PONTIFICIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO PARANÁ

JUSSARA KASUKO PALMEIRO

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE ISOLADOS

CLÍNICOS DE Streptococcus agalactiae

CURITIBA

2009

JUSSARA KASUKO PALMEIRO

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE ISOLADOS

CLÍNICOS DE Streptococcus agalactiae

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências da Saúde, Setor de

Ciências Biológicas e da Saúde da Pontifícia

Universidade Católica do Paraná, como requisito

parcial à obtenção do grau de Mestre.

Orientador: Dr. Humberto Maciel França Madeira

Co-orientadora: Dra. Libera Maria Dalla Costa

CURITIBA

2009

Dados da Catalogação na Publicação Pontifícia Universidade Católica do Paraná

Sistema Integrado de Bibliotecas – SIBI/PUCPR Biblioteca Central

Palmeiro, Jussara Kasuko P172c Caracterização fenotípica e genotípica de isolados clínicos de Streptococcus 2009 agalactiae / Jussara Kasuko Palmeiro ; orientador, Humberto Maciel França Madeira ; co-orientadora, Libera Maria Dalla Costa. -- 2009. 127, [15] f. ; il. ; 30 cm Dissertação (mestrado) – Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2009 Bibliografia: f. 110-127 1. Streptococcus agalactiae. 2. Epidemias. 3. Eletroforese. I. Madeira, Humberto Maciel França. II. Costa, Libera Maria Dalla. III. Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. IV. Título. CDD 20. ed. – 610

Dedico este trabalho às pessoas que mais amo:

meus pais, meus irmãos e meu esposo.

AGRADECIMENTOS

Minha imensa gratidão a todas as pessoas que de alguma forma me

ajudaram a enfrentar as dificuldades que surgiram durante esses anos de minha

contínua formação pessoal e profissional. É com essas pessoas que desejo festejar,

hoje e sempre, todas as minhas conquistas.

Ao meu orientador, Dr. Humberto Maciel França Madeira, pelos

conhecimentos compartilhados, pelo apoio e por ter concretizado meu ingresso na

pós-graduação.

À minha mais que co-orientadora Dra. Libera Maria Dalla Costa, por todo o

incentivo e simplesmente por ter sido a coadjuvante de minha formação profissional.

Ao Dr. Sérgio Fracalanzza e seus colaboradores do Laboratório de

Bacteriologia Médica do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da

UFRJ, pela enriquecedora contribuição no trabalho.

Ao Dr. Newton Sérgio de Carvalho, por me ajudar na aquisição dos dados,

pelas sugestões e conhecimentos compartilhados.

À Coordenação do curso, na pessoa do Dr. Roberto Pecoits, por permitir

concretizar este trabalho.

À minha companheira de labuta Keite da Silva Nogueira, por ter me auxiliado

indefinidamente na realização deste trabalho.

Aos meus amigos de trabalho Adriane Ceschin Maestri, Aurora da

Conceição F. da Silva Faria, Dilair Camargo de Souza, Gislene Maria Botão Kussen,

Helena Homem de Mello de Souza, Laura Lúcia Cogo, Mara Cristina Scheffer,

Margareth Indiukov Neves, Maria Estela de Lima, Marli Terezinha Karpstein e

Roberto Ribeiro dos Santos, pelo companheirismo, conhecimentos e amizade.

À Equipe maravilhosa do Setor de Bacteriologia e Central de Soluções e

Meios de Cultura do Hospital de Clínicas da UFPR, por terem colaborado sempre

que necessário.

À Rosângela Torres e seus colaboradores do Laboratório Central do Estado

do Paraná, pelos conhecimentos compartilhados e pela contribuição no trabalho.

Às alunas de Farmácia Danieli Conte, Fernada Maia e Giuliana Locatelli e de

Medicina Danila Yoshioka e Fernanda Almeida Leite, por contribuírem na execução

do trabalho.

Ao Núcleo de Estudos de Bacteriologia Clínica de Curitiba, pelo apoio e

conhecimento científico transmitido.

À Newprov Produtos para Laboratório Ltda., pelo fornecimento de materiais

emergenciais necessários ao desenvolvimento da pesquisa.

Aos professores que contribuíram para meu desenvolvimento profissional.

À minha família querida, alicerce de minha vida, por sempre acreditarem em

minha capacidade.

Ao meu esposo que foi meu refúgio para agüentar essa caminhada.

Aos meus amigos que me ajudaram a relaxar e esquecer por algumas horas

as responsabilidades do dia a dia.

Meu eterno muito obrigado!

"Somos feitos de carne, mas temos que viver

como se fossemos feitos de ferro”.

Sigmund Freud

RESUMO

Nos últimos quarenta anos, estreptococos do grupo B (EGB) têm sido descrito como relevante patógeno em infecções invasivas neonatais, e atualmente, em pacientes senis ou com condições debilitantes. A terapia antimicrobiana intraparto continua sendo a principal medida de prevenção à doença perinatal, entretanto vacinas estão sendo desenvolvidas. Entre os principais componentes bacterianos, alvos à produção de vacinas, estão os polissacarídeos capsulares de EGB. Têm-se relatado dez sorotipos, a saber, Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII e IX. Penicilina permanece como antimicrobiano de primeira escolha ao tratamento e prevenção de infecções por EGB. Em casos de risco de anafilaxia e falha terapêutica pelo uso de beta-lactâmicos, recomenda-se eritromicina e clindamicina, porém tem ocorrido um aumento de EGB resistentes a esses antimicrobianos. No Paraná e região Sul, pouco se sabe sobre as características fenotípicas e genotípicas desse microrganismo. O objetivo principal deste estudo foi caracterizar fenotipicamente e genotipicamente isolados clínicos de EGB. Foram estudadas 190 amostras de EGB isoladas de três hospitais de Curitiba, no período de abril de 2006 a maio de 2008. A sorotipagem dos isolados foi realizada através do método de imunodifusão radial em gel de agarose para nove sorotipos (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII e VIII). A suscetibilidade aos antimicrobianos foi determinada por disco difusão e diluição em ágar, conforme o CLSI. A pesquisa dos fenótipos de resistência MLSB foi realizada por métodos fenotípicos (dupla difusão em ágar) e genotípicos (PCR). A variabilidade genética das amostras foi pesquisada utilizando a técnica de PFGE. Os isolados clínicos foram recuperados de secreção anogenital de gestantes, de urina de adultos não gestantes e gestantes; de hemocultura, líquor, secreção de ferida cirúrgica, líquido peritoneal, biópsia, catéter endovenoso, abscesso e urina nos casos de infecção em três grupos de pacientes (neonatos, gestantes e não gestantes). Todas as amostras foram sensíveis a penicilina, ampicilina, cefazolina, levofloxacina e vancomicina. Apenas 4,7% dos isolados apresentaram resistência a eritromicina e clindamicina, sendo que todos revelaram o fenótipo constitutivo e amplificaram para o gene ermB. A combinação de genes (ermA e ermB) ocorreu na maioria das amostras resistentes. O sorotipo Ia foi prevalente, seguido dos sorotipos II, IV, Ib, V e III. Isolados não tipáveis compreenderam 10,5% desta população. O sorotipo IV apresentou-se mais associado à infecção. Apesar da ampla diversidade genética observada, quase metade dos isolados de EGB foram agrupados em dois grupos, dentro dos quais as amostras foram geneticamente relacionadas entre si. O sorotipo Ia mostrou menor variabilidade genética entre todos os tipos capsulares. Este foi o primeiro estudo a avaliar o perfil de suscetibilidade, sorotipos e epidemiologia molecular de EGB na região. Isso reflete a necessidade de mais estudos para melhor compreender o perfil epidemiológico de EGB nas distintas populações, buscando desenvolver melhores estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento nas instituições e hospitais do país.

Descritores: Estreptococos do grupo B. Sorotipos. Perfil de suscetibilidade

antimicrobiana. PFGE.

ABSTRACT

In the last forty years, group B streptococci (GBS) have been described as an important pathogen in neonatal invasive infections, and currently, in elderly or adults with underlying medical conditions. Intrapartum chemoprophylaxis remains the main measure for perinatal GBS disease prevention; however vaccines are under development. Studies on candidate vaccines based on capsular polysaccharides of GBS, and have been extensively reported for ten serotypes Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII and IX. Penicillin remains the drug of choice for treatment and prevention of GBS infections. Erythromycin and clindamycin are recommended when risks of anaphylaxis or therapeutic failure are present. However, there has been an increase in GBS resistance to these antibiotics. In Paraná and the southern region, little is known about the phenotypic and genotypic characteristics of the microorganism. The main aim of this study was to phenotypically and genotypically characterize human GBS isolates. One-hundred and ninety (n = 190) GBS isolates from patients of three hospitals in Curitiba isolated from April 2006 to May 2008 were studied. Serotyping was performed by the double immunodiffusion method for nine serotypes (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII and VIII). Antimicrobial susceptibility testing was determined by disk diffusion and agar dilution according CLSI. Screening for MLSB resistance was performed by phenotypic (double-disk testing) and genotypic (PCR) methods. The genetic variability of samples was investigated using PFGE. Isolates were recovered from anogenital specimens of pregnant women, from urine of adult non-pregnant and pregnant women, from blood, cerebrospinal fluid, surgical wound, peritoneal fluid, biopsies, intravenous catheter, abscesses and urine in neonates, pregnant women and nonpregnant patients. All samples were sensitive to penicillin, ampicillin, cefazolin, levofloxacin and vancomycin. Only 4.7% of isolates were resistant to erythromycin and clindamycin, in which the constitutive phenotype was present, as revealed by the amplification of the ermB gene. Combination genes (ermA and ermB) was found in most of the resistant isolates. Serotype Ia was prevalent, followed by serotypes II, IV, Ib, V and III. Nontypeable isolates comprised 10.5% of this population. Serotype IV was more associated in infection. Despite the extensive genetic diversity among isolates revealed by PFGE profiles, almost half GBS isolates could be allotted to two major distinct groups of genetic relatedness. Serotype Ia showed lower genetic variability among all capsular types. This was the first study to assess GBS sensibility, serotypes and molecular epidemiology in this region. From these results, a need for more studies that would allow a better understanding of GBS epidemiological profile in the population of different Brazilian geographical regions can be envisioned. Also, to develop improved strategies for prevention, diagnosis and treatment being conducted in institutions and hospitals around the country.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – ILUSTRAÇÃO DOS PRINCIPAIS FATORES DE VIRULÊNCIA DE

