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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA -
PPGMM
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E
GENOTÍPICA, SENSIBILIDADE A
ANTIMICROBIANOS E DETECÇÃO DE GENES DE
VIRULÊNCIA DE CEPAS CLÍNICAS E AMBIENTAIS
DE Burkholderia pseudomallei
TEREZA DE JESUS PINHEIRO GOMES BANDEIRA
FORTALEZA - CEARÁ
2011
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA -
PPGMM
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E
GENOTÍPICA, SENSIBILIDADE A
ANTIMICROBIANOS E DETECÇÃO DE GENES DE
VIRULÊNCIA DE CEPAS CLÍNICAS E AMBIENTAIS
DE Burkholderia pseudomallei
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-
Graduação em Microbiologia Médica, da Pró-Reitoria
de Pesquisa e Pós-Graduação e da Faculdade de
Medicina, da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim
Coorientadora: Prof.a Dr.
a Raimunda Sâmia
Nogueira Brilhante
Doutoranda: Tereza de Jesus Pinheiro Gomes
Bandeira
FORTALEZA - CEARÁ
2011
3
4
À Dona Diva (in memoriam) e “Seu” Manoel, meus amados pais, dedico.
5
AGRADECIMENTOS ( ...ou a história de como cheguei aqui...)
Antes de tudo, agradeço a Deus por ter me guiado por este caminho, dando-me luz, força e
coragem para ter ações dignas, humildade e tenacidade.
Meus agradecimentos ao meu marido Pedro, meus filhos Rafael e Renata, meu tudo e razão
da minha ânsia pela vida, por me apoiarem incondicionalmente nessa minha decisão,
principalmente quando alguém questionava: “ a essa altura da vida você ainda tem coragem
de se lançar nesse sufôco?”. Aos meus irmãos, pelo carinho, amizade e confiança.
Ao Prof. Dr. Júlio Sidrim, por ter advinhado o meu desejo e ter me convidado para ser sua
aluna, invertendo afetuosamente uma ordem do passado, quando fomos pela primeira vez
professora-aluno. Por ter acreditado no meu trabalho, mesmo sabendo do tempo que
branqueou meus cabelos, confiou, me acolheu e me guiou. Pelas cobranças pertinentes e
necessárias, pelos ensinamentos e principalmente por me haver despertado a chama que move
os que buscam a intimidade com a ciência. Por tudo isso e mais os valores intangíveis de
compartilhamento, a minha mais sincera expressão de agradecimento e admiração.
Para a Profa. Dr.a Sâmia, o meu agradecimento vem numa embalagem com o mais fino e
brilhante tom da emoção por me haver segurado as mãos e conduzido por estes dois anos,
com zelo, dedicação, sabedoria, ensinando-me como conduzir uma pesquisa e, com seu
exemplo, despertando o desejo de sempre ir mais adiante. Muito me ensinou nas suas
correções, as quais eu recebia com o maior respeito. Lembro-me com graça de uma expressão
que ficou na minha memória e um pequeno riso de saudade me ocorre: ... “Doutora, isso não
é POP!”... nunca a convenci de deixar de me chamar de doutora. Com o tempo, quem sabe...?
Agradeço aos professores doutores Rossana e Marcos Fábio, pela valiosa contribuição ao meu
trabalho, com a constante disponibilidade às minhas demandas. Ao professor doutor Marcos
Fábio, que com tanto esmero revisou minhas publicações e com todo cuidado e compreensão
me ensinou a arte de escrever as linhas da ciência, meu carinhoso reconhecimento.
6
Ao retornar aos bancos de sala de aula da minha antiga escola, me deparei com professores
dedicados, comprometidos e competentes que hoje compõem o corpo docente do Programa de
Posgraduação em Microbiologia Médica - PPGMM, a todos o meu muito obrigado.
À Profa. Dra. Maria Cristina Plotkowski, Prof
a. Dra. Elisabeth de Andrade Marques e ao Prof.
Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, por terem prontamente aceitado o convite para participar
da banca examinadora.
Aos professores Vaulice Sales Café, José Luciano Bezerra Moreira e Washington Baratta
Carneiro (in memoriam) que me fizeram microbiologista, os meus mais respeitosos
agradecimentos.
Agradeço aos médicos infectologistas, Jorge Luís Nobre Rodrigues, Ivo Castelo Branco,
Francisco George Magalhães, Bráulio Matias e Roberto da Justa por terem encaminhado os
casos de melioidose e a mim confiado o diagnóstico etiológico dos seus pacientes.
Agradecimentos dirijo ao Laboratório Central do Estado do Ceará e ao Laboratório do
Hospital Geral de Fortaleza, representados por Dr.a Iracema Patrício e Dr.a Núbia,
respectivamente, por contribuirem com o meu trabalho me encaminhando casos de
melioidose.
Aos profissionais do setor de microbiologia do LabPasteur – DASA pela contribuição técnica
na identificação das espécies de B. pseudomallei e apoio constante à minha vida profissional.
Ao Prof. Vianney Mesquita, da U. F. C. e Academia Cearense da Língua Portuguesa, pela
correção estilística e gramatical deste trabalho.
Ao Instituto de Pesquisa e Estratégia Econômica do Ceará – IPECE, na pessoa do seu diretor
geral, Prof. Dr. Flávio Ataliba Barreto, pelas informações geoclimáticas e cartografias
fornecidas.
À equipe de profissionais do PPGMM e do Centro Especializado de Micologia Médica -
CEMM, Carol, secretária da pos-graduação, facilitadora da comunicação docente-discente,
por organizar nossos documentos e matrículas; às amigas, Terezinha e Monalisa, pela
contribuição valiosa aos trabalhos de bancada e preciosa acolhida diária.
7
Quando iniciei meus trabalhos no PPGMM, cumprindo os créditos das disciplinas, convivi
com uma turma jovem e alegre de alunos, que me recebeu muito amistosamente e com os
quais passei momentos maravilhosos. Mesmo o estresse de véspera de prova ou seminários,
corrida pela disputa do fluxo, concorrência por espaço, tudo era motivo para agregar mais o
grupo. Aprendi muito com todos, em especial, Amanda, Joyce, Livia, Daniel, Paiva, Eduardo
e João Jaime, que me deram reforço técnico, assim como a Débora que comigo partilhou seu
tempo na escrita, correção, elaboração de textos na lingua inglesa e finalização da tese. A
todos meu carinho, afeição e agradecimento. Vocês todos são coautores deste trabalho!
8
"Sem a curiosidade que me move, que me inquieta, que me insere
na busca, não aprendo nem ensino".
(Paulo Freire)
9
RESUMO
melioidose é uma doença infecciosa grave causada por Burkholderia pseudomallei, um bacilo
Gram-negativo encontrado no solo e na água. A doença é endêmica no sudeste asiático e
hiperendêmica no norte da Austrália, onde a letalidade permanece com uma taxa de 21%. No
Brasil, é considerada uma doença emergente desde março de 2003. Nos últimos oito anos, 12
casos ocorreram no Estado do Ceará e um notificado pelo Governo holandês, por se tratar de
um turista que morreu de melioidose, após visita ao Ceará. Em razão da ocorrência clínica de
melioidose e do isolamento de B. pseudomallei no ambiente do Estado do Ceará, este trabalho
objetivou estudar as cepas clínicas e ambientais de B. pseudomallei isoladas no Estado no
período de 2003 a 2011, visando a identificar as cepas por métodos fenotípicos e moleculares,
determinar o perfil de sensibilidade contra cinco agentes antimicrobianos
(amoxicilina/clavulanato, ceftazidima, imipenem, doxicilina e sulfametoxazol/trimetoprim),
realizar a genotipagem das cepas pela amplificação aleatória de DNA polimórfico - Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPD), detectar o gene de virulência Type Three Secretion
System (TTSS), além de avaliar os aspectos clínico-epidemiológicos que caracterizaram a
emergência desta doença no Brasil. Todas as 20 cepas (dez clínicas e dez ambientais) de B.
pseudomallei foram precisamente identificadas tanto pela metodologia VITEK2® quanto pelo
sequenciamento da região 16S do DNA, mostraram resultado negativo no teste de assimilação
de L-arabinose, e exibiram-se positivas para a detecção do gene de virulência TTSS. As
concentrações inibitórias mínimas (CIMs), obtidas por microdiluição em caldo Müeller-
Hinton, demonstraram que todos os isolados (100%) foram sensíveis ao imipenem, à
doxicilina e ao sulfametoxazol- trimetoprim, no entanto, para amoxicilina/clavulanato e
ceftazidima, a sensibilidade foi de 80 e 90%, respectivamente. A técnica de RAPD evidenciou
uma variabilidade genética de 63% entre as cepas de B. pseudomallei oriundas do Estado do
Ceará, as quais foram agrupadas em três clusters diferentes. Este trabalho decerto contribuirá
para o conhecimento das características fenotípicas e genotípicas das cepas de B.
pseudomallei isoladas no Ceará e da atualização da vigilância epidemiológica dos casos de
melioidose ocorridos no Estado, além de contribuir para a conscientização dos órgãos de
saúde competentes para a inclusão do Ceará como zona endêmica para esta enfermidade.
Palavras-chave: Ceará; melioidose; B. pseudomallei; sensibilidade antimicrobiana; gene
TTSS; RAPD.
10
ABSTRACT
Melioidosis is a serious infectious disease caused by Burkholderia pseudomallei, a Gram
negative rod, commonly found in soil and water. The disease is endemic in Southeastern Asia
and hyperendemic in Northern Australia. Despite the initiation of empiric therapy, mortality
remains at 21% in patients with melioidosis in Australia. In Brazil, it is considered an
emerging disease, since April 2003, when it was first diagnosed in Ceara, Northeastern Brazil.
In the last eight years, thirteen cases were reported, twelve local cases and one case reported
by the Dutch government because of a tourist who died of melioidosis after a visit to Ceara.
Considering the occurrence of melioidosis in Ceará, this work aimed at studying these clinical
and environmental strains of Burkholderia pseudomallei isolated from Ceará from 2003 to
2011, focusing on the bacterial and molecular identification; determining the susceptibility
profile against five antimicrobial agents (amoxicillin/clavulanate, ceftazidime, imipenem,
doxycycline and trimethoprim/sulfamethoxazole); genotyping through Random Amplified
Polymorphic DNA (RAPD), detecting the virulence gene Type Three Secretion System
(TTSS); and analyzing epidemiological and clinical aspects that characterized the emergence
of this disease in Brazil. All 20 strains (10 clinical and 10 environment) from B. pseudomallei
were accurately identified by both VITEK2 ® and sequencing of the 16S DNA, showed to be
negative for the assimilation of L-arabinose and were positive results for the detection of the
virulence gene TTSS. The minimum inhibitory concentrations (MICs) obtained through
microdilution in Müeller-Hinton broth, showed that all (100%) isolates were sensitive to
imipenem, doxycycline and trimethoprim-sulfamethoxazole, however, the susceptibility rate
to amoxicillin/clavulanate and ceftazidime was of 80 and 90%, respectively, with no
differences between clinical and environmental strains. RAPD-PCR showed a genetic
relatedness of 63% among the B. pseudomallei strains from the State of Ceará, which were
grouped in two different clusters. This work will contribute to the knowledge of phenotypic
and genotypic characteristics of B. pseudomallei strains isolated in Ceará and the update of
epidemiological surveillance of melioidosis cases in the state, also contribute to the awareness
of agencies health authority for inclusion of Ceará State as an endemic area for this disease.
Keywords: Ceara; melioidosis; B. pseudomallei; antimicobrial susceptibility; TTSS gene;
RAPD.
11
LISTA DE FIGURAS
1. Esfregaço de aspirado ganglionar corado pelo Gram. 19
2. Testes bioquímicos utilizados na triagem de B. pseudomallei. 20
3. Distribuição mundial de melioidose e isolamentos ambientais de B. pseudomallei. 29
4. Interação hospedeiro-patógeno na melioidose. 36
5. Esfregaço de material purulento aspirado de gânglio mediastinal corado pelo Gram 42
6. Isolados clínicos de Burkholderia pseudomallei: morfologia típica das
colônias.
43
7. Sete morfotipos diferentes de colônias de B. pseudomallei em ágar-Ashdown. 44
8. Crescimento de B. pseudomallei em ágar-sangue e ágar-MacConkey. 45
9. Colônia de B.pseudomallei, crescimento em ágar-Ashdown. 45
10. Colônia de B.pseudomallei, crescimento em ágar-BPSA. 46
11. Imagens que representam as técnicas de preparo do inóculo para os cartões do
VITEK2®.
57
12. Padrões de RAPD de B. pseudomallei isoladas no Ceará com o primer OPQ-16. 71
13 Dendograma da análise do gel dos produtos de PCR com o primer OPQ-16 72
14. Amplificação por PCR do gene TTSS de B. pseudomallei. 72
15 Mapa da distribuição geográfica dos casos de melioidose no Estado do Ceará 78
16. Mapa temático representativo dos tipos de solos dos municípios do Estado do
Ceará.
79
17 Mapa da representação de precipitações pluviométricas do Estado do Ceará 80
18 Mapa representativo do Modelo Digital do Relevo do Estado do Ceará 81
19 Mapa representativo dos tipos climáticos predominantes no Estado do Ceará 82
12
LISTA DE QUADROS
1. Condições geoclimáticas das regiões mundiais afetadas pela melioidose e
condições artificiais de crescimento de B. pseudomallei.
23
2 Funções de sobrevivência e virulência codificadas no genoma de B.
pseudomallei.
37
LISTA DE TABELAS
1. Relação de cepas de B. pseudomallei da coleção do CEMM. 56
2. Critérios interpretativos padronizados para os testes de sensibilidade a
antimicrobianos.
59
3 Solventes e diluentes usados na preparação e estocagem das soluções de
antimicrobianos
60
4 Relação dos primers utilizados na metodologia de RAPD 65
5 Resultado do teste de sensibilidade das cepas de B. pseudomallei pela
metodologia VITEK2®
67
6 Concentração inibitória mínima CIM de cepas clínicas e ambientais de B.
pseudomallei isoladas no Ceará determinada pela metodologia de microdiluição
em caldo Müeller-Hinton
68
7 CIM50 e CIM90 de cepas ambientais e clínicas de B. pseudomallei isoladas no
Ceará.
69
8. Cepas clínicas e ambientais de B. pseudomallei da coleção do CEMM.
Identificação bioquímica e molecular.
70
9 Características clínicas e epidemiológicas dos 13 casos de melioidose ocorridos
no Ceará, região Nordeste do Brasil.
77
10 Tipos de solo, clima, precipitações pluviométricas e altitudes dos municípios
afetados pela melioidose no Ceará
84
13
LISTA DE ABREVIATURAS
AFLP - Polimorfismo do comprimento do fragmento amplificado –(Amplified
Fragment Length Polymorfism)
AHL - N-acil-homosserina lactona
AI - Autoindutores
AMC - Amoxicilina/clavulanato
Ara - L-arabinose
ATCC - American Type Culture Collection
BHI - Brain Heart Infusion
BPSA - B. pseudomallei selective Agar
CAZ - Ceftazidima
CD - Coding Sequence
CR - Complemente Receptor
CEMM - Centro Especializado em Micologia Médica
CIM - Concentração inibitória mínima
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
CPS - Coli, Proteus, Staphylococcus
DNA - Deoxyribonucleic Acid
rDNA - DNA ribossômico
DOX - Doxicilina
DPOC - Doença pulmonar obstrutiva crônica
EDTA - Ethylenediaminetetraacetic Acid
EEUU - Estados Unidos
ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay
14
EMP - Embden-Meyerhof-Parnas
FcγR - Fc-gamma receptors
GN - Gram-negativo
BGNNF - Bacilo Gram-negativo não fermentador
IHA - Imuno-hemaglutinação
IAL - Instituto Adolfo Lutz
IgG - Imunoglobulina G
IgM - Imunoglobulina M
IMP - Imipenem
IPECE - Instituto de Pesquisa e Estratégia Econômica do Ceará
LAPERE - Laboratório de Patógenos Emergentes e Reemergentes
LPS - Lipopolissacarídeo
LVE - Lista de Verificação de Surtos e Emergências
MgCl - Cloreto de magnésio
MH - Müeller Hinton
mL - Mililitros
MLST - Multilocus Sequence Typing
NAD - Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NE - Não entérico
NaOH - Hidróxido de sódio
NVE - Núcleo de Vigilância Epidemiológica
OF - Oxidação/Fermentação
pb - Pares de bases
PCR - Polymerase chain reaction
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis
15
ppm - Partes por milhão
QS - Quorum Sensing
RAPD - Random Amplified Polimorphyc DNA
RNA - Ribonucleic Acid
rRNA - RNA ribossômico
SESA - Secretaria de Saúde do Estado (Ceará)
SMX - Sulfametoxazol
TBE - Tris-borato-EDTA
TLR - Toll-like receptor
TMP - Trimetoprim
TTSS - Type Three Secretion System
UFC - Unidade formadora de colônias
UV - Ultravioleta
16
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO – MELIOIDOSE, A DOENÇA ........................................................... 19
2 AGENTE ETIOLÓGICO ................................................................................................ 19
2.1 GENOMA .......................................................................................................................... 22
2.2 RELAÇÕES COM O MEIO AMBIENTE ................................................................................ 23
3 EPIDEMIOLOGIA - DISTRIBUIÇÃO GLOBAL E EVOLUÇÃO HISTÓRICA DA
MELIOIDOSE ........................................................................................................................ 25
3.1 ÁSIA - O BERÇO DA MELIOIDOSE ..................................................................................... 25
3.2 OCEANIA .......................................................................................................................... 27
3.3 ÁFRICA E ORIENTE MÉDIO ............................................................................................. 28
3.4 EUROPA ............................................................................................................................ 28
3.5 AMÉRICAS ........................................................................................................................ 29
3.5.1 MELIOIDOSE NO BRASIL ................................................................................................ 30
4 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR ............................................................................... 31
5 PATOGÊNESE E FATORES DE VIRULÊNCIA ASSOCIADO ............................... 33
5.1 TRANSMISSÃO .................................................................................................................. 33
5.2 FATORES DE VIRULÊNCIA - INTERAÇÃO HOSPEDEIRO – PATÓGENO ............................. 34
6 FORMAS CLÍNICAS ....................................................................................................... 40
7 DIAGNÓSTICO ................................................................................................................ 41
7.1 DIAGNÓSTICO CLÍNICO ................................................................................................... 41
7.2 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO ................................................................................... 43
7.3 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO ........................................................................................... 48
7.4 DIAGNÓSTICO MOLECULAR ........................................................................................... 49
8 TRATAMENTO ............................................................................................................... 51
9 PERGUNTAS DE PARTIDA .......................................................................................... 55
10 HIPÓTESES .................................................................................................................... 55
11 OBJETIVOS .................................................................................................................... 55
11.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 55
11.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 55
12 METODOLOGIA ........................................................................................................... 56
12.1 AMOSTRA ....................................................................................................................... 56
12.2 PRECAUÇÕES DE BIOSSEGURANÇA................................................................................ 57
12.3 TESTE DE ASSIMILAÇÃO DA L-ARABINOSE E IDENTIFICAÇÃO PRELIMINAR ................ 57
17
12.4 IDENTIFICAÇÃO E SENSIBILIDADE AUTOMATIZADAS PELA METODOLOGIA VITEK2®
58
12.5 SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS PELO MÉTODO DE MICRODILUIÇÃO EM CALDO
MÜELLER-HINTON, SEGUNDO METODOLOGIA DO CLSI, DOC. M7-A8 (CLSI, 2009B). ........ 59
12.6 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR POR PCR ESPECÍFICA ................................................... 62
12.7 SEQUENCIAMENTO DE DNA .......................................................................................... 63
12.8 TÉCNICA DE RAPD - DNA POLIMÓRFICO AMPLIFICADO ALEATORIAMENTE ............ 65
12.9 REAÇÕES DE PCR PARA DETECÇÃO DO GENE DE VIRULÊNCIA ................................... 65
12.10 CATALOGAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICOEPIDEMIOLÓGICAS DOS CASOS DE
MELIOIDOSE OCORRIDOS NO CEARÁ, NO PERÍODO DE 2005 A 2011 ....................................... 66
13 RESULTADOS ............................................................................................................... 66
12.11 TESTES MANUAIS DE IDENTIFICAÇÃO PRELIMINAR E TESTE DE ASSIMILAÇÃO DE L-
ARABINOSE ............................................................................................................................... 66
12.12 RESULTADOS DA IDENTIFICAÇÃO AUTOMATIZADA E SENSIBILIDADE PELA
METODOLOGIA VITEK2® ...................................................................................................... 67
12.13 RESULTADOS DO TESTE DE SENSIBILIDADE PELA MICRODILUIÇÃO EM CALDO
MÜELLER-HINTON................................................................................................................... 68
12.14 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR PELA TÉCNICA DE PCR ESPECÍFICA ........................... 69
12.15 SEQUENCIAMENTO DA REGIÃO 16S DO DNAR ........................................................... 69
12.16 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA PELA TÉCNICA DE RAPD ....................................... 70
12.17 DETECÇÃO DO GENE TTSS PELA TÉCNICA DA PCR .................................................. 72
12.18 CATALOGAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICOEPIDEMIOLÓGICAS DOS CASOS DE
MELIOIDOSE OCORRIDOS NO CEARÁ ....................................................................................... 73
14 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 84
15 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 91
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 93
ANEXOS ............................................................................................................................... 114
ANEXO I ............................................................................................................................... 115
ANEXO II .............................................................................................................................. 116
ANEXO III ............................................................................................................................ 120
ANEXO IV ............................................................................................................................ 121
ANEXO V .............................................................................................................................. 122
ANEXO VI ............................................................................................................................ 123
ANEXO VII ........................................................................................................................... 124
ANEXO VIII ......................................................................................................................... 125
18
ANEXO IX ............................................................................................................................ 126
ANEXO X .............................................................................................................................. 127
ANEXO XI ............................................................................................................................ 128
19
1 INTRODUÇÃO – MELIOIDOSE, A DOENÇA
Burkholderia pseudomallei, agente causal da melioidose, é um bacilo Gram-negativo
habitante natural do solo e da água e tem sido isolado do solo em áreas endêmicas da doença
(KAESTLI et al., 2009). melioidose é uma doença infecciosa grave que acomete o homem e
animais, apresentando uma grande variedade de formas clínicas, desde infecção assintomática
até choque séptico fulminante (SUPRAPOM et al., 2007). A maioria dos casos de melioidose
relatada apresenta uma história natural de infecções recentes, embora o estado de latência com
reativação após vários anos tenha sido comprovado (CHENG; CURRIE, 2005). A melioidose
se manifesta de forma endêmica no sudeste asiático, hiperendêmica na Austrália tropical e
ocorre esporadicamente em outros países (CURRIE, 2009). Essa doença é ocasionalmente
relatada em turistas que retornam de zonas endêmicas (GÉTAZ et al., 2011).
A infecção por B. pseudomallei em humanos e animais pode ocorrer por inoculação,
ingestão de água contaminada ou inalação de aerossóis ambientais. Na melioidose, as mais
prováveis situações que favorecem a contaminação com o seu agente são: a rega do solo na
estação da seca e a época das precipitações pluviométricas. Nestas situações, animais e seres
humanos podem adquirir do solo ou água barrenta partículas que transportam a bactéria
(HOLDEN et al., 2004).
A exposição da população a B. pseudomallei em áreas endêmicas da melioidose pode
determinar no indivíduo, uma vez infectado, uma resposta imunológica pela produção de
anticorpos sem evidência clínica da doença (WUTHIEKANUM et al., 2004).
2 AGENTE ETIOLÓGICO
Várias publicações descreveram o agente causal da melioidose, apresentando uma
nomenclatura evolutivamente variável, desde Bacillus whitmorii, Pfeifferella whitmorii,
Pfeifferella pseudomallei, Actinobacillus pseudomallei, Loefferella whitmorii, Malleomyces
pseudomallei, Pseudomonas pseudomallei, até Burkholderia pseudomallei, proposta por
Yabuuchi et al., em 1993 (YABUUCHI et al., 1993; SPRAGUE; NEUBAUER, 2004).
20
B. pseudomallei está classificada taxonômicamente, segundo o manual Bergey em: Reino - Bacteria,
Filo – Proteobacteria,
Classe - Beta Proteobacteria,
Ordem - Burkholderiales,
Família - Burkholderiaceae,
Gênero - Burkholderia
Espécie - Burkholderia pseudomallei.
(BRENNER et al., 2005)
B. pseudomallei é um bacilo Gram-negativo, de vida intracelular facultativa, reação de
oxidase positiva, ligeiramente curvo, mede 0,5 a 1,0 µ, não esporula e apresenta aspecto
bipolar quando corado pelo Gram, com extremidades arredondadas e aparência de broche de
segurança (Figura 1). B. pseudomallei apresenta um só flagelo polar ou, às vezes, um tufo de
flagelos polares (CHENG; CURRIE, 2005).
Figura 1. Esfregaço de aspirado ganglionar corado pelo Gram, apresentando bacilos Gram-negativos. Nas setas,
destaque para bacilos com formas de broche de segurança. Fonte: LAPERE, 2009.
As espécies do gênero Burkholderia são classificadas no grupo dos bacilos Gram-
negativos não fermentadores de glicose e são aeróbios, ou seja, dependentes do oxigênio
como aceptor final de elétrons. A espécie B. pseudomallei possui, entretanto, a capacidade de
crescer também em meios contendo nitrato, pois utiliza o nitrato ou nitrito no lugar do
21
oxigênio como aceptor final de elétrons, podendo, assim, também crescer anaerobicamente
(HAMAD et al., 2011). A designação de “não fermentador” significa que essa espécie de
bactéria não metaboliza glicose pela via da fermentação de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP),
também denominada via glicolítica ou anaeróbica (HUGH; LEIFSON, 1953). Espécies de B.
pseudomallei utilizam, no entanto, carboidratos como fonte de energia por intermédio da
respiração aeróbica, quando o aceptor final de elétrons é o oxigênio, ou anaeróbica, quando
este aceptor é o nitrato. A enzima citocromo oxidase, comum em bactérias aeróbias, está
presente nas espécies de B. pseudomallei catalisando o transporte de elétrons do composto
doador (NAD – nicotinamida adenina dinucleotideo) para o aceptor (geralmente o oxigênio).
Este sistema de citocromo tem como produto final de metabolismo a água e o peróxido de
oxigênio. Este último, em seguida, é hidrolisado pela enzima catalase (ISENBERG, 2004).
Na Figura 2, ilustra-se uma representação do metabolismo de carboidratos de B.
pseudomallei em meios de cultura com provas bioquímicas para testar a utilização dos
açúcares glicose e lactose pela reação de oxidação/fermentação (OF) de Hugh-Leifson e da
reação de oxidase em tiras de papel.
Figura 2. Testes bioquímicos utilizados na triagem de B. pseudomallei. (a) teste de fermentação/oxidação de
glicose (Hugh-Leifson) com padrão oxidativo evidenciado pelo crescimento em amarelo no tubo não selado e
manifestação assacarolítica (inerte) no tubo selado com óleo mineral; (b) teste de oxidase positivo - a tira de
papel possui um aceptor artificial de elétrons, que é o composto N’-tetra-methyl-p-phenylenediamine
dihydrochloride que, ao ser oxidado, forma o composto indofenol azul (Dry-slide Difco); (c) Meio IAL (Instituto
Adolfo Lutz) exibe um metabolismo oxidativo pela ausência de mudança do pH no meio (padrão inerte). Fonte:
LAPERE, 2011.
a b c
22
2.1 Genoma
O genoma de B. pseudomallei foi determinado pela cepa K96243, isolada de um caso
clínico na Tailândia. Contém 7.25 megabase de pares e consiste de dois replicons circulares
de 4,07 Mb e 3,17 Mb cada (European Molecular Biology Laboratory accession, BX571965
[GenBank] e BX571966 [GenBank]). Estes dois replicons foram designados como
cromossomo 1 e cromossomo 2 e codificam 3.460 e 2.395 sequências codificadoras,
respectivamente (HOLDEN et al., 2004).
O genoma da espécie B. pseudomallei possui muitas ilhas genômicas e sequências de
repetição, semelhante ao que foi encontrado no genoma de Burkholderia mallei à qual é
estreitamente relacionada. Três diferentes sistemas de secreção do tipo III, TTSS, são
codificados nos cromossomos de B. Pseudomallei, cujo funcionamento está na dependência
da expressão de um complexo grupo de genes (HOLDEN et al., 2004).
O cromossomo 1 contém maior proporção de sequências codificadoras envolvidas em
funções essenciais, como a biossíntese de macromoléculas, metabolismo de aminoácidos, de
cofatores, de nucleotídeos e de proteínas. O cromossomo 2 contém um fraco padrão G + C e
um replicon com as mesmas características apresentadas por plasmídios. Segundo Holden et
al (2004), as sequências codificadoras desse cromossomo estão envolvidas no metabolismo
central e em funções também essenciais, o que o levou a designar este componente do
genoma de “cromossomo 2”, em vez de megaplasmídio.
Ademais, o cromossomo 2 contém uma proporção maior de sequências codificadoras
de funções acessórias, como adaptação às condições atípicas, proteção contra injúria
osmótica, aquisição de ferro, metabolismo secundário, regulamentação e aquisição de DNA.
Este compartilhamento entre funções acessórias e principais destes dois cromossomos de B.
pseudomallei parece ser uma característica remanescente da convivência desta bactéria com
Streptomyces coelicolor, também habitante do solo, com quem provavelmente coabitou no
meio ambiente, na rizosfera (HOLDEN et al., 2004).
