caracterizaÇÃo de aeromonas spp. isoladas de Águas nÃo tratadas para consumo humano

CARACTERIZAÇÃO DE AEROMONAS SPP. ISOLADAS DE ÁGUAS NÃO TRATADAS PARA

CONSUMO HUMANO

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial

Maria Ermelinda de Aguiar Ribeiro

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Vila Real, 2008

Instituição Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Curso Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial

Titulo “Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo Humano”

Autor Maria Ermelinda Aguiar Ribeiro

Orientadores Prof.ª Doutora Maria José Félix Saavedra Prof.º Doutor António José Martínez - Murcia

“As Doutrinas espostas no presente trabalho

são da exclusiva responsabilidade do autor”

Este trabalho foi expressamente elaborado como

dissertação original para o efeito de obtenção do

grau de Mestre em Biologia Clínica Laboratorial.

v

AGRADECIMENTOS

Ao Magnifico Reitor da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Professor

Doutor Armando Mascarenhas Ferreira, a minha especial gratidão pela compreensão e

condições proporcionadas, sem as quais não teria sido possível a realização deste

trabalho.

À Professora Doutora Maria José Saavedra, o meu muito obrigada por se ter

disponibilizado para a orientação científica deste trabalho, pelo apoio imprescindível

que sempre me dispensou, bem como pela amizade e compreensão manifestadas.

Ao Professor António Martínez-Murcia, Director do Laboratório de I&D Molecular

Diagnostic Center (MDC), Alicante, Espanha, o meu profundo reconhecimento por ter

aceite a co-orientação deste trabalho, pela compreensão e incentivo demonstrado em

todos os momentos e disponibilidade para realização da sequenciação dos isolados

bacterianos.

Às colegas de Mestrado, Drª. Anabela Borges e Drª.Carla Dias, pela amizade,

cumplicidade demonstradas no decorrer do trabalho analítico, pelo apoio informático, o

meu mais sincero e reconhecido agradecimento.

Ao Departamento de Ciências Veterinárias, pela disponibilização dos meios necessários

para a realização deste trabalho.

Ao meu marido José João, que nos momentos mais difíceis conseguiu sempre apoiar-me

e incentivar-me mostrando uma total dedicação e disponibilidade, pelo que expresso a

minha mais reconhecida gratidão.

Aos meus filhos, João e Ana Filipa, por todos os momentos que deixei de partilhar com

eles.

A todos, familiares, colegas e amigos, por todo o seu apoio demonstrado na realização

deste trabalho.

vi

FINANCIAMENTOS

A realização deste trabalho foi possível mediante o apoio das seguintes

entidades:

CECAV- Centro de Estudos de Ciência Animal e Veterinária, Universidade de

Trás-os Montes e Alto Douro.

vii

TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE

CONGRESSOS INTERNACIONAIS

Ribeiro E., Borges A., Santos D., Saavedra M.J., and Martínez-Murcia A., 2008. Antimicrobial

resistance patterns of Aeromonas spp. in drinking water from Portugal. Proceedings of the “9th

International Symposium on Aeromonas and Plesiomonas”, 10th _

12th September, UTAD,

Vila Real.

JORNADAS NACIONAIS

Ribeiro E., Borges A., Santos D., Saavedra M.J., e Martínez-Murcia A., 2008. Perfil de

resistência a antibióticos de Aeromonas spp. isoladas de águas de consumo não tratadas em

Portugal. Livro de resumos das 2as

Jornadas de Biologia, 7 e 8 de Outubro, UTAD, Vila Real.

viii

RESUMO

____________________________________________________________

O género Aeromonas forma uma unidade monofilética dentro do sub-grupo gama -3 das

Proteobactérias. Bactérias do grupo das Aeromonas surgem em diversos ambientes

aquáticos. Está também comprovada a presença de Aeromonas spp. em águas para

consumo humano, tratadas e não tratadas. Os organismos deste grupo são

frequentemente referidos como “patogénicos emergentes” sendo pesquisados

obrigatóriamente no Canadá, Itália e Holanda. Assim, pretende-se com este estudo,

fazer uma avaliação da presença de organismos do género Aeromonas em águas não

tratadas de fontes, poços e nascentes, para consumo humano em dois concelhos do

Distrito de Vila Real. Pela sua importância, diversidade genética, e o seu nível de

resistência a antibióticos foi o género seleccionado para a elaboração deste trabalho. A

identificação das estirpes foi realizada por sequenciação dos genes 16S rRNA, gyrB,

gyrA e rpoD. Foram obtidos um total de 34 isolados agrupados em sete espécies

distintas – A. hydrophila, A. eucrenophila, A. caviae, A. tecta, A. veroni, A. bestiarum e

A. encheleia – e um grupo distinto dos actualmente identificados, que pela sua distância

filogenética poderá corresponder a uma espécie ainda não descrita. Foi efectuada a

determinação da susceptibilidade para um total de 27 antibióticos sendo utilizados

β-lactâmicos como as penicilinas (aminopenicilinas), cefalosporinas (1ª, 2ª, 3ª e 4

geração), monobactâmicos e carbapenemos. Adicionalmente outros antibióticos foram

testados como: tetraciclinas, quinolonas, aminoglicosídeos, sulfamidas e cloranfenicol.

Dos antibiogramas realizados verificou-se que todas as estirpes apresentaram

multiresistência. Para a amoxicilina e cefalotina obtiveram-se índices de resistência de

100%. Para o carbapenemo testado (imipenemo) 3% das estirpes apresentaram

resistência e 13% foram consideradas intermédias. Todas as estirpes foram sensíveis

para a piperaciclina/tazobactan, aminoglicosídeos, aztreonamo e tetraciclina.

ix

ABSTRACT

____________________________________________________________

The genus Aeromonas forms a monophyletic unit within the gamma-3 subgroup of the

class Proteobacteria. Bacteria of Aeromonas spp. are widely spread in aquatic

environments. They also occur in untreated and treated drinking water. Members of this

genus are considered as “emerging pathogens” and have been the focus of studies in

Canada, Italy and Holland. Thus, it is intended with this study, to evaluate the presence

of organisms of the genus Aeromonas in untreated water sources, wells and springs, for

human consumption in two counties of the District of Vila Real. The reason for the

selection of this genus for study is its clear importance in terms of health, genetic

diversity, and its level of resistance to antibiotics. The identification of strains was

performed by sequencing of 16S rRNA, gyrB, rpoD and gyrA. A total of 34 isolates

were obtained which were clustered into seven distinct species - A. hydrophila,

A. eucrenophila, A. caviae, A. tecta, A. veronii, A. bestiarum and A. encheleia- and a

distinct group not identified, which by their phylogenetic relationship may correspond

to a new species of Aeromonas. The antibiotic susceptibilities of these species were

determined using 27 antibiotics including β-lactams such as penicillins

(aminopenicillins), cephalosporins (1st, 2nd, 3rd and 4 generation), monobactams and

carbapenems. Additionally other classes of antibiotics were also tested e.g.

tetracyclines, quinolones, aminoglycosides, sulphonamides and chloramphenicol. From

antibiograms performed it was found that the strains showed multidrug-resistance. To

amoxicillin and cephalothin rates of resistance were 100%. For the carbapenems tested

(imipenem) 3% of the isolates showed resistance and 13% were considered as having

intermediate resistance. All isolates were sensitive to piperaciclina/tazobactan,

aminoglycosides, tetracycline and aztreonam.

x

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS v

FINANCIAMENTOS vi

TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE vii

RESUMO viii

ABSTRACT ix

ÍNDICE x

ÍNDICE DE FIGURAS xiii

ÍNDICE DE QUADROS xiv

ÍNDICE DE TABELAS xv

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. A qualidade da água para consumo 2

1.2. O género Aeromonas 6

1.2.1. Ecologia e Patogenicidade 7

1.2.2. Taxonomia e Filogenia 9

1.2.3. Métodos de Identificação 12

1.2.3.1. Métodos microbiológicos convencionais 12

1.2.3.2. Métodos genéticos 13

1.2.3.3. Sequenciação do gene que codifica para o rRNA 16S 14

1.2.3.4. Sequenciação de genes “Housekeeping” 14

1.2.3.4.1. Genes gyrB e gyrA 16

1.2.3.4.2. Gene rpoD 18

1.3. Agentes antimicrobianos 18

1.3.1. Principais mecanismos de resistência 19

1.3.2. Antibióticos antiparietais 20

1.3.2.1. β-lactâmicos 21

1.3.3. Inibidores de β-lactâmicos 22

xi

1.3.4. Antibióticos inibidores da síntese proteica 23

1.3.4.1. Aminoglicosídeos 23

1.3.4.2. Tetraciclinas 24

1.3.4.3. Cloranfenicol 24

1.3.4.4. Macrólidos 25

1.3.5. Antibióticos inibidores da síntese dos ácidos nucleicos 25

1.3.5.1. Quinolonas 26

1.3.6. Antibióticos antimetabolitos 26

1.3.6.1. Sulfonamidas/Trimetropim 26

1.3.7. Antibioresistência no género Aeromonas 27

2. OBJECTIVOS 31

3. MATERIAL E MÉTODOS 32

3.1. Origem das amostras 33

3.1.1. Método de recolha das amostras 34

3.1.2. Isolamento pela técnica de filtração por membrana 34

3.1.3. Conservação das estirpes 35

3.2. Caracterização preliminar dos isolados 35

3.2.1. Coloração diferencial de Gram 35

3.2.2. Prova da citromo-oxidase 36

3.2.3. Prova da catalase 36

3.3. Identificação das estirpes bacterianas 37

3.3.1. Extracção de DNA de culturas puras 37

3.3.2. Amplificação de DNA por reacção de PCR 38

3.3.3. Purificação dos produtos de PCR 38

3.3.4. Sequenciação 39

3.3.5. Análise de sequências e construção dos dendogramas 41

3.4. Caracterização bioquímica pelo API 20NE 41

3.5. Perfil de susceptibilidade a agentes antimicrobianos 42

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 44

4.1. Estirpes isoladas 45

4.2. Identificação por sequenciação de isolados bacterianos 47

xii

4.2.1. Identificação dos isolados por sequênciação do gene 16S rRNA 47

4.2.1. Identificação dos isolados bacterianos por sequênciação do gene gyrB 48

4.2.2. Identificação dos isolados bacterianos por sequênciação do gene gyrA 52

4.3. Isolados identificados como Aeromonas spp. 53

4.4. Caracterização fenotípica da estirpe MDC 2464 55

4.4.1. Métodos bioquímicos 55

4.4.2. Sistema de biotipificação numérico API 20NE 55

4.5.Caracterização bioquímica da espécie Aeromonas spp. 57

4.5.1. Sistema de biotipificação numérico API 20NE 57

4.6. Perfil de susceptibilidade a antibióticos 59

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 66

6. BIBLIOGRAFIA 68

ANEXOS

AnexoI-Perfil de susceptibilidade a antibióticos dos isolados identificados por

16s RNA

Anexo II-Perfil de susceptibilidade a antibióticos dos isolados identificados por gyrB,

gyrA e rpoD

xiii

ÍÍNNDDIICCEE DDEE FFIIGGUURRAASS

Figura 1 - Fotografia de microscopia electrónica de bacilos de Aeromonas hydrophila

colonizando o tecido epitelial de intestino humano 7

Figura 2 - Estrutura da DNA girase. Indicação das subunidades funcionais, GyrA e GyrB 17

Figura 3 - Representação dos locais de actuação dos diferentes grupos de antibióticos 19

Figura 4 - Esquema do gene gyrB da E. coli. O fragmento azul indica a região do gene que foi

amplificada e, em negrito, as posições do primer, e primeiro e último nucleótido amplificado

segundo a numeração de E. coli (Huang, 1996) 49

Figura 5 - Árvore filogenética baseada na sequência do gene gyrB dos isolados obtidos neste

trabalho 50

Figura 6 - Árvore filogenética baseada na sequência do gene rpoD. Está representada nesta

figura a estirpe representativa do grupo Aeromonas spp. 54

Figura 7 - Perfil do sistema de biotipificação numérico API 20NE do isolado F9 (MDC 2464)57

Figura 8 - Perfil do sistema de biotipificação numérico API 20NE dos isolados F1BCa1 (MDC

2510) e F1BC1a2 58

Figura 9 - Perfil de susceptibilidade a diferentes antibióticos dos isolados de Aeromonas em

estudo 59

xiv

ÍÍNNDDIICCEE DDEE QQUUAADDRROOSS

Quadro 1 - Estirpes actualmente aceite no género Aeromonas 11

Quadro 2 - Técnica de filtração por membrana 32

Quadro 3 - Procedimento de Coloração pelo método de Gram 35

Quadro 4 - Metodologia de execução da prova da oxidase 35

Quadro 5 - Metodologia de execução da prova da catalase 36

Quadro 6 - Metodologia de extracção do DNA de estirpes bacterianas 37

Quadro 7 - Oligonucleotidos utilizados para reacção de PCR 38

Quadro 8 - Protocolo de Purificação de produtos de PCR 39

Quadro 9 - Oligonucleotidos utilizados em reacção de sequenciação 40

Quadro 10 - Protocolo de precipitação dos produtos de sequenciação 40

Quadro 11 - Procedimento para a realização do sistema API 20 NE 41

Quadro 12 - Técnica de difusão em agar com discos de antibióticos 43

xv

ÍÍNNDDIICCEE DDAASS TTAABBEELLAASS

Tabela 1 - Locais de amostragem e número de amostras 33

Tabela 2 - Identificação da amostra, origem, localização e referência atribuída 46

Tabela 3 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene 16s RNA 47

Tabela 4 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene por gyrB 51

Tabela 5 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene por gyrA 53

Tabela 6 – Perfil bioquímico das estirpes de A. tecta e do isolado MDC2464 56

Tabela 7- Resistência a múltiplos antibióticos das espécies de Aeromonas 63

1. INTRODUÇÃO ________________________________________________________

Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 2

1.1. Qualidade da água para consumo

Desde a época do Império Romano que se sabe que a água é um potencial

transportador de doenças. O controlo microbiológico das águas de consumo humano

tem sido praticado desde o inicio do século XX. Sendo a água um dos elementos

essenciais para o Homem, é necessário que esta seja utilizada em condições de

potabilidade. Em Portugal, cerca de 1 milhão de pessoas não possui água canalizada,

recorrendo a água de diversas origens, nomeadamente poços, minas, furos e fontes.

