diversidade taxonômica e prospecção da produção de lacases...
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RENAN AUGUSTO ABIB PASTORE
DIVERSIDADE TAXONÔMICA E BIODEGRADAÇÃO DE LIGNINA EM
COMUNIDADE BACTERIANA DO SOLO DA CAATINGA
CAMPINAS
2016
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
2
RENAN AUGUSTO ABIB PASTORE
DIVERSIDADE TAXONÔMICA E BIODEGRADAÇÃO DE LIGNINA EM COMUNIDADE BACTERIANA DO SOLO DA
CAATINGA
CAMPINAS
2016
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biologia da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Mestre em
Genética e Biologia Molecular na área de
Genética de Micro-organismos.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO RENAN AUGUSTO
ABIB PASTORE E ORIENTADA PELA
ORIENTADORA VALÉRIA MAIA MERZEL.
Orientadora: VALÉRIA MAIA MERZEL.
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4
Campinas, 20 de julho de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Valéria Maia Merzel (Orientadora)
Dr. Tiago Palladino Delforno
Dra. Suzete Aparecida Lanza Destéfano
Prof. Dr. Alysson Wagner Fernandes Duarte
Dra. Lucélia Cabral
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
5
“Que os nossos esforços desafiem as
impossibilidades. Lembrai-vos de que as
grandes proezas da história foram conquistas
daquilo que parecia impossível”.
Charles Chaplin
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas,
Biológicas e Agrícolas da Universidade Estadual de Campinas, por conceder a oportunidade
acadêmica e espaço institucional necessário que permitisse a realização deste trabalho de
mestrado.
À minha orientadora Valéria Maia Merzel, pela orientação e suporte ao longo do
desenvolvimento deste trabalho; como também à Fabianna Fantinatti Garboggini , pelas
sugestões e apoio prestados na qualificação e pré-banca.
Aos integrantes da banca examinadora, Suzete Aparecida Lanza Destéfano e
Tiago Palladino Delforno, pelo aceite de convite e participação na minha defesa de
dissertação.
À CAPES pelo auxílio financeiro e concessão da bolsa de mestrado, o qual sem a
mesma este trabalho não se concretizaria.
À equipe da Divisão de Recursos Microbianos (DRM) do CPQBA/UNICAMP,
pelo companheirismo e aprendizado conquistados durante todos estes anos no dia a dia do
laboratório.
À minha família e amigos pelo apoio, torcida, dicas, amizade e descontração, que
foram muito importantes durante a minha vida de mestrando. E, finalmente, à minha
namorada Tiemi, que há três anos tem me incentivado bastante a não desistir e a lutar pelos
meus sonhos, independente das dificuldades... Meu muito obrigado com muito amor!
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RESUMO
A Caatinga é um bioma exclusivamente brasileiro, que cobre aproximadamente 11% do
território nacional e considerada a região semiárida mais diversa do mundo. No entanto, o
conhecimento acerca da diversidade microbiana presente no solo da Caatinga, bem como do
potencial biotecnológico a ela associada, ainda é incipiente e escasso. Atualmente, milhões de
toneladas de lignina e compostos relacionados são produzidos como resíduos de efluentes de
indústrias de produção de papel e polpa de celulose, com a previsão que este número aumente
em um futuro próximo, dado o recente desenvolvimento de combustíveis alternativos gerados
da biomassa lignocelulósica. Enzimas microbianas do grupo das ligninases como as lacases
têm recebido grande atenção dos cientistas nas últimas décadas, uma vez que a catálise destas
enzimas na bioconversão e biodegradação da lignina são exploradas tanto industrialmente
(fábricas de papel e celulose, têxtil e produção de biocombustíveis) quanto ambientalmente
(desintoxicação de compostos aromáticos recalcitrantes e remediação de solos e rios
contaminados). Neste sentido, o presente projeto visou investigar a composição e a dinâmica
de comunidades bacterianas nativas do solo da Caatinga sob a influência da adição de lignina
ao meio/microcosmo, aplicando uma abordagem polifásica para a análise da diversidade
taxonômica. Ao mesmo tempo, bactérias com potencial ligninolítico foram isoladas e
exploradas para a prospecção funcional (ABTS, RBBR e Vermelho Congo) e molecular (uso
de primers degenerados) de genes de lacases, com vistas à aplicação futura no tratamento de
águas residuárias e solos contaminados. Durante 27 dias de amostragem, foram isoladas 156
bactérias potencialmente ligninolíticas (39 oriundas diretamente de microcosmos enriquecidos
com 10% de lignina), todas cultivadas em meios específicos com 0,3 % de lignina (m/v). Os
dados gerados pelo sequenciamento Illumina do gene RNAr 16S mostrou que a introdução da
lignina nos microcosmos proporcionou mudanças na abundância de grupos taxonômicos
pertencentes à comunidade bacteriana ao longo do tempo, interferindo na composição da
microbiota nos microcosmos avaliados. Enquanto que a maioria dos grupos taxonômicos
bacterianos tenha sido suprimida, alguns gêneros como Bacillus e Streptomyces apresentaram
significativo aumento de abundância ao longo do enriquecimento, acompanhados também por
outros grupos taxonomicamente não descritos, ainda, pela literatura. Os ensaios moleculares e
funcionais usados para a prospecção de lacases aparentemente não apresentaram sucesso. No
entanto, alguns isolados foram selecionados para ensaios de cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massas (CG-EM), no qual os compostos liberados durante a biodegradação
da lignina foram analisados.
Palavras-Chave: Caatinga; lignina; biodegradação; bactérias ligninolíticas; Illumina.
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ABSTRACT
The Caatinga is an exclusively brazilian biome, accounting for approximately 11% of the
national territory and considered the most diverse semi-arid region of the world. However, the
knowledge about the microbial diversity present in the soil of Caatinga and the
biotechnological potential associated with it is still incipient and scarce. Currently, millions of
tons of lignin and related compounds are produced as waste from effluents of paper and
cellulose pulp industries, with the forecast which this number will increase in the near future,
given the recent development of alternative fuels generated from lignocellulosic biomass.
Microbial enzymes from the group of ligninases, such as laccases, have received much
attention of scientists in recent decades, once the catalysis by these enzymes in bioconversion
and biodegradation of lignin is exploited both industrially (paper and pulp mills, textile and
biofuels industries) and environmentally (like detoxification of recalcitrant aromatic
compounds and remediation of contaminated soils and rivers). In this sense, this work
investigated native bacterial communities from soil of Caatinga under the influence of the
addition of lignin, applying a polyphasic approach to the analysis of taxonomic diversity. At
the same time, bacteria with ligninolytic potential were isolated and cultivated for molecular
(use of degenerated primers) and functional (ABTS, RBBR e Congo Red) assays to screening
bacterial genes from laccases, hoping a future application in the treatment of sewage and
contaminated soils. During 27 days of sampling, 156 bacteria potentially ligninolytic were
isolated (39 derived directly from microcosms supplemented with 10% lignin), all of them
grown in culture medium with 0.3% lignin (w/v). The data generated by Illumina sequencing
of 16S rRNA gene showed that the introduction of lignin in the microcosms provided changes
in the abundance of taxa belonging to the bacterial community over time, affecting the
microbiota composition in the evaluated microcosms. While the most bacterial taxonomic
groups have been supressed, some genera such as Bacillus and Streptomyces showed
significant increase in abundance under enrichment, as well as other groups not described yet
in the literature. The molecular and functional assays used to prospect laccases apparently
showed unsuccessful. However, some isolated were selected for gas chromatography-mass
spectrometry (CG-EM) assays, in which the compounds released during biodegradation of
lignin were analyzed.
Keywords: Caatinga; lignin; biodegradation; ligninolytic bacteria; Illumina.
9
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 11
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 14
2.1 O bioma Caatinga ..................................................................................................... 14
2.2 Geologia e geomorfologia ........................................................................................ 15
2.3 Biodiversidade .......................................................................................................... 17
2.4 O solo e a microbiota da Caatinga ............................................................................ 20
2.5 Micro-organismos termofílicos e enzimas termoestáveis ......................................... 22
2.6 Lignina ...................................................................................................................... 22
2.6.1 Ligninases e a atividade ligninolítica ................................................................. 25
2.6.1.1. Lacases – as biocatalisadoras ecológicas ........................................................ 26
2.7 Sequenciamento de DNA.......................................................................................... 27
2.7.1 Plataforma Illumina ............................................................................................. 27
2.8.1.1. Sistema MiSeq................................................................................................. 29
2.9 Análise da diversidade bacteriana através do gene RNAr 16S ................................. 29
3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 33
3.1. Objetivo Geral .......................................................................................................... 33
3.2. Objetivos Específicos .............................................................................................. 33
4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 34
4.1 Local de coleta do solo ............................................................................................. 34
4.1.1. Análise meteorológica ........................................................................................ 35
4.1.2. Análise físico-química do solo ........................................................................... 37
4.2 Microcosmos e enriquecimento ................................................................................ 38
4.2.1 Isolamento de colônias bacterianas potencialmente ligninolíticas ........................ 40
4.2.1.1 Meios de cultivo ............................................................................................... 41
4.2.1.2 Diluição seriada ................................................................................................ 42
4.2.1.3 Plaqueamento ................................................................................................... 42
4.2.1.4 Nomenclatura dos microcosmos ...................................................................... 42
4.2.1.5 Contagem de unidades formadoras de colônias ............................................... 43
4.2.1.6 Construção da coleção de culturas bacterianas potencialmente ligninolíticas
isoladas do solo da Caatinga ........................................................................................ 43
4.2.1.7 Descrição macromorfológica de colônias bacterianas ..................................... 44
4.3 Screening de lacases envolvidas na degradação de lignina ...................................... 44
4.4 Extração de DNA ...................................................................................................... 46
4.4.1 Extração de DNA total dos microcosmos ........................................................... 46
10
4.4.2 Extração do DNA genômico de isolados bacterianos ......................................... 47
4.5 Amplificação de genes bacterianos de lacases utilizando primers degenerados ...... 47
4.6 Sequenciamento de DNA dos microcosmos ............................................................. 49
4.7 Estimativas de riqueza e avaliação da diversidade taxonômica bacteriana .............. 50
4.8 Análises filogenéticas ............................................................................................... 52
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 53
5.1 Análise físico-química do solo ................................................................................. 53
5.2 Riqueza e diversidade bacteriana nos microcosmos ................................................. 55
5.3 Afiliação taxonômica de comunidades bacterianas dos microcosmos ..................... 66
5.3.1 Estrutura das comunidades bacterianas em nível de filo ..................................... 67
5.3.2 Estrutura das comunidades bacterianas em nível de família ............................... 71
5.3.3 Estrutura das comunidades bacterianas em nível de gênero ............................... 75
5.3.4 Detalhamento da composição da comunidade bacteriana ao final do enriquecimento
...................................................................................................................................... 82
5.4 Isolamento de colônias bacterianas potencialmente ligninolíticas ........................... 83
5.4.1 Coleção de culturas bacterianas isoladas do solo da Caatinga ............................ 84
5.4.2 Diversidade fenotípica e caracterização macromorfológica das bactérias
isoladas..........................................................................................................................85
5.5 População bacteriana do solo .................................................................................... 87
5.6 Potencial de biodegradação da lignina nos microcosmos enriquecidos ................... 88
5.7 Screening funcional dos isolados para produção de lacases ..................................... 91
5.8 Triagem via PCR de lacases a partir do DNA total dos microcosmos e isolados
bacterianos... ............................................................................................................... ..93
5.9 Filogenia dos isolados bacterianos dos microcosmos enriquecidos ......................... 97
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 102
7. PERSPECTIVAS ......................................................................................................... 103
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 104
9. ANEXOS ...................................................................................................................... 118
11
1. INTRODUÇÃO
A Caatinga é uma das maiores e mais distintas regiões fitogeográficas do Brasil,
ocupando cerca de 10% do território nacional e considerada a região semiárida mais diversa
do mundo (LEAL et al., 2003, 2005). Fatores ambientais característicos da região, como altas
temperaturas, déficit hídrico e chuvas irregulares têm exigido respostas adaptativas
específicas na sua biota nativa, propiciando a existência de um patrimônio genético único
deste que permita a sobrevivência das espécies a estes extremos. Porém, embora recentemente
sua biodiversidade tenha-se revelado elevada e de alto grau de endemismo, a Caatinga é
considerado o bioma menos explorado cientificamente e menos protegido do país,
negligenciado pela maioria das políticas nacionais e unidades de conservação (MMA 2015).
Considerada a região semiárida mais populosa do mundo, a Caatinga tem sido
desmatada de forma acelerada e intensa no decorrer das últimas décadas, no qual o uso
contínuo da terra pelo homem para produção agrícola, pastagem e extrativismo tem
contribuído para a degradação de sua cobertura vegetal nativa e extinção de espécies
endêmicas na região. Tais fatores têm interferido não só na plasticidade e subsistência do
bioma frente às próprias condições extremas inerentes à região, como também tem colocado
em xeque a ciclagem e a dinâmica orgânica e inorgânica de seus ecossistemas e a manutenção
natural de sua biodiversidade, uma vez que atividades econômicas como superpastoreio,
monoculturas e urbanização tem exercido pressão diretamente sobre os recursos naturais
presentes no solo da Caatinga (CASTELLETTI et al., 2003; INPE, 2015).
No caso do solo da Caatinga, o conhecimento acerca da diversidade microbiana
nativa e o potencial biotecnológico a ela associada ainda é bastante escasso (GANS et al,
2005), fato que se torna mais preocupante ao passo que o desmatamento do bioma, associado
ao uso e ocupação do solo, tornam-se atividades cada vez mais frequentes na região (INPE,
2015).
Em solos de ambientes terrestres, a lignina representa parte significativa na
composição dos mesmos, sendo encontrada naturalmente como componente vegetal de raízes
ou matéria orgânica resultante da deposição de folhas, brotos ou troncos no solo, que será
aproveitada por uma grande variedade de microrganismos. Atualmente, milhões de toneladas
de lignina e compostos relacionados são produzidos como resíduos de efluentes de indústrias
de produção de papel e polpa de celulose (RAMOS et al., 2009), com a previsão que este
número aumente em um futuro próximo, dado o recente desenvolvimento de combustíveis
12
alternativos gerados da biomassa lignocelulósica que visam substituir o uso de derivados do
petróleo. Mesmo em biorefinarias que trabalham com processos de produção de
biocombustíveis, apenas a parte (hemi) celulósica é aproveitada, com o componente da
lignina limitado a resíduos de baixo valor (STEWART, 2008), ou então, para a geração de
calor e energia através da incineração (HIMMEL et al., 2007). Segundo Gosselink et al.
(2004), atualmente menos de 100 mil toneladas de lignina obtidas por ano a partir do processo
Kraft (processo industrial mais comum empregado na produção de papel e polpa de celulose)
é comercialmente explorado, desprezando as mais de 50-60 milhões de toneladas de lignina
geradas anualmente apenas por indústrias de papel (U.S. DEPARTMENT OF ENERGY,
2004; HOLLADAY et al., 2007; CHRISTOPHER, 2014). Assim, ao mesmo passo que o
desenvolvimento de tecnologias de despolimerização da lignina é importante para a produção
de energia sustentável (como é o caso do etanol de 2ª geração) e geração de produtos
químicos diferenciados e versáteis para a indústria em geral, o tratamento de seus resíduos (ou
análogos estruturais) industriais deve ser considerado igualmente importante e premente, dado
o acúmulo já existente dos mesmos no meio ambiente causado através da industrialização
histórica mundial.
A degradação biológica da lignina pode ser realizada tanto por fungos quanto por
bactérias. Enquanto que o processo de biodegradação por fungos ligninolíticos seja mais
conhecido e documentado, o conhecimento da biodegradação bacteriana da lignina ainda é
bastante incipiente e prematuro, com poucas linhagens ligninolíticas descritas e caracterizadas
até o momento (BANDOUNAS et al., 2011). A despolimerização da lignina por bactérias ou
outros seres vivos é desempenhado através de enzimas específicas, conhecidas como
ligninases ou LMEs (lignin-modifying enzymes), no qual as lacases fazem parte. As lacases
têm sido bastante exploradas em processos de tratamento e remoção de grande variedade de
poluentes liberados por efluentes de indústrias petroquímicas, têxtil, papel e celulose. Estudos
envolvendo a manipulação genética, a modificação de sítios catalíticos e o isolamento de
novas lacases vêm prometendo revolucionar o desafio de recuperação e tratamento de solos e
efluentes que estejam contaminados pelos chamados poluentes emergentes, classe de
contaminantes que incluem hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), clorofenóis,
bifenilas policlorados (PCBs), fenóis, herbicidas, pesticidas organofosforados, corantes e
compostos xenobióticos de difícil degradação no meio ambiente (PÉREZ, 2002;
13
RODRÍGUEZ et al., 2004; MARTÍNEZ et al., 2005; COUTO, 2006; TELLEZ-JURADO et
al., 2006; HUSAIN, 2008; CAÑAS, 2010; SANTHANAM et al., 2011).
Solos de florestas contém uma diversidade de genes de lacases, com grandes
diferenças em seus mecanismos de indução, grau de polimorfismo e propriedades cinéticas e
físico-químicas (massa molecular, ponto isoelétrico, teor de carboidratos) de seus produtos
proteicos (THEVENOT, 2010). Os fungos saprófitas, por exemplo, parecem exibir uma maior
diversidade de genes de lacases quando comparados aos micorrízicos, possivelmente devido à
maior variedade de fontes de carbono e matéria orgânica com os quais os saprófitos interagem
(CAÑAS, 2010). Analogamente, bactérias nativas de ambientes considerados extremos
também poderiam estar sujeitas a diferenças na estrutura dos seus genes de lacases em relação
a outras isoladas de demais ambientes naturais (FERRER et al., 2007). Devido às
particularidades extremas da Caatinga, é provável que os solos deste bioma guardem
isoformas de lacases bacterianas ainda desconhecidas, bem como novas propriedades
moleculares diferentes das lacases fúngicas ou bacterianas já conhecidas. Comunidades
bacterianas nativas do solo da Caatinga podem ter desenvolvido respostas adaptativas
específicas às condições extremas deste bioma, influenciando mecanismos de produção de
energia e a utilização de fontes de carbono que fossem mais complexas, como a lignina, da
qual as lacases estariam envolvidas. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a
influência da lignina na dinâmica da diversidade taxonômica de uma comunidade bacteriana
nativa do solo da Caatinga e o enriquecimento de bactérias que fossem potencialmente
ligninolíticas, realizando-se ao mesmo tempo a prospecção funcional e molecular de lacases
em isolados bacterianos e na comunidade bacteriana presente no solo.
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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O bioma Caatinga
Exclusivamente brasileiro, o bioma Caatinga abrange desde o norte do estado de
Minas Gerais até a região Nordeste do país (Figura 1), ocupando cerca de 70% desta região e
aproximadamente 11% do território nacional (850 mil km²) (MMA, 2003; GIULIETTI et al.,
2006). O nome “caatinga” tem origem Tupi-Guarani e significa “floresta branca”, condizente
com o aspecto da vegetação na estação seca, quando as folhas caem e apenas os troncos
brancos e brilhosos das árvores e arbustos permanecem na paisagem (ALBUQUERQUE &
BANDEIRA, 1995). A Caatinga pode ser caracterizada basicamente pelo predomínio da
vegetação xerófila e clima semiárido, com temperaturas que podem variar entre 24 e 28ºC
(SAMPAIO, 1995). Cerca de 27 milhões de pessoas vivem na região, a maioria carente e
dependente dos recursos do bioma para sobreviver (MMA, 2015b).
Figura 1. Localização do bioma Caatinga (Fonte: EMBRAPA, 2015).
As chuvas na região da Caatinga são distribuídas irregularmente ao longo do ano,
geralmente com índices pluviométricos anuais abaixo de 1000 mm e média de 750 mm. A
maioria das chuvas na região se concentra em três a cinco meses consecutivos, conhecidos
como período chuvoso, enquanto que em mais de seis meses a precipitação é muito baixa ou
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inexistente (período da seca severa), normalmente situada entre maio e novembro
(SAMPAIO, 1995; CHIANG, 2004). A Caatinga apresenta, ainda, muitas características
extremas dentre os parâmetros meteorológicos, como a mais alta radiação solar, baixa
nebulosidade, a mais alta temperatura média anual, as menores taxas de umidade relativa,
evapotranspiração potencial mais elevada, e, sobretudo, as precipitações mais baixas e
irregulares, limitadas, na maior parte da área, a um período muito curto no ano (LEAL et al.,
2003).
2.2 Geologia e geomorfologia
A maior parte da Caatinga é localizada nas depressões interplanálticas
(AB’SÁBER 1974), estendendo-se ao longo de pediplanos ondulados expostos a partir de
sedimentos do Cretáceo ou Terciário que cobriam o escudo brasileiro basal do período Pré-
Cambriano (Figura 2). Um grande processo de pediplanação (desenvolvimento de áreas
aplainadas) ocorreu durante o Terciário Superior e Quaternário inferior (COLE, 1960;
AB’SÁBER 1974), descobrindo as superfícies atuais de rochas cristalinas do Pré-Cambriano
(gnaisses, granitos e xistos) e gerando vestígios (inselbergs, serras ou chapadas, em ordem de
erosão decrescente) isolados de superfícies mais jovens pela Caatinga (LEAL et al., 2003).
16
Figura 2. Origem geomorfológica da Caatinga (Fonte: PROBIO, 2000).
Como resultado da origem do substrato da Caatinga (rochas pré-cambrianas
cristalinas e setores sedimentares localizados), os solos são pedregosos e rasos, com a rocha-
mãe escassamente decomposta a profundidades exíguas e muitos afloramentos de rochas
maciças (TRICART 1961; AB’SÁBER 1974; LEAL et al., 2003). A origem geomorfológica e
geológica da Caatinga levou à formação de mosaicos de solos complexos, de características
variadas mesmo dentro de curtas distâncias (SAMPAIO, 1995; LEAL et al., 2003). Porém,
certa predominância de solos marrons sem cálcio é verificada, freqüentemente vertissolos
com pedras e pedregulhos característicos na superfície (BEEK & BRAMAO 1968,
FIGUEIREDO-GOMES 1981; BAUTISTA, 1986). A formação de outros solos como
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entissolos (especialmente latossolos) também é comum; geralmente derivada da influência do
clima nas rochas-mãe. Embora a superfície das rochas desta formação geológica seja alcalina,
as chuvas irregulares da Caatinga provocam uma dissolução de suas bases, lixiviando-as e
criando, desse modo, o microambiente ácido típico do solo da Caatinga (LEAL et al., 2003).
2.3 Biodiversidade
O regime de chuvas altamente variável e imprevisível, secas, temperaturas
extremas e déficit hídrico preponderante têm modelado as vidas animal e vegetal particulares
da Caatinga, favorecendo a seleção de mecanismos adaptativos inerentes à biota local
(NIMER, 1977). Tal cenário evolutivo pode ter contribuído sobremaneira para que a Caatinga
apresente índices de biodiversidade inclusive mais altos que os registrados para outras
florestas secas do mundo (LEAL et al., 2005), sendo considerada a região semiárida mais
diversa do planeta. Estima-se que a Caatinga abrigue aproximadamente 178 espécies de
mamíferos, 591 de aves, 177 de répteis, 79 espécies de anfíbios e 241 de peixes, além de
pequenos vertebrados e milhares de invertebrados (Figura 3). Em relação à vegetação, as
fitofisionomias da Caatinga são muito variáveis, dependendo do regime de chuvas e do tipo
de solo, exibindo florestas altas e secas com até 15-20 metros de altura (“caatinga arbórea”)
até afloramentos de rochas com arbustos baixos e esparsos, com cactos e bromeliáceas nas
fendas (PRADO, 2003; MMA, 2015). Até 1991, dados levantados por Prado apontavam a
flora na Caatinga composta por 45 famílias, 199 gêneros e 437 espécies descritas, números
provavelmente maiores se considerados dados atuais da taxonomia vegetal neste bioma
(PRADO, 1991; TAYLOR, 2000). Estimativas do ICMBio também indicam alto grau de
endemismo na região, com pelo menos 380 espécies endêmicas na Caatinga (ICMBio, 2015).