A dupla existência de B. pseudomallei, como colonizador do solo e patógeno humano,
exige flexibilidade, o que se vê refletido na magnitude do seu genoma. O tamanho do genoma
dota o microrganismo com um amplo estoque de sequencias codificadoras (Coding Sequence
CDs) de funções diversas que promovem a sobrevivência em vários ambientes. Esta
capacidade é evidente no grande repertório metabólico codificado e na redundância vista por
23
alguns dos determinantes de virulência, tais como a secreção de proteínas do sistema de
secreção do tipo III, que injetam na célula potentes adesinas, cuja função se adita às funções
de adesão também atribuídas às fimbrias (HOLDEN et al., 2004).
2.2 Relações com o meio ambiente
B. pseudomallei é um microrganismo saprófita do solo em regiões tropicais e residente
da rizosfera. Foi isolado em campos de plantações de arroz, água estagnada e no solo úmido
(BRETT; WOODS, 2000).
Este microrganismo pode ser encontrado nas camadas de argila em uma profundidade
que varia de 25 a 120 cm da superfície e pode ainda sobreviver em uma faixa de temperatura
de 4 a 42 oC em água barrenta. Uma hipótese para a facilidade com que este agente cresce no
solo é a sua propriedade de reduzir nitrato, permitindo o seu crescimento em baixas
concentrações de oxigênio. Além disso, o isolamento de B. pseudomallei das camadas abaixo
da superfície do solo e da água é relatado como resultado da sensibilidade deste agente à luz
ultravioleta nas camadas mais superficiais destes ambientes (DANCE, 2000a).
As observações de Sprague e Neubauer (2004) também reforçam esta hipótese, uma
vez que esses autores relataram que B.pseudomallei foi isolada com frequência do solo em
locais onde os animais descansam em áreas sombreadas protegidas do sol. Relataram também
uma característica de sobrevivência desta espécie no solo pela sua movimentação em busca de
oxigênio, chamada aerotatismo ou aerotaxis, que contribui para que elas se desloquem
ativamente das camadas mais profundas do solo para as mais superfíciais, facilitadas pelo
umedecimento do solo, decorrente, por exemplo, da chuva ou de práticas agrícolas.
B. pseudomallei é sensível à radiação ultravioleta (UV) da luz solar (SAGRIPANTI et
al., 2009), não se multiplica no estuário ou água salgada e o pH que permite a sua
multiplicação no solo pode variar de 4,0 a 8,0 sob uma umidade mínima de 10-15% (INGLIS
et al., 2001).
O cloro, por sua vez, tem apenas um efeito bacteriostático sobre B. pseudomallei, pois
este agente foi recuperado da água contendo até 1.000 ppm (partes por milhão) de cloro livre
(HOWARD; INGLIS, 2003; INGLIS T. J. J.; SAGRIPANTI, J., 2006). Em relação ao óxido
de cálcio a 10% (cal), o seu efeito inibidor contra B. pseudomallei foi demonstrado em
24
laboratório, em amostras de solo coletadas em um campo de arroz no norte-leste da Tailândia
(WHITE et al., 2003).
As condições geoclimáticas das regiões mundiais onde a melioidose ocorreu de forma
endêmica ou esporádica nos últimos anos e algumas características de crescimento de B.
pseudomallei no meio ambiente e in vitro estão sumariadas no Quadro 1. Observa-se neste
quadro a versatilidade de crescimento e sobrevivência deste agente em condições
geoclimáticas e laboratoriais diversas.
Quadro1. Condições geoclimáticas das regiões mundiais afetadasde pela melioidose e condições artificiais
de crescimento de B. pseudomallei relatadas na literatura com suas respectivas referências.
Condições Referências
Temperatura de 37–42°C in vitro Dance (2000a)
Atmosfera de anaerobiose Tandhavanant et al., (2010); Hamad et al., (2011)
Temperatura de 5°C in vitro Yabuuchi et al., (1993)
Crescimento em soluções antissépticas Cheng; Currie, (2005); Gal et al, (2004)
Clima tropical e subtropical Dance (2000a)
Áreas abertas sem florestas Dance (2000a)
Estação das chuvas Draper et al., (2010); Dance, (2000a); Chen et al., (2010);
Limmathurotsakul. et al., (2011); Inglis et al, (2001); Currie; Jacups,
(2003)
Estação da seca Inglis et al, (2001); Currie, (2001)
Ambientes com escassez de nutrientes Wuthiekanun et al., (1995); Inglis et al., (2001)
Áreas de pastagens de animais Dance, (2000a); Sprague; Neubauer, (2004)
Terrenos com altitudes de 140 a 557 m Dance, (2000a), Rattanavong, (2011)
Solo de plantações de arroz Dance (2000a)
Solo argiloso (maior retenção de água) Inglis (2001), Palasatien et al., (2008)
Solo arenoso Wuthiekanun et al., (1995)
Solo a uma faixa de pH de 2,0 a 9,0 Finkelstein, (2000), Inglis (2001), Robertson et al., (2010)
Solo desidratados (conteúdo d’água <10%) Chen et al., (2003)
Solo - ambiente da rizosfera Kaestli, (2009), Chen et al., (2003)
Fonte: elaboraçãoo própria, recorrendo à literatura.
A associação de melioidose com a época de chuvas é embasada na hipótese de que,
durante este período, B. pseudomallei é movida para a superfície, à medida que o volume da
água sobe com as fortes chuvas. Alguns autores observaram também que este fenômeno de
movimento dos microrganismos para a superfície resulta em uma quantidade maior de inóculo
ofertada às pessoas contactantes. Com efeito, os pacientes acometidos de melioidose após
uma ou duas semanas da ocorrência de chuvas pesadas apresentaram formas mais graves da
doença (CURRIE; JACUPS, 2003; CHENG; CURRIE, 2005; INGLIS;SAGRIPANTI, 2006).
Em decorrência da facilidade de disseminação e manutenção de B. pseudomallei no
meio ambiente, sua fácil transmissibilidade e por causar patologia de alta letalidade, o centro
25
de controle de doenças nos EEUU, Centers for Disease Control and Prevention (CDC), a
classificou como agente da categoria B de terrorismo biológico, e recomendou que este
microrganismo seja tratado em nível 3 de biossegurança. Além dos EEUU, a antiga União
Soviética, e, possivelmente, o Egito consideram B. pseudomallei como um agente de guerra
biológica em potencial, mas nunca o usaram para esta finalidade (KORTEPETER et al., 2000;
ALIBEK et al., 1999; SHOHAM et al., 1998).
3 EPIDEMIOLOGIA - DISTRIBUIÇÃO GLOBAL E EVOLUÇÃO
HISTÓRICA DA MELIOIDOSE
3.1 Ásia - o berço da melioidose
Em 1913, na Ásia, o capitão Alfred Whitmore, um médico patologista britânico
servindo na Birmânia trabalhava no laboratório do Hospital Geral em Rangoon quando
publicou um relato de caso sobre uma nova patologia no qual se declarou afortunado por
haver deparado uma doença estranha, grave, logo nos primeiros dois anos de trabalho naquele
país.
Nesse relatório, o autor assim se expressou:
As oportunidades de um patologista em um grande hospital oriental são
muitas; mas seu tempo para o trabalho de pesquisa é curto e suas
conveniências são poucas. Indubitavelmente, é ao acaso que devemos a
distinção de uma doença; mas, espero que tenha sido por observação acurada
e experimentação precisa que tenhamos buscado preencher nosso
conhecimento.
(WHITMORE, A., J. Hyg., v.13, p.1, 1913).
Esta declaração é parte do relato dos primeiros casos de uma doença infecciosa grave,
com características semelhantes a mormo, que se manifestou em Rangoon em 1911. Nessa
ocasião, foi realizada uma necropsia no corpo de um birmanês de 40 anos, usuário de morfina,
admitido ao hospital com febre que persistia há sete dias e múltiplos abscessos superficiais
nas marcas de injeções. Foram encontradas lesões pulmonares caseosas cuja distribuição e
aparência não se assemelhavam a pneumonia lobar nem a tuberculose. Um esfregaço destes
materiais evidenciou a presença de um bacilo com a mesma forma e tamanho do então
conhecido Bacillus mallei, causador de Mormo. Em seu relato, Alfred Whitmore revelou
ainda que as autoridades locais foram notificadas, mas a doença não pôde ser catalogada
26
como Mormo, pois não havia evidência de contato com cavalos, uma vez que o paciente tinha
sido liberado recentemente de uma prisão. Vários experimentos foram realizados pelo Dr.
Whitmore, como inoculação em meios artificiais e em cobaias, além de observações
pertinentes sobre a doença por ele detalhadamente descrita (WHITMORE, 1913).
Em 1914, um ano após a descrição original da melioidose por Alfred Whitmore, um
surto de uma doença septicêmica fatal vitimou vários animais do laboratório do Instituto de
Pesquisa Médica, em Kuala Lumpur, capital da Malásia (STANTON; FLETCHER, 1921).
Em 1917, A.T. Stanton investigou um surto de uma doença semelhante à cólera, mas
com evolução septicêmica, que ocorreu ao sul de Rangoon, e isolou de espécimes clínicos e
espécimes colhidos pos-mortem o seu agente causal, um bacilo semelhante ao descrito por
Whitmore. Em 1919, Stanton, juntamente com Fletcher, reconheceram a semelhança entre os
agentes isolados destes surtos com o bacilo de Whitmore e criaram, nesta ocasião, o termo
melioidose para a denominação da doença, do grego melis, que significa semelhante ao
mormo (STANTON; FLETCHER, 1921).
Pons e Advier, em 1925, diagnosticaram o primeiro caso de melioidose no Vietnã em
uma paciente de 24 anos, grávida, que vivia num vilarejo nos arredores de Saigon.
Hemoculturas foram realizadas e apresentaram o isolamento de um bacilo Gram-negativo
que, segundo o autor, foi identificado como Bacillus whitmorii (PONS et al. 1927). Em
seguida a esta ocorrência, surgiu o primeiro caso de melioidose em Singapura, no ano de 1931
(STANTON; FLETCHER, 1932).
A melioidose teve grande impacto na saúde dos soldados que serviram na Ásia em
tempos de guerra, quando esta doença se manifestou em soldados aliados japoneses na
Birmânia, Malásia e na Tailândia (PATON et al.,1947), além dos casos de melioidose latente
que recrudesceram em veteranos após a guerra. Durante a Guerra da Indochina, havia pelo
menos 100 casos de melioidose entre as forças francesas (PECK; ZWANENBURG, 1947).
Esta doença continuou seu ciclo de instalação no sudeste da Ásia, quando ocorreu pela
primeira vez na Índia e na Turquia em 1953. Na Tailândia, esta doença surgiu pela primeira
vez em 1955 e o seu agente foi isolado no solo em várias regiões desse país (CHITTIVEJ, et
al., 1955; IVES et al., 1961).
Em Hong-Kong, foram relatados quatro casos de melioidose septicêmica em pacientes
idosos com Diabetes Mellitus (SO et al., 1984). Em Taiwan, melioidose foi relatada em 1985
no Lin-Kou Medical Center, em Taipei, onde uma paciente de 46 anos, transferida das
Filipinas, foi admitida com pneumonia secundária a afogamento (LEE et al., 1985).
27
Até 1989 a melioidose não tinha sido relatada na Indonésia nem nas Filipinas, países
que foram relacionados a casos de melioidose em viajantes após visitá-los
(LEELARASAMEE; BOVORNKITTI, 1989).
Em 1999, foi relatado um caso de melioidose em um paciente belga de 66 anos com
história de viagem anterior ao Siri-Lanka, que apresentou abscesso pulmonar e cerebral em
cujo aspirado foi isolado B. pseudomallei. (PEETERMANS et al., 1999).
Outros países asiáticos onde melioidose tem ocorrido são Índia, Bangladesh e
Paquistão (CURRIE, 2003). Ao longo do século XX, a melioidose teve sua disseminação
facilitada pelas guerras, principalmente com envolvimento em conflitos asiáticos.
Uma vez que B. pseudomallei, agente da melioidose, é um microrganismo encontrado
no solo, a taxa de infecção entre soldados durante e após o serviço na guerra foi quatro vezes
superior ao da população em geral, sugerindo que o contato próximo com o solo durante os
treinamentos e manobras militares pode acarretar um risco aumentado de melioidose
(VIETRI; DESHAZER , 2008). Já no século atual, B. pseudomallei foi isolada em espécimes
clínicos de 14 pacientes em Brunei, no período de 2001 a 2007, dos quais foram isoladas 11
cepas em hemocultura (PANDE; KADIR, 2011).
3.2 Oceania
Na Oceania, a melioidose ocorreu pela primeira vez na Austrália, em 1949, depois da
Segunda Guerra Mundial, por ocasião de um surto em ovinos no norte do Estado de
Quensland. No ano seguinte, sucedeu a primeira manifestação humana da melioidose nesse
país, permanecendo, desde então, endêmica, principalmente em áreas tropicais
(REMINGTON, 1962). A melioidose é considerada também endêmica em Townsville, uma
cidade na costa do nordeste desse país, e hiperendêmica na extremidade superior do território
norte da Austrália, onde foi considerada a causa mais comum de pneumonia bacteriana fatal
na comunidade.
Em uma remota comunidade costeira da Austrália ocidental, em 1997, durante a
estação da seca, uma quantidade anormal de casos de melioidose foi confirmada pelo
isolamento de B. pseudomallei em espécimes clínicos de sete pacientes envolvidos, o que
determinou uma investigação de surto. O isolamento de B. pseudomallei ocorreu também em
28
amostras em locais próximos das casas dos pacientes e na água de abastecimento público
(INGLIS et al., 1999; CHENG; CURRIE, 2005).
3.3 África e Oriente Médio
A melioidose foi relatada na África, inicialmente, em espécies animais. Na Nigéria
esta doença acometeu porcos em 1936 (GIRARD, 1936); dromedários em 1986
(GALIMAND; DODIN, 1986) e o seu agente, B. pseudomallei, foi isolado em tecidos de
abortos fetais em cabras na África do Sul (VAN DER LUGT; HENTON, 1995). Apesar
destes relatos, a doença em humanos foi relatada pela primeira vez apenas em 1985 no oeste
deste Continente (WALL et al., 1985) e posteriormente em Gâmbia, Quênia, Madagascar,
Serra Leoa e Uganda (LIMMATHUROTSAKUL; PEACOCK., 2011). A ocorrência de
melioidose no Continente Africano está mais frequentemente relacionada a casos de
melioidose descritos em pessoas que visitaram este Continente em épocas anteriores
(SALAM et al., 2011).
No Oriente Médio, a melioidose foi relatada esporadicamente com casos confirmados
apenas no Iran (POURTAGHVA et al., 1977). Em outros países desta região, no entanto,
foram relatados casos com identificação não confirmada, histórias incertas de viagens ou
casos com apenas evidências sorológicas. Estas últimas ocorrências envolvem os seguintes
países: Emirados Árabes Unidos, Arábia Saudita, Egito e Turquia (DANCE, 2000b).
3.4 Europa
A melioidose também foi relatada em regiões não tropicais. Por volta de 1970, casos
de melioidose ocorreram na França, em um zoológico de Paris, e daí a doença se espalhou
para outros zoológicos e centros equestres na França. Houve extensa contaminação do solo
que persistiu por alguns anos, além de dois casos humanos fatais e óbitos em cavalos
(quantidade não relatada). Nesta ocorrência, B. pseudomallei foi introduzida na França
provavelmente pela importação de animais infectados, tendo como maior suspeita cavalos
provindos do Iran. Não houve repetição ou continuação do surto nem casos esporádicos
descritos na França após este episódio, que ficou conhecido como L’affaire du Jardin des
Plantes. (CURRIE, 2003).
29
Outro episódio relacionado à melioidose na Europa foi relatado em Bolonha, na Itália,
no ano 2000, quando uma pesquisa foi realizada com o objetivo de ampliar a abrangência do
exame bacteriológico da água pela inclusão de B. pseudomallei e B. mallei na lista de
organismos detectados por este exame. Foram cultivadas 85 amostras de água potável para
detectar a presença destes dois microrganismos, das quais 7% apresentaram o isolamento de
B. pseudomallei e 3,5% Burkholderia mallei (ZANETTI et al, 2000).
3.5 Américas
Nos Estados Unidos da América (EUA), a melioidose manifesta-se como casos
relacionados à história de viagens anteriores dos pacientes a áreas endêmicas ou casos com
evidências apenas sorológicas (BEAMER et al., 1948; EICKHOFF et al., 1970;
MCCORMICK et al., 1977).
As guerras contribuíram para aumentar as ocorrências de melioidose nos EEUU por
meio das manifestações da forma latente da doença após o seu término. Os relatos de casos de
melioidose relacionados à Guerra do Vietnã contribuíram com a mudança na descrição desta
doença pelo reconhecimento de suas formas crônicas e reativadas (HOLDEN et al., 2004).
Estas ocorrências levaram os pesquisadores na época a observarem a tendência da doença de
se manifestar depois de um intervalo, a contar do momento do contágio, fenômeno este que
alcançou o recorde de 29 anos em veteranos do Vietnã.
A forma pneumônica da melioidose também foi relacionada a estadunidenses, pilotos
de helicópteros, em decorrência da inalação de poeiras contaminadas oriundas da terra
revolvida pelo movimento das hélices durante a Guerra do Vietnã (CHENG; CURRIE, 2005;
INGLIS; SAGRIPANTE, 2006). Foram relatados 343 casos de melioidose entre os soldados
dos EEUU durante a Guerra do Vietnã, alguns dos quais só se manifestaram anos após o fim
do conflito, fenômeno este que foi denominado de Vietnã Time Bomb (VIETRI; DESHAZER,
2007).
A primeira vez que melioidose foi associada à América Latina foi em um caso
diagnosticado nos EUA em um paciente que trabalhou no canal do Panamá em 1962
(BIEGELEISEN et al., 1964; INGLIS et al., 2006a). Existem relatos de casos esporádicos de
melioidose na América Central (DORMAN et al., 1998), ocorridos principalmente após
inundações. Nesta parte da América, no entanto, as tempestades tropicais não causaram surtos
de Melioidose, a exemplo do que ocorreu após o tsunami do oceano Índico em 2004.
30
Provavelmente dificuldades na qualificação dos laboratórios clínicos nesses países tenham
impossibilitado o diagnóstico etiológico causando possivelmente subnotificação desta
patologia (INGLIS et al., 2006a).
A ocorrência mundial da melioidose foi representada na figura 3, com mapeamento
das áreas endêmicas, das manifestações de casos esporádicos e de relatos de isolamentos
ambientais do seu agente causal, B. pseudomallei.
Figura 3. Distribuição mundial de melioidose e isolamentos ambientais de B. pseudomallei. Fonte CHENG; CURRIE, 2005.
3.5.1 Melioidose no Brasil
No Brasil, existem referências que relatam o isolamento de B. pseudomallei por
pesquisadores franceses em 1977, no solo de duas cidades do interior da Bahia (São Félix e
Santo Antônio), embora as evidências deste isolamento não tenham sido detalhadas. Houve
tentativa de isolar este agente em plantações de arroz no interior do Estado de São Paulo, no
entanto, nenhuma das amostras cultivadas mostrou isolamento de B. pseudomallei
(PESTANA DE CASTRO et al., 1973; GALLIMAND; DODIN, 1982; DANCE, 1991). Em
2007, Barth et al relataram um caso de melioidose em um paciente matogrossense de 17 anos
com fibrose cística, comprovado por isolamento de B. pseudomallei e confirmado por
identificação fenotípica e genotípica.
A primeira manifestação humana da melioidose no Brasil, no entanto, remonta ao ano
de 2003 no Estado do Ceará, pela ocorrência de um surto no interior do Estado, descrito a
31
seguir, juntamente com os casos posteriores ocorridos no Ceará até o ano de 2005 e já
relatados na literatura no momento do início deste trabalho:
Casos no 1, 2, 3 e 4 – no Município de Tejuçuoca, localizado ao norte do Estado, a
uma latitude(S) 3º 59’ 20’’ e longitude(WGr) 39º 34’ 50’’, ocorreu a primeira manifestação
de melioidose que teve o envolvimento de quatro crianças da mesma família. As crianças
com idade de 10, 12 14 e 15 anos, duas do sexo feminino e duas do sexo masculino eram
consideradas até então saudáveis, embora com certo grau de desnutrição. Foram internadas
em um hospital da região com queixa de febre, tosse, dor de cabeça e pústulas nos membros
inferiores havia dez dias. O diagnóstico etiológico destes casos foi feito pelo isolamento de
bacilo Gram-negativo na hemocultura de três dos quatro pacientes. A identificação foi
realizada pela metodologia API 20 NE (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) e confirmada por
PCR. O quadro clínico evoluiu para sepse fulminante e apenas uma dessas três crianças
sobreviveu (ROLIM et al., 2005; VIRGINIO et al., 2006).
Caso no 5 - após o incidente de Tejuçuoca, outro caso de melioidose septicêmica
ocorreu em 2004 no Município de Banabuiú, situado no centro-leste do Estado do Ceará, a
uma latitude(S) 5° 18’ 35” e longitude(WGr) 38° 55’ 14”, cerca de 400 km do local do
primeiro surto. Uma mulher de 39 anos, que costumava lavar roupa agachada em um rio nas
proximidades de sua residência, apresentou um abscesso perineal, motivo pelo qual foi
admitida ao hospital com sepse grave. Foram colhidas amostras de sangue para cultura, cujo
resultado positivo mostrou isolamento de B. pseudomallei identificada por provas
bioquímicas e confirmada posteriormente por métodos moleculares (ROLIM et al., 2005).
4 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
As cepas de B. pseudomallei isoladas por ocasião de surtos foram avaliadas, durante
os anos que se seguiram às primeiras manifestações de melioidose, por uma variedade de
ferramentas moleculares para inferir similaridade genética entre elas. Esses métodos incluem:
ribotipagem, DNA polimórfico amplificado aleatoriamente, ou Random Amplified
polymorphic - DNA (RAPD), e análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico
por eletroforese em gel de campo pulsado ou pulse-fiel gel electrophoresis – PFGE (CHENG;
CURRIE, 2005).
A técnica de RAPD, descrita pela primeira vez por Williams et al., (1990), consiste na
técnica de PCR, que amplifica o DNA genômico utilizando primers de sequência arbitrária
com dez nucleotídeos. Tipicamente utiliza-se apenas um tipo de primer em cada reação, sendo
este normalmente formado por diferentes combinações das quatro bases nitrogenadas, com
32
um conteúdo de G+C entre 50 e 70% (FRITSCH; RIESEBERG, 1996). Este método é
utilizado para analisar relações entre cepas clínicas e ambientais de B. pseudomallei (HAASE
et al., 1995; LEELAYUWAT et al., 2000).
PFGE é uma técnica de eletroforese apropriada para separar grandes fragmentos de
DNA, por meio da reorientação do DNA no gel pela ação de campos elétricos alternados
(FANGMAN, W. L., 1978). Na Malásia, 146 isolados de B. pseudomallei foram submetidos à
tipagem molecular pela utilização de PFGE. Nove clusters foram identificados e os autores
conseguiram com este estudo mapear os isolados clínicos no país (CHUA et al., 2010).Chen
et al., (2010) realizaram um estudo sobre a prevalência de B. pseudomallei no solo da
Tailândia e, pela utilização da metodologia de RAPD e PFGE, evidenciaram a presença de
padrões genéticos idênticos entre os isolados clínicos e ambientais.
Um surto de casos de melioidose aguda ocorreu no verão em um vilarejo da Austrália.
As cepas isoladas de amostras clínicas e dos reservatórios d’água foram submetidas à tipagem
molecular pela utilização da técnica de PFGE, cujo resultado mostrou semelhanças entre elas
(INGLIS et al, 1998).
Nos estudos epidemiológicos da melioidose, comparações de métodos de tipagem
molecular demonstram que as análises de RAPD e PFGE são mais discriminatórias do que
ribotipagem (HAASE et al., 1995; VADIVELU et al., 1997; INGLIS et al., 2002). A
constatação de que existem diferentes linhagens de B. pseudomallei com variados antígenos e
genes de virulência demandou estudos moleculares para tipagem molecular de isolados
australianos por PFGE e ribotipagem para caracterização de clusters (CHENG; CURRIE,
2005).
Segundo Currie et al. (2009), PFGE e MLST (Multilocus Sequence Typing) podem
relacionar geneticamente cepas epidemiologicamente relacionadas, mas demandam muito
tempo para obtenção dos resultados. Os autores desenvolveram um método simplificado da
reação de MLST (Multilocus variable analysis), com quatro locus (MLVA-4) que permitiu
implementar melhorias à epidemiologia global e regional da melioidose em áreas endêmicas
(CURRIE et al., 2009; BAKER et al., 2011; INGLIS et al., 2011).
Ribotipagem é um método que identifica e classifica bactérias de acordo com suas
diferenças no RNA ribossômico. Esta técnica usa o padrão de restrição do operon de RNA
ribossômico, 16S e 23S, como ferramenta epidemiológica e fornece bons resultados para a
33
detecção de polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição (BOUCHET et al.,
2008).
A ribotipagem foi utilizada por alguns autores para estudos epidemiológicos em
melioidose mediante emprego do padrão de polimorfismo de comprimento de fragmentos de
restrição (Restriction Fragment Length Polymorphisms – RFLP) de RNA ribossômico, para
analisar se a melioidose recorrente foi devido à recaída com a mesma cepa, se foi reinfecção
com uma cepa diferente (LEW, A.E.; DESMARCHELIER, P.M., 1993; CURRIE et al.,
2000). Estudos mostraram também a importância desta metodologia para verificar se alguns
ribotipos predominavam em determinadas áreas geográficas ou eram restritos a uma fonte
comum (CURRIE et al., 2001). O trabalho de Lew e Desmarchelier (1994) foi o primeiro a
utilizar PCR para diagnóstico de B. pseudomallei pelo uso de uma porção conservada da
região 23S rDNA como alvo (LEW, A.E.; DESMARCHELIER, P.M, 1994).
5 PATOGÊNESE E FATORES DE VIRULÊNCIA ASSOCIADO
5.1 Transmissão
Na melioidose, tal como acontece em outras doenças infecciosas, o tamanho do
inóculo tem relação direta com a severidade da doença. Situações que apresentam elevada
carga de inóculo, como ocorrem em afogamentos, estão associadas a uma gravidade maior e a
curtos períodos de incubação, até menos de 24 horas. Os períodos de chuvas fortes estão
associados, não só com o maior número de casos, como também com apresentações
pneumônicas, o que imputa maior importância para inalação como porta de entrada
(CURRIE; JACUPS, 2003; CHENG; CURRIE, 2005). Pequenas feridas nos pés dos
plantadores de arroz são comuns durante o plantio e colheita e funcionam como porta de
entrada, uma vez que esses trabalhadores passam a maior parte do dia com os pés
mergulhados na lama ou água estagnada. Foram descritos também casos de melioidose por
inoculação por picada de cobra em trabalhadores rurais (CHENG; CURRIE, 2005).
Nos relatos de Cheng e Currie (2005), 25% dos casos de melioidose do hospital de
Darwin, na Austrália, apresentaram história de uma lesão de inoculação antes da manifestação
da doença; nesse subgrupo de pacientes foi observado também um período de incubação de
um a 21 dias (CHENG; CURRIE, 2005). Dois casos de transmissão materno-infantil de
melioidose foram relatados ao norte da Austrália. Em ambos os casos, as mães tinham mastite
e uma das duas crianças morreu de sepse. Três cepas de B. pseudomallei foram isoladas de
um destes casos, uma cepa do leite materno e as outras duas do sangue e do líquido
34
cefalorraquidiano do bebê. Com a utilização da técnica de eletroforese em gel de campo
pulsátil, comprovou-se uma estreita similaridade entre estas cepas. Nos outros casos, a
transmissão de mãe para filho de B. pseudomallei provavelmente ocorreu em consequência da
infecção placentária (RALPH et al., 2004).
A transmissão entre o homem e o animal, ou mesmo entre os seres humanos, é
bastante rara, embora, na opinião de alguns autores, existam características epidemiológicas e
clínicas semelhantes entre a melioidose humana e em animais (CHOY et al., 2000;
SPRAGUE; NEUBAUER, 2004). Possíveis infecções humanas zoonóticas foram implicadas
em pelo menos três casos em seres humanos na Austrália (CHENG; CURRIE, 2005).
5.2 Fatores de virulência - Interação hospedeiro – patógeno
Nas infecções por B. pseudomallei, as interações hospedeiro-patógeno dependem, no
primeiro momento, da virulência bacteriana e da resposta da imunidade inata. B. pseudomallei
é um microrganismo saprófita e, como tal, tem grande poder de adaptação que lhe permite
sobreviver em ambientes hostis. Apresenta ainda a capacidade de resistir à digestão das
peptidases catiônicas lisossomais e pode sobreviver em várias células eucarióticas, incluindo
neutrófilos e macrófagos. Quando no interior da célula hospedeira, consegue escapar dos
vacúolos endocíticos e forma uma protrusão na membrana pela polimerização da actina. Esta
protrusão na célula infectada é responsável pela disseminação do bacilo de uma célula
hospedeira para a outra vizinha (BREITBACH et al., 2003).
Uma vez dentro da célula hospedeira, B. pseudomallei consegue permanecer viável e
produzir proteases, lipases, lecitinases, catalase, peroxidases, superoxidoredutase,
hemolisinas, exolipídeo citotóxico e siderófilos (WHITE et al., 2003). Algumas dessas
proteínas são também injetadas por B. pseudomallei, diretamente na célula hospedeira, pelo
sistema secretor do tipo três ou Type Three Secretion System (TTSS), utilizado por muitos
outros bacilos Gram-negativos, facilitando a invasão da bactéria na célula hospedeira, e então
permitindo a fuga das vesículas endocíticas, e por isso considerado como atributo de
virulência de B. pseudomallei, contribuindo para a sua patogenicidade (NIERMAN et al,
2004).
