose e

se multiplicam rapidamente por endodiogenia dentro de um vacúolo parasitóforo. A

célula hospedeira se rompe quando não suporta mais o crescimento dos taquizoítos,

que então invadem células vizinhas (BLACK; BOOTHROYD, 2000; DUBEY; LINDSAY;

SPEER, 1998; SPEER et al., 1999). Em um segundo momento, as células parasitárias

se dividem lentamente, encerradas no interior de cistos teciduais. Nesta fase, as células

parasitárias, os bradizoítos, são as únicas formas de multiplicação do agente nos cistos

teciduais, e correspondem ao estágio de desenvolvimento final do parasito no

hospedeiro intermediário (DUBEY, 1993).

Se ingeridos por um hospedeiro definitivo, os bradizoítos iniciam uma nova fase

proliferativa nas células epiteliais dos intestinos. Gamogonia e formação de oocistos não

esporulados ocorrem neste local. Após liberação no lúmen intestinal, os oocistos

esporulam no ambiente originando oocistos com dois esporocistos contendo quatro

esporozoitos cada (DUBEY, 1993).

21

1.1 CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA DE Toxoplasma gondii E Hammondia

hammondi

O T. gondii foi descrito em 1908, quase simultaneamente, por Splendore (1908), no

Brasil, em coelhos, e por Nicole e Manceaux (1908), em um roedor africano,

Ctenodatylus gondi, na Tunísia. Em 1970, Frenkel e Dubey (1970), confirmaram o gato

como hospedeiro definitivo após identificarem estágios sexuais do parasito no intestino

delgado e a presença de oocistos nas fezes desses animais.

O T. gondii é prevalente na maior parte do mundo e tem grande importância médica e

veterinária, podendo causar abortos ou doenças congênitas graves nos hospedeiros

intermediários. A infecção por T. gondii pode levar a formação de cistos latentes, bem

como, em indivíduos imunossuprimidos haver uma reativação da infecção latente,

levando a quadros clínicos severos e muitas vezes fatais. Em animais de produção

como ovinos, caprinos e suínos, os abortamentos e mortalidades neonatais acarretam

prejuízos econômicos (DUBEY, 1994).

O ciclo de vida do T. gondii é heteroxeno facultativo e pode envolver todos os animais

de sangue quente, incluindo mamíferos, aves, humanos (DUBEY, 1994; TENTER;

HECKEROTH; WEIS, 2000).

A Hammondia hammondi é estruturalmente e antigenicamente similar ao T. gondii. O

gato é o único hospedeiro definitivo conhecido da H. hammondi (DUBEY; SREEKUMAR,

2003; FRENKEL; DUBEY, 1975a, b). Apesar da similaridade entre os dois agentes,

existem algumas características antagônicas entre eles, tais como: a H. hammondi não

é transmitida congenitamente pelos seus hospedeiros; os oocistos e taquizoítos não são

22

infectantes para os hospedeiros definitivos; e os taquizoítos e bradizoítos não infectam

os hospedeiros intermediários. Esses se infectam apenas com a ingestão oral de

oocistos (DUBEY; SREEKUMAR, 2003).

Diferentemente do que ocorre com o T. gondii, a H. hammondi é um parasito heteroxeno

obrigatório (FRENKEL e DUBEY, 1975a, b; WALLACE, 1975). Isso foi observado por

Frenkel e Dubey (1975a) a partir do isolamento em fezes de um gato selvagem (Felis

catus) naturalmente infectado. No início acreditavam tratar-se de oocistos de T. gondii,

mas estudos detalhados sobre o ciclo biológico desse organismo, indicaram que essa

espécie de protozoário necessitava de um ciclo obrigatório em dois hospedeiros, ou

seja, os felinos apenas infectam-se caso ingiram cistos teciduais dos hospedeiros

intermediários (FRENKEL; DUBEY, 1975a).

Frenkel e Dubey (2000) consideram a diferença de ciclo biológico, heteroxeno facultativo

no T. gondii e heterexeno obrigatório na H. hammondi, como fator suficientemente

importante para discriminar esses agentes em diferentes gêneros e espécies. Heydorny

e Mehlhorn (2001) discutem essa proposição, uma vez que, estes autores afirmam que,

o ciclo homoxeno de T. gondii, com a inoculação via oral de doses altas de oocistos,

ocorreram apenas em condições experimentais e em menos de 30% dos gatos

estudados. No entanto, a ingestão de cistos teciduais de T. gondii, levou a produção de

oocistos em quase 95% dos gatos. Na opinião deles, o ciclo de vida do T. gondii é

primariamente heteroxeno e apresenta restritas transmissões homoxenas.

Além disso, há o fato de que poucos estudos foram executados com a H. hammondi em

gatos, o que torna insuficiente para categorizá-la como espécie de um novo gênero

(HEYDORNY; MEHLHORN, 2001).

23

Em resposta a essas críticas, Dubey e Sreekumar (2003), relatam um extenso estudo

sobre a H. hammondi e apresentam suas diferenças em relação ao T. gondii. A

começar, duas características morfológicas ultraestruturais são diferentes entre os dois

protozoários quando comparados em estudos citológicos. A primeira é que nos

taquizoítos, as roptrias de H. hammondi são eletro-densas, enquanto que no T. gondii

são eletro-lúcidas e a segunda diferença, está na presença de corpo cristalóide em

esporozoítos de H. hammondia e a ausência dos mesmos nos T. gondii (DUBEY;

SCREEKUMAR, 2003; SPEER et al., 1998).

Nos gatos foram encontrados esquizontes e gamontes de H. hammondi nas células do

intestino delgado 4 dias após a ingestão de tecidos de camundongos cronicamente

infectados. O desenvolvimento extraintestinal e a formação de taquizoítos e cistos

teciduais não foram encontrados nesses animais em cortes histológicos,

imunohistoquímica, ou pelo bioensaio. Ao passo que, essas formas biológicas do T.

gondii já foram amplamente relatadas nos felinos (DUBEY; SREEKUMAR, 2003).

Em transmissões envolvendo a H. hammondi, os gatos infectam-se somente com a

ingestão de cistos presentes nos hospedeiros intermediários. Como prova disso,

camundongos foram inoculados via oral com oocistos de H. hammondi e com apenas 1

dia taquizoítos foram encontrados nos tecidos desses animais. No entanto, os felinos

alimentados com esses camundongos não eliminaram oocistos. Tal fato ocorreu apenas

quando os gatos foram alimentados com camundongos inoculados há 10 dias (DUBEY;

STREITEL 1976; DUBEY; SREEKUMAR, 2003). No caso do T. gondii, os três estágios,

taquizoítos, cistos contendo bradizoítos e oocistos, são infectantes tanto para

hospedeiros intermediários como definitivos (DUBEY; BEATTIE, 1988).

24

Em observações microscópicas os cistos de H. hammondi foram visualizados

principalmente nos músculos esqueléticos e cardíacos, vísceras, linfonodos

mesentéricos e poucos no cérebro de camundongos experimentalmente infectados. Ao

passo que, cistos de T. gondii são observados em grande quantidade no tecido nervoso

desses animais (DUBEY; STREITEL 1976; DUBEY; SCREEKUMAR, 2003).