S. agalactiae ........................................................................................31

FIGURA 2 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS UNIDADES

POLISSACARÍDICAS REPETIDAS DOS NOVE SOROTIPOS

CAPSULARES DE S. agalactiae. .........................................................41

FIGURA 3 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA DISTRIBUIÇÃO DOS

DISCOS DE ERITROMICINA E CLINDAMICINA EM MHA

SUPLEMENTADO PARA A PESQUISA DOS FENÓTIPOS DE

RESISTÊNCIA MLSB ............................................................................57

FIGURA 4 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS FENÓTIPOS DE

RESISTÊNCIA MLSB QUE PODEM SER OBSERVADOS EM

ISOLADOS DE S. agalactiae PELO TESTE DE DUPLA-DIFUSÃO

EM ÁGAR .............................................................................................57

FIGURA 5 – MULTI-INOCULADOR DE STEER UTILIZADO PARA

DISPENSAR O INÓCULO BACTERIANO EM PLACA DE ÁGAR

MULLER HINTON ................................................................................62

FIGURA 6 – GEL-PUNCH UTILIZADO PARA REALIZAR OS POÇOS NA

SUPERFÍCIE DO GEL DE AGAROSE .................................................65

FIGURA 7 – TESTE DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS PELO

MÉTODO DE DISCO-DIFUSÃO EM AMOSTRAS DISTINTAS,

DESTACANDO O TESTE DE DUPLA DIFUSÃO EM ÁGAR OU

TESTE D..............................................................................................82

FIGURA 8 – IMUNODIFUSÃO RADIAL EM GEL DE AGAROSE PARA

PESQUISA DOS SOROTIPOS CAPSULARES DE S. agalactiae .......83

FIGURA 9 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DE LINHAGENS DE

S. pyogenes UTILIZADAS COMO CONTROLE POSITIVO PARA

PESQUISA DOS GENES DE RESISTÊNCIA ermA, ermB E mefA

EM ISOLADOS DE S. agalactiae .........................................................88

FIGURA 10 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DOS ISOLADOS DE

S. agalactiae POSITIVOS PARA O GENE ermB .................................89

FIGURA 11 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM BASE NO

POLIMORFISMO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO EM

PFGE UTILIZANDO A ENZIMA SmaI DE 174 ISOLADOS DE

S. agalactiae ........................................................................................90

FIGURA 12 – EXEMPLOS DE PERFIS ELETROFORÉTICOS CLONAIS DE

PFGE DAS AMOSTRAS PAREADAS DE S. agalactiae

ISOLADAS DE MESMOS PACIENTES ...............................................92

FIGURA 13 – DENDROGRAMAS CONSTRUÍDOS COM BASE NO

POLIMORFISMO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO EM

PFGE UTILIZANDO A ENZIMA SmaI DE 174 ISOLADOS DE

S. agalactiae, DESTACANDO OS clusters GÊNICOS DOS

SOROTIPOS Ia e IV.............................................................................93

FIGURA 14 – DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL DE S. agalactiae RESISTENTES À

ERITROMICINA E CLINDAMICINA ...................................................100

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1 – DISTRIBUIÇÃO DOS 190 ISOLADOS DE S. agalactiae

PROVENIENTES DE INFECÇÃO E COLONIZAÇÃO NAS

UNIDADES DE ATENDIMENTO HOSPITALAR E

AMBULATORIAL ...............................................................................72

GRÁFICO 2 – DISTRIBUIÇÃO DOS 128 ISOLADOS DE S. agalactiae

ASSOCIADOS À COLONIZAÇÃO POR AMOSTRA CLÍNICA ..........73

GRÁFICO 3 – DISTRIBUIÇÃO DOS 62 ISOLADOS DE S. agalactiae

ASSOCIADOS À INFECÇÃO POR AMOSTRA CLÍNICA ..................74

GRÁFICO 4 – FREQÜÊNCIA DE 190 ISOLADOS DE S. agalactiae POR FAIXA

ETÁRIA E SEXO ...............................................................................75

GRÁFICO 5 – DISTRIBUIÇÃO TEMPORAL DE 190 ISOLADOS DE

S. agalactiae, CONSIDERANDO AMOSTRAS DE

COLONIZAÇÃO E INFECÇÃO ..........................................................75

GRÁFICO 6 – DISTRIBUIÇÃO DOS 190 ISOLADOS DE S.agalactiae POR

SOROTIPOS CAPSULARES.............................................................83

GRÁFICO 7 – SOROTIPOS DE S.agalactiae DISTRIBUÍDOS POR

AMOSTRAS ISOLADAS DE INFECÇÃO E COLONIZAÇÃO............84

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 – SEQUÊNCIA DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES

UTILIZADOS NA PCR PARA PESQUISA DE GENES DE

RESISTÊNCIA AOS MACROLÍDEOS EM ISOLADOS CLÍNICOS

DE S. agalactiae.................................................................................69

QUADRO 2 – CRITÉRIOS PARA CLASSIFICAÇÃO DOS ISOLADOS DE

S. agalactiae, SE PROVENIENTES DE INFECÇÃO OU

COLONIZAÇÃO .................................................................................73

QUADRO 3 – INFORMAÇÕES GERAIS E RESULTADOS DAS AMOSTRAS

PAREADAS DE S. agalactiae ISOLADAS DE MESMOS

PACIENTES E DOS CASOS DE DOENÇA PERINATAL ..................87

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS FENOTÍPICAS DE

S. agalactiae ........................................................................................26

TABELA 2 – CRITÉRIOS DE INTERPRETAÇÃO DE SUSCETIBILIDADE E

CONCENTRAÇÕES DOS ANTIMICROBIANOS TESTADAS EM

ISOLADOS DE S. agalactiae ...............................................................59

TABELA 3 – SOLUÇÕES-ESTOQUE DE ANTIMICROBIANOS...............................60

TABELA 4 – DISTRIBUIÇÃO DOS 190 ISOLADOS DE S. agalactiae,

PROVENIENTES DE INFECÇÃO E COLONIZAÇÃO, NOS

HOSPITAIS ..........................................................................................71

TABELA 5 – DISTRIBUIÇÃO DOS 190 ISOLADOS DE S. agalactiae,

PROVENIENTES DE INFECÇÃO E COLONIZAÇÃO POR

GRUPOS DE PACIENTES ..................................................................76

TABELA 6 – FREQUÊNCIA DOS FATORES DE RISCO MATERNOS E

NEONATAIS PARA A PRESENÇA DE S. agalactiae EM 64 RNs

CUJAS MÃES APRESENTAVAM COLONIZAÇÃO OU

INFECÇÃO POR EGB (VARIÁVEIS QUALITATIVAS).........................79

TABELA 7 – FREQUÊNCIA DOS FATORES DE RISCO MATERNOS PARA A

PRESENÇA DE S. agalactiae EM 64 RNs CUJAS MÃES

APRESENTAVAM COLONIZAÇÃO OU INFECÇÃO POR EGB

(VARIÁVEIS QUANTITATIVAS) ..........................................................79

TABELA 8 – PERFIL DE SUSCETIBILIDADE DE 190 AMOSTRAS DE

S. agalactiae ISOLADAS DE COLONIZAÇÃO E INFECÇÃO EM

ABRIL DE 2006 A MAIO DE 2008 .......................................................80

TABELA 9 – MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E DISTRIBUIÇÃO DOS

SOROTIPOS DE 62 ISOLADOS DE S. agalactiae ASSOCIADOS

À INFECÇÃO .......................................................................................85

TABELA 10 – DISTRIBUIÇÃO DOS SOROTIPOS DE S. agalactiae POR

GRUPOS DE PACIENTES ..................................................................86

TABELA 11 – DISTRIBUIÇÃO DOS SOROTIPOS DE S. agalactiae POR

PADRÕES CLASSIFICADOS DE PFGE .............................................91

TABELA 12 – DIVERSIDADE GENÉTICA DE 174 ISOLADOS DE S. agalactiae

AGRUPADOS CONFORME SOROTIPOS ..........................................92

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAP - American Academy of Pediatrics

ABCs - Active Bacterial Core surveillance

ACOG - American College of Obstetricians and Gynecologists

AMP - Ampicilina

ATCC - American Type Culture Collection

CBM - Concentração Bactericida Mínima

CDC - Centers for Disease Control and Prevention

CFZ - Cefazolina

CIM - Concentração Inibitória Mínima

CLI - Clindamicina

CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute

CylE - Denominação do fator de virulência hemolisina de S. agalactiae

DNA - Ácido Desoxirribonucléico

dNTP - Desoxirribonucleotídeo trifosfato

DO - Densidade Óptica

EDTA - Ácido etilenodiaminotreacético

EGB - Estreptococo do Grupo B

ERI - Eritromicina

FBP - Fibronectin-binding protein

GBS - Group B Streptococcus

HC-UFPR - Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná

HMVFA-UFPR - Hospital Maternidade Vitor Ferreira do Amaral da Universidade

Federal do Paraná

HMW - High Molecular Weight

HNSG - Hospital Nossa Senhora das Graças

L - Lincosamida

LEV - Levofloxacina

LMW - Low Molecular Weight

LPXTG - Denominação de um domínio protéico altamente conservado

presente em proteínas superficiais de S. agalactiae

M - Macrolídeo

MHA - Müeller Hinton Ágar

PAI - Profilaxia antimicrobiana intraparto

PENG - Penicilina G

PP - Parto prematuro

RN - Recém-nascido

S. agalactiae - Streptococcus agalactiae

Taq polimerase - Thermus aquaticus polimerase

TPP - Trabalho de parto prematuro

VAN - Vancomicina

MLST - Multi Locus Sequence Typing

PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis

UPGMA - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean

DICE - Coeficiente de similaridade

LISTA DE SÍMBOLOS

kb - kilobase

mg - miligrama

MgCl2 - Cloreto de Magnésio

mL - mililitro

mm - milímetros

NaCl - Cloreto de sódio

ng - nanograma

nm - nanômetro

pb - pares de base

pmol - picomol

rpm - rotações por minuto

S - Svedberg

U - Unidades

v/v - volume/volume

V/cm - voltz/centímetro

°C - grau Celsius

µ - micro

µg - micrograma

µL - microlitros

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................20

1.1 OBJETIVOS ........................................................................................................22

1.1.1 Objetivo Geral ..................................................................................................22