O mecanismo do TTSS permite não somente a secreção de proteinas para fora da
célula bacteriana, mas também uma transferência direta de proteinas para o interior das
células do hospedeiro. Os determinantes de virulência envolvidos nesses sistemas de secreção
incluem bombas de efluxo de múltiplas drogas, liberação de toxinas, proteases secretoras e
35
diferentes adesinas. O funcionamento deste sistema secretor é semelhante a uma seringa que
injeta diretamente no interior da célula hospedeira as proteínas efetoras citadas, inclusive
tirosina-fosfatases, que catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim,
regulam importantes processos bioquímicos das células do hospedeiro. Estes fenômenos
determinam uma cascata de eventos essenciais para o microrganismo superar os mecanismos
de defesa do hospedeiro e estabelecer o processo infeccioso (FRANCIS, 2002).
Os fatores de virulência na superfície das células bacterianas incluem o
lipopolissacarídeo (LPS), polissacarídeos capsulares e flagelos, que também podem
desempenhar importante papel para a formação de biofilmes. A regulação gênica bacteriana
por meio das lactonas N-acil-homoserina (AHLs) é de grande importância para a
sobrevivência bacteriana no interior do hospedeiro, uma vez que funcionam como
codificadores de sinais ou quorum sensing para desencadear importantes funções para a sua
manutenção no processo infeccioso. O hospedeiro, por sua vez, conta com os monócitos,
células consideradas de grande valor na sua defesa, e são provavelmente as mais importantes
células imunológicas no início da infecção (WIERSINGA et al., 2006).
Com base nas evidências provenientes de outros patógenos Gram-negativos,
comprovou-se a importância do papel dos receptores Toll-like (TLRs). TLR4, com os seus
correceptores CD14 e MD2, reconhecem o LPS de B. pseudomallei, enquanto TLR5 pode
reconhecer os flagelos. Os receptores do complemento CR1, CR3 e possivelmente os
receptores para IgG, FcγR, podem mediar a fagocitose opsonina-dependente. O
reconhecimento de B. pseudomallei causa a ativação dos genes pró-inflamatórios por meio do
fator nuclear NF-kB, um complexo protéico que desempenha a função de fator de transcrição,
levando à ativação da resposta imune com a liberação de citocinas pró-inflamatórias
(WIERSINGA et al., 2006).
O lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um antígeno altamente conservado.
Elevadas concentrações de anticorpos contra LPS estão associadas com a maior probabilidade
de sobrevivência em melioidose grave. B. pseudomallei produz uma cápsula de
polissacarídeos, o glicocálice, um determinante de virulência importante na formação de
biofilme. Neste processo, a cápsula facilita a formação de microcolônias, onde o
microrganismo é simultaneamente protegido da penetração de antibióticos, compartilha
funções biológicas e pode ser genotípica e fenotipicamente alterado, resultando, p. ex., na
diminuição da sensibilidade aos antimicrobianos (WHITE, 2003).
Em decorrência da gravidade da melioidose, sua importância epidemiológica nas
zonas endêmicas e as características peculiares do seu agente B. pseudomallei, registra-se um
grande interesse na identificação e caracterização dos determinantes de virulência destes
36
agentes, com o objetivo de implantar estratégias profiláticas e terapêuticas. A variedade de
formas clínicas da melioidose sugere que o seu agente causal utilize uma variedade de fatores
de sobrevivência quando no interior do hospedeiro (PRICE et al., 2010).
Produção de toxinas – o papel das exotoxinas na patogênese da melioidose não é
conclusivo. A alta mortalidade das infecções por B. pseudomallei parece estar relacionada ao
tamanho do inóculo e à propensão do hospedeiro infectado a desenvolver elevado grau de
bacteriemias, embora este fenômeno não seja exclusivo desta espécie, mas comum a outros
bacilos Gram-negativos. Os primeiros estudos sobre a produção de toxinas por B.
pseudomallei tiveram início em 1955, pela demonstração de um efeito letal do sobrenadante
de cultura deste agente em hamsters e camundongos (HECKLY, 1964). Em seguida uma
proteína termolábil de 31.000 Dalton (Da) foi purificada e mostrou ação inibitória à síntese de
DNA e proteínas, além de outra proteína de 762 Da, termoestável, com efeitos citotóxicos em
linhagens de células fagocíticas e não fagocíticas e atividade hemolítica em eritrócitos
(HAUSSLER et al., 1998).
Outras proteínas secretadas – B. pseudomallei secreta proteínas além das
exotoxinas, incluindo siderófilos, proteases, lecitinases, lipases e hemolisinas (ESSELMAN et
al., 1961; HOLDEN ET AL., 2004).
Sistema de secreção tipo III - existem quatro tipos de sistemas secretores, dos quais o
sistema secretor do tipo 3 (TTSS) é o que atua em B. pseudomallei. Este é um mecanismo de
patogenicidade de várias espécies bacterianas, em especial, no gênero Yersinia, onde foi
descoberto e no qual está bem estudado. B. pseudomallei contem três tipos de TTSS,
chamados TTS1, TTS2 e TTS3. Os dois primeiros destes sistemas são semelhantes aos TTSS
patogênicos de plantas e aos sistemas exibidos por Raustonia solanacearum, enquanto o
terceiro é homólogo à ilha de patogenicidade do sistema do gênero Salmonella (HOLDEN et
al., 2004; WARAWA; WOODS, 2005). Novos sistemas de secreção estão sendo descritos
para Gram-negativos, como o tipo VI (T6SS-1), que foi recentemente relatado como
ferramenta importante no fitness desta espécie por apresentar importância no crescimento
intracelular, polimerização actínica e na formação de células gigantes multinucleadas
(BURTNICK et al., 2011; CHEN et al., 2011)
Polissacarídeo de superfície – muitas espécies bacterianas produzem um
polissacarídeo capsular que desempenha diversas funções, como a evasão às defesas do
hospedeiro pela inibição da ativação do complemento, opsonização e fagocitose (WARAWA
et al., 2009). O lipopolissacarídeo (LPS) da parede celular, que é o antígeno imunodominante,
37
é altamente conservado. Altas concentrações de anticorpos anti-LPS estão associadas com
aumento da sobrevivência em casos de melioidose grave (WHITE et al., 2003). Sprague e
Neubauer (2004) mostraram nos seus estudos com modelos laboratoriais que o paciente com
melioidose que desenvolve anticorpo anti-LPS pode ter um tempo de sobrevida
significativamente prolongado. Não existe vacina humana ou animal contra melioidose, no
entanto, existem alguns dados promissores sobre a possibilidade de se desenvolver este tipo
de vacina no futuro (SPRAGUE; NEUBAUER, 2004).
Perry et al. caracterizaram os antígenos LPS de B. pseudomallei e evidenciaram que
esta espécie expressa dois antígenos somáticos na sua superfície. O antígeno Tipo I,
constituído por um antígeno de alto peso molecular, um homopolímero ligado 1,3 do resíduo
de 2-O-acetilado-6-desoxi-b-D-manno-heptopiranosil, enquanto o antígeno Tipo II é um
heteropolímero consistindo de (-3)-b-Dglucopiranose (1-3)-6-desoxi-a-L-talopiranosil
(BRETT; WOODS, 2000). O esquema proposto por Wiersinga et al. (2006), para o primeiro
encontro entre B. pseudomallei e o sistema imunológico, está representado na Figura 4.
Figura 4. Interação hospedeiro-patógeno na melioidose. AHL: N-acil homoserina lactona são os componentes difusíveis
responsáveis pelos sinais entre as bactérias para a formação de biofilme; TTSS: sistema secretor tipo 3 que atua em B.
pseudomallei, facilitando a invasão da bactéria na célula hospedeira; TLRs: receptores Toll-like - TLR4, com os seus co-
receptores CD14 e MD2, reconhecem o LPS de B. pseudomallei, enquanto TLR5 pode reconhecer os flagelos; FcγR
receptores da imunoglobulina G e do complemento facilitadores da fagocitose opsonina dependente. Fonte: Wiersinga et al.,
(2006) com permissão do Nature Review Microbiology.
O comportamento coletivo de uma população bacteriana é autorregulado e essa
habilidade é conseguida por intermédio de um mecanismo regulador via expressão simultânea
38
de grupos de genes e transdução de sinal, fenômeno este chamado tradução de sinal ou
quorum sensing. Este fenômeno foi descrito pela primeira vez em bactérias bioluminescentes
por Naelson et al., (1970). Bactérias usam o quorum sensing para regular uma série de
funções como a formação de biofilmes, bioluminescência, produção de antibióticos e
expressão de fatores de virulência (SAWASDIDOLN et al., 2010). A síntese de autoindutores
(AI) é a etapa inicial da cascata de sinal em bactérias Gram-negativas, nas quais as N-acil
homoserina latona (AHLs) são os componentes difusíveis responsáveis por esta etapa
(CAMILLI, 2006). Os fatores de virulência de B. pseudomallei com suas funções e
respectivas referências, estão sumariados no Quadro 2.
Quadro 2. Funções de sobrevivência e virulência codificadas no genoma de B. pseudomallei
Objetivo Funções Notas e exemplos Referências
Sobrevivência
Metabolismo
secundário
Quatorze clusters que codificam a biossintese de
antimicrobianos, surfactante e sideróforos.
Holden et al., (2004)
Resistência a
antimicrobianos
Sete betalactamases da classe Ambler: A, B e D,
incluindo cefalosporinase e oxacillinase; seis
sistemas de efluxo multidrogas para
aminoglicosídeos, macrolídeos, e polimixina e uma
aminoglicosídeo-acetiltransferase.
Livermore, (1987)
Estresse
intracelular
Detoxificação do superóxido, superóxido dismutases,
catalase, detoxificação do óxido nítrico e
flavohemoglobina.
Stevens et al., (2002)
Motilidade e
quimiotaxia
Cinco agrupamentos de genes codificam os
componentes de um sistema único flagelar e 38
proteínas associadas à quimiotaxia.
Chua et al., (2003)
Virulência
Sistema secretor Três sistemas de secreção de proteínas do tipo III:
Tipo I, Tipo II e Tipo III.
Winstanley et al.,
(2000); Holden et al.,
(2004); Warawa;
Woods, (2005).
Lipopolissacaríde
o e cápsula
Cluster de genes de síntese e exportação de
polissacarídeo capsular, cluster de biossíntese de
lipopolissacarídeo e dois outros clusters de
biossíntese de polissacarídeos de superfície.
Reckseidler et al.,
(2001)
Exoproteínas Síntese de exoenzimas secretórias que podem lesar os
tecidos do hospedeiro, incluindo fosfolipase C,
metaloproteases A, um homólogo da MucD protease
de P. aeruginosa e um gene putativo da colagenase.
Winstanley et al.,
(1999)
Adesinas Várias proteínas de superfície moduladoras das
interações hospedeiro – célula, incluindo sete
proteínas da família Hep-Hag
Wiersinga et al.,
(2006)
Fímbria e pili Treze clusters codificadores dos componentes da
fímbria tipo I, do pili tipo IV e do pili tad-type.
Wiersinga et al.,
(2006)
Fonte: elaboraçãoo própria, com base na literatura.
39
B. pseudomallei produz uma cápsula de polissacarídeo altamente hidratada, que
representa importante determinante de virulência e ajuda na formação de biofilme; este, por
sua vez, protege as microcolônias do acesso de antimicrobianos. No biofilme, ocorrem
alterações fenotípicas entre os habitantes desse convívio, resultando na troca de mecanismos
de resistência bacteriana a antimicrobianos e antissépticos (WHITE et al., 2003).
Trabalhos sobre os atributos de virulência e de caracterização bioquímica de B.
pseudomallei sugeriram a existência de um novo fenótipo avirulento. Os estudos de
caracterização bioquímica de 213 isolados de B. pseudomallei de pacientes com melioidose e
140 isolados do solo na região central e nordeste da Tailândia, realizados por Wuthiekanun et
al. (1996), mostraram diferenças significativas entre os dois grupos, corroborando a ideia de
um novo fenótipo. Segundo Liu et al. (2002), dois biotipos distintos de cepas de B.
pseudomallei foram definidos pela sua capacidade de assimilação de L-arabinose associados à
virulência em modelos animais e variações de nucleotídeos no gene 16S rRNA. O biotipo L-
arabinose positivo (ara +) foi considerado avirulento e foi encontrado quase exclusivamente
em amostras ambientais. Em contraste, os isolados de doença clínica não utilizavam L-
arabinose (ara -), eram altamente virulentos e também foram encontrados no ambiente (LIU et
al., 2002; WUTHIEKANUN, V., 1996).
Smith et al (1997) isolaram e identificaram um organismo muito semelhante ao
patógeno B. pseudomallei em amostras de solo no nordeste da Tailândia. Embora a
morfologia, antigenicidade e sensibilidade a antimicrobianos deste organismo fossem
semelhantes às das bactérias isoladas de pacientes com melioidose, este organismo mostrou
diferenças bioquímicas, exemplificadas pela capacidade de utilizar L-arabinose, denominado
Ara (+) (SMITH et al., 1997). Esses autores utilizaram um modelo murino para determinar a
associação desta característica bioquímica com a virulência. No nordeste da Tailândia, onde
melioidose é endêmica, 75% dos isolados do solo não utilizam a L-arabinose, denominados
Ara (-), enquanto que, na região central, onde melioidose é rara, quase todos os isolados do
solo têm o fenótipo Ara (+). Desde 1986, Smith et al estudaram mais de 1.200 pacientes com
melioidose e, em cada caso, o organismo isolado teve o biotipo Ara (-). Além disso, na cultura
e subcultura de rotina desses isolados, a conversão para o biotipo Ara (+) nunca foi
observada, sugerindo que o biótipo Ara (-) ligado à virulência de B. pseudomallei é estável.
Embora ambos os tipos bioquímicos tenham apresentado semelhanças antigênicas, reações
positivas no teste de aglutinação em látex, e resultados semelhantes nos testes de
hemaglutinação indireta para a melioidose, os autores concluíram, nesse estudo experimental,
que existe diferença marcante entre a virulência apresentada nos animais das cepas Ara (+) e
40
Ara (-) de B. pseudomallei. As cepas Ara (-) foram consideradas como virulentas, enquanto as
cepas Ara (+) se mostraram essencialmente não virulentas (SMITH et al., 1987).
Brett et al. (1998), mediante a clonagem e o sequenciamento do 16S rDNA de B.
pseudomallei 1026B (uma cepa virulenta de um isolado clínico) e Burkholderia
pseudomallei-like E264, avaliaram as diferenças entre esses dois organismos. Os resultados
destes estudos, com base em uma análise filogenética de 16S rDNA, confirmaram a presença
de uma nova espécie do gênero Burkholderia, para a qual o autor sugeriu a denominação
Burkholderia thailandensis.
6 FORMAS CLÍNICAS
melioidose afeta praticamente todos os órgãos e sistemas do homem e se manifesta de
maneira semelhante a outras infecções agudas e crônicas (LEELARASAMEE, A., 2004).
Abscessos de tamanhos variados são encontrados no cérebro (LIMMATHUROTSAKUL et
al., 2007), próstata (MORSE et al., 2009), períneo (ROLIM et al., 2009; PRICE et al., 2010),
glândula parótida (WAIWARAWOOTH et al., 2008), baço (APISARNTHANARAK et al.,
2006), ossos (REDONDO et al., 2011), pernas (SHETTY et al., 2008), coxas (LE HELLO et
al., 2005), pele e tecidos moles (WAIWARAWOOTH et al., 2008).
Na melioidose sistêmica, é importante o uso do recurso da imagem para a localização
anatômica de abscessos em órgãos internos pela utilização da ultrassonografia, maneira eficaz
de avaliar também o envolvimento de melioidose no tecido musculoesquelético, vísceras e
tecidos moles (APISARNTHANARAK et al., 2006). A pneumonia é a mais comum das
apresentações clínicas da melioidose em todos os estudos, representando cerca de metade dos
casos (WAIWARAWOOTH et al., 2008). Melioidose na forma pneumônica aguda tem um
espectro clínico que varia da pneumonia indiferenciada leve ao choque séptico fulminante; no
estudo australiano, Darwin mostrou uma mortalidade de 84% (CHENG; CURRIE, 2005).
Além de pneumonia, outras formas são relatadas: empiema, piopericárdio, artrite
séptica, esternoclavicular, linfadenopatia supraclavicular, abscesso escrotal, infecção
mediastinal e da tireóide (LEELARASAMEE A., 2004; CHENG; CURRIE, 2005; CURRIE
et al., 2010). Aneurismas micóticos são frequentes, em particular na artéria da aorta, ilíaca e
subclávia (SIDRIM et al., 2011). No outro extremo do espectro clínico, estão as infecções
assintomáticas, quando adultos saudáveis e jovens têm uma manifestação autolimitada leve da
melioidose ou permanecem sem sintomas (KRONMANN et al., 2009).
41
A melioidose pode ser classificada como aguda, subaguda e crônica. Para as formas de
melioidose assintomática e localizada, a taxa de mortalidade é inferior a 10%. A taxa de
mortalidade aumenta acentuadamente na melioidose septicêmica, alcançando os 90% em
melioidose com choque séptico (LEELARASAMEE, A., 2004).
No sistema nervoso central, a melioidose se manifesta, principalmente, como
encefalomielite, caracterizada por encefalite do tronco cerebral e paralisia flácida, é vista em
4% das apresentações de melioidose no norte da Austrália e está associada com elevadas
morbidade e mortalidade. Alguns destes casos são decorrentes da disseminação direta de
locais contíguos, como seios da face ou celulite orbitária (LIMMATHUROTSAKUL et al.,
2007; CHENG; CURRIE, 2005).
Nos ossos e articulações a manifestação da melioidose é rara e pode ser difícil
diferenciar de outras causas de infecção, exceto quando a doença se dissemina e as
características clínicas podem ser mais proeminentes. O diagnóstico requer uma forte suspeita
clínica e a drenagem cirúrgica é muitas vezes necessária, tanto para terapia como para
diagnóstico, juntamente com longos cursos de antimicrobianos por via endovenosa (CHENG;
CURRIE, 2005; MIKSIĆ et al., 2007).
Infecções da pele e tecidos moles são manifestações comuns da melioidose e podem
ser a fonte de infecção sistêmica ou resultar da disseminação hematogênica. As apresentações
podem ser rapidamente progressivas, similares à fasciíte, causadas por outros microrganismos
(GIBNEY et al., 2008). Infecção geniturinária foi observada em 19% dos casos na série de
Darwin, 10% dos casos na série de Kuala Lumpur, 7% dos casos da série da Associação de
Doenças Infecciosas da Tailândia, 8% na série Hospital Sapprasithiprasong (CHENG;
CURRIE, 2005) e um caso no Brasil, relatado em Rolim et al (2005).
7 DIAGNÓSTICO
7.1 Diagnóstico Clínico
A melioidose não pode ser considerada uma síndrome infecciosa específica, com
sinais e sintomas patognomômicos, pois apresenta uma grande variedade de manifestações
clínicas. Esta característica acarreta dificuldades diagnósticas e demanda do médico assistente
um conhecimento dos dados epidemiológicos da melioidose na sua região, da biologia e
ecologia do seu agente, para formulação de hipóteses e, principalmente, de uma suspeita
clínica acertada (INGLIS et al., 2006b; INGLIS; SOUSA, 2009). A melioidose, por ser uma
doença que mimetiza outras patologias infecciosas, tem o seu diagnóstico definitivo
42
condicionado ao isolamento de B. pseudomallei nos espécimes clínicos. É considerada
também uma doença comum em idosos, em razão provavelmente, da reativação da infecção
latente primária (LEELARASAMEE, A., 2004; VIRGINIO et al., 2006).
O período de incubação da melioidose varia de 1 a 21 dias, com um período médio de
nove dias, e foi determinado pelo estudo de casos com eventos de inoculação previamente
definidos (CURRIE, 2000). O período de incubação não está claramente definido, mas pode
variar de dois dias a muitos anos. Períodos de incubação de até 29 anos foram descritos em
ex-militares que participaram de guerras em Papua Nova Guiné e no Vietnã (CHENG &
CURRIE, 2005).
A maioria das infecções é adquirida por meio da inoculação percutânea; em
segundo lugar pela inalação; e, em terceiro pela ingestão. Pessoas sem sintomas ou história
prévia de doença também podem apresentar resultados positivos em testes sorológicos,
indicando infecção assintomática. Uma pequena proporção dessas pessoas pode reativar esta
infecção latente muitos anos depois, como um fenômeno semelhante à tuberculose, no
entanto, a reativação representa menos de 5% dos casos no estudo australiano de Darwin
(CHENG & CURRIE, 2005).
O fator de risco mais importante para melioidose é o diabetes manifestado em cerca de
40% dos casos e, na ordem decrescente de frequência, o excesso de consumo do álcool,
doença renal crônica e doença pulmonar crônica. Embora a maioria dos pacientes com
melioidose apresente um ou mais desses fatores de risco, esta doença pode também ocorrer
em crianças e adultos saudáveis. A doença severa com desfecho fatal, no entanto, é bastante
rara em pessoas consideradas saudáveis nas quais não se tenha identificado nenhum fator de
risco associado (CHENG & CURRIE, 2005).
O retardo no diagnóstico determina um mau prognóstico, mesmo com terapia
antimicrobiana. A mortalidade é elevada na doença grave (forma septicêmica da melioidose)
em que o curso clínico, muitas vezes, se deteriora rapidamente, mesmo com os tratamentos
atualmente disponíveis (SAMUEL; TY, 2002).
A melioidose deve ser suspeitada em qualquer paciente gravemente enfermo, febril,
com um fator de risco associado e que mora ou esteve em uma área endêmica (AARDEMA et
al., 2005; DANCE, D. A. B., 1991).
43
7.2 Diagnóstico microbiológico
Para o microbiologista, o isolamento de B.pseudomallei deve ser suspeitado quando
um bacilo Gram-negativo não fermentador isolado apresentar resistência aos
aminoglicosídeos e polimixinas e sensibilidade a amoxicilina-clavulanato (AARDEMA et al.,
2005; DANCE, 1991).
O esquema de identificação preliminar, manual e presuntivo de B. pseudomallei pode
ser realizado com os seguintes testes: o teste de oxidação/fermentação - OF de glicose, a
reação de citocromo oxidase; a resistência a polimixina concomitante à sensibilidade a
amoxicilina/clavulanato e finalmente pela visualização na coloração de Gram de bacilos
Gram-negativos bipolares com aspecto semelhante a broche de segurança, mostrados na
figura 5 (INGLIS et al., 2006c).
Figura 5. Esfregaço de material purulento aspirado de gânglio mediastinal corado pelo Gram, apresentando bacilos Gram-
negativos. Fonte: LAPERE 2010.
Este resultado preliminar, no entanto, permite apenas o diagnóstico presuntivo
semelhante ao de qualquer infecção por bactérias Gram-negativas (CHENG; CURRIE, 2005).
Vários espécimes clínicos já foram coletados de pacientes com suspeita de melioidose para
visualização bacteriana e cultivo do seu agente etiológico. Os espécimes mais citados nos
relatos da literatura são: sangue, lavado broncoalveolar, aspirado traqueal, escarro, urina,
swab de lesão de pele, líquidos orgânicos, aspirados de abscessos, swab da orofaringe e swab
retal (CHENG; CURRIE, 2005).
B. pseudomallei não é considerada uma bactéria fastidiosa, com grandes exigências
nutricionais e cresce em uma ampla variedade de meios de cultura convencionais (p. ex.:
ágar-sangue e ágar-MacConkey) disponíveis comercialmente e utilizados na rotina de
laboratórios clínicos. Para sítios orgânicos colonizados, no entanto, recomenda-se a utilização
44
de meios seletivos específicos e, para sítios estéreis, os meios de cultura convencionais ora
citados podem ser utilizados com bom desempenho. A capacidade seletiva decorre da adição
de antimicrobianos, p.ex., gentamicina, para os quais B. pseudomallei é intrinsecamente
resistente, o que lhe permite uma vantagem de crescimento em relação à microbiota
(CHENG; CURRIE, 2005).
O ágar-Ashdown é um meio seletivo que contem ágar-tripticase soja, glicerol, cristal
violeta e vermelho neutro com a adição de 4mg de gentamicina (ASHDOWN, 1979). O ágar-
Ashdown foi modificado pela adição de outro antimicrobiano, a polimixina, um potente
antimicrobiano para bactérias Gram-negativas para o qual B. pseudomallei é também
naturalmente resistente (CHENG; CURRIE, 2005).
Variações das colônias de B. pseudomallei são comumente observadas durante a
cultura de isolados clínicos em ágar-Ashdown. A morfologia variável da colônia foi
observada por Wiersinga et al., (2006) em cepa única, a qual, ao ser submetida a genotipagem
mostrou que apenas um tipo clonal estava presente. Variações também podem ser vistas
dentro de uma mesma colônia, como mostrado na figura 6, onde uma colônia parental de tom
rosa deu origem ao segundo morfotipo que aparece em vermelho no canto e no centro dela
(WIERSINGA et al., 2006).
Figura 6. Isolados clínicos de B. pseudomallei: (a) morfologia típica das colônias de B. pseudomallei em ágar-Ashdown, após
incubação a 37 ºC por três dias; (b e c) variação da colônia comumente observada durante a cultura de isolados clínicos B.
pseudomallei em ágar-Ashdown; (b) variação também pode ser vista dentro de uma mesma colônia, como mostra a colônia
parental (rosa) que deu origem a um segundo morfotipo (vermelho) no centro e na proximidade do centro. (c) mostra a
morfologia variável da colônia que pode ser vista de uma só amostra (genotipagem dessas colônias mostrou que apenas um
tipo clonal estava presente). Fonte: Wiersinga et al., (2006) com permissão do Nature Review Microbiology.
45
Chantratita et al. (2007), nas suas observações sobre o comportamento de B.
pseudomallei em cultivo, também descreveram, ao longo de um período de 20 anos de
diagnóstico de melioidose, variações nas características das colônias de B. pseudomallei,
geralmente com aparência seca, rugosa, às vezes umbilicada e áspera em cultivo no meio
ágar-Ashdown (Figura 7).
Figura 7. Sete morfotipos diferentes de colônias de B. pseudomallei em ágar-Ashdown. Estes morfotipos foram observados
em 212 cepas de B.pseudomallei em amostras clínicas de 204 pacientes com melioidosis em um hospital no nordeste da
Tailândia incubadas por quatro dias a 37 °C em aerobiose. Os percentuais representam a proporção de cada tipo dentro desta
população. As regiões (centro e periferia) da colônia podem ser representadas como um chapéu mexicano. Tipos II e V são
distinguidos por tamanho, uma vez que nem sempre têm uma cratera central. Tipos III e VI são distinguidos uns dos outros
pelo tamanho, já que uma diferença de cor entre os dois não é consistente.
Nesse trabalho foi idealizado um sistema para registrar as diferentes morfologias das
colônias e os autores criaram um esquema de morfotipagem de colônia com um algoritmo de
tipificação utilizando B. pseudomallei de cepas clínicas em ágar-Ashdown. Observaram
também neste meio que muitas vezes a morfologia da colônia demonstrava uma grande
variabilidade na mesma amostra e entre amostras clínicas. Nos meios de culturas
convencionais padronizados para utilização na rotina de um laboratório clínico, as colônias de
46
B. pseudomallei aparecem com aspecto seco de tom branco-acinzentado (ágar-sangue) e
ligeiramente rugosa, umbilicada e de coloração róseo-clara (ágar-MacConkey) (Figura 8).
Figura 8. Crescimento de B. pseudomallei em ágar-sangue (à esquerda), apresentando colônias com aspecto seco de
tonalidade branco-acinzentada e, no ágar-MacConkey (à direita), colônias com aspecto ligeiramente rugoso, umbilicadas, e
de tom róseo claro. Fonte: LAPERE 2011.
O crescimento de B. pseudomallei no meio seletivo ágar-Ashdown está representado
na figura 9, onde se observa a morfologia típica das colônias rosadas, enrugadas, secas e
opacas.
Figura 9. Colônia de B.pseudomallei, crescimento em ágar-Ashdown com colônias de aspecto
áspero, rugoso, de tom rosa-claro, com leve relevo na periferia. Fonte: LAPERE 2011
O ágar-Ashdown foi modificado pela adição de azul do Nilo e nove diferentes fontes de
carbono. Recebeu então o nome de BPSA - B. pseudomallei selective agar (Figura 10) e foi
validado na Tailândia para uso corrente (HOWARD; INGLIS, 2003; PEACOCK, 2005).
47
Figura 10. Colônia de B.pseudomallei, crescimento em ágar-BPSA com colônias de tom rosa,
rugosas e com bordos ligeiramente elevados. Fonte: LAPERE 2011
Os meios de cultura convencionais, como o ágar-sangue e o ágar-MacConkey, podem
também ser utilizados, desde que seja para espécimes de sítios estéreis (VIRGINIO et al.,
2006). O sangue é o espécime mais recomendado para os casos graves, porquanto nesses
casos a infecção cursa sempre com bacteriemia importante e este agente cresce facilmente nos
meios de culturas dos métodos automatizados comercialmente disponíveis para hemocultura.
O tempo de positivação de uma hemocultura de um paciente com melioidose reflete a
densidade do inóculo e pode ser correlacionado com a gravidade do caso. Em um estudo
publicado, 73,7% dos casos de melioidose com desfecho fatal, a hemocultura positivou nas
primeiras 24 horas, comparado com 40,9% de mortalidade dos casos nos quais a hemocultura
positivou em um tempo maior do que 24 horas. Nesse estudo com a utilização do sistema
BacT / Alert, 62% das hemoculturas positivou dentro das primeiras 24 horas e 90% nas 48
horas (CURRIE et al, 2010).
Em um estudo realizado por Deepak et al (2008), 60 cepas anteriormente relatadas
como B. pseudomallei isoladas de material clínico, após 24h de crescimento em ágar-
Columbia com sangue de carneiro 5%, foram submetidas em paralelo aos métodos de
identificação API 20NE e VITEK 2® GN. As identificações e os níveis de confiança
determinados por estas metodologias foram comparados. O VITEK2® GN identificou 47
(78,3%) e o API 20NE identificou 52 (86,7%) dos isolados de B. pseudomallei. O grau de
comparação, utilizando-se o índice k Cohen de 0,6008, sugeriu boa concordância entre ambos
e os considerou como teste confiável, capaz de identificar corretamente B. pseudomallei
(DEEPAK et al., 2008).
