caracterização da comunidade bacteriana do solo da mata...
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
VÂNIA APARECIDA GONÇALVES
Caracterização da comunidade bacteriana do solo da Mata
Atlântica produtora de substâncias de interesse
biotecnológico
Mogi das Cruzes, SP
2006
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
VÂNIA APARECIDA GONÇALVES
Caracterização da comunidade bacteriana do solo da Mata
Atlântica produtora de substâncias de interesse
biotecnológico
Dissertação apresentada à Universidade
de Mogi das Cruzes para obtenção do
Título de Mestre em Biotecnologia. Área
de concentração: Ciências Biológicas
Orientador: Prof. Dr. Welington Luiz Araújo
Mogi das Cruzes, SP
2006
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, por possibilitar finalizar mais essa etapa de minha vida;
À minha mãe (em memória) que me ensinou a importância do estudo;
A SEESP, pela bolsa e apoio financeiro para o desenvolvimento da pesquisa;
À Universidade de Mogi das Cruzes pela oportunidade;
Professor Doutor João Lúcio de Azevedo pelo apoio, carinho com que me recebeu;
Ao Professor Welington Luiz Araújo pela orientação e por sua contribuição na
transmissão de conhecimento;
À minha família, pela paciência e carinho, em especial minha filha Indiane pelo apoio
durante esses dois anos;
Ao NIB/UMC principalmente aos Professores, José L. C. Wolff, Elisa Espósito e
Alexandre Wagner Silva Hilsdorf por disponibilizar o laboratório, para o
desenvolvimento de parte deste projeto;
À Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo por
disponibilizar o laboratório, e pelo carinho com que me receberam;
Aos amigos do Laboratório de Genética de Microrganismo Prof. João Lúcio de
Azevedo do Departamento de Genética da ESALQ-USP, José Antônio, Maria
Carolina, Joelma Marcon e principalmente ao Fernando Dini Andreote, pelo
auxílio nos momentos de necessidade;
A Prefeitura de Mogi das Cruzes por ter autorizado as coletas no Parque Natural da
Serra do Itapety;
5
A Adriana de Oliveira Andrade e Claudia Machado, pelo apoio e pela ajuda nas
coletas;
A Maria Cecília Brandt, pela amizade e ajuda em todas as horas que precisei;
A secretária Neilce Ribeiro Prado, por estar sempre disposta a ajudar;
Ao engenheiro do DAEE, José Carlos Miya, pelos dados pluviométricos;
Ao pessoal do NIB, CIIB, pela ajuda e companheirismo e a todos os colegas do
curso de pós-graduação de Biotecnologia.
6
Agradecimento especial
Ao meu orientador, Professor Doutor Welington Luiz de Araújo
A quem admiro pela competência profissional e
com quem muito aprendi nesses dois anos de orientação.
Agradeço pela amizade e
pela oportunidade de crescimento pessoal e profissional.
7
“Aprender é a única coisa que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se
arrepende”
(Leonardo da Vinci)
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RESUMO
A diversidade genética e metabólica dos microrganismos tem sido explorada há muitos anos visando à obtenção de produtos biotecnológicos, porém poucos trabalhos foram realizados para o conhecimento da biodiversidade microbiana do solo da Mata Atlântica. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo isolar e identificar bactérias do solo da Mata Atlântica e avaliar a capacidade destas bactérias em produzir substâncias de interesse biotecnológico, como enzimas (amilases e pectinases) e compostos antagônicos aos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e Alternaria alternata, bem como bactérias solubilizadoras de fosfato. A área de estudo está localizada Serra do Itapety (Mogi das Cruzes, SP). Foram coletadas amostras em 4 pontos, durante três épocas do ano. Os resultados obtidos das três coletas demonstram que a comunidade bacteriana cultivada é formada por Arthrobacter nicotinovorans, Bacillus circulans, B. mycoides, B. niacini, Burkholderia cepacia, Cupriavidus basilensis, Dyella koreensis, Enterobacter sp., Flexibacter sp., Microbacterium oleivorans, M. imperiale, Micrococcus luteus, Naxibacter alkalitolerans, Nocardia inohanensis, N. niigatensis, Oxalobacter sp., Beta e gama Proteobacterium, Pseudoxanthomonas sp., Streptomyces morabilis , S. purpureus, S. thermocoerulescens, Variovorax ginsengisoli. Foi observado também que a densidade bacteriana se manteve estável, indicando que existe uma homogeneidade nas áreas amostradas. Por meio da análise genética pelo ARDRA foram observados 19 haplótipos, os quais apresentaram diferença na freqüência de isolamento nas três épocas amostradas, sugerindo uma variação sazonal nas espécies e conseqüentemente de seu papel no ecossistema. Neste contexto, foi verificado que a freqüência de isolados produtores da enzima amilase foi diferente nas épocas amostradas. Em relação à freqüência de bactérias capazes de inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos, foi observado que um aumento na segunda e terceira coleta e embora, bactérias antagonistas a A. alternata foram observadas nas três coletas, somente na última coleta foi observado que 2% dos isolados inibiram o fungo F. oxysporum. Os resultados apresentados no presente trabalho permitem uma primeira prospecção da diversidade bacteriana do solo da Serra do Itapety. Palavra-chave: bactéria, serrapilheira, enzimas, antagonismo, fosfato
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ABSTRACT
The genetic and metabolic microbial diversity have been exploited for a long time trying to find biotechnological products. However, few studies have been carried out to understand the microbial diversity in Brazilian Atlantic Forest. Therefore, the aims of this work were to isolate and identify soil bacteria from a Atlantic Forest and evaluate the ability of these bacteria to produce biotechnological compounds, such as enzymes (amilases and pectinases) and antagonism against phytopatogenic fungi Fusarium oxysporum and Alternaria alternata, as well as bacteria able to solubilize phosphate. Soil from four sites in Itapety Park (Mogi das Cruzes, SP) was sampled three times. The results showed that the density of culturable bacterial community was stable along the sampling time and the species include Arthrobacter nicotinovorans, Bacillus circulans, B. mycoides, B. niacini, Burkholderia cepacia, Cupriavidus basilensis, Dyella koreensis, Enterobacter sp., Flexibacter sp., Microbacterium oleivorans, M. imperiale, Micrococcus luteus, Naxibacter alkalitolerans, Nocardia inohanensis, N. Niigatensis, Oxalobacter sp., Pseudoxanthomonas sp., Streptomyces morabilis, S. purpureus, S. thermocoerulescens, Variovorax ginsengisoli. The analysis by ARDRA technique showed at least 19 haplotypes, which had different frequency between sampling times, suggesting a season variation and consequently in the role of these community in the environment. Also, it was observed that the frequency of able to produce amilases shifted during the sampling times. Similar result was observed for antagonist bacteria against the phytopathogenic fungi, since that the frequency of these antagonistic bacteria were higher in second and third samples and although bacteria able to inhibit A. alternata had been observed in all samples, only in the third sampling it was observed isolates able to inhibit F. oxysporum. These results allow a first characterization of the bacterial diversity of Itapety Park soil. Key words: bacteria, leaf liter, enzymes, antagonisms, phosphate.
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Isolados bacterianos com seus respectivos haplótipos, e
identificação de suas espécies e sua função fisiológica ......................41
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LISTA DE ILUSTRAÇÃO
Figura 1. Densidade bacteriana dos 4 locais amostrados do solo da Serra
do Itapety (Mogi das Cruzes, SP). As coletas foram realizadas
em 4 locais e com pelo menos 4 repetições. Barras indicam o
desvio padrão da média .........................................................................37
Figura 2. Densidade bacteriana em 3 épocas de amostragem: época
1(11/2004), época 2 (03/2005), época 3 (08/2005); de solo da
Serra do Itapety (Mogi das Cruzes, SP). Barras indicam o
desvio padrão da média .........................................................................38
Figura 3. Freqüência dos resultados referente à densidade bacteriana,
Época x Local. Época 1 (11/2004), época 2 (03/2005), época 3
(08/2005); do solo da Serra do Itapety (Mogi das Cruzes, SP).
As coletas foram realizadas em 4 locais e com pelo menos 4
repetições. Barras indicam o desvio padrão da média..............................39
Figura 4. Freqüência dos haplótipos na comunidade bacteriana do solo da
Serra do Itapety. Foram realizadas 3 coletas. Os haplótipos
foram obtidos pela técnica de ARDRA com a enzima de
restrição HhaI.................................................................................................. .39
Figura 5. Freqüência dos haplótipos na comunidade bacteriana do solo da
Serra do Itapety em e épocas de amostragem. Coleta 1
(11/2004), Coleta 2 (03/2005) e Coleta 3 (08/2005). Os
haplótipos forma obtidos pela técnica de ARDRA com a enzima
de restrição HhaI. ...........................................................................................40
Figura 6. Dendrograma mostrando a relação filogenética dos isolados
bacterianos obtidos do solo da Serra do Itapety. A árvore foi
construída pelo método do vizinho mais próximo utilizando o
coeficiente de Jukes-Kantor..........................................................................42
12
Figura 7. Foto mostrando o crescimento de bactérias do solo da Serra do
Itapety sobre o meio para detecção de produtores de amilase
(A) e solubilizadores de fosfato (B). A. Seta indica o halo que
caracteriza a produção de amilases pelo isolado L4-6, uma Beta
proteobacterium não identificada. B. Crescimento bacteriano em
meio de cultura suplementado com fosfato insolúvel. Setas
indicam o halo produzido por colônias de bactérias
solubilizadoras de fosfato inorgânico. Isolados a-L2-1 (Nocardia
niigatensis), b-L4-20 (Pseudoxanthomonas sp), c-L2-8
(Burkholderia cepacia), d-L2-2 (Bacillus niacini).....................................44
Figura 8. Frequência de bactérias solubilizadoras de fosfato, produtora de
enzimas amilases e pectinases na comunidade bacteriana do
solo da Serra do Itapety. Coleta 1 (11/2004), Coleta 2 (03/2005)
e Coleta 3 (08/2005) ...............................................................................45 Figura 9. Produção de pectinases por bactérias do solo da Serra do
Itapety. A seta indica halo de degradação da pectina por
pectinases produzidas pelos isolados: A. L1-3 (sem
identificação) B. L4-28 (Bacillus niacini) ...................................................46
Figura 10. Inibição do fungo Alternaria alternata por bactéria do solo da
Serra do Itapety. Isolados: A. L3-25 (Nocardia inohanensis) B. L4-18 (Streptomyces purpureus), C. L2-13 (não identificado), D. L4-7(Bacillus mycoides)..........................................................................48
Figura 11. Inibição do fungo Fusarium oxysporum por bactéria do solo da
Serra do Itapety A. Crescimento do fungo fitopatôgenico F.