Os cistos intramusculares de H. hammondi e T. gondii não possuem diferenças

significativas ultraestruturalmente nos músculos esqueléticos, exceto pelo tamanho dos

bradizoítos que foi de 4 a 5 x 1,2 µm e 7 a 8 x 1,5-2 µm, respectivamente (MEHLHORN;

FRENKEL, 1980). No entanto, essas mensurações discordam das obtidas por Dubey e

Sreekumar (2003), onde os bradizoítos de H. hammondi foram ligeiramente maiores que

os do T. gondii, sendo 5.9 x 1.3 µm e 5.4 x 1.1 µm respectivamente. De qualquer forma,

as diferenças em termos de localização e tamanho entre os cistos teciduais de ambos

protozoários não são suficientes para a diferenciação entre eles (HEYDORN;

MEHLHORN, 2001; DUBEY; SREEKUMAR, 2003).

No geral, o estudo realizado por Dubey e Sreekumar (2003) relata que taquizoítos,

bradizoítos, oocistos e esporozoítos da H. hammondi são aproximadamente 1µm

maiores que essas estruturas no T. gondii.

Em cultura celular já foi descrita a infecção de H. hammondi nas células CRKF (rim de

felino), CV1 (rim de macaco Verde Africano) e M617 (monócito de bovino), por

taquizoítos e esporozoítos, que formaram estruturas que se assemelhavam a

bradizoítos e cistos teciduais (RIAHI et al., 1995; DUBEY; SCREEKUMAR, 2003). Os

cistos formados nas culturas celulares foram similares aos observados nos músculos e

tampouco diferiam dos cistos mantidos in vitro de T. gondii (RIAHI et al., 1995). No

25

entanto, esse parasito não se mantém indefinidamente em cultura de células, como

observado nas culturas de T. gondii. (DUBEY; SCREEKUMAR, 2003; RIAHI et al.,

1995).

Outra diferença importante entre ambos os organismos é o fato de que em

camundongos a H. hammondi não resiste a mais de uma passagem, diferentemente do

T. gondii que pode ser mantido indefinidamente nesses animais (DUBEY;

SREEKUMAR, 2003; WALLACE, 1975).

Nos gatos e nos hospedeiros intermediários, com exceção dos murinos, a infecção por

H. hammondi não parece causar nenhuma sintomatologia clínica, no entanto, a infecção

experimental com oocistos em camundongos mostrou ser algumas vezes patogênica,

provocando sintomas como letargia, anorexia, diarréia e algumas vezes morte

(FRENKEL; DUBEY, 1975a, b; DUBEY; STREITEL, 1976).

Quando comparado a patogenicidade entre os dois protozoários acometendo hamsters

e camundongos, o T. gondii demonstra uma mortalidade de animais muito mais elevada

do que a H. hammondi. Além disso, o número de mortes e de cistos viáveis nos

cérebros de animais pré-imunizados com oocistos de H. hammondi e que sofreram

posterior desafio com oocistos de T. gondii em doses altas, foi muito menor que em

animais que não foram expostos anteriormente a H. hammondi, indicando que esse

organismo confere certo fator de proteção às infecções por T. gondii (CHRISTIE;

DUBEY, 1977).

Em relação aos testes sorológicos, a H. hammondi apresenta reação cruzada com o T.

gondii, porém os títulos são inferiores, quando comparados aos títulos obtidos nas

26

infecções por T. gondii nos hospedeiros intermediários (FRENKEL; DUBEY, 1975b,

2000). Adicionalmente, algumas organelas internas da H. hammondi como o complexo

apical, grânulos densos, micronemas e roptrias, apresentaram antígenos que foram

reconhecidos por anticorpos monoclonais anti-T. gondii (RIAHI et al., 1999).

A partir dessas relações antigênicas encontradas entre os dois agentes, Heydorn e

Mehlhorn (2001) mais uma vez contestam a existência da necessidade de se criar um

novo gênero e uma nova espécie, uma vez que, não existam casos semelhantes de

espécies pertencentes a gêneros diferentes que sejam capazes de mediar, mesmo que

parcialmente, imunidade um contra o outro.

Antes da descrição do gênero Hammondia, a Microscopia Eletrônica permitia a

diferenciação entre T. gondii, algumas espécies de Frenkelia, Sarcocystis e Besnoitia

através da visualização das características específicas de cada gênero pela morfologia

de cistos teciduais, (MEHLHORN; FRENKEL, 1980). Entretanto, após a descrição das

duas espécies de Hammondia a dificuldade na diferenciação entre os organismos

aumentou, uma vez que a morfologia entre os cistos de T. gondii e das H. hammondi e

H. heydorni, são muito semelhantes (MATSUI, 1991; MEHLHORN; FRENKEL, 1980).

1.2 CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA DE Neospora caninum E Hammondia heydorni

Divergências semelhantes ocorrem entre o N. caninum e a H. heydorni que tem os cães

como hospedeiros definitivos, todavia, ambos parasitos não possuem suas

características e ciclos biológicos bem elucidados.

27

1.2.1 Hammondia heydorni

Oocistos não esporulados foram encontradas nas fezes de um cão alimentado com

carne crua de bovino por Heydorn e Rommel (1972). Após a esporulação esses oocistos

mensuravam 11,9 x 11,1µm e foram considerados, devido ao tamanho e morfologia,

como sendo similar aos oocistos de Isospora bigemina (HEYDORN; ROMMEL1, 1972

apud HEYDORN; MEHLHORN, 2002, p. 177). A partir daí, foi realizado uma série de

experimentos usando este isolado denominado I. bigemina – Berlim 1971, onde o ciclo

biológico foi em partes elucidado por Heydorn (1973) e Heydorn et al. (1975)

(HEYDORN, 19732; HEYDORN; et al., 19753 apud HEYDORN; MEHLHORN, 2002, p.

177).

O nome Isospora bigemina foi utilizado inicialmente em parasitos que se desenvolviam

na lâmina própria do intestino de cães, porém o protozoário em questão possui o

desenvolvimento na superfície do epitélio intestinal (DUBEY et al., 2002a, b).

Os resultados conferidos em relação ao ciclo biológico do I. bigemina foram os

seguintes: estágios teciduais não foram detectados em cortes histológicos de cães e

bovinos, porém, os cães que ingeriram experimentalmente tecidos de outros cães e de

bovinos infectados, eliminaram oocistos nas fezes; oocistos esporulados infectaram

cães, mas não induziram a eliminação de oocistos pelos mesmos; os oocistos não

infectaram gatos, coelhos tampouco camundongos imunocompetentes; e por fim, a

1 HEYDORN, A. O.; ROMMEL, M. Beitrãge zum Lebenszyklus der Sarkosporidien. II. Hundes und Katze als Überträger der Sarkosporidieb des Rindes. Berl Münch Tierãrztl Wochenschr, v. 85, p. 121-123, 1972. 2 HEYDORN, A. O. Zum Lebenszyklus der Kleinen Form von Isospora bigemina des Hundes. I. Rind und Hund als mögliche Zwischernwirte. Berl Münch Tierãrztl Wochenschr, v. 86, p. 323-329, 1973. 3 HEYDORN, A. O.; GESTRICH, R.; IPENZYNSKI, V. Zum Lebenszyklus der Kleinen Form von Isospora bigemina des Hundes. II.Entwicklungsstadien im Darm des Hundes. Berl Münch Tierãrztl Wochenschr, v. 88, p. 449-453, 1975.

28

produção de oocistos eliminados pelos cães foi sempre baixa (1-3 milhões/ cão)

(HEYDORN, 1973; HEYDORN; et al., 1975 apud HEYDORN; MEHLHORN, 2002).

Devido aos estudos realizados por Alfred O. Heydorni sobre o ciclo biológico e pela

diferença na localização do desenvolvimento do protozoário, Tadros e Laarman (1976)

propuseram o nome Isospora heydorni. Posteriormente, Dubey (1977) questionou a

classificação do parasito como pertencente ao gênero Isospora, uma vez que, os

oocistos dos organismos deste gênero induzem reprodução sexuada nos hospedeiros

definitivos, o que não ocorre com esse protozoário. Desta forma, o I. heydorni foi

posicionado no gênero Hammondia recebendo o nome de Hammondia heydorni devido

às similaridades estruturais e de ciclo biológico com a já conhecida H. hammondi.