Nestes casos, sobretudo no interior do país, a contaminação representa um perigo para a

saúde pública, nomeadamente no que se refere aos perigos microbiológicos (Saavedra,

2000).

De entre os microrganismos presentes na água, destacam-se os de natureza

exógena, como os oriundos de matéria fecal humana e animal, tais como os coliformes

totais, coliformes fecais e enterococos. Os coliformes pertencem à família das

Enterobacteriaceae e incluem vários membros dos géneros Escherichia, Enterobacter,

Citrobacter e Klebsiella. Existem ainda os de natureza autóctone, que englobam

diversas espécies e fazem parte da microbiota natural da água, entre elas as bactérias

móveis dos géneros Aeromonas e Pseudomonas (Palumo et al., 1996).

A Organização Mundial de Saúde refere a utilização de microrganismos

intestinais como indicadores de poluição fecal, sendo estes microrganismos

universalmente aceites para a monitorização e avaliação da qualidade microbiológica da

água. A existência de enteropatogénicos em amostras de água para consumo humano

indica potencial contaminação, requerendo atenção imediata e alertam-nos para a

necessidade do seu tratamento (OMS, 2003).

Na Europa são várias as directivas relativas a esta análise, nomeadamente a

directiva nº 98/83/CE que refere os critérios e normas de qualidade da água. Em

Portugal, o Decreto-Lei nº 306/2007, de 27 de Agosto, estabelece o regime da qualidade

da água destinada ao consumo humano, tendo por objectivo proteger a saúde humana

dos efeitos nocivos resultantes da eventual contaminação dessa água e assegurar a

Introdução


disponibilização tendencialmente universal de água salubre, limpa e desejavelmente

equilibrada na sua composição. A qualidade da água para consumo humano, é

estabelecida por parâmetros microbiológicos e baseada em valores paramétricos de

microrganismos patogénicos indicadores de poluição fecal, fixados nas partes I e II do

decreto-lei. Nos países em vias de desenvolvimento as condições socioeconómicas

favorecem a incidência e prevalência de quadros diarreicos, pelo que a preocupação dos

microbiologistas clínicos, incide essencialmente na identificação dos patogénicos

clássicos como a Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Vibrio, Campylobacter e

Yersinia (Payment et al., 1991; Lund, 1994; Asmat e Gires, 2002; Castro- Escarpulli et

al., 2003; Schets et al., 2008). Actualmente E. coli é utilizada como sendo a principal

indicadora de monitorização da poluição da água potável (OMS, 2003), sendo mesmo

considerada um indicador superior (Edberg et al., 2000) e está associada a

contaminação fecal recente (APHA, 2005).

Cada vez mais existem estudos em que outros géneros são considerados como

patogénicos emergentes, e possíveis de ser objecto de monitorização (Asmat e Gires,

2002). Nos países industrializados a circulação de muitos patogénicos tem vindo

progressivamente a diminuir nos últimos anos, pelo contrário, infecções causadas por

patogénicos emergentes (i) bacterianos como: Pseudomonas, Legionella, Arcobacter e

Aeromonas; (ii) parasitas como: Cryptosporodium e Giardia; e (iii) vírus: norovírus,

rotavírus, enterovírus, e astrovírus têm vindo a aumentar (Aulicino, et al., 2005;

Sansebastiano et al., 2008; Schets et al., 2008). Alguns autores referem que se deveria

considerar o género Aeromonas como um indicador na monitorização do funcionamento

do sistema de tratamento e potabilização das águas (Szewezyk et al., 2000; Asmat e

Gires, 2002).

Assim, na Holanda, Itália e Canadá as autoridades de sáude pública, na

sequência do aumento do isolamento de Aeromonas spp. estabeleceram o valor máximo

de 200 UFC/100ml em águas para consumo (Carnahan e Josephh, 2005). Em Itália

limites provisórios e cautelar foram estabelecidos em 1997 para águas minerais naturais

na sua origem (10 UFC/100ml) e (100 UFC/100ml) depois de serem engarrafadas.

Contudo o papel da água de consumo nas infecções causadas por Aeromonas spp. ainda

não está claro (Kirov 1997; Edberg et al., 2007). Fuzihara e colaboradores (1995)

Introdução


verificaram a ocorrência de Aeromonas spp. em amostras de água tratada e não tratada

concluindo estes autores que o consumo dessas águas representam um risco para a

sáude dos consumidores. Estudos referem que a espécie de Aeromonas hydrophila tem

maior prevalência em águas não poluídas, enquanto Aeromonas caviae está associada a

águas com um elevado grau de poluição (Hanninen et al., 1995). A frequência de outras

fenoespécies deste género parece não estar relacionada com condições ambientais

(Fiorentini et al., 1998).

Em 1998, Borrel e colaboradores, isolaram Aeromonas de diferentes espécies

em águas para consumo onde não foram detectados coliformes mostrando que não

existe uma correlação com estes indicadores. O género Aeromonas foi reconhecido

como um enteropatogénico em humanos, e desde 1970 tem ocorrido um maior interesse

na investigação do mesmo. Desde 1995 que este género foi indicado pela EPA

(Environmental Protection Agency) como organismo “patogénico emergente” (Merino

et al., 1995), e a espécie Aeromonas hydrophila como indicadora desse organismo,

tendo sido proposta a “Candidata à Lista dos Contaminantes” nos Estados Unidos por

esta agência.

A biodiversidade de habitats onde estes agentes patogénicos têm sido isolados,

e o crescente número de infecções associadas a este género nas últimas décadas tem

despertado interesse na comunidade científica de forma a estabelecer o risco que este

género representa para a saúde pública. Em 1954 na Jamaica, é descrito o primeiro caso

de infecção, miosite aguda, em humanos por Aeromonas (Hill et al., 1954),

posteriormente numerosos casos de infecções foram publicadas (Von Graevenitz, 1968).

As doenças infecciosas são um dos principais problemas que os países em vias de

desenvolvimento enfrentam.

Estudos revelam que a água desempenha um importante papel na transmissão

do género Aeromonas para humanos e animais (Joseph e Martin-Carnahan, 2000;

Crivelli et al., 2001; Figueras, 2005). É importante saber que os isolados ambientais são

potenciais patogénicos para o ser humano, havendo subpopulações ou subespécies de

Introdução


Aeromonas com maior virulência e que representam um risco para a saúde humana

(Daily et al., 1981; Bin Kingombe et al., 1999; Figueras, 2005).

Em humanos o quadro clínico mais comum está relacionado com

gastroenterites ou com uma condição conhecida como a diarreia do viajante. Infecções

gastrointestinais foram observadas em doentes immunodeprimidos, com doenças

intestinais malignas, doenças hepatobiliares e baixa acidez gástrica após a ingestão de

alimentos e água contaminada (Janda, 1991; Braddour, 1992, Harf-Monteil, 2008).

Numerosos casos têm sido relatados descrevendo o isolamento de Aeromonas spp. em

doentes com diarreia, mas o papel destas bactérias em processos de gastroenterite

continua a ser controverso (Kirov,1993; Janda e Abbott, 1998, Von Gravaenitz, 2007)

mesmo depois de serem isoladas em doentes saudáveis (Janda, 2001; Albert et al.,

2000; Tsai et al., 2006; Figueras, 2005).

Em 1986, Holmberg e colaboradores num estudo que visava avaliarem

aspectos clínicos e epidemiológicos de gastroenterites associadas a Aeromonas spp.

concluíram que o consumo de água não tratada constitui um factor de risco para o

Homem. As três espécies consideradas patogénicas de maior importância para o

Homem são Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii (com 2 biotipos sobria e

veronii), Aeromonas caviae, e constituem assim 85% de todos os isolados clínicos

envolvidos em infecções gastrointestinais como também em infecções extra-intestinais

(Janda, 1991; Braddour, 1992; Abbott, 1998; Janda e Abbott, 1998; Kirov, 2001;

Figueras, 2005; Miñana-Galbis et al., 2007;Von Gravaenitz, 2007). Em contrapartida,

Aeromonas schubertii, Aeromonas jandaei e Aeromonas trota, são consideradas

patogénicos de menor relevância (Sen e Rodgers, 2004; Donohue et al., 2007; Tena et

al., 2008), mas também estão implicadas em doenças nos humanos. Segundo Edberg e

colaboradores (2007) somente três espécies A. hydrophila, A. caviae e A. veronii biovar

sobria, são clínicamente importantes.

Balotescu e colaboradores (2003) referem uma alta mortalidade por infecções

de estirpes do género Aeromonas nomeadamente de certas fenoespécies (A. hydrophila

e A. veronii) em pacientes imunocomprometidos. Para os microbiologistas “essa alta

Introdução


taxa de mortalidade” é provavelmente devida ao pouco conhecimento no que respeita

aos aspectos de antibioresistência em estirpes de Aeromonas, pois tratamentos com

antibióticos para bactérias que apresentam resistência constitutiva levam a resultados

sem sucesso, como também, a crescente tendência de multiresistência que as espécies de

Aeromonas apresentam a alguns grupos de antibióticos (Levy et al., 2005). É

claramente necessário, que intervenções preventivas e programas de monitorização

eficazes, relativamente a águas destinadas ao consumo humano, a actividades

recreativas de lazer e qualidade ambiental, sejam aplicados (Sansebastiano et al., 2008),

de modo a serem conhecidos outros bioindicadores assim como o seu potencial de

resistência.

1.2. O género Aeromonas

O termo Aeromonas, que deriva das palavras gregas “aer” que significa ar ou

gás e “monas” que significa unidade, ou seja unidades produtoras de gás (Martin-

Carnahan e Joseph, 2005). Aeromonas é um género da família Aeromonadaceae.

Actualmente esta família inclui ainda os géneros Oceanimonas, Tolumonas,

Oceanisphaera e Zobellella (Euzéby, 2008). São organismos autóctones do meio

ambiente aquático considerados patogénicos não só para os peixes e anfibios, tendo

actualmente uma importância crescente em humanos.

O género Aeromonas inclui um grupo de bactérias Gram negativo, anaérobias

facultativas, não esporuladas, normalmente oxidade e catalase positiva, capazes de

degradar os nitratos a nitritos, fermentam a D-glucose como fonte principal de carbono

e energia. Estes bacilos não são halofílicos e são resistentes ao agente vibriostático

O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridina) a concentrações de 10 e 150 μg (Martin-

Carnahan e Joseph, 2005). Todas as espécies com excepção de Aeromonas salmonicida

e Aeromonas media são móveis e geralmente movimentam-se por um flagelo polar

(Figura 1). O tamanho varia de 0,3 a 1,0 m de diâmetro e de 1,0 a 3,5 m de longitude.

Podem aparecer como bacilos ou cocobacilos independentes, aos pares ou em cadeias

curtas (Popoff, 1984), a sua temperatura mínima de crescimento é de 4 ºC, a máxima de

Introdução


45ºC. O seu crescimento óptimo é a 30 ºC. A sua tolerância ao pH varia entre 4.5 a 9.0.

Estas espécies produzem exoenximas como amilase, fosfolipase, protease e DNAse

(Popoff, 1984; Kirov, 1997; Kirov et al 2004; Carnahan e Joseph, 2005).

Figura 1 – Micrografía electrónica de bacilos de Aeromonas hydrophila colonizando o tejido epitelial intestinal humano

(“Northwest Fisheries science Center, NOAA”).

1.2.1. Ecologia e patogenicidade

Aeromonas spp. são microrganismos de ocorrência amplamente difundida no

ambiente aquático nomeadamente água doce, água potável, águas contaminadas, água

do mar, sistemas de distribuição de água para consumo, águas termais, lagos, rios, mar,

esgotos, e solos (Hazen et al., 1978; Borrel et al., 1998; Saavedra, 2000; Biscardi et

al., 2002; Abbott, 2003; Palú et al., 2006; Libisch et al., 2008; Sepe et al., 2008).