Acredita-se, ainda, que o número real de espécies na Caatinga seja eminentemente maior, uma
vez que 41% da região nunca foram investigados e 80% permanecem sub-amostrados (MMA,
2007), correspondendo ao bioma brasileiro menos explorado cientificamente (LEAL et al.,
2005; SANTOS et al., 2011).
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Figura 3. Fauna e flora típicas da Caatinga. A Caatinga é caracterizada por alto grau de endemismo
florístico, com espécies da família Cactaceae particularmente numerosas em sua extensão. A fauna
concentra maior endemismo nos répteis, anfíbios e aves, porém mamíferos como o mocó (Kerodon
rupestres, foto superior direita) e o tatu-galinha (Dasypus novemcinctus, foto inferior direita) são
espécies remanescentes de linhagens evolutivas autóctones desta área (Fotos oriundas de Revista
FAPESP, Scientific American e Cristian Dimitrius®).
Resumidamente, a Caatinga pode ser caracterizada por florestas arbóreas ou
arbustivas, principalmente árvores e arbustos baixos, dos quais muitos apresentam espinhos,
microfilia e algumas características xerofíticas. Além da conservação da Caatinga ser
importante para a manutenção de padrões regionais e globais do clima, equilíbrio na
disponibilidade de água potável e solos agricultáveis, a sua biodiversidade ampara diversas
atividades econômicas voltadas para fins agrossilvopastoris e industriais, abrangendo tanto o
uso sustentável de seus recursos quanto a bioprospecção de moléculas biotecnologicamente
atrativas ao setor farmacêutico, cosmético, químico e alimentício.
Infelizmente, a Caatinga continua sendo desmatada de forma acelerada,
principalmente nos últimos anos, vítima de desenfreadas atividades extrativistas, chegando a
preocupantes 46% de sua área total, com alguns estados apresentando índices de
desmatamento inclusive maiores que as áreas preservadas (Figura 4). Além de ser um dos
ecossistemas menos conhecidos na América do Sul do ponto de vista científico (MMA 2015),
a Caatinga possui a menor extensão territorial protegida por unidades de conservação dentre
todos os biomas brasileiros (Figura 5) (LEAL et al., 2005; MMA, 2007), um sério risco tanto
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ao patrimônio genético inerente à sua biota como ao imenso potencial biotecnológico e uso
sustentável a ela associados, ao mesmo tempo que as pressões antrópicas se tornam crescentes
na região (CASTELLETTI et al., 2003).
Figura 4. Taxa de desmatamento da Caatinga por estado do Nordeste em 2013/2014.
Fonte: INPE (Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais), 2015.
Figura 5. Desmatamento da Caatinga. Retirado e traduzido de Revista FAPESP e MMA.
20
2.4 O solo e a microbiota da Caatinga
O solo é a principal fonte de carbono orgânico da Terra, abrigando a maior reserva
natural de microrganismos e variedade de nichos do planeta (WHITMAN, 1998). São
ambientes considerados complexos, tanto pelo extraordinário número de micro-habitats que
podem abrigar quanto pelas múltiplas interações de elementos físico-químicos (pH,
temperatura, umidade, estrutura das partículas, atividade biótica) possíveis ao longo de sua
extensão (ROESCH et al., 2007).
A diversidade microbiana presente em ecossistemas como o solo excede, de
longe, a de organismos eucarióticos superiores. Um grama de solo é capaz de abrigar até um
bilhão de microrganismos de milhares de espécies diferentes, representando um grande
reservatório natural de diversidade genética e bioquímica de um ecossistema (TORSVIK et al.
2002). No caso do solo da Caatinga, o conhecimento acerca da diversidade microbiana nativa
e o potencial biotecnológico a ela associada ainda é escasso (GANS et al, 2005), fato que se
torna mais preocupante com o uso contínuo da terra pelo homem para produção agrícola,
pastagem e extrativismo (INPE, 2015).
Segundo o monitoramento por satélite da Caatinga realizado pelo grupo de
Geoprocessamento do Centro Regional do Nordeste (CRN) do Instituto Nacional de
Pesquisas Espaciais (INPE), os Estados de Alagoas e Pernambuco revelaram a maior
percentagem de desmatamento entre as áreas mapeadas da Caatinga (Figura 6). Tal
monitoramento consistiu no mapeamento de aproximadamente 90 mil km², o que representa
14% dos seis Estados e 9,15% do total da Caatinga. O monitoramento quantificou as áreas de
vegetação natural e as alteradas, delimitando as áreas de produção agrícola, culturas perenes e
pastagens, entre outras; contabilizando em 40% de Caatinga Preservada, 45% de Caatinga
Degradada, 7,2% de Solo Exposto, 6,5% de lavoura e 0,7% de corpos d’água (Figura 7).
Embora o monitoramento ainda esteja em execução, tais índices de desmatamento já se
mostram alarmantes e ameaçadores à biodiversidade da Caatinga, uma vez que os mesmos
resultados nocivos provavelmente devem se repetir nos quase 90% do bioma que não
entraram neste mapeamento.
21
Figura 6. Monitoramento por satélite de desmatamento de áreas pertencentes ao bioma da
Caatinga. Fonte: INPE, 2015.
Figura 7. Uso e ocupação dos solos por estados do Nordeste. Fonte: INPE (Instituto Nacional de
Pesquisas Espaciais), 2015.
22
2.5 Micro-organismos termofílicos e enzimas termoestáveis
O clima semiárido da Caatinga propicia naturalmente a existência de micro-
organismos extremófilos, que sobrevivem a temperaturas entre 45 a 80º C (STETTER, 1996).
Com base na temperatura ótima de crescimento, os termófilos podem ser divididos em três
grupos: termotolerantes, que possuem temperatura ótima de crescimento próxima a micro-
organismos mesofílicos, mas são capazes de sobreviver à temperatura máxima de
aproximadamente 50º C; termófilos propriamente ditos, que tem uma temperatura ótima entre
50 e 70º C; e termófilos extremos (ou extremófilos), cuja temperatura ótima ultrapassa os
70ºC (WIEGEL, 1998; GAO, 2012). Micro-organismos termófilos podem fornecer um
importante reservatório natural para o screening de enzimas termoestáveis ou metabólitos de
interesse biotecnológico (VAN DEN BERG, 2003; GAO, 2012), uma vez que alguns
processos industriais que utilizam hidrólises enzimáticas sob altas temperaturas (como a
hidrólise de lignocelulose para a produção de etanol de 2ª geração) apresentam maiores
vantagens em relação a outros processos baseados no uso de enzimas de microrganismos
mesofílicos (TURNER, 2007; GAO, 2012). Além da própria vantagem da termoestabilidade
enzimática, outras vantagens têm sido reportadas na aplicação industrial de processos
termofílicos, tais como aumento da solubilidade de substratos poliméricos (maior
acessibilidade e penetração da enzima ao substrato), maior tolerância a solventes orgânicos,
redução dos riscos de contaminação bacteriana ou fágica e menor perda de atividade
enzimática (TURNER, 2007; GAO, 2012).
2.6 Lignina
A lignocelulose é o principal componente da biomassa do planeta, representando
cerca de metade da matéria produzida pela fotossíntese. É composta por três tipos de
polímeros: lignina, celulose e hemicelulose (PÉREZ, 2002). A lignina é o segundo
biopolímero mais abundante da Terra, representando a maior fonte de compostos aromáticos
vegetais presente em ecossistemas terrestres. Na natureza, a lignina é encontrada em plantas
gimnospermas e angiospermas, constituindo estruturalmente a parede celular de tecidos e
órgãos vegetais (Figura 8). A lignina representa ainda uma parte significativa na composição
de solos (pode chegar até 20%) de ambientes terrestres, como componente do próprio sistema
vegetal de raízes ou como resultado da deposição de folhas, brotos ou troncos; matéria
23
orgânica esta que será aproveitada por uma grande variedade de microrganismos do solo
(THEVENOT, 2010).
Figura 8. Representação esquemática de parede celular secundária vegetal. Cadeias lineares de
celulose e ramificadas de hemicelulose estão imersas em uma matriz de lignina formada por siringil,
guaiacil e p-hidroxifenil, unidades fenilpropanóides em uma variedade de subestruturas contendo éter
e ligações C-C, entre outras unidades. Ácidos cinâmicos (CA, ácido p-cumárico; FA, ácido ferúlico; e
SA, ácido sinapílico) também são mostrados, com alguns deles formando pontes de lignina em
carboidratos. Retirado e traduzido de (BIDLACK, 1992; MARTÍNEZ et al., 2009).
A lignina é um heteropolímero aromático complexo, constituído por unidades de
hidroxifenil-propanóides conectadas por ligações C – C e C – O – C (VALÁSKOVÁ, 2007),
formado principalmente por três álcoois precursores (Figura 9): álcool p-hidroxicinamil
(coumaril), que dá origem às unidades p-hidroxifenil (H) no polímero; álcool 4-hidroxi-3-
metoxicinamil (coniferil), que compõe as unidades guaiacil (G); e álcool 3-5- dimetoxi-4-
hidroxicinamil (sinaptil), que forma as unidades siringil (S) (FREUDENBERG, 1968). No
entanto, apesar de numerosos estudos realizados desde seis décadas atrás, até hoje a estrutura
da lignina (Figura 10) não foi completamente elucidada (GLAZER & NIKAIDO, 1995;
CHRISTOPHER, 2014).
24
\
Figura 9. Álcoois precursores da lignina (Traduzido de VELEZ, 2014).
A quantidade e a composição da lignina variam entre os táxons, tipos de células, e
camadas individuais da parede celular, sendo influenciadas por estímulos ambientais ou pelo
desenvolvimento vegetal (CAMPBELL, 1996). Embora existam exceções, a lignina de
angiospermas dicotiledôneas (hardwood) consiste principalmente em unidades G e S e
vestígios de unidades H, enquanto que a lignina de gimnospermas (softwood) é
majoritariamente composta de unidades G, com baixos níveis de unidades H (BOERJAN,
2003; CHRISTOPHER, 2014).
Figura 10. Estrutura central da lignina. Embora alguns grupos funcionais da lignina sejam
conhecidos, sua estrutura ainda não está completamente resolvida, sendo variável entre espécies
diferentes ou mesmo em um único indivíduo (Traduzido de VELEZ, 2014; estrutura proposta por
GLAZER & NIKAIDO, 1995).
25
A degradação biológica da lignina pode ser realizada tanto por bactérias quanto por
fungos, sendo estes últimos os organismos da subdivisão dos basidiomicetos os mais
estudados (SÁNCHEZ, 2009; BUGG et al., 2011). Embora as bactérias ligninolíticas não
sejam ainda bem estudadas, várias já foram descritas realizando a degradação da lignina e
metabolismo de compostos aromáticos dela derivados (CRAWFORD, 1980;
ZIMMERMANN, 1990; VICUNA et al., 1993; ARCHANA & MAHADEVANA, 2002;
CHEN et al., 2012; SHI et al., 2013), sendo elas pertencentes a grupos como α-Proteobacteria
(e.g., Sphingomonas spp.), γ-Proteobacteria (e.g., Pseudomonas spp.), Actinobacteria
(Rhodococcus, Nocardia e Streptomyces spp.) e Firmicutes (e.g., Bacillus spp.)
(PERESTELO et al., 1996; ZIMMERMANN, 1990; WENZEL et al., 2002; MASAI, 2007;
CANAS et al., 2007; BUGG et al., 2011; BANDOUNAS et al., 2011).
Kraft-lignin (KL) tem sido o principal composto químico utilizado como lignina
experimental para estudos de biodegradação microbiana da lignina (FORNEY & REDDY,
1979; FIECHTER, 1982; PERESTELO et al. 1996; MORII, 1995; BANDOUNAS et al.,
2011; CHEN et al., 2012; SHI et al., 2013). Kraft-lignin é um subproduto polimérico residual
do tratamento alcalino de sulfetos da lignocelulose, remanescentes da indústria de papel e
celulose, sendo a kraft-lignin considerado um monômero subestrutural da lignina (KUMAR,
2001; CHAKAR, 2004; CHEN et al., 2012). Sua degradação através de bactérias também tem
sido associada com enzimas e vias catabólicas de compostos aromáticos derivados da lignina,
como β-aril éter, bifenil, diarilpropano e fenilpropano (MASAI, 2007; RAJ, 2007; SHI et al.,
2013). O potencial ligninolítico ou de despolimerização da lignina por bactérias ou outros
seres vivos é desempenhado através de enzimas específicas, conhecidas como ligninases ou
LMEs (lignin-modifying enzymes).
2.6.1 Ligninases e a atividade ligninolítica
Dois tipos de sistemas enzimáticos microbianos extracelulares são conhecidos por
participarem da degradação da lignocelulose: o sistema hidrolítico e o sistema oxidativo.
Enquanto o primeiro é mediado por hidrolases e é responsável pela degradação da celulose e
da hemicelulose, o segundo atua no processo da despolimerização oxidativa da lignina, sendo
o único sistema ligninolítico conhecido que ocorre de forma extracelular. Este sistema,
mediado pelas ligninases, atua na oxidação de compostos fenólicos e não fenólicos da lignina
(PÉREZ, 2002; MARTÍNEZ et al., 2005).
26
Dentre as ligninases, duas famílias de enzimas ligninolíticas são responsáveis pelo
sistema oxidativo da biodegradação da lignina: as fenol-oxidases e as enzimas dependentes de
peróxido de hidrogênio. A lignina-peroxidase (LiP) e a manganês-peroxidase (MnP) são
enzimas dependentes de peróxido, enquanto que as lacases são cuproproteínas (proteína com
um ou mais íons de cobre como grupo prostético) independentes de peróxido (MARTÍNEZ et
al., 2005; SÁNCHEZ, 2009). As lacases têm recebido bastante atenção dos pesquisadores no
que se refere à biorremediação de solos e rios contaminados nas últimas décadas, graças à sua
natural capacidade de biodegradação de poluentes ambientais altamente recalcitrantes
(PÉREZ, 2002, COUTO, 2006; MAJEAU, 2010).
2.6.1.1. Lacases – as biocatalisadoras ecológicas
As lacases foram as primeiras enzimas ligninolíticas conhecidas no que diz
respeito à biodegradação da lignocelulose. Estão presentes em plantas, fungos (Pleurotus sp.,
Ganoderma sp., Trametes sp., etc), insetos e também em algumas bactérias, como nos
gêneros Bacillus (CLAUS, 1997; KOSCHORRECK et al., 2008; REISS, 2011), Streptomyces
(RAMACHANDRA, 1988; ENDO, 2003; MACHCZYNSKI et al., 2004) e Cupriavidus (SHI
et al., 2013). As lacases são fenol-oxidases de potencial redox baixo, funcionalmente diversas
e relativamente termoestáveis. São consideradas também biocatalisadoras sustentáveis, dado
que durante a biodegradação da lignina (oxidação de unidades fenólicas desta) apenas o
oxigênio do ar é utilizado para a ação da enzima, que gera água como subproduto da reação
(RODGERS et al., 2010).
Em indústrias de papel, o emprego das lacases na conversão de madeira a papel
(biopulping) e no processo de biobranqueamento (biobleaching) tem permitido uma maior
economia de energia elétrica e maior redução no uso de substâncias químicas, diminuindo a
carga de poluentes em águas residuais geradas por estas indústrias (COUTO, 2006; VELEZ,
2014). Outro exemplo é dado pelas indústrias têxteis, que também têm aplicado as lacases
tanto na síntese de corantes quanto na descoloração de efluentes. As lacases também têm sido
maciçamente exploradas para a produção de etanol de segunda e terceira geração, assim como
de outros biocombustíveis renováveis a partir da biomassa lignocelulósica, diante das
consequências ambientais atreladas ao uso dos combustíveis fósseis (CHANDRA et al., 2007,
2008; RAMOS et al., 2009).
27
Fungos basidiomicetos de podridão branca, como Trametes versicolor, tem sido
extensivamente estudados e atraentes candidatos às altas taxas de produção extracelular de
enzimas ligninolíticas. Por outro lado, muito pouco se sabe sobre o potencial de lacases
bacterianas para aplicações em biorremediação (MAJEAU, 2010; MARGOT et al., 2013).
Estudos recentes têm indicado que algumas lacases bacterianas podem ser altamente ativas e
estáveis a altas temperaturas e elevados níveis de pH e cloreto, contribuindo para o tratamento
de efluentes e remoção de poluentes emergentes. Lacases bacterianas poderiam, ainda, ser
superiores às suas contrapartes fúngicas no que diz respeito à especificidade,
termoestabilidade, manipulação genética e dependência de mediadores enzimáticos
(SHARMA, 2007; BUGG et al., 2011; DWIVEDI et al., 2011; REISS, 2011; MARGOT et
al., 2013).
2.7 Sequenciamento de DNA
O estudo da diversidade de comunidades microbianas a partir de amostras
ambientais através do uso de sequenciamento de nova geração (Next Generation DNA
Sequencing, NGS, também conhecidos como Deep Sequencing) tem permitido grandes
avanços no campo da ecologia e taxonomia microbiana (EDWARDS et al., 2006; RAES et
al., 2011). Ao contrário do sequenciamento de 1ª geração (Sanger), os sequenciamentos de
segunda (454-Roche, Illumina, SOLiD), terceira (HeliScope, SMRT) e quarta geração (Ion
Torrent) promovem o sequenciamento massivo de DNA em plataformas capazes de gerar
milhões de pares de bases em uma única corrida, com uma grande economia de tempo e
considerável velocidade, dados principalmente pela rápida amplificação in vitro de
fragmentos de DNA e elevada capacidade computacional de manipulação e reconhecimento
de sequências biológicas.
2.7.1 Plataforma Illumina
O sequenciamento na plataforma Illumina se baseia na tecnologia de
sequenciamento de DNA por síntese (sequencing by synthesis, SBS), utilizando DNA
polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. Este processo
também é referido como sequenciamento por término reversível, desempenhado pelo sistema
de sequenciamento Genome Analyser da plataforma Illumina, uma vez que é baseada em
28
terminadores de fluoróforo reversíveis. Este processo pode ser dividido em três etapas
principais: preparo da amostra de DNA (ligação de adaptadores), PCR em ponte (formação de
clusters) e sequenciamento propriamente dito. Inicialmente o DNA é fragmentado
aleatoriamente em vários fragmentos, dos quais suas extremidades são ligadas por
complementariedade a adaptadores (oligonucleotídeos) imobilizados geralmente em uma
superfície sólida de vidro, ou superfície de clonagem (flow cell), dividida em oito fileiras
(lanes) que podem ser utilizadas para o sequenciamento de até oito bibliotecas. Cada fileira
dispõe destes adaptadores fixados à superfície pela extremidade 5’, com a extremidade 3’
livre para a iniciação da reação de sequenciamento dos fragmentos imobilizados no suporte
por hibridização. Com a adição de nucleotídeos (dNTPs) não marcados e DNA polimerase,
inicia-se a amplificação em ponte (“bridge amplification”) ou PCR em fase sólida, que
consiste na ligação do adaptador da extremidade livre 3’ da molécula aderida ao suporte com
o seu oligonucleotídeo complementar, localizado no mesmo suporte. Tal ligação forma uma
estrutura em ponte que, uma vez fornecidos os reagentes necessários, dá-se o início da PCR
formando DNA de fita dupla, com a extremidade 3’ livre do oligonucleotídeo, servindo como
primer para a amplificação. Em seguida, desfaz-se a ponte desnaturando a dupla fita através
da elevação de temperatura, com uma fita simples da molécula de DNA permanecendo
ancorada à superfície, e repetindo-se a etapa de anelamento para a formação de novas
estruturas em ponte e novos ciclos de amplificação. Após uma série desses ciclos, serão
obtidos clusters de moléculas idênticas ligadas ao suporte, nos quais os fragmentos foram
amplificados milhões de vezes. A incorporação de nucleotídeos terminadores marcados com
fluoróforo reversíveis, junto à adição de primers e da DNA polimerase, inicia o ciclo de
sequenciamento, que com excitação à laser, propicia que a fluorescência emitida de cada
cluster seja capturada pelo dispositivo de leitura e interpretada como um dos quatro possíveis
nucleotídeos componentes da cadeia. O mesmo processo (incorporação de nucleotídeo
marcado, excitação e leitura) é repetido continuamente para cada nucleotídeo componente da
sequência, culminando na montagem da sequência completa de cada cluster (FEDURCO,
2006; SHENDURE, 2008; TURCATTI, 2008). O processo de sequenciamento Illumina é
resumidamente mostrado na Figura 11.
29
Figura 11. Procedimento ilustrativo do sequenciamento Illumina (Adaptado de RIZZI, 2012).
2.7.1.1. Sistema MiSeq
O sistema MiSeq de sequenciamento da plataforma Illumina é o único
sequenciador que pode produzir 2 x 300 paired-end reads (a distância aproximada que separa
uma read da outra é conhecida) em uma única corrida. O posicionamento conhecido das reads
favorece a sinalização da correta localização de ambos os fragmentos, permitindo o
alinhamento das sequências e a detecção precisa de variantes durante o sequenciamento. O
sistema MiSeq também é capaz de produzir cerca de 13,2 a 15 Gb de dados em um período 56
horas, considerando a extensão de reads (read length) de 2 x 300 bp. Embora o tamanho das
reads seja relativamente pequeno, o Illumina MiSeq é considerado um dos sequenciadores de
melhor rendimento e flexibilidade, tendo em vista a grande quantidade de dados gerados
(TURCATTI, 2008; FADROSH et al., 2014; ILLUMINA, 2015).
2.8 Análise da diversidade bacteriana através do gene RNAr 16S
O gene RNAr 16S é o principal marcador filogenético utilizado para a avaliação
da diversidade bacteriana em amostras ambientais. O fato do gene RNAr 16S ter presença
universal em procariotos, função gênica inalterada ao longo da história evolutiva (mudanças
aleatórias de sua sequência se tornam medidas relativamente acuradas de distância e tempo
evolutivo) e ser uma molécula suficientemente longa (~1,5 kb) para fins informacionais,
permite que o mesmo seja considerado um confiável cronômetro molecular e marcador
taxonômico (WOESE, 1987; WEISBURG et al., 1991; SPIEGELMAN, 2005).
30
Os 1550 pares de bases do gene RNAr 16S codificam para a molécula estrutural
do RNA ribossomal 16S, que consiste em oito regiões altamente conservadas (U1-U8) e nove
regiões variáveis (V1-V9) dentro do domínio bacteriano (JONASSON, 2002). A Figura 12
ilustra a estrutura secundária do RNAr 16S com suas regiões conservadas e variáveis. Pelo
fato de mecanismos de transferência lateral de genes RNAr 16S não serem evidentes (OLSEN
et al., 1986) e a estrutura do gene conter tanto regiões altamente conservadas quanto variáveis
(com diferentes taxas de evolução), sua sequência é bastante utilizada na identificação
taxonômica de comunidades bacterianas e inferência de relações evolutivas entre os
organismos (RAOULT, 2009).
Figura 12: Estrutura secundária do RNAr 16S, mostrando as 9 regiões hipervariáveis (V1 a V9)
na molécula. (Retirado de YARZA et al., 2014).
