caracterizaÇÃo de campylobacter spp. isoladas em … · 2016-04-25 · ii janaina costa feistel...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
CARACTERIZAÇÃO DE Campylobacter spp. ISOLADAS EM
CARCAÇAS DE FRANGO
Janaina Costa Feistel
Orientador (a): Profª. Drª. Cíntia Silva Minafra e Rezende
GOIÂNIA
2013
iii
ii
JANAINA COSTA FEISTEL
CARACTERIZAÇÃO DE Campylobacter spp. ISOLADAS EM
CARCAÇAS DE FRANGO
GOIÂNIA
2013
Dissertação apresentada para obtenção do
grau de Mestre em Ciência Animal junto à
Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Área de Concentração:
Sanidade Animal, Higiene e
Tecnologia de Alimentos.
Orientadora:
Profª. Drª Cíntia Silva Minafra e Rezende EVZ-UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Albenones José Mesquita EVZ-UFG
Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau EVZ-UFG
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iv
v
AGRADECIMENTOS
À Deus por guiar os meus passos, pelas forças infinitas que proveu sobre mim
nos momentos tão difíceis e por colocar em meu caminho pessoas especiais que
me auxiliaram ao longo deste projeto.
Aos meus pais, Jussara Feistel e Egon Feistel, por uma vida inteira de amor,
dedicação e o incentivo necessário para a realização dos meus sonhos e para
mais essa etapa de minha vida e carreira profissional. É com orgulho que digo
que os tenho como exemplo e, por mais que a vida me dê títulos, os
ensinamentos que tive em casa nunca serão superados.
Ao meu irmão, Leonardo Hoichen, por fazer parte desta conquista, por acreditar
na minha capacidade de realizar este trabalho, pelos incentivos para melhorar
cada dia mais e pela compreensão nos momentos em que me afastei. Ao José
que me ensinou o que é o amor incondicional pelos animais.
À professora Dra. Cíntia Silva Minafra e Rezende, li uma frase que combina
perfeitamente com você “O verdadeiro Mestre é aquele que prefere dividir o que
possui, a ter somente para si; é aquele que se sente feliz quando percebe que o
caminho que abriu tem sido trilhado por muitos”. Obrigada pela compreensão,
amizade, estímulo para realizar o melhor trabalho possível, paciência nos
momentos de desespero, ajuda nas horas em que as lágrimas teimavam em cair,
pela confiança de que tudo daria certo e pelas horas extras auxiliando na
realização do trabalho, agradeço também à Maria Clara pela preocupação em
cada crise de desespero.
Às minhas irmãs de coração Aline Pedrosa e Marília Cristina, pelo apoio,
companheirismo, ajuda nas análises laboratoriais, nas opiniões para o trabalho
escrito e também pelos momentos de descontração, risadas e fofocas. Sem vocês
a pós - graduação não seria a mesma “Os verdadeiros amigos são poucos, mas
definitivamente o suficiente”.
Agradeço também à Nadielly e aos novos integrantes do grupo Julierme e Natália.
Ao Clauber Enrique pela paciência, persistência, dedicação e carinho
demonstrados durante o longo período que durou esta formação. Agradeço
também à dona Ruth e senhor Clauber Antônio pelo carinho e amizade.
Ao meu grande amigo Marcos Paulo, pelo apoio em todas as fases decisivas
pessoal e profissionalmente, pela paciência, amizade e pelos ensinamentos de
vida.
Aos meus amigos Alessandra Arnez, Fernando Augusto e Osvaldo José por
estarem comigo desde a graduação até a pós-graduação, cada um de nós seguiu
vi
um caminho diferente, porém a distância não consegue mudar o amor e carinho
que tenho por vocês.
À Sandra, ao Magno e aos funcionários e ex-funcionários do laboratório de
Microbiologia do CPA que se disponibilizaram em apoiar de forma incondicional
em todas as fases necessárias para a execução das tarefas programadas durante
o projeto.
Ao Wilson Ricardo e ao Sr. Adair que não mediram esforços para ajudar em
qualquer hora.
Aos técnicos do laboratório de Biologia Molecular do CPA, em especial Bruno e
Ervaldo que tornaram grandes amigos e peças fundamentais para a realização
deste projeto.
À professora Dra Daise Rossi e todos os alunos e funcionários do laboratório
LABIO da Universidade Federal de Uberlândia em especial a Roberta, Mariela,
Eliane, Priscila e Guilherme, por me receberem no laboratório, pela ajuda e pela
amizade.
A todos os Professores da Graduação e do Programa de Pós-Graduação da
Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás o meu mais
sincero respeito e admiração.
Em especial à professora Maria Auxiliadora de Andrade, por todo ensinamento,
por ser a primeira professora a reparar o meu lado tímido, por acompanhar todo o
meu desenvolvimento da graduação até a pós-graduação, pelos trabalhos
avaliados e pela risada mais contagiante de toda a Universidade.
À Coordenação de Pós-Graduação, à Escola de Veterinária e Zootecnia, e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, pela
oportunidade de realização deste trabalho.
OBRIGADA!
vii
Sumário
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 3
2.1. Objetivo geral .................................................................................................... 3
2.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 3
3. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 4
3.1 Histórico, taxonomia e nomenclatura ........................................................... 4
3.2 Morfologia e motilidade .................................................................................... 6
3.3 Propriedades bioquímicas ............................................................................... 8
3.4 Nutrição e resposta a ambientes adversos ................................................ 11
3.5 Mecanismos de respostas a ambientes adversos .................................. 133
3.5.1 Estado VNC .................................................................................................... 15
3.5.2 Sobrevivência em diversas temperaturas ............................................... 16
3.6 Aspectos epidemiológicos de Campylobacter spp. ................................. 20
3.6.1 Reservatórios e fontes de contaminação .............................................. 211
3.6.2 Incidência de campilobacteriose no mundo ......................................... 244
3.6.3 Incidência de Campylobacter spp e campilobacteriose no Brasil ..... 28
3.7 Patogenia ........................................................................................................ 300
3.8 Métodos de detecção de Campylobacter spp. .......................................... 32
3.8.1 Isolamento Bacteriológico Convencional ............................................. 355
3.8.2 Ensaio Imunuenzimático miniVIDAS® .................................................... 388
3.8.3 Sistema API CAMPY .................................................................................. 400
4. MATERIAL E METODOS ................................................................................. 422
4.1 Delineamento experimental ......................................................................... 422
4.2 Ensaios analíticos ......................................................................................... 422
4.3 Identificação bioquímica e enzimática das colônias sugestivas de
Campylobacter spp. pelo sistema API Campy ................................................. 45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 477
6. CONCLUSÕES .................................................................................................. 600
Referências ........................................................................................................... 611
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RESUMO
Os produtos de origem avícola podem veicular diversos microrganismos patogênicos. Nas últimas décadas, o gênero Campylobacter, em especial as espécies termofílicas, destaca-se como um dos principais agentes responsáveis por Doenças Veiculadas por Alimentos (DVA’s). Em decorrência da importância deste patógeno na saúde pública e na economia, pesquisas são realizadas com o objetivo de identificar e caracterizar os isolados, bem como desenvolver e aprimorar as técnicas para a identificação do gênero, permitindo a determinação da prevalência deste patógeno nas principais fontes de veiculação, como a carne de frango. O presente estudo teve como objetivo verificar a ocorrência de Campylobacter spp. e identificar as espécies termofílicas isoladas de carcaças de frango de abatedouros do estado de Goiás submetidos ao Serviço de Inspeção Federal e que possuíam autorização para o comércio interno e externo. Um total de 200 amostras foi avaliado utilizando o ensaio imunoenzimático como triagem, com posterior isolamento bacteriano e identificação por meio da biotipificação. Observou-se que os métodos empregados permitiram a identificação de Campylobacter spp. em 24% (48/200) das amostras avaliadas. Destas, 21 (10,5%) foram comprovadamente positivas para o gênero, tendo por fundamentação o isolamento bacteriano de amostras positivas à triagem e testes de assimilação enzimática, bioquímicas e de perfil antimicrobiano. Campylobacter coli foi a espécie mais isolada (58,6%), seguida por Campylobacter jejuni ssp. jejuni (17,2%), Campylobacter lari (13,8%) e Campylobacter jejuni ssp. doylei (3,4%). Observou-se que alguns isolados sugestivos, por apresentar positividade no teste de triagem, crescimento em meios seletivos, temperatura de incubação, morfologia e motilidade características do gênero em questão, não foram identificados pelo sistema numérico empregado neste estudo e, portanto, foram considerados negativos. Pelos resultados, pode-se concluir que a associação do método de triagem ao isolamento convencional e perfil numérico para biotipificação permitiram melhor identificação dos isolados. Assim, é possível afirmar que Campylobacter spp. foi identificada em carne de frango destinada ao consumo, havendo a descrição de três espécies termofílicas e duas subespécies. A presença deste patógeno confere risco à saúde pública por ingestão de alimentos contaminados e decorrência de doenças gastroentéricas e extraintestinais e em casos mais graves, porém não raros, a síndromes reumatológicas, oftalmológicas e neurológicas. Especificamente as espécies Campylobacter coli e Campylobacter jejuni descritas como de maior interesse em alimentos foram as de maior frequência e relacionam-se à maioria dos casos de campilobacteriose de origem alimentos. Palavras chave: biotipificação, Campylobacter termofílicos, carcaças de frangos.
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ABSTRACT
Poultry products are recognized as sources of contamination by several pathogens. In the last decades the genus Campylobacter, particularly thermophilic species, stands out in developed countries, where it is considered the primary agent responsible for Foodborne Illnesses (DVA's). Due to the importance of this pathogen in public health and economics, researches are conducted in order to identify and characterize the isolated, as well as develop and improve techniques for the identification of the genus Campylobacter spp. with attention focused mainly to important thermophilic species related to food, allowing the determination of the prevalence of this pathogen in main placement sources, such as chicken. The objective of this study was to verify the occurrence of Campylobacter spp. and identify isolated thermophilic species from chicken carcasses in slaughterhouses in the state of Goiás submitted to the Federal Inspection Service which had proper authorization to internal and external trade. A total of 200 samples have been evaluated using the immunoenzymatic screening assay, with subsequent bacterial samples isolation and identification through biotyping. In this study it was observed that the employed methods allowed the isolation of Campylobacter spp. in 24% (48/200) of the assessed samples. Among these samples, 21 (10.5%) were demonstrably positive for genre, having as basis the set of analytical screening method, sequential bacterial isolation for positive samples and evidence of enzymatic and biochemical assimilation and antimicrobial profile. C.coli was the most frequently isolated species (58.6%), followed by C.jejuni ssp. jejuni (17.2%), C.lari (13.8%) and Campylobacter jejuni ssp. doylei (3.4%). By using a screening method, conventional isolation system and numerical biotyping it was immediately revealed the characterization of the isolated Campylobacter. It was observed that some suggestive isolated, due to its positivity in the screening test, growth on selective sources, incubation temperature, motility and morphology, characteristics of the genus assessed, have not been identified by numerical system and thus were considered negative. From the results, it can be concluded that the association of screening method to conventional isolation and biotyping numerical profile allowed a greater understanding of the isolated. It can also be concluded that Campylobacter spp. is present in chicken meat for human consumption and three thermophilic species and two subspecies have been identified. The pathogen presence attests public health risk.
Keywords: biotyping, thermophilic Campylobacter, chicken carcasses.
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é conhecido mundialmente pela capacidade de produção e
industrialização de alimentos, com destaque para a proteína de origem animal,
principalmente a carne de frango. Atualmente, o país é o maior exportador e o
terceiro maior produtor deste alimento, produzindo 13,058 milhões de toneladas
em 2011, apresentando crescimento de 6,8% em relação a 2010. Deste total,
Goiás representou 6,04% da produção nacional (UBABEF, 2012).
Segundo o relatório nacional dos produtores de frango, publicado em 2012,
o consumo interno de carne de frango aumenta consideravelmente a cada ano,
uma vez que o custo desta fonte proteica é menor em comparação às outras
proteínas de origem animal. Neste contexto, observa-se crescente aumento
quanto ao consumo per capita de carne de frango, atingindo 47,4 quilos no último
ano e sendo um novo recorde para o setor do agronegócio.
Em virtude da grande produção e demanda pelo produto, a preocupação
em relação às doenças veiculadas por alimentos têm atenção dos serviços de
vigilância e dos órgãos de saúde pública em diversos países, visto a elevada
ocorrência dos casos. Nos Estados Unidos, estimou-se que 48 milhões de
pessoas adoeceram, 128.000 foram hospitalizadas e 3.000 morreram em
decorrência de DVA’s a cada ano (CDC, 2011).
No Brasil, entre os anos de 2000 e 2011 foram notificados 8.663 surtos de
doenças veiculadas por alimentos, com 163.425 pessoas doentes e 112 óbitos
(BRASIL, 2012), no entanto acredita-se que os dados mencionados estão
subestimados pelas deficiências identificadas nos sistemas de investigação.
Diversos microrganismos patogênicos são conhecidos como agentes
causadores de doenças associadas ao consumo de carne e derivados, com
destaque para Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli
produtora de toxina de Shiga, Yersinia e Campylobacter spp. (EFSA, 2012).
Dentre estes patógenos, o gênero Campylobacter tem se destacado
mundialmente nos últimos anos, sendo as aves as principais fontes de veiculação
ao homem (EFSA, 2005; CDC, 2010; EFSA, 2012). Nos Estados Unidos, em
2010, estimou-se que infecções por Campylobacter spp. afetaram 2,4 milhões de
pessoas (CDC, 2011).
2
Relatórios realizados pela European Food Safety Authority (EFSA, 2011b;
2012) registraram que a taxa de notificação e o número confirmado de
campilobacteriose humana nos países membros da União Europeia aumentou no
ano de 2010 comparado a 2009. Campilobacteriose tem seguido tendência de
aumento significativo desde 2005 e continuou a ser a zoonose mais comumente
relatada, com mais de 200 mil casos confirmados. No entanto, estima-se que, a
cada ano, existam cerca de nove milhões de casos não diagnosticados ou não
relatados de campilobacteriose no mundo.
No Brasil, os dados sobre a prevalência deste microrganismo são variáveis,
em razão dos reduzidos relatos sobre o patógeno e talvez por não possuir
programas de vigilância e notificação obrigatória da campilobacteriose (BRASIL,
2003). No estado de Goiás, sexto produtor de carne de frango do país, poucos
são os registros a respeito da prevalência deste microrganismo.
Diante do exposto, este trabalho pretendeu identificar e biotipificar espécies
termofílicas de Campylobacter spp. em carcaças de aves provenientes de
abatedouros no estado de Goiás.
3
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Verificar a ocorrência de Campylobacter spp. em carcaças de frangos
liberadas para consumo interno e externo.
2.2. Objetivos específicos
Aplicar método de triagem para detecção do patógeno, associado ao
isolamento bacteriano e caracterização fenotípica por perfil numérico.
Caracterizar a frequência de isolamento de Campylobacter spp.
Identificar as espécies termofílicas.
Realizar a biotipificação dos isolados.
4
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Histórico, taxonomia e nomenclatura
Registros de casos de doenças em humanos provocados pela infecção por
Campylobacter spp, são datados desde o ano de 1880 na Alemanha (MOORE et
al., 2005), mas foi em 1886 que o pesquisador Theodor Escherich relatou pela
primeira vez bactérias semelhantes ao gênero Campylobacter em amostras de
conteúdo intestinal de crianças e gatos que apresentaram diarreia e vieram a
óbito. Nestas amostras foram encontradas bactérias de forma espiralada que a
princípio foram denominadas de Vibrio felinus (BUTZLER, 2004).
Por anos, o microrganismo teve sua importância vinculada essencialmente
à clinica médica veterinária. MOORE et al. (2002) relataram que em 1913 foi
reconhecido, em estudos realizados por McFaydean e Stockman, o primeiro
isolamento e identificação da bactéria que estava associada a abortos em ovinos.
Posteriormente, no ano de 1918 foram confirmados quando SMITH (1918) isolou
microrganismos similares em fetos de bovinos e propôs a nomenclatura de Vibrio
fetus, em virtude das características morfológicas. Com isso o microrganismo foi
considerado um importante agente causador de abortos principalmente em
bovinos e ovinos (SMITH & TAYLOR, 1919).
Em 1931, vibrios microaerófilos, foram encontrados em intestino de
bezerros com enterite. Os pesquisadores avaliaram que particularmente o jejuno
era o principal local de infecção do trato intestinal, nomeando o microrganismo de
Vibrio jejuni (JONES et al., 1931a,b). Posteriormente, DOYLE em 1944 isolou um
vibrio da mucosa do cólon de suínos (DOYLE, 1944) e o denominou de Vibrio coli
(DOYLE, 1948).
Ainda, conforme MOORE et al. (2002), em 1947, Vinzent e colaboradores
realizaram a primeira associação de V. fetus em gestantes com aborto infeccioso.
As pesquisas do microrganismo em animais continuaram e no ano de 1953
especialistas encontraram outros víbrios em esperma e suabes vaginais de
bovinos, que se diferenciavam bioquimicamente de V. Fetus, recebendo a
classificação de V. bubulus (TOUVENOT et al., 1954).