Existem poucos dados relativamente à presença de Aeromonas spp. no solo, contudo

estudos referem que estas podem persistir e mesmo multiplicar-se, mantendo as suas

características de virulência, o que sugere a importância do solo como reservatório deste

microrganismo (Brandi et al., 1996). A incidência de Aeromonas spp. nos sistemas de

distribuição de águas para consumo tem sido alvo de interesse, dada a sua importância

em termos de sáude pública. A concentração destes microrganismos varia com as

estações do ano, e quando a temperatura ambiente é superior a 20 ºC, verifica-se um

aumento, correspondendo à época de maior incidência de quadros diarreicos, o que

apoia a hipótese de considerar que a água e alimentos são os principais veículos de

transmissão deste género (Schubert, 1991; Kirov, 1993; Chopra e Houston, 1999;

Hernould, 2008).

Introdução


Estes microrganismos têm também sido isolados numa grande variedade de

alimentos tais como carnes, pescado, mariscos, alimentos preparados, produtos de

pastelaria, leite, derivados lácteos e verduras (Palumo et al., 1989; Knochel e Jeppesen,

1990; Kirov et al., 1993; Hänninen e Siitonen, 1995; Castro - Escarpulli et al., 2003;

Bin Kingombe et al., 2004; Ottaviani et al., 2006). Por este motivo alguns autores

consideram que Aeromonas deveria incluir-se na lista de microrganismos que podem

actuar como causadores de toxoinfecções alimentares (Kirov, 1993). As fontes de

infecção em humanos podem ser agrupadas em duas grandes categorias: a primeira

devida ao complexo ambiente - água - animais; e a outra será mediante a ingestão de

comida contaminada, sendo este género cada vez mais referenciado como o principal

causador de diversas infecções ao nível da clínica humana (Joseph e Martin-Carnahan,

2000; Ko et al., 2000; Hsiu-Tsun et al., 2003; Figueras, 2005).

À medida que a diversidade do género Aeromonas foi sendo descrita aumentou

a sua importância como agente patogénico (Carson et al., 2001). Algumas espécies têm

sido reconhecidas como patogénicas para o Homem causando infecções intestinais e

extraintestinais, incluindo septicémia, feridas, infecções da pele, tecidos moles e no

sangue (Janda 1991; Chang et al., 1997; Krzyminska et al., 2008), como também nos

animais especialmente em peixes, anfíbios e repteis (Martin-Carnahan e Joseph, 2005;

Figueras, 2005; Tena et al., 2007).

Vários estudos referem que as Aeromonas constituem um grupo de

organismos patogénicos primários, sendo a primeira causa de doenças extraintestinais, e

estão fortemente associadas a infecções gastrointestinais em humanos (Janda, 1991;

Braddour, 1992; Subashkumar et al., 2006). O facto de não se conseguir reproduzir em

animais de laboratório os sintomas diarreicos observados no Homem, também não tem

permitido demonstrar a capacidade enteropatogénica desta bactéria (Janda e Abbott,

1998; Von Graevenitz, 2007). Assim o papel de Aeromonas spp. como agente causador

de gastroenterite continua a ser objecto de investigação e mesmo especulação.

Bardhan e colaboradores em 1998 consideraram Aeromonas spp., Escherichia coli e

Klebsiella spp. como os agentes mais importantes de diarreia infantil no Bangladesh.

Introdução


Estudos recentes têm demonstrado que a presença de Aeromonas spp. na água

é um potencial risco para a saúde pública, uma vez que estes microrganismos

produzem uma ampla gama de factores de virulência, deste modo a patogenicidade das

infecções associadas a estes microrganismos é considerada complexa e multifactorial

(Chopra et al., 2000). A presença de factores de virulência nas espécies de Aeromonas

spp. é um facto comprovado, sendo referido tanto componentes estruturais como

produtos extracelulares (Cahill,1990; Thornley et al., 1997; Chacón et al., 2003; Harf-

Monteil et al., 2004a; Ardi, 2005).

Os componentes estruturais mais estudados e que estão estão associados ao

processo de invasão e patogenicidade são flagelos; cápsula; píli; a camada S; os

lipopolissacarideos e as proteínas de membrana externa (Merino et al., 1998; Gavín et

al., 2002; Gavín et al 2003; Kirov et al., 2004). Aeromonas spp. produzem ainda uma

grande variedade de substâncias extracelulares , tais como, enterotoxinas, hemolisinas,

citotoxinas, DNAses, RNAses, elastases, lecitinases, amilases, proteases e lipases,

substâncias envolvidas nos processos de patogenicidade (Nord et al., 1975; Popoff,

1984; Cahill,1990; Kirov, 1997; Schiavano et al., 1998; Chopra e Houston, 1999;

Santos et al., 1999; Fivaz et al., 2001; Asmat e Gires, 2002; González- Serrano et al.,

2002; Kirov et al., 2004; Martin-Carnahan e Joseph, 2005). Os factores de virulência

referidos no género Aeromonas têm sido descritos quer em estirpes clínicas, estirpes

isoladas em águas e também em alimentos (Bin Kingombe et al., 1999; Martins et al.,

2002; González- Serrano et al., 2002; Sen e Rodgers, 2004).

1.2.2. Taxonomia e Filogenia

A taxonomia do género Aeromonas é um pouco complexa e por vezes confusa,

devido à falta de congruência entre as características fenotípicas e genotípicas das

espécies que constituem este género (Hasan et al., 2006). A caracterização fenotípica é

extremamente difícil e ambígua (Martin-Carnahan e Joseph, 2005). Ao longo dos

últimos anos, o género Aeromonas foi sujeito a numerosas revisões ao nível da

taxonomia e da nomenclatura. Bacillus punctatus foi o primeiro nome atribuído a um

isolado deste género (Zimmerman, 1890). Na sétima edição do Manual de Bergey‟s

(Snieszko, 1957) este género foi incluído na família Pseudomonadaceae, englobando

Introdução


quatro espécies, três espécies mesófilas móveis (A. hydrophila, A. punctata, A.

liquefaciens), e uma psicrófila imóvel (A. salmonicida). Nos finais dos anos sessenta,

Schubert (1969) propôs a classificação do género em três espécies com oito

subespécies: duas espécies móveis, A. hydrophila com as subespécies A. hydrophila

subsp. hydrophila; A. hydrophila subsp. anaerognes e A. hydrophila subsp.

proteolytica, A. punctata com as subespécies A. punctata subsp. punctata e A. punctata

subsp. caviae; e uma espécie imóvel, A. salmonicida com as subespécies A. salmonicida

subsp. salmonicida, A. salmonicida subsp. achromogenes e A. salmonicida subsp.

mausocida. Esta proposta foi a publicada na oitava edição do Manual de Bergey‟s

(Schubert, 1974), sendo este género incluído na família Vibrionacaeae.

Colwell e colaboradores (1986) através de estudos moleculares de Aeromonas

baseados na análise da sequência do rRNA 5S demonstraram que o género Aeromonas

apresentava uma posição filogenética suficientemente distante das famílias

Enterobacteriaceae e Vibrionaceae constituindo uma familia independente, propondo

elevar este género à categoria de família com o nome taxonómico de Aeromonadaceae.

Em 1994 na edição do Manual de Bacteriologia de Bergey‟s o género

Aeromonas segue ainda incluído na família Vibrionaceae (Holt et al., 1994). Martínez-

Murcia e colaboradores em 1992a realizam o primeiro estudo filogenético baseado na

análise do rRNA 16S em Aeromonas. Neste estudo foi ratificada a proposta de elevar o

género Aeromonas à categoria de família, demonstrando que forma uma linha diferente

dento da sub classe gamma-Proteobacteria. Esta proposta foi aceite, e assim aparece na

nova edição do Manual de Bergey‟s 2001, mantendo-se assim na nova edição deste

manual (Martin-Carnahan e Joseph, 2006). No mesmo trabalho foi também ratificado

que o género Aeromonas engloba um grupo de espécies muito parecidas, com uma

similitude de sequência que varia de 97,8% a 100%, e os resultados deste estudo estão

em concordância com os obtidos com a hibridação DNA-DNA. Este género encontra-se

em constante evolução não somente pela descrição de novas espécies mas também pela

sua reclassificação (Martínez- Murcia et al., 1992b;Yáñez et al., 2003; Miñana-Galbis

et al., 2004, 2007; Huys et al., 2005; Saavedra et al., 2006, 2008).

Introdução


Recentemente foi proposta a espécie Aeromonas sharmana, com base num

único isolado obtido de águas termais, GPTSA-6T, (Saha e Chakrabarti, 2006), no

entanto Martínez-Murcia e colaboradores em 2007, esta espécie não foi considerada

como um membro do género Aeromonas. Em 2005 eram 18 as espécies descritas

(Martin- Carnahan e Joseph, 2005; Saavedra et al., 2006) mas em 2009 esse valor

aumentou para 22 (Quadro 1), com a descrição de uma nova espécie, Aeromonas

fluvialis (Alperi et al., 2009).

Quadro 1. Espécies actualmente aceitem no género Aeromonas

Espécie Estirpe tipo Origem Autores

A. hydrophila ATCC 7966T Leite Stainer, 1943

A. bestiarum ATCC 51108T Peixe doente Ali et al., 1996

A. salmonicida NCIMB 1102T Salmão Griffin et al., 1953

A. caviae ATCC 15468T Cobaia Schubert e Hegazi, 1988

A. media ATCC 33907T Água de piscicultura Allen et al., 1983

A. eucrenophila NCIMB 74T Peixe da água doce Schubert e Hegazi, 1988

A. sobria NCIMB 12065T Peixe Popoff et al., 1981

A. veronii ATCC 35624T Muco Hickman-Brenner et al., 1987

A. jandaei ATCC 49568T Fezes humanas Carnahan et al., 1991a

A. schubertii ATCC 43700T Abcesso cutâneo Hickman-Brenner et al., 1988

A. trota ATCC 49657T Fezes humanas Carnahan et al., 1991b

A. allosaccharophila CECT 4199T Enguia Martínez-Murcia et al., 1992b

A. encheleia CECT 4342T Enguia Esteve et al., 1995b

A. popoffii LMG 17541T Água potável Huys et al., 1997

A. culicicola MTC 3249T Mosquito Pidiyar et al., 2002

A. simiae IBS S6874T Fezes de macaco Harf-Monteil et al., 2004

A.molluscorum CECT 5864 Molusco bivalve Miñana-Galagis et al., 2004

A.bivalvium

CECT 7113 Bivalve Miñana-Galagis et al., 2007

A. aquariorium MDC47T/DSM 18362T Aquário Martínez-Murcia et al., 2008

A. tecta CETC7082T MDC91T Isolado clínico e ambiental Demarta et al., 2008

A. piscicola S1.2T Peixe Hidalgo et al., 2008

A. fluvialis CECT 7401=LMG 24681 Água (Rio) Alperi et al., 2009

Introdução


No sentido da resolução de algumas ambiguidades, obtidas mediante a

sequênciação de genes 16S rRNA, têm sido pesquisados outros marcadores

filogenéticos que correspondem às sequências dos genes denominados,

“Housekeeping”, aqueles que estão envolvidos em manter as suas funções vitais na

célula. Estudos baseados na sequenciação do gene gyrB e do gene rpoD (Yàñez et al.,

2003, Soler et al., 2004; Martínez-Murcia et al., 2005; Saavedra et al., 2006, 2007)

revelaram uma boa correlação com as metodologias anteriormente utilizadas,

nomeadamente a hibridação DNA-DNA e a sequenciação do gene 16S rRNA, assim

mostrou-se capaz de solucionar, com maior clareza certas ambiguidades existentes

(Martínez- Murcia et al., 2005).

1.2.3. Métodos de Identificação

1.2.3.1. Métodos microbiológicos convencionais

O género Aeromonas em geral é de difícil identificação laboratorial. A elevada

variabilidade de características bioquímicas dos elementos deste género faz com que as

técnicas habitualmente usadas baseadas no fenotípo por vezes aportam resultados

ambíguos e muitas vezes incorrectos. Os métodos convencionais de identificação

baseiam-se nas propriedades fenótipicas dos microrganismos, isto é, um conjunto de

marcadores fenótipicos como fisiológicos, bioquímicos, estruturais, e todas as

características que porpocionam o aspecto global do individuo (Roman-Aravena et al.,

2008). A falta de concordância entre os métodos de identificação bioquímica e genética,

especialmente nos isolados de origem ambiental, baseiam-se no facto dos esquemas de

identificação bioquímica utilizados não distinguirem as espécies de Aeromonas

existentes (Ørmen et al., 2005), como também a descoberta de novas espécies que não

estão contempladas nos esquemas de identificação frequentemente utilizados (Abbout et

al., 2003).

As bases de dados para a identificação de Gram negativo aeróbios ou

anaeróbios facultativos até à pouco tempo incluíam apenas A. hydrophila ou Aeromonas

spp.. Actualmente existem pelo menos 14 sistemas comerciais que contêm na sua base

de dados diversas espécies pertencentes a este género, mas a sua utilidade em

Introdução


determinados casos é duvidosa (Joseph e Carnahan, 1994; Vivas et al., 2000). Um

problema geralmente associado a elementos deste género é a confusão com algumas das

espécies do género Vibrio (Vivas et al., 2000; Park et al., 2003). Estudos de Abbott e

seus colaboradores (1998) referem um caso concreto da identificação de duas estirpes

de Aeromonas, identificadas pelo sistema de biotipificação numerica (API 20NE), como

membros do género Vibrio.