Ainda em relação aos experimentos realizados por Heydorn (1973) e Heydorn et al.

(1975) referentes ao ciclo biológico, revelaram oocistos não patogênicos, o cão como

hospedeiro definitivo da H. heydorni e o ciclo sendo heteroxeno obrigatório (HEYDORN,

1973; HEYDORN; et al., 1975 apud HEYDORN; MEHLHORN, 2002).

Posteriormente Dubey e Fayer (1976) realizaram diversos experimentos também na

tentativa de melhor elucidar o ciclo biológico da H. heydorni e relataram que em

condições experimentais o cão pode servir tanto como hospedeiro definitivo, bem como

hospedeiro intermediário.

Os achados do experimento supracitado foram os seguintes: ao microscópio não foram

encontrados estágios teciduais ou oocistos nas fezes de cães inoculados oralmente com

oocistos; oocistos infectaram cães, pois alguns animais que ingeriram tecidos de cães

inoculados com oocistos eliminaram oocistos nas fezes; esquizontes e gamontes foram

29

encontrados nas células epiteliais de cães infectados; oocistos não esporulados

mensuraram 11 x 12µm, e quando esporulados mensuraram 12 X 13µm; gatos e

camundongos também não foram infectados por oocistos esporulados (DUBEY; FAYER,

1976).

Poucos anos depois, oocistos tipo H. heydorni foram encontrados nas fezes de uma

raposa (Vulpes vulpes) após a ingestão de tecidos de um corço (Capreolus capreolus)

naturalmente infectado, e nas fezes de coiotes (Canis latrans) após a ingestão de ovinos

experimentalmente infectados com oocistos. Desta forma, foram caracterizados mais

duas espécies de canídeos como hospedeiros definitivos da H. heydorni. (DUBEY;

WILLIAMS, 1980; ENTZEROTH; SCHOLTYSECK; GRUEL, 1978). O estudo que

envolveu o fornecimento de tecidos de corço para a raposa, foi paralelamente realizado

em cães, porém esses animais não eliminaram oocistos em suas fezes (ENTZEROTH;

SCHOLTYSECK; GRUEL, 1978).

Blagburn et al. (1988) realizaram bioensaios em cães, caprinos e um bovino, a partir de

oocistos tipo H. heydorni encontrados nas fezes de um cão com caquexia, atrofia

bilateral dos músculos temporais e diarréia. Os oocistos esporulados, maiores que o

isolado de Heydorn (1973), mensuraram 12,6 x 11,9µm e a quantidade de oocistos

encontrada nas fezes deste animal foi bastante elevada (1,37 x 109). A presença de

sintomatologia e a alta quantidade de oocistos recolhida, foi creditada ao tratamento

contínuo com corticosteróide que vinha sendo administrado. Os animais inoculados

experimentalmente não adoeceram e estágios teciduais não foram encontrados

histologicamente. Neste estudo, apenas os tecidos de caprinos inoculados é que

resultam na eliminação de oocistos, o que discorda dos resultados anteriores onde o

canibalismo entre cães resultou na eliminação de oocistos. Por todas essas diferenças,

30

o autor sugere que esse isolado tenha características biológicas diferentes dos isolados

anteriormente estudados.

Heydorni e Mehlhorn (2002) apresentaram dados de um estudo não publicado de um

isolado de H. heydorni que diferia em alguns aspectos do isolado original I. bigemina -

Berlin -1971. O isolado em questão, denominado I. bigemina - Berlin -1974, foi adquirido

de um cão poodle sacrificado devido a uma incurável diarréia hemorrágica. Cerca de

600 milhões de oocistos foram recolhidos. Ovinos e caprinos experimentalmente

infectados com esses oocistos não apresentaram sintomatologia clínica, porém os cães

alimentados com esses tecidos eliminaram uma grande quantidade de oocistos nas

fezes. Este isolado assemelhou-se mais ao isolado descrito por Blagburn et al. (1988)

do que ao isolado de 1971 descrito por Heydorn (1973), uma vez que, os oocistos

apresentavam-se ligeiramente maiores e a quantidade eliminada pelos cães foi muito

mais elevada.

Em estudos recentes também não publicados, os mesmos autores indicam a

possibilidade de haver mais de uma espécie de coccídea formadores de oocistos tipo

H.heydorni, todas sendo muito semelhantes, porém com ligeiras diferenças em

tamanho, características biológicas e imunológicas (HEYDORNI; MEHLHORN, 2002).

Pesquisando oocistos tipo H. heydorni em fezes de cães, Sreekumar et al. (2003)

demonstraram que, de cinco isolados negativos para uma PCR específica para

detecção de seqüências de N. caninum (BASZLER et al., 1999), apenas dois isolados

foram positivos pela PCR utilizando primers desenhados por Slapeta et al. (2002a),

considerados H. heydorni-específicos. As amostras negativas foram então testadas por

uma terceira PCR utilizando primers desenhados a partir de marcadores gerados por

DNA polimórfico amplificado ao acaso (RADP), amplificados a partir de isolado

31

Manhattan-1 de H. heydorni, e continuaram negativas. A partir destes resultados, os

autores concluem que deva existir variabilidade extensa no táxon atualmente

denominado H. heydorni.

Algumas pesquisas recentes com coccídios do tipo H. heydorni, geneticamente distintos

de N. caninum e de H. heydorni em cães vêm demonstrando que mais de uma espécie

de Hammondia (ou mais de duas espécies de Toxoplasmatinae além de H. heydorni e

N. caninum) podem utilizar cães como hospedeiros definitivos (DUBEY et al., 2002a;

SCHARES et al., 2002; SLAPETA et al., 2002b).

Schares et al. (2002) analisam a possibilidade de que os oocistos tipo H. heydorni

eliminados nas fezes de raposas podem pertencer a um parasito diferente dos que

acometem os cães, pois nesse estudo tanto os cães quanto as raposas se alimentaram

de tecidos de ovinos e caprinos experimentalmente infectados, porém, apenas as

raposas eliminaram oocistos tipo H. heydorni. Resultado similar ocorreu no estudo de

Entzeroth, Scholtyseck e Gruel (1978) onde também apenas uma raposa eliminou

oocistos.

Os oocistos isolados de raposa obtidos por Schares et al. (2002) não resultaram em

fragmentos específicos para N. caninum na reação em cadeia pela polimerase (PCR).

No seqüenciamento de genes RNA ribossomal, o ITS-1 e o domínio D2/ D3 (segmentos

do DNA que codifica o 28S), revelaram similaridade às seqüências designadas H.

heydorni. O gene ITS-1 foi 99% idêntico com H. heydorni, porém as regiões D2/D3

diferiam em algumas posições das seqüências disponíveis de H. heydorni.

32

Mohamemed et al. (2003) baseado em seqüências do domínio D2/ D3 da subunidade

maior do ribossomo (28S do rDNA), apontam para a possibilidade de que os isolados de

cães e raposas H. heydorni constituem populações geneticamente diferentes.

Sreekumar et al. (2004) detectaram polimorfismo entre diferentes isolados de H.

heydorni da Argentina, Brasil e Estados Unidos. Os métodos de detecção foi pelo

polimorfismo conformacional de fita simples (SSCP) e pelo polimorfismo dos fragmentos

gerados por enzimas de restrição (RFLP). Este estudo não demonstra que essa ligeira

heterogeneidade está relacionada com as diferentes distribuições geográfica, tampouco

com a espécie hospedeira, cão ou raposa.