oxysporum sem bactéria (controle). B. Técnica de pareamento
com colônia de bactérias, observa-se o crescimento do
patógeno sobre as colônias bacterianas. C. Fungo patogênico
F. oxysporum sendo inibido por uma colônia de bactéria,
representada pelo isolado L4-7(Bacillus mycoides). D. Halo
formado pela colônia de bactéria, representado pelo isolado L3-
10 (Streptomyces purpureus) .................................................................49
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
ARDRA Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado BDA Batata-dextrose-ágar CaPO4 Fosfato de cálcio
CIIB Centro Investigação Interdisciplinar Bioquímica
DAEE Departamento de água energia elétrica
DGGE Gel de Eletroforese em gradiente desnaturação DNA Ácido desoxirribunucléico
dNTP Nucleotídeo Trifosfatado
EDTA Ácido etileno de aminotetracético (Ethylenediaminetetracetic acid)
FISH Hibridização fluorescente in situ
MgCl4 Cloreto de magnésio
MgSO 4 Sulfato de magnésio
NaCl₂ Cloreto de sódio
NH4Cl Cloreto de amônia
NIB Núcleo Integrado de Biotecnologia
PBS Tampão fosfato com sal (Phosphate Buffer salt)
PCR Reação em cadeia da DNA polimerase rDNA DNA ribossomal RPM Rotação por minuto
SEESP Secretaria Educação Estado São Paulo
TE Tampão Tris -EDTA T-RFLP Polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição Tris-HCl Hidroximetil aminometano (Hydroxymethyl aminomethane) Ácido
Clorídrico
TSB Caldo de triptona de soja (Tryptone Soya broth)
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SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................16
2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................17
2.1 Solo...................................................................................................................17
2.1.1 Diversidade Microbiana do solo..................................................................18
2.1.2 Técnicas de analise molecular no estudo de microrganismos do solo.......21
2.2 Controle Biológico.............................................................................................24
2.2.1 Aspectos Gerais..........................................................................................24
2.2.2 Promoção de crescimento vegetal por microrganismos..............................25
2.3 Enzimas de interesse Biotecnológico................................................................27
3 OBJETIVO...............................................................................................................30
3.1 Objetivo geral....................................................................................................30
3.2 Objetivo específico............................................................................................30
4 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................31
4.1 Área de estudo..................................................................................................31
4.2 Isolamento de bactérias....................................................................................31
4.3 Purificação das colônias bacterianas................................................................31
4.4 Analises da diversidade Fisiológica...................................................................32
4.4.1 Bactérias produtoras de agentes antimicrobianos......................................32
4.4.2 Bactérias solubilizadoras de fosfato............................................................32
4.4.3 Bactérias produtoras de enzimas...............................................................32
4.4.3.1 Bactérias produtoras de amilases........................................................32
4.4.3.2 Bactérias produtoras de pectinases.....................................................33
4.5 Caracterização molecular das bactérias...........................................................33
4.5.1 Extração de DNA total de bactérias............................................................33
4.5.2 Amplificação do 16s rDNA..........................................................................34
4.5.3 Clivagem do 16S rDNA (ARDRA)...............................................................34
4.5.4 Construção de árvores filogenéticas...........................................................35
4.5.5 Análise estatística........................................................................................35
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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................36
5.1 Diversidade e densidade microbiana................................................................36
5.2 Diversidade fisiológica de bactérias do solo......................................................43
5.3 Bactérias produtoras de agentes antimicrobianos............................................46
6 CONCLUSÕES.......................................................................................................50
REFERÊNCIAS..........................................................................................................51
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1 INTRODUÇÃO
A diversidade de microrganismos na natureza é tão vasta quanto
desconhecida, visto que se estima que mais de 80% das plantas e 90% dos
vertebrados existentes já foram descritos, enquanto que conhecemos menos 1% das
bactérias. Entretanto, o número de espécies de bactérias descrita na literatura vem
crescendo nos últimos anos em virtude do desenvolvimento de ferramentas da
biologia molecular, as quais possibilitam a análise de seqüência de DNA a partir de
material genômico extraído diretamente do solo. As novas técnicas evidenciaram a
enorme diversidade genética de bactérias presente em apenas 1 grama de solo,
pois se estima que nesta amostra de solo podem estar presentes entre 10 a 30 mil
espécies, considerando que atualmente foram descritas aproximadamente 4.200
espécies, cuja maioria não é de solos.
Dessa forma, existe uma grande lacuna de conhecimento a ser preenchida
em estudos de biodiversidade do solo, principalmente originada de regiões tropicais
como a Mata Atlântica. Além disso, muitos grupos de microrganismos são essenciais
para um melhor desenvolvimento de plantas no solo, desempenhando inúmeras
funções nos ciclos biogeoquímicos e na manutenção do equilíbrio microbiano no
solo e em associação com plantas. Neste contexto, o estudo da diversidade
microbiana do solo é de grande importância, visto que poderia ser uma fonte de
recursos genéticos para a exploração sustentável de florestas a serem preservadas,
além de permitir o desenvolvimento de produtos de interesse industrial,
farmacêuticos e agropecuários, bem como microrganismos capazes de controlar
pragas e doenças de interesse agrícola.
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2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Solo
O solo é a camada mais superficial da crosta terrestre, que vem se formando
há milhões de anos, é um ambiente heterogêneo, composto por várias fases:
sólida, líquida e gasosa (SMILES, 1988). A fase sólida é formada por substâncias
inorgânicas (areia, silte e argila) e materiais orgânicos (ácidos húmicos, celulose,
amido, pectina, lipídeos, etc.). A fase líquida, é onde se encontram em suspensão
elementos químicos e moléculas solúveis, enquanto que a fase gasosa,
representada pelos gases que circulam entre as partículas do solo, é originária de
processos bioquímicos, como a respiração. O solo apresenta também domínios
funcionais, tais como a rizosfera, parte do solo influenciado pelas raízes das plantas;
as rachaduras, ambiente influenciado por condições edafoclimáticas; a drilosfera,
ambiente influenciado por minhocas, etc. Cada um desses domínios são formados
por ações de reguladores: plantas, fauna do solo, condições edafoclimáticas, entre
outras, e dentro deles há uma série de atividades que envolvem os macro e
microrganismos responsáveis por inúmeros processos biológicos, que podem ser
particulares ou não a cada domínio, e pela estruturação do solo (LAVELLE, 2000).
A atividade metabólica do solo é fortemente influenciada pela presença de
raízes e materiais orgânicos em decomposição. Nas florestas tropicais ocorre forte
interação entre a vegetação e o solo por meio da ciclagem de nutrientes, visto que o
acúmulo de serrapilheira exerce importante função, por ser a mais significativa forma
de transferência de nutrientes (GOLLEY et al., 1978), sendo que as transformações
neste compartimento do ciclo biogeoquímico são as que mais afetam o fluxo de
energia dentro do sistema, do ponto de vista holístico (PRITCHETT, 1979). Através
da decomposição da serrapilheira ocorre a entrada e saída de nutrientes ao
ecossistema. Este processo ajuda na restauração da fertilidade do solo
principalmente em áreas de início de sucessão ecológica (EWEL, 1976). Os padrões
de deposição de serrapilheira introduzem heterogeneidade no ambiente, podendo
afetar a estrutura e dinâmica da comunidade de plantas (FACELLI e PICKETT, 1991;
MOLOFSKY e AUGSPURGER, 1992) e portanto a comunidade microbiana
18
associada. O solo sofre alterações físicas provocadas pela liberação de nutrientes e
de compostos fitotóxicos, que podem alterar a atividade de microrganismos
decompositores (FACELLI e PICKETT 1991; MOORHEAD et al., 1998). A
quantidade de serrapilheira depositada no solo pode influenciar sobre fatores como
luz, temperatura, umidade do solo e a disponibilidade de nutrientes, podendo
favorecer o desenvolvimento de comunidades bacterianas.
Observa-se uma intensa atividade microbiana na rizosfera, em razão da
presença de exsudados e secreções radiculares que representam as maiores fontes
de carbono prontamente disponíveis para os microrganismos (GRAYSTON e
JONES, 1996). Fora da zona de influência das raízes, o solo pode ser considerado
relativamente pobre em fonte de carbono disponível (ROSADO, 2000).