48
7.3 Diagnóstico Sorológico
Os testes sorológicos para detecção de anticorpos quando utilizados isoladamente, não
devem ser considerados métodos para diagnóstico (O’BRIEN et al., 2004), no entanto, têm
utilidade em inquéritos sorológicos para traçar o perfil da resposta imunológica de uma
população a uma determinada doença infecciosa. Os testes imunológicos para melioidose
mais utilizados têm dois principais objetivos: detecção de antígenos e detecção de anticorpos.
Para a detecção de anticorpos, os testes mais usados são a imuno-hemaglutinação (IHA),
enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) e o teste imunocromatográfico
(LIMMATHUROTSAKUL, et al., 2011). O teste IHA é simples, realizado com pequena
quantidade de insumos e de baixo custo, mas apresenta sensibilidade em torno de 75% e
apresenta limitações quanto ao uso em áreas endêmicas (SIRISINHA et al., 2000;
WUTHIEKANUN et al., 2006; CHENG, 2010). Utilizando este teste, Appassakij et al. (1990)
mostraram, com um título de 1:160, uma sensibilidade, especificidade e acurácia de 77, 92 e
89%, respectivamente. Segundo esses autores, o teste não reconhece um paciente com
melioidose aguda. Cheng et al., (2006), utilizando o mesmo teste com um título de 1:40,
estudaram o perfil sorológico de 275 pacientes e encontraram uma sensibilidade de 56%
(CHENG et al., 2006).
Vale ressaltar que o valor diagnóstico de todos os testes sorológicos é questionável em
áreas endêmicas, onde indivíduos saudáveis podem apresentar níveis persistentes de IgG, no
entanto, em áreas não endêmicas, os testes podem ser úteis para a detecção de infecções
crônicas (SPRAGUE; NEUBAUER, 2004).
Um inquérito sorológico, em dois municípios cearenses acometidos por melioidose,
está expresso em Rolim et al., (2011). Nesse estudo, anticorpos IgM e IgG contra B.
pseudomallei foram encontrados em 51,27% e 58.49%, respectivamente, de um total de 317
amostras, comprovando uma alta soropositividade em indivíduos que vivem nestas áreas.
Até o momento, nenhum dos testes sorológicos para pesquisa de anticorpos
mencionados está disponível. A sorologia é uma técnica ainda restrita a um número limitado
de laboratórios especializados em todo o mundo (SPRAGUE; NEUBAUER, 2004).
Para o diagnóstico rápido de melioidose, existe no mercado o teste Melioidosis Rapid
Cassette Test, cujo kit em forma de cassete para testes individuais foi disponibilizado pela
empresa PanBio (Windsor, Queensland, Austrália) para a detecção de imunoglobulinas IgG e
IgM contra B. pseudomallei. A sensibilidade e especificidade do teste foram 90,0 e 91,3%,
49
respectivamente (O'BRIEN et al., 2004). O teste de aglutinação com anticorpos monoclonais
pode ser realizado diretamente das colônias isoladas para identificar B. pseudomallei (All
Eights Sdn. Bhd., Kuala Lumpur, Malaysia) (INGLIS et al., 2005). A aglutinação em látex
baseado em anticorpos monoclonais contra o LPS de B. pseudomallei pode ser utilizada
também para identificação de isolados clínicos com uma sensibilidade de 96,8%
(DHARAKUL et al., 1999a).
Antígenos também podem ser pesquisados nas colônias suspeitas de B. pseudomallei
isoladas de espécimes clínicos para uma rápida identificação. O teste de aglutinação em látex
com anticorpos monoclonais contra a proteína 30 kDa de B. pseudomallei é utilizado para este
fim com sensibilidade e especificidade de 94,12 e 98,25%, respectivamente, comparadas ao
padrão ouro da cultura (PONGSUNK et al., 1999). Outros métodos também utilizam a
pesquisa de antígenos de B. pseudomallei em espécimes clínicos, p. ex., urina para o rápido
diagnóstico de melioidose (LOWE et al., 2002). Testes para detecção direta de antígenos
foram desenvolvidos em laboratórios de pesquisa na Tailândia para serem usados em
espécimes clínicos, tais como escarro, urina ou secreções purulentas. Para detecção de
antígenos em espécimes clínicos a imunofluorescência, é uma das metodologias empregadas
com sensibilidade e especificidade, comparadas à cultura como padrão ouro, de 66% e 99,5%,
respectivamente. Apesar dos estudos publicados sobre a detecção de antígenos de B.
pseudomallei, não existem, até hoje, kits comerciais disponíveis para este fim, sendo
utilizados apenas em laboratórios de referência (WUTHIEKANUN et al., 2005a; SPRAGUE;
NEUBAUER, 2004).
7.4 Diagnóstico Molecular
O diagnóstico de melioidose depende exclusivamente do isolamento e identificação do
seu agente, B. pseudomallei, na cultura. Os métodos moleculares para a identificação de B.
Pseudomallei, apesar de dispendiosos, foram descritos como alternativa aos métodos de
cultivo uma vez que estes resultados demandam muito tempo e exigem muitos recursos
operacionais e humanos. Considerando também que os testes sorológicos possuem baixa
sensibilidade, os ensaios com antígeno específico, microscopia de imunofluorescência direta e
aglutinação em látex não são ainda disponíveis comercialmente, os métodos moleculares, (por
serem mais rápidos, garantirem melhor sensibilidade e especificidade, além de utilizarem
várias plataformas técnicas comercialmente disponíveis) são recomendados em substituição
aos métodos citados (BOWERS et al., 2010).
50
Estas plataformas técnicas compreendem: técnicas de amplificação de DNA por PCR,
PCR multiplex, PCR em tempo real e sequenciamento de DNA. Vários destes ensaios são
promissores como opções rápidas de identificação, porém apenas alguns destes testes foram
validados quanto à robustez e especificidade (BOWERS et al., 2010). A detecção de B.
pseudomallei direta do material clínico pela técnica de PCR foi utilizada por alguns autores
para diagnóstico rápido da melioidose. Estes testes utilizaram a região intergênica entre 16S e
23S rRNA (LEW; DESMARCHELIER, 1994; KUNAKORN; MARKHAM, 1995;
DHARAKUL et al., 1999b; COUTO et al., 2009).
O gene 16S rRNA é altamente conservado em todas as bactérias do mesmo gênero,
enquanto, para as espécies, as regiões variáveis contêm assinaturas únicas e fornecem
informações úteis sobre as relações entre elas. Assim, o sequenciamento do gene se tornou o
padrão ouro para a identificação de espécies bacterianas. Com a descoberta da metodologia
PCR e sequenciamento do 16S rRNA, as bactérias consideradas de identificação difícil foram
identificadas com sucesso, assim como B. pseudomallei. Além disso, esta técnica também
permite a identificação, utilizando somente uma pequena quantidade de DNA bacteriano
(WOO et al., 2008).
Técnicas moleculares são usadas também como ferramentas para detectar isolados de
fontes comuns e tipagem molecular de bactérias em investigações epidemiológicas. As
técnicas mais utilizadas para este fim são a eletroforese em campo pulsátil (Pulsed Field Gel
Electrophoresis- PFGE) e multilocus sequence typing (MLST) (CURRIE et al., 2007).
Williams et al. (1990) descreveram uma técnica de detecção de polimorfismo de DNA
baseada na amplificação randomizada de DNA, usando um só primer com uma sequencia
arbitrária de nucleotídeos. O teste detecta polimorfismos amplificados em uma cepa parental,
mas não em outra, e são herdados de forma mendeliana e podem ser usados para construir
mapas genéticos em uma variedade de espécies. Os autores sugeriram que estes
polimorfismos fossem chamados de marcadores RAPD, ou seja, Random Amplified
Polymorphic DNA (WILLIAMS et al., 1990). Esta metodologia é empregada, desde então,
para B. pseudomallei, por vários autores, com os seguintes propósitos: identificar entre cepas
clínicas e ambientais (LEELAYUWAT et al., 2000) tipagem de cepas emergentes em áreas
não endêmicas (HSUEH et al., 2001; CHEN et al., 2010; O’CARROL et al., 2003),
correlacionar os genótipos com atributos de virulência (WONGRATANACHEEWIN et al.,
2000) e para investigações epidemiológicas (HAASE et al, 1995; WARNER et al., 2008).
51
8 TRATAMENTO
A resistência bacteriana a agentes antimicrobianos é um fenômeno de grande impacto
na assistência médica e terapia de doenças infecciosas. Pode ser classificada em natural ou
intrínseca e adquirida que, por sua vez, pode ser constitutiva ou induzível. Quando a
resistência é natural, todas as cepas de uma espécie bacteriana exibem o mesmo perfil
transmitido às progênies. A resistência adquirida é considerada mais importante neste
contexto, pois pode ser disseminada e transmitida a outras espécies bacterianas (TENOVER,
2006).
Segundo o CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institutes), a resistência
bacteriana pode ser avaliada in vitro por uma variedade de métodos laboratoriais. Estes
métodos podem ser quantitativos ou qualitativos. O método Kirby-Bauer, ou disco difusão, é
uma técnica qualitativa utilizada para bactérias aeróbias de crescimento rápido e baseia-se na
inibição bacteriana ao longo do gradiente de difusão da droga no ágar-Müeller-Hinton a partir
do disco de papel impregnado com esta droga a ser testada. A dimensão do halo de inibição
ou ausência de zona de inibição do crescimento bacteriano ao redor do disco permite a leitura
da sensibilidade/resistência (CLSI, 2009a). Além deste método, pode-se utilizar, também,
para testar a sensibilidade bacteriana, os métodos de diluição quantitativos que podem ser
microdiluição ou macrodiluição. Este último é realizado em tubos de ensaio onde um
gradiente de concentração da droga é distribuído.
A microdiluição em caldo, padrão ouro, corresponde à miniatura da técnica de
macrodiluição, pois utiliza placas semelhantes às de enzima imunoensaio, estéreis, com 96
poços, com o fundo em formato de “U”, para permitir a melhor visualização do crescimento
bacteriano. A vantagem deste método, em relação ao da diluição em tubo, é que em uma placa
se pode testar uma bactéria utilizando um número variável de antimicrobianos, cerca de 12
drogas, com distintas concentrações (quatro a oito diluições logarítmicas). A técnica da
diluição pode também ser realizada pela adição da droga antimicrobiana em pour-plate no
ágar-Müeller-Hinton, distribuído em placas de Petri. Neste método, a concentração do
antimicrobiano a ser testado é fixa e várias bactérias podem ser testadas na mesma placa
(CLSI, 2009b).
B. pseudomallei apresenta resistência intrínseca a aminoglicosídeos, cefalosporinas de
segunda e terceira geração, penicilinas, polimixina B e macrolídeos (JENNEY et al., 2001). O
mecanismo de resistência intrínseca de B. pseudomallei a estas drogas já foi descrito e para a
52
polimixina é decorrente da modificação do lipopolissacarídeo (LPS) da membrana externa da
bactéria que atua como sítio de ligação da polimixina (BURTNICK; WOODS, 1999).
A resistência de B. pseudomallei aos betalactâmicos é conferida pela produção de
betalactamase induzível, sensível ao clavulanato, que hidrolisa e confere resistência aos
seguintes betalactâmicos: ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, cefalotina, cefaloridina,
cefuroxima e cefotaxima. Amoxicilina/clavulanato, ceftazidima e imipenem não são
hidrolisadas por estas betalactamases e, portanto, apresentam concentração inibitória mínima
(CIM) baixa na faixa de sensibilidade para B. pseudomallei (LIVERMORE et al., 1987;
INGLIS et al., 2010). Quanto ao grupo dos aminoglicosídeos e macrolídeos, a resistência foi
revelada pela análise de mutação em transposons, que mostrou um sistema de efluxo,
AmrAB-OprA, codificado pelo gene amr (resistencia a aminoglicosídeo e macrolídeo) que
confere resistência a estes grupos de drogas (MOORE et al., 2004; MIMA et al., 2010).
O CLSI, em seu último documento sobre o teste de sensibilidade de bactérias
incomuns, M45-A2, considerou como drogas de primeira linha para o teste de sensibilidade
de B. pseudomallei a amoxicilina/clavulanato, ceftazidima, imipenem, doxicilina (ou
tetraciclina) e trimetoprim/sulfametoxazol (CLSI, 2010).
Segundo Biot et al., (2011), a produção de betalactamase e a expressão de bombas de
efluxo do tipo multidroga são os mecanismos de resistência mais descritos para B.
pseudomallei. Quatro bombas de efluxo responsáveis pela extrusão de drogas foram descritas
em B. pseudomallei - AmrAB-OprA, BpeAB-OprB, BpeEF-OprC, BpeGH-OprD - embora
apenas as três primeiras tenham sido demonstradas em associação com resistência
antimicrobiana.
A resistência adquirida por B. pseudomallei aos carbapenêmicos não foi ainda relatada
e a taxa de resistência adquirida a ceftazidima e amoxicilina-clavulanato, segundo
Wuthiekanun e Peacock, é considerada baixa, menor do que 0,2%. Ainda consoante estes
autores, a taxa de resistência adquirida a doxiciclina é de 2% e a sulfametoxazol/trimetoprim
(SMX/TMP) geograficamente variável (2,5% na Austrália e 13%-16% no nordeste da
Tailândia) (WUTHIEKANUN; PEACOCK, 2006).
O mecanismo de resistência a ceftazidima relatado por Niumsup e Wuthiekanun
(2002), decorre da produção de uma betalactamase específica para esta droga. A
superexpressão da betalactamase classe D, OXA-42 e OXA-43 também podem ser
responsáveis pela resistência a ceftazidima em algumas cepas de B. pseudomallei
(NIUMSUP; WUTHIEKANUN, 2002).
53
O desenvolvimento de resistência em B. pseudomallei durante a terapia da melioidose
é relatado (DANCE et al., 1989; GOEFREY et al., 1991). Mudanças fenotípicas responsáveis
pela aquisição de resistência durante o tratamento com ceftazidima e com a associação
betalactâmicos/inibidor de betalactamase ocorrem por desrepressão do gene que codifica a
enzima, insensibilidade ao inibidor de betalactamase ou pela produção de uma betalactamase
específica para ceftazidima (TRIBUDDHARAT et al., 2003).
A resistência adquirida a doxiciclina é observada quando esta droga é usada como
monoterapia, fenômeno muito menos frequente com SMX/TMP (JENNEY et al., 2001) e
mais raro ainda para ceftazidima (DANCE et al., 1989). Na opinião de Jenney et al., (2001),
no entanto, a recidiva da melioidose durante o tratamento é atribuível a fenômenos de
resistência e pode ocorrer com qualquer dos agentes utilizados no tratamento, tanto por via
oral como por via intravenosa (JENNEY et al., 2001).
Shih et al. (2009) analisaram 58 cepas de B. pseudomallei, isoladas em Taiwan, no
período de 2000 a 2005, e determinaram a sensibilidade pelo método E-test (AB BIODISK,
Sweden) para amoxicilina/clavulanato, ceftazidima, doxicilina, SMX/TMP, meropenem e
imipenem, com uma taxa de sensibilidade de 93% para amoxicilina/clavulanato e 100% para
as demais.
Sam et al. (2010), utilizando também a metodologia de tiras E-test, para testar a
sensibilidade de 184 cepas clínicas de B. pseudomallei, coletadas na Malásia de 1987 a 2007,
mostraram uma CIM50 para tigeciclina <=1 µg/mL e uma CIM90 <=2 µg/mL. Para
meropenem, estes mesmos resultados foram 1 e 1,5 µg/mL respectivamente. O imipenem
apresentou uma CIM50 de 0,44 µg/mL e uma CIM90 de 1,5 µg/mL. Quanto à ceftazidima, o
autor relatou uma CIM50 de 2 µg/mL e CIM90 de 4 µg/mL. Para SMX/TMP, o resultado para
os mesmos parâmetros foram 0,25 µg/mL e 0,75 µg/mL. Amoxicilina/clavulanato mostraram
para os dois parâmetros, respectivamente, os valores de 2 e 4 µg/mL. Ainda nesse estudo, as
taxas de sensibilidade foram: amoxicilina/clavulanato: 97,3%, ceftazidima: 9,6%, SMX/TMP:
97,8%, imipenem: 100%, meropenem: 100% e tigeciclina 95,7%.
A terapia antimicrobiana para melioidose continua a enfrentar desafios nas áreas
endêmicas. As dificuldades terapêuticas neste âmbito levaram os pesquisadores a considerar a
possibilidade do uso de antimicrobianos alternativos. Estudo de Harris et al. (2011) analisou a
sensibilidade in vitro de B. pseudomallei a quatro novos agentes antimicrobianos, a saber,
moxifloxacina (fluorquinolona), tigeciclina (glicilciclina), ertapenem (carbapenêmico), e
doripenem (carbapenêmico). Para doripenem, o resultado foi bastante semelhante ao de
meropenem, com uma CIM90 de 1,5 µg/mL. Houve boa correlação (p <0,001) entre as
54
técnicas por microdiluição e disco difusão para doripenem, ertapenem tigeciclina e
moxifloxacina. Para ertapenem os resultados, em µg/mL do CIM50 e CIM90, foram 4 e 6
µg/mL, respectivamente. Para tigeciclina os mesmos resultados foram, respectivamente, 3 e 6
µg/mL. Quanto à moxifloxacina, as CIM50 e CIM90 foram, respectivamente, 1,5 e 3 µg/mL
(HARRIS et al., 2011).
Thamlikitkul e Trakulsomboon (2009) apresentaram em seu estudo de sensibilidade a
ertapenem pela metodologia E-test, uma CIM50 e CIM90 de 0,5 e 0,75 µg/mL,
respectivamente. Mima et al. (2011) realizaram o teste de sensibilidade por microdiluição em
caldo Müeller-Hinton de B. pseudomallei a cetromicina, uma nova droga do grupo dos
ketolideos, com amplo espectro de ação contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Segundo os autores esta nova droga foi alvo apenas de uma fraca extrusão pela bomba de
efluxo e apresentou uma atividade significante in vitro para B. pseudomallei.
Apesar de B. pseudomallei dememonstrar resistência a algumas drogas
betalactâmicas, a ceftazidima e a combinação betalactâmicos/inibidor de betalactamase são
comumente usadas para o tratamento de melioidose com um bom desempenho e uma boa
atividade contra B. pseudomallei (TRIBUDDHARAT et al., 2003). Além destes
betalactâmicos, os carbapenêmicos são também considerados drogas de escolha para o
tratamento da melioidose (SCHWEIZER; PEACOCK, 2008). Carbapenêmicos são
especialmente indicados para as cepas que apresentam produção de betalactamase de perfil
ampliado (CHENG; CURRIE, 2005).
Imipenem, ceftazidima e, em menor grau, amoxicilina/clavulanato são os pilares da
terapia antimicrobiana empírica. Na fase aguda da doença, os antimicrobianos com atividade
bacteriostática, como tetraciclinas, não são recomendados para terapia. O tratamento de
primeira linha da melioidose humana aguda consiste em ceftazidima ou carbapenem
intravenoso, pelo menos 10-14 dias, ao que se segue SMX/TMP, via oral com ou sem
doxiciclina, durante 12-20 semanas (CHENG; CURRIE, 2005; WUTHIEKANUN;
PEACOCK, 2006). O SMX/TMP oral, com ou sem doxiciclina e cloranfenicol, é usado para
a erradicação da fase prolongada da melioidose. Estudos demonstram que SMX/TMP têm
pouca atividade na fase aguda (WHITE et al., 1989), além de exibir apenas uma ação
bacteriostática in vitro. O uso de associação de drogas na fase aguda inicial da melioidose é
rotina no nordeste da Austrália e parte da Tailândia como alternativa contra o processo de
seleção e a recorrência da doença durante a terapia (DANCE et al., 1989; CURRIE et al.,
2000).
55
9 PERGUNTAS DE PARTIDA
1. As cepas de B. pseudomallei oriundas do Estado do Ceará exibem diferenças
em atributos de virulência e perfil de sensibilidade a antimicrobianos quando
comparadas àquelas comumente isoladas em regiões consideradas
hiperendêmica e endêmica como Austrália e Tailândia?
2. Qual o padrão molecular destas cepas na análise do DNA polimórfico
amplificado aleatoriamente (RAPD)?
10 HIPÓTESES
1. As cepas clínicas de B. pseudomallei isoladas no Estado do Ceará até 2011 são
semelhantes às cepas isoladas em outros países em atributos de virulência e
sensibilidade a antimicrobianos.
2. As cepas clínicas de B. pseudomallei isoladas no Estado do Ceará apresentam
padrões de RAPD semelhantes, quando comparadas às cepas ambientais
isoladas no Município de Tejuçuoca.
11 OBJETIVOS
11.1 Objetivo geral
Caracterizar fenotipicamente através de identificação bioquímica e sensibilidade a
antimicrobianos, caracterizar genotipicamente pela análise do DNA polimórfico
amplificado aleatoriamente e detectar genes de virulência de cepas clínicas e
ambientais de Burkholderia pseudomallei, isoladas no Estado do Ceará.
11.2 Objetivos específicos
1. Caracterizar as cepas de B. pseudomallei que compõem a amostra deste estudo quanto
à capacidade de assimilar L-arabinose e identificá-las pelos métodos preliminares de
56
identificação que consistem na coloração de Gram, reação de oxidase e na
macromorfologia típica das colônias.
2. Realizar a identificação bioquímica automatizada e sensibilidade a antimicrobianos
destas cepas pela metodologia VITEK2®.
3. Determinar, nestas cepas, o perfil de sensibilidade a antimicrobianos através do
método de microdiluição em caldo Müeller-Hinton.
4. Realizar a identificação molecular pela técnica de PCR específica das novas cepas
isoladas a partir do ano de 2005.
5. Realizar o sequenciamento da região 16S do DNAr das novas cepas isoladas a partir
do ano de 2005.
6. Caracterizar o perfil genético detas cepas, mediante a técnica de RAPD.
7. Detectar o gene de virulência do sistema de secreção do tipo III (TTSS) pela técnica
de PCR.
8. Catalogar os casos de melioidose ocorridos no Ceará no período de 2003 a 2011,
quanto às características clínico-epidemiológicas, com a descrição dos novos casos.
12 METODOLOGIA
12.1 Amostra
Este trabalho teve início após a ocorrência do sexto caso de melioidose no Ceará, e até
este momento a coleção do Laboratório de Patógenos Emergentes e Reemergentes- LAPERE
já continha cinco cepas de B. pseudomallei, que compunham amostras de publicações
anteriores no âmbito do Programa de Pósgraduação em Microbiologia Médica da UFC. Estas
cinco cepas foram incluídas na amostra deste estudo que ficou assim constituída:
− Dez cepas ambientais isoladas do solo do Município de Tejuçuoca
pertencentes à coleção do LAPERE;
− Cinco cepas clínicas da coleção do LAPERE isoladas de casos relatados no
período de 2003 a 2005.
− Cinco cepas clínicas isoladas dos pacientes dos casos descritos neste trabalho.
57
Estas 20 cepas, mantidas em estoque no LAPERE em meio mínimo a 25ºC,
foram reconstituídas no momento do uso em caldo BHI (Brain Heart Infusion). Na
Tabela 1, elas foram relacionadas segundo a origem e o município cearense de
procedência.
Tabela 1 – Relação de cepas de B. pseudomallei da coleção do CEMM
Isolados Origem Município
CEMM 03-06-033 Caso2/sangue Tejuçuoca
CEMM 03-06-034 Caso3/sangue Tejuçuoca
CEMM 03-06-035 Caso4/sangue Tejuçuoca
CEMM 03-06-036 Caso8/Lavado Broncoalveolar Ubajara
CEMM 03-06-037 Caso 6/Sangue Aracoiaba
CEMM 03-06-038 Caso 9/Aspirado peritoneal Granja
CEMM 05-03-008 Caso 10/Sangue Itapajé
CEMM 05-03-009 Caso 11/Aspirado peritoneal Ubajara
CEMM 05-03-010 Caso 12/Medula óssea Pacoti
CEMM 05-03-011 Caso 13/Sangue Ocara
CEMM 03-06-039
Ambiental/solo Tejuçuoca
CEMM 03-06-040
CEMM 03-06-041
CEMM 03-06-042
CEMM 03-06-043
CEMM 03-06-044
CEMM-03-06-045
CEMM-03-06-046
CEMM 03-06-047
CEMM 03-06-048
Fonte: dados da pesquisa
12.2 Precauções de biossegurança
Todos os procedimentos envolvendo a manipulação laboratorial das cepas clínicas e
ambientais de B. pseudomallei foram realizados em capela de fluxo laminar II/B em medidas
de contenção de biossegurança 3, conforme preconizado para este agente (PEACOCK et al.,
2008). Todo o material gerado no NB-3 proveniente do cultivo de B. pseudomallei foi
autoclavado a 121ºC por 30 minutos para completa e eficiente inativação dos microrganismos.
12.3 Teste de assimilação da L-arabinose e identificação preliminar
A identificação preliminar consistiu no teste da oxidase, na caracterização
morfotintorial pela coloração de Gram e macromorfologia típica das colônias nos seguintes
meios seletivos e indicadores: (i) ágar-Ashdown (meio seletivo); (ii) Burkholderia
58
pseudomallei Ágar – BPSA (meio seletivo); (iii) chromID CPS (meio cromogênico,
tecnologia bioMeriéux, para o isolamento de identificação de uropatógenos); (iv) ágar-sangue
com 5% de sangue desfibrinado de carneiro e (v) ágar-MacConkey (meio seletivo e indicador
para bacilos Gram-negativos) (Anexo I). O teste de oxidase foi realizado pela utilização de
tiras de papel impregnadas com o reagente N, N, N’, N’-tetrametil-p-fenilenediamino
dihidroclide da marca Probac do Brasil (ASHDOWN, 1979; HOWARD K.; INGLIS T.J.,
2003).O teste da L-arabinose foi realizado por meio do método das galerias API 20NE
(bioMérieux®), conforme instruções do fabricante. A leitura destas reações faz-se utilizando
um sistema de identificação no programa da bioMérieux disponível na internet no site
https://apiweb.biomerieux.com. O controle de qualidade foi realizado pela utilização da cepa
Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 (DEEPAK et al., 2008).
12.4 Identificação e sensibilidade automatizadas pela metodologia VITEK2®
Neste estudo, todas as 20 cepas tiveram sua identificação realizada pela metodologia
VITEK2® (bioMeriéux) pela utilização do cartão GN de identificação e a sensibilidade pelo
cartão AST 105 (LOWE et al., 2006). O sistema VITEK2® é um equipamento automatizado
que utiliza cartões com 48 poços, onde são realizados testes bioquímicos para identificação de
bactérias de crescimento rápido. Os resultados finais são disponibilizados em
aproximadamente dez horas ou até menos (PINCUS, D. H., 2006).
Figura 11. Imagens que representam as técnicas de preparo do inóculo para os cartões do VITEK2® padronizado,
segundo a escala de MacFarland, com a utilização de um densitômetro, DensiCHEK, da bioMeriéux inc.
Preparo do inóculo para inoculação dos cartões do VITEK2®
O inóculo foi preparado com base em cultura pura, de acordo com as boas práticas
laboratoriais, e está descrita no Anexo II. A suspensão de microrganismo foi preparada com a
utilização do calibrador do DensiCHEK™ VITEK2® (Figura 11) (PINCUS, D. H., 2006).
59
O controle de qualidade foi realizado segundo recomendações do manual do
equipamento, com as seguintes cepas ATCCs: Acinetobacter baumannii ATCC® BAA-747,
Enterobacter cloacae ATCC® 700323, Klebsiella oxytoca ATCC® 700324 e Proteus
vulgaris ATCC® 6380 (PINCUS, D. H., 2006).
O teste de sensibilidade a antimicrobianos pela metodologia VITEK2® foi realizado em
paralelo com o teste de identificação, com uso do cartão AST-105. As técnicas de preparo do
inóculo e inoculação dos cartões são semelhantes às da etapa de identificação (Anexo II).
12.5 Sensibilidade a antimicrobianos pelo método de microdiluição em caldo
Müeller-Hinton, segundo metodologia do CLSI, doc. M7-A8 (CLSI, 2009b).
As drogas antimicrobianas utilizadas nos testes de sensibilidade pelo método de
microdiluição (amoxicilina tri-hidratada, clavulanato de potássio, ceftazidima hidratada,
doxiciclina hiclato, imipenem mono-hidratado, sulfametoxazol e trimetoprim) foram
adquiridas da Sigma-Aldrich, Inc. Estas drogas, disponibilizados em forma de pó, foram
diluídas segundo a escala de diluição recomendada pelo CLSI, documento M7-A8, (CLSI,
2009b). A pesagem das drogas foi realizada segundo as recomendações do CLSI, usando-se a
seguinte fórmula:
Peso (mg) =
Na Tabela 2, estão detalhadas as diluições das cinco drogas testadas, além dos critérios
interpretativos e os pontos de corte para as categorias sensível (S), intermediário (I) e
resistente (R) (CLSI, 2009b).
Tabela 2. Critérios interpretativos padronizados para os testes de sensibilidade a
antimicrobianos
Antimicrobiano Pontos de corte e Critérios
interpretativos - CIMs (µg/mL)
Escala de Diluição
(µg/mL)
S I R
Amoxicilina-clavulanato* <=8/4 16/8 >=32/16 0,5 – 128
Ceftazidima <=8 16 >=32 0,004 – 128
Doxiciclina <=4 8 >=16 0,03 – 128
Imipenem <=4 8 >=16 0,06 – 128
Trimetoprim-sulfametoxazol <=2/38 - >=4/76 4 – 128
Fonte: doc. M100-S21 (CLSI, 2011); * 1 parte de clavulanato para 2 de amoxicilina;
60
As soluções-padrão de agente antimicrobiano foram preparadas em concentrações de
dez vezes a concentração mais alta a ser testada. Uma vez que a contaminação microbiana
destas soluções é bastante rara, decidiu-se por não esterilizá-las. Alícotas de 1 mL destas
soluções foram colocadas em tubos estéreis, seladas cuidadosamente e armazenados a 80° C.