Ainda em relação à diversidade gênica da H. heydorni entre cães e raposas, Abel et al.

(2006) estudaram oocistos em um cão naturalmente infectado, imunossuprimido devido

a altas doses de medicamentos e com episódios de diarréia. Os oocistos deste animal

foram comparados com os oocistos de raposas e de outros cães, através das

seqüências de ITS-1 e α-tubulina. Enquanto as seqüências de ITS-1 foram compatíveis

com as seqüências disponíveis em banco de dados, as análises em gel de agarose e no

seqüenciamento da α-tubulina revelaram uma inserção de 9 pb nas amostras de

raposas que estavam ausentes nas de cães, sugerindo que existam diferenças

genéticas entre os isolados destas duas espécies de animais.

Os esporozoítos do isolado de oocistos de raposas similares, mas geneticamente

diferentes da H. heydorni (SCHARES et al., 2002), foram adicionados a linhagens de

células embrionárias de coração de bovino. Passado três meses de infecção, a média

de vacúolos parasitóforos havia caído muito. Isto sugere que não se consegue

estabelecer uma contínua cultura de células derivadas do isolado Hammondia sp. de

33

raposas. Esse fato contradiz com o que se observa em T. gondii e N. caninum, mas está

de acordo com os resultados encontrados nas tentativas de se estabelecer um sistema

de cultura de células contínuo para H. heydorni ou H. hammondi (SCHARES et al.,

2003).

Esporozoítos de H. heydorni obtidos de um cão naturalmente infectado foram inoculados

em culturas celulares de células endoteliais da artéria pulmonar (CPA), Madin-Darby

bovine kidney (MDBK), monócitos de bovinos (M617) e monócitos de ovinos (WOMO).

Os esporozoítos penetraram nas quatro linhagens celulares e se reproduziram por

endodiogenia formando estruturas semelhantes a cistos. Com o passar dos dias as

células foram se multiplicando cada vez menos e quando transferidas para outras

culturas não inoculadas, os taquizoítos não penetraram nem se desenvolveram (SPEER

et al., 1988).

A única descrição de cistos teciduais de H. heydorni foi em cérebros de dois cobaios

que haviam ingerido oocistos do parasito. Esses cistos foram indistinguíveis dos cistos

descritos de T. gondii (MATSUI, 1991).

Slapeta et al. (2002a) analisando seqüências disponíveis no GenBank indicaram a

existência de inserções e deleções consistentes que acontecem na região ITS-1 de

isolados de T. gondii, H. heydorni, H. hammondi e N. caninum. Com primers

desenhados sobre estas inserções e deleções os autores desenvolvem um método

diagnóstico capaz de detectar exclusivamente seqüências de H. heydorni em oocistos

naturalmente eliminados de fezes de cães.

34

1.2.2 Neospora caninum

Em 1984 foi descrita uma enfermidade neurológica em filhotes de cães da Noruega, que

provocava encefalomielite, miosite e paresia. Parasitos livres foram encontrados no

cérebro e nos músculos e parasitos encistados no cérebro assemelhavam-se ao

Toxoplasma gondii, porém os testes sorológicos e o boiensaio em camundongos foram

negativos para este organismo (BJERKÄS; MOHN; PRESTHUS, 1984).

Pouco depois, Dubey et al. (1988a) tornaram a analisar cortes histológicos de 23 cães

mortos anos e meses antes diagnosticados como toxoplasmose. Somente 13 desses

animais confirmaram o T. gondii como causador das patologias, enquanto que nos

outros 10 cortes foi identificado um novo gênero, o Neospora, e uma nova espécie, o

Neospora caninum.

A nomeação desse parasito em um novo gênero ocorreu devido às diferenças

observadas quando comparado ao T. gondii. Os sintomas clínicos do N. caninum foram

relacionados a paresia e paralisia de cães, principalmente nos membros posteriores, o

que não se observa na toxoplasmose. A ausência de um vacúolo parasitóforo ao redor

dos taquizoítos também diferenciou o novo parasito do T. gondii. Nas observações

relacionadas aos cistos teciduais, ambos organismos possuíram algumas diferenças

morfológicas e divergências quanto à localização dos parasitos. A espessura da parede

no N. caninum foi de 1-4µm e a localização estava restrita a tecidos nervosos, enquanto

que a parede do T. gondii é bastante delgada com

35

O ciclo biológico do N. caninum foi elucidado em 1998, quando foi demonstrada a

eliminação de oocistos nas fezes de cães que ingeriram cistos nos cérebros de

camundongo infectado, concluindo-se que o cão era um hospedeiro definitivo McAllister

et al. (1998). Mais recentemente, observou-se que o coiote (Canis latrans) também pode

eliminar oocistos nas fezes, demonstrando ser também hospedeiro definitivo do N.

caninum (GONDIM et al., 2004).

Em relação aos oocistos, os de N. caninum não diferiram dos oocistos de H. heydorni

dos cães tampouco de H. hammondi e T. gondii dos felinos. Quando esporulados foram

de formato esférico a subsférico e mensuraram 11,7 x 11,3µm e os esporocistos

alongados mensuraram 7,0 – 8,0 x 2,0 – 3,0µm (LINDSAY; UPTON; DUBEY, 1999).

Uma extensa discussão foi apresentada por Heydorn e Mehlhorn (2002), questionando

algumas contradições apresentadas no trabalho que descreveu o N. caninum em 1988

quando comparado com estudos posteriores. No trabalho de Dubey et al. (1988a), os

autores descreveram a ausência de vacúolo parasitófaro ao redor dos taquizoítos, fato

esse que serviu para discriminar o novo organismo do outro coccídeo relacionado, o T.

gondii. No entanto, no mesmo ano e em outros trabalhos posteriores, o autor descreveu

a presença de vacúolo parasitófaro envolvendo os taquizoítos, o que indica que a

ausência ou presença dessa estrutura na discriminação e diferenciação de gêneros foi

indevida (DUBEY; LINDSAY, 1993; DUBEY et al.,1988b; LINDSAY; DUBEY, 1989;

SPEER; DUBEY, 1989; SPEER et al., 1999).

Outra contradição encontrada foi quanto à espessura das paredes dos cistos. Em

diversos trabalhos foi descrito as paredes do N. caninum como sendo mais espessas

que as do T. gondii, com cerca de 1 a 4µm (DUBEY; LINDSAY, 1993). Porém, alguns

36

estudos posteriores descreveram a parede dos cistos bastante delgadas, chegando a

cerca de 0,5µm, variando conforme a localização e o tempo de existência do cisto no

hospedeiro (DUBEY et al., 1990; SPEER; DUBEY, 1989).

Ainda em relação aos cistos teciduais, a localização encontrada por Peters et al. (2001)

também contraria os estudos iniciais sobre o N. caninum, uma vez que, foram relatados

cistos nos músculos de quatro cães com neosporose e dois bovinos recém-nascidos,

confirmados por marcação imunohistoquímica.

Heydorni e Mehlhorn (2002) comentam que os estudos apresentados sobre o N.

caninum estão sendo comparados principalmente com o T. gondii, quando na verdade

há a necessidade de se confrontar resultados que comparem o N. caninum com a H.

heydorni, principalmente devido à similaridade de hospedeiros definitivos.

Dubey et al. (2002b) responde a tais críticas com comparações relacionadas às

principais diferenças presentes no cultivo celular, nos taquizoítos e em diferenças

moleculares. Em relação ao cultivo celular, o N. caninum pode ser mantido

continuamente em diferentes linhagens de células, o que não ocorre na H. heydorni.