1.1.2 Objetivos Específicos .......................................................................................22

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................ .....................................................23

2.1 HISTÓRICO ........................................................................................................23

2.2 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS........................................................24

2.2.1 Taxonomia........................................................................................................24

2.2.2 Aspectos Gerais do Gênero Streptococcus......................................................24

2.2.3 Características Microbiológicas da Espécie Streptococcus agalactiae ............25

2.3 PATOGÊNESE....................................................................................................27

2.4 EPIDEMIOLOGIA: UMA VISÃO MUNDIAL.........................................................33

2.4.1 Infecções por S. agalactiae em neonatos.........................................................34

2.4.2 Infecções por S. agalactiae em parturientes ....................................................35

2.4.3 Infecções por S. agalactiae em adultos não-gestantes ....................................36

2.5 NO BRASIL S. agalactiae É UM PATÓGENO EMERGENTE?...........................38

2.6 A IMPORTÂNCIA DOS SOROTIPOS DE S. agalactiae .....................................39

2.7 PREVENÇÃO, PROFILAXIA E TRATAMENTO DE INFECÇÕES ......................44

2.8 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS..............................47

2.9 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR.........................................................................50

3 MATERIAIS E MÉTODOS .............................. .......................................................53

3.1 AMOSTRAS BACTERIANAS..............................................................................53

3.1.1 Histórico Clínico dos Pacientes ........................................................................53

3.1.2 Aspectos Éticos................................................................................................54

3.2 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA................................................54

3.3 TESTE DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS...............................55

3.4 PESQUISA DOS FENÓTIPOS DE RESISTÊNCIA MLSB ...................................56

3.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA ........................58

3.5.1 Agentes Antimicrobianos Utilizados .................................................................58

3.5.2 Diluição do Antimicrobiano para o Preparo das Placas de Ágar Müeller-Hinton

Suplementadas ................................................................................................60

3.5.3 Preparo das Placas de Müeller-Hinton Suplementadas ...................................61

3.5.4 Preparo do Inóculo Bacteriano .........................................................................61

3.5.5 Inoculação Bacteriana em Ágar .......................................................................62

3.5.6 Interpretação da Concentração Inibitória Mínima.............................................63

3.6 CLASSIFICAÇÃO SOROLÓGICA DE Streptococcus agalactiae

(SOROTIPAGEM) ...............................................................................................63

3.6.1 Preparo do Extrato Bacteriano .........................................................................64

3.6.2 Preparo das Placas de Gel de Agarose para a Imunodifusão Radial...............64

3.7 MÉTODOS MOLECULARES ..............................................................................65

3.7.1 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) .............................................65

3.7.1.1 Preparo dos Blocos com DNA.......................................................................66

3.7.1.2 Clivagem do DNA com Enzima de Restrição ................................................67

3.7.1.4 Análise dos Padrões Moleculares .................................................................68

3.7.2 PCR para Detecção dos Genes de Resistência aos Macrolídeos....................68

3.7.2.1 Extração do DNA...........................................................................................69

3.7.2.2 Amplificação ..................................................................................................69

3.8 MÉTODOS ESTATÍSTICOS ...............................................................................70

4 RESULTADOS....................................... ................................................................71

4.1 CARACTERIZAÇÃO GERAL DAS AMOSTRAS DE S. agalactiae .....................71

4.2 ANÁLISE DO HISTÓRICO CLÍNICO DOS PACIENTES ....................................76

4.3 TESTE DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS E CONCENTRAÇÃO

INIBITÓRIA MÍNIMA ...........................................................................................80

4.3.1 Detecção dos fenótipos de resistência MLSB ...................................................81

4.4 CARACTERIZAÇÃO SOROLÓGICA DOS ISOLADOS DE S. agalactiae...........83

4.5 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS CLÍNICOS DE

S. agalactiae........................................................................................................87

4.5.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detecção de genes de

resistência tipo MLSB .......................................................................................88

4.5.2 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) .............................................89

5 DISCUSSÃO ..........................................................................................................94

5.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ..............................................................................94

5.2 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE S. agalactiae

ISOLADAS EM TRÊS HOSPITAIS DE CURITIBA..............................................98

5.3 DISTRIBUIÇÃO DOS SOROTIPOS DE S. agalactiae ISOLADOS DE DIVERSOS

MUNICÍPIOS DO ESTADO DO PARANÁ.........................................................103

5.4 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE ISOLADOS CLÍNICOS DE S. agalactiae 105

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................. ....................................................108

6.1 HISTÓRICO CLÍNICO DOS PACIENTES.........................................................108

6.2 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS............................108

6.3 DISTRIBUIÇÃO DOS SOROTIPOS..................................................................108

6.4 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR.......................................................................109

6.5 PERSPECTIVAS FUTURAS.............................................................................109

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................... ..............................................110

APÊNDICES ...........................................................................................................128

ANEXOS .................................................................................................................139

20

1 INTRODUÇÃO

Durante quatro décadas, Streptococcus agalactiae ou estreptococos do

grupo B (EGB) tem sido descrito como um importante patógeno em infecções

invasivas perinatais e neonatais, ocasionando pneumonia, septicemia e meningite.

Além dessas doenças, em gestantes EGB pode causar infecção urinária,

corioamnionite, endometrite puerperal e contribuir para promover abortamento e

prematuridade (GIBBS et al., 2004). Na última década, EGB também se tornou

relevante patógeno em adultos não gestantes, particularmente em pacientes senis

ou com condições debilitantes significativas, causando infecções de pele e tecidos

moles, bacteremia, infecção genitourinária, pneumonia, peritonite, meningite,

osteomielite e artrite séptica (FARLEY, 2001).

As infecções perinatais por EGB, em aproximadamente 80% dos casos, são

adquiridas durante o parto por transmissão vertical do microrganismo, o qual pode

colonizar mucosas anogenitais em 10 a 40% das mulheres saudáveis (GIBBS et al.,

2004). Apesar da profilaxia antimicrobiana intraparto, em gestantes colonizadas, ter

sido recomendada desde 1996, nos EUA projetou-se que EGB possa ter causado

perto de 2.700 casos de infecção e 100 óbitos em recém-nascidos dos primeiros

meses de vida, em 2005 (PHARES et al., 2008). No Brasil e em países da América

Latina, o perfil epidemiológico dessa doença é pouco conhecido, o que torna

necessária a implantação de programas de vigilância, e consequentemente, a

divulgação dessas informações à comunidade.

Além de ser considerado um patógeno potencial em seres humanos,

S. agalactiae também é conhecido como uma das principais causas de mastite

bovina e pode promover infecção ou colonização em outros animais como ovinos,

suínos, caninos, felinos, roedores, rãs e até peixes (ELLIOTT et al., 1990;

LAMMLER et al., 1998).

S. agalactiae permanece universalmente sensível a penicilina, por isso esse

antimicrobiano continua sendo a primeira escolha para o tratamento e prevenção

das infecções causadas por esse microrganismo. Entretanto, aos pacientes que

podem desenvolver reações adversas aos beta-lactâmicos, eritromicina e

clindamicina são recomendados (SCHRAG et al., 2002). Estudos prévios têm

21

relatado o aumento da resistência a macrolídeos, lincosamidas e estreptograminas B

(MLSB), sendo que dependendo da região geográfica pode ocorrer variabilidade nas

taxas dessa resistência (DE AZAVEDO et al., 2001). Entre os mecanismos de

resistência MLSB mais comumente encontrados estão a modificação ribossomal

através de metilases e a bomba de efluxo codificadas por genes erm e mef,

respectivamente. Essa resistência pode ser expressa por fenótipos de resistência

cruzada (constitutivo e induzível) ou restrita aos macrolídeos (DESJARDINS et al.,

2004; LAMBERT, 2005).

Com o advento da profilaxia contra EGB, o uso de antimicrobianos tem

aumentado a preocupação quanto às mudanças no seu perfil de resistência e à

emergência de outros patógenos perinatais (LINDAHL et al., 2005). Diante desse

cenário surge o estímulo à busca de novas medidas preventivas, como o

desenvolvimento de vacinas. Inúmeras pesquisas estão sendo voltadas à procura de

componentes bacterianos efetivos na formulação dessas vacinas e em EGB,

polissacarídeos capsulares e proteínas de superfícies têm-se apresentado como

boas opções. Atualmente, nove sorotipos diferentes de EGB são descritos (Ia, Ib, II,

III, IV, V, VI, VII e VIII) e a diferenciação entre eles tem sido relevante à investigação

epidemiológica, pelo fato da distribuição variar de acordo com a região geográfica,

origem étnica, patologia desenvolvida, perfil de resistência aos antimicrobianos e até

período de isolamento (SCHUCHAT, 1998).

A falta de informações a respeito das características de EGB pertencentes à

população em estudo, especialmente quanto ao perfil de resistência e sorotipos,

motivou o interesse à pesquisa. Conhecer o microrganismo foi considerado

fundamental para analisar sua dinâmica de infecção e colonização, além de auxiliar

na implantação de medidas profiláticas eficientes. Estratégias competentes de

prevenção às infecções por EGB promoveriam a diminuição direta de custos com

tratamento e hospitalização, melhorando o prognóstico e a sobrevida dos pacientes.

22

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Objetivo Geral

Caracterizar fenotipicamente e genotipicamente isolados clínicos de

Streptococcus agalactiae de hospitais de Curitiba.

1.1.2 Objetivos Específicos

• Investigar achados clínicos relacionados à ocorrência de processo infeccioso

ou colonização por S. agalactiae, distinguindo-os entre grupos de pacientes

(gestantes, não gestantes e recém-nascidos). Comparar grupos de recém-

nascidos que apresentaram e não apresentaram o isolamento de

S. agalactiae, quanto às variáveis clínicas relevantes.

• Pesquisar os sorotipos de S. agalactiae pelo método de imunodifusão radial.

• Avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos através dos métodos de

disco-difusão e diluição em ágar.

• Caracterizar a resistência macrolídeo-lincosamida-estreptogramina do grupo

B (MLSB) pelos métodos fenotípico (Teste D) e genotípico (PCR).

• Avaliar a diversidade genética pela técnica de Eletroforese em Campo

Pulsado (PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis), relacionando-a com

sorotipo e perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos.

23

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 HISTÓRICO

Streptococcus agalactiae ou estreptococos do grupo B (EGB; também GBS,

de Group B Streptococcus) foi descrito pela primeira vez em 1887 por Nocard e

Mollereau como Streptococcus de la mammite, isto é, um patógeno da mastite

bovina (NOCARD; MOLLEREAU, 1887, apud BISHARAT et al., 2004). Desde então,

a classificação taxonômica da espécie foi modificada em vários momentos, mas em

1896 Lehmann e Neumann denominaram definitivamente a espécie como

Streptococcus agalactiae (BUCHANAN; GIBBONS, 1974).

Somente 50 anos depois, por volta de 1930, esse microrganismo foi

relacionado à colonização e a infecções humanas. A colonização foi descrita a partir

de isolados de cultura de secreção vaginal (LANCEFIELD, 1935) e infecções foram

relatos de septicemia puerperal e bacteremia (FRY, 1938; RANTZ; KIRBY, 1942).

Nas décadas de 1960 e 1970, EGB apareceu como importante agente

etiológico de doença neonatal, tornando-se a principal causa de morbidade e

mortalidade de recém-nascidos nos Estados Unidos (BAKER et al., 1973; BARTON;

FEIGIN; LINS, 1973; FRANCIOSI; KNOSTMAN; ZIMMERMAN, 1973;

MCCRACKEN, 1973). Com a emergência desse problema, vários estudos passaram

a ser realizados, fundamentalmente no âmbito da investigação epidemiológica,

clínica, microbiológica e profilática da doença. Baseada nesses estudos, a

comunidade científica representada pelo Centers for Disease Control and Prevention

(CDC), o American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) e a

American Academy of Pediatrics (AAP) reuniram-se e, em 1996, apresentaram as

diretrizes de prevenção à doença perinatal causada por EGB.

Países da América do Norte e Europa, essencialmente, realizaram estudos

de vigilância e de implementação das estratégias de prevenção, com o objetivo

principal de verificar a eficácia das diretrizes de 1996. Com os resultados desses

estudos, as diretrizes foram reformuladas em 2002 e atualmente auxiliam na prática

clínica.

24

2.2 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS

2.2.1 Taxonomia

O gênero Streptococcus pertence ao filo Firmicute, classe Bacilli, ordem

Lactobacillales e família Streptococcaceae. Essa família também inclui os gêneros

Lactococcus e Lactovum (MATTHIES et al., 2004). Atualmente, o gênero

Streptococcus contém 90 espécies e 17 subespécies, sendo distribuídas em

linhagens de origem animal e humana (GARRITY, 2008).

A taxonomia de estreptococos admitiu inúmeras modificações nos últimos

anos, principalmente devido aos avanços na tecnologia molecular, como exemplo, o

sequenciamento do gene do RNAr 16S (FACKLAM, 2002).

2.2.2 Aspectos Gerais do Gênero Streptococcus

Apesar dos avanços da biologia molecular para melhor reconhecimento das

linhagens bacterianas, a diferenciação fenotípica clássica de estreptococos,

baseada na reação de hemólise, tamanho de colônia e presença de diferentes

carboidratos de superfície, segundo classificação de Lancefield, ainda tem grande

valor à microbiologia clínica.

De maneira geral, estreptococos de importância clínica em humanos podem

ser divididos em dois grandes grupos: estreptococos piogênicos e estreptococos não

piogênicos ou do grupo viridans. Esse último grupo pode ainda ser subdividido em

(1) estreptococos do grupo S. mitis, onde se encontra S. pneumoniae; (2)

estreptococos do grupo S. anginosus; (3) estreptococos do grupo S. mutans; (4)

estreptococos do grupo S. bovis e (5) estreptococos do grupo S. salivarius

(SPELLERBERG; BRANDT, 2007). A divisão seguindo a reação de hemólise

(estreptococos beta, alfa e não hemolíticos) não é distintiva entre os grupos, já que

dentro deles existem espécies apresentando diferentes reações de hemólise.

Estreptococos são células gram positivas esféricas ou ovóides de 0,5 a 2,0

µm de diâmetro e ocorrem aos pares ou cadeias quando crescem em meio líquido.

Não são móveis, não formam esporos e são catalase negativa, isto é, não reagem

25

com peróxido de hidrogênio a 3%. Algumas espécies podem se apresentar

encapsuladas, como exemplo S. pneumoniae. São anaeróbios facultativos e

algumas espécies necessitam de 5% de CO2. São quimiotrópicos, ou seja, não são

capazes de realizar o metabolismo respiratório, já que não possuem as condições

para efetuar a fosforilação oxidativa por meio da cadeia transportadora de elétrons.

O crescimento é geralmente restrito à temperatura de 25 a 45 °C, mas a temperatura

ótima é de 37 °C. Possuem um metabolismo fermentati vo, produzindo a partir de

carboidratos o ácido lático, mas não gás; e requerem um meio de cultivo rico com

adição de sangue ou soro (HOLT; KRIEG; SNEATH, 1994; SPELLERBERG;

BRANDT, 2007).

Espécies de estreptococos comumente lisam ou não hemácias, produzindo

no meio de cultivo contendo sangue de carneiro ou cavalo uma hemólise parcial

(produção de uma coloração verde ao redor da colônia, chamada alfa-hemólise) ou

uma hemólise total (formação de uma zona clara ao redor da colônia, chamada beta-

hemólise). As espécies beta-hemolíticas, na maioria pertencente ao grupo piogênico,

podem ser classificadas conforme o tipo de polissacarídeo presente na parede

celular do microrganismo. Rebecca Lancefield (1933), trabalhando com testes de

precipitação e anti-soros, conseguiu distribuir primeiramente essas espécies em

sorogrupos A, B, C, D e E (LANCEFIELD, 1933). Mais tarde, outros grupos foram

observados e denominados F, G, H, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U e V. Dentro

desses grupos algumas espécies são alfa-hemolíticas e outras não-hemolíticas

(FACKLAM, 1995). Estreptococos beta-hemolíticos podem ainda ser denominados

de forma mais simplificada em estreptococos de colônia pequena (0,5 mm), englobando as

demais espécies (SPELLERBERG; BRANDT, 2007).

2.2.3 Características Microbiológicas da Espécie Streptococcus agalactiae

Streptococcus agalactiae (EGB) é a única espécie pertencente ao sorogrupo

B de Lancefield e está agrupada entre as espécies de estreptococos piogênicos.

Sua identificação presuntiva é verificada pela caracterização morfocolonial típica,

aparecendo cinza, com colônias grandes, circulares e levemente brilhantes em meio

de cultivo contendo sangue. A maioria das cepas apresenta uma beta-hemólise

26

discreta ao redor das colônias, mas pode exibir ausência de hemólise, também

chamada de gama-hemólise, o que possibilita uma confusão com espécies de

Enterococcus (SPELLERBERG; BRANDT, 2007).

EGB tem a habilidade de crescer em atmosferas aeróbia, microaerófila (5%

de CO2) e anaeróbia. A seguir, a TABELA 1 mostra algumas características

fenotípicas de EGB quanto ao perfil bioquímico da espécie.

TABELA 1 – CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS FENOTÍPICAS DE S. agalactiae

PROVAS BIOQUÍMICAS PERFIL BIOQUÍMICO

Fator CAMP(1) (+)

Bacitracina resistente (+)

Hidrólise de hipurato de sódio (+)

PYR(2) (-)

Hidrólise de arginina (+)

Hidrólise de esculina (-)

Ribose (acidificação) (+)

Trealose (acidificação) (+)

Inulina (acidificação) (-)

Manitol (acidificação) (-)

Rafinose (acidificação) (-)

Sorbitol (acidificação) (-)

Lactose (acidificação) (v)

Salicina (acidificação) (v)

VP(3) (+)

Crescimento a 45°C (-)

NaCl a 6,5% (v)

40% de bile (v)

FONTE: Adaptado de Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1994). NOTA: Símbolos – (+), positivo; (-), negativo; (v), variável (21-79%). (1) Reação do fator CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen, 1944) refere-se à lise sinérgica de eritrócitos pela beta-hemolisina de S. aureus e a proteína extracelular CFB de S. agalactiae. (2) Verifica a presença da enzima pirrolidonil aminopeptidase. (3) Teste de Voges-Proskauer (formação de acetoína a partir da fermentação de glicose).

Conforme demonstrado na TABELA 1, existem várias provas bioquímicas

para a identificação fenotípica de EGB, entretanto, na prática da microbiologia

clínica, a observação da morfologia colonial por um microbiologista experiente e a

27

prova do fator CAMP são opções suficientes para a identificação presuntiva da

espécie.

Nesse contexto, a escolha do teste da bacitracina, da prova da hidrólise do

hipurato de sódio, dos testes que verificam o crescimento bacteriano em meio de

tolerância ao sal (NaCl a 6,5%) e em 40% de bile ou o teste PYR, além da prova do

fator CAMP, representam o melhor conjunto de testes que suprimem possibilidades

de identificação errônea com outras espécies de estreptococos. Os testes

sorológicos ou imunoensaios disponíveis comercialmente, os quais detectam os

sorogrupos de Lancefield por aglutinação de partículas de látex ligadas a anticorpos

e antígenos específicos, também são excelentes para uma confirmação rápida do

grupo ao qual pertence o estreptococo beta-hemolítico em identificação

(SPELLERBERG; BRANDT, 2007).