5
KING (1957) descreveu um vibrio com várias características semelhantes
ao Vibrio fetus, observado por Vinzent e colaboradores, em 1947, mas com
diferenças bioquímicas e antigênicas. A pesquisadora dividiu estes
microrganismos em dois grupos distintos, sendo que a maioria dos
microrganismos multiplicava-se a 25°C, como o V. fetus, e outros entre 37°C e
42°C, sendo designados como “Vibrio related”, os quais foram todos isolados a
partir de sangue de doentes com gastroenterites.
Ao longo dos anos os microrganismos observados e/ou isolados tiveram a
classificação taxonômica associada ao gênero Vibrio baseado na morfologia
espiralada e/ou encurvada. A correta identificação, bioquímica e taxonômica, era
dificultada pelo fato da bactéria não fermentar nem oxidar carboidratos o que
impossibilitava a realização da maioria das provas bioquímicas que são
geralmente utilizadas para a identificação das bactérias, conforme as descrições
históricas de MOORE et al. (2005).
MOORE et al. (2005) relatam que o gênero Campylobacter foi proposto por
SEBALD & VÉRON, no ano de 1963. Estes pesquisadores englobaram neste
gênero as bactérias antes denominadas de Vibrio fetus, Vibrio jejuni e Vibrio coli e
optaram pela alteração do gênero em decorrência das diferenças metabólicas e
da composição dos pares de bases do material genético.
Na década de 70, com o desenvolvimento de procedimentos para o
isolamento de microrganismos termofílicos, de origem fecal, utilizando
membranas filtrantes foi possível isolar pela primeira vez Campylobacter em fezes
de pessoas doentes (DEKEYSER et al., 1972; BUTZLER, 2004., MOORE et al.,
2005).
VÉRON & CHATELAIN (1973) incluíram novas espécies no gênero
Campylobacter que foram divididas em três grupos diferentes com base nas
características fenotípicas: Campylobacter catalase positivos e H2S negativo,
incluídas as subespécies Campylobacter fetus subsp. fetus e Campylobacter fetus
subsp. venerealis; Campylobacter catalase positivo e H2S positivo tendo como
representantes Campylobacter. coli e Campylobacter jejuni. O terceiro grupo
relacionado à Campylobacter catalase negativo em que Campylobacter sputorum
subsp. bubulus e Campylobacter sputorum subsp. sputorum foram descritas
(VÉRON & CHATELAIN, 1973).
6
SKIRROW descreveu uma metodologia mais simples e direta para
isolamento do microrganismo em amostras fecais com a utilização de ágar
sangue acrescido dos antibióticos: vancomicina, polimixina e trimetoprim
(SKIRROW et al., 2000). Como consequência do aprimoramento do diagnóstico, o
gênero Campylobacter foi reconhecido como a causa mais comum de
gastroenterites em humanos em diversos países e caracterizada como zoonose
por ser transmitida ao homem por diversos animais domésticos (BUTZLER,
2004).
Posteriormente, vários trabalhos foram realizados e novas espécies foram
descritas, entretanto, pesquisadores revelaram que o gênero Campylobacter por
ser bastante heterogêneo e com base nas sequências de rRNA 16S não seria
possível incluir todos em um único gênero havendo a necessidade de subdivisão
em três grupos (THOMPSON et al.,1988). Cada grupo posteriormente foi
reclassificado em gêneros diferentes, sendo o grupo I pertencente ao gênero
Campylobacter, o grupo II ao gênero Helicobacter e o grupo III ao Arcobacter
(VANDAMME et al. 1991).
VANDAMME et al. (1991) revisaram a taxonomia dos grupos e
estabeleceram relações filogenéticas das bactérias dos gêneros Campylobacter e
Helicobacter, os quais fazem parte da família Campylobacteriaceae, sendo criado
outro grupo para enquadrar estes dois gêneros denominado de Super-família
RNA IV ou Epsilonproteobacteria (VANDAMME, 2000).
Atualmente, são descritas mais de 32 espécies e 13 subespécies
pertencentes ao gênero Campylobacter (EUZÉBY, 2010), dentre as quais, as
espécies consideradas termofílicas (Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari e C.
upsaliensis) destacam-se como importantes patógenos veiculados por alimentos e
estão associadas à gastroenterites em humanos (EFSA, 2012), bem como à
distúrbios oftálmicos, reumatológicos e em forma mais grave neuromusculares.
3.2 Morfologia e motilidade
As espécies do gênero Campylobacter são diferenciadas morfologicamente
de outros microrganismos, pois, quando em culturas jovens, são geralmente
encontradas em formas de pequenos bastonetes espiralados ou encurvadas em
forma de vírgula o que confere morfologia vibróide. Quando agrupadas em
7
cadeias de apenas duas células podem apresentar forma similar à asa de gaivota
ou em forma de “S”. Por esta morfologia particular o exame microscópico é um
grande aliado no diagnóstico presuntivo de Campylobacter (VANDAMME et al.,
1991).
As bactérias do gênero Campylobacter são bastonetes Gram negativos,
pequenos e finos com dimensões de 0,2 a 0,5 μm de largura e 0,5 a 8 μm de
comprimento e, devido a isto, podem ser diferenciados de outras bactérias Gram
negativas por meio da técnica de filtragem, com filtro de 0,65 μm (JAY, 2005).
Os microrganismos não formam esporos, são móveis e apresentam um
único flagelo polar em uma ou em ambas as extremidades culminando em
motilidade característica em torno do próprio eixo (movimento do tipo “saca rolha”
ou “vai-e-vem”) (PARK, 2002; SILVA et al, 2007; FRANCO & LANDGRAF., 2008).
A motilidade é fator determinante para a colonização, adesão e invasão
das células intestinais, os flagelos, auxiliam a superar o peristaltismo intestinal e
facilitam a travessia pela camada de muco. Diante disso, a presença de flagelos é
crucial para o desencadeamento da doença, sendo um dos mais importantes
fatores de virulência envolvido na patogênese de Campylobacter spp. (FERRERO
& LEE, 1988).
ZIPRIN et al. (2005) descreveram uma cepa de Campylobacter coli com
alteração na morfologia por apresentar forma de haste reta sem possuir flagelos o
que incapacitou a colonização do ceco de galinhas. GUERRY (2007) mencionou
que mutantes de C. jejuni, imóveis, com flagelo incompleto ou com ausência de
flagelo não conseguem colonizar o trato gastrintestinal ou requerem grandes
quantidades de inóculo, em relação às cepas móveis com flagelo completo.
Embora a motilidade seja essencial para desencadear o processo infeccioso, a
produção de flagelos é essencial para a secreção de proteínas de virulência,
quimiotaxia, formação de micro colônias, formação de biofilmes e nas
propriedades de adesão e invasão.
Quando a bactéria está exposta a situações desfavoráveis a característica
curvada e a morfologia em espiral de Campylobacter dá lugar à forma cocóide
conhecida como VNC (viável não cultivável), uma forma degenerativa utilizada
como estratégia de sobrevivência por muitos microrganismos patogênicos
(BOVILL et al., 1997; ROLLINS et al., 1986; JAY, 2005).
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Avaliando os isolados de Campylobacter spp., observa-se que as colônias
apresentam formato irregular, podendo ser arredondadas ou convexas, com
aspecto úmido em cultura mais jovem ou seco quando a cultura estiver velha, as
colônias geralmente são planas, com coloração cinza ou translúcida, mas esta
característica varia com o meio de cultura utilizado. Ao refletir a luz ambiente a
cultura pode apresentar brilho d’água, além da ausência de reação hemolítica em
ágar sangue já que este microrganismo não possui capacidade de hemólise
(QUINN et al., 2005).
3.3 Propriedades bioquímicas
A caracterização fenotípica é indispensável para a identificação presuntiva
de Campylobacter spp. As propriedades bioquímicas e as características do
gênero são bastante variáveis para espécies e subespécies que são pesquisadas.
A caracterização bioquímica é importante fase de diferenciação dos
microrganismos, para tanto deve ser realizada uma série de testes que permitem
avaliar a habilidade que um microrganismo possui de produzir ou utilizar
compostos específicos. Desta forma, os procedimentos para a caracterização
fenotípica ou convencional dos microrganismos são baseados na seleção e
purificação das culturas em placa e, em seguida, na caracterização dos isolados
através de métodos tais como a identificação bioquímica, ou seja, biotipagem
(VAN DOORN et al., 1997).
Sabe-se que as espécies de Campylobacter possuem limitações na
realização do método bioquímico por apresentar inúmeras inconstâncias nas mais
variadas propriedades bioquímicas utilizadas na caracterização das estirpes (ON,
1996).
Os microrganismos desse gênero não produzem ácidos ou compostos
neutros como resíduos metabólicos, não hidrolisam gelatina, caseína, amido ou
tirosina, são negativos para os testes de Vermelho Metila (VM) e Voges-
Proskauer (VP), algumas espécies podem apresentar atividade de arilsulfatase,
mas não de lecitinase ou lipase (SILVA et al., 2007).
A maioria das espécies de Campylobacter é oxidase positiva, incluindo as
espécies termofílicas, no entanto, não produzem qualquer tipo de pigmento
(DEBRUYNE et al., 2008). Não produzem hemólise, são sensíveis ao cloreto de
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sódio, não crescem em meios contendo 2,0% de NaCl, sendo que essa
sensibilidade é dependente da temperatura (FRANCO & LANDGRAF, 2008).
Além disso, a correta identificação das espécies termofílicas de
Campylobacter em amostras clínicas e de alimentos pode ser dificultada pelo
reduzido número de testes bioquímicos empregados, já que este microrganismo
não utiliza carboidratos e não é reativo diante da maioria das reações bioquímicas
aplicadas a outros microrganismos. Somado a isso, a reprodutibilidade dos testes
de identificação é limitada especialmente pela concentração do inóculo e o meio
de cultura utilizado (ON et al., 1996). Ainda, vários sistemas bioquímicos foram
testados para verificar a capacidade de identificação e diferenciação das espécies
e/ou subespécies principalmente C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis, as quais
estão associadas à campilobacteriose em humanos.
No entanto, a melhor identificação das espécies de Campylobacter
utilizando características fenotípicas, apresenta algumas dificuldades, como por
exemplo, a variabilidade de respostas frente aos isolados testados. Visto isso, a
maioria dos laboratórios se restringe à identificação apenas do gênero (HÉBERT
et al., 1982; LIOR, 1984; ON, 1996). Outro fator preponderante diz respeito ao
fato de que algumas propriedades bioquímicas utilizadas na identificação deste
microrganismo são dependentes da idade das culturas e das condições de
execução das provas (WASSENAAR & NEWELL, 2000).
Atualmente, não se conhece um único método fenotípico com capacidade
de identificar todas as espécies, clínicas e relacionadas a alimentos. Quatro
métodos de caracterização fenotípica utilizando a biotipagem, são mais
frequentemente utilizados, o método de LIOR (1984), sistema de Preston (Bolton
et al., 1984), ISO 10.272 (2006) e sistema API-Campy (bioMérieux, 2010).
SKIRROW & BENJAMIM (1980) propuseram a primeira caracterização
bioquímica das estirpes de Campylobacter spp. baseando-se na capacidade
destes organismos de produzir ácido sulfídrico, hidrolisar o hipurato de sódio e na
análise de perfis de sensibilidade ao ácido nalidíxico.
Posteriormente, conforme padronização analítica internacional ISO 10.272
(2006) as espécies de maior interesse econômico e em saúde pública associadas
a alimentos, passaram a ser diferenciadas com base nas reações de hidrólise do
hipurato, o qual tem sido usado como o único teste fenotípico para distinguir as
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espécies C. jejuni, C. coli e C. lari e a resistência ao ácido nalidíxico que
diferencia C. lari das demais espécies.
O teste de hidrólise do hipurato é utilizado para diferenciar as cepas de C.
jejuni de C. coli e C. lari, já que apenas C. jejuni é capaz de hidrolisá-lo, por ser a
única que possui o gene codificador da enzima hipuricase (hipO), ausente em
outras espécies. Entretanto, cerca de 10% das cepas de C. jejuni não expressam
esta característica ou apresentam reação fraca para este teste, o que tem gerado
resultados inconclusivos (SKIRROW & BENJAMIN, 1980; TOTTEN et al., 1987;
STEINHAUSEROVA et al., 2001; CANER et al., 2008).
CANER et al. (2008) observaram as propriedades bioquímicas de 190
isolados de Campylobacter spp., dos quais 17,9% apresentaram reação fraca
para o teste de hidrolise do hipurato e 82,1% apresentaram reação negativa. Os
autores submeteram, posteriormente, os isolados a ensaios moleculares para
detecção do gene hipO e observaram o gene em 11% dos isolados que
apresentaram resultado negativo e em 56% dos que apresentaram reação fraca,
confirmando que os isolados pertenciam à espécie C. jejuni, que poderiam ser
erroneamente classificados como C. coli.
A maioria das espécies de Campylobacter exibe resultado negativo para o
teste de urease, entretanto em 1985 foram relatados Campylobacter
termotolerantes atípicos que se apresentavam urease positivos (UPTC),
(BOLTON et al., 1985), os quais foram identificados em 1988 como variantes
bioquímicos de C. lari (UPTC) isoladas de amostras clínicas de humanos
(MÉGRAUD et al., 1988).
De acordo com BENJAMIN et al. (1983) C. lari é conhecido como
Campylobacter termofílico resistente ao ácido nalidíxico (NARTC) e anteriormente
era distinguido de C. coli e C. jejuni por meio desta característica, até que na
década de 90, começaram a surgir cepas de C. jejuni e C. coli também
resistentes a este antimicrobiano (CHATZIPANAGIOTOU et al., 1993; GOMES et
al., 2002). Além da descrição da existência de cepas de C. lari sensíveis ao ácido
nalidíxico (NASC) (OWEN et al., 1988). Foram também relatadas variantes urease
positivo e sensível ao ácido nalidíxico (UP-NASC), considera-se desta forma que
C. lari é uma espécie com extensiva diversidade genética (DUIM et al., 2004).
11
A atividade da enzima fosfatase alcalina foi registrada em algumas cepas
de C. jejuni, mas todas as outras espécies testadas por HÉBERT et al. (1982)
foram negativas para esta atividade.
Cabe ressaltar que relatos da investigação do patógeno apresentam provas
de que alguns dos testes bioquímicos realizados para a identificação das diversas
espécies e biótipos de Campylobacter podem ser muito restritivos. A rígida
aceitação dos resultados destes testes na identificação de Campylobacter pode
resultar na incapacidade de reconhecer e diferenciar algumas espécies (STEELE
et al., 1985).
3.4 Nutrição e resposta a ambientes adversos
Conhecer os aspectos nutricionais, a fisiologia e o metabolismo de
microrganismos patogênicos auxiliam na compreensão a respeito da colonização,
do processo de desenvolvimento da doença e dos mecanismos de adaptação e
sobrevivência ambiental, fato importante principalmente quando se trata de
patógenos complexos como o caso de Campylobacter spp. (KELLY, 2008;
WRIGHT et al., 2009).
KELLY (2008) descreveu que durante a colonização, Campylobacter deve
ser capaz de sobreviver em diferentes ambientes, como por exemplo, água de
superfícies (FROST, 2001), vegetais (EVANS et al., 2003), intestino de aves e
como patógeno em humano, o que torna fundamental a sua adaptação às mais
variadas condições. Para tanto, requer certo grau de flexibilidade metabólico que
deve ser suficiente para fazer uso dos diferentes nutrientes que estão disponíveis
em cada ambiente.
Os mecanismos de quimiotaxia fazem com que o microrganismo se
movimente na direção ou no sentido oposto ao estimulo químico. Assim, a
resposta quimiotática de C. jejuni é importante para direcionar o patógeno a locais
específicos no trato intestinal que sejam favoráveis para o seu desenvolvimento,
bem como as afastam dos ambientes desfavoráveis, sendo que a expressão
deste mecanismo é potencializada em temperatura de 37°C, temperatura
fisiológica dos seres humanos (KHANNA et. al, 2006).
De forma geral, Campylobacter é considerado fastidioso, pois a
multiplicação ocorre de forma lenta, acredita-se que esta característica seja em
12
razão do pequeno tamanho do genoma (PARKHILL et al., 2000), o qual possui de
1600 Kb a 1700 Kb e também ao fato de não fermentarem carboidratos
(VANDAMME, 2000) e não metabolizarem lipídeos e na limitação de realizar
biossíntese (FRANCO & LANDGRAF, 2008).
Por estes motivos, C. jejuni é comumente encontrada na parte inferior do
ceco de aves, pois os aminoácidos são abundantes e é o local onde ocorre a
biossíntese microbiana (BEERY et al., 1988).
Estudos demostram que C. jejuni é altamente ativo durante a fase
estacionária, respondendo às condições de mudança ambiental com a alteração
da expressão de genes fazendo com que o microrganismo aumente a motilidade,
utilize aminoácidos alternativos e use moléculas, tais como o acetato,
previamente excretadas como resíduos por outros microrganismos (WRIGHT et
al., 2009). Fato que explica a capacidade do microrganismo, relativamente
sensível aos fatores ambientais, sobreviver fora do intestino do hospedeiro
(KELLY, 2001).