As regiões variáveis (ou hipervariáveis) do RNAr 16S, denominadas e
enumeradas de V1 a V9, possuem graus de variabilidade distintos entre si, específicas para
grupos taxonômicos de filos até espécies. Dado que as regiões V1, V3 e V6 apresentam maior
31
grau de variação em relação às outras, elas vêm sendo mais usadas para a inferência de
relações filogenéticas e estudos de diversidade de comunidades microbianas (NEEFS et al.,
1990; WEISBURG et al., 1991).
Para tornar possível a análise quantitativa e qualitativa do gene RNAr 16S em
uma comunidade bacteriana, torna-se necessário antes realizar o desenho de oligonucleotídeos
iniciadores específicos ao domínio (no caso, Bacteria) a que se destina, de forma que os
mesmos sejam complementares às regiões que flanqueiam as sequências hipervariáveis dos
seus organismos componentes (BAKER, 2003). De modo geral, tem-se empregado pares de
primers para a amplificação de diferentes regiões do gene RNAr 16S, dos quais em particular
os primers V3-F e V4R têm sido bastante utilizados para a avaliação da riqueza e abundância
taxonômica de comunidades bacterianas oriundas de solo (VON WINTZINGERODE et al.,
1997; SIPOS et al., 2007; MORALES, 2009; KLINDWORTH et al., 2013).
A avaliação da diversidade bacteriana em um ambiente natural, como o solo, pode
ser baseada em dois conceitos: riqueza (número de filotipos/taxa presentes em uma amostra) e
equitabilidade (distribuição de abundância relativa dos taxa). A riqueza é inferida atribuindo-
se à seqüência do gene RNAr 16S o conceito de Unidade Taxonômica Operacional
(Operational Taxonomic Unit – OTU ou filotipo), no qual a percentagem de divergência (ou
cut-off) de 1%, 3%, ou 5% entre as sequências dos nucleotídeos é utilizado como critério para
definir uma OTU. A diversidade da comunidade total de um único ambiente, ou α-
diversidade, muitas vezes é representada por curvas de rarefação, que simulam o número de
OTUs reconhecidos em uma amostra em função do esforço amostral. Curvas de rarefação
possibilitam a comparação da riqueza observada em diferentes amostras, uma vez que a
intensidade de amostragem leva em conta a quantidade de sequências analisadas e o
decréscimo da contagem de filotipos repetidos (HUGHES et al., 2001). Uma amostragem é
considerada estatisticamente confiável quando a curva de rarefação atinge um plateau,
saturando o número de espécies encontrado, significando, assim, que o esforço amostral
(número de sequencias obtidas) foi suficiente para revelar o número total de espécies (ou
OTUs) em uma dada amostra (MAGURRAN, 2005; ROESCH et al., 2007; RAOULT, 2009).
Ao contrário da α-diversidade, a medida de β-diversidade oferece uma
comparação da estrutura da comunidade (composição de grupos microbianos ou taxa e
abundância relativa) entre duas ou mais amostras ambientais. Os índices de β-diversidade
podem ser usados, por exemplo, para comparar duas ou mais comunidades bacterianas sob a
32
influência de um fator abiótico, através de várias ferramentas qualitativas (presença ou
ausência de taxa) e quantitativos (abundância de taxon), das quais a UniFrac constitui um
exemplo (LOZUPONE, 2005, 2008). Esta ferramenta é capaz de detectar qualitativamente
diferenças em linhagens bacterianas de acordo com sua abundância relativa entre
comunidades distintas, refletindo o nível de dissimilaridade entre elas (LIU et al., 2008;
LOZUPONE et al., 2007; RAOULT, 2009).
33
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo geral avaliar a influência da lignina na dinâmica
da diversidade taxonômica de uma comunidade bacteriana nativa do solo da Caatinga, assim
como investigar o potencial de degradação ligninolítico de membros desta comunidade. O
sucesso no enriquecimento de bactérias através da lignina poderia corroborar com a hipótese
que o solo da Caatinga é um ambiente nutricionalmente oligotrófico e pobre em matéria
orgânica, nas quais fontes de carbono mais complexas, como a lignina, poderiam consistir em
alternativas para a obtenção de energia por certos grupos bacterianos nativos do solo.
3.2 Objetivos Específicos
Enriquecimento de populações de bactérias potencialmente ligninolíticas a partir
de microcosmos do solo da Caatinga;
Avaliação da composição e diversidade taxonômica da comunidade bacteriana dos
microcosmos ao longo do período de enriquecimento, através do sequenciamento
massivo de amplicons de DNAr 16S e uso de recursos bioestatísticos;
Isolamento de bactérias dos microcosmos de solo da Caatinga ao longo de todo o
período de enriquecimento, utilizando-se meios seletivos específicos;
Triagem funcional e molecular dos isolados bacterianos para lacases, utilizando-se
reagentes específicos e primers degenerados, respectivamente.
34
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de coleta do solo
A coleta das amostras de solo foi coordenada pelo pesquisador Dr. Itamar Soares
de Melo (Embrapa/Jaguariúna) em conjunto com o doutorando Gileno Vieira Lacerda Jr.
(CPQBA/UNICAMP), realizada durante o final do período da seca (final de outubro de 2014),
pela equipe técnica da Embrapa no “Campo Experimental da Caatinga”, a 42 km do
município de Petrolina/PE, sede da Embrapa Semiárido (Figura 13).
Figura 13. Mapa geográfico da localização da Embrapa Semiárido (Fonte: EMBRAPA).
Com uma área de aproximadamente 2.067 hectares, o Campo Experimental da
Caatinga localiza-se na região do Submédio São Francisco, servindo como base física para o
desenvolvimento de pesquisas relacionadas à agropecuária dependente de chuva e manejo da
Caatinga. Três sub-amostras (aproximadamente 200 gramas cada uma) foram coletadas em
triplicata em uma profundidade de 0-10 cm a partir de perímetro delimitado para área de
coleta (Figura 14).
35
Figura 14. Localização por satélite e características da área de coleta (Foto tirada pelo Google
Earth).
4.1.1 Análise meteorológica
Os dados meteorológicos da Embrapa Semiárido foram pesquisados, referentes ao
período (2014) no qual o solo foi coletado e, também, referente aos anos de 2012 e 2013 para
certos parâmetros. Uma vez que os dados da Estação Experimental da Caatinga tiveram
apenas seus dados meteorológicos anotados a partir de agosto de 2015, a análise
meteorológica deste trabalho baseou-se na estação mais próxima, a Estação
Agrometeorológica de Bebedouro, a 20 km da sede da Embrapa Semiárido e a 40 km do
município de Petrolina/PE, igualmente localizada na região do Submédio São Francisco.
Foram analisadas a precipitação pluviométrica (mm), a evapotranspiração (mm), a
insolação (horas), a radiação solar global (Iy/dia), a temperatura (ºC) e a umidade relativa do
ar (%) para o ano de 2014, bem como 2013 e 2012 para certos parâmetros, de acordo com os
dados disponíveis pela Embrapa Semiárido (Figura 15).
36
Figura 15. Informações meteorológicas da Embrapa Semiárido. A seta vermelha indica o
momento aproximado pelo qual o solo utilizado para esta pesquisa foi coletado (Fonte: EMBRAPA
Semiárido).
A coleta do solo foi realizada no final de outubro, que coincide com o final da
época da seca na Caatinga, dado o aumento drástico de precipitação nos meses subsequentes
(Figura 15). A notável baixa pluviosidade, evapotranspiração potencial mais elevada e
menores índices de umidade relativa ao longo do ano corroboram com o período de estiagem
do bioma, normalmente situado entre os meses de abril a novembro. Neste momento do ano
foram registradas também as temperaturas mais altas ao longo do ano, com máximas
alcançando 34º C, provavelmente não sendo maiores devido à amenização pela umidade
relativa da região (~55%).
A longa estiagem na região neste período favorece a decomposição física das
rochas e o aspecto arenoso e pedregoso característico do solo da Caatinga em algumas
regiões, quando a disponibilidade de recursos é marcadamente reduzida. No que tange à
vegetação, a variação sazonal na disponibilidade de água determina, aparentemente, a
37
cobertura e o desenvolvimento sazonal das espécies tropicais. Segundo Giulietti et al. (2006),
durante a curta estação chuvosa é um pouco maior a presença do estrato herbáceo na
Caatinga, constituído principalmente por terófitas e geófitas, embora seja uma vegetação
bastante efêmera (GIULIETTI et al., 2006). Juntamente com as plantas lenhosas (ricas em
lignina e celulose) e suculentas, a vegetação da Caatinga caracteriza-se por apresentar alta
resistência à seca, devido principalmente ao desenvolvimento de diferentes mecanismos
anatomo-fisiológicos capazes de suportar a deficiência hídrica. Outras condições extremas
representadas pelos gráficos, como altas temperaturas e taxas de radiação solar intensificam o
intemperismo físico, a baixa retenção de água e a baixa produção de matéria orgânica dos
solos da Caatinga (RODAL, 2005), de forma que até mesmo as atividades fenológicas de
espécies vegetais, como floração, frutificação, queda e produção de folhas também são
afetadas pela seca (LIEBERMAN, 1982; REICH, 1995). É possível que a escassez na oferta
de recursos energéticos no bioma da Caatinga tenha propiciado uma fauna e uma microbiota
de hábitos mais generalistas, dotados de organismos mais adaptados a tal ambiente
oligotrófico. A lignina, neste contexto, poderia fornecer uma fonte de energia alternativa para
bactérias e outros microrganismos do solo capazes de degradá-la, uma vez que é rica em
carbono.
4.1.2 Análise físico-química do solo
A análise do solo se baseou na interpretação sugerida pelo Centro de Pesquisa e
Desenvolvimento de Solos e Recursos Ambientais, do Instituto Agronômico de Campinas
(IAC, 2015), de “Métodos de Análise Química, Mineralógica e Física de Solos do Instituto
Agronômico de Campinas” (CAMARGO et al., 2009). Foram analisados o pH do solo, a
umidade total, a matéria orgânica do solo (M.O.), o carbono orgânico (C.O.), o nitrogênio
total (N total), a acidez potencial (H + Al), a soma das bases trocáveis (SB), a capacidade de
troca de cátions (CTC), a saturação da CTC por bases trocáveis (V%) e a quantidade de
elementos químicos. A acidez potencial (H + Al) foi determinada pela acidez trocável e não-
trocável, sendo a primeira referindo-se aos íons Al³+ e H+ retidos na superfície dos coloides
do solo e a segunda o íon H+ de ligação covalente associado aos coloides em carga negativa e
aos compostos de alumínio. A soma das bases trocáveis (SB) consistiu no cálculo da soma
dos cátions Ca² + Mg² + K + Na, indicando o número de cargas negativas que estão ocupados
por bases nos colóides do solo. Por sua vez, a capacidade de troca de cátions (CTC) ou
capacidade tampão do solo é a medida do poder de adsorção e troca de cátions do solo,
38
refletindo a quantidade de cátions que um solo é capaz de reter por unidade de peso. Por fim,
a saturação da CTC por bases trocáveis (V%) expressa quanto por cento dos pontos de troca
de cátions no solo estão ocupados por bases, valor que abaixo de 50% indica um solo pouco
fértil.
4.2 Microcosmos e enriquecimento
Para que fosse possível avaliar a comunidade bacteriana nativa do solo da
Caatinga frente à exposição por lignina, bem como o isolamento de bactérias que exibissem
potencial capacidade ligninolítica e produção de lacases, foram simuladas condições
experimentais que reproduzissem parcialmente o ecossistema do solo da Caatinga, de forma a
se aproximar minimamente do ambiente original. Para isto, foram estabelecidos microcosmos
(DRAKE, 2011) em frascos Erlenmeyer contendo solo da Caatinga, isolados do meio externo
por algodões hidrofílicos e incubados à temperatura de 45ºC (Figura 16), simulando a
temperatura média do solo da Caatinga, que varia de 30 a 60ºC durante o maior período do
dia (MMA/UFPE, 2003).
Figura 16: Foto e ilustração dos microcosmos utilizados para o enriquecimento.
Os microcosmos foram divididos em duas condições: controle e enriquecido com
10% (m/m) de lignina (Lignin-alkali ou kraft, Sigma-Aldrich), cada condição composta por
três amostras (triplicata), gerando um total de seis microcosmos (três microcosmos controles e
três enriquecidos). De acordo com as especificações dos fornecedores, este tipo de lignina é
solúvel em água, contém 5% de impurezas de enxofre e tem uma média de peso molecular de
10.000 daltons (Sigma-aldrich, 2015).
39
Figura 17. Esquema da repartição das sub-amostras do solo da Caatinga para o experimento em
microcosmos.
Um total de 60 gramas de massa final foi estabelecido para cada microcosmo
(Figura 17), sendo 60 gramas de solo da Caatinga para a condição controle contida em um
frasco Erlenmeyer e 54 gramas de solo da Caatinga + 6 gramas de kraft-lignin para a condição
enriquecida (10% de lignina; m/m). Os solos enriquecidos foram homogeneizados a fim de
que a lignina se distribuísse igualmente entre as partículas do solo. Todo o processo de
enriquecimento foi monitorado por um período de 27 dias, e as amostras foram coletadas nos
dias 0, 9, 18 e 27 (pontos de amostragem), com o ajuste da umidade do solo nos microcosmos
sendo realizado a cada dois dias com 1 ml de NaCl 0,85% (NaCl no último dia = 0,16 ml/g de
solo). Assim, nos microcosmos enriquecidos (condição enriquecida) a lignina foi adicionada
logo ao 1º dia (início), enquanto que nos microcosmos controles não se deu qualquer adição
artificial de lignina, desde o primeiro até o último dia de amostragem. As amostras coletadas
dos microcosmos ao longo do enriquecimento foram submetidas ao isolamento de bactérias
potencialmente ligninolíticas, à avaliação da dinâmica da sua diversidade taxonômica
bacteriana e a ensaios funcionais e moleculares para a prospecção de lacases, tanto a partir de
isolados bacterianos quanto das comunidades bacterianas dos microcosmos. A Figura 18
ilustra o delineamento experimental geral deste trabalho de mestrado:
40
Figura 18. Delineamento experimental das principais atividades desenvolvidas.
4.2.1 Isolamento de colônias bacterianas potencialmente ligninolíticas
Para cada ponto de amostragem foi realizado o isolamento de bactérias
potencialmente ligninolíticas e a extração de DNA total do solo, respectivos ao microcosmo
(controle ou enriquecido) em questão. O isolamento consistiu na coleta de 1 grama de solo de
cada microcosmo e em cada tempo amostral e diluição seriada em solução salina (0,85%
NaCl). A partir de cada diluição, foi realizado o plaqueamento em meios de cultura
específicos, seguido de incubação a 45ºC durante um período de 3 a 5 dias. Após o
crescimento das bactérias ser visualizado, deu-se início ao processo de isolamento de culturas
puras e subsequente preservação dos isolados em solução de glicerol 20% a -80ºC. A Figura
19 ilustra o processo metodológico do isolamento bacteriano.
41
Figura 19. Esquema representativo do isolamento de microrganismos ligninolíticos.
4.2.1.1 Meios de cultivo
Meios de cultura específicos para o isolamento de bactérias ligninolíticas foram
preparados e adaptados com base em protocolos desenvolvidos por Bandounas et al. (2011) e
Shi et al. (2013). A composição dos meios de cultura utilizados neste projeto é mostrada na
Tabela 1.
Tabela 1. Composição dos meios de cultivo. Porcentagens expressas em (m/v).
Os meios de cultivo foram definidos com o intuito de verificar o grau de
dependência da lignina como recurso alimentar único aos microrganismos. Partindo desta
ideia, o meio LYB tenderia a ser o meio mais dificilmente assimilável que os demais, uma vez
42
que a principal fonte de carbono é a lignina, porém o mais favorável ao crescimento de
bactérias ligninolíticas. Por sua vez, o GLYB se diferencia do primeiro apenas pelo fato de
apresentar glicose em sua composição. A adição de glicose foi realizada não somente para
avaliar a preferência de microrganismos a uma fonte de carbono mais facilmente assimilável,
mas principalmente para verificar se o consumo da glicose poderia consistir em pré-requisito
(ou “start-up”) para o início da biodegradação de lignina. Por último, o meio LAN foi
designado com a finalidade geral de cultivo de uma larga variedade de bactérias, de modo a
suprir quantidades suficientes de nitrogênio, carbono, vitaminas e aminoácidos.
4.2.1.2 Diluição seriada
Para o isolamento de bactérias potencialmente ligninolíticas, 1 grama de cada
microcosmo em cada tempo amostral foi retirado e suspenso em 9 mL de solução salina
(0,85% de NaCl), agitando-se o conteúdo em um agitador de tubos tipo Vortex por 3 minutos.
A mistura foi deixada por duas horas no interior do fluxo laminar para uma melhor dissolução
do solo, procedendo-se então à diluição seriada de 10-1
a 10-6
gramas de solo por mL de
solução.
4.2.1.3 Plaqueamento
Inicialmente foram escolhidas todas as diluições (10-1
a 10-6
gramas de solo por
mL de solução) para plaqueamento, com o objetivo de selecionar aquelas que apresentassem
melhores resultados de crescimento bacteriano. Para isso, foi realizada a técnica de
espalhamento em superfície ou spread-plate, que se caracteriza pela retirada de uma alíquota
de 100 µL de cada diluição espalhando-a (com o auxílio de uma alça de Drigalski) sobre a
superfície do meio sólido contido em uma placa de Petri. Todas as placas foram vedadas por
filme PVC com o intuito de diminuir a desidratação dos meios, sendo em seguida incubadas a
45ºC em estufa bacteriológica durante um período de 5 a 10 dias, ou até que as colônias
fossem visualizadas.
4.2.1.4 Nomenclatura dos microcosmos
Os microcosmos foram identificados de modo a facilitar o reconhecimento e
monitoramento de todos os ensaios realizados, tais como isolamento e sequenciamento. A
identificação foi determinada por três caracteres, sendo o primeiro relativo ao dia de
43
enriquecimento (0 – início; 9 – 9º dia; 18 – 18º dia; 27 – 27º dia), o segundo a condição
avaliada (S – solo sem lignina; L – solo com 10% (m/m) de lignina) e o terceiro referente à
unidade da triplicata (1, 2 e 3; cada uma representando uma unidade da triplicata). Assim, por
exemplo, um microcosmo identificado como “9S2” refere-se à segunda unidade da triplicata
do microcosmo sem lignina relativo ao nono dia de enriquecimento, enquanto que “27L1”
refere-se à primeira unidade da triplicata do microcosmo com lignina relativo ao 27º dia de
enriquecimento.
4.2.1.5 Contagem de unidades formadoras de colônias
A contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) foi realizada para todas as
placas e todos os meios utilizados, de acordo com Neder (1992). O cálculo consistiu na
multiplicação do valor de UFC pelo valor da alíquota utilizada para o plaqueamento (como a
alíquota foi de 100 µL ou 0,1 mL, multiplicou-se por 10, uma vez que a técnica spread-plate
foi usada), dividindo-se o total pelo valor da diluição correspondente. Assim, tem-se que o
resultado é expresso em UFC por grama de solo, conforme a equação abaixo:
4.2.1.6 Construção da coleção de culturas bacterianas potencialmente
ligninolíticas isoladas do solo da Caatinga
Durante o desenvolvimento deste trabalho, foi construída uma coleção de culturas
bacterianas puras isoladas do solo da Caatinga que apresentassem potencial de biodegradação
ligninolítica. Todos os isolados foram preservados em solução de glicerol 20%, em duplicata
para criotubos e também em placas de 96 wells, ambos armazenados em ultrafreezer a -80ºC.
Todos os isolados foram numerados cardinalmente em ordem crescente de acordo com a
ordem cronológica do enriquecimento, para fácil acesso e consulta dos mesmos. Além do
registro das características macromorfológicas, todos os isolados foram fotografados
individualmente. As características referentes ao dia de amostragem, condição de incubação
(controle ou enriquecido com lignina), unidade da triplicata do microcosmo, meio de cultivo
específico e diluição do qual a bactéria foi isolada também foram registrados.
44
4.2.1.7 Descrição macromorfológica de colônias bacterianas
Abaixo estão listadas as principais características utilizadas na descrição
macromorfológica das colônias bacterianas (Koneman et al., 2006):
Tamanho: diâmetro em milímetros.
Aspecto: liso, butiráceo, quebradiço, membranoso, viscoso ou leitoso.
Cor: bege, branca, alaranjada, creme, marrom, bege-esbranquiçada, creme/esbranquiçada,
marrom-esbranquiçada, bege/marrom, bege/creme, bege/alaranjada, alaranjada/creme,
alaranjada/marrom, alaranjada/rosa, creme/marrom, branca-esverdeada ou creme-esverdeada.
Superfície: brilhante ou opaca.
Densidade: opaca ou translúcida.
Forma: circular, irregular, rizóide, filamentosa, puntiforme ou fusiforme.
Borda: liso, lobado, ondulado, filamentoso ou lacerado.
Estrutura: lisa, granulosa, rugosa e filamentosa.
Elevação: côncava, elevada, umbonada, umbilicada, pulvinada ou convexa.
Produção de pigmento (em meio Nutrient Broth): muito intensa (+++), intensa (++),
moderada (+) ou ausente (-).
4.3 Screening de lacases envolvidas na degradação de lignina
A triagem de lacases a partir dos microcosmos do solo da Caatinga foi realizada
utilizando-se a abordagem funcional, baseada na atividade bioquímica de descoloração ou
coloração de reagentes poliméricos que mimetizam a lignina. ABTS (2,2´azino-bis-3-
etilbenzotiazol-6-ácido sulfônico), Remazol Brilliant Blue R (RBBR) e Congo Red (CR)
foram os substratos utilizados para o teste de produção de lacases nas reações enzimáticas dos
isolados. O ABTS é um substrato não-fenólico que produz um radical cátion de coloração
azul-verde quando oxidado por lacases (PANNALA et al., 2001; HUANG et al., 2013). Por
sua vez, o RBBR consiste em um importante grupo de organopoluentes industriais, cuja
degradação (e consequente descoloração) é resultado da ação de enzimas que atuam no
processo de despolimerização da lignina, como a lignina peroxidase, a manganês peroxidase e
a lacase (OSMA, 2010). Por último, o Congo Red (Vermelho Congo) pertence ao grande
grupo de corantes diazo, podendo ser descolorido também na presença de lacases (TELKE,
2010; LIM, 2013).
O teste funcional para lacases foi realizado em meios sólido e líquido (em placas
de 96 poços). Para o ensaio em meio sólido, os isolados foram cultivados inicialmente em NB
(Nutrient Broth), meio universal utilizado com sucesso na obtenção biomassa celular de todos
45
os isolados em testes prévios. Os isolados foram incubados a 45 °C e agitados a 200 rpm por
aproximadamente 48 horas, sendo plaqueados em placas de Petri contendo o meio de cultivo
original (LYB, GLYB ou LAN) a partir do qual as bactérias foram isoladas, acrescido de
0.05% (50 mg/L) de RBBR (Sigma ®) ou 1 mM (25 mg/L) de ABTS. A seguir, os isolados
foram novamente incubados a 45ºC por um período de 24 a 72 hrs para a visualização dos
resultados. Já para os ensaios em meio líquido, os isolados foram cultivados em placas de 96
poços contendo meio NB, adicionado de 5% (50 mg/L) de RBBR, 1 mM de ABTS ou 1 mM
(25 mg/L) de Congo Red (testes realizados separadamente), por um período de 24 a 72 horas
a 45ºC e 120 rpm. O meio NB com os respectivos reagentes, porém sem o inóculo do isolado,
foi utilizado como controle negativo (metodologia adaptada do screening funcional de Lim,
2013). Tanto no ensaio em meio sólido quanto em meio líquido adicionou-se 1 mM de CuSO4
aos meios de cultivo, um conhecido indutor para a expressão de lacases (BANDOUNAS et
al., 2011). Os ensaios foram avaliados qualitativamente, adotando-se o princípio da
descoloração do Remazol Brilliant Blue R (RBBR) e do Congo Red, conforme Borokhov &
Rothenburger (2000) e Lim (2013); e do surgimento da coloração verde no caso do ABTS
(BOURBONNAIS, 1990; BANDOUNAS et al., 2011). Os padrões de referência esperados na
avaliação qualitativa podem ser visualizados na Figura 20.