A biodiversidade de solos tem um papel fundamental na regulação dos
processos biogeoquímicos formadores e mantenedores dos ecossistemas. Dentre
estes, incluem-se: a formação e estruturação de solos; a decomposição da matéria
orgânica; a ciclagem de nutrientes; e a formação dos gases componentes da
atmosfera terrestre. É nos solos que se realiza a maior parte da ciclagem de
nutrientes da qual a maior parte dos seres vivos dependem para se manter vivo. Por
tudo isso, o solo é um recurso natural que deve ser conservado para que a sua
qualidade seja mantida, permitindo a manutenção de diferentes comunidades
microbianas que habitam, permitindo que estes microrganismos sejam uma
importante fonte de recursos genéticos para a busca de novos genes de interesse
biotecnológico.
2.1.1 Diversidade Microbiana do Solo
O solo é a principal reserva de carbono orgânico da terra e portanto é um
importante habitat para microrganismos, que são componentes essenciais da biota
terrestre. Os microrganismos catalisam transformações únicas e indispensáveis nos
ciclos biogeoquímicos da biosfera, produzem importantes componentes da
atmosfera terrestre e representam a principal porção da diversidade genética viva
19
(TORSVIK et al., 2002). Assim, todas as abordagens suportam a afirmação de que o
solo representa um dos mais diversos habitats para os microrganismos.
No solo pode ser encontrada uma alta proporção de bactérias Gram-positivas,
quando comparados ao ambiente aquáticos, além disso, deve ser levado em conta
que existe relativas proporções de gêneros bacterianos dentro de cada hábitat
(ATLAS e BARTHA, 1998 citados por SILVEIRA, 2004). São encontrados no solo,
por meio de técnicas tradicionais de isolamento, principalmente os gêneros de
bactérias: Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Artrobacter, Bacillus,
Brevibacterium, Caulobacter, Cellulomonas, Clostridium, Corynebacterium,
Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus,
Streptococcus e Xanthomonas (ATLAS E BARTHA, 1998 citado por SILVEIRA,
2004). Segundo estimativas realizadas por Lewinsohn et al. (2002) existe
aproximadamente 4.200 espécies de bactérias descritas. Entretanto, poucos
trabalhos foram realizados com comunidades bacterianas do solo da Mata Atlântica,
dificultando dessa forma o conhecimento da biodiversidade microbiana desse bioma.
Um filo bastante comum no solo é o Acidobacteria (KENT e TRIPLETT, 2002),
porém, segundo Holmes et al., (2000) esse grupo contém poucas seqüências
cadastradas no GenBank. Por outro lado o Filo Proteobacteria apresenta uma
grande diversidade morfológica e fisiológica, e apresentam coloração Gram-negativa
e 5 subdivisões: alfa, beta, gama, delta e epsilon (CANHOS et al., 1997). Outro
grupo importante no solo são as actinobactérias, os quais representam de 10 a 33%
das bactérias existentes no solo. Este grupo é constituído por microrganismos
bastante resistentes, conseguindo sobreviver em ambientes como desertos, embora
sejam bastante sensíveis a ambientes ácidos, desenvolvendo melhor em ambientes
neutros ou alcalinos (HOLMES et al., 2000). A maioria das actinobactérias tem como
característica a produção de odor de mofo, são responsáveis pela degradação de
substâncias muito complexas, são produtores de antibióticos e podem auxiliar na
fixação de nitrogênio sendo um grupo de grande importância para o melhoramento
do solo (TAMAYO e VILLAMIL, 2003; CANHOS et al., 1997). Segundo Pereira
(2003) a população de actinobactérias que vive em solos de florestas tende ser
levemente maior que em solos cultivados.
Por meio da análise de amostras de solo é possível determinar que a
diversidade bacteriana é composta de espécies já conhecidas e grupos novos. Em
análise por metagenômica de solo agrícola foi observado que 98,4% das seqüências
20
de 16S rDNA identificadas pertencem ao domínio Bactéria, destes 16,1% são
Proteobacterias, 2,18% Cytophaga/Flexibacter/Bacteroides, 21,8% bactérias Gram+
com baixa porcentagem de G+C, enquanto 39,4% estão distribuídas em grupos
desconhecidos dentro do domínio Bacteria (BORNEMAN et al., 1996). Em outro tipo
de solo agrícola foi observada uma baixa proporção de Firmicutes e α-
Proteobacterias em comparação com as subdivisões β, γ-Proteobacteria. Além
disso, foi observada a presença de seqüências relacionadas com subdivisões que
necessitam de representantes cultiváveis e não foram observadas seqüências
associadas ao Domínio Archaea (LILES et al., 2003). Estes trabalhos mostram a
necessidade de se avaliar a diversidade microbiana para o conhecimento do seu
potencial biotecnológico, além disso, regiões onde esta biodiversidade não tem sido
exaustivamente avaliada, muitas espécies cultiváveis ou não podem ainda
permanecer desconhecidas.
Existem fatores que podem influenciar a diversidade microbiana no solo, e por
esse motivo se faz necessário avaliar este impacto do ambiente sobre a composição
da diversidade bacteriana, visto que tem sido observado que o tamanho de partícula
do solo tem maior impacto sobre a diversidade bacteriana que o pH e o tipo e a
quantidade de compostos orgânicos (SESSITSCH et al., 2001). Os autores
observaram por meio da análise de T-RFLP do 16S rDNA e de análise de
metagenômica do solo apresentando partículas pequenas, foi observada uma
grande diversidade de bactérias da divisão Halophaga/Acidobacterium e
Prosthecobacter, porém em solos com partículas maiores (areia) foi observada uma
baixa diversidade de bactérias da divisão Halophaga/ Acidobacterium,
predominando a subdivisão γ-Proteobacteria. O conhecimento desta diversidade
pode favorecer a busca por novas fontes de moléculas de interesse biotecnológico.
Neste contexto, o solo em particular tem sido largamente estudado para a
procura de genes ou como fonte para importantes atividades enzimáticas,
biocatalizadores industriais e novos antibióticos (NELSON, 2003). A análise de
metagenômica do solo pode permitir encontrar novos antibióticos, pois tem sido
descrito que existe uma grande diversidade de antibióticos produzidos somente por
um gênero, no caso diferentes estirpes de Pseudomonas. Compostos como
fenazinas, pioluteorinas, pirronitrinas, tropolonas, piocianinas e 2,4
diacetilfloroglucinol têm sido isolados de Pseudomonas spp. do solo, permitindo
21
descobrir vias catabólicas para compostos aromáticos e para síntese de outros
metabólitos secundários (NELSON, 2003).
Estudos feitos nos últimos 15 anos têm mostrado que a verdadeira extensão
da diversidade microbiana excede em muito os cálculos prévios e que a maioria dos
microrganismos não é amostrada pelo cultivo utilizando as atuais técnicas existentes
(RONDON, et al., 1999). Estimativas atuais indicam que menos de 1% da
comunidade microbiana é realmente cultivável com as técnicas de cultivo
conhecidas (AMANN et al., 1995) e somente quatro das 36 principais divisões do
domínio Eubactéria parecem estar corretamente representados em coleções ex situ.
Como os microrganismos cultiváveis do solo têm sido a principal fonte de produção
de produtos naturais e têm sido exaustivamente examinados na busca por
compostos com atividade biológica, isto levou a idéia de que microrganismos do solo
podem ser examinados para novos produtos (RONDON et al., 1999), mostrando
dessa forma, a necessidade de explorar diferentes tipos de solo e em diferentes
condições, permitindo avaliar toda a diversidade cultivável antes de se utilizar
técnicas independente de cultivo que em muitos casos não permite o isolamento e
estudo do microrganismo isolado.
Neste contexto, tendo em vista que grande extensão da diversidade
microbiana na natureza é ainda desconhecida, é possível que produtos de potencial
interesse biotecnológico permaneçam ainda sem identificação nos microrganismos
do solo ainda não conhecidos, necessitando dessa forma, o isolamento desta
comunidade de áreas não amostradas, bem como a sua avaliação também por
métodos moleculares.
2.1.2 Técnicas moleculares para o estudo de microrganismo do solo
Várias metodologias são propostas para estudos da interação microbiana no
solo. A diversidade biológica é geralmente utilizada como índice que reflete a
qualidade do ecossistema, de modo que as metodologias que possibilitam o estudo
da diversidade microbiana também podem indicar diferenças entre solos tanto com
respeito as suas populações quanto a sua função (TURCO et al., 1994). Por isso, ao
22
acessar a diversidade microbiana, importantes considerações devem ser feitas, não
apenas no que se refere ao número e distribuição das espécies, mas também
quanto a sua diversidade funcional (YIN et al., 2000). Tradicionalmente, a detecção
e a identificação de bactérias é feita de acordo com os principais meios de obtenção
de carbono e energia, suas exigências nutricionais e meio de cultivo para seu
crescimento, além da observação direta via microscópio (KENNEDY, 1999;
HERBERT, 1990). No entanto, a utilização dessas metodologias fornece
informações limitadas com necessidade de maior refinamento (ZAK et al., 1994).