Diferenças ultraestruturais nos taquizoítos também são descritas, tais como, diversos

grânulos de amilopectina na H. heydorni que são ausentes ou raros nos taquizoítos de

N. caninum e o mesmo possui maior quantidade de micronemas que a H. heydorni.

Adicionalmente, O N. caninum pode ser transmitido a uma variedade de hospedeiros por

inoculações subcutâneas de tecidos infectados, enquanto que a H. heydorni necessita

obrigatoriamente de dois hospedeiros para fechar o ciclo biológico (DUBEY et al.,

2002b).

37

Através de métodos moleculares, o N. caninum apresentou-se distinto da H. heydorni

baseado em seqüências gênicas do ITS-1 e do 28S DNA ribossomal (ELLIS et al., 1999,

MUGRIDGE et al., 1999; SCHARES et al., 2001).

Schares et al. (2001) atentam que os experimentos muitas vezes descritos como sendo

H. heydorni conduzidos anteriores à descoberta do cão como hospedeiro definitivo do N.

caninum em 1998 (MCALLISTER et al., 1998), devam ser reavaliados criticamente, uma

vez que, os estudos que utilizam oocistos tipo Hammondia encontrados nas fezes de

canídeos podem ter sido descritos indevidamente como H. heydorni quando na verdade

podem ser N. caninum ou talvez outros protozoários coccídeos que também tem o cão

como hospedeiro definitivo.

De qualquer forma, o Neospora caninum tem sido admitido como um importante

causador de desordens neuromusculares em cães e desordens reprodutivas em bovinos

acarretando em prejuízos econômicos. Pouco se sabe sobre o seu ciclo biológico Este

protozoário é transmitido via transplacentária e essa é a principal rota de transmissão

para os bovinos, pela ingestão de tecidos infectados ou pela ingestão de alimentos

contaminados com oocistos excretados pelas fezes de cães (DUBEY, 2003).

Métodos baseados em técnicas moleculares como a PCR e o seqüenciamento

automático de ácidos nucléicos podem oferecer uma alternativa eficiente para a

diferenciação de organismos cujas características morfológicas são indistinguíveis. No

caso dos membros da sub-família Toxoplasmatinae, PCRs específicas para T. gondii e

N. caninum já foram desenvolvidas e tentativas de desenvolvimento de diagnóstico

molecular de oocistos de outras espécies vêm sendo continuamente produzidas

38

(MÜLLER et al., 1996; SLAPETA et al., 2002a; YAMAGE; FLECHTNER; GOTTSTEIN,

1996).

1.3 Marcadores Moleculares para Estudos Filogenéticos da Sub-Família

Toxoplasmatinae.

Inferências filogenéticas da sub-família Toxoplasmatinae feita com base em dados

fenotípicos como especificidade de hospedeiro, padrões de ciclo de biológico, grau de

heteroxenia (heteroxenia facultativa ou obrigatória), modo de transmissão dos estágios

infecciosos, categoria de células parasitadas bem como morfologia e localização dos

cistos teciduais podem ser problemáticas para análises dos gêneros Toxoplasma,

Hammondia e Neospora, visto que ciclos de vida completos somente são conhecidos

para o caso do T. gondii e H. hammondi (TENTER et al., 2002).

Por outro lado, dados moleculares podem ser obtidos sem necessariamente o

conhecimento de características de ciclo de vida, pois muitas vezes podem ser

recuperados de qualquer forma de vida do parasito. Ainda, este tipo de informação

fornece maior número de dados filogeneticamente informativos para inferências

evolutivas, em especial para o caso de organismos estreitamente relacionados. De fato,

caracteres moleculares atendem a premissa evolutiva de homologia, bem como

possuem suficiente variabilidade para fornecer diferentes estados de caractere

(TENTER et al., 2002).

O DNA codificador de RNA ribossomal de eucariotos consiste de múltiplas cópias de um

conjunto de segmentos que contemplam genes que são transcritos para originar as

unidades 18S, 5,8S e 28S, moléculas estruturais dos ribossomos. Neste conjunto de

39

segmentos de DNA, os genes que codificam as unidades 18S e 5,8S são intercalados

por um segmento espaçador denominado ITS-1 (do Inglês internal trascribed spacer).

Da mesma forma, os genes que codificam as unidades 5,8S e 28S são intercalados pelo

segmento espaçador ITS-2 (HILLIS; DIXON, 1991).

De maneira geral, para comparação entre organismos, as seqüências codificadoras da

unidade 18S (18S rDNA) são utilizadas para elucidar divergências pré-cambrianas

enquanto as seqüências codificadoras da unidade 28S (28S rDNA), para divergências

paleozóicas e mesozóicas. As seqüências ITSs são caracterizadas por possuírem uma

taxa evolutiva muito superior àquelas das unidades codificadoras, sendo por isso

utilizadas para revelar divergências entre organismos que ocorreram em períodos muito

mais recentes (HILLIS; DIXON, 1991; OLSEN; WOESE, 1993).

Divergências entre os organismos pertencentes ao grupo dos coccídios vêm sendo

aferidas pela pesquisa do locus ribossomal, em especial as seqüências 18S rDNA

(JENKINS et al., 1999; MORRISON et al., 2004; TENTER et al., 1994). Recentemente,

estudos filogenéticos empregando seqüências 28S rDNA e ITS-1 vêm sendo conduzidos

para pesquisar divergências existente entre grupo de organismos estreitamente

relacionados, como o grupo dos coccídios formadores de cistos e os pertencentes à

sub-família Toxoplasmatinae (ELLIS et al., 1998; 1999; HOMAN et al., 1997; LANG-

UNNASCH et al., 1998; MUGRIDGE et al., 1999; MUGRIDGE et al., 2000; OBORNIK et

al., 2002a; OBORNIK et al., 2002b).

De fato, as elevadas taxas evolutivas das seqüências ITS do rDNA nuclear têm

encorajado alguns autores a pesquisar estes marcadores para diferenciar organismos

estreitamente relacionados dentro do filo Apicomplexa (TENTER et al., 2002).

40

Embora os dados moleculares vêm apontando que os membros da família

Sarcocystidae são muito mais relacionados do que se imaginava quando consideradas

apenas comparações de dados de natureza fenotípica (ELLIS et al., 1998, 1999,

MURGRIDGE et al., 1999; SLAPETA et al., 2002a e 2002b; TENTER et al., 2002),

reconstruções filogenéticas baseadas nas informações do gene codificador da unidade

28S do RNA ribossomal oferecem informações suficientes para que seja sugerido que

os coccídios formadores de cistos sejam divididos em duas linhagens distintas, uma

contendo os gêneros Toxoplasma, Hammondia, Neospora e Besnoitia e outra contendo

organismos do gênero Sarcocystis (ELLIS et al., 1999; MURGRIDGE et al., 1999).

Nestas análises, o gênero Hammondia é parafilético, pois H. Heydorni e N. caninum

formam clusters distintos do grupo formado por H. hammondi, T. gondii.

De fato, é consenso entre diversos autores que os dados moleculares sugerem que

espécies de Toxoplasma, Hammondia, Neospora e Besnoitia têm divergência recente,

podendo ser até mesmo agrupadas em um mesmo gênero.

Independentemente das discussões acaloradas sobre a urgência na reclassificação

taxonômica das espécies pertencentes à sub-família Toxoplasmatinae, é fato que existe

diversidade genotípica entre isolados pertencentes a este grupo de organismos, em

especial aquelas que distinguem N. caninum e H. heydorni (ELLIS et al., 1999;

SCHARES et al., 2002; SLAPETA et al., 2002b).