46
Figura 20. Triagem funcional de lacases. Tanto a coloração (no caso do ABTS) quanto a
descoloração (para o RBBR e o Congo Red) podem funcionar como parâmetros indicativos
da ação de lacases no meio. A reação da lacase com o ABTS gera uma cor verde no meio,
enquanto que o RBBR e o Congo Red sofrem descoloração, ficando amarelo para o primeiro
e mais claro no segundo. Blank = Controle/Branco; as espécies listadas são fungos
produtores de lacases (Retirado de PANNALA et al., 2001 e LIM, 2013).
4.4 Extração de DNA
Tanto o DNA total dos microcosmos quanto o DNA genômico dos isolados,
provenientes de microcosmos enriquecidos com 10% de lignina, foram submetidos ao
procedimento de extração de DNA. A estimativa da concentração de DNA obtida foi
realizada através de eletroforese em gel de agarose na concentração de 1%, usando DNA do
fago lambda como padrão de concentração.
4.4.1 Extração de DNA total dos microcosmos
Para cada ponto de amostragem e condição de microcosmo foi coletado 1 grama
de solo, armazenado em microtubos a -20º C para posterior extração do DNA total. O DNA
total das amostras do solo da Caatinga foi extraído com o kit PowerMax Soil DNA Extraction
(MoBio), conforme as instruções do fabricante.
47
4.4.2 Extração do DNA genômico de isolados bacterianos
O DNA genômico das bactérias isoladas dos microcosmos enriquecidos com
lignina foi extraído após cultivo dos mesmos e avaliação de sua pureza. Após a centrifugação
de 40 mL do cultivo das bactérias por 5 minutos a 13.400 g, o sobrenadante foi descartado e
ao pellet foram adicionados 400 μL de TE 1X para a lavagem das células. O conteúdo foi
novamente centrifugado por 2 minutos a 13.400 g, e o sobrenadante descartado. Cerca de 5
μL de lisozima (100 mg/mL) foram adicionados às amostras, agitando-as no vórtex
brevemente e incubando-as por 1 hora a 37ºC. Em seguida, 67,5 μL de SDS 10% e 2,5 μL de
Proteinase K (10 mg/mL) – ambas pré-aquecidas a 65ºC – foram adicionados às amostras, e
estas foram agitadas rapidamente no vórtex e incubadas a 65ºC por 10 minutos. Em seguida,
foram adicionados 100 μL de NaCl 5 M e 100 μL de solução CTAB/NaCl, ambas soluções
pré-aquecidas a 65ºC, agitando-se as amostras no vórtex até que o conteúdo das amostras
apresentasse um aspecto líquido leitoso. Após incubação a 65ºC por 10 minutos, foram
adicionados 750 μL de clorofórmio/álcool isoamílico (1:24), seguido de agitação em vórtex
por 10 segundos e centrifugação das amostras a 13.400 g por 5 minutos. O sobrenadante (fase
aquosa) foi transferido para novos microtubos e 0,6 volumes (aproximadamente 450 μL) de
isopropanol foi acrescido em cada tubo, promovendo a precipitação do DNA por meio de
agitação por inversão. Depois de mantidas a -20ºC por 30 minutos, as amostras foram
centrifugadas à temperatura ambiente a 13.400 g durante 5 minutos, descartando-se o
sobrenadante e adicionando-se 500 μL de etanol 70% gelado (-20ºC). As amostras foram
novamente centrifugadas a 13.400 g por 5 minutos, descartando-se o sobrenadante e
deixando-se o pellet secar em temperatura ambiente. Finalmente, o pellet foi suspenso em 80
μL de água Milli-Q, e posteriormente tratado com RNAse (volume de 1,0 μL com
concentração de 10 mg/mL por amostra) sob 37ºC durante aproximadamente 1 hora. O DNA
das amostras foi armazenado a -20ºC para análises posteriores (adaptado de VAN
SOOLINGER et al., 1993).
4.5 Amplificação de genes bacterianos de lacases utilizando primers
degenerados
Os primers degenerados utilizados para detecção de genes bacterianos de lacases
através de reações de amplificação por PCR estão indicados na Tabela 2. Estes primers foram
utilizados com sucesso em estudos prévios para avaliar a diversidade e distribuição de lacases
48
bacterianas em solos, detectando uma grande variedade taxonômica entre bactérias produtoras
da enzima (KELLNER et al., 2008; AUSEC, 2011).
Tabela 2. Sequências dos primers degenerados utilizados para amplificação de genes
bacterianos de lacases.
Tanto as condições para amplificação quanto a concentração dos reagentes e DNA
molde foram seguidas de acordo com Ausec (2011), com o seguinte protocolo: desnaturação
inicial a a 94º C por 3 minutos, 30 ciclos de 30 segundos a 94º C, 30 segundos a 48º C, 1
minuto a 72º C e nessa mesma temperatura por mais 5 minutos. As reações foram conduzidas
em um volume final de 25 μL, contendo primers, dNTPs, BSA, MgCl2, 500 ng de DNA
molde, 1 X de PCR buffer e 1 U de Taq DNA polimerase. Posteriores tentativas adicionais
para amplificação foram realizadas, variando-se certos parâmetros da reação.
Como controle positivo da reação de PCR para os pares de primers degenerados
Cu1AF/Cu2R (KELLNER et al., 2008) e Cu1AF/Cu4R (AUSEC, 2011), foi utilizado um
gene inserido a um clone (E. coli EPI300) previamente detectado de uma biblioteca
metagenômica do solo da Caatinga, cedido gentilmente pelo doutorando em Genética e
Biologia Molecular da Unicamp Gileno Vieira Lacerda Júnior, do qual mantém o projeto
“Análise integrada de metagenômica e metatranscriptômica do solo da Caatinga e
prospecção de genes envolvidos na degradação de lignina”, supervisionado pela Dra. Valéria
Maia Merzel (orientadora deste trabalho) e auxiliado pela FAPESP (Proc. 13/09386-9). Este
gene foi sequenciado e identificado como membro pertencente à superfamília de proteínas
denominadas multicopper oxidases (MCOs), cujas lacases estão incluídas (REISS, 2011). A
busca por domínios conservados na proteína, realizada pelo Blast, detectou dois domínios de
ligação ao cobre, caracterizando-a uma multicopper oxidase tipo 2 ou tipo 3 (Figura 21).
Primer Aplicação Sequência (5’- 3’) Referência
Cu1AF Bacterial laccase-like genes diversity in soil
ACMWCBGTYCAYTGGCAYGG (KELLNER et al., 2008)
Cu2R Bacterial laccase-like genes diversity in soil
GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC (KELLNER et al., 2008)
Cu4R Bacterial laccase-like genes diversity in soil
TGCTCVAGBAKRTGGCAGTG (AUSEC, 2011)
49
Figura 21. Resultado da busca por domínios conservados na proteína lacase baseado nos
resultados obtidos por BLASTx.
4.6 Sequenciamento de DNA dos microcosmos
O DNA total extraído das amostras de solo dos microcosmos durante o
enriquecimento foi submetido à abordagem de sequenciamento massivo de amplicons do gene
RNAr 16S para análise de diversidade. O sequenciamento foi realizado pela plataforma
Illumina (Illumina 20k avg reads, 2x300 bp, MiSeq Platform) por firma especializada
(MRDNA - Molecular Research, Texas/USA). Os amplicons obtidos resultaram da
amplificação das regiões hipervariáveis V3 e V4 do domínio Bacteria, utilizando os primers
V3-F e V4-R, ou 341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) e 785R (5′-
GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) (Figura 22).
Figura 22. Esquema indicando os primers para a amplificação por PCR da região hipervariável
V3-V4 do gene RNAr 16S do Domínio Bacteria (Adaptado de FADROSH et al., 2014).
As amostras foram identificadas por barcodes (sequências únicas acopladas a uma
amostra de DNA em análise quando esta é sequenciada em mistura, o que permite identificá-
la após o sequenciamento), com os primers sendo acompanhados por adaptadores específicos
do sequenciamento MiSeq. Os amplicons gerados foram purificados, quantificados e
agrupados em proporção equimolar, sendo sequenciados após a amplificação por PCR em
fase sólida. Todo o processo de alinhamento e comparação de sequências foi seguido de
acordo com a pipeline padronizada pelo MRDNA, que consiste basicamente em: agrupamento
50
de sequências > depleção de barcodes > remoção de sequências quiméricas, de sequências
menores que 150 pb e de sequências com bases ambíguas > definição de OTUs (MRDNA,
2015). As sequências resultantes foram então analisadas por ferramenta de bioinformática
específica (QIIME).
4.7 Estimativas de riqueza e avaliação da diversidade taxonômica bacteriana
Os dados de sequenciamento foram utilizados como arquivo de entrada para o
software QIIME (versão 1.9), um programa especializado na análise da diversidade
taxonômica através do cálculo de índices de diversidade alfa e beta de microbiomas. A
abundância taxonômica utilizada pelo QIIME é baseada na definição de OTUs (Operational
Taxonomic Units - Unidade Taxonômica Operacional), a menor entidade taxonômica, que foi
representada, neste estudo, pelas sequências do gene RNAr 16S que apresentaram ≥ 97% de
similaridade (nível de espécie) (STACKEBRANDT, 1994). O agrupamento (clustering) de
sequências similares (OTUs) foi determinado pelo algoritmo uclust, que cria "seeds" de
sequências que geram clusters baseados na percentagem de identidade (3% de divergência ou
97% de similaridade) de sequências. A limpeza de reads foi realizada pelo programa
Trimmomatic (versão 0.35), a checagem de quimeras pelo usearch 8.1 (Gold database) e a
análise taxonômica pelo algoritmo pynast. A classificação taxonômica das OTUs foi realizada
utilizando-se o BLASTn contra banco de dados curados derivados do GreenGenes e NCBI
(BLASTn x GreenGenes e NCBI). Além disso, foram calculados pelo QIIME a diversidade
alfa e a diversidade beta dos microcosmos, com os dados do sequenciamento sendo
normalizados para ambas as análises (nº de sequências igual a 60.000). Para o cálculo da
primeira, foram utilizadas as curvas de rarefação e a contagem de espécies (OTUs)
observadas para se determinar a riqueza específica, bem como o estimador Chao 1, usado para
estimar a riqueza de espécies na amostra; enquanto que para a segunda empregou-se o
programa UniFrac (LOZUPONE, 2005, 2008).
Considerando que o tamanho populacional (OTUs) das amostras dos
microcosmos não é o mesmo entre elas, foi necessário utilizar uma técnica de rarefação de
modo a permitir a comparação das mesmas, calculando-se o número observado de espécies
em cada amostra de acordo com um tamanho padrão (BRUCE, 2011). A equação abaixo é
utilizada para se obter o número observado de espécies:
51
Onde E (S) é o número observado de espécies em uma amostragem aleatória, S é o
número total de espécies registradas, N é o número total de indivíduos registrados, Ni é o
número de indivíduos da espécie i, e n é o tamanho padronizado e escolhido da amostra
(BRUCE, 2011).
Estimativas de riqueza de espécies possibilitam estimar o número total de espécies
numa determinada comunidade a partir dos dados amostrais. A principal vantagem desses
estimadores é a disponibilidade de equações para o cálculo de limites de confiança da
estimativa. O método não paramétrico Chao 1, utilizado neste trabalho, foi calculado nos
mesmos níveis de distância genética das análises de rarefação, baseando-se na abundância de
OTUs únicas (singletons) e raras (doubletons) para estimar a diversidade de uma população
de tamanho desconhecido, com a equação representada abaixo:
Onde SChao1 é a estimativa de riqueza, Sobs é o número de espécies observadas, n1
é o número de OTUs representadas por apenas um indivíduo e n2 é o número de OTUs
representadas por apenas dois indivíduos (BRUCE, 2011).
Por fim, o índice de Shannon é utilizado para medir a diversidade de uma
comunidade, baseando-se na abundância proporcional das espécies (OTUs). Seu cálculo parte
da premissas que a população é indefinidamente grande ou efetivamente infinita, mas que
todas as espécies seriam representadas. O índice foi calculado de acordo com a equação:
Onde Sobs é o número de espécies observadas, Si é o número de sequências da
espécie/OTU (filotipo) i e N é o número de sequências amostradas (BRUCE, 2011).
52
4.8 Análises filogenéticas
A reconstrução filogenética de organismos (isolados) do Domínio Bacteria foi
baseada na amplificação dos primers 10F e 1100R do gene RNAr 16S (LANE, 1991; Tabela
3), com as sequências submetidas à busca por similaridade através de alinhamento local
(BLAST) no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e no RDP (através da ferramenta
SeqMatch) para a determinação dos vizinhos filogenéticos mais próximos. As sequências
foram alinhadas pelo programa MEGA6, através do algoritmo ClustalW (THOMPSON et al.,
1994; TAMURA et al., 2013). O método de reconstrução utilizado foi o Neighbor Joining
(SAITOU & NEI, 1987), com a opção de deleção completa ou pairwise deletion, em que
apenas os gaps de cada par das sequências que estão sendo comparadas foram ignorados no
processo de montagem. Já as matrizes de distância e similaridade foram calculadas através da
distância p (para cada duas sequências, a distância é um único valor com base na fração de
posições em que as duas sequências diferem), convertida em distância evolutiva pela correção
de Jukes & Cantor (JUKES & CANTOR, 1969; LEMEY, 2009). O número de acesso das
linhagens tipo mais próximas foi obtido com base na lista de nomes de linhagens tipo
caracterizadas e validadas taxonomicamente no LPSN (List of Prokaryotic names with
Standing in Nomenclature) (TINDALL et al., 2006), permitindo o uso das mesmas como
âncoras filogenéticas nas árvores. A topologia das árvores filogenéticas (enraizada e não
enraizada) resultantes foi analisada com um valor de bootstrap baseado em 1000 réplicas, a
partir da busca heurística (anteriorimente descrita) pelo MEGA6 (LEMEY, 2009; BRUCE,
2011).
Tabela 3. Sequências de primers utilizados para a amplificação do gene RNAr 16S de bactérias para a
construção da árvore filogenética dos isolados.
Primer Sequência (5’- 3’) Referência
10F GAG TTT GAT CCT GGC TCA G (LANE, 1991)
1100R AGG GTT GCG CTC GTT G (LANE, 1991)
53
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise físico-química do solo
O solo é um reservatório de nutrientes essenciais aos microrganismos, sendo que
vários elementos minerais não apenas constituem a biomassa microbiana, como também são
importantes para a realização de diversas reações metabólicas (síntese de enzimas, estrutura
do DNA e RNA, divisão celular, etc.) (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). A temperatura e o
pH também são fatores relevantes na distribuição e atividade dos microrganismos do solo.
Enquanto que a primeira afeta diretamente a fisiologia dos microrganismos e indiretamente
exerce mudanças no ciclo de nutrientes e atividade da água, o segundo influencia a
disponibilidade e toxicidade de nutrientes minerais, tais como Fe, Mn e Al. O material de
formação do solo, a exportação de bases trocáveis pelas plantas e a atividade microbiana de
decomposição da matéria orgânica (M.O.) também são capazes de modificar o pH do solo,
alterando consequentemente sua microbiota (LEITE & ARAÚJO, 2007).
A análise química e granulométrica das três sub-amostras (P1, P2 e P3) coletadas
do solo da Caatinga para este projeto foi realizada pelo “Laboratório de Análise de
Microbiologia do Solo”, pertencente à Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz –
ESALQ/USP (Tabela 4).
54
Tabela 4. Análise química e granulométrica do solo da Caatinga.
Parâmetros Sub-amostras
P1 P2 P3 Média
pH CaCl2 4,9 5,1 4,7 4,9
P (mg.dm -3
) 4 3 5 4
K (mmolc.dm -3
) 2,1 1,8 2,2 2,0
Ca (mmolc.dm -3
) 7 8 8 7,6
Mg (mmolc.dm -3
) 2 2 1 1,6
H+Al (mmolc.dm -3
) 20 20 20 20
SB (mmolc.dm -3
) 11,1 11,8 11,2 11,3
CTC (mmolc.dm -3
) 31,1 31,8 31,2 31,3
V (%) 16 37 36 29,6
B (mg.dm -3
) 0,19 0,24 0,2 0,2
Cu (mg.dm -3
) 0,5 0,4 1,1 0,6
Fe (mg.dm -3
) 21 14 17 17,3
Mn (mg.dm -3
) 5,9 10,1 8,6 8,2
Zn (mg.dm -3
) 0,3 0,5 0,3 0,3
M.O. (g.dm -3
) 13 14 14 13,6
C.O. (g.dm -3
) 8 8 8 8
N total (mg.kg -1
) 1204 896 798 966
UMIDADE TOTAL 0,38 0,38 0,35 0,37
Classe textural do solo: argiloso. Abreviaturas: H + Al = Acidez
potencial; SB = Soma das bases trocáveis; CTC = Capacidade de troca de
cátions; V = Saturação da CTC por bases trocáveis; M.O. = Matéria
orgânica; C.O.: Carbono orgânico; N total = Nitrogênio total
(CAMARGO et al., 2009). Umidade total = massa de 1kg de água por
1kg de solo.
Os teores de fósforo, potássio e magnésio podem ser classificados como baixos
em tipos de solos perenes como o da Caatinga, ao passo que o cálcio apresentou altos teores
(acima de 7 mmolc.dm-3
) nas três sub-amostras. Embora a baixa quantidade de cálcio esteja
associada geralmente com a acidez (solos deficientes em cálcio sendo extremamente ácidos);
deve-se ressaltar que deficiências de cálcio em solos são raras em condições de campo, sendo
difícil correlacionar corretamente a questão da deficiência de cálcio ao problema da acidez
excessiva. Assim, apesar do alto teor de cálcio no solo analisado, o valor do pH do solo em
CaCl2 apresentou indicativo de alta acidez, característico da Caatinga. Já elevadas
concentrações de Mn e Al são mais frequentemente encontradas em solos ácidos, cujos teores
são altos segundo os dados da tabela; ao contrário de solos alcalinos cujos elementos estão
indisponíveis (LEITE & ARAÚJO, 2007). Micronutrientes como B, Cu e Zn apresentaram de
baixo a médios teores no solo, enquanto que os teores de Fe e Mn podem ser considerados
55
relativamente altos. Por fim, a matéria orgânica (M.O.) do solo da Caatinga se apresenta como
moderada para solos arenosos, visto que se encontra praticamente na transição de
classificação considerada média (acima de 15 g/dm3).
5.2 Riqueza e diversidade bacteriana nos microcosmos
A riqueza e a diversidade da comunidade bacteriana presente nos microcosmos
foram avaliadas pela ferramenta computacional QIIME, com base nos dados gerados pelo
sequenciamento da região V3-V4 do gene RNAr 16S. As análises se deram de duas formas:
1) Comparando-se os microcosmos enriquecidos com lignina dos dias 9, 18 e 27
com o microcosmo controle do início (solo nativo, sem adição de lignina); e
2) Comparando-se os microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e
enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) existentes para um mesmo dia de amostragem.
Para a primeira forma, os dados de riqueza e diversidade são apresentados
comparando os microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 com o microcosmo controle
do início da amostragem, com solo nativo (original) e sem adição de lignina. Nesta forma,
foram calculadas as diversidades alfa e beta dos microcosmos, avaliando de que modo se
deu o impacto da ação da lignina ao longo do tempo, ou em outras palavras, quais
características foram preservadas, transformadas ou eliminadas nos microcosmos
enriquecidos com lignina em relação ao microcosmo controle inicial (sem adição de lignina).
Já para a segunda forma, os dados são apresentados comparando-se, para um mesmo dia de
amostragem (9º, 18º ou 27º), os microcosmos controles com os enriquecidos destes dias.
Excetuaram-se desta comparação os microcosmos controles (solo nativo, sem adição de
lignina) do início com os microcosmos recém-enriquecidos com lignina do primeiro dia, uma
vez que se partiu da premissa que a adição da lignina não causaria diferenças ecológicas
instantâneas e estatisticamente significativas à comunidade bacteriana presente no solo. Em
conta disso, os microcosmos “enriquecidos” do dia 0 (início) foram descartados. Preferiu-se
também agrupar as triplicatas de cada condição (controle e enriquecido) de cada dia de
amostragem, para melhor visualização dos resultados. Assim, levando-se em conta os dados
56
do sequenciamento da primeira forma, foi obtido um total de 419.418 sequências de alta
qualidade, sendo reconhecidas 36.439 OTUs deste valor (Tabela 5).
Tabela 5. Número de sequências e diversidade das comunidades bacterianas dos microcosmos do
ínicio e subsequentes dias de enriquecimento.
Início 9º dia com
lignina
18º dia com
lignina
27º dia com
lignina
Número de sequências
99701 90001 122902 106814
OTUs observados 19955 18673 11379 11405
Estimador Chao (0.03)
23667 20815 12797 11425
Índice de Shannon 11,52 11,09 7,88 7,86
Os resultados calculados mostraram valores de riqueza e diversidade maiores que
os encontrados na literatura para solo de rizosfera (GREMION, 2003) e da mata atlântica
brasileira (FAORO, 2010; BRUCE, 2010), embora estes trabalhos não tenham sido feitos por
sequenciamento em larga escala, como Illumina (caso deste trabalho de mestrado). No
entanto, nota-se que do início ao último dia de enriquecimento a quantidade de OTUs presente
na comunidade bacteriana dos microcosmos decaiu de 19.955 OTUs para 11.405 (Figura 23),
ocorrendo uma queda expressiva do 9º ao 18º dia. Pode-se dizer que a lignina desempenhou
um papel predominantemente negativo sobre a riqueza da comunidade bacteriana, inibindo o
crescimento e/ou a sobrevivência da maioria dos grupos taxonômicos originais. Embora os
valores do índice de diversidade tenham se mostrados mais altos que outros reportados na
literatura para solos Os resultados levantados mostraram, também, que houve considerável
redução na diversidade da comunidade bacteriana sob efeito da lignina ao longo do tempo,
queda expressa pelo Índice de Shannon (Tabela 5). Os dados mostram que os dois primeiros
dias de amostragem (início e 9º dia) apresentam valores de diversidade muito similares entre
si (~11), sendo posteriormente reduzidos para aproximadamente 7,8 nos dois últimos dias (18º
e 27º). Esta redução na diversidade, acompanhada ao mesmo tempo pela redução na
quantidade de OTUs ao longo do tempo, é um forte indício de que a comunidade bacteriana
sofreu uma grande perturbação em sua biodiversidade e estrutura. O impacto de uma
perturbação biótica ou abiótica dependerá de sua freqüência e intensidade com que a mesma
ocorre ou ocorreu (WILKINSON, 2002). No caso dos fatores bióticos, a interação entre os
microrganismos do meio (solo) do qual este está confinado (microcosmo) pode se dar por
57
competição pelo mesmo substrato ou fonte de energia, acarretando uma redução na
viabilidade ou taxa de natalidade de certos grupos e possível desparecimento de funções
ecologicamente importantes ao equilíbrio de um ecossistema (caso não haja mais de uma
espécie desempenhando papéis ecologicamente redundantes). Já abioticamente estes fatores
podem estar restritos à oxidação química de minerais do solo importantes para o metabolismo
bacteriano ou mesmo à diversificação local de condições ambientais, influenciando a
disponibilidade de nutrientes em micro-hábitats (heterogeneidade espacial de recursos). A
alteração nas condições ambientais de um (micro) ecossistema pode representar um tipo de
perturbação à sua comunidade biótica, exercendo pressão seletiva sobre ela (CALBRIX,
2005). No caso do enriquecimento, o input de lignina nos microcosmos significou um estresse
abiótico considerável na estrutura e abundância da comunidade bacteriana ali presente,
propiciando a preponderância de micro-organismos que tolerarassem ou minimizassem as
pressões seletivas ao longo do tempo (FIERER et al., 2010).