As limitações às técnicas tradicionais de detecção e de identificação de
microrganismos são ainda maiores quando se quer estudar a diversidade de
microrganismos em ambientes específicos. Sabe-se que a diversidade das bactérias
é maior que a de qualquer outro grupo de organismos, no entanto, os meios de
cultivo são, em maior ou menor extensão, seletivos a grupos particulares. Até
mesmo quando se quer utilizar um meio seletivo para determinado organismo-alvo,
algumas estirpes não cultiváves, provavelmente, serão excluídas das análises
(COUTINHO et al.,1999). Como alternativas para esses métodos, foram
desenvolvidas várias técnicas, dentre as quais destacam-se aquelas baseadas nos
ácidos nucléicos. Neste contexto, o emprego de técnicas moleculares se tornou
possível a partir dos estudos de Pace et al. (1986), pioneiros nas análises de
estrutura de comunidades microbianas utilizando as informações da seqüência de
nucleotídeos do gene da subunidade 16S do RNA ribossômico (16S rDNA). Além da
alta conservação deste gene entre as espécies, existem outras razões para a larga
utilização do 16S rDNA (AMANN e LUDWIG, 2000): a) a grande quantidade de rRNA
na maioria das células; b) a aparente ausência de transferência genética lateral e c)
um tamanho satisfatório (aproximadamente de 1500 nucleotídeos), permitindo
inferências filogenéticas.
Os métodos moleculares receberam grande impulso com o desenvolvimento
da técnica da PCR. Essa técnica permite amplificar pequenos e específicos
segmentos do genoma, permitindo a obtenção, in vitro, de várias cópias de
determinada região do DNA. Como a reação de PCR é específica, pode-se obter a
amplificação de seqüências de nucleotídeos-alvo mesmo em uma amostra com
grande diversidade de seqüências, permitindo a detecção de organismos específicos
em mistura heterogêneas. Seqüências do DNA de determinados microrganismos
podem ser amplificadas, utilizando-se primers (seqüências iniciadoras)
23
complementares àquelas localizadas em pontos específicos do genoma. O que
ocorre é a extensão do fragmento de DNA a partir dos primers, pela ação de uma
DNA polimerase termoestável, a Taq DNA polimerase (isolada originalmente do
microrganismo Thermus aquaticus). Antes da extensão, o DNA é desnaturado e o
primer anelado, sendo o ciclo (desnaturação - anelamento - extensão) repetido
várias vezes, permitindo a amplificação exponencial da seqüência específica
franqueada pelos primers (SAIKI et al.,1985). As primeiras aplicações de técnicas
baseadas em ácidos nucléicos no estudo de interações microbianas foram para
explicar as relações filogenéticas entre microrganismos por meio da análise da
seqüência do 16S rDNA (MACRAE, 2000).
Atualmente, outras técnicas vêm sendo desenvolvidas, com base na
utilização desses marcadores (ARDRA, FISH, DGGE/TGGE), fazendo com que
sejam as ferramentas moleculares mais utilizadas para a exploração da diversidade
e da análise da estrutura de comunidades microbianas (KOZDROJ e ELSAS, 2000).
A ARDRA, é semelhante ao PCR-RFLP, pois é baseada no grau de conservação
dos sítios de restrição do rDNA, a qual reflete padrões filogenéticos. A ARDRA é
bastante útil para uma rápida análise da diversidade de um ambiente (GRIFONI et
al., 1995). No entanto, recomenda-se cuidado na escolha do fragmento de rDNA a
ser amplificado e analisado por esse método. No caso da análise de diversidade
intra-específica ou entre grupos de isolados com elevada afinidade filogenética, o
fragmento amplificado deve incluir o espaço intergênico 16S-23S rDNA. Essa região
intergênica apresenta maior variabilidade tanto na sua composição de bases quanto
no seu tamanho quando comparadas com a 16S ou 23S rDNAs. Quando a análise
tratar da diversidade entre isolados distantes, filogeneticamente, os fragmentos
amplificados podem ser o 16S ou 23S rDNAs. Esses genes geram padrões de
bandeamento mais simples, dependendo das enzimas de restrição utilizadas
(ROSADO et al., 1999). Laguerre et al. (1996) realizaram, com a utilização da
ARDRA (16S-23S rDNA), a caracterização de 43 estirpes de Rhizobium
leguminosarum de diferentes biovares.
24
2.2 Controle Biológico
2.2.1 Aspectos Gerais
Embora os pesticidas químicos sejam usados com relativo sucesso na
agricultura, podem resultar em problemas de contaminação de águas superficiais e
subterrâneas, resíduos em alimentos, aumento da resistência em populações de
patógenos e pragas e seus efeitos sobre organismos não-alvo (incluindo os
benéficos), mostram a necessidade de se avaliar outras estratégias de controle de
patógenos (KUNOH, 2002). O controle biológico é uma alternativa, principalmente
quando empregado em conjunto com outros métodos, pois apresentam um menor
custo e agressividade ao ecossistema quando comparado ao tratamento químico
(AZEVEDO et al., 2000).
O controle biológico pode ser considerado como a redução da densidade do
inóculo ou da capacidade de um patógeno ou parasita em causar doença. Esta
redução poderá ser causada por um ou mais organismos favorecidos naturalmente,
pela manipulação de seu habitat ou ambiente, pela manipulação do hospedeiro ou
antagonista, ou ainda pela introdução em massa de um ou mais antagonista
(BAKER e COOK, 1974). Neste contexto várias pesquisas com bacteriófagos (WALL
e SANCHEZ, 1993), isolados não patogênicos de Pseudomonas solanacearum
(TRIBALET et al., 1994), Pseudomonas fluorescens (KEMPE e SIQUEIRA, 1983),
Bacillus spp. (SHEKHAWAT et al., 1994) e actinomicetos (GAO et al., 1983;
KUNOH, 2002) têm sido desenvolvidas com sucesso.
Para avaliar microrganismos com potencial para o controle biológico de
patógenos de plantas é necessário o seu isolamento a partir do ambiente. El-
Tarabily et al. (2000) isolaram bactérias e actinomicetos da rizosfera de alface, e de
um total de 85 bactérias e 129 actinomicetos foram observados três isolados,
Serratia marcescens, Streptomyces viridodiasticus e Micromonospora carbonacea
que reduziram significativamente in vitro e em casa de vegetação o desenvolvimento
do fungo Sclerotinia minor, mostrando o seu potencial para o controle biológico.
A busca de novas linhagens para o controle biológico pode resultar no
conhecimento de novas espécies de microrganismos, visto que novos nichos são
25
avaliados. Neste contexto, Gomes et al. (2000), isolaram do solo do cerrado
brasileiro, cinco linhagens de Streptomyces sp. com atividade antagonista in vitro a
Aspergillus parasiticus, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium sp., F.
graminearum, F. oxysporum e F. solani. Segundo os autores estes isolados podem
ser novas espécies dentro do gênero Streptomyces, visto que habitam um ambiente
muito peculiar e com uma vegetação única. Dessa forma, tendo em vista que o
ambiente onde se cultiva pode ser a fonte de novas linhagens a serem utilizadas no
controle biológico, deve ser mantida uma preocupação especial aos tratos culturais
ou técnicas que podem reduzir a biodiversidade microbiana.
2.2.2 Promoção de crescimento vegetal por microrganismos
Bactérias do solo podem beneficiar a planta hospedeira, aumentando seu
crescimento, controlando patógenos ou melhorando seu desempenho em condições
adversas. Bactérias promotoras de crescimento vegetal constituem um grupo
complexo, normalmente associado a rizosfera do hospedeiro. Estudos recentes têm
mostrado que bactérias também podem aumentar o crescimento vegetal de diversas
culturas de interesse, entre elas batata (FROMMEL et al., 1991; STURZ, 1995),
milho (HINTON e BACON, 1995), pepino (RAUPACH e KLOEPPER, 1998), arroz
(HUREK et al., 1994; PRAYITNO et al., 1999) e melancia (LIU et al., 1995).
Sharma e Nowark (1998) sugerem que a promoção de crescimento é um
evento que precede a indução de resistência e pode ser dependente da colonização
e posterior sensibilização do hospedeiro, pois foi verificado que as bactérias
promotoras de crescimento B. polymyxa e P. fluorescens, após 5 meses de
inoculação na semente, colonizaram as raízes, células corticais e tecidos vasculares
do caule de um híbrido de pinheiro (Picea glauca X P. engelmannii) (SHISHIDO et
al., 1999). A capacidade de estimular o crescimento das plantas pode ocorrer por
mecanismos diretos (fixação de nitrogênio ou produção de fitohormônios) e por
mecanismos indiretos (exercendo antagonismo contra patógenos ou resistência a
drogas) (DI-FIORE e DEL-GALLO, 1995; CHANWAY, 1998). Neste aspecto,
bactérias podem promover o crescimento da planta pelo aumento dos níveis de
ácido indol acético (AIA) e citocininas, e pela redução dos níveis de etileno na planta
26
(BUCHENAUER, 1998). Inúmeros estudos têm mostrado que as bactérias
Gluconoacetobacter diazotrophicus e Herbaspirillum seropedicae (BASTIAN et al.,
1998), Azospirillum braziliense (BASHAN e HOLGUIN, 1997), Azorhizobium
caulinodans (CHRISTIANSEN-WENIGER, 1996), B. polymyxa (SRINIVASAN et al.,
1996) e Methylobacterium spp. (HOLLAND e POLLACO, 1994) são capazes de
sintetizar compostos análogos aos fitohormônios, bem como fixar nitrogênio,
aumentando dessa forma o crescimento da planta.