Deste modo, o uso sistemas de biotipificação numérica no diagnóstico não são

aconselháveis quando se pretende uma identificação precisa (Valera e Esteve, 2002). O

de metodologias capazes de identificar todas as espécies de Aeromonas é crucial. A sub

identificação dos elementos deste género poderá gerar consequências ao nível da saúde

pública. Por este motivo desde a década de oitenta tem vindo a ser desenvolvidas

diferentes técnicas baseadas na análise de DNA que se têm mostrado mais estáveis e

fiáveis.

1.2.3.2. Métodos genéticos

A porção do genótipo que se expressa em cada estirpe é portanto o fenótipo,

estas propriedades são muito variáveis pela capacidade de adaptação das bactérias a

qualquer ecossistema, e por outro lado apresentam uma interpretação subjectiva e

complicada. A aplicação de métodos genéticos abre novas perspectivas aos

microbiologistas para a identificação ou tipificação de alguns géneros fastidiosos na

determinação da taxonomia e filógenia (Castro-Escarpulli et al., 2003). O

desenvolvimento das técnicas de biologia molecular nos últimos anos tornou possível a

identificação de espécies bacterianas directamente através da análise genética do seu

DNA (métodos genotípicos). O DNA bacteriano contém toda a informação biológica da

célula, quer se expresse ou não e de uma forma geral o genótipo é mais estável durante a

sua evolução. Apesar da introdução de novos métodos de identificação de espécies, não

somente para o género Aeromonas, mas também para outros, o método DNA-DNA

hibridação é considerado por alguns autores como „a gold standard‟ para a identificação

taxonómica de novas espécies (Stackebrandt et al., 2006; Janda e Abbott, 2007).

Introdução


1.2.3.3. Sequênciação do gene que codifica para o 16S rRNA

A sequência nucleotídica do genoma bacteriano é a impressão digital de cada

bactéria. O estudo da sequência do 16S rRNA é um dos métodos mais discriminativos e

precisos para determinar o nível de relação filogenética entre bactérias (Woese, 1987).

A sua utilização permitiu a identificação de quase todas as espécies no entanto quando

se pretende estudar relações filogenéticas próximas, como é o caso de espécies de um

mesmo género, esta técnica apresenta algumas limitações (Martínez-Murcia et al., 1992;

Martínez-Murcia et al., 1999; Janda e Abbott, 2007), visto ser uma molécula

extremamente conservada, verificando-se frequentemente situações em que espécies

distintas apresentam poucas diferenças nucleotídicas (Janda e Abbott, 2007).

A análise do gene 16sRNA (com aproximadamente 1500pb) pode ser

potencialmente aplicada a todas as bactérias. Este gene, o 16S rRNA, que codifica a

unidade de rRNA é altamente conservado, mas ao mesmo tempo possui uma zona

hipervariavel com cerca de 138 pb na região 5‟ terminal que permite a identificação da

maior parte das espécies (Mendes et al., 2003), sendo normalmente usado para a

classificação taxonómica, e é considerado um bom marcador molecular (Woese, 1990;

Amann et al., 1995).

Ainda que, a maioria destes resultados estejam em concordância com os

obtidos com a técnica de hibridação DNA-DNA, também se encontram sequências de

16S rRNA idênticas para espécies que apresentam grupos de hibridação distintos, como

é o caso de A. salmonicida e A. bestiarum que representando duas espécies distintas

deste género ao nível da sequência de rDNA 16S não se verifica nenhuma diferença

nucleotidica (Martínez-Murcia et al., 2005). Por esta razão foi necessário pesquisar

outros métodos eficazes para a identificação das estirpes deste género.

1.2.3.4. Sequenciação de genes “Housekeeping”

A sequenciação é um método simples e preciso que permite a identificação da

maioria das espécies bacterianas, sendo útil quando é impossível obter um resultado

fidedigno pelos métodos fenótipicos convencionais usados habitualmente pelos

Introdução


laboratórios de rotina. Nos últimos anos têm aparecido cada vez mais estudos

taxonómicos e filogenéticos baseados em genes “Housekeeping”, genes que codificam

para proteínas de função vital na célula. A utilização de genes alternativos para a

identificação molecular de certas espécies aumenta ainda as potencialidades da

sequenciação. Deste modo estes genes apresentam um conjunto de qualidades que

permitem a sua utilização em filogenia.

Estas vantagens de forma simplificada e objectiva são defenidas em três pontos

principais:

i) São proteínas com uma função vital na célula logo representam uma função

ancestral e encontram-se em todas as células;

ii ) São proteínas sobre as quais já existem estudos científicos que estudaram a

correlação com os estudos de hibridação DNA-DNA e as conclusões

filogenéticas das duas técnicas são semelhantes o que demonstra que na

maioria dos casos não existe transferência horizontal destas proteínas ou que

caso exista é baixa;

iii ) O facto de se tratar de uma sequência que codifica para uma proteína a

percentagem de substituição nucleotídica é superior à encontrada no rDNA

16S, o que se torna útil para o esclarecimento de relações filogenéticas mais

próximas.

A utilização de genes alternativos para a identificação molecular de certas

espécies aumenta ainda as potencialidades da sequenciação. Diferentes genes têm vindo

a ser utilizados para a classificação de bactérias ao nível intra-genérico tais como os

genes recA (Kullen et al., 1997), groEL (Haake et al., 1997), hps 75 (Pai et al., 1997),

tuf (Chavagnat et al., 2002), rpoD (Yamamoto et al., 2000; e gyrB (Kasai et al., 2000;

Yáñez et al., 2003; Soler et al., 2004).

Actualmente existem estudos a demonstrar que estes genes esclarecem de

forma mais objectiva as relações filogenéticas interespécies no género Aeromonas

(Yáñez, 2003; Soler et al., 2004; Kupfer et al., 2006) e caracterização de novas espécies

Introdução


(Pidiyar et al., 2002). O estudo das sequências nucleotídicas e de aminoácidos destes

genes tem permitido esclarecer os pontos controversos das árvores filogenéticas

elaboradas com base na sequenciação dos genes ribossómicos (Feng et al., 1997;

Doolitle, 1999).

O gene gyrB e rpoD parecem bons indicadores da evolução do genoma, pelo que

podem ser utilizados como marcadores filogenéticos para a sistemática bacteriana (Kim

et al., 1999; Watanabe et al., 2001). Apenas existe uma cópia do gene e não sofre

transferência horinzontal (Sawada et al., 1999). Estes dois genes housekeeping têm sido

os mais utilizados como uma ferramenta filogenética, dada a sua aplicação já

anteriormente descrita, no género Aeromonas (Soler et al., 2004).

1.2.3.4.1. Genes gyrB e gyrA

A DNA girase pertence à família das topoisomerases de tipo II. As DNA

topoisomerases intervêm em processos biológicos tão essenciais como a replicação,

transcrição e recombinação das moléculas de DNA, através do controlo que exercem

sobre o grau de superenrolamento da molécula de DNA numa reacção que não requer

energia (Huang, 1996). Estas enzimas classificam-se atendendo à sua função em tipo I,

tipo II, tipo III ou Tipo IV. A primeira toipomerase do tipo II a ser descoberta foi a

DNA girase em Escherichia coli que é constituída por duas subunidades, GyrA e GyrB

de 97 kDa e 90 kDa respectivamente (Figura 2), e que se integram numa holoenzima de

estequiometria A2B2 (Cove et al., 1997).

A sua funcionalidade está dividida pelos seus domínios. Esta divisão é apoiada

por análises bioquímicas e pela determinação cristalográfica da estrutura da proteína

(Wigley, 1995). A proteína GyrB apresenta o extremo N-terminal, onde ocorre a

hidrólise do ATP (domínio ATPase), necessária ao superenrolamento negativo da

molécula de DNA circular. Este processo é endoenergético, desfavorecido

termodinamicamente, pelo que a energia necessária obtém-se a partir da hidrólise de

uma molécula de ATP. O extremo C-terminal, zona de união à proteína A (GyrA), é a

zona da molécula de enrolamento do DNA (Cabral et al., 1997). O extremo N-terminal

Introdução


da proteína GyrA contém o centro activo para a tirosina (Tyr 122) necessária para o

reconhecimento do DNA, é aqui que ocorre a ligação covalente proteína-DNA e se

ligam também as quinolonas. O extremo C-terminal é a zona de enrolamento do DNA

(Huang, 1996; Cove et al., 1997).

Figura 2- Estrutura da DNA girase. Com indicação das subunidades funcionais, gyrA (A‟) e gyrB (B‟)

Apenas existe uma variação de 40 resíduos entre as classes de proteobacterias

gamma e épsilon, a sub unidade A da DNA girase tem 850 aminoácidos em todas as

espécies bacterianas estudadas. A classe epsilon, aparece separada do resto dos grupos

de proteobacterias devido à inserção dos 40 resíduos, sendo que esta diferença de

aminoácidos se localiza no extremo C-terminal da proteína. A subunidade B da DNA

girase em bactérias pode apresentar dois tamanhos diferentes, num grupo representado

pela E. coli, esta enzima tem aproximadamente 800 aminoácidos e todas as

proteobacterias conhecidas pertencem a este grupo.

O outro grupo, representado pelo Bacillus subtilis apresenta cerca de 650

aminoácidos. Os 150 aminoácidos extra das girases do grupo de E. coli formam um

bloco no domínio II da proteína. A ausência desta região nas DNA girases de B. subtilis

sugere que este fragmento não é necessário para a reacção enzimática da

topoisomerização. Deste modo, a inserção destes 150 aminoácidos (450 nucleótidos) é a

que permite separar o grupo de proteobacterias do grupo de Gram positivo. A sequência

nucleotídica do gene gyrB permitiu estudar as relações filogenéticas de géneros como:

Acinetobacter (Yamamoto et al., 1999); Pseudomonas (Yamamoto et al., 2000);

Salmonella, Shigella e Escherichia (Fukshima et al., 2002) e Aeromonas (Yanez et al.,

2003). Todos os trabalhos realizados demonstram a fiabilidade e versatilidade da

Introdução


utilização deste gene marcador molecular. Yanez e colaboradores em 2003

demonstraram que a sequenciação deste gene em estudos moleculares de elementos do

género Aeromonas era coerente com as outras técnicas antes utilizadas.

1.2.3.4.2. Gene rpoD

O gene rpoD é uma ferramenta útil para o reconhecimento de novas linhas

filogenéticas no género Aeromonas (Alperi et al., 2008). A RNA polimerase é a enzima

responsável pela síntese de RNA dirigida pelo DNA.Todas as células têm RNA

polimerase e nas bactérias uma variedade destas enzimas sintetiza todos os RNAs

celulares, com excepção dos primers utilizados na replicação do DNA. A RNA

polimerase de E. coli é uma proteína de 480 KD composta por quatro subunidades α2

ββ`Ϭ; duas subunidades α (encoded by the rpoA gene), uma subunidade β (rpoB), uma

subunidade β`(rpoC) e ainda a subunidade Ϭ (Kupfer et al., 2006). A subunidade Ϭ

também chamada de factor Ϭ separa-se do núcleo da enzima após a iniciação da síntese

do DNA e continua isoladamente o processo de polimerização (Ishihama, 2000;

Borukhov e Nudler, 2003). Nas bactérias expressam-se diferentes tipos de factores Ϭ70

.

O factor Ϭ70

é responsável por 99% da transcrição celular, é codificado pelo gene rpoD

(Borukhov e Nudler, 2003). Dependendo das necessidades da célula e das condições do

meio são utilizados outros factores de transcrição. A sequência nucleotídica do rpoD foi

utilizada no estudo taxonómico dos géneros Acinetobacter (Yamamoto et al., 1999);

Pseudomonas (Yamamoto et al., 2000) e Aeromonas (Soler et al., 2004).

1.3. Agentes antimicrobianos ____________________________________________________________________________________

Cada grupo de antibióticos tem um alvo específico na célula bacteriana

(Figura 3). Dependendo da zona de actuação, e de algumas características dos agentes

antimicrobianos como a estrutura química e o peso molecular a sua actividade será

variável, devendo encarar-se cada antibiótico em particular e não como um todo.

Segundo Sousa (2002) para que as moléculas de antibióticos possam exercer uma

eficiente actividade, sem que existam problemas de toxicidade para com os animais

Introdução


(incluído o Homem), são investigadas as diferenças entre a célula bacteriana

(procariotica) e as células dos animais (eucariota).

Figura 3 – Representação dos locais de actuação dos diferentes grupos de antibióticos. Adaptado de

Sousa, 2006.

Um agente antibacteriano poderá eventualmente não actuar sobre um

determinado agente patogénico por causas intrínsecas (por ex. elevado peso molecular

para atravessar as membranas celulares), nestas situações esse agente patogénico

apresenta resistência inata a esse antibiótico não fazendo parte do seu espectro de acção.

Apesar disso, sabe-se que moléculas inicialmente activas contra determinadas espécies

bacterianas hoje já não o são (Lipsitch e Levin, 1997). A resistência bacteriana aos

antibióticos vai evoluindo dada a pressão selectiva exercida pela antibioterapia, gerando

mutações espontâneas ou a transmissão horizontal de genes de resistência por

transferência de outras estirpes. Pois o fluxo de genes de resistência entre o cromossoma

e elementos genéticos móveis, como plasmídeos, transposões ou integrões, leva a que a

ecologia genética de resistência se propague facilmente (Kummerer, 2004).