Pela incapacidade de metabolizar carboidratos, Campylobacter necessita
da disponibilidade de aminoácidos livres específicos como serina (VELAYUDHAN
et al., 2004, KELLY, 2005), aspartato, glutamato (GUCCIONE et al., 2008), e
prolina (LEACH et al., 1997), intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico e
alguns ácidos orgânicos, eliminados a partir do hospedeiro ou dos
microrganismos presentes no intestino (LEE et al., 2006; HOFREUTER et al.,
2008), nomeadamente fumarato, piruvato, lactato (HINTON, 2006;THOMAS et al.,
2011), succinato, malato e α-cetoglutarato, e da desaminação e oxidação dos
ácidos glutâmico e aspártico (ELHARRIF & MÉGRAUD, 1986).
O aminoácido L- serina é o mais utilizado durante o desenvolvimento de C.
jejuni, pois este possui a enzima desaminase, que converte serina em piruvato e
amônia. O piruvato também é metabolizado de forma rápida e eficiente pela via
piruvato e pelo ciclo do ácido cítrico, o que pode explicar por que este aminoácido
é tão bem utilizado (VELAYUDHAN et al., 2004).
Recentes estudos demostraram que algumas cepas de C. jejuni são
capazes de captar e metabolizar o açúcar L-fucose o qual é obtido a partir do
hospedeiro no momento da colonização do intestino (MURAOKA & ZHANG, 2011;
STAHL et al., 2011). Este açúcar é também químioatrativo para Campylobacter o
13
qual se movimenta em direção ao intestino por meio da quimiotaxia além de
facilitar a adaptação em ambientes com baixos níveis nutricionais, o que
proporciona a este organismo maior vantagem competitiva (MURAOKA &
ZHANG, 2011).
Sutis variações genéticas são capazes de interferir na aquisição de
determinados nutrientes o que aumenta a capacidade de uma cepa altamente
patogênica de C. jejuni colonizar tecidos específicos. Por exemplo, a capacidade
de adquirir o gene responsável por codificar a enzima gama-glutamil transferase
permite que a cepa hidrolise a glutamina e glutationa à glutamato, auxiliando na
colonização do intestino. Da mesma forma, observa-se que a capacidade de
utilização da asparagina permite que o microrganismo infecte o fígado. Deste
modo, suprir as exigências nutricionais específicas é necessário para a efetiva
colonização dos mais variados tecidos (HOFREUTER et al., 2008).
HOFREUTER et al. (2006) destacam a possibilidade de C. jejuni
catabolizar algumas moléculas como glicerol-3-fosfato, o que requer a presença
apenas das porções finais da via glicolítica, o uso desta molécula é sustentado
pela presença de transportador específico para este nutriente.
As variações metabólicas decorrentes das mudanças ambientais são
fatores que contribuem para as alterações do potencial virulento do patógeno,
especificamente quando relacionados ao intestino humano e de frangos, visto a
abundância de aminoácidos preferencialmente metabolizados por C. jejuni tais
como aspartato, serina, prolina e glutamato (VELAYUDHAN et al., 2004;
GUCCIONE et al.,2008).
A versatilidade no metabolismo ocorre em razão da significativa
variabilidade existente entre as espécies e até mesmo entre estirpes, o que
resulta em diferentes formas de virulência e de apresentação clínica, variando
desde gastroenterite até síndromes neurológicas (WASSENAAR & BLASER,
1999; HOFREUTER et al., 2008; MOURIK, 2011).
3.5 Mecanismos de respostas a ambientes adversos
As espécies termofílicas de Campylobacter enfrentam condições não
favoráveis durante toda a cadeia de transmissão, desde o hospedeiro animal, o
ambiente até o homem. No ambiente o microrganismo é exposto ao oxigênio,
14
mudanças de temperatura, dessecação, variação de pH, entre outros tipos de
estresse, o que representa grande desafio ao agente. Ao contrário de outros
patógenos entéricos, o microrganismo é relativamente frágil e muito sensível às
pressões ambientais o que impede a multiplicação fora do hospedeiro (MURPHY
et al., 2006).
A fragilidade característica deste microrganismo deve-se à ausência de
mecanismos clássicos para a resposta a diferentes formas de estresse, os quais
são importantes para outras bactérias, tais como Salmonella spp. e Escherichia
coli. Especificamente, Campylobacter carece de genes de resposta ao estresse
oxidativo (SoxRS e OxyR), defesa a pressão osmótica (BetAB, GbsAB, OtsAB e
ProU), ausência da principal proteína de defesa de choque frio (CspA), ausência
do regulador de resposta ao choque quente (RpoH) e a ausência de gene
responsável pela fase estacionária (rpoS) (PARK, 2002).
Mesmo com a ausência de diversos mecanismos de resposta ambiental as
espécies do gênero Campylobacter, constituem a causa mais frequente de
diarreia bacteriana de origem alimentar, o que sugere que o patógeno
desenvolveu mecanismos alternativos próprios, como por exemplo, a variação
genômica e secreção de proteínas extracelulares, para contornar as diferentes
tensões impostas pelo hospedeiro e ambiente (MURPHY et al., 2003a).
Apesar da ausência do regulador de fase estacionária (rpoS), acredita-se
que ao entrar nesta fase, C. jejuni passa por algumas alterações fisiológicas, tais
como a modulação da membrana e composição de ácidos graxos, que
aumentam a integridade da membrana celular e a resistência à pressão, mas não
aumentam a resistência ao ácido ou ao calor (MARTINEZ-RODRIGUEZ et al.,
2004; MARTINEZ-RODRIGUEZ & MACKEY, 2005).
Outro mecanismo desenvolvido pra a sobrevivência é a formação de
biofilmes que permite ao patógeno sobreviver por período prolongado mesmo
exposto a condições desfavoráveis. Isso sugere ser uma adaptação que contribui
para a característica zoonótica do patógeno (JOSHUA et al., 2006; REUTER et
al., 2010).
A tolerância à bile é outra característica importante, os sais biliares são
estímulos para o microrganismo, pois sinalizam a entrada no intestino do
hospedeiro, entretanto a bile tem atividade antimicrobiana, sendo de suma
15
importância que o agente desenvolva estratégias para escapar desta atividade,
isto inclui: bile porinas, proteínas de transporte, bombas de efluxo, entre outros
(BHAVSAR & KAPADNIS, 2007).
Em virtude dos estímulos estressantes ao patógeno, as proteínas do
periplasma perdem sua forma original podendo formar agregados e com isso
causar injúrias celulares. Para prevenir a agregação, existem proteínas auxiliares,
chamadas chaperones, que fazem com que as proteínas periplasmáticas
retornem ao seu estado original. As chaperones são sintetizadas no citoplasma e
ativadas no periplasma frente a ambientes hostis. Este mecanismo está presente
em várias bactérias Gram negativas, como Salmonella spp. e Escherichia coli,
porém é mais eficiente em Campylobacter spp., favorecendo deste modo a
sobrevivência e multiplicação do patógeno (BAEK et al., 2011).
A compreensão dos mecanismos de resposta ao estresse fornece
informações necessárias para melhorar o processamento e desenvolver
estratégias que proporcionem a segurança dos alimentos (PARK, 2000).
3.5.1 Estado VNC
Morfologicamente o gênero Campylobacter é reconhecido pela forma
espiralada ou encurvada. Quando exposta a situações desfavoráveis esta
característica curvada e a morfologia em espiral de Campylobacter dá lugar à
forma cocóide conhecida como VNC (viável não cultivável), uma forma
degenerativa utilizada como estratégia de sobrevivência por muitos
microrganismos patogênicos. C. jejuni é capaz de utilizar esta forma quando
incubada por períodos prolongados a 4°C (ROLLINS et al., 1986;
CHAISOWWONG et al., 2012), como também por exposição ao oxigênio,à falta
de nutrientes, altas temperaturas entre outros (PARK, 2002; KLANCNIK et al.,
2006).
Esta fase é de extrema importância em relação à saúde humana e saúde
pública (CHAVEERACH et al., 2003), pois, por não ser cultivável, os métodos de
isolamento convencional não são capazes de identifica- lá no alimento, embora as
células permaneçam potencialmente patogênicas (PARK, 2002).
16
Isso pode explicar, em parte, o motivo das infecções ocorrerem sem que
haja o conhecimento da fonte de contaminação (BOVILL et al., 1997; ROLLINS et
al., 1986; JAY, 2005).
Estudos revelaram que as células VNC expressam os genes associados à
virulência (flaA, flaB, cadF, ciaB, cdtA, cdtB e cdtC), portanto, o patógeno no
estado VNC pode ser contagioso e células estressadas podem ser mais virulentas
do que aquelas sob nenhum estresse (ROWAN, 2004; MA et al., 2009). As
células VNC são potencialmente patogênicas por serem capazes de invadir
células epiteliais intestinais humanas (Caco-2) “in vitro” (CHAISOWWONG et al.,
2012).
A célula na forma VNC pode ser reversível se as condições ambientais
tornam-se favoráveis, situação em que o microrganismo volta a apresentar a
forma em espiral, podendo se multiplicar e manter a virulência (BHAVSAR &
KAPADNIS, 2007).
Apesar do conhecimento a respeito deste estado não estar completamente
elucidado, não há duvidas de que desempenha papel importante e essencial na
sobrevivência de C. jejuni após exposição a condições estressantes
(HAZELEGER et al, 1995).
3.5.2 Sobrevivência em diversas temperaturas
As espécies responsáveis por causar doenças em humanos são
conhecidas por fazerem parte do grupo termofílico de Campylobacter. Estas
espécies se multiplicam dentro de uma estreita faixa de temperatura de 30 a
47°C, com temperatura ótima de 42°C (HAZELEGER et al., 1998; STINTZI, 2003).
Apesar disso, a infecção humana causada por espécies termofílicas de
Campylobacter está geralmente associada com a ingestão de alimentos que
foram expostos a altas e/ou baixas temperaturas durante a fase de
processamento e estocagem. Deste modo, apesar de não se multiplicar em
temperaturas baixas, observa-se que Campylobacter spp. possui potencial para
sobreviver em condições de temperatura não favoráveis (CHAN et al., 2001;
EIDEH & AL-QADIRI, 2011; LIGOWSKA et al., 2011).
17
A capacidade de sobreviver ao processo de refrigeração e congelamento é
devido à pronunciada variabilidade genética existente entre as cepas do
microrganismo e isso se torna relevante na questão de segurança alimentar e de
saúde pública, entretanto, dificulta o conhecimento a respeito do mecanismo de
sobrevivência às variações de temperaturas (WASSENAAR & NEWELL, 2000).
Por meio da análise genômica de Campylobacter, os pesquisadores
avaliaram que este patógeno não possuía a capacidade de produzir proteínas de
choque frio, as quais estão relacionadas com a multiplicação em baixas
temperaturas, como ocorre em diversas outras bactérias (PARK, 2000), o que
explica a dificuldade de Campylobacter em multiplicar abaixo de 30º C
(HAZELEGER et al., 1998).
No entanto, sabe-se que o “suco” da carne do frango é capaz de prolongar
a sobrevivência de C. jejuni a 5°C em relação a outros meios laboratoriais, o que
sugere que os compostos presentes neste ambiente influenciam na adaptação a
baixas temperaturas (BIRK et al., 2004). Este meio, faz com que aumente a
expressão do gene luxS que está envolvido no quorum sensing e na adaptação
promovendo a sobrevivência prolongada de C. jejuni neste importante ambiente
da cadeia alimentar (LIGOWSKA et al., 2011).
O estudo realizado por BIRK et al. (2004) forneceu evidências consistentes
que o ambiente proporcionado na carne, pele ou "suco" da carne do frango,
disponibiliza vantagem em particular à C. jejuni.
C. jejuni é capaz de sobreviver por apenas alguns dias na pele do frango,
quando incubada a 20°C, mas a sobrevivência pode ser prolongada a 4°C (LEE et
al., 1998). Nessa temperatura é possível ocorrer várias atividades biológicas,
incluindo a síntese de proteínas, atividade da catalase, geração de ATP e
motilidade, podendo se mover em direção a ambientes mais favoráveis como os
folículos (HAZELEGER et al., 1998).
Enquanto Campylobacter spp. demonstra a capacidade de sobreviver em
carcaças de frango mantidas sob refrigeração o mesmo pode não acontecer em
temperatura de congelamento, o que diminui a viabilidade deste microrganismo,
no entanto, sem eliminá-lo, este fato relaciona-se à nucleação do gelo no interior
da célula, a desidratação e o estresse oxidativo.
18
O microrganismo também não suporta repetidos congelamentos e
descongelamentos, tanto que no ano de 2000, autoridades veterinárias oficiais
irlandesas decidiram empregar o congelamento das carcaças e produtos avícolas
como estratégia mitigatória (GEORGSSON et al., 2006). Entretanto, através do
congelamento rápido, as células sobreviventes podem permanecer viáveis por
muitas semanas (FRANCO & LANDGRAF, 2008).
Apesar do patógeno ser inativado em temperatura de -15°C por três dias
(STERN & KOTULA, 1982), este ainda pode permanecer no alimento
contaminado mesmo após o congelamento (LEE et al., 1998). Esta permanência
vai depender do meio de cultura em que o microrganismo se encontra, como por
exemplo, no meio suplementado com FBP (piruvato de sódio, metabisulfito de
sódio e sulfato ferroso), a bactéria pode ser recuperada após um ano em
temperatura de -20°C a – 85°C (GORMAN & ADLEY, 2004).
EL-SHIBINY et al. (2009) demonstram que mesmo após o congelamento,
as células de C. jejuni e C. coli permaneceram viáveis na pele de frango por
aproximadamente oito dias, em quantidade suficiente para desencadear a
doença.
Outro meio avaliado como apropriado para a manutenção da viabilidade
bacteriana é o leite desnatado a 10%, o qual é uma solução para o
armazenamento da bactéria em temperatura de -80°C, com o intuito de aumentar
a viabilidade da célula a longo prazo e proteger contra a morte celular durante
posteriores períodos de elevada temperatura (CODY et al., 2008).
Estes relatos enfatizam a complexa capacidade de sobrevivência de C.
jejuni em temperaturas tão baixas durante muitos dias, tendo em vista que não foi
descrito a expressão de nenhuma proteína conhecida em resposta ao choque frio
em C. jejuni, tais como CspA, encontrada em outros microrganismos, ressaltando
que existem mecanismos diferentes para a sobrevivência nessas condições
(PARKHILL et al., 2000). Campylobacter induz, em resposta ao estresse térmico,
a síntese de um grupo de proteínas altamente conservadas chamadas Hsps que
varia proporcionalmente a temperatura, ou em resposta a outras agressões
ambientais (LINDQUIST et al., 1988).
STINTZI & WHITWORTH (2003) identificaram potenciais mecanismos que
possam contribuir para a adaptação às baixas temperaturas. Estes incluíam a
19
aquisição ou a biossíntese de moléculas crioprotetoras, alteração da composição
lipídica da membrana e supra-regulação de vários sistemas de dois componentes,
os quais podem ser úteis na detecção das alterações no ambiente e desencadear
uma resposta adequada.
A termotolerância está associada às proteínas: GroEL, GroES, DnaJ,
DnaK, GRPE, HRAC e Lon (PARK, 2000). Aquelas codificadas pelo gene dnaJ
apresentam papel importante no momento de mudanças bruscas na temperatura.
A resposta ao choque térmico é essencial para a colonização do trato intestinal e
sobrevivência bacteriana a temperatura elevada (STINTZI, 2003). De acordo com
KONKEL (1998), vinte e quatro proteínas são preferencialmente sintetizados por
C. jejuni imediatamente após o choque térmico, ainda de acordo com este autor,
C. jejuni, que produz um mutante da proteína DnaJ, teve a capacidade de formar
colônias a 46°C diminuída o que indica que DnaJ desempenha um papel
importante na termotolerância e na colonização de C. jejuni sugerindo que as
proteínas de choque térmico desempenham um papel importante “in vivo”.
MOORE & MADDEN (2000) estudaram um comportamento interessante
em cepas de C. coli. Em temperaturas acima de 56°C, houve um desvio da
redução logarítmica de Campylobacter, o que sugere a existência de populações
resistentes a altas temperaturas, este dado é importante se levar em conta que
cozimento de certos alimentos pode não ser suficiente para inativar todas as
populações de Campylobacter.
O conhecimento sobre os efeitos da exposição do microrganismo ao frio e
ao calor ainda é limitado, quando avalia-se o gênero e as subespécies, mas sabe-
se que Campylobacter spp. é sensível ao tratamento térmico e é inativada
rapidamente por meio de tratamentos de pasteurização e processos de cozimento
doméstico (PARK, 2002).
Para compreender melhor as adaptações, pesquisadores adotaram as
análises de perfil de expressão de genes que codificam proteínas envolvidas na
modificação da estrutura de membrana. Os estudos revelaram, por exemplo, que
quando cultivada em 37°C e 42°C C. jejuni é capaz de expressar de forma distinta
estes genes. Isso sugere a produção de diferentes proteínas de membrana nas
duas temperaturas de desenvolvimento. Portanto, o microrganismo possui a
20
habilidade de adaptar ao homem (temperatura corporal de 37°C) e aves
(temperatura de 42°C) (STINTZI, 2003).