Entre os elementos essenciais para crescimento das plantas, encontrados no
solo, o fósforo (P), logo após o nitrogênio (N), ocupa posição de destaque em
relação aos seres vivos, tendo em vista sua atuação estrutural, funcional, e na
transferência de energia (NAHAS, 1991). Neste contexto, apesar de ser abundante
tanto na forma orgânica quanto na inorgânica, muitos solos são considerados
deficientes em P devido a sua baixa concentração na forma livre (forma disponível
para as plantas), pois mesmo em solos férteis, geralmente esta concentração não é
maior que 10 µM em pH 6,5, onde o P é mais solúvel (RODRIGUÉZ e FRAGA,
1999). O baixo nível de P é devido à alta reatividade do P solúvel com Cálcio (Ca),
ferro (Fe) ou alumínio (Al) resultando na precipitação do P. A Imobilização e
precipitação do P no solo é geralmente muito dependente do pH e tipo de solo. O P
inorgânico em solos ácidos associa-se a compostos de Al e Fe (LINDSAY, 1979). O
P orgânico também pode compor uma grande fração do P solúvel, tanto quanto em
solos com alto conteúdo de matéria orgânica (BARBER, 1984).
Dessa forma, várias pesquisas têm sido desenvolvidas para se encontrar
alternativas para suprir as necessidades de P para as plantas a um custo menor.
Neste contexto, tem sido estudada a possibilidade de aplicação direta dos fosfatos
naturais no solo (BOLLAND e GILKES, 1995; OMAR, 1998), que apresentam
limitações na disponibilidade de P. Por isso, são recomendados na formação e
manutenção de pastagens e capineiras, em reflorestamentos e na formação de
culturas perenes (LOPES e GOEDERT, 1987). Foi constatado que em culturas
anuais, a eficiência desses fosfatos deixa a desejar, pois se manifesta somente após
longo período de tempo (GOEDERT, 1983).
Por outro lado, foi comprovada a presença de microrganismos do solo com
capacidade de solubilizar fosfatos naturais, por meio da produção de ácidos
orgânicos, propiciando fosfato solúvel além das suas necessidades, que é
aproveitado pelas plantas. Por meio destes resultados foi possível o
27
desenvolvimento de programas de inoculação de microrganismos solubilizadores de
fosfatos, com resultados favoráveis (YOUNG, 1990). Dessa forma, a pesquisa da
diversidade e das condições de crescimento desses microrganismos no solo
constitui um potencial a ser explorado.
Entre as plantas cultivadas, foi constatada maior presença de bactérias
solubilizadoras em leguminosas do que em gramíneas (SYLVESTER-BRADLEY et
al., 1982). Com relação aos microrganismos solubilizadores, os dados da literatura
dão mais ênfase às bactérias do que aos fungos, que são potencialmente mais
promissores no processo de solubilização de fosfato. Rodrigues e Fraga (1999)
citam que estirpes do gênero Pseudomonas, Bacillus e Rhizobium estão entre as
bactérias com maior potencial de solubilização de fósforo.
2.3 Enzimas de interesse biotecnológico
Após os antibióticos, enzimas são os produtos microbianos mais explorados
na indústria biotecnológica, pois em relação a produtos similares de origem vegetal
ou animal, os de origem microbiana apresentam menor custo, facilidade para
produção em fermentadores industriais, amplo espectro de características fisico-
químicas, geralmente relacionadas ao habitat e fisiologia do microrganismo produtor
(organismos termofílicos produtores de enzimas termorresistentes), susceptibilidade
de manipulação genética, além de representarem um recurso renovável.
As plantas desenvolveram sistemas diversificados que permitem resistir a
patógenos devido ao acúmulo de moléculas no local de infecção, e entre estes
componentes estão as enzimas hidrolíticas e fitoalexinas que podem prevenir o
crescimento de patógenos. A produção destas substâncias com ampla ação
antimicrobiana pode ser induzida por metabólitos produzidos por patógenos ou
microrganismos associados, tais como microrganismos endofíticos. Esta indução
pode ser devido à síntese de celulases por parte destes microrganismos endofíticos
durante o processo de infecção, ativando assim o sistema de defesa da planta
(HALLMANN et al.,1997) limitando assim o desenvolvimento do patógeno. Dentro
deste contexto podemos citar as enzimas celulases, amilases e pectinases bem
28
como as quitinases como importantes enzimas que desempenham papéis
importantes na interação planta - microrganismos.
Celulases - O complexo celulolítico secretado por fungos filamentosos é
formado por três componentes enzimáticos majoritários, as endoglicanases, as
celobiohidrolases (exoglucanases) e as glucosidases ou celobiases (FAN et al.,
1987; CONVERSE, 1994). Estas três classes de enzimas, por meio de suas
propriedades complementares, apresentam um alto grau de sinergismo durante a
hidrólise da celulose (BELDMAN et al., 1988). No entanto, apenas as endo e
exoglucanases são capazes de adsorver sobre o substrato, sendo assim
consideradas como celulases verdadeiras (KLYOSOV, 1990).
A descrição da presença de enzimas capazes de degradar a parede celular
do fitopatógeno parece ser uma constante nos trabalhos envolvendo a utilização de
microrganismos como agentes do biocontrole. Inúmeros estudos foram conduzidos
com o intuito de melhor caracterizar as enzimas envolvidas neste processo, mas
sabe-se que a síntese de celulases está envolvida com a capacidade de
microrganismos induziram resistência sistêmica na planta (HALLMANN et al., 1997)
e controlarem fungos patogênicos.
Quitinases - A quitina é o segundo polímero mais abundante na natureza e
está presente em insetos, crustáceos e na maioria dos fungos. Para degradar este
polissacarídeo, inúmeros organismos sintetizam as quitinases, as quais são
classificadas em dois grupos principais: as endoquitinases, as quais digerem
aleatoriamente regiões internas da quitina, gerando multímeros solúveis de GlcNAc
de baixo peso molecular (SAHAI e MANOCHA, 1993), e as exoquitinases, as quais
são subdividida em duas categorias: quitobiosidases, que liberam resíduos de di-
acetilquitobiose a partir do terminal não reduzido da quitina, e as 1-4-α-N-
acetilglicosaminidase, que quebram os oligômeros produzidos pelas outras duas
enzimas em monômeros de GlcNAc (COHEN-KUPIEC e CHET, 1998).
Devido à importância da molécula de quitina na constituição de fungos e
insetos as quitinases têm sido estudadas quanto à sua utilização no controle
biológico desses organismos. Dentro deste contexto, a bactéria endofítica Bacillus
cereus, com alta atividade quitinolítica, foi utilizada no controle de R. solani, Pythium
ultimum e S. rolfsii em algodão (PLEBAN et al., 1997). Também, o gene chi1 de
Serratia marcescens foi clonado e introduzido em Pseudomonas fluorescens e
Herbaspirillum seropedicae, permitindo o controle do fungo Rhizoctonia solani e da
29
praga Eldana saccharina e em feijão e cana-de-açúcar, respectivamente (DOWNING
et al., 2000).
Amilases - O amido é um polissacarídeo heterogêneo constituído por dois
componentes de alto peso molecular: a amilose que é uma molécula linear composta
de unidades de glicose unidas por ligações alfa-1,4, e a amilopectina que é um
polímero heterogêneo com ramificações unidas à cadeia principal por ligações alfa-
1.6. Para a sua degradação, microrganismos produzem a enzima alfa-amilase, a
qual hidrolisa ligações alfa-1,4, tanto na amilose quanto na amilopectina. Estes
fungos e bactérias podem utilizar alfa-amilases para penetrar e infectar os tecidos
vegetais, mas em contrapartida as plantas produzem proteínas (as chamadas PR)
que são capazes de inibir a ação destas alfa-amilases protegendo as plantas destes
patógenos (MARGIS-PINHEIRO et al., 1999).
Pectinases- As enzimas pectinolíticas são produzidas principalmente por
plantas superiores, fungos filamentosos, leveduras e bactérias. A composição dos
complexos enzimáticos pectinolíticos varia entre as espécies de microrganismos
(UEDA et al., 1982; EL-REFAI et al., 1984). As pectinases são classificadas de
acordo com o seu modo de ação em poligalacturonases quando hidrolisam ligações
glicosídicas e liases quando atuam por transeliminação. As poligalacturonases ainda
podem ser subdivididas em endopoligalacturonases quando hidrolisam a molécula
de pectato, produzindo oligogalacturonatos e em exopoligalacturonases quando
liberam resíduos de galacturonato a partir do pectato.
O estudo das pectinases tem sido considerado de grande importância, pois
estas enzimas podem estar ligadas a indução de resistência sistêmica da planta a
patógenos. Em estudos envolvendo o patógeno Erwinia carotovora subsp.
carotovora em tabaco foi observado que esta bactéria produz várias pectinases e
celulases durante o processo de infecção (VIDAL et al., 1988). Os autores
observaram que o tratamento de plantas de tabaco com filtrado da bactéria
aumentou a expressão local e sistêmica de genes envolvidos na resposta de defesa
da planta, sendo sugerido que a ação sinergistica entre celulases e pectinases pode
aumentar a indução do gene de defesa da planta.
30
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
O objetivo do presente trabalho foi estudar a diversidade genética e fisiológica
da comunidade bacteriana do solo da Serra do Itapety.
3.2 Objetivos específicos
Os objetivos específicos do projeto foram:
a) Isolar bactérias do solo da Mata Atlântica (Serra do Itapety);
b) Avaliar a diversidade bacteriana por meio da técnica de ARDRA;
c) Avaliar a capacidade destas bactérias em inibir in vitro o crescimento de
fungos fitopatogênicos;
d) Avaliar a capacidade destas bactérias em produzir enzimas de interesse
biotecnológico e de solubilizar fosfato inorgânicos.