Figura 23. Riqueza nos microcosmos ao longo do enriquecimento. O gráfico mostra a quantidade
de OTUs presentes nos microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e no microcosmo controle do
primeiro dia (solo nativo; sem adição de lignina).
Para avaliar como a lignina interferiu na diversidade da comunidade bacteriana,
foram aplicados dois conceitos de cálculo de diversidade: a diversidade alfa (α) e a
diversidade beta (β). Enquanto a diversidade alfa se limita a calcular a diversidade em uma
mesma amostra/microcosmo, a diversidade beta compara a diversidade entre duas ou mais
amostras/microcosmos, indicando quais delas são mais similares ou distintas entre si.
A riqueza e a diversidade de organismos em uma comunidade são estritamente
dependentes do esforço amostral realizado, tendo em vista que o número de OTUs tende a
58
aumentar à medida que a quantidade de sequências-marcadoras (no caso, o gene RNAr 16S)
são analisadas. Neste sentido, medidas que estimem a riqueza (número de espécies ou OTUs)
permitem avaliar o quanto os dados amostrais representam a riqueza presente no ambiente,
além de oferecer também dados mais consistentes na realização de analogias ou estudos
comparativos entre comunidades. Tais medidas podem ser dadas através de curvas de
acumulação ou estimadores de riqueza. Nesse contexto, foram aplicadas curvas de
acumulação e o estimador de riqueza Chao1 para cada comunidade de microcosmo, adotando
um tamanho amostral (número de sequências/OTUs) padrão. A seguir, são apresentadas as
quantidades de OTUs em função do número de sequências analisadas (curva de acumulação,
Figuras 25 e 25) e a estimativa da riqueza das comunidades através do método não-
paramétrico Chao1 (Figuras 26 e 27).
59
Figura 24. Curva de rarefação mostrando o número de OTUs observado em função do número
de sequencias do gene RNAr 16S analisadas a partir dos microcosmos enriquecidos dos dias 9,
18 e 27 e do microcosmo controle (solo nativo). Painel (A): triplicatas das amostras foram analisadas
individualmente; Painel (B): triplicatas das amostras foram agrupadas antes da análise.
Os gráficos da Figura 24 mostram a significativa diferença entre o número de
OTUs dos dois primeiros dias (início e 9º dia) e dos dois últimos (18º e 27º dias), à medida
que o número de sequências analisadas e o tempo de exposição à lignina aumentam. Tal
resultado reforça a hipótese que a lignina influencia negativamente a riqueza bacteriana de
uma comunidade ao longo do tempo, mesmo que o input da mesma tenha se dado apenas uma
única vez no início do enriquecimento. Apesar da concentração de lignina (10% m/m)
adicionada ao microcosmo não ser comum em meios naturais, e a mesma corresponder a uma
forma prontamente disponível (lignin-alkali em pó), a diminuição no número de OTUs indica
que a maioria das bactérias que habitam o solo possivelmente não detém mecanismos capazes
de biodegradar, detoxificar ou tolerar a lignina quando em contato com as suas células,
levando à seleção de alguns grupos microbianos em detrimento de outros.
60
Por outro lado, os valores de riqueza observados nos microcosmos controles
(início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) foram comparados entre si para
cada dia de amostragem, cujos dados são expressos na Figura 25.
Figura 25. Curva de rarefação mostrando o número de OTUs observado em função do número
de sequencias do gene RNAr 16S analisadas, comparando os microcosmos controles (início, 9º,
18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de amostragem. As linhas
tracejadas mostram maior diferença na riqueza encontrada entre os microcosmos controles e
enriquecidos dos 18º e 27º dias de amostragem.
É possível notar que, para praticamente qualquer quantidade de sequências
analisadas (principalmente a partir de aproximadamente 25.000), a quantidade de OTUs na
condição controle é sempre maior que na condição enriquecida. Isto evidencia que a adição de
lignina impactou a comunidade bacteriana ao longo do tempo, sendo a menor diferença
encontrada no 9º dia e a maior no 27º dia (os microcosmos controles têm quase o dobro de
OTUs em relação aos enriquecidos, para mais de 60.000 sequências analisadas).
Os resultados obtidos pelo método não-paramétrico Chao1 corroboraram os
resultados observados nas curvas de rarefação. Os números de OTUs dos dois primeiros dias
de amostragem (início e 9º dia) são menores do que dos dois últimos dias (18º e 27º dias),
indicando novamente o impacto negativo da lignina sobre a riqueza da comunidade bacteriana
ao longo do tempo (Figura 26).
61
Figura 26. Estimativa de riqueza pelo método não-paramétrico Chao 1, comparando-se os
microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 com o início (solo nativo). Número de OTUs
estimado em função da quantidade de sequências do gene RNAr 16S analisadas, para as triplicatas
analisadas individualmente (A), ou com suas triplicatas agrupadas (B).
Assim como realizado na análise da riqueza observada, a estimativa de riqueza
pelo método Chao1 também comparou os microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e
enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de amostragem (Figura 27). Do mesmo modo,
maiores diferenças na estimativa de riqueza também foram encontradas entre os microcosmos
controles e enriquecidos à medida que o tempo de exposição à lignina aumenta, ou seja, nos
18º e 27º dias de amostragem.
62
Figura 27. Estimativa de riqueza pelo método não-paramétrico Chao 1, comparando os microcosmos
controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de amostragem.
As linhas tracejadas mostram maior diferença na riqueza estimada entre os microcosmos controles e
enriquecidos do 18º e 27º dias de amostragem.
A Figura 27 mostra que, para praticamente qualquer quantidade de sequências
analisadas (principalmente a partir de aproximadamente 25.000), a quantidade de OTUs na
condição controle é sempre maior que na condição enriquecida. Isto corrobora novamente
com a tese que a adição da lignina aos microcosmos impactou negativamente a riqueza da
comunidade bacteriana nativa do solo da Caatinga ao longo do tempo, reduzindo sua riqueza
no final para praticamente à metade do seu valor inicial. No entanto, uma vez que qualquer
distúrbio possui a capacidade de modificar o tamanho de uma comunidade, diminuindo o
número de indivíduos (OTUs) e a frequência como os mesmos são aleatoriamente amostrados
(PETRAITIS, 1989; MYERS et al., 2015), é necessário avaliar como a composição da mesma
foi afetada nos vários microcosmos, o que pode ser feito pelo cálculo da diversidade beta.
Uma perturbação, como a adição de lignina ao microcosmo, poderia aumentar a
convergência de espécies mais tolerantes ou causar divergência na composição de
comunidades através da formação de gradientes ambientais, que poderiam ser criados após a
introdução da lignina no habitat em questão (MYERS et al., 2015). Por conta disso, a
dissimilaridade na composição taxonômica entre as duas situações de estudo (controle e
adição de lignina) é bem explorada pela diversidade beta, dado que a heterogeneidade
ambiental entre ambas se evidencia principalmente pela quantidade de lignina adicionada
inicialmente ao microcosmo.
63
Nesse contexto, a diversidade beta entre todas as comunidades bacterianas dos
microcosmos/dias de enriquecimento foi calculada pela ferramenta QIIME, determinando-se
as distâncias entre os pontos de amostragem através do método UniFrac. A análise das
coordenadas principais (PCoA) foi realizada tanto na forma weighted (ponderada) quanto
unweighted (não ponderada), ambos representados pela ferramenta de visualização Emperor,
integrada ao QIIME. A principal diferença entre a forma ponderada e não ponderada baseia-se
na inclusão da abundância de OTUs no cálculo das distâncias entre as comunidades. Enquanto
a forma não ponderada (unweighted) toma todas as OTUs dos grupos em níveis iguais de
abundância, a forma ponderada (weighted) considera as OTUs de cada grupo com seus
específicos níveis de abundância nas comunidades, sendo assim mais coerente para estudos
biológicos, e a escolhida para representação (Figuras 28 e 29). Assim como nos gráficos de
alfa-diversidade, estão representados os microcosmos de forma individual (triplicatas separadas)
e com as triplicatas agrupadas, bem como a comparação dos mesmos em diferentes condições
para cada dia de amostragem.
Figura 28. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) da diversidade beta (via PCoA-UniFrac) entre
as comunidades bacterianas dos microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e início (solo nativo)
utilizando a ferramenta Unifrac ponderada (weighted). Painel (A): triplicatas das amostras foram
analisadas individualmente, Painel (B): triplicatas analisadas de maneira agrupada.
64
Na Figura 28, pode-se observar considerável distância entre os pontos
pertencentes a aparentemente dois grupos distintos: um abrangendo as amostras relativas ao
início e 9º dia de enriquecimento com lignina (dias iniciais) e outro abrangendo as amostras
relativas aos 18º e 27º dias de enriquecimento (dias finais). O grau de dissimilaridade entre os
dois grupos pode ser verificado pela distância entre os seus pontos representantes, sendo mais
expressiva quando as triplicatas das amostras são analisadas de maneira agrupada (Figura
28B). Destes resultados, podemos deduzir que do início ao 9º dia com lignina a comunidade
bacteriana não teve alterações significativas em sua estrutura e diversidade.
A diversidade beta (via PCoA-weighted-UniFrac) da comunidade bacteriana entre
os microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para
cada dia de amostragem também foi calculada e analisada, cujos resultados estão mostrados
na Figura 29.
Figura 29. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) da diversidade beta (via PCoA-UniFrac) entre
as comunidades bacterianas dos microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º,
18º e 27º dias) para cada dia de amostragem utilizando a ferramenta Unifrac ponderada (weighted).
Na Figura 29, percebe-se que há a formação de três grupos distintos, dos quais o
primeiro consiste das amostras relativas ao início + 9º dia de solo enriquecido; o segundo
engloba as amostras relativas ao 9º dia de solo sem lignina + 18º dia de solo sem lignina +
27º dia de solo sem lignina, e o terceiro grupo engloba as amostras relativas ao 18º dia de
solo com lignina + 27º dia de solo com lignina. Estes resultados sugerem que do início ao 9º
dia com lignina não houve alterações significativas na estrutura e diversidade da comunidade
bacteriana. Ainda, a comunidade bacteriana dos microcosmos sem lignina parecem ter se
diferenciado relativamente da comunidade inicial, mantendo-se constante depois nos 9º, 18º e
65
27º dias, isto é, não apresentarando relevantes diferenças na diversidade bacteriana entre si. Já
o terceiro grupo (microcosmos enriquecidos dos dois últimos dias de amostragem) se mostra
bastante disperso em relação aos demais, sugerindo uma diferenciação mais profunda na
comunidade bacteriana em relação ao início do experimento e em relação aos microcosmos
sem lignina. Isto se deu provavelmente em função da pressão seletiva exercida pela lignina,
que favoreceu apenas grupos de bactérias capazes de tolerar e/ou utilizar a lignina como fonte
de carbono, partilhando, assim, poucas características em comum com o início do
enriquecimento.
De maneira geral, é possível observar que houve duas situações distintas às quais
a comunidade bacteriana presente no microcosmo esteve sujeita: uma relativa ao início do
enriquecimento e outra ao final, estágio pelo qual os efeitos da lignina já são mais intensos.
Além da própria heterogeneidade na composição taxonômica existente entre os microcosmos,
a diversidade beta mostra alterações na microbiota ao longo do tempo, resultantes
principalmente da ação da lignina e esgotamento nutricional do ecossistema, dado que a troca
de componentes dos microcosmos com o meio externo é praticamente nula.
O diagrama de Venn mostra o número de OTUs exclusivas e compartilhadas entre
os microcosmos enriquecidos dos diferentes pontos de amostragem (Figura 30).
Figura 30. Diagrama de Venn mostrando as OTUs exclusivas e compartilhadas entre as comunidades
bacterianas dos microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e do início (solo nativo).
66
Na Figura 30 é possível notar que 4684 OTUs são unicamente exclusivas ao
primeiro dia de amostragem (início), ao passo que apenas 1883 OTUs são exclusivas ao
último dia de amostragem (27º dia). Isto não significa que tais OTUs não estavam presentes
nos outros dias anteriores, mas que possivelmente a abundância destas na comunidade
bacteriana aumentou significativamente ao longo do enriquecimento, permitindo sua detecção
ao final do experimento através do sequenciamento Illumina.
Outra observação que merece destaque é que das 19.995 OTUs existentes no
primeiro dia de amostragem (Figura 23), 953 (Figura 30) permaneceram até o 27º e último dia
de enriquecimento, sendo a maioria (~95,2%) erradicada pela exposição à lignina ao longo do
tempo. No entanto, apesar da lignina ter exercido um papel devastador na riqueza da
comunidade, nem todos os grupos taxonômicos bacterianos sofreram impacto negativo em
sua abundância na comunidade. Muitos deles não só sobreviveram ou toleraram a influência
da lignina ao longo do tempo, mas sim se beneficiaram após o input da mesma nos
microcosmos, como detalhado a seguir.
5.3 Afiliação taxonômica de comunidades bacterianas dos microcosmos
A introdução de lignina aos microcosmos proporcionou evidentes mudanças na
abundância de grupos taxonômicos ao longo do tempo, interferindo na composição da
microbiota respectiva. Embora os microcosmos mimetizem parcialmente um ambiente a partir
de condições controladas, eles foram projetados como sistemas isolados do meio externo,
determinados pela ciclagem limitada de materiais (e elementos) em seu interior. Por conta
disso, é mais provável que variações na estrutura e diversidade de uma comunidade bacteriana
tenham sido estimuladas estritamente pelas condições ou perturbações internas que foram
propositalmente induzidas ao microcosmo, como adição de lignina, temperatura elevada
(45ºC) constante e duração do processo de enriquecimento (dias), com as devidas
consequências associadas (por exemplo, ocorrência de intemperismo químico ou
decomposição dos minerais do solo). Para investigar como a comunidade bacteriana foi
impactada mediante tais fatores, em termos de diversidade, procedeu-se a análise taxonômica
em diferentes níveis de organização, buscando, se possível, grupos que pudessem funcionar
como marcadores ou preditores das alterações.
Os dados gerados pelo sequenciamento Illumina da região V3-V4 do gene RNAr
16S de comunidades bacterianas presentes nos microcosmos, durante o enriquecimento,
67
foram avaliados para os níveis taxonômicos de filo, família e gênero, este último com a mais
profunda resolução taxonômica analisada. Embora a análise dos dados em nível de espécie
tenha sido realizada para a determinação das OTUs, ela não foi incluída na descrição e
discussão dos resultados neste item, uma vez que o número de espécies determinado para
todos os microcosmos, incluindo aquelas com abundâncias menores que 0,1%, tornaram esta
tarefa inviável.
Neste sentido, o número de OTUs correspondentes aos níveis taxonômicos filo,
família e gênero foi analisado durante o enriquecimento concomitante à identificação de seus
representantes, considerando sequências do gene RNAr 16S com similaridade igual ou maior
a 95% como pertencentes ao mesmo gênero, igual ou maior que 90% como pertencentes à
mesma família e igual ou maior que 80% como pertencente ao mesmo filo. Sequências
desconhecidas foram assim denominadas pelo QIIME pelo fato de não apresentarem
alinhamento com sequencias de RNAr 16S disponíveis nos bancos de dados.
A seguir, inicialmente cada nível taxonômico dispõe de informações, análises e
gráficos da variação da diversidade nos microcosmos enriquecidos (dos 9º, 18º e 27º dias de
amostragem) em relação ao início do processo de enriquecimento (sem adição de lignina),
enquanto que, em um segundo momento, os dados dos microcosmos enriquecidos dos 9º, 18º
e 27º dias são comparados com os microcosmos controles para cada um destes dias de
amostragem. Do mesmo modo, excetuaram-se da análise taxonômica os microcosmos
controles (solo nativo, sem adição de lignina) do início com os microcosmos recém-
enriquecidos com lignina do primeiro dia. Todas as triplicatas de cada condição (controle e
enriquecido) referentes a um mesmo dia de amostragem também foram reunidas em uma
única amostra (média percentual das triplicatas).
Em geral, nossos resultados mostraram uma notável variação na abundância de
grupos taxonômicos ao longo do tempo, em diferentes níveis e etapas. Basicamente,
observou-se a repressão de alguns grupos taxonômicos em detrimento da sucessão de outros
ao longo do enriquecimento, em diferentes proporções. A seguir, cada nível taxonômico é
abordado individualmente para análise de seus representantes e discussão dos dados.
5.3.1 Estrutura das comunidades bacterianas em nível de filo
As sequências obtidas dos microcosmos foram distribuídas em 34 filos, com 14
deles apresentando abundâncias médias totais (em todos os microcosmos) maiores que 0,1%.
68
A Tabela 6 lista os principais filos encontrados do início ao fim do enriquecimento. Assim
como em outras tabelas de níveis taxonômicos, para cada dia de amostragem é mostrada a
média percentual de determinado grupo taxonômico, calculada a partir de seus valores
representativos nas triplicatas. Além disso, é expressa também a percentagem média total de
cada grupo taxonômico tendo-se em base todos os dias do enriquecimento.
Tabela 6. Distribuição dos principais filos encontrados do início ao fim do enriquecimento do solo
com lignina.
Filos % média total Início 9º dia com
lignina
18º dia com
lignina
27º dia com
lignina
Actinobacteria 37,2% 33,56% 43,26% 34,23% 37,73%
Proteobacteria 21,7% 20,5% 18,73% 22,96% 24,63%
Firmicutes 16,6% 2,26% 4,23% 32,2% 27,53%
Acidobacteria 7,3% 14,0% 10,43% 3,23% 1,66%
Chloroflexi 6,9% 9,7% 9,96% 3,26% 4,73%
Gemmatimonadetes 2,6% 5,13% 3,13% 1,0% 0,93%
Planctomycetes 2,1% 4,16% 2,56% 0,9% 0,9%
Verrumicrobia 2,0% 3,66% 2,9% 1,0% 0,63%
Bacteroidetes 1,7% 3,6% 2,03% 0,53% 0,46%
Nitrospirae 0,3% 0,63% 0,36% 0,16% 0,13%
Cyanobacteria 0,3% 0,66% 0,63% 0,0% 0,0%
Elusimicrobia 0,1% 0,16% 0,1% 0,03% 0,0%
TM7 0,1% 0,2% 0,2% 0,03% 0,06%
WPS-2 0,1% 0,2% 0,2% 0,0% 0,0%
Obs.: As porcentagens referentes aos dias de amostragem (início, 9º, 18º e 27º dia) correspondem à
média das porcentagens das respectivas triplicatas. A porcentagem média total é a média aritmética de
todas as porcentagens do grupo apresentada em todos os microcosmos, considerando a média das
triplicatas.
Considerando a percentagem média total, os filos mais comuns de todos os
microcosmos foram Actinobacteria (37,2%), Proteobacteria (21,7%) e Firmicutes (16,6%),
sendo os dois primeiros responsáveis por mais da metade dos filos encontrados (Tabela 6).
Acidobacteria (7,3%), Chloroflexi (6,9%), Gemmatimonadetes (2,9%), Planctomycetes
(2,1%), Verrucomicrobia (2,0%) e Bacteroidetes (1,7%) aparecem em seguida, com valores
intermediários a raros. Por outro lado, Cyanobacteria, Elusimicrobia, Nitrospirae, TM7 e
WPS-2 apresentaram-se como filos excepcionalmente raros dentre os demais em praticamente
69
todos os dias de enriquecimento, com índices percentuais menores que 1%. Os dados relativos
aos filos bacterianos estão ilustrados na Figura 31.
Os resultados de diversidade de filos bacterianos chamam principalmente a
atenção para o aumento na abundância do filo Firmicutes a partir do nono dia de
enriquecimento, subindo de aproximadamente 2-4% do início e 9º dia até 27-32% nos dias
18º e 27º, além do aumento discreto do filo Proteobacteria (Figura 31). Este proeminente
aumento na quantidade de OTUs fez com que o filo Firmicutes passasse de uma das menores
percentagens de abundância na comunidade dos primeiros dois dias de amostragem (início e
9º dia) para o segundo filo mais abundante nos dias 18º e 27º, ficando atrás apenas do filo
Actinobacteria, que dominou os microcosmos durante todo o período de enriquecimento. O
aumento do filo Firmicutes é bastante visível quando comparado aos outros filos bacterianos
que decresceram em abundância na comunidade do início ao último dia, como nos casos dos
filos Acidobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Cyanobacteria, Elusimicrobia,
Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, TM7, Verrumicrobia e WPS-2. Quase
metade destes filos apresentavam abundâncias menores que 2,0% nos dois primeiros dias de
amostragem, decaindo para índices próximos à zero até o final do enriquecimento (27º dia). Já
outros filos que exibiram percentagens superiores a 2,0% nos dois primeiros dias de
amostragem, como Chloroflexi, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes, Planctomycetes e
Verrumicrobia, tiveram suas abundâncias reduzidas a índices menores que os iniciais ao
decorrer do enriquecimento. Por outro lado, os filos Actinobacteria e Proteobacteria
mantiveram aproximadamente as mesmas abundâncias em todos os dias amostrados, com
leves flutuações entre os valores médios percentuais. Isto indica que ambos não parecem ter
sido afetados pela manutenção da temperatura constante de 45º C ou introdução da lignina,
sugerindo a existência de possível tolerância as tais condições entre os seus representantes.
70
Figura 31. Gráfico de área mostrando a diversidade de filos bacterianos presentes nos microcosmos
enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e início (solo nativo).
Já os dados dos filos bacterianos referentes à comparação entre os microcosmos
controles com os enriquecidos para cada um dos dias de amostragem (9º, 18º ou 27º) são
representados na Figura 32 (gráfico de barras).
Figura 32. Gráfico de barras mostrando a diversidade de filos bacterianos presentes nos microcosmos
controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) existentes para cada dia de
amostragem.
71
Os dados da Figura 32 mostraram resultados interessantes quanto aos filos
Actinobacteria, Firmicutes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes e Chloroflexi. A abundância
de Actinobacteria mostrou-se maior com a adição de lignina nos dias amostrados em relação
aos microcosmos controles. Tal comportamento pode ser explicado pelo filo possuir
representantes com características tolerantes à lignina, como espécies do gênero Streptomyces
(RAMACHANDRA, 1988; ENDO, 2003; MACHCZYNSKI et al., 2004), capazes de
degradar bioquimicamente o composto. Firmicutes é outro filo que aparece de forma
expressiva nos microcosmos enriquecidos, principalmente nos dias 18º e 27º, apresentando
um enriquecimento expressivo em seus níveis de abundância sob o efeito da lignina. Os
principais responsáveis por este aumento são espécies do gênero Bacillus (PERESTELO et
al., 1996; CLAUS, 1997; MARTINS et al., 2002; RUIJSSENAARS & HARTMANS, 2004;
RAJ, 2007; KOSCHORRECK et al., 2008; REISS, 2011; BANDOUNAS et al., 2011;
CHANG et al., 2014; MIN et al., 2015), das quais algumas espécies como B. subtilis
(CHANG et al., 2014; MIN et al., 2015) e B. pumilus (PERESTELO et al., 1996; REISS,
2011) têm sido descritas como ligninolíticas. Já os filos Acidobacteria, Gemmatimonadetes e
Chloroflexi mostraram redução de seus níveis de abundância sob o efeito da lignina, ao passo
que nos controles os níveis praticamente se mantém os mesmos ao longo da amostragem.