Além disso, C. jejuni apresenta diferença na metabolização das fontes de
carbono quando cultivada em diferentes temperaturas (LINE et al., 2001).
Outra variação é encontrada na quantidade e na variedade de formas de
LOS (lipooligossacarideo) a 37 e 42°C, que são observadas nas diferentes
estirpes, o que indica que esta variação desempenha um papel no mecanismo de
adaptação ou de uma resposta ao estresse pela bactéria durante a colonização
nos diferentes hospedeiros (SEMCHENKO et al., 2010).
3.6 Aspectos epidemiológicos de Campylobacter spp.
Campylobacter é considerado um microrganismo emergente, que
reapareceu nas últimas décadas (BUTZLER, 2004). As espécies termofílicas
principalmente C. jejuni e C. coli, e com menor frequência C. lari e C. upsaliensis
(VANDAMME, 2000) são importantes microrganismos causadores de
gastroenterites de origem alimentar, conhecidas como campilobacteriose.
Esta enfermidade tem sido reportada como a maior causa de doenças
gastroentéricas em humanos em muitos países desenvolvidos e em
desenvolvimento (HUMPHREY et al., 2007; MOORE et al., 2005) cuja incidência
aumenta a cada ano (EFSA, 2011a; EFSA, 2012).
De acordo com EFSA (2012) C. jejuni é a espécie mais isolada em
produtos de origem avícola representando aproximadamente um terço dos
isolados (34.2%), C. coli e C. lari foram detectados em 27.3% e 0,2% dos
isolados, respectivamente, entretanto, 38,7% dos isolados tiveram a identificação
atribuída apenas ao gênero.
Apesar da importância deste patógeno, vários aspectos sobre a
epidemiologia ainda não foram estabelecidos devido à complexidade
epidemiológica e da transmissão deste agente zoonótico (EFSA, 2011a).
Os casos de campilobacteriose na maioria das vezes são esporádicos
(ALLOS, 2001), entretanto, surtos têm sido reportados (BUTZLER, 2004; EFSA,
2011b; EFSA, 2012).
Dados da União Europeia revelaram que crianças menores de cinco anos
tiveram a maior taxa de notificação em 2010 (126,8 casos por 100.000
21
habitantes). No geral, as notificações para todos os grupos de idade aumentaram,
no entanto, neste mesmo ano a taxa de mortalidade foi baixa, 0,22%. A maior
frequência de notificações de campilobacteriose foi relatada durante os meses do
verão europeu, de junho a agosto, diminuindo gradualmente de setembro a
dezembro (EFSA, 2012).
A maioria dos países não descreve nem implantam programas de vigilância
epidemiológica para este microrganismo e não possuem ou não publicam dados
sobre a incidência do mesmo. Os sistemas de notificação da doença são falhos e
variam de acordo com o país e região. No Brasil, não existe um sistema para
notificar nem avaliar os casos de doenças causadas por este patógeno, além de
não possuir a obrigatoriedade de pesquisar Campylobacter em alimentos, o que
torna os dados subestimados.
3.6.1 Reservatórios e fontes de contaminação
Os microrganismos do gênero Campylobacter são considerados
ubiquitários por estarem distribuídos em vários ambientes industriais, domésticos
e na natureza (LEVIN, 2007). Entretanto, o reservatório principal é o trato
gastrintestinal das aves pelo fato de C. jejuni colonizar estes animais a níveis
elevados sem induzir resposta imune (LEE et al., 2006; KUDIRKIENE et al.,
2011).
Considera-se que as espécies de Campylobacter sejam microrganismos
comensais do intestino de muitas espécies aviárias domésticas e selvagens, tais
como, frangos (EFSA, 2011a), perus (ATANASSOVA et al., 2007), patos (RAHIMI
et al., 2011; ADZITEY et al., 2012) e faisões (DIPINETO et al., 2008).
Diante disso, as aves domésticas, em especial o frango, foram a maior
fonte de C. jejuni na Hungria em 2011 (DAMJANOVA et al., 2011). Em alguns
países a prevalência de Campylobacter spp. em frangos é alta, estima-se
encontrar o microrganismo em 75% (HUMPHREY, 1999) a 90% das carcaças de
frango (STERN et al., 2001), podendo chegar a 100% das aves testadas quando
o lote de frango é positivo (ELLERBROEK et al.,2010).
22
O microrganismo pode infectar o homem de forma direta, através do
contato do ser humano com animais ou de forma indireta com a ingestão de
alimentos e água contaminados pelas fezes dos animais (EFSA, 2005).
Sabe-se que alimentos tais como carnes, cruas ou mal cozidas, de aves
(KRAMER et al., 2000), bovinos (HÄNNINEN, 1981) e suínos (GABRIEL et al.,
2010), leite não pasteurizado (WYSOK et al, 2011) e água de superfície são
consideradas as principais fontes de infecções humanas.
Dentre estas fontes, acredita-se que a carne de aves é a mais incriminada
nos casos de campilobacteriose (EFSA, 2005; OLSON et al., 2008; EFSA, 2011a;
KOVALENKO et al., 2013).
Na Grécia foi realizado um trabalho, sendo o primeiro neste país, sobre
isolamento, identificação e resistência a antimicrobianos de Campylobacter spp.
em frangos. Para tanto, foram coletadas 1080 amostras de carne de frango,
sendo 16 positivas. Destas amostras 14 foram identificadas como C. coli e duas
como C. jejuni Os autores enfatizaram a necessidade de sistemas de vigilância e
monitoramento a respeito da prevalência e resistência aos antibióticos de
Campylobacter spp. em frangos (MARINOU et al., 2012).
No Canadá, avaliou-se a prevalência de Campylobacter na carne de frango
no varejo, foram coletadas 1256 amostras de frango, 59,6% foram positivas para
Campylobacter, deste resultado 90% era C. jejuni, 9% foram confirmadas como C.
coli e 1% de C. lari (DECKERT et al., 2010).
GARIN et al. (2012), afirmaram que, nos países em desenvolvimento, os
dados quantitativos sobre a contaminação dos alimentos por Campylobacter são
escassos, por este motivo, estes autores analisaram a prevalência do
microrganismo nas cinco maiores cidades de quatro continentes, África (Dakar no
Senegal, Yaounde capital do Camarões), Oceania (Nouméa na Nova Caledónia),
Índia (Antananarivo em Madagascar) e Ásia (Cidade de Ho Chi Minh no Vietnã).
No total foram colhidas 750 carcaças de frango, com positividade de 65,5%
(491/750). O microrganismo foi isolado em todas as cidades em quantidades
diferentes, entretanto, em duas cidades (Yaounde e Noumé) o índice de
prevalência foi alto (92,7% e 96,7% respectivamente) em contraste com a cidade
de Ho Chi Minh onde a prevalência foi de 15,3%.
23
A elevada taxa de incidência nos produtos e derivados avícolas é
justificada pela alta capacidade apresentada pelas espécies termofílicas de
Campylobacter de sobreviver na pele do frango e no interior dos folículos das
penas (DAVIS & CONNER, 2007).
A densidade do microrganismo presente nas carcaças processadas de
frango está diretamente correlacionada com a presença do agente no intestino
destes animais, deste modo, a contaminação das penas, pele e,
consequentemente da carcaça, durante o transporte das aves e durante o
manuseio e evisceração é inevitável (HALD et al., 2000; MIWA et al., 2003).
A contaminação do ambiente de criação e, consequentemente a infecção
das aves por Campylobacter, entre os ciclos de produção, pode estar associada a
diversos fatores, dentre estes: o período de vazio sanitário, (BERNDTSON et al.,
1996), o manuseio de aves e animais diferentes no sistema de produção
(KOENRAAD et al., 1995; BERNDTSON et al., 1996) e baixos níveis de
biossegurança, idade e tamanho do plantel (HANSSON et al., 2007).
Dentro do mesmo lote, pode ocorrer infecção das aves devido à presença
de aves selvagens em proximidade aos galpões (BERNDTSON et al., 1996), à
alta temperatura e ao ar estático na granja, à baixa qualidade da água, ausência
de cuidados básicos como, por exemplo, pedilúvio, presença de cascudinhos e
roedores (REFRÉGIER-PETTON et al., 2001; HANSSON et al., 2007). Ainda não
se sabe se é possível a transmissão vertical de Campylobacter (FONSECA,
2006).
O Codex Alimentarius durante a elaboração das diretrizes referentes ao
controle de Salmonella e Campylobacter em carne de aves, juntamente com
membros da Food and Agriculture Organization (FAO) e World Health
Organization (WHO) considerou que, pelo microrganismo ser encontrado
predominantemente no intestino, sua presença no abate está mais relacionada à
contaminação fecal (FAO/WHO, 2009).
Por este motivo, os principais fatores de risco em áreas de abate de
frangos estão relacionados com a ruptura das vísceras e com a contaminação
cruzada, que pode vir a ocorrer em diversas etapas do processamento, sendo as
principais a recepção, escaldagem, depenagem e evisceração (FAO/WHO, 2009;
24
GHAFIR et al., 2007; ELLERBROEK et al., 2010; HUE et al., 2011; MALHER et al
., 2011; KOVALENKO et al., 2013).
Deste modo, é necessário combater o patógeno na granja, em razão da
dificuldade de impedir a contaminação das carcaças por Campylobacter que pode
estar presente no conteúdo intestinal das aves (AZEVEDO et al., 2010).
Publicações da EFSA relataram a variação da prevalência de 4 a 100% de
infecção por Campylobacter spp. em frangos de diferentes países europeus,
evidenciando que as alterações climáticas, regionais e as praticas de manejo
interferem diretamente nos registros de contaminação (EFSA, 2010).
O rastreamento epidemiológico das espécies do gênero Campylobacter
nos mais diversos ambientes é complexo (EFSA, 2011b), devido a vários fatores.
Entre eles: a presença de múltiplas espécies diferentes no mesmo lote (KUANA et
al., 2009), a capacidade de transformar-se em um estado viável, mas não
cultivável, dificultando o isolamento (HUMPHREY et al, 2007), a sensibilidade a
vários fatores ambientais e a instabilidade genética (WASSENAAR & NEWELL,
2000).
3.6.2 Campilobacteriose no mundo
A campilobacteriose constitui uma zoonose de distribuição mundial, com
graves repercussões em saúde pública e econômica (CDC, 2010). Mesmo em
países desenvolvidos os dados são preocupantes, apesar de todos os recursos
na área de vigilância sanitária. Em 2010, estimou-se que infecções por
Campylobacter spp. afetaram 2,4 milhões de pessoas nos Estados Unidos (CDC,
2010).
Nos países membros da união europeia estima-se que aproximadamente
nove milhões de casos de campilobacteriose ocorram anualmente, os quais
geralmente podem estar atribuídos ao preparo, manipulação e o consumo de
carne de frango (EFSA, 2011a,b).
De forma global, a incidência anual pode ser subestimada, já que os dados
disponibilizados pelos sistemas de vigilância são baseados em casos confirmados
em laboratórios (OLSON, et al., 2008) Soma-se o fato de muitos países e regiões
não apresentam sistema de notificação e de vigilância epidemiológica, além da
25
complexidade em isolar o microrganismo, o que torna os dados pouco
conclusivos. Sabe-se também da impossibilidade de comparar a incidência da
doença entre os vários países, já que a prática clínica e os métodos laboratoriais
para detecção da doença é bastante variável e em poucos países a pesquisa do
microrganismo é efetuada rotineiramente (EFSA, 2011a).
De acordo com ANG et al. (2011) o número anual de episódios de
campilobacteriose na Holanda, é estimado em 75.000 casos. Dados obtidos pelos
autores demostraram que mais de 95% da população deste país foi exposta
repetidas vezes ao Campylobacter ao longo da vida, entretanto a maioria não
apresentou sintomas clínicos.
Na Austrália foi realizado um estudo com o objetivo de avaliar a frequência
de surtos de Campylobacter ocorridos no país entre os anos de 2001 a 2006, e
determinar as rotas mais comuns na transmissão do patógeno. Durante este
período, foram relatados 33 surtos de Campylobacter, afetando 457 pessoas. De
todos os casos avaliados, 147 (32%) tiveram o diagnóstico confirmado
laboratorialmente. Os surtos ocorreram com maior frequência (45%) durante a
primavera australiana (setembro a novembro), predominando a transmissão de
origem alimentar ou suspeita de origem alimentar (82%), estando os ambientes
comerciais entre os mais envolvidos (55%). Oito surtos (30%) foram atribuídos
aos alimentos preparados ou consumidos em instituições, quatro (15%) em
instalações de cuidados a idosos e três (11%) em acampamentos escolares.
Carne de aves (frango ou pato) foi associado em 11 surtos (41%), o leite não
pasteurizado e salada foram associados com dois focos cada (UNICOMB et al,
2009).
Órgão oficial da Nova Zelândia sobre Autoridade de Segurança Alimentar
reconhece que os alimentos, principalmente de origem avícola, contribuem para
as altas taxas de campilobacteriose no país. Assim, em 2010, foi estabelecida a
meta de desempenho organizacional de redução de 50% na incidência anual de
campilobacteriose de origem alimentar. Em 2010, a incidência da enfermidade foi
de 60 casos por 100.000 habitantes, sendo o microrganismo encontrado em
42,2% das 1440 carcaças de frango analisadas neste país (NZFSA, 2010).
Um surto envolvendo C. jejuni ocorreu em 2009 na cidade de Creta, sendo
a maioria dos casos oriunda de área rural abastecida por água diferente da cidade
26
adjacente. Trinta e sete pessoas doentes foram entrevistadas e o consumo de
água da torneira foi associado à infecção por C. jejuni. Apesar da ingestão de
água diretamente da torneira ter sido um fator de risco, no estudo não foram
isolados Campylobacter nas amostras de água testadas (KARAGIANNIS et al.,
2010).
Em 2011, a Seção de Epidemiologia do Alasca (SOE) detalhou surto de
campilobacteriose associada ao consumo de leite cru. Houve a confirmação de
sete casos em laboratório, sendo todos os isolados identificados como C. jejuni.
11 pessoas relataram a doença gastrointestinal, mas não foram confirmados
laboratorialmente e foram considerados como suspeitos para campilobacteriose.
A contaminação do leite pode ter ocorrido pelas fezes dos animais ou devido a
alguma vaca com o úbere infectado (Alaska Epidemiology Bulletin, 2011).
De acordo com a rede dos Estados Unidos sobre a vigilância ativa das
Doenças Transmitidas por Alimentos (FoodNet) em 2010, os casos de infecções
causadas por Campylobacter foram de 6.365 casos, com incidência de 13,6 casos
por 100,000 habitantes, números maiores que o apresentado por outros
patógenos como Shigella, Cryptosporidium, Vibrio, Yersinia, Listeria, e
Cyclospora. A incidência foi maior em crianças com até cinco anos de idade com
24,4 casos por 100.000 habitantes (CDC, 2011).
Os relatórios realizados pela European Food Safety Authority (EFSA)
mostraram que em 2010, Campylobacter foi relatado como a principal causa de
gastroenterites em humanos. O número de relatos de casos confirmados
aumentou 6,7% em 2010 em comparação com 2009. Este fato também refletiu no
aumento da taxa de notificação de campilobacteriose em toda União Europeia,
com 48,6 casos por 100.000 habitantes em 2010, sendo que neste ano foram
relatadas 266 mortes em decorrência da doença (EFSA, 2012).
As razões para esta tendência crescente de notificação não são
completamente compreendidos. Uma possível explicação pode ser a vigilância
mais focada e/ou uma maior preocupação com relação à campilobacteriose
devido à diminuição da salmonelose. No entanto, devido às características
específicas deste patógeno é difícil compreender todos os aspectos de sua
epidemiologia e as razões possíveis para o aumento dos casos (EFSA, 2012).
27
Um surto associado à Campylobacter lari chama atenção em razão desta
espécie não ser causa frequente de infecção intestinal em seres humanos.
WERNO et al. (2002) relataram a infecção por esta espécie em um homem de 81
anos de idade, com o sistema imunológico comprometido com choque séptico e
óbito.
Recentemente, foi realizado estudo descritivo da epidemiologia de
Campylobacter na Inglaterra e no País de Gales, com avaliação de um milhão de
casos entre os anos de 1989 e 2011. Neste trabalho, NICHOLS et al. (2012)
concluíram que Campylobacter é a bactéria mais comum em casos de diarreia,
sendo capaz de afetar cerca de meio milhão de pessoas anualmente. Também
observaram que o frango é a principal fonte de infecção e o veiculador mais
comum para a transmissão da doença. Os autores relataram que a infecção por
Campylobacter aumentou em pessoas mais velhas, especialmente nos homens.
Observou-se também que a resistência aos antibióticos tem aumentado
nos últimos anos e que houve maior prevalência em áreas com baixa densidade
populacional.