Existe uma espécie de estreptococo beta-hemolítico comumente isolada de

animais, designada S. porcinus (Grupos E, P, U e V de Lancefield). Essa espécie

raramente tem sido identificada em humanos, mas há relatos do seu isolamento em

sangue, ferida e secreção vaginal (FACKLAM et al., 1995). S. porcinus pode ser

erroneamente identificada como S. agalactiae, já que pode ser isolado do trato

genital feminino e apresenta reação positiva à prova do fator CAMP, além de reação

falso-positiva com anti-soro do grupo B disponível em kits comerciais. A hidrólise do

hipurato de sódio pode contribuir parcialmente na diferenciação das espécies,

contudo o teste PYR corrobora em 100% de distinção, visto que S. porcinus é PYR

positivo (FACKLAM et al., 1995).

2.3 PATOGÊNESE

S. agalactiae foi primeiramente identificado como patógeno de origem

animal, especificamente de bovinos. Desde sua descrição em 1887, esse

microrganismo apareceu como agente etiológico de doenças e colonização em

outros animais como ovelhas, cabras, suínos, caninos, felinos, roedores, rãs e até

peixes (ELLIOTT et al., 1990; LAMMLER et al., 1998). A partir de 1930 foi relatado

como patógeno e colonizante de seres humanos.

28

Durante as três últimas décadas, S. agalactiae emergiu como um relevante

agente etiológico de doenças humanas e passou a ser comumente associado a

infecções invasivas no período perinatal e neonatal, ocasionando septicemia,

pneumonia, meningite e endocardite (SCHUCHAT, 1998, 1999; LINDAHL et al.,

2005). Um fato interessante é que as infecções por S. agalactiae ocorrem em certos

grupos populacionais, além do recém-nascido. Esse microrganismo também é

considerado um importante patógeno em gestantes, visto que pode contribuir na

gênese do abortamento, prematuridade, infecção do trato urinário, corioamnionite e

endometrite puerperal (GIBBS et al., 2004; LINDAHL et al., 2005). Outro grupo

populacional susceptível a infecções por EGB que ascendeu nos últimos anos é o

dos adultos, geralmente com idade superior a 65 anos, imunocomprometidos ou que

apresentam co-morbidades como diabetes mellitus, neoplasias malignas, doença

hepática, danos neurológicos, alcoolismo ou HIV. A gama de infecções nesse perfil

de pacientes inclui infecções de pele e tecidos moles, bacteremia sem foco definido,

infecção do trato genital e urinário, pneumonia, peritonite, meningite, endocardite,

osteomielite e artrite séptica (FARLEY, 1995, 2001; PHARES et al., 2008).

Subtraindo esses grupos susceptíveis, a prevalência de infecções por S. agalactiae

não é muito preocupante, visto que esse microrganismo pode se apresentar apenas

como colonizante do trato genital e urinário, já que pertence a microbiota do trato

gastrintestinal, seu principal reservatório. No entanto, se ocorrer colonização no

grupo das gestantes, esse microrganismo torna-se extremante relevante, motivo

pelo qual esse é o principal fator de risco para o desenvolvimento da doença

invasiva neonatal (SCHUCHAT, 1996; GIBBS et al., 2004).

A colonização por EGB pode ser transitória, crônica ou intermitente.

Diversos estudos mostram variações na taxa de colonização em gestantes de 10 a

40% das culturas do trato genital e anorretal. Não só nessa população, mas também

crianças, mulheres não-grávidas e homens podem ser colonizados por esse

microrganismo, principalmente no trato urogenital, pele e faringe (GIBBS et al.,

2004).

As infecções neonatais podem apresentar duas manifestações clínicas

diferentes: a doença de início precoce e a de início tardio. De forma geral, essas

manifestações diferem quanto à apresentação clínica, prognóstico, características

epidemiológicas e patogênese. A infecção de início precoce é a manifestação mais

comum e é caracterizada pelo desenvolvimento de septicemia e pneumonia nos

29

primeiros sete dias de vida. A patogênese dessa doença inicia-se pela exposição do

neonato ao microrganismo S. agalactiae antes ou depois do nascimento. De maneira

geral, a infecção pode ocorrer de duas formas principais: durante a passagem do

recém-nascido pelo canal vaginal materno, ficando exposto à colonização por EGB,

ou por ascensão dessa bactéria pelo trato genital ao líquido amniótico, através da

ruptura das membranas fetais. No líquido amniótico o microrganismo se multiplica e

inicia uma colonização no trato respiratório do feto. Com isso pode desenvolver

pneumonia, o que possibilita a disseminação da bactéria à corrente sanguínea,

permitindo sua invasão em múltiplos tecidos e resultando em manifestações como

meningite e osteomielite (RUBENS et al., 1991; LINDAHL et al., 2005). É importante

ressaltar que alguns estudos afirmaram que esse foco infeccioso no líquido

amniótico também pode ocorrer através de membranas fetais intactas (KATZ;

BOWES, 1988; GIBBS et al., 2004). Já a infecção de início tardio ocorre entre sete

dias e três meses de idade, sendo mais comum meningite e septicemia (GIBBS et

al., 2004). A patogênese dessa infecção é pouco conhecida, principalmente porque

pode afetar neonatos nascidos após um período gestacional normal (SCHUCHAT,

2001), porém se afirma que tanto a transmissão vertical (materno-infantil) quanto a

transmissão horizontal (profissionais de saúde) sejam prováveis focos dessa doença

(LINDAHL et al., 2005). Geralmente, essa infecção apresenta menor taxa de

mortalidade (2 a 6%), porém alta morbidade, visto que 25 a 50% dos sobreviventes

desenvolvem sequelas neurológicas permanentes, cegueira, surdez, hidrocefalia e

perda da audição (TUROW, 2000).

Alguns fatores de risco maternos aumentam a probabilidade de infecção. O

fator mais importante é a colonização por EGB, principalmente entre a 35ª e 37ª

semanas de gestação (GIBBS et al., 2004). Além desse fator, incluem-se mulheres

negras, idade jovem (menor que 20 anos), histórico de filho com doença invasiva por

EGB, aborto espontâneo, múltiplas gestações, bacteriúria por EGB durante a

gestação, filho de baixo peso, trabalho de parto prematuro (menos de 37 semanas),

ruptura prolongada de membranas antes do trabalho de parto e do parto (superior ou

igual a 18 horas), monitoramento intra-uterino prolongado, corioamnionite, febre

intraparto superior ou igual a 38 °C e baixos nívei s de anticorpos maternos contra

polissacarídeos capsulares ou proteínas superficiais (GIBBS et al., 2004; LINDAHL

et al., 2005).

30

Geralmente, a ocorrência de infecções estreptocócicas invasivas depende

de características bacterianas, como a capacidade de produzir fatores de virulência

e das condições do hospedeiro, como a deficiência do sistema imune ou a falta de

anticorpos contra a bactéria como resposta da imunidade adaptativa. Assim como

outras espécies de estreptococos, S. agalactiae é extremamente hábil em colonizar

e causar infecções em seu hospedeiro. Isso se deve a sua eficiência em realizar os

mecanismos essenciais da patogênese: adesão a superfícies teciduais e mucosas;

competição com a microbiota; invasão, principalmente no epitélio alveolar e

endotelial e multiplicação no sítio de infecção. Conforme supracitado, toda essa

habilidade de S. agalactiae decorre de sua capacidade em produzir diversos fatores

de virulência, sendo os mais estudados, a cápsula, a proteína ligadora de laminina,

as proteínas alfa e beta, as proteínas ligadoras de fibronectina, a C5a peptidase, as

proteínas superficiais ancoradas à LPXTG (domínio protéico altamente conservado),

a hialuronidase e a hemolisina (CylE) (MITCHELL, 2003) (FIGURA 1).

S. agalactiae, além de ser classificado dentro do grupo B de Lancefield,

pode ser subdividido em sorotipos de acordo com o tipo imunogênico apresentado

pelos polissacarídeos capsulares dos isolados. A cápsula é um importante fator de

virulência de EGB, visto que apresenta função antifagocítica. Ou seja, é um

elemento que confere proteção ao microrganismo contra a deposição de fragmentos

opsonizantes C3b do sistema complemento, os quais sinalizam a migração de

células de defesa do sistema imune ao sítio de infecção (MARQUES et al., 1992).

Além da cápsula, algumas proteínas superficiais são consideradas

relevantes fatores de virulência. A proteína ligadora de laminina (Lmb), codificada

pelo gene lmb, é uma lipoproteína similar a adesinas (estruturas ligantes à matrix

extracelular). Alguns pesquisadores relataram a importância direta ou indireta dessa

proteína na dinâmica de colonização e invasão de EGB. Porém, nem todos os

isolados de S. agalactiae expressam essa proteína. (SPELLERBERG et al., 1999;

LINDAHL et al., 2005).

O primeiro antígeno de superfície identificado em S. agalactiae foi o antígeno

C, antes designado Ic e atualmente reconhecido como uma fração protéica presente

em alguns sorotipos. Com a caracterização do antígeno C, foi verificado que essa

proteína superficial é composta por outros dois componentes protéicos não

relacionados, as proteínas alfa e beta, que também compõem a gama de fatores de

virulência de EGB. O papel da proteína alfa na patogênese é pouco conhecido,

31

havendo relatos de que a inibição do gene que codifica o antígeno alfa-C atenua a

virulência de EGB (MITCHELL, 2003) e que há participação dessa proteína na

indução da resposta imune no hospedeiro (LINDAHL et al., 2005). Já a proteína beta

interage com diferentes componentes do sistema imune, IgA-Fc sérica e fator H

(uma proteína reguladora da via alternativa do sistema complemento), contribuindo

com mecanismos de escape do patógeno frente ao sistema imune do hospedeiro.

Pesquisadores ainda sugerem que a proteína beta também apresente propriedade

imunogênica (LINDAHL et al., 2005).

FIGURA 1 – ILUSTRAÇÃO DOS PRINCIPAIS FATORES DE VIRULÊNCIA DE S. agalactiae

FONTE: Adaptado de MITCHELL, T. J. (2003) NOTA: Lmb representa uma proteína ligadora de laminina1, ancorada a proteínas transportadoras da família ABC. PavA-like e FbsA representam proteínas ligadoras de fibronectina2. (1) Lipoproteína componente da membrana basal. (2) Glicoproteína que auxilia a adesão das células do hospedeiro à matriz extracelular.