Os frascos foram retirados do freezer conforme a necessidade, usados no mesmo dia, e as
sobras descartadas no final da jornada. Foram utilizados solventes e diluentes segundo as
recomendações do CLSI (CLSI, 2011).
Diluição dos antimicrobianos, segundo documento M7-A8 do CLSI
Os antimicrobianos foram diluídos tendo como ponto de partida a concentração
desejável no primeiro poço da placa de microdiluição. Para doxicilina, cujo 1º poço foi 128
µg/mL, preparou-se uma solução 4X concentrada (512 µg/mL) com água como diluente.
Foram apostados 3,5 mL desta solução, que foram distribuídos em alíquotas de 700µL e
armazenados a -20 oC até o uso. Para ceftazidima e imipenem, cujo 1º poço foi 128µg/mL,
também foram preparadas soluções 4X concentradas (512 µg/mL) com água como diluente.
3,5 mL foi o volume preparado destas soluções, distribuído em alíquotas de 700 µL mantidas
a -20 oC até o uso. Para sulfametoxazol/trimetoprim (19 partes de sulfametoxazol e uma parte
de trimetoprim) cujo 1º poço foi 304/16 µg/mL respectivamente, em virtude da posterior
reconstituição da solução com a associação das duas droga, preparou-se uma solução 8X
concentrada para cada droga (2.432/128 µg/mL, respectivamente), tendo como diluentes o
NaOH 0,1M para sulfametoxazol e água mais ácido acético glacial para trimetoprim. Foram
distribuídas alíquotas de 700 µL e armazenadas a -20 oC até o uso. Já para
amoxicilina/clavulanato (duas partes de amoxicilina / uma de clavulanato), o 1º poço foi
128/64 µg/mL, tendo sido preparada uma solução 8X concentrada para cada droga, ou seja,
1.064/512 µg/mL, respectivamente, tendo como diluentes o dimetilsulfóxido (DMSO) para
amoxicilina o tampão fosfato 0,1 M para o clavulanato. Foram distribuídas alíquotas de 700
µL, armazenadas a -20 oC até o uso. Para a determinação da sensibilidade das cepas de B.
pseudomallei frente a antimicrobianos, utilizou-se a técnica de microdiluição em caldo
Müeller-Hinton com microplacas, descrita pelo CLSI, documento M7-A8 (CLSI, 2009).
61
Preparo das diluições na microplaca
Foram adicionados 100µL do meio de cultura caldo Müller-Hinton (MH) em todos os
poços da placa. Para o preparo do inóculo, utilizou-se o método de suspensão direta das
colônias. Colônias isoladas de uma placa de ágar-sangue com 18-24 horas de crescimento
foram selecionadas e suspensas em solução salina estéril (NaCl aquoso a 0,9%) que em
seguida foi ajustada até alcançar a turbidez da solução-padrão do tubo 0,5 da escala de
McFarland. Para garantir que cada poço tivesse aproximadamente 5 x 105 UFC/mL, seguiu-se
a recomendação do tempo de 15 minutos entre o preparo do inóculo e a inoculação das placas
(CLSI, 2009).
O procedimento da diluição para obter esse inóculo final foi executado conforme o
método de diluição sucessiva na aplicação do inóculo em cada poço na placa de
microdiluição. Considerou-se como indispensável saber o volume exato de inóculo aplicado
nos poços para fazer esse cálculo. Como o volume do meio de cultura no poço foi 0.1mL e o
volume de inóculo a ser diluído MH foi 0,01mL, a suspensão McFarland 0,5 (1 x 108
UFC/mL) teve que ser diluída 1:20 para se conseguir uma diluição de 5 X 106 UFC/mL.
Quando 0,01 mL dessa suspensão foi inoculado no caldo, a concentração final de bactérias do
teste ficou aproximadamente 5 x 105 UFC/mL. Uma coluna de poços não inoculados e uma
sem antibióticos foram incluídas. A primeira controlou a adequação do meio de cultura para o
crescimento bacteriano e a segunda controlou a esterilidade do meio. A placa foi coberta com
uma tampa e um filme plástico selador e incubada a 35-36 oC por 18-24 h (CLSI, 2009).
Leitura das placas e determinação da Concentração Inibitória M’nima – CIM, segundo
documento M45-A2 do CLSI
A leitura e a interpretação do teste foram realizadas pela observação do ponto final da
CIM para a menor concentração do antimicrobiano, no qual não houve crescimento visível, ou
seja, 100% de inibição. Para a droga com a associação sulfametoxazol/trimetoprim, a leitura
foi realizada observando 80% de inibição de crescimento, como recomenda o CLSI. As CIMs
das cepas-controle, P.aeruginosa ATCC®-27853 e E. coli ATCC®-25922, foram observadas
conforme a faixa de resultados esperados para cada cepa. O resultado da CIM foi interpretado
segundo os critérios padronizados para cada droga antimicrobiana, de forma a determinar um
resultado qualitativo com a utilização das categorias “S” sensível, “I” intermediário e “R”
resistente quando aplicável (CLSI, 2010).
62
12.6 Identificação molecular por PCR específica
Extração de DNA genômico - o DNA genômico foi extraído de culturas de B.
pseudomallei pela utilização do sistema comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit –
(Promega, EUA), de acordo com as instruções do fabricante (Anexo III). Para o
procedimento, os isolados de B. pseudomallei estocados foram inicialmente cultivados em
ágar-sangue a 37 ºC por 48horas. Em seguida, apenas uma colônia isolada na placa foi então
repicada para caldo BHI e incubada a 37 ºC por 24 horas. Após este período, realizou-se
coloração de Gram para checar a pureza dos cultivos. Alíquotas de DNA obtidas após o
primeiro tratamento com o tampão de lise foram incubadas em caldo BHI a 37º C por sete
dias. A ausência de qualquer crescimento garantiu a segurança do procedimento. Após o
término desta etapa, as amostras de DNA genômico foram estocadas a 4 ºC (SAMBROOK et
al., 2001; CLSI, 2005).
Verificação da presença e da integridade do DNA genômico – para verificar a
pureza e integridade do DNA extraído, as amostras de DNA foram submetidas a eletroforese
em gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio (10 µL/100 mL), com o objetivo de
verificar a presença e a integridade do DNA extraído. A corrida foi realizada em tampão tris-
borato-EDTA (TBE) 1X a 100 V por 50 minutos. Após corrida eletroforética, o padrão de
bandas resultante foi visualizado sob luz UV - Promega Co. USA e registrada em máquina
fotográfica digital (SAMBROOK et al., 2001).
Quantificação do DNA - a concentração e a pureza do DNA nas amostras foram
determinadas por espectrofotometria e mensuração da densidade óptica a 260 nm e 280 nm
usando o espectrofotômetro Ultrospec 1100 pro (GE Healthcare, Reino Unido)
(SAMBROOK et al., 2001).
Técnica de identificação molecular de B. pseudomallei por PCR específica - a
identificação molecular dos isolados clínicos e ambientais neste estudo foi realizada por meio
da técnica de PCR específica proposta por Merritt et al. (2006). Para tanto, foi utilizado um
par de iniciadores com 18 bases (Invitrogen, USA), que amplifica um fragmento de
aproximadamente 302 pb, da região 16S-23S do DNAr específico para B. pseudomallei. As
sequências dos iniciadores que amplificam fragmento de 302 pb da região 16S-23S DNAr
específico para a identificação de B. pseudomallei foram: (i) primer Bp1, posição 397-415,
fita senso, sequência 5’-3’(CGATGATCGTTGGCGCTT); (ii) primer Bp4, posição 680-
63
662, fita antissenso, sequência 5’-3’ (CGTTGTGCCGTATTCCAAT). A reação foi realizada
em um volume final de 25 µL, contendo 10 µL de amostra de DNA (na concentração 30
ng/µL), 2,5 µL de tampão de reação 10X (New England Biolabs, Reino Unido), 1 mmol/L de
MgCl2 (Invitrogen, USA), 50 pmol de cada primer Bp1 e Bp4, 10 mmol/L de cada
desoxirribonucleotídeo e 1 U de Taq DNA polimerase (New England Biolabs, Reino Unido).
A amplificação de DNA bacteriano foi realizada em termociclador Mastercycler (Eppendorf,
USA). No começo, seguiu-se uma etapa de desnaturação inicial a 94 ºC por quatro minutos, e
45 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 50 ºC por 30 segundos e
extensão a 72 ºC por 45 segundos. Após os 45 ciclos, seguia-se um passo de extensão a 72 ºC
por sete minutos. Após a amplificação, o produto foi armazenado a -20 ºC até a realização de
corrida eletroforética. A visualização dos produtos amplificados pela PCR foi realizada em
gel de agarose 1%, contendo brometo de etídio e visualizada por transluminador UV. A
corrida foi realizada em tampão tris-borato-EDTA (TBE) 1X a 100 V por 50 minutos
(MERRITT et al., 2006).
12.7 Sequenciamento de DNA
Os produtos de PCR amplificados foram diluídos em água ultrapura estéril e
submetidos a reações de sequenciamento de 10 μL pelo método da terminação da cadeia pelo
didesoxinucleotídeo (SAMBROOK et al., 2001), usando-se o kit DYEnamicTM ET
terminators cycle sequencing (GE Healthcare, Reino Unido). Os dois primers usados para
amplificação da região 16S DNAr também foram usados nas reações de sequenciamento,
além de outros dois primers, 782R (ACCAGGGTATCTAATCCTGT) e 1100R
(AGGGTTGCGCTCGTTG). A reação de sequenciamento foi realizada em um volume final
de 10 μL por poço da placa, sendo 5 μL de DNA purificado diluído, 1 μL de um só iniciador e
4 μL de pré-mix de reação, fornecido pelo kit. Para cada amostra de DNA sequenciada, a
reação para cada iniciador foi realizada em quadruplicata na placa de sequenciamento. A
reação de sequenciamento foi realizada em termociclador Mastercycler (Eppendorf, USA) em
25 ciclos de desnaturação a 95 ºC por 20 segundos, anelamento a 50 ºC por 15 segundos e
extensão a 60ºC por um minuto (SAMBROOK et al., 2001).
Amplificação da região 16S do DNAr - a região completa do DNA ribosomal 16S
(16S DNAr) foi amplificada in vitro por PCR usando os primers 27F
64
(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) e 1525R (AAGGAGGTGATCCAGCC), gerando
amplicons de aproximadamente 1500 pb. A PCR para amplificação da região 16S DNAr
(feita em quadruplicata para cada amostra) foi realizada com um volume final de 25 µL,
contendo 1 µL de DNA (na concentração 200 ng/µL), 5 µL de tampão de reação 5X (Green
GoTaq Buffer, Promega, USA), 1,5 mmol/L de MgCl2, 50 pmol de cada iniciador 27F e
1525R, 10 mmol/L de cada desoxirribonucleotídeo e 1 U de Taq DNA polimerase (GoTaq
DNA polimerase, Promega, USA). A amplificação da região 16S DNAr foi realizada em
termociclador Mastercycler (Eppendorf, USA). Inicialmente, seguia-se uma etapa preliminar
de desnaturação a 95 ºC por dois minutos, anelamento a 62 ºC por dois minutos e extensão a
72 ºC por um minuto e 30 segundos, seguida de 33 ciclos de desnaturação a 95 ºC por um
minuto, anelamento a 62 ºC por um minuto e extensão a 72 ºC por um minuto e 30 segundos.
Após os 33 ciclos, seguia-se um passo de extensão a 72 ºC por cinco minutos. Após a
amplificação, o produto foi armazenado a -20 ºC até a realização da corrida eletroforética. O
protocolo de purificação do kit encontra-se descrito no Anexo IV. Os produtos da PCR para
amplificação da região 16S DNAr foram visualizados por eletroforese em gel de agarose
0,8%, corado com brometo de etídio, sendo as amostras purificadas com o kit GFXTM PCR
DNA and gel band purification (GE Healthcare, Reino Unido) de acordo com as instruções
fornecidas pelo fabricante. Feito isso, as amostras purificadas foram quantificadas em
espectrofotômetro pela mensuração da densidade óptica a 260 nm e então diluídas em água
deionizada estéril para a concentração de 30 ng/µL (LIESACK, W.; DUNFIELD, P. F, 2004).
Precipitação da placa de sequenciamento e análise das sequências - ao término da
reação de sequenciamento, os produtos foram precipitados de acordo com protocolo descrito
no Anexo V, para a remoção de sais e componentes do kit não incorporados e então
analisados em um sequenciador MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences, USA).
Montagem das sequências consenso, alinhamento múltiplo e edição das
sequências - as sequências de DNA foram analisadas em relação à qualidade e montadas com
o auxílio do pacote Phred/Phrap/Consed (EWING et al., 1998; EWING; GRENN, 1998;
GORDON et al., 1998). Sequências de alta qualidade (phred > 20) foram comparadas com as
sequências correspondentes depositadas no GenBank, por meio do programa BLAST
(ALTSCHUL et al., 1990). As sequências com maior similaridade foram alinhadas usando-se
o programa ClustalW (THOMPSON et al., 1997). As edições dos alinhamentos foram
realizadas manualmente, com o auxílio do programa Bioedit, versão 5.0.9. (HALL, 1999).
65
12.8 Técnica de RAPD - DNA polimórfico amplificado aleatoriamente
A técnica de PCR otimizada para RAPD foi realizada segundo Leelayuwat et al.,
2000. Foram realizados ciclos de 94 ºC, por cinco minutos, e 35 ciclos a 94 ºC, por um
minuto, a 37 ºC, por um minuto, a 72 ºC, por dois minutos, seguida de uma extensão final a
72 ºC, por dez minutos, e mantida a 4 ºC. Foram utilizados os primers citados na Tabela 3
(LEELAYUWAT et al, 2000; VIKTOROV et al., 2006).
Os padrões variados de bandas obtidas por PCR-RAPD mostradas no gel de
eletroforese foram analisados de acordo com a presença (1) ou ausência (0) de bandas, o que
gerou uma matriz binária. O coeficiente Dice de similaridade foi medido e um dendograma
foi obtido pela utilização da metodologia Unweight Pair Group Method with Arithmetic
Average (UPGMA). O programa de computação BioNumerics versão 6.6 foi utilizado para a
análise dos clusters para medir as relações entre as espécies.
Foram analisados também, em conjunto com o RAPD, os dados demográficos dos
pacientes, dados clínicos (sepse e defecho clinico) e distribuição geográfica dos casos de
melioidose, relacionando-os aos clusters obtidos.
Tabela 3. Relação de primers utilizados na metodologia de RAPD para B. pseudomallei
Primers Sequências (5’3’) %GC
OPQ-16 AGTGCAGCCA 70
OPQ-4 AGTGCGCTGA 70
OPQ-2 TCTGCTGGTC 70
Fonte: LEELAYUWAT et al, 2000.
12.9 Reações de PCR para detecção do gene de virulência
O gene TTSS foi amplificado a partir de 100 ng de DNA total, com os seguintes
oligonucleotídeos (primers): primer BPTTSF 5’-CTTCAATCTGCTCTTTCCGTT-3’ e
primer BPTTSR 5’-CAGGACGGTTTCGGACGAA-3’. As condições de PCR foram
realizadas de acordo com o protocolo descrito por Gal et al. (2005), com uma desnaturação
inicial a 95 °C (1min), extensão a 95°C (30seg), 72 °C (30seg) por 35 ciclos e extensão final
66
de 72 °C (2min). Para a visualização do produto amplificado, realizou-se eletroforese em gel
de agarose 1% e coloração com brometo de etídeo (GAL et al., 2005).
12.10 Catalogação das características clínicoepidemiológicas dos casos de
melioidose ocorridos no Ceará, no período de 2005 a 2011
Foram realizadas pesquisas nos bancos de dados de sites bibliográficos como Medline,
PubMed e Scielo, utilizando-se palavras-chaves como Burkholderia pseudomallei,
melioidosis, ecology, environmental e Brazil, bem como publicações da Secretaria de Saúde
do Estado do Ceará. Essas pesquisas tiveram como objetivo investigar as condições
geoclimáticas das regiões mundiais onde a melioidose tem ocorrido de forma endêmica ou
esporádica desde 1913, além de buscar relatos de casos sobre turistas acometidos de
melioidose após visita ao Brasil. Por contato formal com o Instituto de Pesquisa e Estratégia
Econômica do Ceará – IPECE, também foram coletadas informações sobre as condições
geoclimáticas das regiões onde houve ocorrência de melioidose no Estado do Ceará com o
objetivo de comparar com as informações relatadas em outros países. Os indicadores
pesquisados nesse estudo foram: posição geográfica, altitude, classes de solos, tipos
climáticos e precipitação pluviométrica (IPECE, 2010a).
13 RESULTADOS
12.11 Testes manuais de identificação preliminar e teste de assimilação de L-
arabinose
Os resultados nas provas bioquímicas manuais preliminares para as 20 cepas de B.
pseudomallei foram: teste da oxidase positivo, teste de assimilação de L-arabinose negativo,
características morfotintoriais de bacilos Gram-negativos e morfologia típica das colônias
(secas, sem brilho, enrugadas e cerebriforme), nos meios de culturas ágar-Ashdown, ágar-
BPSA, ChromID CPS, ágar-sangue e ágar-MacConkey.
67
12.12 Resultados da identificação automatizada e sensibilidade pela metodologia
VITEK2®
O sistema VITEK2® identificou como B. pseudomallei todas as 20 cepas, pela utilização
do cartão GN de identificação, com nível de confiança, definido pelo fabricante, de 93%
(muito bom) a 99,0% (exelente) (Tabela 4). O teste de qualidade com as cepas ATCCs
mostrou resultados dentro da faixa esperada.
Tabela 4. Resultado do teste de sensibilidade e determinação da concentração inibitória mínima –CIM
(μg/mL ) das cepas de B. pseudomallei do LAPERE pela metodologia VITEK2®
Cepas
Amoxicilina/
Clavulanato
Ceftazidima Imipenem
Sulfamtexazol/
Trimetoprim Tigeciclina
CEMM 03-06-033 4/2 4 <= 1 2/38 4
CEMM 03-06-034 4/2 4 <= 1 2/38 4
CEMM 03-06-035 4/2 2 <= 1 2/38 2
CEMM 03-06-036 4/2 2 2 1/19 4
CEMM 03-06-037 8/4 4 <= 1 2/38 4
CEMM 03-06-038 8/4 4 <= 1 2/38 4
CEMM 05-03-008 2/1 4 <= 1 2/38 4
CEMM 05-03-009 2/1 2 <= 1 2/38 4
CEMM 05-03-010 4/2 2 <= 1 2/38 4
CEMM 05-03-011 4/2 4 <= 1 2/38 4
CEMM 03-06-039 2/1 4 <= 1 1/19 2
CEMM 03-06-040 8/4 8 <= 1 2/38 <= 0,5
CEMM 03-06-041 4/2 4 <= 1 2/38 4
CEMM 03-06-042 8/4 16 <= 1 2/38 <= 0,5
CEMM 03-06-043 4/2 4 <= 1 2/38 4
CEMM 03-06-044 2/1 <= 1 <= 1 1/19 4
CEMM-03-06-045 4/2 2 <= 1 2/38 2
CEMM-03-06-046 4/2 <= 1 <= 1 1/19 <= 0,5
CEMM 03-06-047 4/2 <= 1 <= 1 1/19 <= 0,5
CEMM 03-06-048 4/2 2 <= 1 2/38 4
Fonte: dados da pesquisa; CEMM: Centro Especializado em Micologia Médica
Os valores de CIM para as 20 cepas de B. pseudomallei determinadas no sistema
VITEK2®, pelo cartão AST-105 estão representados na tabela 5. para Tigeciclina, foram
obtidos com os critérios interpretativos de Enterobacteriaceae. A interpretação das CIMs não
foi realizada em virtude do sistema VITEK2® não possuir critérios interpretativos para B.
pseudomallei.
68
12.13 Resultados do teste de sensibilidade pela microdiluição em caldo Müeller-
Hinton
Na determinação das CIMs pelo teste de sensibilidade por microdiluição, todos os
isolados foram sensíveis ao imipenem, doxicilina e trimetoprim-sulfametoxazol. O teste de
qualidade com as cepas ATCCs mostrou resultados dentro da faixa esperada.
Tabela 5. CIM ((µg/mL) das cepas de B. pseudomallei isoladas no Ceará, determinadas pela
metodologia de microdiluição em caldo Müeller-Hinton
Cepas Amoxicilina
/clavulanato
Ceftazidima Doxiciclina Imipenem Sulfametoxazol
/trimetoprim
CIM Cat CIM Cat CIM Cat CIM Cat CIM Cat
CEMM 03-6-033 8/4 S 8 S 0,5 S 0,25 S 0,25/4,75 S
CEMM 03-6-034 32/16 R 8 S 0,25 S 0,5 S 2/38 S
CEMM 03-6-035 8/4 S 8 S 0,25 S 0,5 S 1/19 S
CEMM 03-6-036 8/4 S 4 S 0,25 S 0,5 S 1/19 S
CEMM 03-6-037 8/4 S 4 S 0,5 S 0,5 S 0,5/9,5 S
CEMM 03-6-038 16/8 I 4 S 0,25 S 1,0 S 0,5/9,5 S
CEMM 05-03-008 8/4 S 4 S 0,25 S 0,25 S 1/19 S
CEMM 05-03-009 4/2 S 2 S 0,25 S 0,5 S 1/19 S
CEMM 05-03-010 16/8 S 8 S 0,25 S 0,5 S 0,25/4,75 S
CEMM 05-03-011 16/8 S 8 S 0,25 S 0,125 S 0,5/9,5 S
CEMM 03-06-039 8/4 S 8 S 0,25 S 0,25 S 0,5/9,5 S
CEMM 03-06-040 8/4 S 4 S 0,25 S 0,5 S 0,25/4,75 S
CEMM 03-06-041 8/4 S 4 S 0,25 S 1,0 S 2/38 S
CEMM 03-06-042 16/8 I 16 I 0,25 S 1,0 S 2/38 S
CEMM 03-06-043 16/8 I 16 I 0,25 S 0,25 S 2/38 S
CEMM 03-06-044 4/2 S 2 S 0,25 S 0,5 S 0,125/2,375 S
CEMM 03-06-045 8/4 S 4 S 0,5 S 1,0 S 0,25/4,75 S
CEMM 03-06-046 8/4 S 8 S 0,25 S 1,0 S 0,25/4,75 S
CEMM 03-06-047 8/4 S 8 S 0,25 S 0,5 S 0,25/0,475 S
CEMM 03-06-048 8/4 S 4 S 0,5 S 1,0 S 0,25/4,75 S
Fonte: dados da pesquisa ; CIM - concentração inibitória minima; cat - categorização segundo o ponto de corte de sensibilidade do CLSI
(CLSI, 2010)
As CIMs determinadas pela metodologia de microdiluição em caldo Müeller-Hinton
das 20 cepas de B. pseudomallei deste estudo foram distribuídas em CIM50 e CIM90 e quanto
ao percentual de sensibilidade. O percentual de sensibilidade para doxicilina, imipenem e
69
sulfametol/trimetoprim foi de 100% cada e para amoxicilina/clavulanato e ceftazidima foi de
80% e 90% respectivamente (Tabela 6).
Tabela 6. CIM50 e CIM90 (µg/mL) das 20 cepas de B. pseudomallei isoladas no Estado do Ceará
Antimicrobianos CIM
50
(µg/mL)
CIM90
(µg/mL) Intervalo Sensibilidade (%)
Amoxicilina/ clavulanato 8/4 18/8 4/2 - 32/16 80
Ceftazidima 4 16 2 - 16 90
Doxicilina 0 1 0,25 - 0,5 100
Imipenem 1 1 0,125 - 1 100
Sulfametoxazol/ Trimetropim 1 2 0,125/2,375 – 2/38 100
Fonte: dados da pesquisa.
12.14 Identificação molecular pela técnica de PCR específica
As cepas de B. pseudomallei isoladas dos casos de melioidose do Ceará, de 2005 a
2011, foram submetidas à identificação pela técnica de PCR específica, utilizando-se os
primers Bp1 e Bp2 e mostraram resultado positivo pela apresentação de uma banda de
aproximadamente 300 pb.
12.15 Sequenciamento da região 16S do DNAr
As cepas de B. pseudomallei oriundas dos pacientes de melioidose do Ceará, no
período de 2005 a 2011, tiveram sua identificação confirmada pela técnica do sequenciamento
da região 16S do DNA ribossômico, pela produção de uma sequência de aproximadamente
1.400 pb.
Os resultados da identificação bioquímica e molecular das cepas de B. pseudomallei
da coleção do LAPERE, assim como o resultado das cepas isoladas dos casos descritos neste
trabalho estão sumariados na Tabela 7.
70
Tabela 7. Cepas clínicas e ambientais de B. pseudomallei da coleção do CEMM – sumário
do resultado da identificação bioquímica e molecular.
Isolados Município Fonte L-arabinose
VITEK2®†
isolados (nível de
confiançal)
PCR* Sequenciamento‡
CEMM 03-6-033 Tejuçuoca Sangue (-) B. pseudomallei
(98.4%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-6-034 Tejuçuoca Sangue (-) B. pseudomallei
(94,0%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-6-035 Tejuçuoca Sangue (-) B. pseudomallei
(94,0%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-6-036 Ubajara Sangue (-) B. pseudomallei
(99,0%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-6-037 Aracoiaba Sangue, Lavado
broncoalveolar (-)
B. pseudomallei
(95,0%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-6-038 Granja Sangue (-) B. pseudomallei
(98,0%) (+) B. pseudomallei
CEMM 05-03-008 Itapajé Tecido ganglionar (-) B. pseudomallei
(93,0%) (+) B. pseudomallei
CEMM 05-03-009 Ubajara Líquido peritoneal (-) B. pseudomallei
(99,0%) (+) B. pseudomallei
CEMM 05-03-010 Pacoti Medula óssea (-) B. pseudomallei
(99,0%) (+) B. pseudomallei
CEMM 05-03-011 Ocara Sangue (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-039
Tejuçuoca Solo
(-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-040 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-041 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-042 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-043 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-044 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-045 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-046 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-047 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
CEMM 03-06-048 (-) B. pseudomallei
(97%) (+) B. pseudomallei
Fonte: dados da pesquisa ; †Identificação bioqímica pelo VITEK2®: > 93% nível de confiança na faixa muito bom - excelente pela avaliação do fabricante; (-)
reação negativa; (+) reação positiva; * PCR da região específica do espaço intergênico 16S-23S do ; ‡sequenciamento do gene 16S do rRNA;
12.16 Caracterização genotípica pela técnica de RAPD
Para a técnica de RAPD, foram utilizados os primers OPQ-2, OPQ-4 e OPQ-16. Dos
três primers citados, o OPQ-16 gerou bandas cujos tamanhos variaram de 117 a 1.131 pb
(Figura 12) e foi escolhido para a construção de um dendograma, por ter sido mais
discriminatório.
71
Figura 12. Padrões de RAPD de 20 cepas de B. pseudomallei isoladas no Ceará, obtidos por PCR com o primer
arbitrário OPQ-16 (GAL et al, 2006). Linhas 1 e 22 representam os marcadores de 100 pb. Fonte: dados da
pesquisa.
Com base no dendograma obtido a partir do primer OPQ-16, observou-se a formação
de dois clusters: o cluster I contemplou 14 cepas e o cluster II quatro cepas. Duas cepas não
foram agrupadas em clusters por apresentarem baixa similaridade (17%) com as demais
(Figura 13).
Das 14 cepas contempladas no cluster I, 13 eram oriundas de Tejuçuoca, sendo dez
ambientais e três clínicas; destas duas isoladas de casos fatais, e uma cepa clínica originária
do Município de Ocara. O cluster II foi formado por quatro cepas oriundas de municípios
diferentes (Ubajara, Aracoiaba, Granja e Pacoti) e todas foram isoladas de casos fatais da
doença (Figura 13).
72
Figura 13. Dendograma resultante da análise do gel com os produtos de PCR-RAPD, das cepas clínicas e
ambientais de B. pseudomallei, com o primer OPQ-16; correlação com dados demográficos dos pacientes e com
aspectos clínicos dos respectivos casos de melioidose. Dendograma realizado no programa BioNumerics
(Applied Math, inc.). Em destaque, um clado com quatro cepas isoladas dos pacientes com desfecho fatal. NA:
não se aplica. Fonte: dados da pesquisa.
12.17 Detecção do gene TTSS pela técnica da PCR
A pesquisa do gene TTSS por PCR foi realizada, segundo Gal et al., (2005), para todas
as 20 cepas, cujo resultado demonstrou a produção de uma banda única de aproximadamente
500 pb (Figura 14).
Figura 14. Amplificação por PCR do gene TTSS de B. pseudomallei. A figura mostra um dos géis
de agarose dos produtos de amplificação do PCR para as cepas de B. pseudomallei da coleção do
CEMM. Nas linhas de 1 a 10, as cepas ambientais e, na linha M, o marcador de PCR de 100bp. Fonte:
dados da pesquisa.
500 pb
73
12.18 Catalogação das características clínicoepidemiológicas dos casos de
melioidose ocorridos no Ceará
Os cinco primeiros casos ocorridos no Ceará, desde o ano de 2003, foram objeto de
relato de caso na literatura (MIRALES et al., 2004; ROLIM et al., 2005; AARDEMA et al,
2005).
De 2005 em diante, novos casos de melioidose ocorridos no Ceará, ou relacionados a
visitas a este Estado, foram classificados de acordo com o município acometido sumariamente
descritos a seguir, em ordem cronológica.