Outro surto, ocorrido no Alasca, envolvendo C. jejuni estava associado ao
consumo de ervilhas que foram contaminadas com o microrganismo pelas fezes
de pássaros selvagens. Os autores confirmaram 63 casos de infecção, 5 casos
foram hospitalizados e um caso desenvolveu a síndrome de Guillain-Barré. Este
surto ressalta a necessidade de considerar as fezes de aves selvagem como
fonte de contaminação em todo o mundo. Deste modo, os autores enfatizam a
necessidade de compreender melhor a epidemiologia e reservatórios de
Campylobacter e desenvolver medidas adicionais de controle para evitar ou
reduzir a contaminação de produtos frescos (GARDNER et al., 2011).
MADDEN et al. (2011) realizaram na Irlanda um estudo para verificar a
prevalência de Campylobacter spp. e Salmonella em carne de frango “in natura’’ e
avaliar o risco para o consumidor. Para tanto foram coletadas 510 amostras no
varejo. A contaminação por salmonela representou 5,1%, o que sugere que o
controle para limitar a contaminação por este microrganismo na fase de produção
têm sido bem sucedida, entretanto, a contaminação por Campylobacter foi de
84,3%, destes 67% eram C. jejuni e 32% eram C. coli. Estes resultados
evidenciam a necessidade de introduzir nas granjas controles para minimizar a
28
exposição dos consumidores a Campylobacter spp., como tem sido feito com
sucesso para Salmonella spp..
3.6.3 Campylobacter spp e campilobacteriose no Brasil
Os relatos sobre campilobacteriose no Brasil são escassos. Em 2001, foi
registrado um surto de Campylobacter envolvendo 11 pessoas em São Paulo
(CVE, 2001), e, em 2003 foi também notificado ao CVE um surto de
Campylobacter, envolvendo três pessoas (CVE, 2003).
No Brasil, as descrições são escassas sobre os sistemas de vigilância
epidemiológica para averiguar a ocorrência de campilobacteriose em humanos. A
Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Epidemiológica) desenvolveu em 2004 o
Programa Nacional de Monitoramento da Prevalência e da Resistência Bacteriana
em Frango (PREBAF), com o objetivo inicial de avaliar a prevalência de
Salmonella e Enterococs em carcaças de aves e posteriormente monitorar o
impacto dos medicamentos veterinários utilizados na produção de frango e a
consequência de seu uso no aparecimento de bactérias resistentes aos
antimicrobianos. Com a implementação deste programa foi possível avaliar a
prevalência e o perfil de resistência bacteriana dos microrganismos mencionados
(BRASIL, 2010).
Em sua segunda fase, o Prebaf pretende desenvolver metodologias nos
laboratórios de saúde pública, possibilitando a realização de análises de
prevalência e de perfis de suscetibilidade aos antimicrobianos de mais dois
microrganismos em carne de frango comercializada no Brasil, sendo eles,
Campylobacter spp. e Escherichia coli.
Ocorrência de Campylobacter spp. foi registrada entre manipuladores de
alimentos em cozinhas hospitalares em Florianópolis em 1995. A pesquisa foi
realizada para avaliar a presença de Campylobacter em fezes de manipuladores
de alimentos, e pode demonstrar que a média de portadores foi de 6,2% de um
total de 177 indivíduos pesquisados. Dentre as observações feitas sugere-se uma
maior prevalência de Campylobacter spp. em fezes de manipuladores do sexo
masculino do que aquele do sexo feminino (TOSIN et al., 1995).
29
Em Pelotas, GOMES et al. (2006) verificaram a ocorrência de
Campylobacter jejuni em amostras fecais de galinhas em 26 pequenas
propriedades. Foram analisadas 404 amostras fecais de galinhas, verificando a
presença do patógeno em sete propriedades (26,9%), com isolamento de C. jejuni
em 5,2% das 404 amostras testadas. Os autores concluíram que galinhas criadas
em estabelecimentos não industriais e sem atenção sanitária, são portadoras de
C. jejuni e, desta forma, podem ser consideradas um fator de risco para infecção
humana.
No trabalho realizado em 2008 por KUANA e colaboradores, foi verificada a
ocorrência de Campylobacter em 22 lotes de frango de corte durante a fase de
criação e nas carcaças correspondentes. Foram analisados 110 conteúdos do
ceco e 96 carcaças analisadas em pontos diferentes, sendo 38 após a
depenadeira e 58 após o ultimo chiller. Os resultados mostraram que quatro dos
lotes analisados não estavam colonizados, mas após a depenadeira, as carcaças
ficaram contaminadas. Das amostras na granja, 81,8% estavam contaminadas e
97,4% das carcaças estavam contaminadas após a depenadeira e 98,3% após o
chiller (KUANA et al., 2008a).
CHAVES et al. (2010) com o objetivo de verificar a ocorrência de
Campylobacter em granjas e abatedouro avícolas, coletaram, em três granjas
avícolas, do Belém do Pará, 120 de amostras de suabe cloacal, cama de frango,
ração e de água dos bebedouros. Também foram coletadas em um abatedouro,
126 amostras de água, pele, fígado e moela. Em análise das frequências dos
isolados de Campylobacter nas granjas, observou-se que 96,6% de amostras de
suabe cloacal, 33,3% amostras de cama e 3,3% amostra de água foram positivas
para Campylobacter. Identificou-se C jejuni em 82,5% dos isolados nas granjas.
Já em relação as amostras colhidas no abatedouro, 8,73% dos isolados
foram identificadas como C. jejuni. Em análise das frequências dos isolados de C.
jejuni no abatedouro, observou-se que 27,8% amostras de água provenientes da
calha de evisceração foram positivas, seguida pela moela, com uma 3,3%
amostras positivas. As principais fontes de contaminação nas granjas foram as
excretas, a cama e, em menor escala, a água. Os principais pontos críticos
observados no abatedouro foram a água proveniente da calha de evisceração,
30
seguida pela moela coletada no mini tanque de resfriamento (CHAVES et al.,
2010).
No Brasil, durante os anos de 2000 a 2011 foram registrados 8.663 surtos
de doenças veiculadas por alimentos, sendo Campylobacter spp. um dos
microrganismos menos frequentes associados a esses surtos, apresentando-se
apenas em três casos neste período de tempo (BRASIL, 2012).
No estado de Goiás foi realizado um trabalho avaliando a ocorrência de
Campylobacter spp. no qual observou-se o patógeno em 50% dos oito lotes
avaliados de empresas submetidas à inspeção estadual, o microrganismo esteve
presente em 4,37% das 160 amostras avaliadas, sendo que as vísceras coração,
moela e fígado mostraram-se positivas, ao contrário de todas as carcaças
avaliadas (TRASSI, 2012).
Pela falta de política e de legislações que obriguem a pesquisa deste
microrganismo e a notificação dos casos de campilobacteriose, torna-se difícil
reconhecer a prevalência do patógeno. Soma-se a dificuldade de isolamento, a
sensibilidade ao ambiente e a ausência de metodologias para a detecção nos
laboratórios de análise (BRASIL, 2003).
O acesso restrito aos serviços públicos de saúde, a dificuldade no
diagnóstico e o não reconhecimento de casos suspeitos contribuem para que os
casos de doenças veiculadas por alimentos sejam subnotificados (BRASIL, 2003).
3.7 Patogenia
A campilobacteriose é uma forma grave de diarreia, no entanto a maioria
das pessoas com a doença apresenta recuperação em período de dois a cinco
dias, perdurando por até 10 dias. Raramente a infecção por Campylobacter spp.
resulta em consequências que permanecem por longo prazo (WHO, 2011).
Dentre as sintomatologias apresentadas, podem ser citadas desde diarreia
aquosa, moderada e auto limitante até uma disenteria sanguinolenta, com
presença de muco e células sanguíneas brancas, podendo ser acompanhada de
dores de cabeça e abdominal, febre, indisposição, náusea e vômitos. Essa
sintomatologia é semelhante à causada por diversos outros microrganismos
patogênicos entéricos, porém a baixa dose infectante de Campylobacter, com
cerca de 400 a 800 células, aumenta o risco de infecção (BUTZLER, 2004).
31
Em alguns casos, as espécies de Campylobacter podem provocar algumas
complicações e sequelas em longo prazo, observados após o quadro clássico de
campilobacteriose. Estas sequelas compreendem problemas gastrintestinais,
reumatológicos (Síndrome de Reiter), pulmonares, dermatológicos,
intravasculares, renais, abortos e neurológicos (CRUSHELL et al, 2004;
BROIDES et al., 2010).
Dentre estas complicações, a síndrome de Guillain-Barré (SGB) destaca-se
como a causa mais comum de paralisia neuromuscular aguda no mundo (ADAMS
et al., 1993; VUCIC et al., 2009). Esta síndrome é caracterizada como doença
autoimune e pós-infecciosa com destruição da bainha de mielina dos nervos
periféricos, causando paralisia neuromuscular flácida aguda e generalizada,
podendo comprometer os músculos da respiração e levar o paciente à morte
(TAKAHASHI et al., 2005). Anualmente pode acometer até quatro pessoas para
cada 100.000 habitantes. Aproximadamente de 60% a 70% dos pacientes com
SGB apresentaram alguma doença aguda de uma a três semanas antes dos
sintomas aparecerem, sendo a infecção por Campylobacter jejuni a mais
frequente.
O desenvolvimento da SGB ocorre através de um mecanismo de
mimetismo antigênico entre os lipo-oligossacarídeos da bactéria e os
gangliosídeos da membrana dos nervos periféricos (GUERRY et al., 2002).
Quando C. jejuni invade o corpo humano, uma das respostas imunes é a
produção de anticorpos específicos para a estrutura desses lipo-oligossacarídeos.
No entanto, o próprio corpo humano contém compostos com exatamente a
mesma estrutura molecular e são encontrados na membrana celular das células
nervosas humanas. Assim, a estrutura do lipo-oligossacarídeo de C. jejuni imita a
estrutura molecular do gangliosídeo, e os anticorpos produzidos em reação à
membrana da célula de C. jejuni também reagem contra a membrana das células
nervosas. O resultado é o dano ao nervo que evolui em paralisia característica da
síndrome de Guillain-Barré (REES et al., 1995).
Outra síndrome decorrente da infecção por Campylobacter jejuni é a
síndrome de Reiter ou artrite reativa. Esta síndrome é uma resposta autoimune
que provoca inflamação (artrite) em diferentes articulações em resposta à
infecção por C. jejuni. É mais frequente em grandes articulações que suportam o
32
peso, como joelhos e parte inferior das costas, mas outras articulações também
podem ser acometidas (MURRAY, 2007).
3.8 Métodos de detecção de Campylobacter spp.
Diversas metodologias para isolar, detectar, identificar e confirmar
microrganismos patogênicos foram desenvolvidas ao longo dos anos devido a
crescente preocupação com a obtenção de alimentos seguros. Estas
metodologias variam de acordo com o princípio de detecção e são basicamente
subdividas em isolamento convencional e métodos rápidos, estes ainda podem
ser classificados com base nas propriedades bioquímicas, imunológicas e
moleculares.
Entretanto, deve-se levar em consideração que no Brasil não há legislação
específica que obriga a pesquisa de Campylobacter spp., sendo assim não
existem metodologias nacionais padronizadas para pesquisa do agente e os
laboratórios não possuem rotina de análise para este patógeno (KUANA et al.,
2008a). Evidencia-se, porém a necessidade de desenvolvimento e padronização
de técnicas eficientes e rápidas na detecção e isolamento de Campylobacter,
avaliando-se qual o melhor método a ser escolhido em virtude dos inúmeros
fatores a serem considerados, como a demanda do laboratório, espaço
necessário, custos, tempo para obtenção dos resultados, praticidade da técnica,
limites de detecção e quantificação, precisão, sensibilidade, especificidade e
ainda qual a matriz alimentar a ser analisada.
Por se tratar de organismos microaerófilos, possuírem crescimento lento,
serem mais exigentes e apresentarem grande instabilidade genômica
(WASSENAAR & NEWELL, 2000), Campylobacter é considerado de difícil cultivo.
Há a necessidade de se manter condições ambientais e laboratoriais específicas,
como temperatura de armazenamento e condições de microaerofilia (OYOFO et
al., 1992; HAZELEGER et al., 1998; LEE et al., 1998; SILVA et al., 2007 ) para
conservar a viabilidade deste agente (KUANA et al., 2008b). Isto torna os
métodos de cultivo muito trabalhosos, complexos, demorados e de elevado custo
(WISESSOMBAT, et al., 2009).
Devido as injúrias causadas pela presença de oxigênio, temperatura baixa
ou falta de nutrientes, este microrganismo modifica a sua morfologia para formas
33
cocóides (MURPHY, et al., 2003b), entrando num estado de viável, mas não
cultivável (VNC) (HUMPHREY, 1986; FORSYTHE, 2002; CHAVEERACH et al.,
2003; LEE et al., 2006; GANGAIAH et al., 2009), tornando-se ainda mais difícil de
isolar. Portanto, os métodos convencionais podem não recuperar todos os
patógenos, sendo importante a utilização de métodos alternativos como os
baseados em imunologia (ELISA) e sequência de DNA (PCR) (FORSYTHE,
2002).
Apesar disso, os métodos convencionais de isolamento são geralmente
empregados como métodos oficiais nos laboratórios de microbiologia e estão
descritos como referências internacionais. Para a pesquisa de Campylobacter
spp. em alimentos, os principais métodos de isolamento convencional são os
preconizados pela International Organization for Standardization (ISO) sob a
codificação 10272-1 e 2 (2006), pelo Bacteriological Analitical Manual Online de
Food and Drug Administration (BAM/FDA) e o Food Safety and Inspection
Service, United States Departament of Agriculture, sendo que estas metodologias
não apresentam grandes diferenças metodológicas e são direcionadas para
pesquisa das espécies termotolerantes (SILVA et al., 2007).
Com a finalidade e necessidade de reduzir as características negativas dos
métodos convencionais, como demanda de tempo, materiais e equipamentos,
mão de obra e aumento da probabilidade de erro tanto na execução das análises
quanto durante a leitura e interpretação dos resultados, a partir da década de 70
começaram a surgir os métodos rápidos para identificação de microrganismos
patogênicos. Além dos fatores citados, estes métodos podem aliar ainda a maior
sensibilidade e especificidade em relação aos métodos convencionais (LUND, et
al., 2004; BONJOCH, et al., 2010) e facilitar a identificação e quantificação de
microrganismos que não expressam suas propriedades fenotípicas e/ou estão em
estado VNC (ON, 1996).
Portanto, os métodos rápidos, voltados principalmente às indústrias de
alimentos e os órgãos de saúde, são necessários para detectar as espécies do
gênero Campylobacter e outros patógenos. Além disso, a diferenciação entre as
espécies de Campylobacter pode ajudar a escolher o antibiótico necessário para
o tratamento de infecções severas (NACHAMKIN et al., 2007).
34
Como mencionado anteriormente, os métodos rápidos podem ser
classificados em métodos imunológicos, bioquímicos e moleculares.
Os métodos imunológicos são utilizados em sistemas de triagem de
microrganismos patogênicos em alimentos e, portanto, os resultados positivos,
considerados presuntivos, devem ser confirmados por métodos convencionais,
mesmo quando são aprovados por órgãos oficiais (FENG, 1995).
Este método tem como o princípio reações entre os antígenos e anticorpos
específicos do microrganismo o que permite o desenvolvimento de inúmeros
ensaios analíticos, como sistemas imunoenzimático, entre outros (FRANCO &
LANDGRAF, 2008).
Dentre este grupo o mais utilizado para pesquisa de patógenos em
alimentos é o teste imunoenzimático ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent
Assay) (QUINN et al., 2005). Porém, além de trabalhoso, este método quando
realizado manualmente pode apresentar erros, com isso, desenvolveu-se testes
imunuenzimáticos que são acoplados a equipamentos em que se realiza o teste
automaticamente, como exemplo o método analítico miniVIDAS® Campylobacter
(bioMérieux, França). O método miniVIDAS® é validado como oficial pela AOAC e
pelo instituto AFNOR para análise em alimento como técnica de triagem.
Os métodos bioquímicos baseiam-se no metabolismo do microrganismo,
ou seja, na capacidade destes em utilizar substratos ou de produzir metabólitos
previamente determinados. O gênero Campylobacter não fermenta carboidratos e
são geralmente bioquimicamente pouco ativos ou inativos assim, muitos testes
fenotípicos, como os bioquímicos, não tem potencial discriminatório para o gênero
(ON, 1996).
No mercado são encontrados “Kits” miniaturizados que oferecem um rápido
perfil bioquímico, economizando espaço, trabalho e tempo (ON, 1996), além
dessas vantagens somam-se ainda o fato de serem produzidos por empresas
reconhecidas o que garante a confiabilidade e reprodutibilidade dos testes. O
número de testes oferecidos também é maior que os métodos convencionais, o
que permite a obtenção de resultados mais confiáveis (FRANCO & LANDGRAF,
2008).
Porém, mantém a necessidade de se obter culturas puras do
microrganismo desejado, como exemplos deste grupo o API campy (bioMerieux,
35
França) e Vitek (bioMerieux, França). No entanto, os métodos fenotípicos, têm-se
revelado muito inconsistentes, devido às características metabólicas e a
taxonomia complexa deste microrganismo (ON, 1996).