31
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Área de estudo
O solo foi coletado em três épocas: primeira coleta 04/11/2004, segunda
coleta 19/03/2005, terceira coleta 12/08/2005. O solo foi amostrado em 4 pontos do
Parque Natural Municipal da Serra do Itapety, (23° 28’5 e 46° 09’W), município de
Mogi das Cruzes, Estado de São Paulo. Cada amostra foi composta por 4 sub-
amostras coletadas a uma distância 20cm de distância, que foram homogeneizadas
e transportadas ao laboratório para análise imediata.
4.2 Isolamento de bactérias
Para o isolamento da comunidade bacteriana do solo, as amostras de solo
(5g) foram colocadas em 50ml de tampão PBS e agitado (150 RPM) por 1h.
Diluições apropriadas em tampão PBS foram semeadas sobre meio TSB 5%,
suplementado com o fungicida Benomyl (50µg.ml-1) e incubado a 28°C por até 10
dias. Após o crescimento bacteriano as colônias foram contadas para determinação
da densidade microbiana e coletadas aleatoriamente para posterior análise da
diversidade genética e fisiológica.
4.3 Purificação das colônias bacterianas
No processo de purificação foi empregada a técnica de estrias por
esgotamento, que consiste na inoculação dos isolados por meio de estrias em meio
sólido, onde por esgotamento obtêm-se colônias isoladas no final de cada estria.
Este processo foi repetido por três vezes para a obtenção de colônias puras, as
quais foram armazenadas em meio TSB 5% sólido a 40C e meio TSB 5% líquido
com 10% de Glicerol em freezer -700C.
32
4.4 Análise da diversidade fisiológica
4.4.1 Bactérias produtoras de agentes antimicrobianos
Os isolados bacterianos foram avaliados quanto à capacidade de inibir in vitro
fungos fitopatogênicos. Para tanto, as bactérias de interesse e os fungos: Fusarium
oxysporum e Alternaria alternata, foram cultivados utilizando a estratégia de
pareamento sobre meio BDA a 280C por até 10 dias. Após este período, o
crescimento do fitopatógeno foi comparado com o controle (fungo crescido na
ausência da bactéria do solo), para observar a ocorrência de inibição. A freqüência
de bactérias com capacidade de produzir compostos antimicrobianos foi calculada
para cada local e época de amostragem. Todas as análises foram realizadas em
triplicata.
4.4.2 Bactérias solubilizadoras de fosfato
As bactérias isoladas da Serra do Itapety foram crescidas a 28°C por 24 a 72
h em meio para solubilização de fosfato (10g de glicose, 1g NaCl, 5 g NH4Cl, 1 g
MgSO4, 0,8 g CaPO4 e 15g de Agar em 1000mL; pH 7,2) de acordo com (VERMA et
al., 2001). A presença de um halo em torno das colônias indicou a capacidade
desses isolados de solubilizar fosfato.
4.4.3 Bactérias produtoras de enzimas
As bactérias isoladas no solo da Serra do Itapety (Mogi das Cruzes, SP)
foram avaliadas quanto à produção das enzimas amilases e pectinases.
4.4.3.1 Produção de amilases
As bactérias foram crescidas a 28°C por até 72 horas em Meio de amido
contendo 10g de amido e 15g Agar que foram dissolvido com 600mL de água
33
destilada e autoclavado, 10g M9 (sais) que foi dissolvido em 400mL de água
destilada e autoclavado, após esse procedimento os itens acima, foram misturados
e colocados em placas de Petri onde foram inoculados os isolados a serem
avaliados. Após o crescimento bacteriano, foram adicionados 5ml de Solução de
Iodo (1%), e a observação de um halo incolor em torno da colônia, indicou a
secreção de amilase, degradando o amido do meio de cultura.
4.4.3.2 Bactérias produtoras de pectinases
As bactérias foram crescidas 28°C por até 72 horas em meio de pectina (10g
de pectina em 1000ml de meio TSB 5%, o pH foi ajustado a 7,0 a 7,2). Após o
crescimento bacteriano, foram adicionados 10mL de Vermelho Congo (1%) e
posteriormente lavado com NaCl (5M). A secreção de pectinase foi observada pela
formação de um halo incolor em torno das colônias.
4.5 Caracterização molecular das bactérias
4.5.1 Extração de DNA total de bactérias
Para a extração de DNA total, as bactérias foram crescidas em 5ml de meio
TSB 5% por 24 horas (150 rpm). Em seguida 2mL da cultura foram centrifugados e
lavados em tampão TE (1M de Tris-HCl pH 8 e 10M de EDTA). Ao precipitado de
células foram adicionados 500µl de TE, 30µl de SDS 10% e pérolas de vidro
(0,1mm, Sigma) e levado ao homegenizador de células para romper a parede
celular, deixando o DNA livre. Então, foi adicionando 1 volume de fenol,
homogeneizado por inversão e centrifugado a 14000 X g por 5min. O sobrenadante
foi coletado, acrescentado um volume de clorofane (fenol 1:1 Clorofórmio) e
centrifugado novamente a 14000 X g por 5min. O sobrenadante foi novamente
coletado e a ele adicionado um volume de clorofórmio e novamente centrifugados a
14000 X g por 5min. Por fim, a fase aquosa foi coletada, adicionando 0,6 volume de
34
isopropanol e 20µl de acetato de sódio, incubado a temperatura ambiente por 5min.
e centrifugado a 14000 X g por 5min. O sobrenadante foi descartado, e o DNA
lavado com Etanol 70% gelado e secado a 37°C por 40min. A integridade do DNA foi
verificada em gel de agarose (0,8%) com brometo de etídio e com luz de ultravioleta.
4.5.2 Amplificação do 16s rDNA
A amplificação do 16s do rDNA foi realizada por meio da técnica PCR com
os primers universais R1387 (5´- CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3´) e
P027F (5´-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3´). A PCR foi realizado em volume de
50µl contendo tampão da enzima 1 X, 3,75 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTPs,
0,2 µM de cada primer, 0,1U/µl de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, Brasil).
A reação da amplificação foi realizada em termociclador, programado para
realizar uma desnaturação inicial a 94°C por 4 minutos, 25 ciclos de desnaturação a
94°C por 30 segundos, anelamento a 63°C por 1 minuto e extensão de primers 72°C
por 1 minuto, seguida de extensão final a 72°C por 7 minutos. Após a amplificação,
5µl da reação de PCR foram avaliados por eletroforese em gel de agarose (1%) em
tampão 1 x TAE e corado com brometo de etídio.
4.5.3 Clivagem do 16S rDNA (ARDRA)
Para a clivagem do fragmento amplificado (27-1401) do 16S rDNA, foi
utilizado 1µg do produto de PCR, o qual foi clivado com 2U enzima de restrição
HhaI, (Invitrogen, Brasil) de acordo com as instruções do fabricante. As reações de
digestão foram realizadas a 37°C por 2 horas, em volume final de 20µl. Após a
digestão, toda a reação foi analisada por eletroforese em gel de agarose (2% p/v)
em 1 x TAE, juntamente com o marcador de peso molecular DNA Ladder 100pb
(Invitrogen). Em seguida o gel foi corado com brometo de etídio, observado sobre luz
ultravioleta e fotodocumentado. Cada padrão de clivagem, caracterizado pelo
número e tamanho das bandas observadas no gel de eletroforese, foi denominado
de haplótipo. Amostras representativas de cada haplótipo foram seqüenciadas no
35
Laboratório de Virologia (NIB/UMC) sob responsabilidade do Prof. Dr. José Luiz
Caldas Wolff.
Para a identificação dos isolados bacterianos, as seqüências foram
analisadas comparativamente via BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
contra a base de dados do GenBank, que utiliza o método heurístico para encontrar
o melhor score de alinhamentos locais entre a seqüência submetida e o banco de
dados. Dessa forma foram consideradas as seqüências que apresentaram os
maiores valores de similaridade.
4.5.4 Construção de árvores filogenéticas
A árvore filogenética foi construída com base na seqüência de 16S rDNA das
bactérias do solo da Serra do Itapety. Para o alinhamento das seqüências foi
utilizado o programa Clustal X 1.8 (THOMPSON et al., 1997). Em seguida, as
seqüências tiveram suas extremidades cortadas afim que todas apresentassem
mesmo número de caracteres, essa edição foi realizada com o programa BioEdit
v5.0.9 copyright (c) 1997-2001, Tom Hall, North Carolina State University.
Finalmente a árvore foi construída utilizando o programa Phylogenetic Analysis
Using Parsimony PAUP* 4.0 b10, considerando máxima parcimônia.
4.5.5 Análise estatística
Para a análise dos dados de isolamento microbiano, foi calculada a densidade
bacteriana por grama de solo amostrado. A análise estatística foi feita com o auxílio
do programa SAS - Copyright (c) 1989-1996 by SAS Institute Inc., Cary, NC, USA. O
delineamento do experimento foi em blocos casualizados. E as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey.
36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Diversidade e densidade microbiana
Foram obtidos no presente trabalho 235 isolados, sendo 69 isolados na
primeira coleta, 83 isolados na segunda coleta, 83 isolados na terceira coleta. Em
relação à densidade bacteriana do solo da Serra do Itapety, não houve diferença
significativa (Figuras 1 e 2) referente ao local e a época, os resultados indicam que a
densidade bacteriana se manteve estável durante as diferentes épocas amostradas.