1.3.1. Principais mecanismos de resistência

A resistência aos antibióticos é um problema global, com implicações em

saúde pública. O uso generalizado de antibióticos permitiu às bactérias sobreviver e

multiplicar-se sob a pressão dos antibióticos devido à sua flexibilidade genética (Cohen,

1997; Kapil, 2005; Levy, 2005). A resistência aos antibióticos pode ser intrínseca ou

Introdução


adquirida (Courvalin, 1996; Sousa, 2001; Kapil, 2005; Sousa, 2006). Os mecanismos de

resistência que se podem observar estão relacionados com a forma de acção dos

antibióticos, existindo quatro mecanismos principais (Gilman et al., 1996; Ferreira e

Sousa, 1998; Sousa, 2006). A adopção de determinado mecanismo de resistência por

parte das bactérias está intimamente relacionada com o seu modo de acção e

mecanismos de aquisição de resistência dos antibióticos. As bactérias por vezes

combinam diferentes mecanismos de resistência, o que as torna multiresistêntes.

Pseudomonas aeruginosa apresenta resistência aos carbapenemos e poderá dever-se à

combinação da produção de β-lactamases, aumento das bombas de efluxo e alterações

na parede celular da bactéria (Sousa, 2001).

A emergência da resistência antimicrobiana pode ser uma ameaça para o

ambiente e saúde pública, maior que o aparecimento de novos agentes patogénicos ou o

reaparecimento de antigos. Compreender e reconhecer os problemas da resistência

antimicrobiana e usar os agentes químicos apropriadamente é da maior importância para

a prevenção da sua propagação (Levy, 1990; Cohen, 1997). As bactérias são melhores

engenheiros genéticos que o Homem e vão continuar a escapar ao efeito dos

antibióticos. A melhor solução é usar os antibióticos quando necessários, evitar a

antibioterapia sem conhecimento do agente patogénico em questão e o cumprimento de

regras rígidas com fins profiláticos.

1.3.2. Antibióticos antiparietais

Os antibióticos antiparietais são inibidores na fase de síntese do peptidoglicano

(molécula característica da parede celular bacteriana) e actuam nas diferentes fases da

biossíntese desta macromolécula. Apenas iremos abordar os antibióticos β-lactâmicos, e

fosfomicina. Os β-lactâmicos constituem um grupo muito importante, uma vez que são

amplamente utilizados na clínica, devido á sua baixa toxicidade e boa eficácia

terapêutica (Essack, 2001; Sousa, 2006). Os restantes compostos englobados neste

grupo apenas manifestam acção sobre organismos Gram positivo.

Introdução


1.3.2.1. β-lactâmicos

Os antibióticos β-lactâmicos englobam na sua totalidade quatro grupos de

antibióticos distintos, como as penicilinas, as cefalosporinas, os monobactâmicos e os

carbapenemos. As penicilinas foram o primeiro grupo de antibióticos a ser

comercializado, a sua descoberta em 1928 por Alexander Fleming revolucionou a

terapêutica das doenças infecciosas. Os antibióticos β-lactâmicos não são homogéneos

na sua composição, nem nos seus efeitos. Entre si apresentam um anel β-lactâmico

constituído por 3 átomos de carbono e um de nitrogénio com radicais substituintes. Este

anel encontra-se fundido com um anel tiazolidina nas penicilinas enquanto nas

cefalosporinas com um anel dihidrotiazina. Relativamente aos monobactâmicos apenas

temos o anel β-lactâmico, nos carbapenemos observa-se a presença de um C a substituir

o S no anel tiazolidina (Sousa, 2006).

Este grupo de antibióticos inibem irreversivelmente as D-D-

carboxitranspeptidases, conhecidas como PBPs (Penicillin-Binding-Proteins),

impedindo assim o establecimento das pontes interpeptídicas entre as cadeias peptídicas

vizinhas. Estes antibióticos só são activos sobre bactérias em crescimento (Essack,

2001; Sousa, 2005; Sousa, 2006). Existem várias moléculas de características distintas

que foram desenvolvidas para rebater certas limitações destes compostos, como

reacções alérgicas e elevada resistência microbiana (carboxipenicilinas,

ureidopenicilinas, aminopenicilinas (Sousa, 2001; Sousa, 2006)). São exemplos deste

grupo a penicilina, a ampicilina, a carbenicilina, a piperacilina e a amoxicilina.

As cefalosporinas actualmente comercializadas podem ser classificadas em

primeira, segunda, terceira e quarta geração, de acordo com o seu espectro de

actividade. À medida que se avança nas diferenças de gerações, o espectro para as

bactérias Gram negativo amplia-se, perdendo-se actividade contra as Gram positivo. A

ceftazidima, a cefotaxima, a cefoxitina e o cefepime são exemplos de Cefalosporinas

(Sousa, 2001, Sousa, 2006). Têm sido desenvolvidos outros β-lactâmicos não clássicos,

os monobactâmicos e os carbapenemos.

Introdução


O aztreonamo a única molécula actualmente comercializada no grupo dos

monobactâmicos. Este antibiótico é muito activo para bactérias aeróbias Gram negativo,

e dotado de grande estabilidade para as β-lactamases de largo espectro. Os

carbapenemos dentro dos β-lactâmicos, são o grupo com maior actividade - antibióticos

de largo espectro que resistem à hidrólise de grande parte das β-lactamases existentes

(Sousa, 2001; Sousa, 2006). No mercado nacional existem três moléculas a ser

comercializadas (imipenemo, meropenemo e ertapenemo), porém este grupo está

reservado ao uso hospitalar como último recurso para estirpes multiresistentes. O

mecanismo de resistência mais importante para esta família é a hidrólise enzimática por

β-lactamases. Estas enzimas plasmídicas ou cromóssomicas catalizam a hidrólise do

anel β-lactâmico (ligação CO-N) inactivando o antibiótico (Bonomo, 2003). Em

Pseusomonas aeruginosa a ausência de porinas justifica a sua resistência aos

carbapenemos (Essack, 2001; Sousa, 2006).

Actualmente existem centenas de β-lactamases descritas. As β-lactamases

dependendo da sua especificidade são muitas vezes chamadas penicilases,

cefalosporinases e carbapenemases. Outra forma de classificação é em relação ao centro

activo, as serino-β-lactamases têm a serina no seu centro activo e as metalo-

β-lactamases que têm zinco no centro activo.

1.3.3. Inibidores de β-lactâmicos

Com a finalidade de expandir o espectro destes compostos é usual a sua

associação com compostos inibidores de β-lactamases. As substâncias inibidoras devem

ser estruturalmente semelhantes ao antibiótico. O sulbactam, ácido clavulânico e o

tazobactam, têm estruturas parecidas com o anel β-lactâmico que a enzima o hidrolisa

ficando unida, irreversivelmente, não podendo voltar a actuar sobre outras moléculas

β-lactâmicas (Poole, 2004), ao contrário do que sucede com os antibióticos

convencionais.

Introdução


1.3.4. Antibióticos inibidores da síntese proteica

Os antibióticos inibidores da síntese proteica actuam no complexo ribossomal

70S. Este complexo é formado pela associação das subunidades 30S e 50S). A

subunidade 30S é composta de rRNA 16S (aproximadamente 1.500 nucleótidos) e 21

proteína, enquanto a unidade 50S é constituida por rRNA 5S (aproximadamente 120

nucleótidos), rRNA 23S (aproximadamente 2.900 nucleótidos) e por 31 proteinas. As

mitocondrias presentes nas células eucariotas, possuem ribossomas do tipo bacteriano

70S, assim podem ser vulneráveis aos efeitos destes antibióticos se estivermos perante

moléculas lipófilas (cloranfenicol) que com grande facilidade atravessam as membranas

mitocondriais inibindo a sua síntese proteica. Este grupo de antibióticos inclui os

aminoglicosídeos, as tetraciclinas o cloranfenicol, macrólidos lincosamidas e o ácido

fusídico (Sousa, 2006)

1.3.4.1. Aminoglicosídeos

Os antibióticos aminoglicosídeos juntamente com os β-lactâmicos são

considerados os principais agentes na terapia de infecções severas provocadas por

bacilos Gram negativo e cocos Gram positivo (Sousa, 2006). Os elementos deste grupo

são bastante heterogéneos quanto à sua composição química, propriedades

antibacterianas e propriedades farmacológicas. A gentamicina, a canamicina, a

neomicina, a estreptomicina a tobramicina, a amicacina, e a netilmicina são alguns dos

elementos deste grupo. Estes antibióticos apresentam um anel aminoclitol, derivado do

inositol, unido a açúcares aminados, através de ligações glicosídicas. Têm marcada

actividade contra bacilos Gram negativo aeróbios (Kotra et al., 2000).

As estirpes produtoras de aminoglicosídeos desenvolveram um mecanismo de

auto-defesa, a fim de escaparem ao suicídio produzem metilases para o rRNA 16S,

impedindo a acção dos antibióticos na subunidade 30S. Recentemente no Japão foram

detectados plasmídeos codificadores destas metilases (gene armA e rmtB). Estes genes

têm-se disseminado rapidamente para outras espécies representando já um mecanismo

de relevância neste grupo (Yamane et al., 2004; González-Zorn et al., 2005).

Introdução


1.3.4.2. Tetraciclinas

As tetraciclinas constituem uma família de antibióticos contendo um núcleo

hidroxinaftaceno, formado por quatro anéis benzónicos fundidos. A tetraciclina é o

protótipo do grupo e os restantes elementos possuem características bastante

semelhantes a esta. Estes antibióticos inibem a síntese proteica, actuando ao nível da

subunidade 30S dos ribossomas. Inibem a ligação dos aminoacil- tRNA(s) aos

ribossomas, impedindo estericamente a ligação codão anticodão ente o tRNA e o local

A dos ribossomas (Chopra et al., 2001). As bombas de efluxo são o principal

mecanismo de resistência bacteriana aos antibióticos desta família. O sistema de efluxo

é especificado por diferentes determinantes genéticos, os genes tet, que codificam as

proteínas TET (Orth et al., 2000).

Estes antibióticos são considerados de largo espectro, activos contra bacilos

Gram positivo e Gram negativo, aeróbios e anaeróbios (Chopra e Roberts, 2002), no

entanto tem se vindo a observar uma elevada prevalência de resistências às tetraciclinas.

1.3.4.3. Cloranfenicol

Trata-se de um antibiótico de largo espectro abrangendo bactérias Gram

positivo e Gram negativo, inibidor da síntese proteica, bacteriostático, actuando na

subunidade 50S, impedindo a actuação da transpeptidase. O cloranfenicol liga-se à

subunidade 50S do ribossoma, impedindo portanto a transpeptidase durante a fase de

alongamento (Sousa, 2006). Dada a sua lipofilia atravessa a dupla membrana

mitocondrial, inibe a síntese proteica em mitocondrias na medula óssea provocando

alterações hemáticas graves (aplasia medular) (Sousa, 2006). O mecanismo de

resistência mais comum é a inactivação enzimática do cloranfenicol por

acetiltransferases bacterianas. O gene cat codifica as O-acetiltransferases bacterianas

que promovem a acetilação da molécula de cloranfenicol em C3 originando derivados

acetoxi, destituídos de propriedades antibióticas (Yoo et al., 2003). Estes genes podem

ter localização plasmídica ou cromossómica.

Introdução


1.3.4.4. Macrólidos

Os macrólidos têm um espectro bacteriano alargado, sendo activos contra

bactérias Gram positivo. Englobam compostos como a eritromicina, e são inibidores da

síntese proteica. Bactérias Gram negativo são intrinsecamente resistentes à eritromicina

com excepção de Neisseria spp., Haemophilus spp., Legionella spp., Campylobacter

spp., Mycoplasma spp., Chlamydia spp. (Sousa, 2006).

Este grupo apresentam uma apetência reversível para as subunidades 50S dos

ribossomas e bloqueiam o local P, prejudicando a transpetidação e/ou a translocação,

exercendo deste modo uma acção bacteriostática. Estas moléculas anfilíticas

moderadamente lipófilas são incompatíveis com os canais de porina (via hidrófila) e

com a superfície predominantemente hidrófila de muitas bactérias Gram negativo. A

difusão através das regiões fosfolipídicas da membrana externa é assim a principal via

de entrada destes compostos.

A mais frequente forma de resistência deste grupo é a resistência cruzada aos

Macrólidos-Lincosamidas-Sptreptogramina B (resistência MLSB). Esta resistência deve-

se à N.N‟-dimetilação da adenina na posição 2058 no rRNA 23S, mediada por uma

metilase, produto do gene erm (Schwarz et al., 2002). Estes genes podem ter localização

cromossómica ou plasmídica e podem se exprimir constitutivamente ou por indução. As

bombas de efluxo, geradas por produtos do gene mef, têm também importância na

resistência bacteriana dos macrólidos no entanto, este mecanismo não é eficaz em todas

as moléculas do grupo (Wierzbowski et al., 2005).

1.3.5. Antibióticos inibidores da síntese dos ácidos nucleicos

Fazem parte deste grupo de antibióticos a rifampicina, o metronizadol e as

quinolonas. Actuam sobre a síntese dos ácidos nucleicos provocando a morte celular

(Sousa et al., 1998).

Introdução


1.3.5.1.Quinolonas

As quinolonas são antibióticos de síntese, derivados do ácido naladíxico sendo

que este foi a primeira quinolona a ser utilizada em 1962 no tratamento da cistite

causada por bactérias Gram negativo (Oliphant e Green 2002; Sousa, 2006).