Diante disso, com a necessidade de resolver os problemas taxonômicos e
epidemiológicos relacionados ao Campylobacter, foram desenvolvidos métodos
baseados nas características genotípicas, sendo que a sua aplicabilidade na
identificação e/ou tipificação das estirpes bacterianas é uma ferramenta para os
estudos taxonômicos e as investigações epidemiológicas (WASSENAAR &
NEWELL, 2000).
A técnica da reação de polimerase em cadeia (PCR) é uma das técnicas
genéticas de maior aplicação em alimentos. De certa forma, com o uso das
características genéticas, a identificação ou tipificação das bactérias, pode ser
considerada um processo seguro e vantajoso, já que estes métodos recorrem aos
procedimentos baseados no DNA ou RNA bacteriano, que são considerados
estáveis.
Em estudos de Campylobacter, a aplicação dos métodos moleculares
trouxe muitos benefícios que permitiram esclarecer as inúmeras dúvidas sobre a
verdadeira posição taxonômica do grupo (MOORE et al., 2005).
Entretanto, esta técnica também pode ser afetada negativamente pela
complexidade das matrizes alimentares, podendo ter a presença de inibidores de
PCR, principalmente em alimentos contendo alto teor de proteína e gordura. Além
disso, implementar este tipo de análise na rotina laboratorial requer um alto
investimento em equipamentos e reagentes, além de padronização e
regulamentação por órgãos oficiais (MALORNY et al., 2003).
3.8.1 Isolamento Bacteriológico Convencional
Os métodos convencionais para identificar o gênero Campylobacter
dependem do enriquecimento seletivo, seguido de isolamento do microrganismo
em meios seletivos, identificação microscópica e testes bioquímicos para
confirmação do resultado (SILVA et al., 2007).
De um modo geral, o isolamento de Campylobacter spp. em alimentos,
está direcionado para as espécies termofílicas do microrganismo, que são
36
conhecidas pela sua característica fastidiosa e pela necessidade de condições
especiais para o desenvolvimento. Estas vão desde a composição dos meios de
cultura com necessidade de meios seletivos, até as condições de incubação pois
são microaerófilas e requerem cerca de 10% de CO2 e 5% de O2 para o seu
desenvolvimento e não se desenvolvem em meios com pH abaixo de 4,9
(HUMPHREY, 2007).
As espécies de interesse são conhecidas por se desenvolverem melhor a
temperatura de 41+1°C (HUMPHREY, 2007). No entanto, não são
termorresistentes e são facilmente destruídos pela pasteurização ou pela cocção
dos alimentos (JAY, 2005). As espécies termofílicas não crescem em
temperaturas inferiores a 30ºC, o que diferencia da espécie C. fetus, que se
desenvolve a 25ºC (VANDAMME, 2000). Por não fermentarem nem oxidarem
carboidratos e utilizarem aminoácidos como fonte de carbono, o meio de cultura
deve ser composto por altos níveis de proteína e aminoácidos livres (KELLY,
2005).
As etapas descritas nas mais diversas publicações são semelhantes,
incluindo a fase de pré-enriquecimento em caldo seletivo incubado a 37°C por 4 a
6 horas, com posterior enriquecimento no mesmo caldo, porém em temperatura
de 41,5 + 0,5°C, permanecendo por 44 + 4 horas (SILVA et al., 2007).
Entretanto MORAN et al. (2009) afirmaram em seu estudo que resultados
equivalentes podem ser encontrados em 24 horas de incubação, economizando
tempo e ainda sugere a revisão da metodologia descrita pela ISO 10272-1 e 2
(2006).
A fase de enriquecimento é de extrema importância nas amostras em que a
concentração de bactérias presentes é baixa ou se estas tiverem sido expostas a
alguma injuria por fatores ambientais, como no caso dos alimentos, pois o caldo
de enriquecimento melhora a sensibilidade da cultura e aumenta a capacidade de
recuperação e sobrevivência de Campylobacter nas amostras (World
Organization for Animal Health [OIE], 2008).
Segue-se depois de plaqueamento em um ou dois meios seletivos
diferenciais, incubados a 41,5 + 0,5°C por 44 + 4 horas e seleção inicial das
culturas puras para confirmação do gênero, sendo opcional a diferenciação entre
as espécies (SILVA et al, 2007).
37
Por ser microrganismo exigente, os métodos mencionam o cuidado no
transporte e estocagem das amostras, além de mencionar a sensibilidade do
patógeno ao congelamento e à temperatura ambiente, com a recomendação de
que estas não sejam congeladas. Porém se for necessário o congelamento
devem ser usados crioprotetores, e protegidas para não perderem a umidade. As
recomendações também se estendem a estocagem em temperatura de 4 + 2°C,
por um tempo curto de duas a quatro semanas. Caso sejam mantidas a baixa
tensão de oxigênio nas mesmas condições podem sobreviver por mais tempo
(dois a cinco meses) a 20°C negativos dependendo da espécie (SILVA et al.,
2007).
Apesar da redução populacional com o congelamento, as bactérias
sobreviventes podem ser recuperadas após mais de cinco meses. Recomenda-se
que as análises sejam realizadas o mais rápido possível, visto a ocorrência de
injúrias celulares que dificultam ou inviabilizam a detecção (SILVA et al., 2007).
Para aumentar a aerotolerância de Campylobacter spp. são usados meios
seletivos suplementados com sulfato ferroso, metabissulfito de sódio e piruvato de
sódio (FBP), carvão, heme e sangue, pois estas substâncias reduzem os
componentes tóxicos derivados do oxigênio como peróxido de hidrogênio,
oxigênio simples e íons superóxido (BOLTON et al., 1984; SILVA, et al., 2007;
KUANA et al., 2008a). Além disso, para se reduzir a microbiota acompanhante, os
meios seletivos devem conter diversas combinações de antibióticos, com o
objetivo de facilitar a multiplicação de Campylobacter por impedir o
desenvolvimento de bactérias competidoras (KUANA et al., 2008a).
Após o isolamento do microrganismo, é realizada a confirmação do gênero
Campylobacter. De acordo com a ISO 10272, são necessários quatro testes para
a confirmação, sendo estes, morfologia, arranjo e motilidade típicos; teste de
oxidase positivo; crescimento negativo a 25°C em condições de microaerofilia e a
incapacidade de crescer a 41,5°C em condições de aerobiose. A metodologia ISO
ainda cita os testes bioquímicos realizados para diferenciar as espécies
termofílicas, porém, esta etapa é opcional, sendo utilizada para a diferenciação
entre as espécies Campylobacter jejuni subsp jejuni, Campylobacter coli,
Campylobacter lari e Campylobacter upsaliensis através dos testes de
38
sensibilidade ao ácido nalidíxico, sensibilidade à cefalotina, hidrólise do hipurato e
indoxil acetato (SILVA, et al., 2007).
Assim, a correta identificação das espécies termofílicas de Campylobacter
pode apresentar algumas dificuldades devido à restrição de testes bioquímicos
para a diferenciação das espécies na rotina dos laboratórios e à existência de
cepas atípicas bioquimicamente, o que gera interpretações errôneas em análises
fenotípicas convencionais de Campylobacter, entretanto esta diferenciação
fenotípica é utilizada como rotina nos laboratórios de pesquisa (LINTON et al.,
1996; ON, 1996; CHE, et al., 2001).
Somado a estas dificuldades na identificação, tem-se que com a
metodologia convencional o tempo estimado para obter o resultado é em torno de
sete a 10 dias (CHE, et al., 2001). Desta forma, um método rápido de
identificação bioquímica é desejável para aperfeiçoar o trabalho laboratorial.
3.8.2 Ensaio Imunuenzimático miniVIDAS®
O Ensaio Imunuenzimático miniVIDAS® é um dispositivo desenvolvido com
o intuito de realizar a triagem, de forma rápida, das bactérias do gênero
Campylobacter. O método é capaz de detectar em aproximadamente 50 horas as
espécies C. coli, C. jejuni e C. lari. Este período é necessário para fase de
enriquecimento em caldo seletivo incubado em condição de microaerofilia e o
ensaio que dura cerca de 70 minutos (bioMérieux, VIDAS® Campylobacter, REF
30111-07999 H - pt - 2007/09). O método é rápido, uma vez que reduz em dois a
três dias o tempo das análises, quando comparado ao método tradicional (SILVA
et al., 2007). Porém não elimina a necessidade de isolamento para testes com
resultado positivos.
Além disso, é um método analítico validado internacionalmente por órgãos
oficiais, tais como a validação AFNOR (Association Française de Normalisation) e
AOAC Internacional (Association of Official Analytical Chemists), com a
codificação AFNOR/ISO 16140 BIO 12/29-05/10 (bioMérieux, 2011). De acordo
com trabalho de JORGE (2005) as metodologias baseadas em reações
imunoenzimáticas (Campylobacter Visual Immunoassay (TECRA diagnostic) e
Vidas® Campylobacter (bioMérieux) demonstraram resultados semelhantes à
39
metodologia convencional preconizada pelo FDA (Food and Drug Administration).
Portanto podem ser utilizadas para reduzir o tempo de análise, desde que os
resultados sejam confirmados pelo isolamento em meios de cultura seletivos
tradicionais.
O princípio do método VIDAS CAM baseia-se na reação imunoenzimática
que permite a detecção de antígenos de Campylobacter pelo método ELFA
(Enzyme Linked Fluorescent Assay). É um ensaio semelhante ao ELISA, e que
associa o método “sanduíche” em duas etapas, com uma detecção final por
fluorescência. A reação antígeno-anticorpo é marcada com um anticorpo
associado à enzima fosfatase alcalina, que reage com determinado substrato,
desta reação obtêm-se um composto fluorescente. A emissão de fluorescência é
proporcional à quantidade de antígeno ou (anticorpo) presente na amostra
(bioMérieux, VIDAS® Campylobacter, REF 30111-07999 H - pt - 2007/09).
O ensaio imunoenzimático enquadra-se entre as técnicas de triagem,
sendo que para as amostras em que a análise apresenta resultado negativo, não
é necessário que se continue com as análises por meio do método convencional
(bioMérieux, VIDAS® Campylobacter, REF 30111-07999 H -pt - 2007/09).
O kit VIDAS® é composto por cones, cobertos em seu interior com
anticorpos anti-Campylobacter adsorvidos na sua superfície e por barretes,
compostos por 10 poços que contêm reagentes para reação imunológica. Uma
alíquota do caldo de enriquecimento previamente aquecido é dispensada no poço
do barrete, o patógeno de interesse, quando presente, é fixado aos anticorpos
específicos presentes no cone. As etapas de lavagem eliminam os elementos não
fixados. Todas as fases do ensaio são executadas automaticamente inclusive a
leitura e interpretação dos resultados, sendo que cada resultado é interpretado
como positivo ou negativo. Este teste é, portanto, bastante sensível uma vez que
a mínima formação do hidrolisado produz sinais de fluorescência detectáveis
(bioMérieux, VIDAS® Campylobacter, REF 30111-07999 H - pt - 2007/09).
MENA et al. (2008) ao utilizar o ensaio imunoenzimático para detecção do
patógeno, observou que o método não foi capaz de detectar a espécie C.
upsaliensis a qual também é causa de campilobacteriose em humanos (PATTON
et al., 1989, LABARCA, et al., 2002).
40
NESBAKKEN et al., 2003 não relataram diferença entre o método de
isolamento convencional e o imunoenzimático VIDAS® para detecção de
Campylobacter em amostras de suínos enriquecidas em caldo Preston.
LIU et al. (2009) analisaram a eficiência do miniVIDAS® para detectar
Campylobacter em carne de frango, após o enriquecimento em caldo Bolton, em
dois tempos diferentes (24 horas e em 48 horas). Demostraram que a
porcentagem de amostras positivas neste teste foi maior quando incubado por 48
horas do que por 24 horas, o que foi necessário para evitar falsos negativos.
Observaram ainda que o sistema obteve resultados semelhantes aos meios
seletivos convencionais, entretanto apresentaram a vantagem dos resultados
positivos ou negativos serem obtidos em cerca de 4 horas após a etapa de pré-
enriquecimento.
No trabalho de CHON et al. (2011) foi analisada a recuperação de
Campylobacter em carnes moídas e vegetais artificialmente contaminados com a
utilização de três diferentes meios seletivos (modified cefoperazone charcoal
deoxycholate agar (mCCDA), ágar Karmali e ágar Preston) e também pelo ensaio
VIDAS CAM. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre
os meios utilizados e que o ensaio VIDAS apresentou uma taxa de recuperação
semelhante ao do cultivo nos meios seletivos em carne moída, no entanto, obteve
mais resultados positivos que o isolamento bacteriano convencional.
3.8.3 Sistema API CAMPY
O sistema API CAMPY foi desenvolvido há mais de trinta anos, sendo um
sistema que se baseia na identificação bioquímica e enzimática (bioMérieux,
2010).
Este sistema é constituído por uma galeria que permite obter para cada
microrganismo testado um conjunto de resultados, ou seja, o perfil bioquímico e
por uma base de dados a qual é constituída pelo conjunto de táxons (que pode
ser espécie, biotipo ou grupo de espécie) e das porcentagens de positividade de
cada teste (bioMérieux, 2010). Considerando, neste caso, as espécies e/ou
subespécies de Campylobacter spp., JACOB et al. (1993) descreveram outros
41
microrganismo utilizando este sistema de biotipificação. Atualmente existem 22
sistemas vinculados ao sistema API.
A galeria API Campy comporta 20 microtubos que contêm substratos
desidratados, divididos em duas galerias diferentes. A primeira parte da galeria
que possui os testes enzimáticos e convencionais: urease (URE), redução dos
nitratos (NIT), esterase (EST), redução de hipurato (HIP), gama glutamil
transferase (GGT), redução do cloreto de trifenil-tetrazolium (TTC), pirrolidonil
arilamilase (PyrA), L-arginina arilamidase (ArgA), L-aspartato arilamidase (AspA),
fosfatase alcalina (PAL) é inoculada com suspensão do microrganismo densa que
reidrata os substratos. As reações produzidas durante o período de incubação
(em aerobiose) traduzem-se pelas mudanças de cor espontâneas ou reveladas
através da adição de reagentes (bioMérieux, 2010).
A segunda parte da galeria com testes de assimilação ou inibição:
produção de H2S (H2S), assimilação de D-glucose (GLU), de succinato de sódio
(SUT), de acetato de sódio (ACE), de propionato (PROP), de malato (MLT) e de
citrato trissódico (CIT); sensibilidade à eritromicina (ERO), resistência ao ácido
nalidíxico (NAL) e à cefazolina de sódio (CFZ) é inoculada com meio menos
denso, pois o primeiro foi repassado para outro tubo para diluição, exceto o teste
de H2S que é realizado com o mesmo meio anterior, a segunda galeria então é
incubada em atmosfera de microaerofilia. As bactérias multiplicam-se se forem
capazes de utilizar o substrato correspondente ou se forem resistentes ao
antibiótico testado. O 21° teste constitui o teste de catalase.
Apesar dos erros na identificação de algumas espécies de Campylobacter
(ON, 1994), dos problemas que podem ocorrer devido mutações do gênero e dos
problemas na identificação de certas cepas de C. coli e de C. Lari (REINA et al.,
1995), observa-se que a utilização do sistema pode trazer comodidade e
praticidade nos laboratórios (ON, 1996).
42
4. MATERIAL E METODOS
4.1 Delineamento experimental
Foram analisadas 200 carcaças de frango provenientes de nove
abatedouros submetidos ao serviço de inspeção federal localizados no estado de
Goiás que destinam carne para o mercado interno e externo
As amostras foram obtidas na linha de abate por profissionais do Ministério
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, dispostas em sacos plásticos
individuais, identificadas, lacradas e encaminhadas em ambiente refrigerado,
entre 2 e 8°C, ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água do Centro de
Pesquisa em Alimentos. As coletas compreenderam o período entre os meses de
agosto de 2011 a dezembro de 2012.
Todas as amostras foram submetidas ao ensaio imunoenzimático
miniVIDAS, sendo que para amostras positivas, houve complementação com
procedimentos de isolamento bacteriano e posterior caracterização fenotípica com
a utilização de testes bioquímicos, enzimáticos e antimicrobianos, para
identificação de espécies e subespécies quando possível.
4.2 Ensaios analíticos
Após a chegada ao laboratório, de 120 amostras de carcaças de frango
foram retiradas e pesadas 25 gramas de pele das áreas do pescoço, asas e
próximo à cloaca, em seguida foram trituradas com tesouras e homogeneizadas.
Após este processo, uma alíquota de 1,0 g da amostra foi retirada e disposta em
tubo contendo 9,0 mL de caldo seletivo Bolton sem sangue, conforme
preconizado pelo método imunoenzimático VIDAS (bioMérieux), validado pela
Association Française de Normalisation (AFNOR), código de certificação BIO
12/29 – 05/10, suplementado com antibióticos cefoperazona, trimetoprim,
vancomicina e anfoteracina B (MERCK®).