Além do estudo da região ITS-1, o gene codificador de proteína de choque térmico,

HSP70, também pode ser esclarecedor em relação à constituição gênica de coccícidias.

Essas proteínas denominadas Proteínas de Choque Térmico (Heat Shock Proteins -

HSPs) têm merecido destaque por constituírem uma resposta comum nos mais distintos

41

organismos e por serem conservadas ao longo de toda a escala evolutiva. Os genes

que codificam HSP do grupo de 70 kDa (HSP70) foram os primeiros a serem isolados e

estudados em diversos organismos (CRAIG et al., 1993).

A família HSP70 possui a função de reunir os complexos de proteínas, e quando atuam

como moléculas chamadas chaperonas, auxiliam no dobramento de proteínas até a

conformação funcional que precisam assumir. Em condições estressantes, as

chaperonas são rapidamente ativadas para prevenir a agregação e o dobramento

incorreto das proteínas (BUKAU; HORWICH, 1998).

Em condições normais para as células constituem proteínas abundantes e importantes.

Entre as funções podemos citar: assistência no dobramento de proteínas recém

traduzidas; auxilio para que as proteínas atravessem entre as membranas organelares

pela ação de cis e trans; desmontar proteínas de estruturas oligoméricas; e facilitar

degradação proteolítica de proteínas instáveis. Na maioria dos eucariotos, são

localizadas em três regiões diferentes nas células, no lúmen do retículo endoplasmático,

no citoplasma, e nas organelas como mitocôndrias e cloroplastos (KARLIN;

BROCCHIERI, 1998).

A incerteza em relação ao diagnóstico e diferenciação entre os protozoários da sub-

família Toxoplasmatinae, resulta em discussões que até o momento não foram capazes

de esclarecer e fornecer subsídios adequados para tal distinção. Uma apropriada

elucidação destes organismos permitiria melhoria e direcionamento adequado nos

estudos, além da necessidade que existe em se firmar ou corrigir, a nomenclatura de

tais parasitos. A diferenciação torna-se ainda mais necessária no momento em que há o

42

envolvimento das sintomatologias e perdas econômicas que são provocadas pelo T.

gondii e N. caninum.

Algumas ferramentas moleculares apresentadas permitem diagnosticar somente um dos

protozoários, não podendo ser descartada a possibilidade de alguma falha na

metodologia empregada da reação, o que acarretaria em falso resultado. Outra maneira

de se obter resultados através de ferramentas moleculares baseia-se em PCR seguido

de seqüenciamento das amostras, porém isso encarece o procedimento, além de ser

possível apenas em laboratórios bem estruturados e que contenham os equipamentos

necessários.

Entre as técnicas moleculares disponíveis para a caracterização de amostras de

protozoários, está a análise de RFLP, que vem sendo utilizada para estudos de

diferentes organismos como Leishmania, Trypanosoma, Plasmodium, Acanthamoeba,

Cryptosporidium (CRISTINA, 1991; GOBET; TOZE, 2001).

A técnica de RFLP baseia-se na clivagem de DNA com enzimas de restrição que

reconhecem uma determinada seqüência de quatro a oito bases. Em uma mesma

região de um determinado cromossomo compartilhado entre organismos relacionados,

observa-se que a seqüência de DNA pode ser similar, porém não idênticas. Desta

forma, ao se clivar duas seqüências de DNA relacionadas com a mesma enzima de

restrição, o perfil eletroforético apresenta bandas de pesos moleculares diferentes que

são os segmentos de comprimentos diferentes obtidos pela clivagem do DNA (CLARK;

RUSSEL, 1997).

43

Com base no que foi exposto, o presente estudo visa identificar oocistos de tipo H.

heydorni em fezes de carnívoros domésticos através de um método rápido e simples

como a PCR-RFLP que seja capaz de gerar resultados possíveis de diferenciação entre

os organismos. Adicionalmente, este estudo apresenta reconstruções filogenéticas com

a utilização de um gene codificador de proteínas (HSP70) que permite a inclusão de

grupos externos nas análises.

44

2 OBJETIVOS

• Identificar oocistos tipo H. heydorni em fezes de carnívoros pela análise da

seqüência intercalada entre as frações codificadoras das unidades ribossômicas

18S e 5.8S e do gene codificador de proteína de choque térmico HSP70 (heat

shock protein 70KDa).

• Distinguir os oocistos de H. hammondi dos de T. gondii de fezes de felinos e

Neospora spp. dos de H. heydorni de fezes de canídeos por PCR-RFLP de

fragmentos de gene codificador da HSP70.

• Propor reconstrução filogenética dos organismos estudados com os dados

obtidos e com aqueles recuperados de bases de dados de acesso público.

45

3 MATERIAL E MÉTODO

Neste capítulo estão descritos os materiais e as metodologias utilizadas para a

realização deste experimento.

3.1 AMOSTRAS ANALISADAS

Amostras de fezes de cães e gatos submetidas à rotina de exames coproparasitológicos

no Laboratório de Doenças Parasitárias do Departamento de Medicina Veterinária

Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP

foram avaliadas pelo método de centrífugo flutuação em solução de sacarose

(d=1,203g/cm3) para a pesquisa de oocistos tipo Hammondia (H. hammondi e T. gondii

em fezes de felinos e Neospora spp. e H. heydorni em fezes de caninos). Além das

amostras de rotina, o Laboratório já dispunha de uma coleção de amostras

armazenadas em dicromato de potássio 2,5%, positivas para oocistos tipo Hammondia.

Como controles positivos nas reações de PCR e também para teste da eficiência dos

primers foram utilizados taquizoítos da cepa NC1 de Neospora caninum e da cepa RH

de Toxoplasma gondii. Os taquizoítos de N. caninum são mantidos por inoculações em

células VERO e os de T. gondii por inoculação intraperitoneal em camundongos suíços

albinos. Também foi utilizado neste estudo amostra de taquizoitos de N. hughesi

mantido em células VERO, gentilmente cedidos pelo Prof. Luis Fernando Pita Gondim

da Universidade Federal da Bahia (UFBA). Todas as amostras utilizadas neste estudo

estão reunidas no quadro 4.

46

3.2 PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE FEZES

As amostras positivas para oocistos tipo Hammondia foram submetidas a uma

centrifugação para concentração de oocistos. Dissolveu-se cerca de 1 grama de fezes

em 11mL de solução de sacarose (d=1,203g/cm3). O material foi transferido para tubos

tipo falcon e centrifugado a 1.500g por 10 minutos. Os oocistos presentes na superfície

da suspensão foram recuperados com o auxílio de uma alça de platina e depositados

em lâmina coberta por uma lamínula para visualização ao microscópio óptico a fim de se

avaliar a morfologia e estimar a quantidade de oocistos.

A recuperação dos oocistos foi realizada com a lavagem da lâmina e lamínula com

1,5mL de tampão TE (10mM Tris HCl ph 8,0; 1mM EDTA ph 8,0) em placa de Petri. O

lavado foi transferido para microtubos de 1,5mL e centrigugado a 12.000g por 10

minutos. Desprezou-se o sobrenadante e foi repetido o mesmo processo. O sedimento

contendo oocistos foi submetido à extração do DNA.

3.3 EXTRAÇÃO DE DNA DOS OOCISTOS

Adicionou-se ao sedimento de oocistos um tampão de extração (Tris-HCl 10mM; NaCl

100mM; EDTA 25mM; SDS 1%) até a obtenção de um volume final de 590µL. Realizou-

se o congelamento e descongelamento das amostras três vezes consecutivas para

melhor rompimento dos oocistos. Adicionou-se 5µl de proteinase K (10µg/µL) e

procedeu-se uma incubação em banho-seco por 4 horas à 37oC ou 2 horas a 56oC.