O componente alfa é codificado pelo gene bca e pode variar quanto à

quantidade de cadeias polipeptídicas constituintes. O gene bac codifica o

componente beta, expresso como uma proteína ancorada à peptideoglicana através

de um motif denominado LPXTG (MITCHELL, 2003; DORAN; NIZET, 2004).

32

A função das proteínas ligadoras de fibronectina (FBP) na virulência de

S. agalactiae tem sido relacionada à invasão do microrganismo (GUTEKUNST et al.,

2004). Existem diversas FBPs no genoma de EGB, a exemplo de uma delas

encontra-se a proteína ligadora de fibronectina FbsA, a qual se afirma contribuir na

resistência à fagocitose, já que protege EGB da opsonização (MITCHELL, 2003;

LINDAHL et al., 2005).

Ainda quanto às proteínas de superfície representantes de virulência,

S. agalactiae possui uma proteína com atividade enzimática: a C5a peptidase

(ScpB). Essa enzima, codificada pelo gene cromossomal scpB, é uma serino-

protease capaz de clivar o fator C5a do sistema complemento, o qual é responsável

pelo recrutamento de neutrófilos ao sítio infeccioso (CHMOURYGUINA et al, 1996;

MITCHELL, 2003). Estudos apontaram ainda que a C5a peptidase pode se ligar à

fibronectina e que colabora com a adesão e invasão de células epiteliais (CHENG et

al., 2002). Outro fator de virulência com atividade enzimática secretado por EGB é a

hialuronidase, que se constitui em uma proteína com atividade hidrolítica sobre o

ácido hialurônico, um polímero importante de glicosaminoglicana encontrado na

matriz extracelular de tecidos animais. Afirma-se que essa degradação facilita a

disseminação do patógeno pelo tecido e fornece nutrientes após a lise do ácido

hialurônico. A hialuronidase é codificada pelo gene hyl, expressa em altos níveis em

amostras do sorotipo III e em isolados de infecções invasivas (HYNES; WALTON,

2000).

Outro fator de virulência relevante em S. agalactiae é a hemolisina (CylE),

proteína responsável pela reação de beta-hemólise de EGB em meio de ágar

sangue. Afirma-se que a produção de hemolisina esteja associada à invasão e

lesões no epitélio pulmonar (NIZET et al., 1996) e endotelial (GIBSON et al., 1999).

Além disso, CylE pode estimular a produção de óxido nítrico em macrófagos (RING

et al., 2000), a apoptose dessas células (HENNEKE et al., 2002), a liberação de

interleucina-8 e a hipotensão arterial (DORAN et al., 2002). A ação citolítica e pró-

inflamatória de EGB pode ser inibida pelo principal componente do surfactante

pulmonar, a dipalmitoil fosfatidilcolina, o que pode explicar, em parte, a maior

suscetibilidade do prematuro à doença invasiva, já que este possui esta substância

em menor quantidade (DORAN et al., 2002). Ressalta-se também que algumas

estirpes bacterianas de EGB não produzem beta-hemólise e geralmente são

isoladas de bovinos. Outro fator que pode contribuir com a invasão celular é o

33

chamado fator CAMP, uma proteína extracelular que forma poros e provoca lise de

membranas celulares do hospedeiro (SPELLERBERG, 2000).

Um aspecto importante e que confere grande virulência é a evasão

imunológica, ou seja, a presença de mecanismos que dificultam o reconhecimento

de EGB pelo hospedeiro. A capacidade de sobreviver por longos períodos dentro de

lisossomas de macrófagos, a produção da enzima superóxido-dismutase e de um

pigmento carotenóide, que protegem contra o estresse oxidativo e a inibição da

atividade do sistema complemento, reduzem ainda mais a capacidade de

reconhecimento e ativação dos mecanismos de defesa do hospedeiro,

especialmente de recém-nascidos prematuros (SPELLERBERG, 2000).

Assim como em outras espécies de estreptococos, principalmente

S. pyogenes e S. pneumoniae, o arsenal de virulência de S. agalactiae é completo,

extremamente evoluído e competente para causar infecções graves, especialmente

em indivíduos que não disponham de um sistema imune maduro e adequado.

Entretanto, ainda há necessidade de muitos estudos para melhor elucidar os

mecanismos e funções desse arsenal.

2.4 EPIDEMIOLOGIA: UMA VISÃO MUNDIAL

A emergência de graves infecções perinatais por S. agalactiae na década de

1970 instigou a realização de inúmeros estudos, principalmente em busca de

estratégias de prevenção. Em vista disso, em 1996 foi publicado pelo CDC um

consenso das primeiras diretrizes de prevenção.

Durante as décadas de 1980 e 1990, a grande maioria dos estudos

realizados nessa temática introduzia-se da mesma forma: “Estreptococos do grupo B

é a principal causa de infecções neonatais no mundo”. Após anos de pesquisa

atribuídos ao tema e à atualização das estratégias de prevenção, o questionamento

tornou-se evidente: “S. agalactiae continua sendo a causa principal de septicemia e

meningite em neonatos”?

Pesquisadores norte-americanos possuem um sistema bem desenvolvido de

vigilância denominado Active Bacterial Core surveillance (ABCs), pertencente ao

Programa Rede de Infecções Emergentes, o qual tem colaboração do CDC, das

34

secretarias estaduais de saúde e de universidades de dez estados dos EUA. Esse

sistema ABCs recentemente permitiu um estudo realizado por Phares e

colaboradores (2008), o qual revelou o perfil estatístico das infecções por

S. agalactiae nos EUA durante o período de 1999-2005. Essa pesquisa estimou a

ocorrência de incidência de 7,2 casos para cada 100.000 pessoas, em 2005, sendo

estimado ainda, que EGB possa ter causado 21.500 casos de doença e 1.700

mortes nesse mesmo ano.

2.4.1 Infecções por S. agalactiae em neonatos

Após a aplicação das primeiras diretrizes de prevenção, a incidência da

doença de início precoce nos EUA diminuiu aproximadamente 68%; de 1,7 casos

por 1.000 nascimentos em 1993 para 0,6 casos por 1.000 nascimentos em 1998

(SCHRAG et al., 2000; 200b). Com a implantação do consenso de 2002, a

incidência passou a ser de 0,34 casos por 1.000 nascimentos em 2003-2005

(PHARES et al., 2008). Apesar da incidência dessa doença ter diminuído

S. agalactiae ainda permanece como importante causa de infecção neonatal nos

EUA, principalmente pelo fato de que esse decréscimo não vem ocorrendo

gradativamente e aumentos sutis na incidência foram observados nos últimos anos

de estudo (PHARES et al., 2008).

Outro resultado interessante revelou que a incidência da doença foi maior

entre os recém-nascidos negros, fato que confirma a continuidade desse fator de

risco. Além disso, a maioria dos recém-nascidos que adquiriu infecção nasceu

prematura e apresentou septicemia (PHARES et al., 2008). Mulheres negras exibem

uma colonização vaginal e anorretal por EGB mais densa, o que poderia explicar o

aumento do risco e da incidência de infecção nesse grupo. Os recém-nascidos

prematuros, principalmente de idade gestacional igual ou inferior a 34 semanas,

mostram-se mais susceptíveis à infecção devido ao fato de que o transporte

transplacental de imunoglobulinas classe G maternos apresenta-se reduzido no

período gestacional precoce (SCHUCHAT, 1998).

A doença neonatal de início tardio demonstra maior complexidade. Apesar

de incomum sua incidência continua estável, apresentando uma taxa média de 0,34

casos por 1.000 nascimentos (2003-2005), similar a doença de início precoce

35

(PHARES et al., 2008). A análise de taxas de incidência em estudos a partir de 1990

sugere que a estratégia de prevenção utilizada na doença de início precoce, isto é, a

terapia antimicrobiana intraparto, não previne a doença de início tardio (SCHRAG et

al., 2000).

A meningite continua sendo a principal manifestação clínica da infecção

neonatal tardia e os recém-nascidos pré-termos também são os alvos mais

incidentes dessa infecção (PHARES et al., 2008).

2.4.2 Infecções por S. agalactiae em parturientes

Estudos internacionais demonstram que as infecções em gestantes

apresentaram um declínio sutil desde a implantação das estratégias de prevenção:

de 0,29 casos por 1.000 nascimentos (SCHRAG et al., 2000) para 0,11 a 0,14 casos

por 1.000 nascimentos (PHARES et al., 2008). O maior número dos casos de

infecção por EGB em parturientes foi associado ao trato genital superior, placenta ou

saco amniótico, resultando em morte fetal (PHARES et al., 2008). O aborto

espontâneo mostrou-se o principal evento obstétrico em consequência da infecção

(PHARES et al., 2008). Além disso, a maioria das gestantes não apresentou co-

morbidades ou comportamentos de risco (diabetes, obesidade, fumo, uso de álcool e

drogas de abuso) (PHARES et al., 2008).

Além de parturientes, as puérperas também podem apresentar septicemia,

meningite, infecções de ferida cirúrgica, celulite, fasciíte, osteomielite e endocardite

por EGB (SCHUCHAT, 1998).

Yancey e colaboradores (1996) realizaram um estudo prospectivo, o qual

investigou os fatores de risco associados à infecção periparto em uma população de

gestantes com cultura vaginal para S. agalactiae. A colonização por EGB, a ruptura

de membranas fetais com duração de mais de seis horas, o monitoramento

intrauterino sob um período maior que 12 horas e os exames vaginais antecedentes

ao parto por mais de seis vezes foram as variáveis independentes e de risco para

corioamnionite reveladas nesse estudo.

36

2.4.3 Infecções por S. agalactiae em adultos não-gestantes

O perfil estatístico de infecções por S. agalactiae mais preocupante nos

últimos anos foi constatado por estudos realizados nos EUA em adultos não-

gestantes, os quais evidenciaram um aumento de 32% na incidência de infecção

nessa população no período de 1999-2005, resultando em 7,9 casos por 100.000

pessoas em 2005. Sabe-se que, as infecções por EGB ocorrem naqueles adultos

que apresentam certos fatores de risco peculiares, principalmente doenças crônicas

e faixa etária elevada.