5.3.2 Estrutura das comunidades bacterianas em nível de família
A avaliação taxonômica dos microcosmos em nível de família resultou na
verificação de 177 famílias bacterianas, das quais 133 apresentaram abundâncias médias
totais (em todos os microcosmos) maiores que 0,1%. A Tabela 7 fornece as principais
famílias encontradas do início ao fim do enriquecimento, com suas proporções exibidas
graficamente na Figura 33.
As famílias mais abundantes (média percentual total de todos os dias de
amostragem) durante o enriquecimento foram: Rubrobacteraceae (8,4%),
Sporolactobacillaceae (7,9%), Alcaligenaceae (6,1%), Streptomycetaceae (6,0%) e
Bacillaceae (4,0%). Com médias percentuais um pouco mais baixas, aparecem as famílias:
Gaiellaceae (2,7%), Micromonosporaceae (2,7%), uma família desconhecida pertencente à
classe Chloracidobacteria (2,4%); Rhodospirillaceae (1,8%), uma família desconhecida da
classe Acidobacteria (1,6%) e Sphingomonadaceae (1,4%).
72
Membros das famílias Sporolactobacillaceae, Alcaligenaceae, Streptomycetaceae
e Bacillaceae apresentaram considerável aumento de suas abundâncias na comunidade nos 18º
e 27º dias, com as maiores delas registradas pelas famílias Streptomycetaceae (subindo de
aproximadamente 0,8% nos dois primeiros dias de amostragem para 10-11% nos últimos) e
Alcaligenaceae (passando de 0,1-0,2% nos dois primeiros dias de amostragem para 10-13%
nos últimos). Já famílias como Rubrobacteraceae, Rhodospirillaceae e Sphingomonadaceae
exibiram queda na abundância relativa nos últimos dias de amostragem em comparação ao
início do enriquecimento, enquanto que outras como Gaiellaceae e Micromonosporaceae
aparentemente oscilaram de forma estável entre 1,5-4,0 %.
Algumas características podem ser levantadas a partir da literatura sobre as
famílias mais comuns encontradas durante o enriquecimento. A família Sporolactobacillaceae,
pertencente ao filo Firmicutes, é conhecida por possuir bactérias tanto aeróbicas quanto
fermentativas, muitas das quais sendo termófilas, isoladas majoritariamente do solo e da água
(MADIGAN et al., 2010; BERTRAND, 2015). Outra família pertencente ao filo Firmicutes é
a Bacillaceae, que consiste de bactérias em forma de bastonete formadoras de esporos,
responsáveis pela disseminação ubíqua e abundante deste grupo tanto em ambientes aquáticos
quanto terrestres (solo). Seus membros podem ser tanto aeróbicos quanto anaeróbicos
restritivos ou facultativos (NAZINA et al., 2001; MADIGAN et al., 2010). Rubrobacteraceae
e Streptomycetaceae, por outro lado, são famílias do filo Actinobacteria. Enquanto a primeira
família é bastante conhecida por conter espécies do gênero Rubrobacter, tolerantes a altos
níveis de radiação ionizante (FERREIRA et al., 1999), a segunda é frequentemente associada
ao gênero Streptomyces, considerado o mais representativo e numeroso em espécies da
família como um todo (ANDERSON, 2001; MADIGAN et al., 2010). Alcaligenaceae, por
último, pertence ao filo Proteobacteria e ordem Burkholderiales, cujos membros são
encontrados no solo, na água, em animais e humanos (GARRITY et al., 2005; MADIGAN et
al., 2010). Uma espécie (Comamonas sp. B-9) desta ordem foi descrita como capaz de
degradar a lignina (CHEN et al., 2012).
73
Tabela 7. Distribuição das principais famílias encontradas do início ao fim do enriquecimento do solo
com lignina.
Famílias % média total Início 9º dia com
lignina
18º dia com
lignina
27º dia com
lignina
Rubrobacteraceae 8,4% 10,03% 12,1% 6,1% 5,23%
Sporolactobacillaceae 7,9% 0,23% 0,8% 15,93% 14,5%
Alcaligenaceae 6,1% 0,2% 0,13% 13,2% 10,7%
Streptomycetaceae 6,0% 0,73% 0,8% 11,66% 10,63%
Bacillaceae 4,0% 0,5% 3,33% 8,16% 6,1%
Gaiellaceae 2,7% 2,96% 4,16% 1,53% 2,1%
Micromonosporaceae 2,7% 2,3% 4,06% 2,16% 2,06%
Família desconhecida da
classe Chloracidobacteria
2,4% 0,5% 3,23% 1,03% 0,36%
Rhodospirillaceae 1,8% 2,06% 2,83% 1,0% 1,03%
Família desconhecida da
classe Acidobacteria
1,6% 2,96% 2,2% 0,96% 0,43%
Sphingomonadaceae 1,4% 2,1% 2,13% 0,66% 0,8%
Obs.: As porcentagens referentes aos dias de amostragem (início, 9º, 18º e 27º dia) correspondem à
média das porcentagens das respectivas triplicatas. A porcentagem média total é a média aritmética de
todas as porcentagens do grupo apresentada em todos os microcosmos, considerando a média das
triplicatas.
Figura 33. Gráfico de área mostrando a diversidade de famílias bacterianas presentes nos
microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e início (solo nativo).
74
Por sua vez, a comparação dos dados referentes às famílias bacterianas entre os
microcosmos controles e enriquecidos para os mesmos dias de amostragem mostrou
significativas diferenças nos níveis de abundância de certas famílias (Figura 34, gráfico de
barras). Para as famílias Sporolactobacillaceae e Bacillaceae (ambos pertencente ao filo
Firmicutes), Streptomycetaceae (filo Actinobacteria), Acetobacteraceae e Alcaligenaceae
(ambos pertencentes ao filo Proteobacteria), as abundâncias foram maiores nos microcosmos
enriquecidos, para um mesmo dia de amostragem. Tais diferenças são bastante visíveis nos
18º e 27º dias de amostragem, nos quais tais famílias chegam a ultrapassar 10% de
abundância na comunidade. Por outro lado, Sphingomonadaceae e Xanthomonadaceae
(ambos pertencentes ao filo Proteobacteria) indicam potencialmente uma influência negativa
da lignina sobre o crescimento e sobrevivência bacteriana, uma vez que nos microcosmos
controles tais famílias apresentaram maiores quantidades de OTUs do que nos ensaios
enriquecidos. Essa influência negativa pode ter ocorrido de forma direta ou indireta, neste
último caso através da dominância de outros grupos taxonômicos que seriam desfavoráveis ou
antagônicos às suas presenças na comunidade (FIERER et al., 2010).
Figura 34. Gráfico de barras mostrando a diversidade de famílias bacterianas presentes nos
microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de
amostragem.
75
5.3.3 Estrutura das comunidades bacterianas em nível de gênero
Por último, as sequências obtidas dos microcosmos foram analisadas em nível de
gênero, sendo confrontados 231 gêneros conhecidos com os dados do sequenciamento, em que
161 deles apresentaram abundâncias médias totais (em todos os microcosmos) maiores que 0,1%.
A Tabela 8 lista os principais gêneros encontrados do início ao fim do enriquecimento.
Alguns gêneros identificados pelo sequenciamento dos microcosmos ao longo do
enriquecimento foram: Rubrobacter, Streptomyces, Bacillus, Kaistobacter, Rhodoplanes,
Paenibacillus, Dyella, Balneimonas, Flavisolibacter, Pseudonocardia, Geodermatophilus e
Amycolatopsis. No entanto, também se verificou a presença significativa de gêneros
desconhecidos pertencentes a vários níveis taxonômicos. Exemplos deles foram gêneros não
identificados das classes Acidobacteria e Chloracidobacteria; das ordens Micrococcales,
Solirubrobacterales, Acidimicrobiales e Rhizobiales; e das famílias Acetobacteraceae,
Conexibacteraceae, Rhodospirillaceae, Thermogemmatisporaceae, Sporolactobacillaceae,
Alcaligenaceae, Gaiellaceae e Bacillales, com as respectivas abundâncias detalhadas na
Tabela 8. Tais resultados destacam a presença de uma diversidade bacteriana ainda
desconhecida e inexplorada, que pode guardar importantes informações ecológicas,
metabólicas e filogenéticas de seus componentes em resposta à indução por lignina. Embora a
técnica de sequenciamento da região V3-V4 do DNAr 16S não esteja isenta de artefatos ou
outros fatores responsáveis pela perda de informação biológica, ela permite com segurança a
percepção de mínimas diferenças de diversidade taxonômica bacteriana ao longo de um
processo contínuo, demonstrando de maneira robusta a variação da abundância de uma
comunidade ao longo do tempo. Além da classificação de espécies com base na comparação
das OTUs com sequências de organismos conhecidos depositadas em bases de dados
públicas, o sequenciamento do gene RNAr 16S torna possível a detecção de novas espécies
bacterianas ainda não reconhecidas na literatura, que podem representar grande potencial ou
aplicabilidade no ramo industrial, sustentável e biotecnológico.
Embora a completa identificação de todos os representantes ao longo do
enriquecimento não tenha sido possível, nossos dados mostram uma variação considerável da
abundância relativa de certos gêneros bacterianos ao longo do tempo, passando de uma
comunidade relativamente homogênea no início para uma mais heterogênea na presença de
lignina. Na Figura 35, é possível reconhecer pelo menos quatro gêneros bacterianos com
abundância significativa ao longo do enriquecimento: Bacillus, Streptomyces, Rubrobacter e,
76
mais sutilmente, Dyella. Enquanto Rubrobacter se destaca no início e 9º dia enriquecimento,
ele não é mais o único gênero a se sobressair dos demais nos 18º e 27º dias, sendo
acompanhado por outros gêneros mais ou menos abundantes, como Streptomyces, Bacillus e
Dyella, além de vários outros desconhecidos. Dentre os gêneros que não foram identificados,
embora reconhecidos até certo grau taxonômico e que exibiram expressivo aumento de
abundância nos 18º e 27º dias de amostragem, temos: um gênero desconhecido da família
Alcaligenaceae, um desconhecido da família Sporolactobacillaceae e outro da família
Acetobacteraceae; assim como outros gêneros não identificados pertencentes à família
Bacillaceae.
Os gêneros Rubrobacter, Streptomyces, Bacillus e Dyella incluem bactérias que
são normalmente isoladas do solo. Entre estes, Bacillus e Streptomyces são os gêneros mais
comumente encontrados na natureza, com o maior número de espécies conhecidas
(MADIGAN et al., 2010; GRAUMANN, 2012) e representantes capazes de biodegradar a
lignina (RAMACHANDRA, 1988; PERESTELO et al., 1996; CLAUS, 1997; MARTINS et
al., 2002; ENDO, 2003; RUIJSSENAARS & HARTMANS, 2004; MACHCZYNSKI et al.,
2004; RAJ, 2007; KOSCHORRECK et al., 2008; REISS, 2011; BANDOUNAS et al., 2011;
CHANG et al., 2014; MIN et al., 2015).
77
Tabela 8. Distribuição dos principais gêneros encontrados do início ao fim do enriquecimento do solo com lignina.
Gêneros % média total Início 9º dia com
lignina
18º dia com
lignina
27º dia com
lignina
Rubrobacter 7,8% 9,26% 11,33% 5,7% 4,8%
Desconhecido da família Sporolactobacillaceae
7,8% 0,2% 0,8% 15,83% 14,4%
Desconhecido da família Alcaligenaceae
6,0% 0,2% 0,13% 13,0% 10,56%
Streptomyces 5,7% 0,63% 0,7% 11,43% 10,2%
Bacillus 3,4% 0,4% 1,03% 7,23% 3,6%
Desconhecido da ordem Micrococcales
2,9% 1,7% 2,8% 3,16% 3,76%
Desconhecido da família Gaiellaceae 2,7% 2,96% 4,16% 1,53% 2,2%
Desconhecido da ordem Solirubrobacterales
2,6% 3,03% 3,66% 1,76% 1,96%
Outros gêneros da família Bacillales 2,5% 0,8% 1,2% 3,13% 4,83%
Desconhecido da classe
Chloracidobacteria
2,4% 5,0% 3,23% 1,03% 0,36%
Desconhecido da família
Acetobacteraceae
2,0% 0,66% 0,43% 1,2% 5,7%
Desconhecido da classe Acidobacteria 1,6% 2,96% 2,2% 0,96% 0,43%
Desconhecido da família Conexibacteraceae
1,4% 2,23% 2,16% 0,43% 0,6%
Desconhecido da família Rhodospirillaceae
1,3% 1,83% 2,1% 0,7% 0,56%
Desconhecido da família Thermogemmatisporaceae
1,1% 2,0% 1,73% 0,23% 0,2%
Kaistobacter 1,0% 1,43% 1,4% 0,53% 0,63%
Desconhecido da ordem
Acidimicrobiales
1,0% 0,46% 0,83% 1,0% 1,2%
Rhodoplanes 0,9% 1,53% 1,4% 0,33% 0,3%
Paenibacillus spp. 0,9% 0,13% 0,13% 2,23% 1,03%
Dyella 0,8% 0,03% 0,0% 1,66% 1,56%
Balneimonas 0,8% 1,16% 1,26% 0,4% 0,4%
Flavisolibacter 0,7% 1,43% 0,8% 0,23% 0,26%
Pseudonocardia spp. 0,7% 0,6% 0,73% 0,46% 1,13%
Outros gêneros da ordem Rhizobiales 0,7% 0,9% 1,06% 0,23% 0,3%
Geodermatophilus 0,2% 0,23% 0,36% 0,13% 0,23%
Amycolatopsis 0,2% 0,16% 0,1% 0,3% 0,43%
Obs.: As porcentagens referentes aos dias de amostragem (início, 9º, 18º e 27º dia) correspondem à média das
porcentagens das respectivas triplicatas. A porcentagem média total é a média aritmética de todas as
porcentagens do grupo apresentada em todos os microcosmos, considerando a média das triplicatas.
O gênero Bacillus inclui bactérias gram-positivas e formadoras de endósporos,
podendo ser aeróbias ou anaeróbias facultativas (GRAUMANN, 2012). Embora não
dominante, o gênero mostrou resultados interessantes durante o período compreendido pelo
enriquecimento. Um pico de abundância no 18º dia (7,23%) foi verificado, ao mesmo tempo
78
em que a abundância de Rubrobacter e certos grupos eram reduzidos e outros eram
aumentados (e.g., Streptomyces e demais gêneros desconhecidos da família
Sporolactobacillaceae e Alcaligenaceae). É viável supor que Bacillus tenha se beneficiado de
uma condição específica no microcosmo, dada provavelmente pela morte de demais grupos
taxonômicos. Assim, tanto os fatores abióticos quanto bióticos influenciaram de alguma
maneira a dominância ecológica dos gêneros Bacillus e Streptomyces a partir do 18º dia.
Provavelmente estes gêneros que dominaram os microcosmos com lignina são tolerantes a
este composto ou mesmo capazes de degradá-lo e usá-lo como fonte de carbono. Ou
alternativamente, puderam ainda ser detectados em função do fato de conseguirem esporular e
tolerar condições adversas por longos períodos (ANDERSON, 2001). Várias espécies de
Bacillus tem indicado a biodegradação de lignina (CHANDRA et al., 2007, 2008; REISS,
2011; CHANG et al., 2014; MIN et al., 2015) e demonstrado a atividade de lacases, tais como
B. sphaericus (CLAUS, 1997), B. subtilis (MARTINS et al., 2002; CHANG et al., 2014; MIN
et al., 2015), B. halodurans (RUIJSSENAARS & HARTMANS, 2004), B. licheniformis
(KOSCHORRECK et al., 2008, KOSCHORRECK, 2009); B. pumilus (REISS, 2011) e B.
tequilensis (SONDHI et al., 2015).
Em geral, solos arenosos como o da Caatinga são favoráveis ao desenvolvimento
de Streptomyces, uma vez que teoricamente fornecem condições mais aeróbias do que solos
alagadiços (MADIGAN et al., 2010). O gênero Streptomyces é constituído por bactérias
filamentosas, gram-positivas e aeróbias estritas, com a maioria delas formadora de esporos
(conídios). Também denominado de estreptomicetos, mais de 500 espécies de Streptomyces
são reconhecidas, majoritariamente habitantes do solo, muitas das quais são produtoras
importantes de antibióticos e biomoléculas de interesse biotecnológico (ANDERSON, 2001;
MADIGAN et al., 2010). A maioria dos estreptomicetos produz enzimas hidrolíticas
extracelulares capazes de degradar polissacarídeos (amido, celulose e hemicelulose), proteínas
e gorduras. Outras linhagens também conseguem utilizar a fonte de carbono disponível em
hidrocarbonetos, lignina, tanino e borracha, consistindo em um grupo bacteriano de extrema
versatilidade enzimática. Um único isolado pode ser capaz de degradar mais de 50 fontes de
carbono distintas (ANDERSON, 2001; MADIGAN et al., 2010). Algumas espécies de
Streptomyces têm sido reportadas desempenhando atividade ligninolítica através de
ligninases, como Streptomyces viridosporus (CRAWFORD, 1983; RAMACHANDRA,
79
1988), Streptomyces griseus (ENDO, 2003) e Streptomyces coelicolor (MACHCZYNSKI et
al., 2004).
Já os gêneros Rubrobacter e Dyella abrangem um número bem menor de
espécies, com a filogenia de seus representantes pouco conhecida. Enquanto o primeiro
pertence à classe Actinobacteria e é mais conhecido por apresentar linhagens radiotolerantes
(R. radiotolerans) e termofílicos (R. xylanophilus); o segundo só foi descoberto a partir de
2005 entre isolados do solo, pertencente à família Xanthomonadaceae e com seis espécies
descritas até o momento (ANANDHAM et al., 2011).
Os gêneros desconhecidos que mostraram expressivos níveis de abundância nos
18º e 27º dias de amostragem são referidos como pertencentes às famílias Alcaligenaceae,
Acetobacteraceae, Sporolactobacillaceae e Bacillales. Embora potencialmente representantes
de gêneros novos, tais bactérias constituem parcelas significativas na comunidade no final do
enriquecimento, principalmente aquelas pertencentes às famílias Alcaligenaceae e
Sporolactobacillaceae que, ao lado do gênero Streptomyces, são responsáveis pelas maiores
abundâncias relativas nos microcosmos enriquecidos dos últimos dias (18º e 27º). Vale
ressaltar o grau de variação de tais grupos taxonômicos ao longo do enriquecimento, dado que
os mesmos se encontravam em abundâncias ínfimas no início do processo.
O gênero desconhecido da família Alcaligenaceae passa de desprezíveis valores
de 0,1-0,2% de abundância relativa no início e 9º dia de enriquecimento para 10-13% e
segunda maior abundância nos 18º e 27º dias. Caso semelhante se observa para o gênero
desconhecido da família Sporolactobacillaceae, que de 0,2-0,8% de abundância relativa nos
dois primeiros dias de amostragem passa para índices percentuais próximos a 15% nos dois
últimos dias, detendo ainda a maior abundância na comunidade neste período. Similarmente,
o gênero Streptomyces passa de 0,7% de abundância no início e 9º dia de enriquecimento para
10-11% nos dois últimos dias, correspondendo a terceira maior abundância relativa da
comunidade neste período.
80
Figura 35. Gráfico de área mostrando a diversidade de gêneros bacterianos presentes nos
microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e início (solo nativo).
Por fim, a comparação dos dados referentes aos gêneros bacterianos entre os
microcosmos controles e enriquecidos dos 9º, 18º e 27º dias de amostragem pode ser
observada na Figura 36.
81
Figura 36. Gráfico de barras mostrando a diversidade de gêneros bacterianos presentes nos
microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) existentes para
cada dia de amostragem.
A partir dos dados, nota-se que certos gêneros, como Streptomyces, Bacillus e
outros desconhecidos das famílias Sporolactobacillaceae, Acetobacteraceae e Alcaligenaceae
exibiram níveis de abundância expressivamente maiores nos microcosmos enriquecidos frente
aos controles, para o mesmo dia de amostragem analisado. Tais grupos possuem grandes
chances de abrigar espécies ligninolíticas ou que se relacionam, de certa maneira, com a
biodegradação da lignina, dada a larga superioridade e dominância na abundância na
comunidade quando na presença e influência da lignina ao longo do tempo. Outro dado
interessante é a presença do gênero Rubrobacter em praticamente todas as situações
analisadas, do início ao fim do período de amostragem, indicando que espécies deste gênero
poderiam potencialmente ser indiferentes ou tolerantes à influência da lignina.
82
5.3.4 Detalhamento da composição da comunidade bacteriana ao final do
enriquecimento
A análise mais detalhada dos grupos que mostraram-se mais abundantes no último
dia de enriquecimento permitiu identificar algumas espécies dos gêneros Bacillus e
Streptomyces e alguns gêneros das famílias Alcaligenaceae e Sporolactobacillaceae (dados
expressos na Tabela 9). A espécie Tuberibacillus calidus aparece com a maior percentagem
de abundância dentre todos os grupos listados, apresentando 13,8% em relação aos demais.
No entanto, esta bactéria tem tido sua taxonomia discutida recentemente entre as espécies
Bacillus naganoensis e Pullulanibacillus naganoensis (HATAYAMA, 2006). A denominação
de uma nova espécie foi proposta por Hatayama e colaboradores em 2006, após os autores
sugerirem uma reclassificação da espécie Bacillus naganoensis para Pullulanibacillus
naganoensis (novo gênero), baseado em análises filogenéticas (RNAr 16S e espaçadores
transcritos internos– ITS, internal transcribed spacer - entre os genes RNAr 16S e 23S),
características fisiológicas e quimiotaxonômicas. Tuberibacillus calidus seria uma nova
espécie que abriga dois isolados obtidos de uma pilha de compostagem no Japão mantida a
alta temperatura. Os isolados mostraram alta similaridade (>99,8%) a um clone bacteriano
isolado de um biofiltro de sulfeto de hidrogênio e metanol, porém com nenhuma proximidade
a espécies conhecidas, apenas com a maior similaridade correspondendo a Bacillus
naganoensis (94% de similaridade). Ainda, a nova espécie proposta mostrou baixa
similaridade com o gênero Bacillus (abaixo de 91,9%) e Sporolactobacillus (91-92,5%) que,
no caso deste último, poderia explicar a alta abundância encontrada no grupo desconhecido da
família Sporolactobacillaceae, evidenciada nas Figuras 35 e 36 (HATAYAMA, 2006). Por
outro lado, o gênero Pullulanibacillus (Tabela 9) também foi detectado pelo sequenciamento,
fato que poderia reforçar a hipótese de nova espécie de Hatayama (2006).
Já o(s) membro(s) desconhecido(s) das famílias Alcaligenaceae e
Acetobacteraceae pertencem possivelmente aos gêneros Bordetella (11,8%) e Roseomonas
(6,5%), respectivamente, os quais abrigam espécies que podem ser encontradas mais
comumente em solos e rios naturais ou poluídos (RIHS, 1993; MATTOO, 2005). Da mesma
forma como o Tuberibacillus calidus, não há dados na literatura a respeito de linhagens
ligninolíticas para estes gêneros. Finalmente, algumas espécies de Streptomyces e Bacillus
puderam ser reconhecidas dentro de seus grupos, que foram Streptomyces viridiviolaceus
(7,70%), Bacillus ginsengihumi (3,3%), Bacillus niacini (2,1%) e Streptomyces
83
yokosukanensis (1,4%). Streptomyces viridiviolaceus foi identificado pela primeira vez
em 1958 (PRIDHAM, 1958), com apenas um trabalho publicado sobre esta espécie na
literatura (EL-GAMMAL, 1986), que a descreve como nativa do solo e capaz de produzir um
pigmento com função antibiótica. Bacillus ginsengihumi foi proposta como nova espécie em
2006 (TEN, 2006), sendo associada potencialmente à função ligninolítica, com alguns
trabalhos indicando sua presença em várias plantas e participando do processo de deterioração
da madeira (CLAUSEN, 1996) e da lignina (BUGG et al., 2011; BRUEZ, 2015). Já Bacillus
niacini é uma espécie bacteriana predominantemente encontrada no solo e em plantas,
descrita pela primeira vez como capaz de utilizar a niacina (ácido nicotínico) como única
fonte de carbono e nitrogênio (NAGEL, 1991). É possível que sua presença em plantas
também esteja relacionada com a biodegradação de lignina, relação que ainda precisa ser
melhor investigada. Por fim, a espécie Streptomyces yokosukanensis também é nativa do solo
(KONUK, 2008); porém, não há dados na literatura acerca sua relação com a lignina ou
lignocelulose até o momento, podendo ou não participar do processo de biodegradação.