Nas outras 80 amostras foi realizado o esfregaço por suabes em toda a
superfície da carcaça, interna e externamente, com atenção às regiões do
pescoço, asas e peito. Os suabes foram obtidos de forma asséptica e
43
individualmente dispostos em tubos contendo 9,0 mL de caldo Bolton sem
sangue, suplementado com antibióticos, conforme determinações do protocolo
analítico para ensaios imunoenzimáticos VIDAS (BIOMÉRIEUX, 2010).
Todos os tubos foram incubados em atmosfera de microaerofilia com a
utilização de jarras de anaerobiose e geradores de microaerofilia Genbox, sob
temperatura de 41,5 ± 1°C por 44 ± 4 horas. Finalizado o período de incubação,
segundo o protocolo VIDAS, foram retirados 2,0 mL do caldo de cada tubo e
transferidos individualmente para outros tubos os quais foram aquecidos por 15
minutos a aproximadamente 100°C. Após esta etapa, os tubos foram dispostos
em bancada para diminuição da temperatura de forma gradual.
Ato contínuo, 0,5 mL do caldo de cultura foi transferido para o barrete do kit
VIDAS® Campylobacter e procedeu-se a avaliação da amostra por meio da
técnica ELFA no aparelho miniVIDAS®.
Os resultados expressos em positivo e negativo foram obtidos após
aproximadamente 75 minutos de análise automatizada (BIOMÉRIEUX, 2010).
Conservou-se a alíquota de todos os caldos não aquecidos, para a
confirmação pelo método de isolamento bacteriológico em caso de resultado
positivo, a 4°C, pelo período de no máximo 24 horas, mantendo os tubos envoltos
com filme plástico com o intuito de manter a tensão de oxigênio reduzida.
Como forma de manter o rigor analítico, os procedimentos foram
desenvolvidos com cepas referência de Campylobacter jejuni ATCC 33291, como
controle positivo.
Para as amostras positivas no ensaio de triagem, adotou-se a metodologia
descrita na ISO 10272-1 (2006), que tem como objetivo o isolamento do
microrganismo alvo.
Os caldos foram retirados da refrigeração, dispostos em temperatura
ambiente e posteriormente submetidos à temperatura de incubação 41,5 ± 1°C
por 6 horas, em microaerofilia.
Alíquotas de cada caldo positivo foram semeadas, por esgotamento, com
auxílio de alças descartáveis, na superfície de ágar Charcoal Cefoperazona
Desoxicolato Modificado (mCCDA) (OXOID®) suplementado com antibióticos e
em ágar CampyFood ID (BIOMÉRIEUX®). Todas as placas foram incubadas em
microaerofilia a 41,5±1°C/ 44±4 horas.
44
Terminado o período de incubação, colônias com características típicas de
Campylobacter spp. foram selecionadas comparando-as com as cepas
referências. No ágar mCCDA as colônias apresentavam-se acinzentadas,
geralmente com brilho metálico, planas e úmidas, com tendência ao
espalhamento (FIGURA 1A). No ágar CampyFood ID, selecionaram-se colônias
com coloração avermelhada e levemente metalizadas (FIGURA 1B).
Na ausência de colônias isoladas, uma alçada do crescimento foi semeada
por esgotamento na superfície de ágar Campyfood ou ágar mCCDA
suplementado e incubada a 41,5 ± 0,5°C por 48 horas em atmosfera de
microaerofilia na tentativa de obtenção de colônias isoladas e puras.
Figura 1- Colônias características de Campylobacter spp. em ágar mCCDA (A) e em ágar CampyFood ID (B).
Das colônias características de Campylobacter spp., foram selecionadas de
uma a cinco unidades formadoras de colônias, de cada ágar, para a realização do
teste de catalase, a mesma colônia foi semeada em ágar sangue e as placas
incubadas em microaerofilia a 41,5± 0,5°C/ 44±4 horas.
Em caso da não realização das análises bioquímicas imediatamente, as
colônias selecionadas foram estocadas isoladas em tubos de polipropileno tipo
“eppendorf” esterilizados com 1,5 mL de leite desnatado esterilizado. Os tubos
foram armazenados em temperatura de congelamento (-18°C) com o objetivo de
Fonte: Arquivo pessoal, 2012.
(A) (B)
45
estocar os isolados de uma mesma amostra para criação de banco de dados e
posterior realização dos ensaios bioquímicos e enzimáticos.
Um tubo de cada amostra congelada foi incubado em estufa com
temperatura de 41°C por um período de duas horas em microaerofilia, para o total
descongelamento, em seguida, foi semeada em ágar sangue. As placas foram
incubadas a 41,5±1°C/ por 24 a 48 horas em ambiente microaerófilo.
De colônias isoladas, sem presença de hemólise, foi realizado o teste de
KOH para verificar se o microrganismo pertencia ao grupo Gram negativo e
contraste de fase para verificar o grau de pureza, morfologia em espiral e
motilidade do tipo saca rolha ou movimento de vai-vem, típicos de Campylobacter
spp. Posteriormente procedeu-se a confirmação, identificação e biotipificação dos
isolados por meio do sistema numérico de identificação bioquímica e enzimática
API Campy (bioMérieux®).
4.3 Identificação bioquímica e enzimática das colônias sugestivas de Campylobacter spp. pelo sistema API Campy
Para a identificação das cepas sugestivas de Campylobacter spp. foi
utilizado o sistema numérico bioquímico e enzimático API Campy (bioMérieux).
Para a preparação do inócuo, as cepas isoladas no ágar sangue foram
transferidas, com auxílio de um suabe esterilizado, para o diluente próprio do
sistema API Campy (bioMérieux), criando uma suspensão com densidade
equivalente ao número seis da escala de McFarland, utilizada imediatamente
após a preparação.
A primeira parte da galeria (testes enzimáticos e convencionais) foi
inoculada com a suspensão densa que hidrata os substratos, inoculou-se a
primeira parte da galeria e o teste H2S da segunda parte da galeria. Cobriu-se o
teste URE com óleo de parafina criando um menisco convexo. Incubou-se a
primeira parte da galeria por 24 horas a 36ºC ± 2ºC em atmosfera aeróbia.
As reações produzidas durante o período de incubação (em aerobiose)
traduzem-se pelas mudanças de cor espontâneas ou reveladas quando feita a
adição de reagentes.
Para inoculação da segunda parte da galeria (testes de assimilação ou
inibição) utilizou-se um meio diluído. Para tanto, abriu-se a ampola de API AUX
46
médium para a qual foi transferida a totalidade da suspensão bacteriana anterior.
Distribuiu-se esta nova suspensão nos tubos e cúpulas e a galeria foi incubada
por 24 horas (± 2 horas) a 35 ± 2ºC em atmosfera microaerófila. As bactérias
capazes de utilizar o substrato correspondente ou que eram resistentes ao
antibiótico testado cresceram visivelmente.
Para a leitura da primeira parte, adicionou-se reagente correspondente
conforme descrito pelo fabricante. Após esta etapa foi necessário esperar o prazo
de cinco minutos para posterior consulta do quadro de leitura. Qualquer reação,
mesmo fraca, foi considerada como reação positiva, conforme as recomendações.
Na segunda parte da galeria, se o teste SUT apresentou resultado positivo,
observaram-se todos os testes de assimilação ou de inibição de crescimento.
Caso houvesse resultado negativo, a incubação foi feita por mais 24 horas.
Qualquer crescimento mesmo muito fraco foi considerado como reação positiva.
As reações foram anotadas na ficha de resultados e em sequência os
dados anotados foram transferidos para o sistema Apiweb para a expressão dos
resultados, conforme o programa aplicável.
47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das 200 amostras de carcaças de frangos analisadas, 56 mostraram-se
positivas pelo miniVIDAS® Campylobacter spp., o que representou 28% de
positividade (Tabela 1).
Das amostras positivas para o método imunoenzimático, 85,7% (48/56)
foram classificadas como do gênero Campylobacter pelo ensaio do isolamento
bacteriano convencional, correspondendo a 24% do total de carcaças analisadas
(48/200), como disposto na Tabela 1.
Tabela 1 - Frequência de amostras positivas e negativas de Campylobacter spp. utilizando o ensaio imunoenzimático (miniVIDAS) e isolamento bacteriano convencional, no período de agosto de 2011 a dezembro de 2012.
Resultado* miniVIDAS® MiniVIDAS + IBC**
Positivo Negativo
Carcaças positivas 56/200 (28%) 48/56 (85,7%) 8/56 (14,3%)
Carcaças negativas 144/200 (72%) Não avaliadas
Total carcaças 200 (100%) 48/200 (24%)
* Resultado considerando o gênero ** IBC - isolamento bacteriano convencional
No presente estudo, observou-se que os métodos empregados permitiram
o isolamento de Campylobacter spp. em 24% das amostras avaliadas. Isto
significa que as carcaças de frango destinadas tanto ao consumo interno quanto à
exportação podem constituir risco alimentar à população. Este patógeno é um
importante causador de enterite bacteriana vinculada a surtos na Europa,
conforme os dados publicados da European Food Safety Authority (EFSA, 2011).
A bactéria em carcaças de frangos indica a presença em abatedouros, uma
vez que as amostras foram obtidas logo após o resfriamento durante as etapas de
operação de abate e sugere sua presença em granjas localizadas no estado de
Goiás.
GARIN et al. (2012) analisaram a prevalência de Campylobacter spp. nas 5
maiores cidades de 4 continentes, África (Dakar no Senegal, Yaounde capital do
Camarões), Oceania (Nouméa na Nova Caledónia), Índia (Antananarivo em
Madagascar) e Ásia (Cidade de Ho Chi Minh no Vietnã). O microrganismo foi
48
isolado em todas as cidades, entretanto, em duas cidades (Yaounde e Noumé) a
prevalência foi alta, (92,7% e 96,7% respectivamente) em contraste com a cidade
de Ho Chi Minh onde a prevalência foi de 15,3%. Os resultados demonstraram a
presença do microrganismo em países em desenvolvimento, de diferentes
continentes, com elevada densidade demográfica e extenso mercado interno
consumidor.
Recentemente em um estudo de DASKALOV et al. (2012), durante 11
meses foram colhidas 292 amostras em 13 matadouros na Bulgária, para
investigar a presença de Campylobacter spp. Os autores constataram que 44,9%
das amostras foram positivas.
No Brasil, SCARCELLI et al. (2005) ao avaliarem 74 amostras de frango
congelados, não detectaram presença de Campylobacter spp., indicando suposta
vulnerabilidade às condições adversas do ambiente.
KUANA et al. (2008a) analisaram 22 lotes de frango de corte durante a
criação e 96 carcaças correspondentes a estes lotes após o abate. Do total das
carcaças coletadas a frequência de isolamento foi de 97,4% (37/38) após a
depenadeira e de 98,3% após o chiller (57/58). Os autores encontraram quatro
lotes inicialmente livres de Campylobacter spp. entretanto, após a depenadeira,
as carcaças correspondentes destes lotes estavam contaminadas.
De acordo com estes autores, as razões para a contaminação das
carcaças podem estar na complexidade das variáveis existentes até a chegada ao
processamento industrial, ou seja, o tempo de transporte, gaiolas previamente
contaminadas e o abate de lotes infectados previamente, o que propicia a
contaminação cruzada entre lotes, em conclusão dos autores, as medidas
higiênicas como as boas práticas de produção são úteis, mas insuficientes para
eliminar completamente o Campylobacter do produto final.
Em Goiás, TRASSI (2012) avaliou a presença de Campylobacter spp. em
oito lotes e em carcaças e vísceras comestíveis (coração, moela e fígado) do
frango, Campylobacter spp. foi identificado em 50% dos lotes avaliados. Foi
identificado também em 4,37% das 160 amostras analisadas, sendo que as
vísceras mostraram-se positivas, ao contrário de todas as carcaças avaliadas que
apresentaram livre de Campylobacter spp.. A variação observada para ocorrência
de Campylobacter pode ser resultante de diferenças geográficas, sazonalidade,
49
além do emprego de diferentes técnicas de amostragem e metodologias
laboratoriais.
Observou-se no presente estudo, o resultado correspondente ao ensaio
imunoenzimático (miniVIDAS®), mesmo não descartando o subsequente
isolamento, reduz o tempo destinado à análise como forma de detecção inicial e é
importante ferramenta para monitorar a higiene dos alimentos, que é uma das
ferramentas para a prevenção de doenças de origem alimentar.
JORGE (2005) ao analisar a inoculação de Campylobacter em três tipos de
substratos (leite C, leite UHT e meio Bolton), observou que metodologias
baseadas em reações imunoenzimáticas demonstraram resultados semelhantes
às metodologias de isolamento validadas. O autor registrou a eficácia e
sensibilidade elevada para o teste e afirmou que métodos de triagem podem ser
utilizados para reduzir o tempo de análise, desde que os resultados sejam
confirmados pelo isolamento em meios de cultura seletivos tradicionais, o que
ocorreu de forma similar no presente estudo.
Neste estudo verifica-se, no entanto que 14,3% das amostras registradas
como positivas frente ao miniVIDAS®, quando avaliadas pelo isolamento
convencional mostraram-se negativas (Tabela 1). Isso pode ter ocorrido pelo
baixo número de células do microrganismo alvo e pela provável presença de
microrganismos acompanhantes. A ausência do suplemento de sangue pode ter
prejudicado a detecção do gênero Campylobacter, comprovadamente dificulta o
isolamento tendo em vista as enzimas que favorecem a manutenção da
microaerofilia no próprio meio de cultura, fator de grande importância para o
cultivo.
LIU et al. (2009) avaliaram a eficácia do ensaio imunoenzimático VIDAS®
na detecção de Campylobacter spp. em carne de frango inoculada em caldo
Bolton suplementado com sangue ou não. Os autores observaram que quando
houve a adição de sangue ao caldo, 27/55 (49,1%) apresentaram resultado
positivo pelo método de triagem e 23/55 (41,8%) foram positivas para o método
de cultivo. Por outro lado, avaliando a detecção e isolamento em caldo Bolton
sem o suplemento de sangue foram encontradas 32/55 (58,2%) amostras
positivas pelo método de triagem e 30/55 (54,5%) pelo método de cultivo.
Estatisticamente não houve diferença entre o método de triagem e o método
50
convencional, entretanto, os autores relataram que o método VIDAS® pode
encurtar o tempo para a detecção de Campylobacter spp. em carne de frango e
observaram que a adição de sangue não é necessária para o isolamento do
agente, corroborando com as determinações feitas para o procedimento analítico
preconizado.
Concordando com os resultados dispostos na Tabela 1, REITER et al.
(2010) ao pesquisarem a presença de Campylobacter spp. em diversas
categorias de amostras utilizando os dois métodos empregados neste estudo,
observaram que o ensaio imunoenzimático detectou maior percentual de
amostras positivas 35/40 (87,5%) para a bactéria em questão, quando
contrastado com o percentual identificado no isolamento bacteriano 26/40 (65%).
Nesta avaliação, os autores concluíram que o ensaio imunoenzimático foi mais
satisfatório que o método convencional.
Torna-se necessário reforçar que os resultados divergentes demonstrados
neste estudo, assim como pelos autores supracitados, podem estar relacionados
ao fato de que o isolamento convencional, apesar de ser adotado como método
padrão para a pesquisa de Campylobacter spp. apresenta alguns fatores
limitantes, como a incapacidade de detectar a presença de células viáveis, mas
não cultiváveis (VNC) e a dificuldade de isolar o microrganismo devido às
características da bactéria (HAZELEGER et al., 1998; LEE et al., 1998; ON, 2005;
RAHIMI et al, 2011), bem como a provável presença de microrganismos
competidores que suplantam a multiplicação da bactéria alvo.
Outro fator que pode estar relacionado, refere-se às descrições de SILVA
et al. (2007) quanto à detecção de Campylobacter em alimentos. Os autores
salientaram que deve ser levado em consideração o fato de que a população
presente nos produtos é normalmente baixa, devido ao não crescimento em
temperaturas abaixo de 30ºC e à extrema sensibilidade à concentração de
oxigênio do ar (21%).
Considerando que o método miniVIDAS® fundamenta-se em uma técnica
de cunho imunoenzimático, há a capacidade de detecção de baixos níveis de
células viáveis cultiváveis. Portanto, é de se esperar que a frequência de células
recuperadas nos meios sólidos pelo método ISO 10272 (2006) seja menor que a
51
taxa de antígenos de Campylobacter presente na amostra e detectada pelo
método de triagem.
LINE (2001) mencionou que a microbiota acompanhante de determinadas
amostras multiplicam-se mais facilmente nos meios sólidos que servem de
suporte à seleção das colônias a serem pesquisadas, dificultando a observação
das colônias características do gênero. Neste experimento foi possível observar
vasto crescimento de bactérias não características nos ágares empregados.
Reforçando o ocorrido neste estudo, HABIB et al. (2011) observaram que
Escherichia coli e Pseudomonas spp. foram capazes de resistir à presença dos
suplementos antimicrobianos adicionados ao caldo Bolton usado para o
enriquecimento seletivo, deste modo, o crescimento de bactérias competidoras
capazes de utilizar pouco oxigênio durante a fase de enriquecimento, pode
subestimar a presença de Campylobacter, que na maioria das vezes é encontrada
em baixa concentração nas amostras.