Estudos de vigilância realizados principalmente nos EUA, em um período

cronológico de 1991 a 2005, verificaram que houve um aumento gradativo na idade

média de adultos acometidos pela infecção por EGB, inferindo que a senilidade é um

importante fator de risco (SCHWARTZ et al., 1991; FARLEY et al., 1993; JACKSON

et al., 1995; EDWARDS; BAKER, 2005). Além da decrepitude, as co-morbidades

também são relevantes fatores de risco associados à infecção por EGB. Schwartz e

colaboradores (1991) e Farley (1993) e colaboradores estimaram que pessoas

diabéticas ou com neoplasia maligna apresentam maior risco de infecção quando

comparadas a outros adultos. Entretanto, um achado interessante em ambos os

estudos mostrou que os adultos com idade entre 20 e 64 anos foram mais

susceptíveis à infecção do que os adultos com faixa etária mais avançada. E em

pesquisa mais recente, 88% dos adultos com infecção apresentaram pelo menos

uma co-morbidade, como diabetes mellitus, doença cardíaca, câncer,

imunossupressão, obesidade, desordens neurológicas, doenças renais, hepáticas ou

pulmonares (PHARES et al., 2008).

No período de 1999-2005, houve um aumento significativo na incidência de

infecção por EGB em adultos de duas faixas etárias distintas: a) aqueles com idade

entre 15 e 64 anos, cuja incidência aumentou de 3,4 para 5,0 casos por 100.000

pessoas; e b) adultos com idade igual ou superior a 65 anos, cujo aumento foi de

21,5 para 26,0 casos por 100.000 pessoas. Os resultados ainda mostraram que

esse grupo demonstrou mais suscetibilidade à infecção, já que a taxa de mortalidade

foi maior, porém o aumento da incidência foi mais significativo em adultos inseridos

na primeira faixa etária (PHARES et al., 2008).

Em adultos não-gestantes, a manifestação clínica mais importante é a

bacteremia sem foco evidente. No entanto, infecções de pele e tecidos moles,

37

pneumonia, osteomielite, artrite, peritonite, abscesso e vaginite em mulheres

também são incidentes (PHARES et al., 2008). Pesquisas conduzidas por Farley e

colaboradores (1993) e Jackson e colaboradores (1995) apontaram que 32% e 26%

dos pacientes com bacteremia por EGB, respectivamente, também apresentaram

outro microrganismo isolado do sangue. Entre os microrganismos mais comuns

foram mencionados estafilococos e enterococos.

Estudos apontaram que o sexo é uma variável independente, podendo

homens e mulheres não-gestantes ser igualmente infectados. No entanto, a

incidência entre os negros mostrou-se particularmente alta (SCHWARTZ et al., 1991;

FARLEY, 1993, 2001).

Em um período de sete anos de estudo foi observada uma variabilidade

sazonal na incidência de infecção por EGB em adultos. Ocorreram aumentos

periódicos e consideráveis no último mês do verão, além de decréscimos durante a

estação de inverno de cada ano avaliado (PHARES et al., 2008).

A gama substancial de trabalhos epidemiológicos de grande impacto

envolvendo a temática S. agalactiae provém de pesquisadores norte-americanos e

europeus, uma vez que possuem competentes programas de vigilância e prevenção.

O aparecimento das infecções por EGB, assim como por outros

microrganismos, depende consideravelmente de fatores como acompanhamento

pré-natal, eficácia nos procedimentos de diagnóstico, presença de profissionais

qualificados, medidas preventivas e intervenções médicas rápidas. Dependendo das

condições sócio-econômicas e da política de saúde pública adotada pelo país, a

aplicabilidade desses fatores pode variar entre diferentes instituições e hospitais.

Essas considerações corroboram numa variabilidade epidemiológica, sobretudo em

medidas de frequência (prevalência, incidência, morbidade e mortalidade) de cada

região. Frequentemente se observa que as incidências de infecções por EGB são

mais elevadas em populações com qualidade de vida precária (SCHUCHAT;

WENGER, 1994). Além disso, em países que não apresentam programas

sistemáticos de vigilância, torna-se difícil obter informações epidemiológicas.

Em comparação com os países desenvolvidos, poucos estudos foram

realizados em países emergentes e menos desenvolvidos. Apesar das diferenças

social, cultural, econômica e educacional existentes entre esses países, a avaliação

da prevalência de colonização por EGB indicou medidas similares de frequência,

essencialmente quando as metodologias de isolamento e identificação foram

38

adequadas (WALSH; HUTCHINS, 1989; STOLL; SCHUCHAT, 1998). Ao contrário

dessa similaridade de colonização, dados de frequência de infecção não têm se

mostrado semelhantes, sobretudo quando comparados com países menos

desenvolvidos. Pesquisadores sul-africanos estimaram uma incidência para doença

neonatal precoce de 2,06 casos por 1.000 nascimentos e de 1,00 casos por 1.000

nascimentos para doença neonatal tardia, bem como taxas de mortalidade de 19,8%

e 13,6%, respectivamente (MADHI et al., 2003). Esse cenário confirma que as

diferenças sócio-econômicas contribuem com resultados epidemiológicos distintos e

que há necessidade de intervenções médicas, vigilância e estudos nessas regiões.

2.5 NO BRASIL S. agalactiae É UM PATÓGENO EMERGENTE?

No Brasil e em países da América Latina há limitada produção científica

nessa temática. A maioria das pesquisas a respeito de S. agalactiae realizadas no

Brasil concentra-se em centros universitários, principalmente do Rio de Janeiro e

São Paulo.

Os dados epidemiológicos brasileiros de infecções por S. agalactiae não são

bem conhecidos. Não existe um programa de vigilância específico para averiguar

casos e mortes por essas infecções na população. Em geral, estudos pontuais

mostraram que a prevalência de colonização e a incidência de infecção em neonatos

e parturientes têm-se apresentado semelhantes aos países desenvolvidos (EL

BEITUNE et al., 2006; ZUSMAN et al., 2006; SIMÕES et al., 2007). Diferenças de

suma importância foram observadas nas taxas de mortalidade e morbidade. Em

estudos brasileiros, essas taxas apresentaram-se maiores, entre 20 e 60%, quando

comparadas com de países do hemisfério norte (aproximadamente 7,9% nos EUA,

por exemplo) (MIURA; MARTIN, 2001; VACILOTO et al., 2002; PHARES et al.,

2008).

Um estudo realizado em Ribeirão Preto, SP, investigou uma população de

261 recém-nascidos que manifestaram desordem respiratória. Destes, 31

apresentaram bacteremia confirmada. Quanto aos agentes etiológicos, 70,9% e

29,1% dos isolados foram bactérias gram-positivas e gram-negativas,

respectivamente, sendo que EGB esteve presente em 19,4% dos casos de infecção

39

confirmados (MUSSI-PINHATA, 2004). Esse trabalho demonstrou que esse

patógeno realmente é importante em neonatos pertencentes à população brasileira.

As pesquisas localizadas inferem que as infecções por EGB no Brasil são

relevantes, sendo de suma importância que programas de vigilância sejam

implantados em todos os estados do país, a fim de se acompanhar o perfil

epidemiológico desse microrganismo.

2.6 A IMPORTÂNCIA DOS SOROTIPOS DE S. agalactiae

Baseado em variações na estrutura e composição de polissacarídeos

capsulares e nas respostas imunogênicas distintas, os sorotipos de S. agalactiae

foram também identificados inicialmente por Rebecca Lancefield (LANCEFIELD,

1933; LANCEFIELD; HARE, 1935). Atualmente, têm sido descritos nove sorotipos

diferentes, a saber, Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII e VIII, os quais todos têm associação

com infecções humanas (JENNINGS et al., 1981, 1983a; 1983b; WESSELS et al.,

1987, 1989, 1991; VON HUNOLSTEIN et al., 1993; KOGAN et al., 1995, 1996).

Polissacarídeos extracelulares são características comuns em bactérias

gram-positivas e gram-negativas. Essas macromoléculas são importantes para

proteção contra condições do meio e do hospedeiro que podem ser prejudiciais à

sobrevivência do microrganismo. A capacidade de mimetizar estruturas do

hospedeiro e de intervir com vias de ativação do sistema complemento define esses

polissacarídeos como potentes fatores de virulência (EDWARDS et al., 1982;

HAYRINEN et al., 1989).

Estreptococos do grupo B, assim como outras bactérias gram-positivas,

apresentam uma parede celular espessa sob um arranjo complexo de cadeias

constituídas por peptideoglicana, carboidratos, ácido teicóico, lipoteicóico e

proteínas. A peptideoglicana é composta pelos monômeros elementares ácidos N-

acetilglicosamina e N-acetilmurâmico, e também por carboidratos redutores como

glicose, galactose e ramnose (KONEMAN et al., 2005). Além dessa estrutura básica,

estreptococos possuem um complexo polissacarídico grupo específico. Segundo o

sistema de classificação de Lancefield, a espécie S. agalactiae é constituída pelo

antígeno de grupo B. Esse complexo antigênico, de forma simplificada, é formado

40

por uma cadeia oligossacarídica principal composta por ramnose, glucitol (poliol) e

fosfato e por cadeias trissacarídicas laterais, compostas por ramnose, galactose e N-

acetilglicosamina, às quais estão ligadas a ramnose da cadeia principal

(PRITCHARD et al., 1984; MICHON et al., 1987).

A variação estrutural de S. agalactiae não se resume somente ao antígeno

grupo-específico B, havendo a presença de outro complexo polissacarídico,

localizado na região externa à parede celular que representa a cápsula. Essa

estrutura apresenta composição variável e é o que determina os nove tipos

sorológicos de EGB já descritos. De maneira geral, todos os sorotipos de

S. agalactiae são constituídos por unidades polissacarídicas repetidas que formam

um polímero linear composto pelos monômeros galactose, glicose e ácido N-

acetilneuramínico (ácido siálico), sendo este último localizado na porção terminal da

cadeia. Exceto nos sorotipos VI e VIII, N-acetilglicosamina também está presente.