Caso No 6 – Município de Aracoiaba, ano 2005
Um caso fatal de melioidose foi associado ao Município de Aracoiaba, na região
nordeste do Estado do Ceará, a uma latitude(S) 4º 22’ 16’’ e longitude(WGr) 38º 48’ 51’’, em
maio de 2005, quando ocorreu um acidente automobilístico cuja vítima, um homem de 30
anos, caiu em um rio e aspirou água contaminada. Durante o tratamento de traumatismo
crânioencefálico, na UTI de um hospital em Fortaleza, apresentou um quadro grave de
pneumonia. O diagnóstico etiológico foi confirmado pelo isolamento de B. pseudomallei em
hemocultura, identificada pela metodologia VITEK1® (fluorescent card; bioMérieux, Marcy
l’Etoile, France) e confirmada por métodos moleculares. A despeito da terapia antimicrobiana
empírica adequada, o paciente evoluiu para sepse grave que culminou em óbito (ROLIM et al,
2009).
Caso No 7 – melioidose em um turista holandês após visita ao Ceará, ano 2005
Em 2005, um caso de melioidose foi notificado pelo Governo holandês, por se tratar
de um turista que veio a falecer no seu país de origem, após retornar do Brasil, precisamente
do Estado do Ceará. O paciente do sexo masculino, 50 anos, diabético, foi admitido a um
hospital de emergência na Holanda com história de dois dias de febre, dispneia, tosse e
escarro purulento, que evoluiu para sepse e óbito. Na hemocultura e cultura de escarro, foi
isolado um bacilo Gram-negativo identificado como B. pseudomallei pela metodologia API
20 NE e métodos moleculares. O relato referiu que a viagem do paciente ao Ceará incluiu
caminhadas em parques, visita a grutas, banhos de mar, bem como em piscinas e um banho
em um lago de água doce (AARDEMA et al, 2005).
74
Caso No 8 – Município de Ubajara, ano 2008
A melioidose voltou a acontecer no Ceará em abril de 2008, quando um jovem de 17
anos, portador de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), residente em Fortaleza,
visitou, por ocasião de um feriado prolongado, as regiões do noroeste do Estado do Ceará, nos
Municípios de Ubajara [latitude(S) 3º 51' 16", longitude(WGr) 40º 55' 16"], Guaraciaba do
Norte [latitude(S) 4º 10’ 01’’, longitude(WGr) 40º 44’ 51’’] e Ipu [latitude(S) 4º 19’ 20’’,
longitude(WGr) 40º 42’ 39’’]. Durante essa viagem, tomou banho de açude, cachoeiras e
visitou a gruta de Ubajara. Após cinco dias, apresentou um quadro de infecção respiratória
com febre alta e dispneia, que motivou seu internamento com pneumonia aguda e grave. A
terapia antimocrobiana com imipenem foi iniciada, mas o paciente evoluiu para um quadro de
sepse grave e foi a óbito em 48 horas. O diagnóstico etiológico foi realizado pelo isolamento,
no lavado broncoalveolar, de bacilo Gram-negativo, identificado pela metodologia VITEK2®
como B. pseudomallei e confirmado por métodos moleculares. Este caso foi relatado pela
Secretaria de Saúde do Estado na Lista de Verificação de Surtos e Emergências (MS/SVS,
2008; COUTO et al., 2009).
Caso No 9 – Município de Granja, ano 2008
Outro caso de melioidose ocorreu no Ceará em novembro de 2008, quando um
paciente do sexo masculino, 69 anos de idade, agricultor, natural da cidade de Granja,
localizada no noroeste do Estado do Ceará, a uma latitude(S) 3º 07’ 13’’ e longitude(WGr)
40º 49’ 34’’, foi admitido a um hospital de emergência em Fortaleza, apresentando quadro
clínico de abdome agudo. No mesmo, dia foi submetido a laparotomia exploratória, sendo
evidenciados sangue na cavidade abdominal e aneurisma de aorta abdominal roto com
coágulos no seu interior. Houve agravamento do quadro clínico, com evidência de choque
séptico, insuficiência renal, falência de múltiplos órgãos e óbito. O resultado da hemocultura
revelou a presença de B. pseudomallei, identificada pela metodologia VITEK2® e métodos
moleculares (SIDRIM et al, 2011).
75
Caso No 10 – Município de Itapajé, ano 2009
Em outubro de 2009, ocorreu um novo caso de melioidose associado ao Municipio de
Itapajé [latitude(S) 3º 41' 12", longitude(WGr) 39º 35' 10"], ao norte do Estado do Ceará. Um
paciente do sexo masculino, 50 anos, diabético, residente em Fortaleza, natural de Itapajé, foi
hospitalizado em Fortaleza com febre e adenopatia mediastinal. O paciente costumava
frequentar a fazenda em Itapajé e por várias ocasiões teve que atravessar a pé um riacho que
cruza as suas terras. A suspeita clínica inicial era de tuberculose ganglionar, porém, na cultura
do aspirado dos gânglios, foi isolado um bacilo Gram-negativo identificado pela metodologia
VITEK2® como B. pseudomallei e confirmado por métodos moleculares. O paciente foi
tratado com imipenem e teve alta após remissão completa do quadro (comunicação pessoal do
médico assistente, Dr. Ivo Castelo Branco Coelho).
Caso No 11 – Município de Ubajara, ano 2010
Em abril de 2010, um novo caso de melioidose relacionado ao Município de Ubajara
[latitude(S) 3º 51' 16", longitude(WGr) 40º 55' 16"], chamou a atenção da comunidade médica
em Fortaleza [latitude(S) 3º 43' 02", longitude(WGr) 38º 32' 35"]. Um paciente do sexo
masculino, 57 anos, residente em Fortaleza, portador de anemia falciforme, pai do adolescente
de 17 anos que faleceu de melioidose em 2008 (caso no 8), foi internado com quadro clínico
de abdome agudo. O paciente participou da mesma viagem a Ubajara realizada por seu filho
em 2008. O quadro se agravou e ele foi submetido a laparotomia exploratória, quando foi
evidenciado um quadro de peritonite purulenta e abscesso esplênico. O diagnóstico etiológico
foi realizado pelo isolamento de um bacilo Gram-negativo no aspirado purulento da cavidade
abdominal, cuja identificação feita pela metodologia VITEK2® revelou B. pseudomallei
confirmada por métodos moleculares. Com a suspeita de melioidose, em virtude do caso do
filho, a terapia empírica com imipenem foi instituída precocemente, o que resultou em franca
recuperação do paciente e alta hospitalar (comunicação pessoal dos médicos assistentes, Drs.
Jorge Luis N. Rodrigues e Ivo Castelo Branco).
Caso No 12 – Município de Pacoti, ano 2010
O 12o caso de melioidose no Ceará ocorreu também no ano de 2010, em dezembro,
quando um paciente de 29 anos, natural de Pacoti [latitude(S) 4º 13' 30", longitude(WGr) 38º
55' 24"], foi acometido de doença febril a esclarecer. Com suspeita clínica de tuberculose, fez
76
esquema terapêutico para esta patologia. Foi atendido a um hospital geral de Fortaleza,
quando foram solicitadas sorologias para esclarecer o diagnóstico da doença febril, inclusive
hemocultura e cultura de medula óssea. Em seguida, foi instituida a terapia antimicrobiana
empírica com carbapenêmicos. O diagnóstico de melioidose foi confirmado com o isolamento
de B. pseudomallei em cultura da medula óssea, identificada pela metodologia VITEK2® e,
posteriormente, confirmada por métodos moleculares. Alguns dias depois foi liberado o
resultado positivo da sorologia para dengue. A presença da coinfecção viral provavelmente
agravou a manifestação de melioidose e o paciente evoluiu para sepse grave e óbito. A
provável fonte de contaminação com B. pseudomallei relacionou-se à atividade profissional
do paciente, que envolvia o manuseio e o transporte de tijolos fabricados em uma olaria onde
trabalhava na região. Estes tijolos manuseados pelo paciente tinham como materia-prima a
terra escavada do solo da região de Pacoti (comunicação pessoal do médico assistente, Dr.
Francisco George Magalhães).
Caso No 13 – Município de Ocara, ano 2011
Em janeiro de 2011, surgiu outro caso de melioidose no Ceará, no Município de Ocara
[latitude(S) 4º 29’ 27’’, longitude(WGr) 38º 35’ 48’’]. Um paciente de 59 anos, paraplégico,
diabético, foi internado em um hospital em Fortaleza com febre e imagem radiológica
compatível com gânglios mediastinais infartados. Foi submetido a vários exames laboratoriais
para diagnóstico, inclusive hemocultura. Foi iniciada a terapia antimicrobiana empírica com
imipenem endovenoso, que resultou em melhora clínica. O resultado da hemocultura mostrou
o isolamento de um bacilo Gram-negativo idenficado pela metodologia VITEK2® como B.
pseudomallei e, posteriormente, confirmado por métodos moleculares. Com a liberação do
resultado, o paciente recebeu o tratamento completo para melioidose e teve alta hospitalar. A
provável fonte de contaminação com B. pseudomallei, nesse caso, estava associada ao fato de
o paciente se locomover se arrastando pelo chão em virtude da paraplegia, decorrente de
poliomielite (comunicação pessoal do médico assistente, Dr. Francisco George Magalhães).
Os dados clínico-epidemiológicos dos casos de melioidose descritos no Estado do
Ceará, nos últimos oito anos, encontram-se sumariados na Tabela 8.
77
Tabela 8. Características clínicas e epidemiológicas dos 13 casos de melioidose ocorridos no Ceará, região Nordeste do Brasil.
Casos Mês/ano Idade
(anos) Sexo Aspectos clínicos/exposição Tratamento
Desfecho
clínico Diagnóstico laboratoria
a Cepasb Origem(IPECE, 2010) Referência
01 Fev/2003 15 M Febre, tosse, cefaleia, pústulas nos membros
inferiores e sepse fulminante. Exposição: mergulhos
em águas da chuva.
Dados não
disponíveis
Óbito Não disponível Não
disponível
Tejuçuoca: latitude(S) 3º 59’ 20’’;
longitude(WGr) 39º 34’ 50’’
MIRALLES et al.,
2004; VIRGINIO
etal.,2006;
02 Fev/2003 14 F Febre, tosse, cefaleia, pústulas nos membros
inferiores e sepse fulminante. Exposição: mergulhos em águas da chuva.
Dados não
disponíveis
Óbito Identificação bioquímica
para BGNNFc
03-06-033 Tejuçuoca: latitude(S) 3º 59’ 20’’;
longitude(WGr) 39º 34’ 50’’
MIRALLES et al.,
2004; VIRGINIO
etal.,2006
03 Fev/2003 10 M Febre, tosse, cefaleia, pústulas nos membros inferiores e sepse fulminante. Exposição: mergulhos
em águas da chuva.
Dados não disponíveis
Óbito Identificação bioquímica
para BGNNFc
03-06-034 Tejuçuoca Latitude (S) 3º 59’ 20’’; longitude
(WGr) 39º 34’ 50’’
MIRALLES et al.,
2004; VIRGINIO
etal.,2006
04 Fev/2003 12 F Febre, tosse, cefaleia, pústulas nos membros
inferiores. Exposição: mergulhos em águas da chuva.
Dados não
disponíveis
Sobrevivente Identificação bioquímica
para BGNNFc
03-06-035 Tejuçuoca latitude (S) 3º 59’ 20’’;
longitude (WGr) 39º 34’ 50’’
MIRALLES et al.,
2004; VIRGINIO
etal.,2006
05 Jan/2004 39 M Abscesso genital e sepse. Sem comorbidades.
Exposição: lavar roupas agachada no rio.
Dados não
disponíveis
Óbito Dados não disponíveis Não
disponível
Banabuiú: latitude (S) 5° 18’ 35” e
longitude (WGr) 38° 55’ 14”
ROLIM et al., 2005
06 Mai/2005 30 M Pneumonia aspirativa e sepse. Comorbidade: TCE
Exposição: acidente automobilístico/imersão no rio.
Imipenem Óbito Sistem VITEK1®,
confirmada por PCR
03-06-037 Aracoiaba
latitude(S) 4º 22’ 16’’ e
longitude(WGr) 38º 48’ 51’’
ROLIM et al., 2009;
INGLIS et al., 2006
07 Jul/2005 50 M Pneumonia comunitária e sepse. Comorbidade:
diabetes. Exposição: nadar em lagos.
Cefuroxime,
eritromicina
Óbito API 20NE; confirmada por
PCR
Não
disponível Dados não disponíveis
AARDEMA et al.,
08 Abr/2008 17 M Pneumonia e sepse. Exposição: banho em cachoeira. Imipenem Óbito
Sistem VITEK2®,
confirmada por PCR 03-06-036
Ubajara
Latitude (S) 3º 51' 16", longitude
(WGr) 40º 55' 16"
MS/SVS, 2008
09 Nov/2009 70 M Aneurisma micótico, exposição desconhecida. Cefepime Óbito Sistem VITEK2® ,
confirmada por PCR
03-06-038 Granja latitude (S) 3º 07’ 13’’ e
longitude (WGr)
SIDRIM et al., 2011
10 Out/2009 50 M Adenopatia mediastinal e febre. Comorbidade: diabetes. Exposição desconhecida.
Meropenem Sobrevivente Sistem VITEK2® , confirmada por PCR
05-03-008 Itapajé latitude (S) 3º 41' 12", longitude (WGr) 39º 35' 10"
Case not reported yet
11 Abr/2010 57 M Abscesso esplênico e peritonite, comorbidade: anemia falciforme. Exposição desconhecida.
Imipenem Sobrevivente Sistem VITEK2® , confirmada por PCR
05-03-009 Ubajara latitude (S) 3º 51' 16", longitude (WGr) 40º 55' 16"
Case not reported yet
12 Dez/2010 29 M Pneumonia e sepse, comorbidade: dengue. Exposição: manuseio e transporte de tijolos.
Imipenem Óbito Sistem VITEK2® , confirmada por PCR
05-03-010 Pacoti latitude (S) 4 13' 30", longitude (WGr) 38º 55' 24"
Case not reported yet
13 Jan/2011 59 M Adenopatia e febre. Co-morbidade: diabetes Exposição desconhecida.
Meropenem Sobrevivente Sistem VITEK2® , confirmada por PCR
05-03-011 Ocara latitude (S) 4º 29’ 2 7’’, longitude (WGr) 38º 35’ 48’’.
Case not reported yet
Fonte: dados da pesquisa ; a Métodos diagnósticos usados pelo laboratório que detectou o caso e isolou a espécie;
bCepas da coleção do LAPERE ;
cBGNNF – Bacilo Gram-negativo não fermentador .
78
Distribuição geográfica dos casos de melioidose no Ceará
O Estado do Ceará possui uma área de 148.825,6 km², o que equivale a 9,57% da área
pertencente à região Nordeste e 1,74% do Brasil e é composto atualmente por 184 municípios
(IPECE, 2010). A figura 15 apresenta o mapa do Ceará com destaque para os municípios
afetados pela melioidose que foram agrupados pela proximidade em três macroregiões: (1)
Granja / Ubajara, (2) Tejuçuoca / Itapajé e (3) Pacoti / Aracoiaba / Ocara / Banabuiú.
Figura 15. Mapa da distribuição geográfica dos casos de melioidose no Estado no Ceará
Pesquisa geoclimática da ocorrência de melioidose no Ceará
A ocorrência de melioidose no Ceará está compreendida geograficamente numa faixa
do território formada pelas regiões noroeste, norte e nordeste do Estado, próximo ao litoral.
Estas regiões possuem características geográficas diferentes das outras regiões do Ceará.
79
Quanto ao solo, o neossolo é o tipo de maior ocorrência no Estado, embora, nesta faixa
do mapa onde estão os municípios afetados pela melioidose, o tipo predominante seja o
argissolo (Figura 16).
Figura 16. Mapa temático representativo dos tipos de solos dos municípios do Estado do Ceará. Fonte: IPECE,
2007.
Os neossolos são solos minerais não hidromórficos, pouco desenvolvidos em geral,
originados de depósitos arenosos, apresentando textura de areia, ou areia franca, ao longo de
pelo menos 2m de profundidade. Os argissolos são agrupamentos de solos minerais, não
hidromórficos, com argila de atividade baixa a alta, conjugados ao caráter alumínico e/ou à
saturação por bases abaixo de 50%. Os luvissolos, por sua vez, são solos com argila de
atividade alta, praticamente neutros, hipereutróficos, com alta atividade de argila e alta
saturação por bases (IPECE, 2007; EMBRAPA, 2006).
Em relação às precipitações pluviométricas, segundo o IPECE (IPECE, 2010b), as
regiões de Granja, Ubajara, Pacoti, Aracoiaba e Ocara apresentaram, até 2009, uma taxa anual
de mais de 1.300 mm (Figura 17).
80
Figura 17. Mapa temático da representação de precipitações pluviométricas (média anual em mm) dos
municípios do Estado do Ceará. Fonte: IPECE, 2007.
Os municipios de Tejuçuoca e Itapajé exibiram, no entanto, taxas menores do que
1.000 mm (IPECE, 2010b). Ubajara teve o seu maior índice de precipitação desde 2007,
chegando a ultrapassar a marca de 2.400 mm, em 2009. O Município de Tejuçuoca teve um
aumento de chuvas no primeiro quadrimestre, assim como o Município de Itapajé, que
apresentou nesse ano 1.243 mm, o seu maior índice de precipitação nesta década.
Em termos de relevo, as regiões dos municípios afetados por melioidose demarcadas
na Figura 18 apresentam níveis de baixa a média altitudes, numa faixa de 500 a 1.000 m
(IPECE, 2007).
81
Figura 18. Mapa representativo do Modelo Digital do Relevo do Estado do Ceará, com escala em cores da
altitude em metros. Fonte: IPECE, 2007.
Ressalte-se neste passo que os pontos de maior altitude no Estado estão nestas regiões,
precisamente em Ubajara, que faz parte da serra da Ibiapaba. Ubajara e Pacoti apresentam
uma altitude de 1.356m e 1.232m respectivamente, enquanto as demais regiões acometidas
por melioidose exibem uma altitudeabaixo de 1.000m.
O clima predominante no Estado é o tropical quente semiárido, ocorrendo em uma
extensão de 101.001 km², ou seja, aproximadamente 68% da área total do Estado. O mapa da
Figura 19 mostra a região mais ao norte e nordeste do Estado, onde estão representadas as
áreas afetadas por melioidose.
82
Figura 19. Mapa temático representativo dos tipos climáticos predominantes no Estado do Ceará. Fonte: IPECE,
2007.
Nestas regiões, predomina o clima tropical semiárido brando e tropical quente
subúmido, enquanto no resto do Estado encontra-se com maior frequencia o tropical quente
semi-árido. Ubajara e Granja, que estão próximas, apresentam clima tropical semiárido
brando e tropical quente subúmido. Em Tejuçuoca, Itapajé, Ocara, Aracoiaba e Banabuiú, o
que predomina é o clima tropical quente semiárido. Pacoti exibe um clima tropical sub-quente
úmido.
O clima tropical quente semiárido ocorre em 98 municípios cearenses em sua
totalidade, mas, em virtude das vicissitudes climáticas e pelas áreas de influência, o Estado do
Ceará possui 150 municípios inseridos no contexto do clima tropical semiárido brasileiro
(IPECE, 2007).
A pesquisa ao IPECE resultou nos dados sumariados na tabela 8, que relaciona as
características geoclimáticas das regiões cearenses onde surgiram os casos de melioidose nos
últimos oito anos.
Na Tabela 9, está sumariado todo o resultado da busca de dados geoclimáticos dos
municípios do Estado do Ceará onde ocorreu melioidose nos últimos oito anos.
83
Tabela 9. Tipos de solo, clima, precipitações pluviométricas, e altitudes dos municípios afetados pela melioidose no Ceará no period de 2003 a 2011.
Municípios (casos) Tipo de solo Clima Taxa annual
pluviométrica (mm) Altitude
Tejuçuoca (Casos 1,2,3 e 4) Bruno não Cálcico, Solos Litólicos,
Planossolo Solódico, Podzólico Vermelho-Amarelo Tropical Quente Semiárido 659 140,32
Banabuiú (Caso 5) Solos Aluviais, Solos Litólicos,
Planossolo Solódico, Podzólico Vermelho-Amarelo e Cambissolo Tropical Quente Semiárido 815 100,0
Aracoiaba (Caso 7) Areias Quartzosas Distróficas, Podzólico Vermelho-Amarelo,
Solos Aluviais, Solos Litólicos e Planossolo Solódico
Tropical Quente Semiárido,
Tropical Quente Semiárido Brando,
Tropical Quente Subúmido
1.010 107,1
Ubajara (Caso 8 e 11) Areias Quartzosas Distróficas, Solos Litólicos, Latossolo Vermelho-
Amarelo e Podzólico Vermelho-Amarelo Tropical Quente Subúmido 1.483 847,5
Granja (Caso 9) Areias Qurtzosas Distróficas, Solos Litólicos, Planossolo Solódico,
Podzólico Vermelho-Amarelo,
Tropical Quente Semiárido
Brando, Tropical Quente Subúmido 1.040 10,75
Itapajé (Caso 10) Bruno não Cálcico, Solos Litólicos, Planossolo Solódico e Podzólico
Vermelho-Amarelo Tropical Quente Semiárido 800 262,2
Pacoti (Caso 12) Podzólico Vermelho-Amarelo Tropical Subquente Úmido e
Tropical Quente Úmido 1558 736,1
Ocara (Caso 13) Areias Quartzosas Distróficas, Planossolo Solódico,
Podzólico Vermelho-Amarelo Tropical Quente Semiárido 959 170,2
Fonte:IPECE, 2007; EMBRAPA, 2006
84
14 DISCUSSÃO
Neste experimento, a determinação da capacidade de assimilar arabinose nas cepas da
nossa amostra apresentou um resultado consoante com trabalhos relatados na literatura.
Segundo os estudos em modelo murino de Smith et al., a propriedade de B. pseudomallei de
assimilar L-arabinose é uma característica fenotípica associada à virulência (1997). Estes
autores evidenciaram que as cepas L-arabinose negativas (Ara -) mostraram-se mais
virulentas, com dose letal mínima do inóculo de 182, enquanto que, para as cepas L-
arabinose positivas (Ara +), consideradas avirulentas, a dose letal foi 109. Mostraram ainda
que não havia diferença entre as cepas de B. pseudomallei Ara - isoladas do ambiente e
aquelas isoladas de espécimes clínicos. Segundo os autores, existem dois ribotipos diferentes
associados à capacidade de assimilar L-arabinose. Todas as cepas clínicas e algumas do solo
pertenciam ao mesmo ribotipo, eram Ara (-) e virulentas. O outro ribotipo foi isolado apenas
do solo, foi Ara (+) e mostrou-se avirulento.
Vale ressaltar o relato de Brett et al. (1998) sobre seus estudos na Thailândia, no qual
o segundo ribotipo L-arabinose positiva foi isolado apenas do solo, e foi considerado, após
estudos genéticos, como uma nova espécie do gênero Burkholderia, a espécie B.
thailandensis por ter sido inicialmente isolada no solo daquele país (BRETT et al., 1998).
Assim, as cepas ambientais podem apresentar ambos ribotipos, podendo ou não assimilar L-
arabinose, como demonstrado em um estudo, também na Thailândia, cujo resultado mostrou
que 44,5% das cepas de B. pseudomallei isoladas do solo e testadas pelo teste de assimilação,
apresentaram L-arabinose negativas (SMITH et al., 1987; TRAKULSOMBOON et al.,
1999). As cepas de B. pseudomallei clínicas e ambientais, contempladas neste trabalho, foram
todas classificadas como L-arabinose negativas, evidenciando que não existe B.
thailandensis, L-arabinose positiva, no solo do Município de Tejuçuoca, e que estas cepas
ambientais estão fenotipicamente caracterizadas como virulentas.
Neste ensaio sob-relatório, o gene de virulência, TTSS, estava presente tanto em cepas
clínicas quanto em cepas ambientais de B. pseudomallei, consistente com os resultados de
relatos anteriores (SMITH et al., 2000; ULETT et al. 2001). De forma semelhante,
Winstanley el al. (2000), utilizando a técnica de hibridização por Dot Blot e PCR, estudaram
22 cepas de B. pseudomallei, 14 L-arabinose negativas e oito L-arabinose positiva, e
85
demonstraram que o gene do sistema de secreção tipo 3 (TTSS) estava presente em todas as
cepas Ara (-) (WINSTANLEY et al., 2000).
Estudos têm mostrado, porém, não haver distinção consistente na virulência entre
isolados clínicos e ambientais de B. pseudomallei, além de evidenciarem também o potencial
de uma cepa, em particular, para exibir variações de virulência em diferentes condições de
crescimento (ULETT et al., 2001). Neste estudo, em adição ao achado de caracterização
fenotípica e genotípica de virulência tanto das cepas clínicas quanto das ambientais de B.
pseudomallei, ressaltem-se outras variáveis associadas ao poder patogênico destes agentes.
Consideradas neste estudo como fatores críticos determinantes da gravidade da melioidose,
estas variáveis, evidentes nos casos fatais, foram: a quantidade do inóculo (aspiração de água
contaminada), os fatores de risco do hospedeiro como comorbidades (diabetes, dengue,
anemia falciforme, DPOC) e o tempo entre a infecção e a administração da terapia antibiótica
adequada.
No que concerne à resistência a antimicrobianos, B. pseudomallei é um
microrganismo dotado de mecanismos intrínsecos de resistência a vários antimicrobianos
pertencentes às classes dos betalactâmicos, aminoglicosídeos e lipopeptídeos
(WUTHIEKANUN & PEACOCK, 2006). Esta evidência torna a terapia antimicrobiana na
melioidose um desafio, pois o sucesso terapêutico depende da utilização de antimicrobianos
de amplo espectro de uso reservado que fazem parte da restrita relação dos antimicrobianos
usados como opção terapêutica na melioidose (ESTES et al., 2010). Além disso, a melioidose
é atualmente um problema de saúde publica nas áreas endêmicas, dado que a letalidade
permanece alta na Tailândia (43%), Malásia (44%) e Singapura (16%). Na Austrália, a
letalidade de 30%, dos primeiros cinco anos, reduziu para 9%, nos últimos anos (CURRIE et
al., 2010; LIMMATHUROTSAKUL et al., 2011).
Segundo Keulenaer et al. (2006), a redução nas taxas de letalidade decorre, dentre
outras medidas, da instituição de uma terapia antimicrobiana empírica adequada. Estudos
sobre infecções bacterianas graves mostraram que a terapia empírica precoce e efetiva é
condição preditora de letalidade e está associada à redução desta taxa (KOLLEF, M. H.,
2008). Chan et al. (2005) relataram uma letalidade de 60% nos pacientes com melioidose
septicêmica, enquanto Currie et al. (2010), para o mesmo grupo de pacientes, observaram
50% de letalidade.
86
No Ceará, a ocorrência de melioidose apresentou um perfil diferente do relatado no
sudeste asiático por não terem sido ainda detectados casos com manifestações clínicas leves,
casos crônicos, ou infecções latentes e recorrentes. Na realidade do Estado do Ceará, a
melioidose apresentou-se apenas como formas graves com letalidade global de 69,23%
(9/13) e de 100% (9/9) entre os pacientes que apresentaram melioidose septicêmica.
Acredita-se que o fato de a melioidose no Ceará ter se manifestado apenas na forma aguda e
grave decorre em grande parte, da não proatividade da assistência médica local na busca ativa
de casos. Isso acarreta o aparecimento apenas de casos fatais em circunstâncias curiosas,
como o caso de acidente automobilístico, de lavar roupas agachada no rio ou de andar se
arrastando no solo, situações estas que, por sua repercussão social, chamam a atenção da
classe médica, inclusive da mídia e da população leiga. Estas considerações reforçam a
necessidade da divulgação das informações sobre os dados epidemiológicos regionais da
melioidose, dos fatores de riscos associados, das peculiaridades da transmissibilidade, da
ocorrência e do perfil de sensibilidade do seu agente, B. pseudomallei, como guia da terapia
empírica. Este objetivo foi contemplado no escopo geral deste trabalho, daí a importância do
combate a esta doença de letalidade tão alta.
O resultado da sensibilidade apresentado pelas cepas de B. pseudomallei isoladas no
Ceará ante os cinco antimicrobianos testados mostrou um perfil semelhante ao encontrado na
literatura. Para os antimicrobianos imipenem, doxicilina e sulfametoxazol/trimetoprim, a taxa
de sensibilidade foi de 100%, enquanto para amoxicilina/clavulanato e ceftazidima foi de 80
e 90%, respectivamente. Vale ressaltar que estes dados representam os primeiros relatos de
sensibilidade antimicrobiana de B. pseudomallei a estas cinco drogas antimicrobianas,
avaliados por meio da técnica de microdiluição em caldo, considerada padrão ouro pelo CLSI
(CLSI, 2010).
No cotejo dos resultados da sensibilidade das cepas isoladas no Ceará, com os
resultados do relato de Jenney et al. (2001), observou-se que para os cinco antimicrobianos
testados neste estudo, a sensibilidade esteve acima de 80%, corroborando os resultados deste
ensaio. Estes autores realizaram um estudo prospectivo no Royal Darwin Hospital, na
Austrália, testaram 170 cepas de B. pseudomallei, pela metodologia de diluição em ágar, e
obtiveram uma sensibilidade de 96% a imipenem/meropenem, ceftazidima,
sulfametoxazol/trimetoprim, amoxicilina/clavulanato e doxicilina. A taxa de recorrência de
melioidose nos 167 pacientes que sobreviveram foi de 4%. Durante a terapia com Doxicilina
foi observada aquisição de resistência pelas cepas de B. pseudomallei isoladas em três destes
87
pacientes. Vale ressaltar que foram obtidos aqui 100% de sensibilidade a doxicilina, e que
este antimicrobiano foi utilizado na casuística deste trabalho apenas em um dos sobreviventes
como terapia de manutenção e não se observou nenhum fenômeno de resistência durante o
tratamento.