Após esse período, realizou-se três novo congelamentos e descongelamentos e

adicionou-se mais 5µL de proteinase K (10µg/µL). As amostras foram novamente

47

incubadas em banho-seco por 2 horas a 56oC ou “overnight” a 37oC. O volume final

obtido foi de 600µL.

Para a purificação das amostras adicionou-se 300µL de fenol e 300µL de clorofórmio,

seguido por homogeneização e centrifugação a 12.000g por 10 minutos a 4oC. O

sobrenadante (cerca de 400µL) foi transferido a um novo microtubo e adicionou-se 10%

deste volume recolhido, que neste caso foi 40µL, de acetato de sódio (3M pH 5,3) para

precipitação do DNA. Após a homogeneização, as amostras foram mantidas em freezer

a -20oC por no mínimo 2 horas, ou “overnight”.

As amostras foram centrifugadas a 12.000g por 30 minutos a 4oC. Desprezou-se o

sobrenadante e o sedimento foi ressuspendido em 1mL de etanol a 70%. O material foi

novamente centrifugado a 12.000g por 10 minutos a 4oC. O sobrenadante foi

desprezado e o microtubo deixado em posição invertida até estarem completamente

secos.

Por fim, adicionou-se 30µL de TE (10mM Tris HCl pH 8,0; 1mM EDTA pH 8,0) nas

amostras e essas foram homogeneizadas e incubadas em banho-seco a 56oC por 30

minutos. Após uma nova homogeneização as amostras foram armazenadas no freezer a

-20oC até a sua utilização.

48

3.4 PURIFICAÇÃO DOS TAQUIZOÍTOS DE N. caninum/ T. gondii

Partiu-se do material de inoculação de cada agente. Quando o material a ser extraído o

DNA era N. caninum recolheu-se cerca de 300µL da suspensão de células VERO

contendo taquizoítos e no caso de T. gondii, 300µL de suspensão de lavado

intraperitoneal de camundongos contendo taquizoítos.

Para a extração dos taquizoítos o protocolo utilizado é muito semelhante ao de oocistos,

porém mais simplificado e com menos etapas.

As suspensões foram lavadas adicionando-se TE (10mM Tris HCl pH 8,0; 1mM EDTA

pH 8,0) até completar o volume total de1,5mL e centrifugado a 12.000g por 10 minutos.

Desprezou-se o sobrenadante e repetiu-se o mesmo processo. Os sedimentos contendo

taquizoítos foram submetidos à extração do DNA.

3.5 EXTRAÇÃO DE DNA DOS TAQUIZOÍTOS DE N. caninum E T. gondii

Adicionou-se ao sedimento um tampão de extração (Tris-HCl 10mM; NaCl 100mM;

EDTA 25mM; SDS 1%; proteinase K 10µg/µL) até a obtenção de um volume final de

600µl. Em seguida procedeu-se uma incubação em banho-seco por 2 horas à 56oC ou

“overnight” a 37oC.

Para a purificação do material adicionou-se 300µL de fenol e 300µL de clorofórmio,

homogeneizou-se e foram centrifugados a 12.000g por 10 minutos a 4oC. O

sobrenadante (cerca de 400µL) foi transferido a um novo microtubo e adicionou-se 10%

49

(40µL) deste volume recolhido de acetato de sódio (3M pH 5,3). As amostras foram

homogeneizadas e mantidas em freezer a -20oC por no mínimo 2 horas, ou “overnight”.

Após esse período de incubação, as amostras foram centrifugadas a 12.000g por 30

minutos a 4oC. Desprezou-se o sobrenadante e o sobrenadante foi ressuspendido em

1mL de etanol a 70%. O material foi novamente centrifugado a 12.000g por 10 minutos a

4oC. O sobrenadante foi desprezado e o microtubo deixado em posição invertida até

estarem completamente secos.

Adicionou-se 30µl de TE (10mM Tris HCl pH 8,0; 1mM EDTA pH 8,0) nas amostras e

essas foram homogeneizadas e incubadas em banho-seco a 56oC por 30 minutos. Após

uma nova homogeneização as amostras foram armazenadas no freezer a -20oC até a

sua utilização.

3.6 DESENHO DOS PRIMERS

Para a amplificação de seqüências intercaladas entre as frações codificadoras das

unidades ribossômicas 18S e 5,8S (ITS-1) de organismos da sub-família

Toxoplasmatinae foram utilizados um primer senso complementar a região 3´terminal da

seqüência 18S rDNA e um primer anti-senso complementar à região 5´ terminal do gene

5,8S rDNA,. Para isso, foi padronizada uma PCR com o primer JS4 (SLAPETA et al.,

2002a) como primer senso e o primer CT2b anti-senso foi desenhado neste estudo.

O primer CT2b é complementar à região 5´terminal do gene 5,8S e seu desenho

baseou-se nas seqüências parciais e completas do gene 5,8S de H. heydorni, H.

hammondi, N. caninum e T. gondii disponíveis em bases de dados moleculares.

50

No presente estudo, descrevemos também os resultados obtidos com a caracterização

molecular de fragmentos gênicos codificadores de proteína de choque térmico, no intuito

de encontrar marcador molecular para a identificação de espécies pertencentes à sub-

família Toxoplasmatinae. O alvo elegido foi o gene codificador de proteína de choque

térmico de 70KDa, a HSP70.

Para o desenho dos primers, buscamos regiões similares entre seqüências de T. gondii

e N. caninum que pudessem servir de sítios de ancoragem de primers capazes de

amplificar fragmentos gênicos de ambas as espécies. Os primers desenhados neste

estudo foram denominados HSP70 out-F e HSP70-R.

A metodologia empregada para o desenho dos primers HSP70 out-F e HSP70-R está

sumarizada nos itens a seguir:

1. Pesquisa no Genbank de seqüências de HSP70 para T. gondii.

2. Recuperação das seqüências encontradas no item anterior e submissão das

mesmas no banco de dados de seqüências genômicas de T. gondii

http://toxodb.org/. Com este procedimento verificamos que as seqüências

pesquisadas no item 1 eram contínuas e não intercaladas por íntrons.

3. Submissão das seqüências encontradas no item 1 junto ao banco de seqüências

de N. caninum, disponíveis no site site http://www.tigr.org/.

4. Recuperação das seqüências obtidas no item 3.

5. Alinhamento das seqüências obtidas nos itens 1 e 3. As regiões de total

similaridade entre as seqüências foram usadas para desenho dos primers

HSP70out-F e HSP70-R

51

6. Os primers foram sintetizados e utilizados para amplificar as amostras

disponíveis neste estudo.

Os pares de primers JS4/CT2b e HSP70out-F/HSP70-R (Quadro 1) foram testados para

amplificar amostras de taquizoitos de N. caninum (cepa NC-1, mantida em cultura de

células VERO nos laboratórios da FMVZ-USP) e T. gondii (cepa RH, mantida em

camundongos nos laboratórios da FMVZ-USP). A seguir, foram testadas todas as

amostras de oocistos isoladas de cão e de gato que estavam estocadas nos laboratórios

da FMVZ-USP (n=23), bem como três amostras de taquizoitos mantidas em modelos

biológicos (uma amostra de N. huguesi, cepa Oregon, uma amostra de T. gondii, cepa

RH1 e uma amostra de N. caninum, cepa NC1).