Somente o sorotipo VIII possui a ramnose formando as unidades repetidas

(CIESLEWICZ et al., 2005). Substituindo N-acetilglicosamina, o sorotipo V possui 2-

acetamido-2-deoxi-D-glicose (WESSELS et al., 1991) (FIGURA 2).

Embora a composição dos carboidratos seja estreitamente semelhante e

conservada, a estrutura tridimensional, a posição das ligações glicosídicas e o

número de monossacarídeos na cadeia são variáveis, o que contribuem para as

diferenças antigênicas. Essas distintas estruturas capsulares de EGB são formadas

pela polimerização de nove tipos de unidades polissacarídicas repetidas. Essa

polimerização ocorre através de reações de acetilação entre os carboidratos,

formando ligações glicosídicas em determinadas posições (1, 2, 3, 4 ou 6). A análise

dos nove sorotipos revelou a presença de dois motifs básicos, isto é, regiões

genômicas altamente conservadas. Um motif foi representado pela cadeia

dissacarídica galactose-glicose, o qual se encontra em oito dos nove sorotipos. O

outro motif foi demonstrado pela cadeia trissacarídica variável ácido N-

acetilneuramínico-galactose-N-acetilglicosamina, o qual constitui a maioria dos

sorotipos, exceto Ib, VI e VIII. Além desses motifs, outras características

apresentam-se intimamente relacionadas entre os sorotipos, por simples

substituição ou por ausência e presença de ligações glicosídicas (FIGURA 2).

No contexto molecular, essa variedade limitada dos antígenos

polissacarídicos é codificada e sintetizada por um conservado cluster gênico (cps)

presente no cromossomo de S. agalactiae. Genes que codificam as enzimas

41

glicosiltransferases, polimerases, ácido siálico sintetases, sialiltransferases e

proteínas que exportam os polissacarídeos capsulares, são constituintes desse

cluster (CIESLEWICZ et al., 2005).

FIGURA 2 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS UNIDADES

POLISSACARÍDICAS REPETIDAS DOS NOVE SOROTIPOS CAPSULARES DE S. agalactiae.

FONTE: Adaptado de CIESLEWICZ, M. J. et al. (2005) NOTA: As setas menores indicam a direção de polimerização e as maiores indicam a estreita relação entre as unidades polissacarídicas repetidas. β-D-Gal-p (em vermelho), β-D-Glc-p (em azul), β-L-Rha-p (em verde), α-D-Neu-pNAc (em rosa e preto) e α-D-Glc-pNAc (em azul e preto) representam galactose, glicose, ramnose, ácido N-acetilneuramínico e ácido N-acetilglicosamina, respectivamente.

Os determinantes imunogênicos, como os carboidratos e o ácido siálico, não

são os únicos componentes que contribuem para o aparecimento de reações

42

cruzadas. Alguns sorotipos possuem em comum certas proteínas de superfície, que

também se apresentam altamente imunogênicas e podem favorecer esse tipo de

reação. Entre elas encontram-se as proteínas C (alfa e beta), proteínas C alpha-like

2 e 3, proteínas R, X e proteína Rib. Estudos relataram que essas proteínas

apresentam associação com os sorotipos capsulares (KONG et al., 2002; LINDAHL

et al., 2005).

O antígeno C consiste em um complexo protéico composto pelas proteínas

alfa e beta, sendo que esta se apresenta resistente ao tratamento com a protease

tripsina e aquela se mostra sensível (JOHNSON; FERRIERI, 1984). Esse antígeno

de superfície é considerado fator de virulência, uma vez que sua presença pode

conferir a célula bacteriana resistência à fagocitose e à morte intracelular por

polimorfonucleares da resposta inata. Aproximadamente 60% dos sorotipos Ia, Ib e II

contêm um ou ambos componentes proteicos do antígeno C. Já para o sorotipo III

apenas cerca de 1% possuem esse(s) componente(s) (DORAN; NIZET, 2004).

A proteína Rib, assim denominada por Stalhammar-Carlemalm (1993), foi

detectada em inúmeras amostras do sorotipo III, sendo incomum nos demais

antígenos capsulares. Apresenta-se antigenicamente distinta das proteínas C e é

resistente às proteases tripsina e pepsina (KONG et al., 2002).

Frequentemente, amostras não tipáveis de EGB são encontradas, sobretudo

em isolados de animais. Um estudo apontou que 2,9% dos colonizantes e 1,4% dos

isolados invasivos nos EUA mostraram-se não tipáveis (BENSON et al., 2002). Já

outras pesquisas no México (12%), Canadá (13%), Nova Zelândia (8,7%) e Brasil

(17,4%), por exemplo, apresentaram proporções diferentes de amostras não tipáveis

(PALACIOS et al., 1997; TYRRELL et al., 2000; KONG, et al., 2002; SIMOES et al.,

2007), denotando a diversidade geográfica que existe entre as linhagens de

S. agalactiae. Entretanto, ressalta-se que nesses estudos foram utilizados métodos

fenotípicos de sorotipagem.

Estudos moleculares revelaram uma considerável heterogeneidade genética

entre amostras não tipáveis de EGB. Há indícios de que a distribuição gênica do

cluster cps afeta esses resultados, uma vez que esse locus compreende regiões

conservadas iniciais e terminais, relacionadas respectivamente, às enzimas ligadas

ao ácido siálico e às proteínas que exportam o polissacarídeo capsular; bem como a

regiões centrais variáveis que contêm os genes sorotipo específico (CIESLEWICZ et

al., 2005). Pesquisadores sugerem que o fenótipo não-tipável pode surgir a partir de

43

mutações ou inserções em genes da região variável do cluster cps (SELLIN et al.,

2000; KONG et al., 2008), de recombinação gênica nessa região (RAMASWAMY et

al., 2006), da diminuição na síntese dos polissacarídeos capsulares (PALACIOS et

al., 1997) ou do fenômeno chamado variação de fase, o qual produz linhagens com

modificação ou ausência de cápsula (CIESLEWICZ et al., 2001). A impossibilidade

de identificar amostras não tipáveis de EGB pelo método convencional (sorológico)

necessita de uma investigação mais complexa, através de métodos moleculares

como tipificação, amplificação e sequenciamento de DNA. No âmbito prático, essa

identificação mais detalhada permite a subdivisão de EGB em vários sorovariantes,

facilitando estudos epidemiológicos, patogenéticos e, sobretudo para produção de

vacinas.

Pesquisadores dinamarqueses e australianos recentemente propuseram um

novo sorotipo de S. agalactiae, denominado sorotipo IX (SLOTVED et al., 2007). As

amostras foram obtidas de humanos residentes da Dinamarca, Canadá, Alemanha,

Hong Kong e Sydney (Austrália). A princípio não apresentaram reação com a

maioria dos nove anti-soros conhecidos. Outros métodos fenotípicos foram

realizados, porém sem sucesso. Técnicas moleculares foram utilizadas para

identificar proteínas de superfície e sorotipos. Estruturas proteicas comuns a

determinados antígenos capsulares já descritos foram detectadas nessas amostras,

entretanto, diferenças significativas no cluster gênico cps também foram

identificadas. As inferências que sustentam a proposta dos pesquisadores referem-

se à ampla distribuição geográfica das amostras por pelo menos 20 anos e ao

ineditismo da sequência gênica do cluster cps presente na mesma localização e em

todas as cepas investigadas (SLOTVED et al., 2007).

A identificação dos sorotipos de EGB tem sido relevante à investigação

epidemiológica e à produção de vacinas, pelo fato da distribuição desses sorotipos

variar de acordo com a região geográfica, origem étnica, patologia desenvolvida e

perfil de resistência aos antimicrobianos.

Estudos realizados em diversos países têm revelado prevalências diferentes

entre os sorotipos. Geralmente os antígenos capsulares Ia, III e V foram os mais

comumente isolados (ANDREWS et al., 2000; PERSSON et al., 2004; UH et al.,

2004). Entretanto, o sorotipo II tem sido mais isolado em países da América Latina

(LOPARDO et al., 2003; PALACIOS et al., 2005). Curiosamente, os polissacarídeos

tipo VI e VIII foram identificados predominantemente em gestantes no Japão

44

(LACHENAUER et al., 1999), embora existam raros relatos em outros países

(SENSINI et al., 1997; PAOLETTI et al., 1999; LEE et al., 2000).

Quando S. agalactiae emergiu como um importante patógeno em doenças

neonatais, amostras do sorotipo III prevaleceram como causa dessas graves

infecções, sobretudo em meningite e doença neonatal de início tardio. Os antígenos

capsulares Ia e V também têm sido relevantes causas de infecções invasivas

(BAKER; BARRETT, 1974; BLUMBERG et al., 1996; HARRISON et al., 1998; LIN et

al., 1998; KALLIOLA et al., 1999).

O sorotipo V tem sido associado à presença de resistência à eritromicina e à

clindamicina em isolados de EGB (BLUMBERG et al., 1996; DIEKEMA et al., 2003).

Esses antimicrobianos são recomendados para o tratamento e prevenção de

infecções por EGB, especialmente em pacientes alérgicos aos beta-lactâmicos.

A importância de se identificar e classificar os polissacarídeos capsulares de

S. agalactiae tem sido extensivamente discutida. Várias metodologias foram

desenvolvidas para essa finalidade, incluindo imunoprecipitação (WILKINSON;

MOODY, 1969), ensaio imunoenzimático (HOLM; HAKANSSON, 1988),

coaglutinação (HAKANSSON et al., 1992), contraimunoeletroforese (TRISCOTT;

DAVIS, 1979), precipitação capilar (LANCEFIELD, 1933), aglutinação em látex

(ZUERLEIN et al., 1991) e microscopia fluorescente (CROPP et al., 1974). Todas

essas técnicas são trabalhosas e requerem altos títulos de anti-soros específicos

para se obterem bons resultados. Atualmente, métodos moleculares baseados em

PCR e sequenciamento têm sido desenvolvidos, uma vez que oferecem

reprodutibilidade e alto poder discriminatório (KONG et al., 2002).

2.7 PREVENÇÃO, PROFILAXIA E TRATAMENTO DE INFECÇÕES

A maioria das infecções por EGB pode ser prevenida através da profilaxia

antimicrobiana intraparto