Entretanto, a análise da interação Local x Época (Figura 3) mostra que o local 3 na
época 2 e o local 4 na época 3, apresentam uma pequena redução na densidade,
embora não tenha sido considerada significativa pelo teste de Tukey. Estes
resultados evidenciam que a densidade populacional se manteve estável durante os
períodos de coleta. Segundo De Fede et al. (2001); Grayston et al. (2001) um solo
com alto teor de matéria orgânica tende a manter a população microbiana mais
estável ao longo do ano, provavelmente, em decorrência da riqueza de nichos
ecológicos e pela heterogeneidade das fontes de carbono. O solo da Mata Atlântica
apresenta muita serrapilheira que origina abundante húmus, aumentando a
qualidade de matéria orgânica desse solo, isso poderia manter uma alta densidade
bacteriana durante todas as épocas amostradas. Os isolamentos realizados neste
trabalho mostraram que a comunidade bacteriana do solo da Serra do Itapety é
composta pelas espécies Arthrobacter nicotinovorans, Bacillus circulans, B.
mycoides, B. niacini, Burkholderia cepacia, Cupriavidus basilensis, Dyella koreensis,
Enterobacter sp., Flexibacter sp., Microbacterium oleivorans, M. imperiale,
Micrococcus luteus, Naxibacter alkalitolerans, Nocardia inohanensis, N. niigatensis,
Oxalobacter sp., Beta e gama Proteobacterium, Pseudoxanthomonas sp.,
Streptomyces morabilis, S. purpureus, S. thermocoerulescens, Variovorax
ginsengisoli.
A diversidade microbiana foi analisada pela técnica de ARDRA. Para esta
análise foi utilizado 18,3% da população amostrada, tendo sido observados 19
haplótipos (Tabela 1). Os haplótipos A, B, C e E foram os mais freqüentes (Figuras 4
e 5), sendo obtidos em todas as 3 coletas. Foi observado também que alguns
haplótipos foram específicos para algumas coletas, visto que os haplótipos F, M, P,
37
Q e R foram observados somente na população obtida na 1º coleta, já os haplótipos
K, O e S foram observados apenas na 2º coleta, enquanto os haplótipos D,H e N
foram observados somente na 3º coleta (Figura 5).
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Local 1 Local 2 Local 3 Local 4
UFC
x104 .
g de
sol
o-1
Figura 1. Densidade bacteriana dos 4 locais amostrados do solo da Serra do Itapety (Mogi das Cruzes, SP). As coletas foram realizadas em 4 locais e com pelo menos 4 repetições. Barras indicam o desvio padrão da média.
Estes resultados mostram que embora a densidade bacteriana se manteve
estável nas épocas amostradas, ocorreu variação nas espécies, visto que houve
variação nos haplótipos. A mudança nos haplótipos pode indicar a alteração dos
nichos disponíveis e a substituição de espécies na comunidade e conseqüentemente
o papel desta população no solo pode estar sendo alterado. Amostras
representativas de cada haplótipo foram seqüenciadas, permitindo a identificação
das espécies presentes em cada haplótipo (Tabela 01 e Figura 06).
38
Tendo em vista que os haplótipos mais freqüentes, A, B, C e E, como
descrito acima foram os mais freqüentes, indicando que Pseudoxanthomonas sp.,
Bacillus sp., Streptomyces sp. e Burkholderia cepacia são as espécies dominantes
nesta comunidade.
Torsvik e Ovreas (2002) constataram que em cada estação parece ocorrer
uma comunidade microbiana dominante acompanhada de outras pouco abundantes
que, muitas vezes, estão abaixo do nível de detecção dos métodos atuais de
avaliação. Essas variações podem estar diretamente ligadas ao regime hídrico e ao
clima da região, à estrutura e ao manejo do solo, e ao teor e à qualidade dos
resíduos vegetais aportados (ROGERS e TATE , 2001; TIEDJE et al., 2001). Neste
contexto, a análise dos dados pluviométricos (Fonte: DAEE, Mogi das Cruzes) na
época das coletas (médias dos 5 dias anteriores às coletas) indicou que a
precipitação foi maior na 2º coleta (25,04mm) que nas demais (0,08mm). Esses
dados demonstram que, embora não tenha ocorrido variação na densidade
bacteriana (Figura 2), esta mudança na pluviosidade poderia alterar as espécies
presentes no solo.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Época 1 Época 2 Época 3
UFC
x10
4 . g
de s
olo-1
Figura 2. Densidade bacteriana em 3 épocas de amostragem: época 1(11/2004), época 2 (03/2005), época 3 (08/2005); de solo da Serra do Itapety (Mogi das Cruzes, SP). Barras indicam desvio padrão da média.
39
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Local 1 Local 2 Local 3 Local 4
UFC
104 .
g de
sol
o-1Época 01 Época 02 Época 03
Figura 3. Freqüência dos resultados referente à densidade bacteriana, Época x Local. Época 1 (11/2004), época 2 (03/2005), época 3 (08/2005); do solo da Serra do Itapety (Mogi das Cruzes, SP). As coletas foram realizadas em 4 locais e com pelo menos 4 repetições. Barras indicam desvio padrão da média.
Haplótipos
00,020,040,060,08
0,10,120,140,16
A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S
Freq
üênc
ia
Figura 4. Freqüência dos haplótipos na comunidade bacteriana do solo da Serra do Itapety. Foram realizadas 3 coletas. Os haplótipos foram obtidos pela técnica de ARDRA com a enzima de restrição HhaI.
40
1° Coleta
00,010,020,030,040,050,060,070,08
A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S
Freq
üênc
ia
2º Coleta
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S
Freq
üênc
ia
3° Coleta
00,010,020,030,040,050,060,070,08
A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S
Freq
üênc
ia
Figura 5. Freqüência dos haplótipos na comunidade bacteriana do solo da Serra do Itapety em e épocas de amostragem. Coleta 1 (11/2004), Coleta 2 (03/2005) e Coleta 3 (08/2005). Os haplótipos forma obtidos pela técnica de ARDRA com a enzima de restrição HhaI.
41
TABELA 1 - Isolados bacterianos com seus respectivos haplótipos, e identificação de suas espécies e sua função fisiológica.
Isolados Época Haplótipos Identificação Características fisiológicas* Ami Pec SF Fus Alt
L2-5 1 A + - + - - L4-20 2 A Pseudoxanthomonas sp. - - + - - L3-8 2 A - - - - - L1-11 3 A + - + - - L4-5 3 A - - - - - L2-2 1 B + - + - - L4-28 2 B - + - - - L2-2 2 B Bacillus niacini - + - - - L3-21 3 B - - - - - L4-21 3 B - - + - - L2-14 3 B + - + - - L1-11 1 C β proteobacterium + - + - - L4-6 1 C + - + - - L3-25 1 C Nocardia inohanensis - - - - + L2-4 2 C Streptomyces mirabilis - - - - - L2-17 3 C + - + - - L2-11 3 D Variovorax ginsengisoli - - - - - L3-19 3 D Bacillus circulans - - - - - L1-8 1 E Burkholderia cepacia - - - - - L3-9 1 E - - + - - L2-8 2 E Burkholderia cepacia - - + - - L1-21 2 E Cupriavidus basilensis - - - - + L1-16 3 E - - + - - L4-8 1 F - - - - - L4-25 1 F Micrococcus luteus - - - - - L1-5 1 G Oxalobacter sp. - - - - - L4-10 2 G Dyella koreensis - - - - - L4-11 3 H Naxibacter alkalitolerans - - + - - L2-6 2 I Bacillus mycoides - - - - - L4-7 3 I - - + + + L1-24 2 J Arthrobacter nicotinovorans - - - - - L1-14 3 J Microbacterium oleivorans + - - - - L2-1 2 K Nocardia niigatensis - - + - - L1-22 2 K - - - - -
L4-18 2 L Streptomyces purpureus - - + - -
L3-10 3 L - - + + + L1-9 1 M Microbacterium imperiale - - - - - L3-18 3 N S. thermocoerulescens - - - - - L3-3 2 O β proteobacterium - - - - - L1-13 1 P Flexibacter sp. - - - - - L1-22 1 Q - - - - - L3-11 1 R γ proteobacterium - - - - - L1-4 2 S Enterobacter sp. - - - - -
* Ami = amilase, Pec = pectinase, SF = solubilização de fosfato, Fus = inibição do Fusarium, Alt = inibição da Alterna
42
Bactéria do solo L4-25
M. luteus DQ512738
Bactéria do solo L1-24
Arthrobacter nicotinovorans AY833102
Bactéria do solo L1-9
Microbacterium imperiale AF526906
Bactéria do solo L1-14
M. oleivorans AJ698725
Kitasatospora k ifunensis AJ781341
Streptomyces purpureus AJ781324
Bactéria do solo L4-18
Bactéria do solo L2-4
S. mirabilis AY999730
Bactéria do solo L3-18
S. thermocoerulescens AB184584
Bactéria do solo L3-25
Nocardia inohanensis AJ619769
Bactéria do solo L3-19
B. circulans DQ339686
Bactéria do solo L2-6
B. mycoides Z84591
Enterobacter amnigenus AY579148
Bactéria do solo L4-10
Dyella koreensis AY884571
Bactéria do solo L2-11
Variovorax ginsengisoli AB245358
Burk holderia sp. AY538659
B. cepacia AY741332
Bactéria do solo L2-8
Bactéria do solo L1-21
Cupriavidus basilensis AY047217
Naxibacter alkalitolerans AY679161
Bactéria do solo L4-11
Bactéria do solo L1-5
Oxalobacter sp. AY367029
Janthinobacterium sp. AY753304
Flexibacter sp. AF361187
Bactéria do solo L1-13
Uncultured bacterium AB179500
100
77100
100
100
100
100
7599
94
99
53
91
39
46
100
100
100
100
100
80100
76100
100
100
96
96
84
7785
44
99100
87
91
0.05
Figura 6. Dendrograma mostrando a relação filogenética dos isolados bacterianos obtidos do solo da Serra do Itapety. A árvore foi construída pelo método do vizinho mais próximo utilizando o coeficiente de Jukes-Kantor.