Todas as 32 amostras testadas foram positivas para ambos os pares de primers. Dentre

as amostras amplificadas com os primers JS4/CT2b, 25 foram seqüenciadas para a

determinação da seqüência completa de ITS-1 (Quadro 4). Este fragmento foi

seqüenciado com os mesmos primers que o geraram (ver protocolo detalhado de

seqüenciamento nos itens seguintes). As seqüências obtidas foram submetidas ao

BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) para a identificação molecular da espécie

detectada, por comparação com seqüências já caracterizadas e disponíveis em rede.

Vinte e nove amostras foram seqüenciadas com os primers HSP70out-F/HSP70-R.

Após a determinação das seqüências obtidas com o par de primers HSP70out-

F/HSP70-R (Quadro 4), dois novos pares de primers internos a estas seqüências foram

desenhados. O primeiro deles foi o par HSP70-F/HSP70-R, baseado em seqüências de

T. gondii e de H. hammondi. O segundo par, o HSP400-F/HSP400-R, é baseado em

seqüências de N. caninum, N. hughesi e H. heydorni. Assim, os primers HSP70-F e

52

HSP70-R foram utilizados para concluir o seqüenciamento dos fragmentos originados de

T. gondii ou de H. hammondi. Os primers HSP400-F e HSP400-R foram utilizados para

concluir o seqüenciamento dos fragmentos originados de N. caninum, N. hughesi ou H.

heydorni. O desenho de primers internos foi necessário por que o fragmento gerado por

HSP70out-F/HSP70-R é muito grande. As porções medianas do fragmento não seriam

alcançadas com os primers HSP70 out-F/HSP70-R.

Todos os primers utilizados neste estudo estão identificados no quadro 1.

Primers Seqüências Referência Tamanho do produto JS4

(senso) 5’-CGAAATGGGAAGTTTTGTGAAC-3’ SLAPETA et.

al., 2002a CT2b

(anti-senso) 5’-TTGCGCGAGCCAAGACATC-3’ Este estudo

Varia entre os

organismos

HSP70 out-F (senso) 5’-CAGTCGGACATGAAGCATTGGC-3’

Este estudo

HSP70-R (anti-senso) 5’-ATCGCACGCTCACCTTCGTACAC-3’ Este estudo

1103

HSP70-F (senso) 5’-GAACGTCCTCATCTTCGACATGG-3’ Este estudo

HSP70-R (anti-senso) 5’-ATCGCACGCTCACCTTCGTACAC-3’ Este estudo

771

HSP400-F (senso) 5’-GAAGAGGTTTCAGCCATGGTG-3’ Este estudo

HSP400-R (anti-senso) 5’-GGTTCTTGCGCTTGAAGTCCT-3’ Este estudo

400

Quadro 1 - Seqüência dos primers utilizados nas reações de PCR e seqüenciamento, seus respectivos tamanhos em pares de bases e dos produtos que amplificam

3.7 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)

Os primers foram testados nas seguintes combinações: HSP70out-F/ HSP70-R,

HSP400-F/ HSP400-R e HSP70-F/ HSP70-R.

53

Para uma reação de 50µL utilizou-se 2,5µL de cada primer (10pmol/µL), 5µL de 10x

PCR Buffer, 1,5µL de MgCl2 (50mM), 8µL de dNTP (1,25mM), 0,3µL de Taq polimerase

e 5µL de DNA extraído da amostra alvo.

3.7.1 Temperatura de Hibridização dos Primers

Para testar o desempenho dos pares de primers HSP70out-F e HSP70-R, HSP70-F e

HSP70-R e HSP400-F e HSP400-R, amostras de DNA extraído de taquizoítos de T.

gondii, bem como de N. caninum, foram submetidas a PCRs com diferentes

temperaturas de hibridização, a fim de se avaliar com qual delas se obtinha uma melhor

eficiência da reação. A amplificação do DNA foi feita em equipamento Martecycler

Gradient Eppendorf.

Para testar os primers HSP70out-F e HSP70-R, o ciclo foi realizado da seguinte forma:

Desnaturação a 94o por 3 minutos

Desnaturação a 94o por 50 segundos

Hibridização dos primers em 7 diferentes temperaturas: 50,0oC; 52,7oC;

54,0oC; 55,4oC; 56,8 oC; 58,1 oC; 60,4 oC por 50 segundos

Extensão a 72oC por 50 segundos

40 ciclos de repetição a partir da desnaturação por 50 segundos

Extensão final a 72oC por 5 minutos

Para os pares de primers HSP70-F/ HSP70-R e HSP400-F/ HSP400-R o ciclo foi

realizado conforme o que se segue:

54

Desnaturação a 94o por 3 minutos

Desnaturação a 94o por 30 segundos

Hibridização dos primers em 7 diferentes temperaturas: 50,0oC; 52,7oC;

54,0oC; 55,4oC; 56,8 oC; 58,1 oC; 60,4 oC por 50 segundos




3.7.2 Ciclo da Reação em Cadeia pela Polimerase

Após a determinação da melhor temperatura de hibridização de cada primer, o protocolo

a seguir foi adotado para a amplificação das amostras com qualquer um dos primers

desenhados neste estudo.

Para uma reação de 50µL foram utilizados:

25, 2µL de água ultrapura autoclavada

5µL de 10x PCR Buffer (KCl 50mM; Tris-HCl 10mM; pH 9,0)

8µL da mistura de dNTPs (1,25mM)

1,5µL de MgCl2 (50mM)

2,5µL de cada primer (10 pmol/ µL)

0,3µL de Taq DNA polimerase

5µL de DNA extraído da amostra alvo

Os primers JS4/CT2b, HSP70-F/HSP70-R, HSP 400-F/HSP 400-R foram utilizados com

o seguinte ciclo:

55

Desnaturação inicial a 94oC por 3 minutos

Desnaturação a 94oC por 30 segundos

Hibridização dos primers a 55oC por 30 segundos




Como os primers HSP70 out-F/ HSP70-R amplificam fragmentos de 1103 pb, o ciclo

utilizado foi mais longo:

Desnaturação inicial a 94oC por 3 minutos

Desnaturação a 94oC por 50 segundos

Hibridização dos primers a 55oC por 50 segundos

Extensão a 72oC por 50 segundo


Extensão final a 72oC por 5 minutos.

3.8 DETECÇÃO DO PRODUTO AMPLIFICADO

Os produtos amplificados pela PCR mais o marcador de peso molecular com

fragmentos múltiplos de 100 pares de bases (GeneRulerTM 100 pb DNA Ladder), foram

analisados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, em cuba horizontal, imersos em

tampão TBE (Tris-Borato 0,045M; EDTA 1mM). Em cada orifício do gel foram

depositados 10µL de cada amostra misturado a 2µL de corante de amostra (30% de

glicerol; 0,25% de azul de bromofenol).

56

Para a detecção de fragmentos obtidos após restrição enzimática utilizou-se o marcador

de peso molecular com fragmentos múltiplos de 50 pb (GeneRulerTM 50bp DNA Ladder),

analisados em gel de agarose a 2,5%. Nesse caso, em cada orifício do gel foram

depositados cerca de 30µL das amostras misturado a 2µL de corante de amostra.

Após a corrida eletroforética, o gel foi corado em solução de brometo de etídeo

(0,5µg/mL) por 15 a 20 minutos e a visualização das bandas foi realizada através de

transiluminação com luz ultravioleta.

A foto-documentação dos géis com os fragmentos amplificados foi realizada pelas

câmaras Polaroid Fotodyne Incorporated ou Image Master GE Healthcare.

3.9 PESQUISA DE SÍTIOS DE RESTRIÇÃO

Após o seqüenciamento dos fragmentos de gene HSP70 das amostras utilizadas neste

estudo, foi possível desenhar os primers HSP70-F

caracterização de protozoários pertencentes à sub-família ......alexandre (fininho). À...

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