Actualmente esta família de antimicrobianos tem sofrido grande evolução, pelo que é

classificada, tal como as cefalosporinas, em quatro gerações com base na sua actividade

antimicrobiana. Ao longo das gerações estes antibióticos vão aumentando

sucessivamente o seu espectro de acção. As quinolonas são inibidores directos da

síntese do DNA e actuam mediante a inibição da DNA girase (Topoisomerase II)

codificada pelos genes gyrA e gyrB (principal alvo nas bactérias Gram negativo) e a

toipomerase IV codificada pelos genes parC e parE. Ao actuarem contra as

topoisomerases, as quinolonas interferem com o enrolamento do DNA, impedindo a

replicação e a transcrição do DNA. Assim sendo, a forma de resistência mais comum é

a mutação das enzimas alvo (Topoisomerase II e IV). São exemplos desta família de

antibióticos o ácido naladíxico, a ciprofloxacina, a norfloxacina, a ofloxacina e a

levofloxacina.

1.3.6. Antibióticos antimetabolitos

1.3.6.1. Sulfonamidas / Trimetopim

O ácido para-aminobenzoico (PABA) é um factor indispensável para o

crescimento celular, pois sem ele não há síntese dos ácidos nucleicos. Todas as

moléculas que inibam esta cadeia metabólica, como as sulfamidas, sulfonas, PAS e

Trimethopim são conhecidas como anti-metabolitos ou como inibidores da síntese dos

ácidos nucleicos. As sulfamidas, PAS e sulfonas competem com o PABA impedindo a

sua adição à pteridina, bloqueando assim a síntese de ácido dihidropteroico. O enzima

dihidropteroato sintetase tem mais afinidade para as sulfonamidas do que para o se

substrato natural (PABA). Trimetopim inibe competitivamente a dihidro-folato

redutase, o enzima que reduz dihidrofolato a tetrahidrofolato (também conhecido como

co-factor folato, indispensável à síntese de timidina, purinas e N-formilmetionina).

Introdução


Trimetopim, um anti-metabolito, siner-geticamente associado a sulfametoxazol, é

largamente utilizado na terapêutica. As sulfamidas inibem portanto a síntese de DNA,

RNA e síntese proteica.Têm efeito bacteriostático

1.3.7. Antibioresistência no género Aeromonas

O aparecimento de resistências é uma estratégia dos procariotas própria da sua

evolução natural, ocorre na natureza, mas “nós” temos acelerado este curso natural com

a sua sobre-pressão selectiva que torna mais rápido o aparecimento de uma grande

variedade de respostas (Levy, 2005). A transferência da resistência ocorre entre

bactérias patogénicas e comensais, mas também nas presentes no solo, água, esgotos,

estrume, efluentes e plantas.

A emergência de isolados clínicos e isolados ambientais resistentes a

antibióticos constitui um sério problema a nível mundial, principalmente a ocorrência

de bactérias resistentes a antibióticos provenientes de ambientes naturais, dado que estes

microrganismos não são expostos directamente aos antibióticos (Blasco et al., 2008).

Considerando as crescentes evidências de que a resistência clínica está intimamente

associada à ambiental (Prabhul et al., 2007; Abriouel et al., 2008), a presença de

resistência a diferentes grupos de antibióticos em microrganismos não “patogénicos”,

isolados de ambientes aparentemente inócuos como é o caso das águas de consumo, é

um procedimento promissor e emergente, relativamente à disseminação dos genes

responsáveis por este tipo de resistência, às quais a investigação deve responder (Sayah

et al., 2005).

No âmbito de determinar o perfil de susceptibilidade aos agentes

antimicrobianos comercializados actualmente, vários estudos têm sido efectuados com

isolados de Aeromonas. Apesar disso, a maioria dos trabalhos que estudam a

sensibilidade in vitro a antimicrobianos incide apenas sobre as espécies fenotípicas

“A. hydrophila“, “A. caviae” e “A. sobria”, porque a identificação habitual das estirpes

é realizada mediante testes bioquímicos, que segundo o anteriormente descrito, não

Introdução


identificam com exactidão os elementos deste género ao nível de espécie. As estirpes de

Aeromonas hydrophila isoladas de ambientes aquáticos no Bengladehs por McNicol e

colaboradores em 1980 revelaram sensibilidade à gentamicina, canamicina e ácido

naladíxico, contudo apresentaram um fénótipo de resistência múltiplo à estreptomicina e

tetraciclina.

Num trabalho realizado por Kampfer e colaboradores (1999) testou a

sensibilidade de 217 estirpes, representativas das 14 espécies descritas até aquele

momento, a 69 agentes antimicrobianos. Estes autores verificaram que não existiam

diferenças significativas entre as espécies. No entanto, o trabalho de Overman e Janda

(1999) em que foi testado o efeito de 18 antibióticos em 56 estirpes, compara a

susceptibilidade de estirpes pertencentes às espécies: A. jandaei, A. schubertii, A. trota e

A. veronii, tendo verificado que A. jandaei era a espécie que apresentava maior nível de

resistência aos antibióticos testados e A. trota seria a espécie mais susceptível.

De uma forma geral admite-se que os indivíduos deste género são resistentes

à penicilina, ampicilina e carbenicilina (β-lactâmicos - penicilinas). Em vários trabalhos

é referido que estas estirpes são intrinsecamente resistentes à ampicilina de tal forma

que, para o seu isolamento foi generalizada a adição deste antibiótico ao meio de cultivo

(Ceylana et al., 2003; Vila et al., 2003; Vivekanandhana et al., 2005). Estudos

descrevem que 100% dos isolados apresentam resistência à ampicilina (Vila et al.,

2002).

Contudo, outros estudos têm vindo a descrever estirpes com sensibilidade a

este antibiótico (Goñi-Urriza et al., 2000a; Saavedra et al., 2004). Num trabalho de

Saavedra e seus colaboradores (2004), realizado com estirpes de Aeromonas isoladas de

trutas de aquacultura, concluiu-se que 35% das estirpes testadas apresentaram

susceptibilidade à ampicilina, referindo que o facto de se considerar estas estirpes

intrinsecamente resistentes à ampicilina foi baseado em estirpes clínicas, nas estirpes

ambientais, em que a pressão selectiva é significativamente diferente, os resultados

podem ser diferentes.

Introdução


Relativamente ao perfil de susceptibilidade em estirpes de origem alimentar

existem também diferentes estudos (Radu et al., 2003; Vivekanandhan et al., 2005; Palú

et al., 2006; Akinbowale et al., 2007). Em 2006, Palú e colaboradores verificaram que

todas as estirpes de Aeromonas spp.de origem alimentar (alfaces), eram sensíveis à

cefotaxima, ceftazidima, imipenemo, amicacina, gentamicina, tobramicina,

ciprofloxacina, cloranfenicol e trimetropim- sulfametoxazol. No entanto há estudos em

que para o trimetropim- sulfametoxazol os valores de resistência variam entre os 18,8%

em Aeromonas isoladas de trutas e os 100% em estirpes obtidas de tilapia e pacu

(Belém-Costa e Cyrino, 2006; Akinbowale et al., 2007)

No tratamento de infecções por Aeromonas, aconselha-se, como primeira

escolha, as fluoroquinolonas, e como alternativa o trimetropim-sulfametoxazole,

aminoglicosídeos, carbapenemos, cefalosporinas de segunda e terceira geração, e as

tetraciclinas (Overman e Janda, 1999,Vila et al., 2003; Otaviani et al., 2006).

Diferenças no perfil de susceptibilidade a antibióticos em estirpes de origem

ambiental estão associadas a zonas de elevado impacto humano (Ko et al., 1996; Goñi-

Urriza et al., 2000a). Assim, podemos inferir pelos diferentes trabalhos que o perfil de

susceptibilidade para este género pode ser bastante diversificado e continua por

clarificar.

2. OBJECTIVOS ____________________________________________________________

Objectivos


Este trabalho tem como objectivo avaliar a presença, as espécies e a incidência

de membros do género Aeromonas em águas para consumo humano, tratadas e não

tratadas. Contribuirá também para aumentar o conhecimento sobre a ecología deste

grupo de microorganismos e no futuro poder contribuir para evitar processos

infecciosos em humanos e em animais.

Para a concretização deste estudo estabeleceram-se objectivos específicos:

Obter de uma colecção de estirpes bacterianas do género Aeromonas;

Determinar o perfil de susceptibilidade a diferentes grupos de

antibióticos dos isolados de Aeromonas;

Caracterizar, os isolados obtidos, por métodos genéticos e identificá-los

filogeneticamente, recorrendo à análise de genes “housekeeping”. Estes

métodos serão usados para uma identificação inequívoca à especie.

Pretende-se, assim, com os resultados deste trabalho, alertar para a presença de

resistência a diferentes grupos de antibióticos em microrganismos não patogénicos,

isolados de ambientes aparentemente inócuos como é o caso das águas de consumo, que

é não só preocupante, como coloca questões importantes, relativamente à disseminação

dos genes responsáveis por este tipo de resistência, às quais a investigação deve

responder.

3. MATERIAL E MÉTODOS ___________________________________________________________________________________

Material e Métodos


3.1. Origem das amostras ____________________________________________________________________________________

Neste estudo foram analisadas amostras de águas não tratadas, provenientes de

fontes, poços e nascentes, localizadas em dois Concelhos do Distrito de Vila Real de

acordo com a tabela 1.

Tabela 1 - Locais de amostragem e número de amostras

Concelho Localização Nº de Amostras

Vila Real Agarêz 3

Vila Real Constantim 2

Vila Real Escariz 1

Vila Real Estação 1

Vila Real Fonteita 2

Vila Real Guiães 3

Vila Real Nascente do Hospital 1

Vila Real Nascente do Marão 1

Vila Real S. Mamede 1

Vila Real S. Cibrão 2

Vila Real Lordelo 3

Vila Real Parada de Cunhos 3

Vila Real F. Piscinas 1

Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar 1

Vila Pouca de Aguiar Capelos 1

Vila Pouca de Aguiar Soutelo de Aguiar 1

Vila Pouca de Aguiar Cerdeira de Jales 1

Vila Pouca de Aguiar Vreia de Jales 1

Vila Pouca de Aguiar Campo de Jales 2

Vila Pouca de Aguiar Alfarela de Jales 1

Vila Pouca de Aguiar Jales 2

Total 34

As amostras foram analisadas na Universidade de Trás-os-Montes e Alto

Douro no Departamento de Ciências Veterinárias nos laboratórios de Microbiologia

Alimentar e Microbiologia Médica. O estudo filogenético ocorreu nas instalações do

laboratório Molecular Diagnostics Center (MDC) com sede em Orihuela (Alicante –

Espanha).

Material e Métodos


3.1.2. Método de recolha das amostras

As amostras de água foram recolhidas para frascos de polipropileno estéreis e o

tempo máximo decorrido entre a colheita da amostra de água e a sua análise

laboratorial. A recolha foi realizada seguindo as regras estabelecidas pela ISO 5667-2

(1991) aprovada como Norma Portuguesa NP EN 25 667-1 (1997), que se reporta à

norma europeia EN 25 667 (1993).

3.1.3. Isolamento pela técnica de filtração por membrana

O método de isolamento utilizado foi o método de filtração por membrana

(ISO 9308-1,1990) que permite determinar o número de microrganismos presentes na

água, quando se filtra um determinado volume de amostra de água através de uma

membrana de nitrocelulose com uma porosidade de 0.45μm de diâmetro (Quadro 2).

Quadro 2- Técnica de filtração por membrana

1. De cada amostra de água, depois de homogeneizada, passar 100 ml, por uma membrana de nitrocelulose

(Gelman) de 0.45μm de porosidade;

2. Retirar com a ajuda de uma pinça estéril a membrana de filtração, e colocar à superfície do meio de

GSP, (Meio 1- Anexo I);

3. Incubar a 30ºC, durante 24horas.

Dado este estudo incidir apenas sobre o género Aeromonas, o meio de cultura

utilizado foi o G. S. P. (Glutamato Amido Vermelho de Fenol) – MERCK 10230 – que

segundo especificação da empresa fabricante é selectivo e diferencial para

Pseudomonas spp. e Aeromonas spp..

A cultura pura das colónias presuntivas de Aeromonas, colónias amarelas, foi

obtida por expansão clonal, seguida de diversas provas morfofisiológicas, bioquímicas e

identificação por métodos fenotípicos e genotipicos.

Material e Métodos


3. 1. 3. 1. Conservação das estirpes

De colónias isoladas, procedeu-se à inoculação da cultura em meio líquido de

B.H.I-Oxoid CM 0225- e foi a incubar a 30 ºC, durante 24 horas. Foram conservadas

alíquotas de B.H.I. com glicerol a 15% a -70 º C.

3.2. Caracterização preliminar dos isolados

____________________________________________________________________________________

3.2.1. Coloração diferencial de GRAM

A coloração de Gram é um dos primeiros passos para a caracterização

morfofisiológica dos isolados, o género Aeromonas são Gram negativo. O procedimento

para a realização desta coloração encontra-se no quadro 3.

Quadro 3 – Coloração pelo método de Gram

1.

Esfregaço;

Laminas microscópicas limpas e desengorduradas;

Ansa esterilizada;

Deixa-se arrefecer;

Espalha-se em camada muito fina;

Secar ao ar ou suavemente à chama.