Quanto às células viáveis não cultiváveis, partindo do pressuposto do
enriquecimento inicial, o ensaio imunoenzimático também apresenta limitações
analíticas que podem ocorrer devido ao limiar de detecção, já que a injúria celular
associada aos microrganismos microaerófilos é suficiente para inviabilizar os
cultivos seletivos. Desta forma, o resultado com um valor de teste inferior ao valor
limiar indica uma amostra que não contém antígenos de Campylobacter ou
contendo uma concentração de antígenos de Campylobacter inferior ao limite de
detecção o que favorece a ocorrência de resultado falso-negativo, conforme
informações sobre limite de detecção de métodos para diagnóstico.
Outro fator a ser considerado, relaciona-se a prováveis interferentes
analíticos como alta concentração de gordura proveniente das amostras. Este
componente pode permanecer na alíquota amostral o que dificulta a ligação entre
antígeno e anticorpo tendo como consequência o resultado falso negativo, pelo
método imunoenzimático, mesmo com as lavagens sucessivas que ocorrem
durante o ensaio automatizado.
Das 48 amostras positivas (24%) frente ao método de isolamento
convencional, 58 isolados foram classificados como sendo do gênero
Campylobacter spp, quanto às provas clássicas de catalase, KOH, morfologia
típica e motilidade características. Como todos os isolados foram submetidos aos
52
testes do sistema API Campy, observou-se que 29 isolados classificaram-se em
perfil aceitável, sendo provenientes de 21 amostras, como pode ser visto na
Tabela 2, e os outros 29 isolados não foram discriminados conforme os resultados
apresentados pelo conjunto de provas bioquímicas, testes de assimilação
enzimática e de antimicrobianos. Tal fato também pode ser explicado pela
complexa taxonomia de Campylobacter, devido à diversidade genética. Segundo
ON (1996) pode ocorrer resultado “falso negativo” quando o método não é capaz
de detectar todas as espécies.
Tabela 2- Classificação do perfil numérico dos isolados de Campylobacter spp. provenientes de carcaças de frangos analisadas entre agosto de 2011 e dezembro de 2012.
Perfil Numérico Cepas positivas/total
Percentual %
Correspondência a amostras positivas ao
IBC
Aceitável 29/58 50 21 (10,5%)
Inaceitável 29/58 50 -
Total 58 100% -
Das 200 carcaças de frangos analisadas, 21 (10,5%) foram
comprovadamente positivas para o gênero, tendo por fundamento o conjunto
analítico do método de triagem, sequencial isolamento bacteriano para amostras
positivas e provas de assimilação enzimática, bioquímicas e de perfil
antimicrobiano, para confirmação do gênero, espécie e subespécie, conforme o
caso.
Neste estudo, todas as amostras estavam em condição de refrigeração. No
entanto, devido à indisponibilidade dos insumos para análise alguns dos isolados
foram congelados antes da realização das análises bioquímicas pelo sistema API
Campy. Acredita-se que a divergência dos resultados entre os métodos de
triagem e isolamento convencional, em decorrência da classificação de perfil
inaceitável para 50% dos isolados pode estar relacionada ao congelamento. De
acordo com ON (1996), a bactéria pode sofrer variações em sua expressão
gênica devido a fatores ambientais, afetando o poder discriminatório dos testes
bioquímicos.
53
REINA et al. (1995) avaliaram a eficácia do sistema API Campy na
identificação bioquímica de 62 estirpes de Campylobacter spp. pré identificadas
como hipurato negativas, isoladas de fezes de pacientes com diarreia. Os autores
observaram que cinco tiveram o perfil numérico 6421706. De acordo com os
autores, este perfil não existia até a data da publicação do trabalho podendo
conduzir a um perfil inválido. Entretanto, o programa de acesso para registro do
perfil numérico, fornecido pelo fabricante possui esse perfil classificado como de
boa identificação para Campylobacter coli com 98,4% de similaridade.
No mesmo ano, HUYSMANS et al. (1995) realizaram a comparação entre
métodos bioquímicos convencionais e o método API Campy, estes autores
relataram que não houve vantagens na utilização do sistema numérico sobre os
métodos convencionais oferecidos e que os testes convencionais mostraram
satisfatórios para a identificação rotineira de Campylobacter.
Estudo realizado por SHIH (2000) teve como objetivo comparar o sistema
API Campy com o método bioquímico tradicional para caracterização de 85
amostras de Campylobacter isoladas de carcaças de aves, obtendo 100% de
concordância para gênero Campylobacter e para as espécies Campylobacter
jejuni (96%) e Campylobacter coli (97%).
SAMOSORNSUK et al. (2007) utilizando o sistema API Campy, não
identificaram três isolados de Campylobacter, os quais posteriormente foram
confirmados pelo ensaio da reação em cadeia pela polimerase. Naquele estudo, o
sistema bioquímico identificou um isolado como Arcobacter cryaerophilus,
entretanto, houve posterior identificação de DNA de Campylobacter na amostra, o
que demostra que técnicas moleculares são mais eficientes para detectar as
espécies de Campylobacter.
BIASI (2010) ao utilizar o sistema numérico API Campy verificou
divergência do resultado comparado à técnica molecular da reação em cadeia
pela polimerase, por este motivo, a autora questionou a real eficiência das provas
bioquímicas e enzimáticas para a identificação do patógeno, uma vez que são
observadas falhas quando estas provas são comparadas aos métodos
genotípicos.
MARINOU et al. (2012), no primeiro trabalho realizado na Grécia sobre o
tema abordado, analisaram 1080 amostras de diversas fontes de origem animal e
54
isolaram o microrganismo em 16 amostras. Todos os isolados foram
armazenados a - 80°C e, posteriormente identificados utilizando o sistema API
Campy. Com este método foi possível identificar sete dos 16 isolados.
Na presente pesquisa, algumas limitações e dificuldades na interpretação
dos resultados por fraca formação de cores das reações de gama glutamil
transferase (GGT), pirrolidonil arilamilase (PyrA), L-arginina arilamidase (ArgA) e
L-aspartato arilamidase (AspA), podem explicar alguns dos perfis classificados
como inválidos. Quanto aos testes de assimilação ou de inibição do crescimento,
houve necessidade de incubação por 48 horas, tendo em vista leitura dúbia de
algumas reações. Acredita-se que estas constatações relacionam-se à
similaridade dos isolados ao gênero, sem no entanto, identificá-los e classificá-los.
ON (1996) afirmou que apesar do sistema API Campy possuir diversos
testes para identificação do microrganismo, um fator agravante é a não inclusão
de todas as espécies de importância clínica da família Campylobacteriaceae na
lista relacionada pelo sistema.
Todavia, a ocorrência de 10,5% (21/200) de Campylobacter não significa a
ausência do microrganismo nas amostras que apresentaram colônias
características do patógeno, mas que não foram confirmadas. Isso pode ser
comprovado pelo estudo realizado por KUANA et al. (2009), quando detectaram a
presença do patógeno por métodos bioquímicos convencionais, mas o mesmo
não foi detectado pelo sistema numérico API Campy.
No presente trabalho, o sistema de biotipificação numérica API Campy foi
utilizado para confirmação dos isolados sugestivos de Campylobacter e para a
identificação das espécies termofílicas do microrganismo. Observa-se que foram
isoladas bactérias classificadas como do gênero (7,0%), Campylobacter coli
(58,6%), Campylobacter jejuni subespécie jejuni biótipo 2 (17,2%), Campylobacter
jejuni subespécie doylei (3,4%), Campylobacter lari (13,8%).
Relatórios da EFSA (2012) revelaram que entre 2.386 amostras isoladas,
Campylobacter jejuni é a espécie mais frequentemente isolada de carcaças de
frangos com 34,2% dos isolados, seguido por Campylobacter coli com 27,3% e
Campylobacter lari com 0,2%. Entretanto 38,7% dos isolados foram relatados
somente como Campylobacter spp., o que pode ser devido a dificuldade em se
identificar a espécie.
55
Neste estudo, Campylobacter coli (58,6%) foi a espécie de maior
frequência, seguida por Campylobacter jejuni subespécie jejuni 2 (17,2%).
FERRO (2012) utilizando o sistema API Campy identificou 24 colônias de
Campylobacter, 22 foram caracterizadas como pertencentes à espécie
Campylobacter jejuni, sendo 16 (66,70%) pertencentes à subespécie jejuni
(29,16% jejuni 1 e 37,50% jejuni 2) e 6 (25%) à subespécie doylei, uma cepa
(4,16%) pertencente à espécie C. lari e uma (4,16%) pertencente à espécie C.
coli.
KUANA et al. (2009) também encontraram predominância de C. jejuni
(66,7%) em carcaças de frango, sendo 42,9% caracterizados como C. jejuni
subsp. jejuni 1, 23,8% como C. jejuni subsp. jejuni 2 e 9,5% como C. jejuni subsp.
doylei. Os autores encontraram ainda outras três espécies, sendo 14,3% de C.
coli e 4,8% de C. fetus e C. upsaliensis.
MARINOU et al. (2012) utilizando o sistema API Campy, detectou 7 dos 16
isolados, destes, 4 foram identificados como C. coli, 2 como C. lari e 1 como
Arcobacter cryaerophilus. Ao realizar a analise pela técnica de PCR o número de
amostras positivas para C. coli aumentou para 14 das 16 amostras analisadas. De
acordo com os autores, a maior prevalência de C. coli pode estar relacionada a
região geográfica onde as amostras foram colhidas.
No estudo de DASKALOV et al. (2012), durante 11 meses, foram colhidas
292 amostras em 13 matadouros na Bulgária para investigar a presença de
Campylobacter spp. O estudo revelou que 44,9% das amostras foram positivas
para Campylobacter spp. sendo que C. coli prevaleceu sobre C. jejuni em 61,8%
e 37,4%, respectivamente, a prevalência foi maior nos meses de junho e julho,
demonstrando variação sazonal.
A Tabela 3 apresenta dados referentes aos perfis classificados como de
similaridade ao gênero e espécies de Campylobacter spp., no estudo em questão.
Ainda, de acordo com os dados obtidos na identificação pelo sistema API
Campy, os resultados podem ser expressos como: “Excelente identificação”,
“Muito boa identificação”, “Boa identificação” e “Identificação aceitável” (Tabela 4).
Analisando esta Tabela, percebe-se que C. jejuni subespécie jejuni biotipo
2 foi a que apresentou melhor identificação pelo sistema API Campy, apesar de
não ser a espécie de maior frequência.
56
Tabela 3 - Identificação de Campylobacter spp., utilizando o sistema API Campy e a probabilidade de identificação.
Amostra Isolados
Espécie/Subespécie Probabilidade
(%)
A
1
2
3
Campylobacter spp.
Campylobacter coli
Campylobacter coli
100
97.1
99,7
B 1
2
Campylobacter jejuni subespecie jejuni 2
Campylobacter lari
98,9
98,3
C 1
2
Campylobacter coli
Campylobacter lari
99,2
98,3
D 1 Campylobacter coli 99,2
E 1 Campylobacter coli 99
F 1 Campylobacter coli 94,2
G 1 Campylobacter coli 41
H 1 Campylobacter coli 92,2
I 1 Campylobacter lari 98,3
J 1
2
Campylobacter coli
Campylobacter coli
97,1
99,5
K 1 Campylobacter coli 99,3
L 1 Campylobacter coli 97,2
M 1 Campylobacter jejuni subespecie doylei 92,3
N 1 Campylobacter jejuni subespecie jejuni 2 99,9
O 1 Campylobacter coli 74,4
P 1
2
Campylobacter jejuni subespecie jejuni 2
Campylobacter lari
79,2
71
Q 1
2
Campylobacter coli
Campylobacter spp.
99,5
100
R 1 Campylobacter coli 97,9
S 1 Campylobacter jejuni subespecie jejuni 2 99,9
T 1
2
Campylobacter coli
Campylobacter coli
97,2
99
U 1 Campylobacter jejuni subespecie jejuni 2 99,9
Tabela 4- Expressão dos resultados apresentados pelo sistema API Campy.
Expressão resultados
Valores limiares
N° de Isolados
% Cepa Frequência
57
Excelente identificação
%id >= 99.9 5 17,2 C. jejuni ssp.
jejuni 2 3
Muito boa identificação
%id >= 99.0 8 27,6 C. coli 8
Boa identificação
%id >= 90.0 12 41,4
C. coli C. lari
C. jejuni ssp. jejuni 2
C. jejuni ssp. doylei
7 3 1
1
Identificação fraca
%id <= 80.0 4 13,8 C. coli
C. jejuni jejuni 2 C. lari
2 1 1
De acordo com os dados dispostos na Tabela 4, 86,2% das cepas
identificadas referiram-se a excelente, muito boa ou boa identificação.
Outro fator a ser considerado é o surgimento de Campylobacter resistentes
a antimicrobianos usados na terapia e profilaxia (RAHIMI et al., 2011).
Consequentemente há o aumento da prevalência de estirpes resistentes aos
antibióticos encontradas nos alimentos, o que culmina em reemergência de
microrganismos resistentes (PALERMO NETO, 2011).
Neste estudo foi determinado o perfil de resistência antimicrobiana para
três antimicrobianos utilizando o sistema API Campy; ácido nalidíxico, cefazolina
e eritromicina.
No presente trabalho, em relação à resistência ao ácido nalidíxico,
observou-se resistência em 37,93% dos isolados avaliados (11/29). Considerando
as espécies identificadas, C. coli apresentou resistência em 58,82% (10/17) e
uma cepa de C. jejuni ssp. jejuni 2.
Verificou-se também resistência a cefazolina em 20 (68,96%) isolados,
sendo que das cepas de C. coli 14 (82,35%) e quatro cepas de C. jejuni (66,66%)
também foram resistentes. Simultaneamente 11 isolados (37,93%) foram
resistentes para o ácido nalidíxico e cefazolina sendo 10 isolados de C. coli e um
isolado de C. jejuni ssp jejuni 2. A elevada resistência das bactérias à cefazolina é
esperada, uma vez que esta característica é utilizada, conforme recomendação
da ISO 10.272-1 (2006), na identificação das espécies de Campylobacter.
Com relação à sensibilidade, nove isolados (31,03%) foram sensíveis aos
dois antimicrobianos, e foram classificados como C. lari (4/9), C. coli (3/9) e C.
jejuni (2/9).
58
A resistência à eritromicina (macrolídeo) foi observada em nove amostras
(31,03%), sendo que todas eram da espécie C. coli.
ZHAO et al. (2010) encontraram baixo percentual para a resistência a
eritromicina (2,8%) em isolados de Campylobacter de amostras de frangos
refrigerados, assim como BARDON et al. (2011) afirmaram que a resistência a
eritromicina é normalmente baixa em Campylobacter spp.
Os resultados deste trabalho podem ser comparados a outros que
observaram que a resistência é geralmente mais comum em C. coli do que a C.
jejuni, incluindo a resistência a fluoroquinolonas e macrolídeos (BORGES, 2009;
FRAQUEZA, 2009).
A sensibilidade aos antimicrobianos está associada a diversos fatores os
quais estão relacionados à expressão dos genes de resistência; a presença de
elementos móveis (plasmídeos e transposons) contendo genes de resistência;
além das altas taxas de transferência lateral de genes. Estes e outros fatores
fazem com que estes marcadores sejam inconstantes e inapropriados como
característica taxonômica, principalmente para um microrganismo tão complexo
como Campylobacter spp.
Com o uso de método de triagem, isolamento convencional e sistema de
biotipificação numérica foi demonstrada prontamente a caracterização dos
isolados de Campylobacter. No entanto, foi observado que alguns isolados
sugestivos de Campylobacter, por apresentar positividade no teste de triagem,
crescimento em meios seletivos e na temperatura de incubação e a morfologia e
motilidade característica do gênero em questão, não foram identificados pelo
sistema numérico e, portanto, foram considerados negativos. Entretanto, a
ocorrência de perda do perfil para algumas espécies, em testes conclusivos para
a sua diferenciação, pode ter prejudicado a aplicabilidade deste sistema na
identificação das amostras que resultaram em um perfil inválido, isso pode sugerir
que os isolados resultaram de mutações. Também pode ter ocorrido a ausência
de expressão fenotípica, decorrente do congelamento dos isolados antes da
realização das provas bioquímicas. Além do mais deve se levar em consideração
que nem todas as espécies estão no banco de dados do sistema e a presença de
várias espécies em um mesmo isolado, dificultando a caracterização bioquímica.
59
Sendo necessário o uso de testes mais sensíveis e específicos para a
identificação deste complexo microrganismo.
60
6. CONCLUSÕES
1. A associação dos métodos imunoenzimático, isolamento bacteriano
e caracterização pelo sistema API permitiu a identificação dos
isolados em espécie s subespécies.
2. Campylobacter spp. está presente em carcaças de frangos,
produzidas no estado de Goiás, destinadas tanto ao mercado interno
e externo.
3. A espécie de maior frequência foi Campylobacter coli. Foram
identificadas em menor frequência Campylobacter jejuni e
Campylobacter lari.
4. Monitoramento oficial para o gênero bacteriano Campylobacter spp.
deve compor estratégia de redução de patógenos em carne avícola.
61
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