Tabela 9. Distribuição dos principais grupos encontrados no último dia de enriquecimento do solo com lignina.
Gêneros/Espécies 27º dia com lignina
Tuberibacillus calidus (família Sporolactobacillaceae) 13,8%
Bordetella sp. (família Alcaligenaceae) 11,8%
Streptomyces viridiviolaceus 7,7%
Roseomonas spp. (família Acetobacteraceae) 6,5%
Rubrobacter spp. 5,2%
Bacillus ginsengihumi 3,3%
Pullulanibacillus sp. 2,9%
Bacillus niacini 2,1%
Fulvimonas sp. (família Xanthomonadaceae) 1,8%
Geodermatophilus spp. 1,6%
Streptomyces yokosukanensis 1,4%
Obs.: As porcentagens correspondem à média das porcentagens das triplicatas do 27º dia.
5.4 Isolamento de colônias bacterianas potencialmente ligninolíticas
O processo de isolamento de bactérias potencialmente ligninolíticas passou por
várias tentativas e mudanças nas formulações dos meios de cultivo antes que pudessem ser
visualizadas colônias representativas. Inicialmente, foi testado um meio mínimo (Bushnell
Haas, BH – Sigma Aldrich; 0,2 g de Sulfato de Magnésio, 0,02 g de Cloreto de Cálcio, 1 g de
84
Fosfato de Monopotássio, 1 g de Fosfato Dipotássio, 1 g de Nitrato de Amônia e 0,05g de
Cloreto Férrico em 1 L de água destilada, pH 7,0) acrescido de lignina na concentração de 1%
(m/v), seguido posteriormente pela mesma formulação acrescida de 0,3% (m/v) de extrato de
levedura, além de ágar para solidificação. Não houve qualquer crescimento bacteriano em
ambos os ensaios, fato que poderia ser explicado pela hipótese que concentrações de lignina
maiores que 0,3% (m/v) no meio de cultivo são tóxicas aos microrganismos, como apontado
por Chen et al. (2012) e Shi et al. (2013). Diminuiu-se, então, a concentração de lignina do
meio BH para 0,3% (m/v), mantendo-se o extrato de levedura (0,3% m/v), permitindo
finalmente o surgimento das primeiras colônias no meio denominado LYB. Assim, a menor
concentração de lignina foi usada também nos outros meios (GLYB e LAN) para os
posteriores processos de isolamento.
Os isolados foram selecionados principalmente com base na morfologia, muitos
dos quais com aspecto morfológico similar, uma vez que foi dada prioridade para se obter o
maior número possível de isolados para a posterior triagem de lacases. Um total de 156
bactérias foi isolado dos microcosmos com e sem enriquecimento durante os 27 dias de
experimento.
5.4.1 Coleção de culturas bacterianas isoladas do solo da Caatinga
Foi estabelecida uma coleção de 156 culturas bacterianas puras isoladas do solo
da Caatinga (Figura 37), com potencial atividade ligninolítica (de acordo com os meios
utilizados). Estas bactérias encontram-se preservadas no acervo de pesquisa da Coleção
Brasileira de Microrganismos de Ambiente e Indústria (CBMAI), localizada na Divisão de
Recursos Microbianos (DRM), do CPQBA/UNICAMP. Os isolados foram preservados em
glicerol 20% e mantidos a -80ºC.
85
Figura 37. Exemplos de isolados bacterianos obtidos a partir dos microcosmos de solo da Caatinga.
Os isolados foram numerados de 1 a 269 seguindo-se a ordem cronológica dos
dias de enriquecimento, quando possível, totalizando 156 isolados bacterianos. Tal diferença
entre a enumeração dos isolados e a quantidade total real deve-se ao fato de que alguns
isolados bacterianos não se mostraram viáveis, sendo excluídos da coleção.
5.4.2 Diversidade fenotípica e caracterização macromorfológica das bactérias
isoladas
Em geral, as colônias bacterianas originárias dos microcosmos controles ou
enriquecidos apresentaram-se em sua maioria morfologia similar, com pouca variação entre as
colônias. Durante todo o experimento de enriquecimento predominaram bactérias do tipo
actinomicetos e bactérias puntiformes ou circulares, de cor branca ou bege e margem lobada
ou lisa. No entanto, algumas colônias apresentaram exceções, mais especificamente nas cores
e formas, indicando uma interessante diversidade fenotípica nos meios utilizados (Figura 38).
O levantamento das características macromorfológicas das colônias isoladas dos
microcosmos da Caatinga baseou-se na análise de tamanho, aspecto/consistência, cor,
superfície, densidade, forma, borda/margem, estrutura, elevação e pigmentação, revelando
relativa diversidade bacteriana (ANEXO 1). O tamanho, expresso em milímetros, foi
resultado da média aritmética do diâmetro das colônias para cada isolado.
86
Figura 38. Diversidade fenotípica dos isolados bacterianos obtidos neste estudo.
Adicionalmente, muitos isolados também mostraram pigmentação quando
cultivados em meio líquido (Figura 39), fenótipo comum entre bactérias do solo, das quais a
melanina é um exemplo destes pigmentos produzidos (SHARMA, 2007; LIU, 2009;
FOWLER et al., 2011). A melanina confere uma vantagem de sobrevivência ao hospedeiro,
uma vez que tem sido relacionada com o aumento da sobrevivência de um micro-organismo
através da proteção contra o estresse oxidativo, radiação (e.g., UV), temperatura extrema,
toxicidade de metais pesados e enzimas digestivas de predadores e decompositores, como
amebóides e nematóides (GONYAR, 2014).
Figura 39. Pigmentação de alguns isolados bacterianos da Caatinga.
87
5.5 População bacteriana do solo
Para a quantificação da população bacteriana do solo foi realizada a contagem de
unidades formadoras de colônia (UFC) por grama de solo seco para cada ponto de
amostragem e condição de estudo (controle ou enriquecido) (Figura 40). Para a construção do
gráfico foram calculados os valores da média de UFCs das triplicatas para um mesmo meio de
cultivo e condição estudada (controle ou enriquecida), respeitando-se as diluições
correspondentes. Curiosamente, o meio LYB foi o que recuperou a maior quantidade de
unidades formadoras de colônias bacterianas (239 UFCs), em detrimento dos demais meios
considerados mais ricos nutricionalmente, a saber, GLYB (53 UFCs) e LAN (56 UFCs). Isto
poderia ser explicado pela baixa quantidade de fontes de carbono mais facilmente
assimiláveis em ambientes que são considerados extremos, como a Caatinga; propiciando a
seleção de populações bacterianas mais adaptadas à escassez de recursos energéticos ou à
assimilação de outras fontes existentes no ecossistema, como a lignina. Por outro lado, a
presença da lignina (10% m/m) no solo dos microcosmos enriquecidos parece ter influenciado
negativamente o crescimento de bactérias em praticamente todas as situações, uma vez que a
quantidade total média de UFCs bacterianas em microcosmos enriquecidos com lignina foi
menor que a quantidade total de UFCs dos microcosmos controles, para todos os pontos de
amostragem/isolamento. É provável que a concentração de 10% (m/m) de lignina seja tóxica
ou estressante para a comunidade bacteriana nativa do solo da Caatinga, sendo excessiva até
mesmo para bactérias ligninolíticas. Tais resultados estão de acordo com os encontrados em
linhagens bacterianas isoladas por Chen et al. (2012) e Shi et al. (2013), onde o aumento da
concentração de lignina se revelou inibitório ao crescimento bacteriano.
88
Figura 40. População bacteriana média dos microcosmos ao longo do enriquecimento. As barras com
intervalos indicam os limites estatísticos de confiança de 95%.
5.6 Potencial de biodegradação da lignina nos microcosmos enriquecidos
Durante o período de 27 dias, foram isoladas dos microcosmos 156 bactérias,
todas cultivadas em meios específicos com 0,3 % de lignina (m/v) na composição, de forma
que a seleção de bactérias ligninolíticas fosse estimulada. Além do fato do crescimento de
bactérias em meios contendo lignina indicar potencial de degradação ou consumo deste
composto, 39 (~25%) das 156 bactérias isoladas foram oriundas diretamente dos
microcosmos enriquecidos com 10% de lignina dos dias 9º, 18º e 27º, sugerindo maior
capacidade de degradação ou tolerância destas bactérias à lignina (Figura 41). Ainda, nossos
resultados demonstram que a quantidade de isolados oriundos de microcosmos enriquecidos é
decrescente ao longo do experimento, sugerindo uma forte seleção de alguns membros da
comunidade pela lignina.
89
Figura 41. Percentagem das bactérias isoladas diretamente dos microcosmos enriquecidos com 10%
de lignina em relação aos dias de amostragem.
Ainda em relação aos isolados obtidos a partir dos microcosmos enriquecidos,
houve diferenças numéricas em função do meio de cultivo usado, sendo 17 (43,59%) isolados
do meio LYB, 13 (33,33%) do GLYB e 09 (23,08%) do LAN (Figura 42).
Figura 42. Proporção de bactérias isoladas de microcosmos com 10% de lignina em função do meio
de cultivo utilizado para isolamento.
Tais resultados são intrigantes, pois hipoteticamente o meio LYB consiste na
fonte de energia mais oligotrófica em relação aos outros meios (GLYB e LAN), com a lignina
representando o constituinte principal de fonte de carbono potencialmente assimilável neste
meio de cultivo em especial. Ainda, o meio LYB permitiu o isolamento de colônias
bacterianas procedentes de todos os dias de amostragem, do início ao final do experimento
90
(Figura 43). Assumindo que o último dia corresponda ao ponto crítico de estresse abiótico
exercido pela lignina à comunidade bacteriana, os dois isolados obtidos no 27º dia podem
apresentar mecanismos de resistência ou tolerância particulares em nível genético e
molecular, com um maior potencial de biodegradação da lignina.
Figura 43. Quantidade de bactérias isoladas diretamente dos microcosmos enriquecidos com 10% de
lignina em relação aos meios de cultivo e dias de amostragem.
Em teoria, a exposição da comunidade bacteriana presente no solo à lignina
parece impactar negativamente a diversidade cultivável ao longo do tempo, uma vez que a
quantidade de isolados que sobrevivem a ela é reduzida, como também a abundância relativa
é alterada. Até hoje, apenas alguns isolados bacterianos foram reportados na literatura como
capazes de degradar Kraft-Lignin, com composição variável entre 0,1-0,3% (m/v) nos meios
de cultivo (PERESTELO et al., 1996; CHANDRA et al., 2007; BANDOUNAS et al., 2011;
CHEN et al., 2012; SHI et al., 2013).
Por outro lado, o tempo de exposição da comunidade bacteriana a uma
temperatura de 45ºC também poderia interferir negativamente na viabilidade e sobrevivência
das bactérias presentes nos microcosmos, dado que a temperatura extrema foi mantida
constante durante todo o período de amostragem. É possível que ambas as condições extremas
(temperatura elevada e alta concentração e tempo de exposição à lignina) tenham efeitos
sinérgicos na viabilidade e tolerância das bactérias frente a estes ou outros estresses abióticos,
afetando mecanismos de resposta ou adaptações que funcionariam normalmente na ausência
de um ou outro fator. Este trabalho é o primeiro na área a realizar o cultivo de bactérias (com
91
vistas à biodegradação de lignina) sob a temperatura de 45ºC, diferenciando-se dos demais
cuja temperatura de incubação foi de 30ºC.
5.7 Screening funcional dos isolados para produção de lacases
O ensaio funcional qualitativo para lacases, utilizando-se os reagentes RBBR,
ABTS e Congo Red, foi realizado para todas as 156 bactérias isoladas, em meios líquido e
sólido (exceto Congo Red). A descoloração ou coloração destes substratos tem sido bastante
reportada na detecção de lacases por fungos; porém, a detecção em bactérias tem sido mais
escassa.
A descoloração de corantes que tenham semelhança estrutural com a lignina ou
polifenóis, como o RBBR, sugerem a atividade enzimática de oxidases de compostos
aromáticos, as quais incluem as lacases. A verificação de halos ou zonas de descoloração em
placas contendo meio de cultivo geralmente indica a presença de lacases (BANDOUNAS et
al., 2011).
Figura 44. Ensaio funcional de lacases usando o corante RBBR como substrato. As setas vermelhas
apontam para isolados bacterianos que absorveram o corante para o interior das células.
O teste de RBBR em meio sólido e líquido foi realizado com o propósito de
detectar qualitativamente algum tipo de descoloração nos 156 isolados, de forma que o
mesmo consistisse em um screening para a seleção de potenciais bactérias produtoras de
92
lacases. No entanto, não foram encontrados sinais indicativos de descoloração que pudessem
sugerir a presença de lacases em ambos os testes. No caso do RBBR em meio sólido, apenas
verificou-se a absorção do corante pelos isolados 129, 154, 206 e 212 (Figura 44), porém sem
a presença de um halo ou descoloração ao redor das colônias, típica em fungos produtores de
lacases. No meio líquido, também não se verificou um indício de descoloração do RBBR
(Figura 45). De forma análoga, o teste com Congo Red evidenciou alguns poços nos quais o
meio ficou mais escuro, ao contrário do efeito esperado (a descoloração do meio). O ABTS
também não demonstrou nenhum indicativo de coloração verde nos isolados testados, não
apresentando variação entre os controles e os ensaios, tanto em meio sólido quanto em meio
líquido.
Figura 45. Teste em meio líquido utilizando análogos estruturais à lignina.
A pigmentação se mostrou variável entre os reagentes, sendo expressa em uns e
ausente em outros. Existem várias razões para bactérias produzirem pigmentos. Nesta situação
em particular, a pigmentação pode ter sido resultante de estresse celular quando em contato
com os reagentes, da ativação de mecanismos de defesa, da aquisição de nutrientes minerais
(por exemplo, do cobre proveniente do CuSO4), do acúmulo de metabólitos secundários ou,
93
ainda, da ocorrência de reações enzimáticas. Apesar dos compostos análogos da lignina não
terem se mostrado oxidados em comparação com os padrões qualitativos referentes à
mudança de cor ou descoloração, a possibilidade de algum isolado de produzir lacases não
deve ser descartada. Artefatos inerentes à semelhança imprecisa dos reagentes aos
monômeros da lignina, bem como a escassez de dados na literatura sobre a detecção funcional
de lacases bacterianas dificultam a obtenção de respostas assertivas da produção da enzima
pelos isolados. Os mesmos reagentes podem estar sendo transformados ou degradados não
pelas lacases, porém por outras ligninases da classe das peroxidases, como LiPs e MnPs, ou
até mesmo por vias metabólicas ou enzimas independentes das próprias ligninolíticas. A
expressão de lacase bacteriana nos meios de cultivo, de forma que a mesma seja detectável
pelos ensaios funcionais também deve ser ponderada, uma vez que muitas enzimas têm sua
expressão favorecida com a adição de indutores ou metais. No caso de lacases, átomos de
cobre em seu sítio ativo auxiliam a enzima em seu processo de catálise. Além do sulfato de
cobre (CuSO4), outros indutores de expressão ou métodos de optimização da atividade
enzimática das lacases poderiam contribuir para a detecção destas enzimas em isolados
bacterianos, necessitando de maiores estudos de suas aplicações em lacases bacterianas. A
variação do padrão de pigmentação e absorção de corantes entre as amostras testadas parece
ser devida às diferenças genéticas e fisiológicas associadas aos isolados bacterianos (LIU,
2009) do que à produção de lacases pelos mesmos.
5.8 Triagem via PCR de lacases a partir do DNA total dos microcosmos e
isolados bacterianos
Foram realizadas várias tentativas para amplificação de sequências gênicas de
lacases que poderiam estar presentes no DNA total dos microcosmos e no DNA genômico de
cada isolado bacteriano. Foi detectada um sinal de amplificação intenso de aproximadamente
600 pb apenas para o par de primers Cu1AF/Cu4R (Figura 46).
94
Figura 46. Eletroforese em gel de agarose (1%) dos produtos de PCR utilizando primers degenerados
para lacases para o controle positivo (C+). Temperatura de anelamento dos primers: 48°C.
O DNA total de cada microcosmo (inclusive triplicatas) foi utilizado como
molde em reações de PCR para a triagem de lacases através do uso dos primers Cu1AF/Cu4R
(AUSEC, 2011). No entanto, nenhuma banda de tamanho similar à do controle positivo foi
observada no DNA total dos microcosmos testados. Sabendo-se que condições como
concentração dos reagentes e temperatura de anelamento podem interferir na eficiência de
uma reação em cadeia da polimerase, variou-se a concentração do íon magnésio e primers na
reação, de forma a otimizar a atividade da Taq DNA Polimerase, além de testar outras
temperaturas de anelamento (49ºC, 50ºC, 51ºC, 52ºC, 53ºC e 54ºC). Porém, não houve
qualquer sinal de amplificação de genes de lacases a partir dos DNAs avaliados. Uma das
principais questões em relação à amplificação usando amostras de DNA ambiental é superar a
inibição da PCR por substâncias extraídas conjuntamente com os ácidos nucléicos, como
ácidos húmicos provenientes do solo. Para contornar este possível problema, diluiu-se a
solução de DNA 10x (1:10), bem como aumentou-se levemente a concentração de BSA
(albumina de soro bovino) na reação de PCR (RÖLING & HEAD, 2005). Apesar disso, não
foi encontrado qualquer indício de amplificação nestas condições. A fim de se verificar a
possibilidade da falta de sensibilidade dos primers utilizados na detecção de lacases
bacterianas, foi realizada a técnica de Nested-PCR, ou seja, produtos de uma primeira PCR
foram utilizados como molde para uma nova reação de amplificação com os mesmos primers.
Todavia, foram obtidos os mesmos resultados de ausência de amplificação no DNA total dos
microcosmos.
95
Já o teste de amplificação (via PCR) de sequências bacterianas de lacases
(utilizando-se pares de primers degenerados) a partir do DNA genômico das bactérias
isoladas dos microcosmos enriquecidos, indicou uma possível presença putativa destas
sequências no DNA de algumas bactérias isoladas (Figura 47). Inicialmente, realizou-se a
reação de PCR com os primers Cu1AF/Cu4R e temperatura de anelamento de 48ºC para
todos os isolados provenientes dos microcosmos enriquecidos. Alguns isolados (129, 152,
164, 165, 166, 212 e 214) apresentaram uma banda muito próxima à banda de referência do
controle positivo utilizado neste estudo, cujo tamanho correspondente é 600 pb (Figura 47B).
Figura 47. Eletroforese em gel de agarose (1%) dos produtos da PCR utilizando primers degenerados
para lacases bacterianas a partir do DNA genômico dos isolados. (A) Ausência de produtos de
amplificação para os isolados testados; (B) São visíveis bandas inespecíficas em alguns dos isolados,
referenciados com a cor vermelha. Temperatura de anelamento de 48ºC.
Embora estes isolados não tenham apresentado uma banda exatamente do mesmo
tamanho da banda do controle positivo, optou-se por investigar mais detalhadamente a
especificidade de bandas situadas próximas àquela do controle, verificando como as mesmas
96
se comportavam diante do aumento da temperatura de anelamento em PCR. Adotando a
estratégia de PCR com gradiente de temperatura, com aumentos de 1ºC na temperatura de
anelamento em reações de PCR em um intervalo entre 49 e 52ºC, foi possível reduzir um
pouco o grande número de bandas inespecíficas dos isolados em análise. Observou-se que, a
na temperatura de anelamento de 52ºC, quase todas as amplificações inespecíficas foram
eliminadas; no entanto, tanto a banda do controle quanto a correspondente a ela nos isolados
testados foram substancialmente comprometidas (Figura 48). Por outro lado, embora em
intensidade fraca, o isolado 166 continuou a apresentar a banda próxima à do controle mesmo
a 51ºC, o que não ocorreu com os outros isolados. Para que um processo de sequenciamento
desta banda fosse viável, decidiu-se selecionar a temperatura de anelamento de 49ºC para os
isolados 166 e 164. Ainda na Figura 48, é possível perceber que estes isolados apresentaram
uma banda de maior intensidade em relação aos demais isolados, situada abaixo da banda do
controle, indicada na figura através das setas amarelas. Embora ela não estivesse alinhada
com a banda controle, foi necessário determinar se tal banda corresponderia a alguma
sequência de lacase bacteriana.
Figura 48. Eletroforese em gel de agarose (1%) dos produtos da PCR adotando-se um gradiente de
temperatura (49 a 52ºC).
Para isso, foi realizada uma nova reação de PCR dos isolados 164 e 166,
utilizando-se a temperatura de anelamento de 49ºC. No entanto, nesta nova reação apenas o
97
isolado 166 apresentou uma banda próxima à banda de referência do controle, desta vez
levemente acima da banda controle (Figura 49). Por outro lado, o isolado 164 não exibiu
qualquer banda suficientemente próxima a esta última.
Figura 49. Eletroforese em gel de agarose (1%) dos produtos da PCR dos isolados 164 e 166
utilizando primers degenerados para lacases bacterianas (temperatura de anelamento = 49ºC). A seta
amarela indica a banda de interesse no isolado 166, próxima à banda correspondente à lacase do
controle positivo.
Tal inconstância nos resultados de amplificação pode ser explicada, em parte, pela
natureza dos próprios primers degenerados, que podem amplificar produtos inespecíficos ou
formar dímeros de primers durante a reação de PCR, dificultando a confirmação dos dados
apenas por eletroforese. Sendo assim, escolheu-se sequenciar a banda do isolado 166 (entre
500 e 750 pb) situada próxima à banda controle (+-600 pb). A banda foi concentrada,
excisada do gel, purificada e submetida ao sequenciamento Sanger para que a sequência fosse
confrontada contra o banco de dados do GenBank, através da ferramenta BLASTx. Porém, a
qualidade do sequenciamento não se mostrou adequada, comprometendo a análise dos
resultados em software específico, muito provavelmente por se tratarem de primers
degenerados.
5.9 Filogenia dos isolados bacterianos dos microcosmos enriquecidos
Com a finalidade de identificar os vizinhos filogenéticos mais próximos dos
isolados dos microcosmos enriquecidos dos 9º, 18º e 27º dias, foi construída uma árvore
filogenética baseada nas sequências do gene RNAr 16S para 36 isolados bacterianos,
98
resultados expressos nas figuras 50 e 51. Destes 36 isolados, 29 mostraram-se afiliados ao filo
Firmicutes e gênero Bacillus (Figura 50), ao passo que os 7 isolados restantes mostraram ser
pertencentes ao filo Actinobacteria e provavelmente relacionados com o gênero Streptomyces
(Figura 51).