Na pesquisa sob relação, observou-se que a taxa de sensibilidade de B. pseudomallei
ante sulfatoxasol/trimetoprim (100%) foi discrepante quando comparada à taxa dos autores
relatados a seguir: Thibaut et al. (2004), Paveenkittiporn et al. (2009) e Sam et al. (2010)
também mostraram boa atividade dos antimicrobianos testados contra B. pseudomallei,
semelhante ao observado neste estudo, exceto para sulfametoxazol/trimetoprim. Thibaut et al.
(2004), por meio da técnica de diluição em ágar, relataram taxas de sensibilidade de 100%
para imipenem, doxiciclina e amoxicilina/clavulanato e de 32% para
sulfametoxazol/trimetoprim. Paveenkittiporn et al. (2009) testaram pelo método de disco-
difusão, 4.019 cepas isoladas em 28 hospitais da Tailândia, ao longo de quatro anos, e
obtiveram taxas de sensibilidade de 98,5% para ceftazidima, de 95% para
amoxicilina/clavulanato, de 98,5% para imipenem, de 98% para meropenem e de 53% para
sulfametoxazol/trimetoprim. Sam et al. (2010), no entanto, avaliaram 184 cepas de B.
pseudomallei e mostraram taxas de sensibilidade, obtidas pelo E-test, de 97,3% para
amoxicilina/clavulanato, de 99,5% para ceftazidima, de 100% para imipenem, 95,7% para
Tigeciclina e 97,8% para sulfametoxazol/trimetoprim.
Este achado levou a um maior aprofundamento no estudo desse assunto e viu-se que a
metodologia empregada para avaliação da sensibilidade é um fator de grande importância
para a interpretação dos resultados, principalmente para a combinação
sulfametoxazol/trimetoprim. No seu estudo, Lumbiganon et al. (2000) concluíram que a taxa
encontrada para esta combinação de droga tratava-se de uma falsa resistência em razão das
dificuldades metodológicas enfrentadas, associadas à técnica de determinação da
sensibilidade pelo método de disco-difusão. Similarmente, Piliouras et al. (2002) compararam
o método de disco-difusão aos métodos de diluição em ágar, automação com MicroScan e E-
test, para avaliar a sensibilidade a sulfametoxazol/trimetoprim, obtendo uma taxa de
sensibilidade de 92,5%, 90% e 97,5%, respectivamente, contra 31,3% obtida pela técnica de
disco-difusão. Várias pesquisas subsequentes, que compararam diferentes técnicas de
avaliação da sensibilidade antimicrobiana, também observaram que o método de disco-
difusão culmina em resultados equivocados para a combinação sulfametoxazol/trimetoprim
88
(KARANUKARAN et al., 2007; TAN; TAN, 2008; PAVEENKITTIPORN et al., 2009),
sendo, portanto, inapropriado para testar esta combinação de drogas.
Quanto à origem, independentemente do antimicrobiano avaliado, neste estudo, não
foram observadas diferenças de sensibilidade entre cepas clínicas e ambientais pela
metodologia de microdiluição em caldo Mueller-Hinton, semelhantemente ao observado por
Thibaut et al. (2004), por meio da técnica de diluição em ágar.
Cheng e Currie (2005), em um artigo de revisão, mostraram resultados de
sensibilidade de vários autores ao revelarem que os carbapenêmicos (imipenem e
meropenem) e a ceftazidima eram as drogas com melhores taxas de sensibilidade. No genoma
de B. pseudomallei, sete genes codificam betalactamases de classes A, B e D da classificação
de Amber (HOLDEN et al., 2004). Em termos de funcionalidade, a mais importante destas
betalactamases é a da classe A, penA, codificada pelo gene blaA, que hidrolisa a maioria das
cefalosporinas, mas é inibida pelo clavulanato (CHEUNG et al., 2004). Resistência adquirida
aos betalactâmicos, durante o tratamento com betalactamico/inibidor de betalactamase ou
ceftazidima, resulta da depressão da enzima cromossomial, da insensibilidade à inibição do
inibidor de betalactamase ou da produção de uma betalactamase específica para ceftazidima
(GOLFREY et al., 1991). Provavelmente as cepas deste experimento com sensibilidade
diminuída a amoxicilina/clavulanato e ceftazidima (cepas CEMM 03-06-042 e CEMM 03-
06-043) que apresenta este fenótipo, sejam portadoras do gene que codifica essas enzimas o
que suscita estudos posteriores de caracterização molecular destas cepas, uma vez que são
cepas ambientais isoladas do Município de Tejuçuoca. A superexpressão de betalactamase D,
OXA-42 e OXA-43, pode também ser responsável pela resistência a ceftazidima em alguns
isolados (NIUMSUP et al., 2002). As cepas clínicas que apresentaram sensibilidade
diminuída apenas a amoxicilina/clavulanato (CEMM 03-06-034 e CEMM 03-06-038), com
CIM elevadas, possivelmente tenham um mecanismo de resistência associado à mutação no
gene blaA, como evidenciado por Tribuddharat et al. (2003).
Sabe-se que para o tratamento de melioidose o arsenal terapêutico é restrito e,
portanto é importante testar e validar drogas alternativas. Existem relatos sobre a expressão
de bombas de efluxo comum em B. pseudomallei e estas são responsáveis pela resistência
intrínseca e adquirida a aminoglicosídeos e macrolídeos (SCHWEIZER et al., 2008). Mima et
al. (2011) testaram por meio da técnica de microdiluição em caldo, a cetromicina, um novo
macrolídeos (subclasse ketolídeo), que mostrou eficácia contra B. pseudomallei, com uma
89
faixa de MIC de 4 a 64 µg/mL. Segundo o autor, a resistência aos ketolídeos se dá pela
superexpressão da bomba de efluxo AmrAB-OprA.
A esse respeito, utilizou-se o valor da CIM do equipamento VITEK para conhecer os
valores da CIM das demais drogas e principalmente da tigeciclina. Esta droga é uma
subclasse das tetraciclinas com ação eficaz ante algumas bactérias Gram-negativas e Gram-
positivas indicada especialmente para infecções intraabddominais e partes moles. Para isso
decidiu-se utilizar os pontos de corte do grupo das Enterobactriaceae, uma vez que o FDA
ainda não padronizou para o VITEK2 os pontos de corte para B. pseudomallei. Por este
motivo, a relação de CIM para esta metodologia não apresenta a classificação categórica de
R, S, e I, para, respectivamente, sensível, intermediário e resistente. Para Tigeciclina, as
cepas clínicas mostraram valores de CIM variando de 2 a 4, o que, na interpretação para
Enterobactriaceae, seriam de intermediário a resistente. Já as cepas ambientais apresentaram
50% de sensibilidade.
Empregou-se a técnica de RAPD neste estudo, com o objetivo de agrupar as cepas da
amostra e associar os clusters encontrados aos dados demográficos dos pacientes, dados
geoclimáticos das regiões afetadas e aspectos clínicos dos casos. A técnica de RAPD é
amplamente aplicável para a genotipagem de microrganismos, principalmente por não
requerer o conhecimento prévio de sequências nucleotídicas específicas das cepas analisadas
(ANTONOV et al., 2007).
O primer OPQ-16 foi escolhido para a construção do dendograma, por ensejar maior
número de bandas, sendo, portanto, mais discriminatório. Esses achados corroboram aqueles
de Leelayuwat et al. (2000) que, após a análise de vários primers para genotipagem de B.
pseudomallei, observaram que os padrões RAPD obtidos por meio da utilização do OPQ-16
eram reprodutíveis.
Foi possível observar que as cepas ambientais, isoladas de Tejuçuoca, estavam
distribuídas em um só cluster, sempre agrupadas com cepas clínicas do mesmo município,
além de uma cepa clínica do Município de Ocara, a 175 km de Tejuçuoca. Como observado
em Haase et al. (1995) e Chen et al. (2010), estes achados evidenciaram a relação
epidemiológica entre cepas clínicas e ambientais.
Quanto às cepas clínicas, seis foram isoladas de casos fatais de melioidose, das quais
quatro foram agrupadas no cluster II e duas no cluster I. Apesar do agrupamento destas duas
90
cepas de B. pseudomallei de casos de óbitos no cluster I, acredita-se que estes óbitos estavam
associados a características inerentes ao hospedeiro e às condições da assistência médica
local. Estes dois pacientes eram crianças subnutridas e representaram os primeiros casos de
melioidose no Estado, não havendo ainda suspeitas diagnósticas, nem consciência da
gravidade associada à doença. Adicionalmente, estas crianças apresentaram lesões cutâneas
que, segundo alguns autores é a forma clínica que exibe menor letalidade
(LEELARASAMEE, A., 2004; CHENG; CURRIE, 2005). Acredita-se, porém, que o cluster
II seja formado por cepas mais relacionadas à gravidade e, possivelmente, apresentem mais
atributos de virulência, uma vez que acometeram pacientes com manifestações clínicas de
natureza grave (pneumonia fulminante) alguns imunocompetentes.
Leelayuwat et al. (2000) observaram associação significativa de determinados padrões
RAPD de cepas de B. pseudomallei à ocorrência de melioidose septicêmica, sem estar
associados à letalidade. Neste ensaio, no entanto, foi observada a associação de determinados
padrões RAPD à forma septicêmica de melioidose, como nos casos agrupados no cluster II,
os quais evoluíram para o óbito.
Considerando a catalogação dos 13 casos de melioidose no Ceará, observou-se que
nove eventos ocorreram no primeiro quadrimestre do ano, período chuvoso no Estado do
Ceará. Nove casos foram relacionados à exposição direta ao solo, água de rio, lago e
cachoeira, e quatro não tiveram sua exposição esclarecida. Onze ocorreram em pacientes do
sexo masculino e apenas dois no sexo feminino. A idade dos pacientes variou dos dez aos 70
anos. Para cinco dos 13 pacientes, desconhecia-se o relato de comorbidades e, para os nove
casos restantes, as comorbidades foram: diabetes (três), traumatismo cranioencefálico (um),
doença pulmonar obstrutiva crônica – DPOC (um), aneurisma da aorta (um), anemia
falciforme (um) e dengue hemorrágico (um caso). Nos relatos dos cinco primeiros, não havia
informações sobre a terapia antimicrobiana e, dos oito restantes, seis fizeram uso de
carbapenêmicos, imipenem ou meropenem, como terapia antimicrobiana empírica.
Após a análise das características geoclimáticas dos municípios acometidos pela
melioidose, observou-se que a doença, no Ceará, se manifestou numa área geográfica com
algumas semelhanças entre as áreas encontradas em outros países onde essa doença foi
relatada, como o clima (DANCE, 2000a), o tipo de solo (INGLIS, 2001; ROBERTSON et al.,
2010), a altitude (DANCE, 2000a, RATTANAVONG et al., 2011) e a relação com estações
das chuvas (INGLIS, 2001; LIMMATHROTSAKUL et al., 2011).
91
15 CONCLUSÃO
Este trabalho catalogou todos casos de melioidose ocorridos no Ceará no últimos oito
anos e mostrou uma realidade no cenário da ocorrência de melioidose no Estado. No tocante
à identificação pelo VITEK2 e por sequenciamento, a concordância de resultados entre os
dois métodos foi de 100% denotando um bom desempenho de análise do VITEK2 comparada
ao sequenciamento.
O teste de assimilação de arabinose, cujo resultado foi negativo para todas as cepas,
indica que as cepas foram identificadas como B. pseudomallei e que não existe B.
thailandensis na amostra deste experimento. Mostrou ainda uma associação entre cepas
ambientais e clínicas, além de sugerir que todas as cepas são caracterizadas fenotipicamente
como virulentas, o que também foi evidenciado pela detecção do gene TTSS.
O perfil de sensibilidade das cepas isoladas do Ceará evidenciou um perfil compatível
com os resultados relatados na literatura para cepas da Austrália e da Tailândia, indicando,
inclusive, que não apenas imipenem, que é a droga de escolha para os casos graves, mas a
ceftazidima, também mostrou uma boa sensibilidade, dado este relevante, uma vez que esta
droga é economicamente mais acessível para os centros assistenciais de saúde no interior do
Estado. Uma vez, porém, que a forma grave da infecção foi a mais frequente no Ceará, o
imipenem, com 100%, continua sendo a droga de escolha nessas situações. Foi importante
também detectar uma boa sensibilidade à amoxicilina/clavulanato e
sufametoxazol/trimetoprim, porque essas drogas são relevantes para o tratamento dos casos
mais brandos. Estes resultados da determinação do perfil de sensibilidade dessas drogas será
de grande utilidade para direcionar a terapia empírica nos futuros casos.
A genotipagem por RAPD mostrou estreita relação entre as cepas clínicas e
ambientais do Município de Tejuçuoca, o que leva a uma necessidade de pesquisar outros
reservatórios desta espécie nos municípios, para que as questões ecológicas possam ser
levadas em consideração no estabelecimento de medidas preventivas na contextura estadual.
Os achados clínico-epidemiológicos dos casos de melioidose do Ceará e as condições
geoclimáticas dos municípios acometidos pela doença são semelhantes àqueles descritos para
os casos e para Austrália e Tailândia.
92
Finalmente, além do valor epidemiológico agregado a estes resultados, anteriormente
citados, existe a possibilidade deste trabalho divulgar a importância da Melioidose no Ceará,
contribuindo para a conscientização da classe médica quanto à inclusão desta enfermidade nas suas
hipóteses diagnósticas e à orientação para uma terapia empírica adequada, consequentemente,
contribuindo para a melhoria da assistência médica nesta doença grave, de fácil transmissão e
difícil preveção.
93
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114
ANEXOS
115
ANEXO I
RELAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURAS
1. Ágar-Ashdown
Material:
i. 475ml água destilada
ii. 7.5g agar bacteriológico
iii. 5g TSB (Tryptone Soy Broth)
iv. 20ml glicerol aquecido
v. 2.5ml cristal violeta a 0.1%
vi. 2.5ml vermelho neutro a 1.0%
vii. 100µg/mL de solução de gentamicina recém preparada
viii. Recipiente de vidro capacidade 1L
ix. Placas de Petri
Preparo:
1. Misture os ingredientes (i) ao (vi) no recipiente de vidro capacidade 1L.
2. Aqueça para dissolver e dispense em 19 mL em tubos de ensaios de tampa de
rosca com a tampa levemente apertada.
3. Autoclave a 1200C por 15 minutos. Quando esfriar aperte bem a tampa e
conserve a +4°C.
4. No momento do uso afrouxe a tampa e aqueça em banho-maria para dissolver.
5. Após dissolvido esfrie à uma temperatura de 56°C e adicione 1ml 100µg/ml de
gentamicin. Misture cuidadosamente e dispense na placa de
6. Rotule a placa e mantenha-a a +4°C por não mais que uma semana.
2. Burkholderia pseudomallei Ágar – BPSA
i. Triptona 15.0 g/L
ii. Ágar 12.0 g/L
iii. Glicerol 40.0 ml/L
iv. Vermelho Neutro 0.005 g/L
v. Cristal Violeta 0.0025 g/L
vi. Gentamicina 0.004 g/L
3. ChromID CPS
4. Ágar-sangue com 5% de sangue desfibrinado de carneiro
5. Ágar-MacConkey
116
ANEXO II
INFORMAÇÕES NECESSÁRIAS PARA OS TESTES DE SENSIBILIDADE
DESCRIÇÃO E PREPARO DO INÓCULO PARA O TESTE VITEK2
As técnicas de identificação e sensibilidade pela metodologia VITEK2® utiliza
cartões fabricados com cristal de poliestireno de alto impacto, com 3% de borracha butílica e
dióxido de titânio (agente clareador). Alguns destes cartões são permeáveis ao oxigênio para
atender as exigências nutricionais e garantir o crescimento adequado de determinados
microrganismos (PINCUS, D. H., 2006).
A identificação bacteriana no sistema VITEK2® baseia-se em reações bioquímicas
com substratos desenvolvidos e selecionados para permitir a identificação de uma grande
faixa de microrganismos com base nas suas características bioquímicas. O sistema VITEK2®
tem armazenado no seu banco de dados informações sobre o comportamento bioquímico da
maioria dos microrganismos patógenos humanos, permitindo a formação de perfis
bioquímicos específicos utilizados para se estimar as reações típicas das espécies testadas.
Como parte do processo de identificação, o software compara o conjunto de reações
do teste com o conjunto de reações esperadas para cada microrganismo, ou grupo de
microrganismos disponíveis no banco de dados do equipamento. Caso não seja reconhecido
um padrão único de identificação, é fornecida uma lista de possíveis microrganismos
identificados ou a cepa-teste é determinada como fora da capacidade de resolução de
identificação.
1. Identificação
Preparo do Inóculo
Nota: Prepare o inóculo a partir de uma cultura pura, de acordo com as boas práticas
laboratoriais. Em caso de culturas mistas, é necessária uma etapa de reisolamento.
Recomenda-se que seja realizado um teste de pureza em placa para se certificar que foi usada
uma cultura pura no teste.
117
1) Seleccione colónias isoladas de uma placa primária caso os requisitos de cultura tenham
sido satisfeitos (Ágar-sangue) ou faça uma subcultura do microrganismo a ser testado em
meio gelosado apropriado e incube adequadamente.
2) Transfira assepticamente 3,0 mL de solução salina estéril (NaCl aquoso de 0,45% a 0,50%,
pH 4,5 a 7,0) para um tubo de ensaio de plástico (poliestireno) transparente (12 mm x 75
mm).
3) Utilize alça descartável estéril para transferir um número suficiente de colónias
morfologicamente idênticas para o tubo com solução salina preparado na Etapa 2. Prepare
uma suspensão de microrganismo homogénea com uma densidade equivalente a um padrão
McFarland N. 0,50 a 0,63 usando o calibrador do DensiCHEK™ VITEK® 2.
Nota: O tempo de espera da suspensão não deve exceder os 30 minutos antes da inoculação
da carta.
4) Coloque o tubo da suspensão e a carta GN na cassete.
5) Consulte o Manual do Utilizador do Aparelho apropriado para obter instruções sobre a
introdução de dados e sobre a introdução da cassete no aparelho.
2. Teste de sensibilidade
a. Utilizando uma alça descartável estéril, seleccione colónias isoladas de uma placa
primária caso os requisitos de cultura tenham sido satisfeitos (Ágar-sangue) ou faça
uma subcultura do microrganismo a ser testado em meio gelosado apropriado e incube
adequadamente;
b. transfira assepticamente 3,0 mL de solução salina estéril (NaCl aquoso de 0,45% a
0,50%, pH 4,5 a 7,0) para um tubo de ensaio de plástico (poliestireno) transparente
(12 mm x 75 mm);
c. prepare uma suspensão homogênea do microrganismo com uma densidade da escala
de McFarland 0,5 a 0,63;
Nota: o tempo de espera da suspensão não deve exceder os 30 minutos antes da inoculação da
carta.
d. para um segundo tubo contendo 3 mL desalina estéril, transfira 145µL da suspensão
bacteriana anterior e em seguida coloque o tubo na estante do equipamento com o
118
cartão de aensibilidade para ser inoculado automaticamente no interior do
equipamento.
Nota: consulte o Manual do Utilizador do Aparelho apropriado para obter
instruções sobre a introdução de dados e sobre a introdução da cassete no
aparelho.
Observações
Foram observadas as recomendações para evitar cultura mista na etapa de preparo
do inóculo.
Realizou-se um teste de pureza em placa para se certificar de que foi usada uma
cultura pura para cada teste. Utilizando-se colônias isoladas de uma placa primária preparou-
se um subcultivo dos microrganismos testados em ágar-sangue e incubou-se a 35 oC. Com a
utilização de alça descartável estéril, transferiu-se um número suficiente de colônias
morfologicamente idênticas para um tubo com solução salina. Duas suspensões foram
preparadas, uma para identificação e outra para sensibilidade. Os tubos com as suspensões
bacterianas e os dois cartões (identificação e sensibilidade) foram colocados no cassete e
introduzidos no equipamento para leitura. O equipamento executou automaticamente o
preenchimento do cartão de identificação e sensibilidade na câmara de vácuo. O tempo de
leitura foi em média dez horas.
O cartão de identificação Vite2® GN permite 47 testes bioquímicos e um poço para o
controle negativo. (bioMÉRIEUX, 2007). Caso não seja reconhecido um padrão único de
identificação um valor quantitativo, a percentagem de probabilidade, é calculado,
representando a probabilidade de similaridade entre as reações observadas e as reações típicas
de cada microrganismo. Uma correspondência perfeita entre o padrão de reação do teste e o
padrão de reação característico de um determinado microrganismo ou grupo de
microrganismos fornece uma percentagem de probabilidade de 99%. (PINCUS, D. H., 2006).
Níveis de confiança da identificação pela metodologia VITEK2®
Nível
deconfiança da
identificação
No de microrganismos
prováveis
% de Probabilidade Comentários
Excelente 1 96 a 99
Muito Bom 1 93 a 95
119
Bom 1 89 a 92
Aceitável 1 85 a 88
Baixa
discriminação
2a3 Soma das escolhas = 100.
Após resolução para uma
escolha, a percentagem de
probabilidade reflete o
número associado à escolha
selecionada.
2 a 3 grupos taxonômicos mostram o mesmo
perfil biológico. Separar por testes
suplementares. Necessário descriminar para
haver correspondência com o cartão de
sensibilidade.
Inconclusivo ou
microrganismo
não identificado
> 3 ou 0 (zero)
n/a Não corresponde a nenhum grupo taxonômico
na base de dados. Verificar a coloração de
Gram e a pureza do isolado.
n/a, não se aplica. Fonte: Informação de produtos dos sistemas VITEK2® 2 Systems, bioMérieux, Inc.( bioMÉRIEUX,
2007)
TESTE DE SENSIBILIDADE PELA TÉCNICA DE MICRODILUIÇÃO
Relação dos solventes e diluentes
A Tabela abaixo mostra a relação de solventes e diluentes para as drogas citadas,
segundo o CLSI.
Solventes e diluentes usados na preparação e estocagem das soluções de antimicrobianos (soluções de
estoque contendo 1.000 mg/mL)
Antimic Solvente Diluente Estocagem da
solução a -70oC
Estocagem do pó (proteção
contra luz e umidade)
Fabricante
Amoxicilina/ DMSO Tampão fosfato* 30 dias 4 oC Glaxo SK
Clavulanato Tampão fosfato* Tampão fosfato* 30 dias 4 oC Glaxo SK
Ceftazidima - water - 4 a 25 oC Glaxo SK
Imipenem - water 30 dias 15 a 30 oC MSD
Doxiciclina - water - 2 a 8 oC Pfizer
Sulfametoxazol - water 2 anos 4 a 25 oC Glaxo SK
Trimetoprim - water 2 anos 4 a 25 oC Glaxo SK
*Tampão fosfato; pH 6; 0,1 mol/L; MSD: Merck Sharp Dohme; DMSO : Dimetilsulfóxido
120
ANEXO III
PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE BACTÉRIAS GRAM-
NEGATIVAS
WIZARD
GENOMIC DNA PURIFICATION KIT (Promega, Estados Unidos).
PROCEDIMENTO:
1- Adicionar 1.8 mL da cultura bacteriana (com crescimento overnight em caldo BHI) em
microtubo de 1.5 mL;
2- Centrifugar de 13.000-16.000 x g por 2 minutos. Remover o sobrenadante;
3- Adicionar 600 µL de solução de lise nucléica. Pipetar gentilmente até as células serem
resuspendidas;
4- Incubar a 80ºC por 5 minutos para a lise celular, e então deixar esfriar a temperatura
ambiente;
5- Adicionar 4 µL de solução Rnase e inverter o tubo de 2 a 5 vezes para misturar;
6- Incubar a 37ºC de 15 a 60 minutos. Deixar esfriar a temperatura ambiente;
7- Adicionar 200 µL de solução de precipitação de proteínas para as células lisadas tratadas
com a Rnase. Agitar vigorosamente no vórtex em velocidade máxima por 20 segundos;
8- Incubar a amostra no gelo por 5 minutos;
9- Centrifugar de 13.000-16.000 x g por 3 minutos;
10- Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um microtubo de 1.5 mL limpo contendo
600 µL de isopropanol;
11- Misturar gentilmente por inversão o conteúdo até que uma faixa de DNA forme uma
massa visível;
12- Centrifugar de 13.000-16.000 x g por 2 minutos;
13- Cuidado ao desprezar o sobrenadante e secar o tubo com papel absorvente limpo.
Adicionar 600 µL de etanol (70%) e inverter o tubo muitas vezes para lavar o pellet de
DNA;
14- Centrifugar de 13.000-16.000 x g por 2 minutos. Aspirar o etanol com cuidado e
desprezar;
15- Seque o tubo com papel absorvente limpo e deixe o pellet ao ar seco de 10 a 15 minutos;
16- Adicionar 100 µL de solução de rehidratação de DNA e rehidrate o material por
incubação a 65ºC por 60 minutos. Feito isso, rehidrate o DNA por incubação da solução
de rehidratação em overnight a temperatura ambiente ou a 4°C;
17- Estoque o DNA de 2 a 8ºC.
121
ANEXO IV
PROTOCOLO PARA PURIFICAÇÃO DE DNA (PRODUTOS DE PCR)
KIT GFXTM
PCR DNA AND GEL BAND PURIFICATION (GE Healthcare, USA)
PROCEDIMENTO:
1- Transferir toda a amostra de reação de PCR para um microtubo de 2 mL e adicionar 500
µL de tampão de captura tipo 2, misturando bem;
2- Transferir todo o volume para um microtubo contendo a coluna do filtro e dar spin de 30
segundos na centrifuga;
3- Descartar volume do microtubo e recolocar a coluna com o filtro no mesmo;
4- Adicionar 500 µL de tampão de lavagem tipo 1 na coluna e dar spin de 30 segundos;
5- Transferir coluna com filtro para um novo microtubo limpo;
6- Adicionar 50 µL de tampão de eluição e dar spin por 1 minuto;
7- Descartar filtro;
8- Estocar a -20ºC.
122
ANEXO V
PROTOCOLO PARA PRECIPITAÇÃO DE DNA EM PLACA DE
SEQUENCIAMENTO
PROCEDIMENTO:
1- Com o auxílio de pipeta multicanal, adicionar 20 µL de isopropanol 80% em cada poço
da placa de sequenciamento;
2- Agitar vigorosamente por 20 segundos em vórtex para placa;
3- Centrifugar placa por 50 minutos a 4ºC (4000 rpm);
4- Descartar isopropanol e dar spin invertido de 5 segundos na centrífuga;
5- Adicionar 45 µL de etanol 75% em todos os poços;
6- Centrifugar por 10 minutos a 20ºC (4000 rpm);
7- Descartar etanol e dar spin invertido de 5 segundos;
8- Deixar secar até que todo o álcool evapore (em torno de 15 minutos);
9- Adicionar 10 µL de loading solution (faz parte do kit se sequenciamento) em todos os
poços da placa;
10- Adicionar 10 µL de agarose a 0.12% e agitar vigorosamente em vórtex por 20 segundos;
Estocar a -20ºC.
123
ANEXO VI
Tabela que relaciona o registro das cepas nos arquivos da coleção do CEMM (coluna 1) e
a denominação preliminar de rotina no momento de recebimento das cepas (coluna 2).
Concentração inibitória mínima - CIM de cepas clínicas e ambientais de B. pseudomallei isoladas no Ceará
determinadas pela metodologia de microdiluição em caldo Müeller-Hinton.
Cepas Doxiciclina
(µg\mL)
Amoxicilina
/Clavulanato
(µg\mL)
Sulfametoxazol
/Trimetoprim
(µg\mL)
Ceftazidima
(µg\mL)
Imipenem
(µg\mL)
CIM Cat CIM Cat CIM Cat CIM Cat CIM Cat
03-6-033 Bp1 0,5 S 8\4 S 0,25\4,75 S 8 S 0,25 S
03-6-034 Bp2 0,25 S 32\16 R 2\38 S 8 S 0,5 S
03-6-035 Bp3 0,25 S 8\4 S 1\19 S 8 S 0,5 S
03-6-036 Bp4 0,25 S 8\4 S 1\19 S 4 S 0,5 S
03-6-037 Bp5 0,5 S 8\4 S 0,5\9,5 S 4 S 0,5 S
03-6-038 Bp6 0,25 S 16\8 I 0,5\9,5 S 4 S 1 S
05-03-008 Bp9 0,25 S 8\4 S 1\19 S 4 S 0,25 S
05-03-009 Bp10 0,25 S 4\2 S 1\19 S 2 S 0,5 S
05-03-010 Bp11 0,25 S 16\8 S 0,25\4,75 S 8 S 0,5 S
05-03-011 Bp12 0,25 S 16\8 S 0,5\9,5 S 8 S 0,125 S
03-6-039 1331 0,25 S 8\4 S 0,5\9,5 S 16 I 0,25 S
03-6-040 1333 0,25 S 8\4 S 0,25\4,75 S 4 S 0,5 S
03-6-041 1334 0,25 S 8\4 S 2\38 S 4 S 1 S
03-6-042 1336-AL 0,25 S 16\8 I 2\38 S 8 S 1 S
03-6-043 1336-R 0,25 S 16/8 I 2\38 S 8 S 0,25 S
03-6-044 1338 0,25 S 4\2 S 0,125\2,375 S 2 S 0,5 S
03-6-045 1345 0,5 S 8\4 S 0,25\4,75 S 4 S 1 S
03-6-046 1346-L 0,25 S 8\4 S 0,25\4,75 S 8 S 1 S
03-6-047 1346R 0,25 S 8\4 S 0,25\0,475 S 8 S 0,5 S
03-6-048 1347 0,5 S 8\4 S 0,25\4,75 S 4 S 1 S
CIM: concentração inibitória mínima; cat: categorização segundo o ponto de corte de sensibilidade do CLSI
(CLSI, 2010)
124
ANEXO VII
Resultado do gel de eletroforese dos produtos da PCR-RAPD com o primer OPQ-4 realizado
com 10 cepas ambientais e 8 cepas clínicas.