Actinobacteria
Firmicutes
Proteobacteria
Bacteroidetes
43
Visto que a Mata Atlântica apresenta grande diversidade vegetal, isto poderia
influenciar as características do solo e conseqüentemente as populações
bacterianas. As comunidades vegetais podem alterar fatores químicos e físicos do
solo, favorecendo ou não o crescimento de diferentes espécies microbianas. Neste
contexto, áreas de preservação sofrem poucas alterações favorecendo o equilíbrio
entre as comunidades microbianas, segundo Hackl et al. (2004) florestas naturais
que são pouco perturbadas, apresentam uma grande biodiversidade.
5.2 Diversidade fisiológica de bactérias do solo
A comunidade bacteriana do solo da Serra do Itapety foi avaliada quanto a
produção das enzimas amilases e pectinases, solubilização de fosfato e produção
de compostos antagônicos as fungos Fusarium oxysporum e Alternaria alternata.
Foi possível observar a formação de halo incolor em torno das colônias
produtoras de amilase (Figura 07 A) e solubilizadoras de fosfato (Figura 07 B). A
freqüência destas bactérias produtora de amilase (Figura 08) foi diferente entre as
épocas amostradas, sendo na época 1 > época 3 > época 2, mostrando que o fator
sazonal influência na freqüência destas bactérias. As condições ambientais podem
estimular ou inibir o desenvolvimento e atividade de microrganismos do solo. As
variáveis climáticas, a precipitação e a temperatura são os fatores que exercem
maior influência sobre os microrganismos (MASON, 1980; SANTOS e CAMARGO,
1999). Visto que a primeira coleta ocorreu na primavera, época de maior aporte de
serrapilheira, conseqüentemente maior disponibilidade de amido na Mata.
44
Figura 7. Foto mostrando o crescimento de bactérias do solo da Serra do Itapety sobre o meio para detecção de produtores de amilase (A) e solubilizadores de fosfato (B). A. Seta indica o halo que caracteriza a produção de amilases pelo isolado L4-6, uma Beta proteobacterium não identificada. B. Crescimento bacteriano em meio de cultura suplementado com fosfato insolúvel. Setas indicam o halo produzido por colônias de bactérias solubilizadoras de fosfato inorgânico. Isolados a-L2-1 (Nocardia niigatensis), b-L4-20 (Pseudoxanthomonas sp), c-L2-8 (Burkholderia cepacia), d-L2-2 (Bacillus niacini).
A presença de microrganismos solubilizadores de fosfato tem sido constada
na maioria dos solos investigados (JONES et al., 1991; NAHAS et al., 1994).
Segundo Odunfa e Oso (1978) alguns fatores como o tipo de solo, a espécie e a
idade da planta, podem influenciar a freqüência destes microrganismos. No presente
trabalho foi observado que 51% dos isolados avaliados foram capazes de solubilizar
fosfato, sugerindo que nos locais amostrados, o fosfato se encontrou disponível
durante as três épocas, visto que não foi observada diferença significativa entre as
épocas amostradas (Figura 08). Parece que o tipo de vegetação encontrada na mata
pode favorecer a estabilidade desta população, permitindo que mesmo após
variações sazonais a freqüência destas bactérias seja mantida. Tendo em vista que
a análise de ARDRA mostrou que ocorre variação nas espécies presentes no solo
amostrado, pode ser sugerido que as espécies solubilizadoras de fosfato pertencem
aos haplótipos presentes em todas as épocas amostradas, ou que caso sejam
eliminadas, outras espécies com as mesmas características ocupam o nicho.
45
0,00
0,15
0,30
0,45
0,60
Amilase Pectinase Solubilizadores de Fosfato
Freq
üênc
iaColeta 1 Coleta 2 Coleta 3
Figura 8. Frequência de bactérias solubilizadoras de fosfato, produtora de enzimas
amilasese pectinases na comunidade bacteriana do solo da Serra do Itapety. Coleta 1 (11/2004), Coleta 2 (03/2005) e Coleta 3 (08/2005).
De acordo com a metodologia descrita, os isolados bacterianos do solo da
Serra do Itapety foram avaliados quanto à produção de pectinases, a qual foi
constatada pela presença de um halo claro em torno da colônia (Figuras 09 A e B).
Nesta característica foi também observada uma variação na freqüência, sendo na
época 1< época 2> época 3, embora a freqüência total observada foi inferior a 10%
sugerindo que estas bactérias apresentam um papel pequeno na degradação de
tecidos vegetais, os quais apresentam uma grande quantidade de pectina (Figura
08). Outro fator que pode reduzir a freqüência de bactérias degradadoras de pectina,
seria a freqüência de bactérias patogênicas às plantas na comunidade amostrada,
visto que este grupo de bactérias pode degradar as paredes da planta hospedeira
durante o processo de infecção. Entretanto, neste caso deve ser desconsiderada o
papel destas bactérias na reciclagem de compostos orgânicos ricos em pectinas
como os tecidos vegetais.
46
Figura 9. Produção de pectinases por bactérias do solo da Serra do Itapety. A seta indica halo de degradação da pectina por pectinases produzidas pelos isolados: A. L1-3 (sem identificação) B. L4-28 (Bacillus niacini).
5.3 Bactérias produtoras de agentes antimicrobianos
Utilizando a metodologia descrita no item 4.1.1 foi possível observar que as
bactérias do solo da Serra do Itapety são capazes de produzir agentes
antimicrobianos contra fungos de interesse agrícola como Alternaria alternata (Figura
10 e Tabela 1) e Fusarium oxysporum (Figura 11 e Tabela 1). Em relação à
freqüência desses isolados, foi observada uma diferença significativa entre as três
épocas amostradas, visto que a freqüência de bactérias capazes de inibir o fungo A.
alternata no mês de novembro foi de 2%, enquanto que na segunda coleta no mês
março, freqüência foi de 11%, e na terceira coleta 10% sugerindo que fatores
ambientais podem estar afetando estas populações. Por outro lado, na terceira
coleta 2% dos isolados foi capaz de inibir o fungo F. oxysporum, mostrando que
somente uma pequena proporção destes isolados inibe este fungo. Segundo Vargas
e Scholles (2000); Andrade (1999) os microrganismos são muito sensíveis e podem
ser influenciados pelos fatores bióticos e abióticos. Um outro fator que pode interferir
nas comunidades microbiana são os metabólicos microbiológicos, os quais podem
47
agir de diversas maneiras, atuando como fatores probióticos ou antibióticos
(DROZDOWICZ, 1997). Nas épocas 2 e 3 onde foi observada uma maior freqüência
de isolados antagonistas, pode ser sugerido que mesmo em ambientes em
equilíbrios, nestas épocas poderia ocorrer competição por nutrientes, visto que foram
períodos com menor quantidade de serrapilheira, permitindo assim a seleção de
bactérias produtoras de compostos antimicrobianos. Um dos fatores de maior risco
na agricultura são as doenças de plantas, elas comprometem a produção final de
muitas culturas, causando grandes prejuízos para os produtores e consumidores,
sendo os fungos uns dos grandes responsáveis por estas doenças (ZAMBOLIM e
RIBEIRO DO VALE, 1985). Neste contexto, o fungo Fusarium spp. pode estar
associado a inúmeras espécies vegetais, quando possível causando doenças,
sobretudo em culturas de importância econômica como: feijoeiro (ITO, 2004), em
frutos de ameixa e nectarina (GONÇALVES, 2005), em amendoim (DHINGRA, O.D.
et al., 1998). No presente trabalho, foram observados diferentes isolados bacterianos
capazes de inibir in vitro os fungos fitopatógenos avaliados, e por esse motivo
poderiam ser utilizados como fontes de novos fungicidas e/ou auxiliar no controle de
doenças que causam grandes prejuízos na agricultura.
48
Figura 10. Inibição do fungo Alternaria alternata por bactéria do solo da Serra do Itapety. Isolados : A. L3-25 (Nocardia inohanensis) B. L4-18 (Streptomyces purpureus), C. L2-13 (não identificado), D. L4-7 (Bacillus mycoides).
49
Figura 11. Inibição do fungo Fusarium oxysporum por bactéria do solo da Serra do Itapety A. Crescimento do fungo fitopatôgenico F. oxysporum sem bactéria (controle). B. Técnica de pareamento com colônia de bactérias, observa-se o crescimento do patógeno sobre as colônias bacterianas. C. Fungo patogênico F. oxysporum sendo inibido por uma colônia de bactéria, representada pelo isolado L4-7(Bacillus mycoides). D. Halo formado pela colônia de bactéria, representado pelo isolado L3-10 (Streptomyces purpureus).
50
6 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que:
- Embora a densidade bacteriana do solo da Mata Atlântica não seja alterada, a
freqüência de algumas espécies pode ser mudada por fatores como época do ano;
- Os isolados bacterianos obtidos neste trabalho apresentam potencial aplicação
biotecnológica como produção de enzimas como amilases e pectinases,
solubilização de fosfato e inibição de fungos fitopatogênico, demonstrando a
importância do estudo deste bioma na procura de novas linhagens para controle
biológico.
51
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