Os isolados pertencentes ao gênero Bacillus mostraram-se proximamente
relacionados às espécies B. subtilis, B. aerius, B. licheniformis, B. sonorensis, B. tequilensis,
B. hemicellulosilyticus, B. clausii e B. rhizosphaeae. B. subtilis foi a primeira espécie da qual
uma lacase bacteriana foi caracterizada (MARTINS et al., 2002; CHANG et al., 2014; MIN et
al., 2015), abrindo um precedente para a descoberta de outras espécies com atividade
ligninolítica e genes ortólogos à lacase bacteriana, como B. licheniformis (KOSCHORRECK
et al., 2008, KOSCHORRECK, 2009), B. clausii (BRANDER, 2014) e B. tequilensis
(SONDHI et al., 2015). Já um estudo de Oke (2016) demonstrou que um isolado da espécie
de B. aerius, obtido de um cacho de uma fruta de palma em decomposição na Malásia,
mostrou melhor crescimento em substratos lignocelulósicos do que outros contendo apenas
substratos de celulose (OKE, 2016). Finalmente, B. sonorensis foi proposto como uma nova
espécie bacteriana após oito isolados serem obtidos do solo do deserto de Sonoran (Arizona,
Estados Unidos), por Palmisano et al. (2001), a qual seria proximamente relacionada a
Bacillus licheniformis, embora com diferenças genéticas e fisológicas em relação a última
(PALMISANO et al. 2001). Há de se considerar a semelhança do local de isolamento de B.
sonorensis com o bioma da Caatinga, ambientes áridos ou semiáridos consideravelmente
oligotróficos, bem como elevada temperatura e escassez hídrica.
99
Figura 50. Análise filogenética baseada no gene RNAr 16S dos isolados bacterianos, representando
membros do filo Firmicutes. Os números nos nós são valores de bootstrap com base em 1000
replicatas, a partir do método de neighbor joining. O número do GenBank para cada sequência
individual é indicado entre parênteses, com os números em vermelho correspondentes ao número de
um isolado específico. Os números antecedentes aos números em vermelho representam apenas os
identificadores usados para a confecção da árvore. A barra de escala indica o coeficiente de
similaridade (distância genética em substituições por nucleotídeo).
100
Já os isolados relacionados com o gênero Streptomyces apontaram proximidades
maiores com as espécies S. archromogenes e S. glomeratus, ambas associadas recentemente
com a produção de enzimas lignocelulíticas (GARRITY et al., 2007; JEFFREY, 2007; GAO,
2012; SAINI et al., 2015). S. archromogenes foi a espécie indicada mais proximamente
relacionada (99% de identidade - alinhamento BLAST) a um isolado (nomeado ORS10)
obtido por Gao (2012) da areia do solo de um deserto da Namíbia, local semiárido
considerado extremófilo e oligotrófico, aspectos estes semelhantes à Caatinga. Tal isolado foi
descrito apresentando morfologia típica de colônias de Actinobacteria e crescimento em
condições termofílicas (temperatura de 45Cº), tendo seu DNA genômico digerido com
enzimas de restrição e clonado a uma biblioteca genômica para a triagem de enzimas
hemicelulósicas. O procedimento revelou uma presença putativa de uma acetil-xilana-
esterase, uma hemicelulase relacionada com a hidrólise da biomassa lignocelulósica, embora
com baixa similaridade em nível protéico (GAO, 2012). No entanto, testes para ligninases
nesta espécie ainda não foram executados. Já a espécie S. glomeratus tem sido reportada
quanto a sua produção de celulases extracelulares (JEFFREY, 2007; SAINI, 2015), mas não
de ligninases até o momento.
101
Figura 51. Análise filogenética baseada no gene RNAr 16S dos isolados bacterianos, representando
membros do filo Actinobacteria. A espécie de bactéria Rhodococcus cercidiphylli foi usada como a
raiz da árvore. Os números nos nós são valores de bootstrap baseado em 1000 replicatas, a partir do
método de neighbor joining. O número do GenBank para cada sequência individual é indicado entre
parênteses, com os números em vermelho correspondentes ao número de um isolado específico. Os
números antecedentes aos números em vermelho representam apenas os identificadores usados para a
confecção da árvore. A barra de escala indica o coeficiente de similaridade (distância genética em
substituições por nucleotídeo).
102
6. CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos, foi possível concluir que:
Houve influência da lignina na comunidade bacteriana nativa do solo da
Caatinga ao longo do tempo, uma vez que, além da redução do número de OTUs (riqueza) e
de isolados obtidos ao final do enriquecimento, houve também perda de diversidade. Isto pode
ser verificado pelo fato que a maioria dos grupos taxonômicos teve suas abundâncias relativas
diminuídas ao longo do tempo nos microcosmos enriquecidos, em contraste com os gêneros
Streptomyces e Bacillus, que apresentaram aumento em suas abundâncias no 18º e 27º dias.
Além disso, os microcosmos controles (sem adição de lignina) apresentaram seus níveis de
abundância praticamente inalterados ao longo do tempo, evidenciando que a adição de lignina
ao solo foi essencial para a variação da diversidade taxonômica da comunidade bacteriana
encontrada nos microcosmos enriquecidos.
O isolamento de bactérias dos microcosmos do solo da Caatinga a partir dos
meios específicos contendo lignina sugere que a mesma tenha sido utilizada como principal
fonte de carbono para a obtenção de energia, visto que os isolados foram capazes de crescer
em meios de cultivo oligotróficos, basicamente compostos por kraft-lignin.
Embora os ensaios funcionais e moleculares não tenham sido capazes de
detectar a atividade de lacases bacterianas, sua presença não deve ser descartada, uma vez que
os ensaios funcionais podem se comportar diferentemente entre fungos e bactérias, e primers
degenerados amplificar sítios inespecíficos não correspondentes às sequências de lacases.
103
7. PERSPECTIVAS
Os resultados da variação da diversidade taxonômica da comunidade bacteriana
sob o efeito da lignina, obtidos através do sequenciamento dos microcosmos, podem servir
não só de alicerce para estudos comparativos de ecologia microbiana e ciclagem de lignina
em solos, como também auxiliar o delineamento de estratégias de recuperação de áreas
degradadas ou prospecção biotecnológica dirigida para enzimas ligninolíticas de origem
bacteriana, através do foco nos grupos taxonômicos mais abundantes ao final do
enriquecimento. Neste sentido, alguns isolados foram selecionados para a avaliação dos
compostos que são liberados durante a biodegradação da lignina, utilizando-se cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), experimentos já em fase de análise. A
identificação das bactérias isoladas dos microcosmos que são capazes de biodegradar a
lignina poderia contribuir para uma melhor compreensão da associação entre vias metabólicas
e enzimas bacterianas envolvidas na conversão de lignocelulose em biocombustíveis ou
outros produtos renováveis, bem como a maior valorização de resíduos de lignina gerados de
indústria de papel e celulose para a geração de energia.
104
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118
ANEXO 1. Macromorfologia de colônias bacterianas isoladas dos microcosmos.
Isolado Características macromorfológicas das colônias isoladas
Tamanho Aspecto Cor Superfície Densidade Forma Borda Estrutura Elevação Pigmentação
07 3 mm Quebradiço Bege Opaca Opaca Circular Lobada Lisa Umbilicada -
10 2 mm Quebradiço Bege Opaca Opaca Irregular Ondulada Lisa Convexa -
15 28 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Rizóide Ondulada Rugosa Umbilicada -
18 4 mm Quebradiço Creme Brilhante Opaca Circular Lobada Rugosa Umbonada ++
19 6 mm Quebradiço Bege Opaca Opaca Irregular Lisa Lisa Umbonada -
21 25 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Rizóide Lacerada Rugosa Côncava -
25 3 mm Quebradiço Bege Opaca Translúcida Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
26 26 mm Leitoso Bege/Marrom Opaca Translúcida Rizóide Filamentosa Filamentosa Convexa -
28 2 mm Quebradiço Creme Brilhante Translúcida Circular Lisa Lisa Pulvinada -
29 1 mm Quebradiço Creme Opaca Opaca Circular Lisa Rugosa Pulvinada -
30 17 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Puntiforme Ondulada Granulosa Elevada -
37 15 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Filamentosa Filamentosa Filamentosa Umbonada -
38 1 mm Quebradiço Bege Opaca Opaca Circular Ondulada Lisa Côncava -
40 30 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
41 5 mm Membranoso Bege/Esbranquiçada Brilhante Opaca Circular Lisa Lisa Convexa -
48 9 mm Butiráceo Creme/Esbranquiçada Opaca Opaca Puntiforme Lacerada Granulosa Umbonada -
52 30 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Irregular Ondulada Rugosa Umbonada -
54 35 mm Leitoso Bege/Esbranquiçada Opaca Translúcida Rizóide Filamentosa Filamentosa Umbonada +++
57 3 mm Leitoso Bege Opaca Translúcida Fusiforme Lisa Lisa Elevada -
61 8 mm Membranoso Bege/Esbranquiçada Opaca Opaca Circular Lisa Rugosa Umbilicada -
62 4 mm Butiráceo Alaranjada Opaca Opaca Circular Lisa Granulosa Umbonada -
64 12 mm Membranoso Alaranjada Opaca Opaca Circular Ondulada Rugosa Umbonada -
67 8 mm Membranoso Branca Opaca Translúcida Irregular Lobada Granulosa Pulvinada -
68 29 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Irregular Ondulada Rugosa Elevada +++
70 12 mm Membranoso Creme/Esbranquiçada Opaca Translúcida Circular Ondulada Rugosa Umbonada -
71 7 mm Membranoso Marrom Opaca Opaca Circular Lisa Lisa Convexa -
75 1 mm Quebradiço Bege Opaca Opaco Circular Lisa Lisa Umbonada -
79 6 mm Butiráceo Marrom Opaca Translúcida Circular Ondulada Rugosa Umbonada -
83 6 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Circular Lisa Rugosa Pulvinada -
86 5 mm Membranoso Marrom/Esbranquiçada Opaca Translúcida Irregular Lobada Rugosa Umbilicada ++
88 4 mm Membranoso Creme/Marrom Opaca Translúcida Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
91 1 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Irregular Lobada Granulosa Umbonada -
92 6 mm Butiráceo Creme/Esbranquiçada Brilhante Opaca Irregular Ondulada Granulosa Umbonada -
93 2 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Circular Lobada Rugosa Pulvinada -
94 1 mm Liso Marrom/Esbranquiçada Opaca Translúcida Circular Lisa Lisa Convexa -
95 2 mm Viscoso Bege Opaca Opaca Puntiforme Lobada Granulosa Elevada -
96 1 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
97 3 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
98 2 mm Membranoso Creme Brilhante Translúcida Irregular Lobada Lisa Convexa -
99 1 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Irregular Ondulada Rugosa Elevada -
118
ANEXO 1. Macromorfologia de colônias bacterianas isoladas dos microcosmos (continuação).
Isolado Características macromorfológicas das colônias isoladas
Tamanho Aspecto Cor Superfície Densidade Forma Borda Estrutura Elevação Pigmentação
100 2 mm Liso Marrom Opaca Opaca Irregular Ondulada Granulosa Convexa -
101 1 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Fusiforme Lisa Lisa Côncava -
102 2 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Puntiforme Ondulada Granulosa Umbonada -
104 3 mm Butiráceo Bege Opaca Translúcida Irregular Lobada Granulosa Umbilicada -
105 4 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Circular Ondulada Rugosa Pulvinada ++
106 9 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Irregular Lobada Granulosa Elevada -
107 1 mm Leitoso Bege Opaca Translúcida Puntiforme Ondulada Granulosa Elevada -
108 4 mm Membranoso Bege/Esbranquiçada Brilhante Opaca Circular Lisa Lisa Elevada -
109 1 mm Membranoso Bege Opaca Opaca Irregular Ondulada Rugosa Umbilicada -
110 2 mm Quebradiço Marrom Opaca Translúcida Circular Lobada Rugosa Elevada -
111 2 mm Viscoso Bege Opaca Opaca Circular Lisa Lisa Pulvinada -
112 1 mm Viscoso Bege Opaca Translúcida Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
113 2 mm Liso Marrom Opaca Opaca Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
114 1 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Irregular Lobada Granulosa Côncava -
115 1 mm Quebradiço Marrom Opaca Translúcida Puntiforme Lisa Granulosa Elevada -
116 3 mm Butiráceo Marrom Opaca Translúcida Circular Ondulada Rugosa Umbonada -
117 6 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Circular Lobada Rugosa Umbonada +
118 1 mm Butiráceo Bege Opaca Translúcida Circular Ondulada Rugosa Elevada -
119 6 mm Quebradiço Bege Opaca Opaca Irregular Lisa Rugosa Umbonada -
120 1 mm Butiráceo Creme Opaca Translúcida Puntiforme Lobada Rugosa Elevada -
122 16 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Puntiforme Lobada Granulosa Côncava -
123 7 mm Membranoso Bege/Creme Brilhante Opaca Circular Ondulada Rugosa Umbilicada -
124 24 mm Membranoso Bege Brilhante Translúcida Circular Lisa Rugosa Umbonada -
125 7 mm Butiráceo Bege Opaca Translúcida Irregular Ondulada Lisa Convexa -
126 5 mm Quebradiço Bege Opaca Translúcida Irregular Ondulada Granulosa Convexa +
127 2 mm Quebradiço Bege Opaca Translúcida Circular Lobada Granulosa Pulvinada -
128 13 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Circular Lisa Rugosa Umbonada -
129 3 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Circular Lisa Lisa Pulvinada -
130 6 mm Quebradiço Bege/Esbranquiçada Opaca Translúcida Circular Lisa Rugosa Umbilicada -
131 1 mm Butiráceo Marrom Opaca Translúcida Irregular Ondulada Rugosa Elevada -
132 1 mm Butiráceo Marrom Opaca Translúcida Fusiforme Lisa Lisa Elevada -
133 2 mm Viscoso Bege Opaca Opaca Irregular Lisa Lisa Pulvinada -
134 5 mm Membranoso Creme Brilhante Translúcida Circular Ondulada Rugosa Umbonada ++
137 35 mm Viscoso Bege Opaca Opaca Puntiforme Filamentosa Granulosa Côncava -
138 32 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Puntiforme Filamentosa Granulosa Côncava -
139 34 mm Viscoso Bege Opaca Opaca Puntiforme Filamentosa Granulosa Côncava -
141 30 mm Butiráceo Bege /Alaranjada Opaca Opaca Puntiforme Lobada Granulosa Elevada -
142 29 mm Butiráceo Bege/Esbranquiçada Opaca Opaca Puntiforme Ondulada Granulosa Côncava +
143 31 mm Quebradiço Branca Opaca Opaca Puntiforme Ondulada Granulosa Côncava -
144 28 mm Butiráceo Alaranjada Opaca Opaca Puntiforme Lisa Granulosa Umbilicada -
119
ANEXO 1. Macromorfologia de colônias bacterianas isoladas dos microcosmos (continuação).
Isolado Características macromorfológicas das colônias isoladas
Tamanho Aspecto Cor Superfície Densidade Forma Borda Estrutura Elevação Pigmentação
145 32 mm Viscoso Bege/Esbranquiçada Opaca Translúcida Filamentosa Ondulada Granulosa Côncava ++
146 33 mm Leitoso Bege/Creme Opaca Opaca Filamentosa Lacerada Granulosa Umbonada -
147 33 mm Butiráceo Bege/Creme Opaca Opaca Puntiforme Lobada Granulosa Umbonada -
148 35 mm Quebradiço Branca Opaca Opaca Puntiforme Lobada Granulosa Elevada -
149 15 mm Membranoso Alaranjada Brilhante Opaca Circular Ondulada Rugosa Umbonada ++
150 14 mm Membranoso Alaranjada Brilhante Opaca Circular Lisa Rugosa Umbilicada +
151 7 mm Butiráceo Marrom Opaca Translúcida Circular Lisa Granulosa Umbilicada -
152 6 mm Membranoso Alaranjada/Marrom Brilhante Opaca Circular Lisa Rugosa Umbilicada +
153 3 mm Membranoso Alaranjada Brilhante Opaca Irregular Lobada Lisa Umbonada -
154 9 mm Butiráceo Alaranjada/Rosa Opaca Opaca Circular Lisa Granulosa Umbonada +
155 1 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Irregular Ondulada Granulosa Elevada -
156 17 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Irregular Ondulada Rugosa Umbonada -
158 13 mm Butiráceo Bege/Esbranquiçada Opaca Translúcida Irregular Lisa Granulosa Convexa -
163 13 mm Membranoso Bege Opaca Translúcida Circular Ondulada Rugosa Umbonada -
164 16 mm Viscoso Bege/Creme Opaca Opaca Irregular Filamentosa Filamentosa Umbonada -
165 19 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Irregular Lisa Granulosa Convexa -
166 25 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Rizóide Filamentosa Granulosa Pulvinada -
167 21 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Circular Filamentosa Granulosa Pulvinada -
168 1 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Irregular Lobada Granulosa Convexa -
171 2 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Circular Lisa Granulosa Elevada -
172 4 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Circular Ondulada Granulosa Pulvinada -
173 17 mm Butiráceo Bege/Esbranquiçada Opaca Translúcida Irregular Ondulada Granulosa Pulvinada -
174 6 mm Membranoso Alaranjada/Creme Opaca Opaca Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
176 10 mm Membranoso Bege/Creme Brilhante Opaca Circular Ondulada Rugosa Umbilicada -
177 5 mm Membranoso Bege Opaca Translúcida Irregular Ondulada Rugosa Umbonada -
178 3 mm Quebradiço Bege Opaca Translúcida Circular Ondulada Rugosa Umbilicada +
179 4 mm Quebradiço Branca-esverdeada Brilhante Opaca Circular Lisa Rugosa Umbilicada -
180 6 mm Quebradiço Bege Opaca Translúcida Circular Lobada Rugosa Umbilicada -
181 6 mm Membranoso Creme-esverdeada Brilhante Translúcida Irregular Ondulada Rugosa Umbonada -
182 3 mm Membranoso Bege Opaca Translúcida Circular Lobada Rugosa Umbonada -
183 4 mm Quebradiço Branca-esverdeada Brilhante Opaca Circular Lobada Rugosa Umbonada +
120
ANEXO 1. Macromorfologia de colônias bacterianas isoladas dos microcosmos (continuação).
Isolado Características macromorfológicas das colônias isoladas
Tamanho Aspecto Cor Superfície Densidade Forma Borda Estrutura Elevação Pigmentação
184 3 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Circular Ondulada Rugosa Umbonada +
185 31 mm Butiráceo Branca Opaca Opaca Irregular Lobada Granulosa Pulvinada ++
186 20 mm Quebradiço Bege/Creme Brilhante Opaca Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
187 29 mm Butiráceo Branca Opaca Opaca Irregular Filamentosa Granulosa Convexa -
188 15 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Irregular Ondulada Granulosa Elevada -
192 5 mm Quebradiço Branca-esverdeada Brilhante Opaca Irregular Lisa Rugosa Pulvinada -
193 9 mm Membranoso Branca-esverdeada Opaca Opaca Irregular Filamentosa Filamentosa Umbonada -
194 4 mm Quebradiço Creme Opaca Opaca Irregular Ondulada Granulosa Pulvinada -
196 14 mm Butiráceo Creme Opaca Opaca Irregular Filamentosa Granulosa Convexa -
197 14 mm Butiráceo Branca-esverdeada Opaca Opaca Circular Lisa Granulosa Umbilicada ++
198 6 mm Membranoso Bege Brilhante Opaca Circular Ondulada Rugosa Umbilicada -
201 4 mm Membranoso Branca-esverdeada Brilhante Opaca Circular Ondulada Rugosa Umbilicada -
202 4 mm Membranoso Branca-esverdeada Brilhante Opaca Circular Lisa Rugosa Umbilicada ++
203 3 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Circular Ondulada Rugosa Umbonada -
204 10 mm Butiráceo Marrom/Esbranquiçada Opaca Translúcida Puntiforme Ondulada Granulosa Côncava -
205 1 mm Membranoso Bege Opaca Translúcida Puntiforme Lisa Granulosa Elevada -
206 5 mm Quebradiço Branca-esverdeada Opaca Opaca Circular Lisa Rugosa Umbilicada -
207 2 mm Butiráceo Branca Opaca Opaca Puntiforme Lisa Granulosa Convexa -
209 3 mm Membranoso Bege Brilhante Translúcida Circular Lobada Rugosa Umbilicada -
211 2 mm Membranoso Bege Opaca Translúcida Puntiforme Lisa Granulosa Umbonada ++
212 8 mm Membranoso Creme Brilhante Opaca Circular Lisa Rugosa Umbonada -
213 5 mm Quebradiço Branca Opaca Opaca Irregular Lobada Rugosa Umbilicada ++
214 2 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Puntiforme Lisa Lisa Elevada -
218 1 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Puntiforme Lisa Lisa Elevada -
219 3 mm Membranoso Branca-esverdeada Opaca Opaca Circular Lisa Rugosa Umbilicada ++
220 18 mm Leitoso Bege Opaca Translúcida Filamentosa Lacerada Lisa Umbonada -
221 20 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Puntiforme Lobada Filamentosa Convexa -
223 32 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Rizóide Ondulada Lisa Elevada -
225 34 mm Viscoso Bege/Marrom Opaca Opaca Rizóide Lacerada Filamentosa Umbonada -
232 21 mm Butiráceo Marrom Opaca Opaca Puntiforme Lisa Granulosa Elevada -
233 2 mm Leitoso Branca Opaca Translúcida Puntiforme Lisa Lisa Pulvinada -
235 2 mm Quebradiço Marrom Opaca Translúcida Circular Lisa Lisa Umbilicada -
236 5 mm Quebradiço Branca Opaca Translúcida Irregular Ondulada Rugosa Umbonada +
238 6 mm Quebradiço Branca-esverdeada Opaca Translúcida Circular Lobada Granulosa Umbilicada ++
243 4 mm Membranoso Bege/Marrom Opaca Translúcida Circular Ondulada Rugosa Umbonada -
248 1 mm Quebradiço Alaranjada/Creme Opaca Translúcida Irregular Lisa Lisa Elevada -
249 36 mm Butiráceo Branca Opaca Translúcida Puntiforme Filamentosa Granulosa Convexa -
121
ANEXO 1. Macromorfologia de colônias bacterianas isoladas dos microcosmos (continuação).
Isolado Características macromorfológicas das colônias isoladas
Tamanho Aspecto Cor Superfície Densidade Forma Borda Estrutura Elevação Pigmentação
251 6 mm Membranoso Branca Opaca Translúcida Irregular Lobada Rugosa Umbonada -
252 3 mm Quebradiço Creme/Esbranquiçada Opaca Translúcida Irregular Lobada Lisa Elevada -
253 33 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Rizóide Lobada Filamentosa Umbonada -
254 4 mm Leitoso Bege Opaca Opaca Irregular Lobada Lisa Côncava -
255 1 mm Quebradiço Bege Opaca Translúcida Fusiforme Ondulada Rugosa Elevada -
266 37 mm Viscoso Bege Opaca Translúcida Puntiforme Ondulada Lisa Convexa +++
268 3 mm Butiráceo Bege Opaca Opaca Puntiforme Lisa Granulosa Pulvinada +
269 30 mm Butiráceo Branca Opaca Translúcida Puntiforme Lisa Granulosa Pulvinada +
122
ANEXO 2 - Características macromorfológicas de colônias bacterianas.
Características Macromorfológicas
Tamanho Diâmetro em milímetros (Grande = 5 mm) (Média = 2 a 5 mm) (Pequena = 2 mm)
Aspecto Butirácea (aspecto de manteiga), viscosa, úmida,
membranosa, quebradiça, leitosa, outra.
Cor Branca, amarela, preta, camurça, laranja, outra.
Superfície Brilhante, Fosca, outra.
Brilho Brilhante, Opaca, Translúcida, Transparente, outra.
Forma
Margem/Borda
Estrutura
Elevação
Fonte: Koneman et al., (2006).
123
ANEXO 3 – BIOÉTICA
124
ANEXO 4 – DIREITOS AUTORAIS