125
ANEXO VIII
Resultado do gel de eletroforese dos produtos da PCR-RAPD com o primer OPQ-2
realizado com 10 cepas ambientais e 8 cepas clínicas.
126
ANEXO IX
Declaração de Correção Linguítica e gramatical
127
ANEXO X
NATURE PUBLISHING GROUP LICENSE TERMS AND CONDITIONS
Apr 19, 2011
This is a License Agreement between Tereza J P Bandeira ("You") and
Nature Publishing Group ("Nature Publishing Group") provided by
Copyright Clearance Center ("CCC"). The license consists of your order
details, the terms and conditions provided by Nature Publishing Group,
and the payment terms and conditions.
License Number 2652410629783
License date Apr 19, 2011
Licensed content publisher
Nature Publishing Group
Licensed content publication
Nature Reviews Microbiology
Licensed content title Melioidosis: insights into the
pathogenicity of Burkholderia pseudomallei
Licensed content author W. Joost Wiersinga, Tom van der Poll,
Nicholas J. White, Nicholas P. Day and Sharon J. Peacock
Licensed content date Apr 1, 2006
Volume number 4
Issue number 4
Type of Use reuse in a thesis/dissertation
Requestor type academic/educational
Format electronic
Portion figures/tables/illustrations
Number of figures/tables/illustrations
5
High-res required no
Figures Figure 5 | Host–pathogen interactions in Burkholderia pseudomallei infection:
bacterial virulence meets innate immunity
128
ANEXO XI
NATURE PUBLISHING GROUP LICENSE
TERMS AND CONDITIONS
Apr 19, 2011
This is a License Agreement between Tereza J P Bandeira ("You") and
Nature Publishing Group ("Nature Publishing Group") provided by
Copyright Clearance Center ("CCC"). The license consists of your order
details, the terms and conditions provided by Nature Publishing Group,
and the payment terms and conditions.
All payments must be made in full to CCC. For payment instructions, please see information listed at the bottom of this form.
License Number 2652410041329
License date Apr 19, 2011
Licensed content publisher
Nature Publishing Group
Licensed content publication
Nature Reviews Microbiology
Licensed content title Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei
Licensed content author W. Joost Wiersinga, Tom van der Poll, Nicholas J. White, Nicholas P. Day and Sharon J. Peacock
Licensed content date Apr 1, 2006
Volume number 4
Issue number 4
Type of Use reuse in a thesis/dissertation
Requestor type academic/educational
Format electronic
Figures Figure 4 | The intracellular lifestyle of Burkholderia pseudomallei
129
ANEXO XII
METODOLOGIA – Fluxograma de atividade
130
PUBLICAÇÕES
131
Journal of Clinical Microbiology – Original Article
Clinical features and epidemiological data of thirteen cases of melioidosis: Eight years
of surveillance in the state of Ceará, Northeastern Brazil
Raimunda S. N. Brilhantea,b
, José J. C. Sidrima,b
, Tereza J. P. G. Bandeira a,b,d
, Rossana A.
Cordeiroa,b
, Rita A. C. Limaa,b
, Joyce F. Ribeiroa,b
, Débora S. C. M. Castelo-Brancoa,b
, Jorge
L. N. Rodriguese, Ivo C. B. Coelho
e, Francisco G. Magalhães
f,
Marcos F. G. Rochaa,b,c
.
a Specialized Medical Mycology Center, Postgraduate Program in Medical Microbiology,
Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil.
b Postgraduate Program in Medical Microbiology, Federal University of Ceará, Fortaleza,
Ceará, Brazil
c Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of Ceará, Fortaleza, Ceará,
Brazil
d LabPauster Laboratory, Fortaleza, Ceará, Brazil,
e Postgraduate Program in Public Health, Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará,
Brazil
f Infectious Disease Physician Assistant, São Mateus Hospital.
Running title: Eight years of melioidosis in Brazil
Corresponding Author: Raimunda S. N. Brilhante. Rua Barão de Canindé, 210; Montese.
CEP: 60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: +55 85 3295-1736. E-mail: [email protected].
132
Abstract
Melioidosis is endemic in Southeastern Asia and hyperendemic in Northern Australia.
In Brazil it has been considered an emerging disease since February 2003, when the first
cases were reported in the state of Ceará. The main goal of this work was to categorize the
clinical and eco-epidemiological features of melioidosis in Ceará from 2003 to 2011, as well
as to evaluate the relationship of the clinical and environmental strains included in this study
with strains from Australia and Thailand. For this purpose, the clinical-epidemiological
characteristics of the cases of melioidosis were catalogued and the isolated strains were
biochemically and genetically characterized. Thirteen cases of melioidosis occurred in Ceará,
during this period. One of them was notified by the Dutch government when a tourist died of
melioidosis after a visit to the state. The others were nine fatal disseminated cases of
melioidosis and three mild forms of the disease in which the patients survived. Nine of these
thirteen cases occurred in the rainy season (from January to May). Clayey soils and a
semiarid tropical climate predominate in the region affected by melioidosis in Ceará. The
phylogenetic analysis of 16S rRNA showed that the Brazilian strains of B. pseudomallei are
evolutionarily clustered with the strains from Australia and Thailand. Finally, the detection of
melioidosis in Northeastern Brazil highlights the extent of its distribution in the Americas and
indicates the need for improved technical skills to diagnose and treat this disease.
Keywords: Burkholderia pseudomallei, melioidosis, Brazil, DNA sequencing, phylogeny
133
Introduction
Melioidosis is a serious disease that afflicts humans and other animals, with a wide
range of clinical forms (27). Most melioidosis cases show a history of recent infection,
although latency with relapse after several years has been reported (3). Melioidosis is
endemic in Southeastern Asia, hyperendemic in tropical Australia and only sporadically
reported in other regions, including tourists returning from endemic zones, particularly during
periods of war or the aftermath of natural catastrophes (5).
Burkholderia pseudomallei, the agent that causes melioidosis, is a gram-negative rod
that naturally inhabits soil and water (7). It was isolated from soil samples for the first time in
1955 in French Indo-China (Vietnam) (15). Since then, the epidemiology of melioidosis, the
ecological conditions for the growth of B. pseudomallei and its relationship with
environmental factors have been studied by various authors (7, 8, 15, 24). These studies have
established that close contact with soil and accumulated water plays an important role in the
ecology of melioidosis. An association has also been noted between melioidosis and the rainy
season, although some outbreaks have occurred in Australia in the dry season as well (6).
Melioidosis in Brazil has been considered an emerging disease since 2003, when the
first cases were reported in the Northeastern region, specifically in the state of Ceará (4, 23).
Therefore, the objective of this work was to catalog the clinical-epidemiological and
ecological characteristics of the cases from Ceará, from 2003 to 2011, as well as to assess the
relation between local Brazilian strains and Australian and Thai strains, through sequencing
and phylogenetic analysis.
134
Materials and Methods
Microorganisms isolated
The 20 strains included in this study (Table 1) were isolated from clinical cases
(n=10) that have been reported in Ceará in the past eight years, which were identified through
molecular tests at the Laboratory of Emerging and Reemerging Pathogens (LAPERE) of
Ceará Federal University (UFC); and from environmental sources from the municipality of
Tejuçuoca, as part of an environmental study conducted in Ceará by Rolim et al.(24).
Cataloging the clinical-epidemiological characteristics of the melioidosis cases
Active search in papers and bibliographical sites
We searched the databases of bibliographical sites such as Medline, PubMed and
Scielo, using keywords like Burkholderia pseudomallei, melioidosis, ecology, environment
and Brazil to investigate the geoclimatic conditions of the regions of the world where
melioidosis is endemic or has sporadically occurred in recent years. We also gathered data
from the Ceará Institute of Research and Economic Strategy (IPECE) (17) on the geoclimatic
conditions of the areas affected by melioidosis in the State, aiming at comparing the obtained
information with geoclimatic features reported in other countries. The studied indicators were
geographic location, elevation (by the digital elevation model – DEM), soil and climate types
and rainfall.
135
Search for new cases
To find new reported cases worldwide, we searched the literature and also the
database and publications (epidemiological bulletins) of the Ceará State Health Secretariat.
We also used the mandatory infectious disease notification services of some public and
private laboratories for this purpose. Finally, a group of infectologists interested in
melioidosis, led by our research group, created an alert program to detect new cases of this
disease.
Biochemical identification
The diagnostic methods utilized by the services that have detected cases are described
in Table 2, with their respective references. To confirm the identification of the clinical and
environmental strains of B. pseudomallei, all 20 strains utilized in this study were first
characterized by gram staining, macromorphology of colonies in selective media (blood agar,
Asdown agar and MacConkey agar) and by the oxidase reaction test. The complete
biochemical identification was performed by testing with the automated VITEK2 system
(bioMérieux, Marcy l’Etoile, France).
Molecular characterization
The molecular identification was carried out with the PCR technique, through
amplification of the specific 16S-23S spacer region of B. pseudomallei, according to Merritt
et al. (12) The reaction was performed in a final volume of 25 µL containing 10 µL of DNA
sample (30 ng/µl), 2.5 µL of buffer (New England Biolabs, UK), 1 mmol/L of MgCl2
(Invitrogen, Carlsbad, USA), 50 pmol of each of the primers Bp1 (5’-
136
CGATGATCGTTGGCGCTT-3’) and Bp4 (5’-CGTTGTGCCGTATTCCAAT-3’), 10
mmol/L of pooled deoxynucleoside triphosphates and 1 U of Taq polymerase (New England
Biolabs, UK). The PCR routine comprised 4 min at 94 ºC, followed by 45 cycles of 30 s at 94
ºC, 30 s at 50 ºC and 45 s at 72 ºC, with a final hold for 7 min at 72 ºC. PCR products were
demonstrated by ethidium bromide gel electrophoresis on 1% agar gel and visualized under
UV light.
16S rRNA genes sequencing: The nearly complete 16S rRNA gene was amplified by
PCR using the primers 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) and 1525R (5’-
AAGGAGGTGATCCAGCC-3’). Amplification reactions were performed in a final volume
of 25 μL containing 200 ng of genomic DNA, 1X Green GoTaq reaction buffer (Promega,
Madison, USA), 1.5 mmol/L of MgCl2, 10 mmol/L of each dNTP (GE Healthcare Life
Sciences, Buckinghamshire, UK), 12.5 pmol of each primer and 1.25 units of GoTaq DNA
Polymerase (Promega, Madison, USA). The cycling parameters were as follows: an initial
denaturation step (2 min at 95 °C) followed by 35 cycles of 1 min at 95 °C, 1 min at 62 °C,
and 1.5 min at 72 °C. After the last cycle, the reactions were further incubated for 5 min at 72
°C. The amplification of DNA bands with the expected size was checked by analyzing a 2-L
aliquot of PCR reactions by 1.0% agarose gel electrophoresis (25), then the PCR products
were purified from the remaining reactions using GFX PCR DNA and the Gel Band
Purification kit (GE Healthcare Life Sciences), according to the manufacturer’s instructions.
The concentration of the purified PCR products was determined by measuring the absorbance
at 260 nm of a ten-fold dilution. DNA sequencing was performed with the DYEnamic ET
terminator cycle sequencing kit (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK). The
16S rRNA fragment was sequenced using the primers 27F, 1525R, 782R (5’-
ACCAGGGTATCTAATCCTGT-3’) and 1100R (5’-AGGGTTGCGCTCGTTG-3’).
Sequencing reactions were then analyzed in a MegaBACE 1000 automatic sequencer (GE
137
Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK). The samples were injected at 3 kV for 50 s
and the runs were performed at 6 kV for 180 min. High-quality, overlapping reads (phred
>20) were used to generate near full-length 16S rRNA gene sequences using the
Phred/Phrap/Consed package (9, 10, 12).
Phylogenetic analysis: The 16S rRNA gene sequences determined were compared to
those already deposited in the GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) using the Basic
Local Alignment Search Tool – BLAST (2). Multiple sequence alignments were produced
and edited using ClustalW (29) and BioEdit (13), respectively. The obtained 16S rRNA gene
sequences were aligned with homologous sequences from selected Burkholderia species as
well as with species of related genera. Only complete 16S rRNA gene sequences were used,
which were taken from the corresponding complete genome sequences of the chosen species.
The species used and the GenBank accession numbers of their genome sequences were as
follows (the chromosome number from which each sequence was obtained is also indicated,
when appropriate): B. pseudomallei strains 1710b (CP000125, II), 668 (CP000571, II),
MSHR346 (CP001408, I), 1106a (CP000573, II), and K96243 (BX571965, I); B. mallei
strains SAVP1 (CP000526, I), ATCC 23344 (CP000011, II), NCTC 10229 (CP000546, I)
and NCTC 10247 (CP000548, I); B. thailandensis E264 (CP000085, II), B. cenocepacia
strains J2315 (AM747721, II), AU 1054 (CP000379, II) and HI2424 (CP000459, II); B.
ambifaria MC40-6 (CP001026, II), B. cepacia AMMD (CP000441, II), B. multivorans
ATCC 17616 (AP009386, II), B. vietnamiensis G4 (CP000615, II), B. phymatum STM815
(CP001044, II), B. phytofirmans PsJN (CP001053, II), B. xenovorans LB400 (CP000271, II),
Bordetella petrii DSM 12804 (AM902716), B. avium 197N (AM167904), B. pertussis
Tohama I (BX470248), B. bronchiseptica RB50 (BX470250), B. parapertussis 12822
(BX470249), Neisseria meningitidis MC58 (AE002098), and Pseudomonas aeruginosa
138
PAO1 (AE004091). The program MEGA4 – Molecular Evolutionary Genetic analysis
version 4.1 (28) was used to perform phylogenetic analyses.
Results
Melioidosis has occurred in municipalities of Ceará that are geographically distributed
along the Northwestern, Northern and Northeastern regions of the state, near the coastline
(Figure 1). Concerning rainfall (Table 2), the municipalities of Pacoti [latitude(S) 4º13'30",
longitude(WGr) 38º55'24"], Ubajara [latitude(S) 3º51'16", longitude(WGr) 40º55'16"],
Granja [latitude(S) 3º07’13’’, longitude(WGr) 40º49’34’’], Aracoiaba [latitude(S) 4º22’16’’,
longitude(WGr) 38º48’51’’], Ocara [latitude(S) 4º29’27’’, longitude(WGr) 38º35’48’’],
Banabuiu [latitude(S) 5°18’35”, longitude(WGr) 38°55’14”] and Itapajé [latitude(S)
3º41'12", longitude(WGr) 39º35'10"] had annual rate (through 2010) greater than or equal to
800 mm, while the municipality of Tejuçuoca [latitude(S) 3º59’20’’, longitude(WGr)
39º34’50’’] had a level of 659 mm (21).
Although the most prevalent soil type in the state is Litholic (Neosol), in the territory
affected by melioidosis the predominant type is Red-Yellow Podzolic (Argisol), followed by
Brown Sandy Loam (Luvisol) (Table 2). The municipalities affected by melioidosis have
varying elevations, with Ubajara, Pacoti and Itapajé being the highest, with respective
altitudes of 847 m, 736 m and 262 m (Figure 1). Additionally, concerning climate, Tejuçuoca
is classified as semi-arid, while the other affected municipalities have mild semi-arid tropical
climate (Table 2).
The search for new cases produced the following result: (i) one report of melioidosis
notified by the Dutch government involving a tourist who died in his home country after
139
having visited Ceará (case 6); (ii) one case reported in the epidemiological bulletin – State
Epidemiological Vigilance List (case 8); (iii) two cases notified by LabPasteur in the state
capital, Fortaleza (cases 10 and 11) and (iv) two cases reported by the group of infectious
disease specialists previously mentioned. These cases plus those previously reported in the
literature (Table 3) make a total of thirteen cases, which were all included in this study.
Among the thirteen melioidosis cases, nine occurred in the first half of the year, which is
the rainy season in Ceará, nine cases were related to direct exposure to soil and water (river,
lake and waterfall), but there was no clarification of exposure in four cases. Eleven of the
patients were men and only two were women. The patients’ ages varied from 10 to 70 years.
Comorbidities were not reported for five of the thirteen patients, while in the other nine cases,
the comorbidities were diabetes (3 cases), cranioencephalic trauma (1 case), chronic
obstructive pulmonary disease – COPD (1 case), aneurysm of the aorta (1 case), sickle cell
anemia (1 case) and hemorrhagic dengue (1 case). In the first five cases reported, there was
no information on antimicrobial therapy, biut for the other eight cases, six were empirically
treated with carbapenemics (imipenem and meropenem).
We confirmed the identification of the 20 clinical and environmental strains of B.
pseudomallei involved in this study by the VITEK2 methodology, with a confidence level up
to 93%, which is defined by the manufacturer as very good. We also used the PCR test, with
the primers Bp1 and Bp2, to confirm identification of B. pseudomallei by the production of a
band of approximately 300 bp in agarose gel.
The sequencing of the 16S region of ribosomal DNA allowed identifying the 20 strains
as B. pseudomallei, with an obtained sequence of approximately 1,400 bp. We also
performed phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequences of some B. pseudomallei
strains. Pairwise comparisons between these 16S rRNA gene sequences with corresponding
140
sequences from different strains of B. pseudomallei (MSHR346, 1106a, K96243, 668 and
1710b), retrieved from the GenBank, revealed sequence identities ranging from 99.7 to
100%. The phylogenetic analysis based on the 16S rRNA sequences supports the close
relationship of the Brazilian isolates to well-characterized B. pseudomallei strains from which
genome sequences have been determined.
Discussion
The soils in the municipalities affected by melioidosis are mainly rich in clay, such as
Argisol (predominant), followed by Luvisol (17), similar to the soils where melioidosis is
endemic (15). Argisols form a group of non-hydromorphic mineral soils with clay having
high or low activity. Finally, Luvisols have high clay activity and high base saturation levels
(17).
As shown in Table 3, these municipalities have annual rainfall above 800 mm (except
Tejuçuoca) (18), which is similar to the precipitation levels in the other zones where
melioidosis is endemic (3). The predominant climate in Ceará is semi-arid tropical, although
the affected regions present a mild semi-arid tropical climate. The endemic world regions for
melioidosis also have tropical or subtropical climates (8).
Regarding altitude, Ceará has hilly regions with elevations above 300 m, rich in
waterfalls and cataracts that are very popular for leisure and tourist outings. However, most
described cases (n=10) occurred in municipalities ranging from 10 to 260 m high. Similarly,
in other endemic countries the altitudes range from140 to191 m (22).
Of the thirteen melioidosis cases, nine arose during the rainy season (January to May),
corroborating previous a work that stated that 75% of the cases have occurred in this period
141
(8). The four cases that occurred in the dry season were probably due to reactivation of latent
infection, since the patients also suffered from acute and/or debilitating comorbidities,
namely sickle cell anemia, ruptured aortic aneurism, diabetes and hemorrhagic dengue.
As new cases of melioidosis have been reported in other countries, an increasing
number of studies have been published on the phylogenetic relationship between the strains
isolated from these places and those previously identified from Southeastern Asia (5, 14).
The phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequences showed that the isolates from
Northeastern Brazil are evolutionarily clustered with B. pseudomallei strains from Australia
(MSHR346 and 668) and Thailand (1106a, K96243 and 1710b). This finding agrees with
previous results that were based on multilocus sequence typing (11) and with those based on
comparative genome sequence analysis (14).
The melioidosis cases in Ceará have occurred in rural areas where diagnostic
microbiology is precarious. The detection of the first outbreak in the state, in the municipality
of Tejuçuoca, was facilitated because it attacked four children of the same family and the
resulting social repercussion was sufficient for the cases to have been referred to health
authorities in the state capital (23). Over the succeeding years, the majority of the diagnosis
of melioidosis was performed through isolation of B. pseudomallei in blood cultures. Despite
the reported cases and confirmation of the presence of B. pseudomallei in soil samples from
the state, clinical suspicion of the disease is still not a routine medical practice. The
limitations of microbiology laboratories have been discussed by several authors (3, 8, 24).
This issue might have a great impact in Ceará state referring underestimating occurrence of
melioidosis. The laboratories, which are generally not prepared for triage or complete
identification of B. pseudomallei from clinical specimens, can be a limiting factor for the
detection of melioidosis in the state.
142
In conclusion, the clinical and epidemiologic features of melioidosis in Ceará are
similar to those regions of the world where this diseases is endemic. This study contributes to
increase knowledge on the importance of melioidosis in Ceará, Brazil, and on its clinical-
epidemiological characterization, allowing inclusion of the state as an endemic zone for the
disease.
Funding
This work was supported by the National Counsel of Technological and Scientific
Development (CNPq, Brazil, Process: 302574/2009-3; PROTAX Process: 562296/2010-7).
Conflicts of Interest
Nothing to declare.
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18 IPECE - Instituto de Pesquisa E Estratégia Econômica do Ceará, Secretaria de
Planejamento e Gestão (SEPLAG) Governo do Estado Do Ceará. (2010) Ceará em
números. http://www2.ipece.ce.gov.br/Ceará_em_numeros/2010/.
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147
Table 1. Clinical and environmental isolates of B. pseudomallei from northeastern Brazil identified by biochemical and molecular methods.
Isolates
(CEMM) Origin/Municipality Source VITEK2† Isolate (confidence level) PCR* Sequencing‡
03-6-033 Clinical/Tejuçuoca Blood B. pseudomallei (98.4%) (+) B. pseudomallei
03-6-034 Clinical/Tejuçuoca Blood B. pseudomallei (94.0%) (+) B. pseudomallei
03-6-035 Clinical/Tejuçuoca Blood B. pseudomallei (94.0%) (+) B. pseudomallei
03-6-036 Clinical/Ubajara Blood B. pseudomallei (99.0%) (+) B. pseudomallei
03-6-037 Clinical/Aracoiaba Blood, bronchoalveolar
lavage B. pseudomallei (95.0%) (+) B. pseudomallei
03-6-038 Clinical/Granja Blood B. pseudomallei (98.0%) (+) B. pseudomallei
05-03-008 Clinical/Itapajé Ganglion tissue B. pseudomallei (93.0%) (+) B. pseudomallei
05-03-009 Clinical/Ubajara Peritoneal fluid B. pseudomallei (99.0%) (+) B. pseudomallei
05-03-010 Clinical/Pacoti Bone marrow B. pseudomallei (99.0%) (+) B. pseudomallei
05-03-011 Clinical/Ocara Blood
B. pseudomallei (97.0%) (+) Not yet
completed
03-06-039 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-040 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-041 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-042 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-043 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-044 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-045 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-046 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-047 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei
03-06-048 Environmental/Tejuçuoca Soil B. pseudomallei (97.0%) (+) B. pseudomallei †Biochemical identification VITEK2 > 93 very good confidence level by the manufacturer’s evaluation; (-) negative reaction; (+) positive reaction; * Specific 16S-23S rRNA intergenic spacer PCR; ‡16S rRNA gene sequencing;
148
Table 2. Soil type, climate, rainfall and altitude in the municipalities affected by melioidosis in Ceará from 2002 to 2010
Municipality (cases) Soil type Climate
Rainfall
Annual rate
(mm)
Altitude
Tejuçuoca (Cases 1,2,3
and 4)
Brown Sandy Loam, Litholic Soils, Solodic Planosol,
Red-Yellow Podzolic Tropical hot semi-arid 659 140.32
Banabuiú (Case 5) Alluvial Soils, Litholic Soils,Solodic Planosol, Red-Yellow Podzolic
Cambissol Tropical hot semi-arid 815 100.0
Aracoiaba (Case 7) Dystrophic Quartzose Sands, Red-Yellow Podzolic,Alluvial Soils, Litholic
Soils Solodic Planosol
Tropical hot semi-arid, tropical hot
mild semi-arid, tropical hot sub-humid 1,010 107.1
Ubajara (Caso 8 e 11) Dystrophic Quartzose Sands, Litholic Soils, Red-Yellow Latosol
Red-Yellow Podzolic Tropical hot sub-humid 1,483 847.5
Granja (Case 9) Dystrophic Quartzose Sands, Litholic Soils, Solodic Planosol,
Red-Yellow Podzolic,
Tropical hot mild semi-arid, tropical
hot sub-humid 1,040 10.75
Itapajé (Case 10) Brown Sandy Loam, Litholic Soils, Solodic Planosol
Red-Yellow Podzolic Tropical hot semi-arid 800
262.2
Pacoti (Case 12) Red-Yellow Podzolic Tropical sub-hot humid and tropical
hot humid 1,558 736.1
Ocara (Case 13) Dystrophic Quartzose Sands,Solodic Planosol,
Red-Yellow Podzolic Tropical hot semi-arid 959 170.2
Sources: IPECE, 200711
149
Table 3. Clinical features and epidemiologic data of thirteen cases of melioidosis in the estate of Ceará, northeastern Brazil from 2003 to 2011
Cases Month
/ Year
Age
(years) Sex Clinical features and type of exposure Treatment
Out-
come
laboratory diagnostic
methodsa
CEMMb
Strains
Origin(IPECE, 2010) Refere
nce
01 Feb/
2003
15 M Fever, cough, headache and pustules on the limbs.
Fulminant sepsis. No comorbidity. Exposure:
swimming in a reservoir
No available data Death Not available data Not
available
Tejuçuoca: latitude(S) 3º 59’
20’’; longitude(WGr) 39º
34’ 50’’
[25, 26]
02 Feb/ 2003
14 F Fever, cough, headache and pustules on the limbs. Fulminant sepsis. No comorbidity. Exposure:
swimming in a reservoir
No available data Death GNNFc Biochemical
identification; confirmed
by PCR
03-06-033 Tejuçuoca: latitude(S) 3º 59’ 20’’; longitude(WGr) 39º
34’ 50’’
[25, 26]
03 Feb/
2003
10 M Fever, cough, headache and pustules on the limbs.
Fulminant sepsis. No comorbidity. Exposure:
swimming in a reservoir
No available data Death GNNFc Biochemical
identification; confirmed
by PCR
03-06-034 Tejuçuoca:latitude(S) 3º 59’
20’’; longitude(WGr) 39º
34’ 50’’
[25, 26]
04 Feb/
2003
12 F Fever, cough, headache and pustules on the limbs. No
comorbidity. Exposure: swimming in a reservoir
No available data Survived GNNFc Biochemical
identification; confirmed
by PCR
03-06-035 Tejuçuoca: latitude(S) 3º 59’
20’’; longitude(WGr) 39º 34’ 50’’
[25, 26]
05 Jan/ 2004
39 M Genital abscess, sepsis. No comorbidity. Exposure: squatting in a river washing clothes
No available data Death Not available data Not available
Banabuiú: latitude(S) 5° 18’ 35” e longitude(WGr) 38°
55’ 14”
[9]
06 July/
2005
50 M Community acquired pneumonia, sepses.
Comorbidity: diabetes. Exposure: swimming in a lake
Cefuroxime,
Erythromycin
gentamicin
Death API 20NE; confirmed by
PCR
Not
available
Not available [27]
07 May/ 2005
30 M Aspiration pneumonia, sepsis. Comorbidity: TCE. Exposure: vehicle accident and immersion in a river
Imipenem Death VITEK1 system, confirmed by PCR
03-06-037 Aracoiaba: latitude(S) 4º 22’ 16’’ e longitude(WGr) 38º
48’ 51’’
[7, 28]
08 April
/2008
17 M Pneumonia, sepses. Comorbidity: COPDd. Exposure:
bathing in waterfalls
Imipenem Death VITEK2 system,
confirmed by PCR
03-06-036 Ubajara:latitude(S) 3º 51'
16", longitude(WGr) 40º 55' 16"
[29]
09 Nov/ 2009
70 M Mycotic aneurysm, sepsis. Exposure: Unknown Cefepime Death VITEK2 system, confirmed by PCR
03-06-038 Granja: latitude(S) 3º 07’ 13’’ e longitude(WGr)
[30]
10 Oct/
2009
50 M Mediastinal adenopathy, fever. Comorbidity:
diabetes. Exposure: Unknown
Meropenem Survived VITEK2 system,
confirmed by PCR
05-03-008 Itapajé: latitude(S) 3º 41' 12",
longitude(WGr) 39º 35' 10"
Case not
reported
yet
11 April/ 57 M Splenic abscess, peritonitis. Comorbidity: Sickle cell Imipenem Survived VITEK2d system, 05-03-009 Ubajara: latitude(S) 3º 51'
16", longitude(WGr) 40º 55'
Case not
reported
150
2010 anemia. Exposure: Unknown confirmed by PCR 16" yet
12 Dec/20
10
53 M Pneumonia, sepsis Comorbidity: dengue. Exposure:
handle and transporting bricks
Imipenem Death VITEK2d system,
confirmed by PCR
05-03-010 Pacoti: latitude(S) 4 13' 30",
longitude(WGr) 38º 55' 24"
Case not
reported
yet
13 Jan/20
11
32 M Adenopathy, fever. Comorbidity: diabetes. Exposure:
Unknown
Meropenem Survived VITEK2 system,
confirmed by PCR
05-03-011 Ocara: latitude(S) 4º 29’ 2
7’’, longitude(WGr) 38º 35’
48’’.
Case not
reported
yet
aDiagnostic method used by the laboratory that first isolated the strain; bSpecialized Medical Mycology Center; c GNNFs - Non-fermenting gram negative rods26, d Chronic Obstructive Pulmonary Disease.
151 Figure 1. Geographic location of the state of Ceará (upper picture). Geographic distribution of the municipalities
where cases of melioidosis have been reported in Ceará (Tejuçuoca, Banabuiú, Aracoiaba, Ubajara, Granja,
Itapajé, Pacoti and Ocara). Cases of melioidosis are represented by the text boxes, except for case 6 which refers
to the dutch tourist.