2. Fixação;

Coloca-se a lâmina acima da chama, a uma altura que a mão possa suportar o calor;

Passa-se duas a três vezes a lâmina pela chama;

Deixa-se arrefecer

3. Corante inicial – Violeta de metilo (1minuto);

4. Mordente- Lugol (30 segundos);

5. Diferenciação- alcool/acetona até se tornar incolor;

6. 2ª Lavagem- água;

7. Corante de contraste- Vermelho neutro (1 a 2 minutos),

8. 3ª Lavagem- água;

9. Secagem- entre duas folhas de papel de filtro;

10. Observação- objectiva de X 100 (com óleo de emersão).

Material e Métodos


3.2.2. Prova da citromo-oxidase

A prova da oxidase utiliza-se na identificação de bactérias aeróbias Gram

negativo, apesar de muitas bactérias Gram positivo apresentarem um sistema citocromo

dectetável.

O sistema de citocromos possui hemoproteínas que contêm ferro que

transferem electrões ou hidrogénio até ao oxigénio com a formação de água. As

bactérias com reacção positiva possuem um sistema citocromo oxidase de transporte de

electrões, as negativas não possuem este sistema, embora estas possam ter outros

citocromos.

As reacções lentas ou mesmo negativas estão relacionadas com níveis baixos

de citocromo oxidase. O género Aeromonas geralmente é oxidase positivo.

Para a realização desta prova foi preparada uma solução de tetrametil p-fenileno de

amina. As colónias suspeitas foram inoculadas com umas gotas deste reagente seguindo

a metodologia descrita no quadro 4.

Quadro 4 – Prova da Oxidase

1. Colocar uma tira de papel de filtro sobre uma tampa de uma placa de petri, colocando duas a três gotas

do reagente oxidase sobre a tira;

2. Com uma pipeta de Pasteur retira-se uma pequena porção de colónia e coloca-se sobre a tira de papel

de filtro;

3. Se houver mudança de cor. (Azul púrpura junto à zona em que se colocou a porção de colónia) a

reacção é positiva.

3.2.3. Prova da catalase

A catalase é uma enzima hemoproteica que contém ferro, decompõe o peróxido

de hidrogénio (H2O2) em água e oxigénio. A actividade da catalase manifesta-se na

maior parte das bactérias aeróbias, mas apenas em algumas anaeróbias. O género

Aeromonas é catalase positivo. Esta prova realiza-se inoculando uma porção de cultura

da estirpe em estudo em peróxido de hidrogénio, a metodologia utilizada encontra-se

descrita no quadro 5.

Material e Métodos


Quadro 5 - Prova da catalase

1. Numa lâmina desengordurada e passada previamente ao bico de Busen, colocar uma gota de água

oxigenada;

2. De um meio sem sangue, recolher um de uma colónia sobre a gota de água oxigenada;

3. Ao verificar efervescência diz-se que a reacção é positiva, ou seja, revela-se a produção de catalase.

3.3. Identificação das estirpes bacterianas ____________________________________________________________________________________

A identificação dos isolados foi realizada através da sequenciação do gene

gyrB que codifica para a subunidade β da DNA girase, através da metodologia validada

por Yáñez e colaboradores (2003). Em ocasiões que o justifica-se, foi sequenciado o

16S rRNA, gyrA e o rpoD gene que codifica para o factor Ϭ70

da RNA polimerase.

3.3.1. Extracção de DNA

Antes de proceder à sequenciação dos genes é necessário efectuar a extracção

do DNA a partir de cultura pura. A metodologia seguida está descrita no quadro 6.

Quadro 6 – Metodologia de extracção do DNA de estirpes bacterianas

1. Suspender num tubo de 1,5 ml contendo 100 µl de TE, uma colónia de cultura recente.

2.

Adicionar 200 µl de chelex, previamente preparado na concentração de 20% (Bio-Rad).

3. Agitar no vortex durante cerca de 1 minuto.

4. Submeter a mistura a uma sucessão de três ciclos de choques térmicos, alterando 10 minutos de

aquecimento a 95 ºC com um período de 10 minutos de congelação a -20 ºC.

5. Agitar novamente o tubo no vortex.

6. Centrifugar durante 5 minutos a 13000 r.p.m.

7. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e armazenar a -20 ºC.

Material e Métodos


3.3.2. Amplificação de DNA por reacção de PCR

Para a amplificação dos genes 16S rRNA, gyrB, rpoD e gyrA utilizaram-se os

oligonucleótidos descritos no quadro 7.

Quadro 7 – Oligonucleótidos utilizados em reacção de PCR

Posição Sequência (5`--- 3`) Referência

gyrB 3F 334/354 TCC GGC GGT CTG CAC GGC GT Yáñez et al., 2003

gyrB 14R 1464/1444 TTG TCC GGG TTG TAC TCG TC Yáñez et al., 2003

rpoD 70F 280/302 ACG ACT GAC CCG GTA CGC ATG TA Yamammoto et al., 2000

rpoD 70R 1139/1117 ATA GAA ATA ACC AGA CGT AAG TT Yamammoto et al., 2000

gyrA “MLPA analysis of the genus Aeromonas” Martínez-Murcia et al. (MS submitted)

16S 0F 8/27 AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG Martínez-Murcia et al., 1999

16S 15R 1492/1510 GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Martínez-Murcia et al., 1999

Nota: * posição segundo numeração de E. coli (Huang, 1996).

A mistura da PCR foi realizada para um volume final de 50 µl, contendo

75mM de Tris HCl (pH 9.0), 2mM de MgCl2, 50mM de KCl, 20mM de (NH4) 2 SO4, 1

µl de DNA genómico, 2,5mM de cada dNTP, 10 pmol de cada oligonucleótido e 1 U

Taq polimerase (BIOTOOLS).

As condições de amplificação a que se submeteram as misturas, foram

diferentes conforme os genes a amplificar. Para a amplificação dos genes gyrB e rpoD

foram utilizadas as seguintes condições: desnaturação inicial durante 5 minutos à

temperatura de 94ºC, 35 ciclos de amplificação (desnaturação a 94ºc durante 15

segundos, hibridação a 55ºC durante 30 segundos e extensão a 72ºc durante 45

segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extensão final a 72ºC por

um período de 5 minutos.

Para a amplificação do 16S rRNA a mistura foi submetida inicialmente a um

período de 5 minutos à temperatura de 94 ºC para a desnaturação, de seguida foi

submetida a 35 ciclos de amplificação (desnaturação a 94 ºC durante 15 segundos,

hibridação a 55 ºC durante 30 segundos e extensão a 72 ºC durante 1 minuto e 30

Material e Métodos


segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extensão final a 72 ºC por

um período de 5 minutos.

Para amplificação do gene gyrA foram utilizadas a seguintes condições:

desnaturação inicial durante 5 minutos à temperatura de 94 ºC, 35 ciclos de

amplificação (desnaturação a 94 ºC durante 15 segundos, hibridação a 55 ºC durante 30

segundos e extensão a 72 ºC durante 45 segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura

a um ciclo de extensão final a 72 ºC por um período de 5 minutos.

3.3.3. Purificação dos produtos de PCR

A purificação dos produtos de PCR foi realizada com o “Kit” QIAquick PCR

Purification Kit (Qiagen), seguindo o procedimento aconselhado pelo fabricante, cujos

passos estão indicados no quadro 8.

Quadro 8 – Protocolo de purificação dos produtos de PCR

1. Colocar 250 µl de Buffer PB num tubo de 1,5 ml e adicionar o produto da PCR (50 µl).

2. Colocar a mistura numa coluna QIAquick.

3. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 r.p.m.

4. Rejeitar o que passa para o tubo colector.

5. Adicionar 750 µl de Buffer PE à coluna, para lavar.

6. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 r.p.m.

7. Rejeitar e centrifugar novamente durante 1 minuto a 13000 r.p.m.

8. Colocar a coluna num tubo de 1,5 ml.

9. Adicionar 30 µl de H2O M.Q. para eluir o DNA.

10. Centrifugar novamente.

11 Guardar a -20 ºC.

3.3.4. Sequenciação

Os produtos de amplificação purificados foram preparados com o Kit Big

Dye® Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), segundo recomendações do

fabricante, sendo a reacção de sequenciação preparada para um volume final de 10 µl,

Material e Métodos


adicionando-se 4 µl da solução “Premix”; 4 µl de DNA genómico e 2 µl de primer a 2

µM. Os oligonucleótidos utilizados estão descritos no quadro 10. A mistura foi

submetida a uma sucessão de 25 ciclos. As condições para cada ciclo foram:

desnaturação a 96 ºC durante 10 segundos, hibridação a 50 ºC durante 5 segundos e

extensão a 60 ºC durante 4 minutos.

Quadro 9 – Oligonucleótidos utilizados nas reacções de sequenciação

Posição Sequência (5`--- 3`) Referência

gyrB 3F 334/354* TCC GGC GGT CTG CAC GGC GT Yáñez et al., 2003

gyrB 7F 792/812* GGG GTC TAC TCG TTC ACC AA Yáñez et al., 2003

rpoD 8F 740/757# GT CAA TTC CGC CTG ATG C Soler et al., 2004

rpoD 9R 800/782# ATA GAA ATA ACC AGA CGT AAG TT Soler et al., 2004

gyrA “MLPA analysis of the genus Aeromonas” Martínez-Murcia et al. (MS submitted)

16S 0F 8/27҂ AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG Martínez-Murcia et al., 1999

16S 9R 926/908 CCG TCA ATT CAT TTG AGT TT Martínez-Murcia et al., 1999

16S15R 1492/1510҂ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Martínez-Murcia et al., 1999

Nota: * posição segundo numeração de E. coli (Huang, 1996).

# posição segundo numeração de E. coli

҂ posição segundo numeração de E. coli (Stern et al., 1988).

Os produtos da reacção de sequenciação foram precipitados conforme a

metodologia descrita no quadro 10.

Quadro 10 – Protocolo de precipitação dos produtos de sequenciação

1. Colocar num tubo de 1,5 ml: 2,5 µl de EDTA (125 mM) e 30 µl de Etanol a 100%.

2.

Adicionar os 10 µl da reacção de sequenciação e misturar por inversão, deixando à temperatura

ambiente durante 15 minutos.

3. Centrifugar durante 20 minutos a 14000 r.p.m. à temperatura de 4 ºC.

4. Eliminar a solução de etanol e EDTA

5. Adicionar 100 µl de etanol a 70%.

6. Centrifugar durante 2 minutos a 14000 r.p.m a 4 ºC e eliminar na totalidade a solução de etanol.

7. Secar o pellet (10 minutos no Concentrator-Vacufuge Eppendorf).

8. Armazenar o pellet seco a -20 ºC.

Material e Métodos


Para a ressuspensão do pellet, adiciona-se 20 µl de formamida desionizada e

deixa-se repousar 5 a 10 minutos à temperatura ambiente. Centrifuga-se brevemente

durante alguns minutos. Por fim, carrega-se a placa do sequenciador automático ABI

3100 Avant Genetic Analiser (Applied Biosystems).

3.3.5. Análise de sequências e construção de dendogramas

As sequências nucleotídicas obtidas foram analisadas pelo programa Chromas

lite versão 2.0. O alinhamento foi realizado com o programa Clustal X, versão 1.8

(Tompson et al., 1997). As árvores evolutivas construíram-se pelo método de

Neighbour-Joining (Saitou e Nei, 1987) com o programa MEGA – Molecular

Evolutionary Genetics Analysis - versão 2.1 (Kumar et al., 2001).

3.4. Caracterização bioquímica pelo API 20NE

____________________________________________________________________________________

As provas bioquímicas convencionais e o sistema de biotipificação numérico

são métodos de identificação que se baseiam nas características fenótipicas dos

microrganismos isto é, os caracteres fisiológicos, bioquímicos e estruturais que o

microrganismo apresenta. O sistema de identificação utilizado foi o sistema de

biotipificação númerico API 20NE, que é um sistema padronizado para identificação de

bacilos Gram negativos não enterobacterias e não fastidiosos como Pseudomonas,

Acinectobacter, Vibrio e Aeromonas. Este sistema é composto por 8 testes

convencionais, 12 testes de assimilação e uma base de dados. Para a realização do

sistema da bioMerieux API 20NE foi seguida a metodologia fornecida pelo fabricante,

cujos passos estão indicados no quadro 11.

Quadro 11 – Procedimento para a realização do sistema API 20NE

1. Preparar a câmara de incubação, colocando aproximadamente 5ml de água destilada nos alvéolos para

criar uma atmosfera húmida. Após retirar a galeria do invólucro hermético, coloca-la na câmara;

2. Preparação do inóculo – abrir uma ampola de meio de auxiliar (API 20/NE Médium).

Material e Métodos


3.Preparar uma suspensão com opacidade superior a 4 da escala de McFarland. Transferir 1 ml desta

suspensão para o meio auxiliar;

4. Homogeneizar; e distribuir o meio nas galerias enchendo até à cúpula;

5. Vedar com parafina líquida;

6 Inocular a 30 ºC durante 48 h;

7. Observar os resultados às 24 e 48h.

3.5. Perfil de Susceptibilidade a agentes antibacterianos ____________________________________________________________________________________

O perfil de resistência aos agentes antibacterianos foi efectuado pelo método de difusão

em disco em Agar Muller-Hinton seguindo o procedimento do quadro 12. Foram

testados vinte e sete antibióticos (Oxoid) pertencendo a diferentes grupos:

β-lactâmicos: (i) Penicilinas- Amoxicilina (AML10); Amoxicilina / ácido Clavulânico

(AMC30); Piperacilina (PRL100); Piperacilina / Tazobactan (TZP110); Ticarcilina (TIC75);

Ticarcilina / ácido Clavulânico (TIM85); (ii) Cefalosporinas - Cefalotina (KF30);

Cefoxitina (FOX30); Cefoperazona (CFP30); Ceftazidime (CAZ30); Cefepime (FEP30);

Cefotaxime (CTX30); Ceftriaxona (CRO30); (iii) Monobactâmicos- Aztreonamo

(ATM30); (iv) Carbapenemos (IMP10);

Aminoglicosídeos- Gentamicina (CN10;) Canamicina (K30); Tobramicina (TOB10);

Amicacina (AK30); Estreptomicina (S)

Quinolonas- Ciprofloxacina (CIP5); Ácido nalidixico (NA)

Macrólidos- Eritromicina (E15);

Cloranfenicol (C30);

Tetraciclina (TE30);

Sulfamidas- Co –trimoxazol (SxT25);

Fosfomicina (FOS).

Material e Métodos


Quadro 12 – Protocolo da técnica de difusão em agar com discos de antibióticos

1. Preparar uma suspensão bacteriana de cada estirpe em estudo a partir de 3 – 4 colónias em soro fisiológico

estéril. A suspensão deve ter uma turvação equivalente a metade do grau 1 da escala de McFarland;

2. Mergulhar uma zaragatoa na suspensão bacteriana retirando o excesso e semear em placas de agar Mueller-

Hinton;

3. Aplicar os discos dos antibióticos sobre a superfície do meio de cultura, após a secagem do inoculo e vai

incubar a 37 ºC, durante 18 horas;

4. Com uma craveira medir os diâmetros dos halos de inibição de crescimento para cada antibiótico.

Os resultados foram analisados segundo as normas do “Clinical and

Laboratory Standards Institute” (CLSI, 2007) que segundo o diâmetro do halo formado

pela acção dos antibióticos classifica as estirpes em sensível, resistente ou intermédio.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ___________________________________________________________

Resultados e Discussão


4.1. Estirpes isoladas

____________________________________________________________________________________

Para a obtenção das estirpes necessárias à elaboração deste trabalho, foram

realizadas 34 amostras de água para consumo humano não tratadas, provenientes de

dois Concelhos do Distrito de Vila Real, nomeadamente o Concelho de Vila Real e

Vila Pouca de Aguiar, já referidas no capítulo de Material e Métodos. A sementeira

realizou-se em meio de G.S.P (Glutamato Amido Vermelho Fenol) - MERCK 10230-

que segundo especificação do fabricante é selectivo e diferencial para Pseudomonas

spp. e Aeromonas spp.

Das 34 amostras de água não tratadas para consumo humano, utilizadas neste

estudo com origem em fontes, poços e nascentes. No total foram obtidos 87 isolados,

sendo que 43 destes revelaram oxidase e catalase positiva. Os restantes isolados (n=44),

referem-se a bactérias com oxidase e catalase negativa, que não foram objecto de estudo

neste trabalho.

Às estirpes isoladas foi atribuída uma codificação constituída por uma letra e

um número. A letra faz referência à origem da amostra (F- Fonte, P- Poço e N -

Nascente), e o número corresponde à colónia isolada.

As estirpes foram depositadas na colecção de Aeromonas da Universidade de

Trás-os-Montes e Alto Douro, no Departamento de Ciências Veterinárias e as amostras

que foram seleccionadas para sequenciação, nas instalações do Molecular Diagnóstics

Center (MDC), foi atribuída uma referência dessa colecção.

Na tabela 2 encontram-se os isolados (n=43), obtidos por amostra como

também a sua origem. Pela análise desta tabela verifica-se que o número de isolados

obtidos nas fontes é superior ao obtido nos poços. Este facto não significa

obrigatoriamente que exista maior incidência de isolados do género Aeromonas nas

fontes.



Tabela 2- Identificação da amostra, origem, localização e referência atribuída.

Amostra Origem Localização Referência dos Isolados

F1 Fonte Centro Povo Guiães F1 AL; F1b

F1B Fonte do Senhor Guiães F1BC 1a 1(MDC 2510); F1BC 1a2; F1BC2;

F1BA1; F1BA2.1; F1BA2.2;F1BA3

F2 Fonte do Corgo Piscinas F2.1; F2. 2a2;

F4 Fonte da Estrada Escariz F4A

F5B Fonte da Aldeia Parada de Cunhos F5.B1; F5.B2

F7 Fonte do Mouco V. Pouca de Aguiar F7A; F7 R

F8 Fonte Capelos F8

F9 Fonte do Largo Soutelo de Aguiar F9 (MDC2464) ; F9Ap

F10 Fonte da Cerdeira Cerdeira de Jales F10AA

F11 Fonte da Igreja Vreia de Jales F11 B; F11 R

F12 Fonte Nova Campo de Jales F12

F13 Fonte de Reguenga Alfarela de Jales F13

F24 Fonte do Cruzeiro Andrães F24. 2

F25 Fonte Central S. Cibrão F25. 1; F25. 2.1; F25. 3

F27 Fonte do Paço Torneiros Arroios F27. 1a; F27. 1b; F27. 2

F28 Fonte Constantim F28 1a; F28 1b

P1 Poço Lordelo P1. a1

P2 Poço Jales P2. 1a; P2.1b

P3 Poço Fonteita P3. 1a; P3. 1aa; P3.1b1

P4 Poço Jales P4. 2

P5 Poço Estação P5. 1.1;

P6 Poço Constantim P6

Nascente

1

N. do Hospital Lordelo N1.1



4.2. Identificação por sequênciação de isolados bacterianos

____________________________________________________________________________________

4.2.1. Identificação de isolados por sequênciação do gene 16S rRNA

A sequenciação por 16S rRNA permite determinar as relações filogenéticas

entre bactérias, sendo que este método é considerado o mais correcto na identificação

dos microrganismos.

Nove isolados foram seleccionados por apresentarem características

morfológicas distintas; (i) colónias rosa ou laranja em GSP; (ii) Gram negativo; (iii)

oxidase positiva; (iv) catalase positiva - presuntivas de Pseudomonas/ Plesiomonas.

De referir ainda que no estudo do perfil de susceptibilidade, quatro dos

isolados apresentaram resistência ao imipenemo. Os resultados da identificação por

sequenciação do gene 16sRNA para os nove isolados encontram-se na tabela 3.

Tabela 3 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene 16S rRNA

Pela análise desta tabela verifica-se que todos os isolados foram obtidos de

fontes. Os quatro isolados seleccionados (F281a, F281b, F1AL e F10AA) apresentavam

Referência dos isolados Identificação das estirpes

F1AL Chryseobacterium spp.

F1b Pseudomonas costantinii

F10AA Chryseobacterium spp.

F11Bp Pseudomonas brenneri

F11R Pseudomonas brenneri

F12 Pseudomonas savastanoi

F13 Pseudomonas veronii

F281a Pseudomonas fluorescens

F281b Pseudomonas fluorescens



um fenótipo de resistência ao imipenemo, contudo em GSP a morfologia das colónias

era diferente entre eles, tendo os isolados (F281a, F281b) cor rosa e os isolados (F1AL,

F10AA) cor laranja. Com estas características fenótipicas e após a sequenciação do

gene 16sRNA dois dos isolados foram identificados como Pseudomonas fluorescens e

os outros dois como pertencentes ao género Cryseobacterium spp.. De referir que os

isolados (F1AL, F10AA) revelaram perfis de susceptibilidade diferentes aos

antibioticos testados (Anexo I).

O imipememo é um carbapenemo de uso hospitalar e é referido em vários

estudos (Chin-Chen Lai et al., 2007) como último recurso para estirpes multiresistentes

nosocomiais. Relativamente à amostra F11 os isolados obtidos (F11Bp e F11R)

apresentavam características morfológicas distintas, e perfil de susceptibilidade

idêntico, no entanto a identificação dos isolados bacterianos foi a mesma (Pseudomonas

brenneri). Este facto reforça a necessidade da utilização de métodos genótipicos para a

correcta identificação.

Da tabela análise da tabela 3 observa-se que as sequências obtidas pertencem a

5 espécies do género Pseudomonas - P. costantinni, P. brenneri, P. savastonoi,

P.veronni e P. fluorescens. Algumas espécies de Pseudomonas são patógenicas para os

animais, incluindo o Homem. A espécie Pseudomonas aeruginosa é considerada um

importante patogénico nosocomial em doentes com fibrose quistica (Spilker et al.,

2004), e em queimaduras e feridas (Muller et al., 2009).

4.2.1. Identificação de isolados bacterianos por sequenciação do gene

gyrB

Algumas espécies de bactérias não podem ser diferenciadas entre si apenas

pela sequenciação do gene 16S rRNA. A utilização de genes alternativos para a

identificação molecular de certas espécies aumenta as potencialidades da sequenciação.

A identificação da espécie a que pertencem as 34 estirpes foi realizada por

sequenciação de genes housekeeping. Amplificou-se e determinou-se a sequência

nucleotídica do gene gyrB em 29 isolados presuntivos de Aeromonas: i) colónias

amarelas em GSP, ii) Gram negativo, iii) oxidase e catalase positivam.



O fragmento de gyrB amplificado foi de 1100 nucleotidos (Figura 4), dos

quais se sequenciaram entre 989 e 1100 pares de bases. Este fragmento representa

aproximadamente 40% da sequência completa (seguindo como referência a sequência

de gyrB da E. coli, que apresenta 2415 nucleótidos; Huang, 1996) e contém 70% dos

nucleótidos correspondentes ao domínio ATPase da proteína.

Foi comparado um fragmento contínuo de 989 pares debases, desde a posição

393 até à posição1389. O número de posições variáveis no fragmento de, gyrB

analisado foi de 241 pb que corresponde a 24,4% do total comparado, ou seja, o número

de posições conservadas (isto é, com idêntica composição) corresponde a 75% dos

nucleótidos sequenciados.

Figura 4 – Esquema do gene gyrB da E. coli. O fragmento azul indica a região do gene que foi amplificada, as setas

indicam a localização dos primers utilizados e em negrito encontram-se as posições do primeiro e último nucleótido

amplificado seguindo a numeração de E. coli (Huang, 1996).

Estas sequências foram comparadas com as da base de dados do MDC para

poder inferir acerca de quais as espécies representadas. A árvore filogenética obtida

dessa análise encontra-se na figura 4.

Desta análise observa-se que as sequências obtidas pertencem a 6 espécies do

género Aeromonas - Aeromonas hydrophila, Aeromonas bestiarum, Aeromonas

eucrenophila, Aeromonas tecta, Aeromonas veronii e Aeromonas encheleia. Verifica-se

ainda, a formação um cluster filogenético independente dos grupos pertencentes a todas

as espécies actualmente reconhecidas neste género, pelo que poderá representar uma

espécie ainda não descrita. A estirpe deste grupo será denominada de Aeromonas spp.

gyrB14R gyrB3F

5’ 3’ 334 1464



Figura 5- Àrvore filogenética obtida com a sequênciação do gene gyrB das estirpes isoladas neste estudo

Aeromonas spp.

A. hydrophila

A. aquariorum

A. trota

A. jandaei

A. caviae

A.schubertii

A. bivalvium

A. eucrenophila

A. tecta

A. encheleia

A. salmonicida

A. bestiarum

A. popoffii

A. media

A. allosacharophila

MDC181P5 1.1

MDC57MDC41

MDC260

MDC39T

MDC28T

MDC100

MDC561MDC1TA

MDC12MDC45

MDC99

MDC17T

MDC105

MDC103MDC104

MDC10T

MDC219

MDC241

MDC250MDC273

MDC149T

MDC30MDC9

MDC23

MDC15F27.1b

F27.1a

MDC165

MDC162

P6

N1.1

F5B1

MDC34

MDC11T

MDC4

MDC26

MDC19T

MDC148

MDC25

MDC44

MDC5MDC24

MDC64

MDC16T-A.HG11

MDC63

MDC37TMDC14

MDC93

F9=MDC2464

MDC91T

MDC92

MDC94

MDC95MDC20T

MDC74

MDC72

MDC73

MDC43

F1BC1a1

F7R

MDC256

P2.1b

F7AMDC147

P2.1a

MDC32T

MDC21

MDC146F8

MDC87T

MDC88

MDC574

MDC575

MDC2T

MDC18-A.G501MDC2374

MDC54T

MDC55MDC51

MDC52

MDC33

MDC40T

MDC49MDC48

MDC2475F4A

MDC240

P3.1b1MDC27

F25.2.1

MDC231

P4.2

MDC35TMDC13T

MDC578

MDC582

MDC580

MDC579

MDC581

MDC38T

MDC36

MDC90

MDC89

MDC576

MDC577MDC317

MDC573

MDC442

MDC259

MDC2406MDC310

MDC47

MDC318

100

100

47

52

100

92

99

99

81

52

99

99

99

67

83

99

41

25

98

98

52

32

68

60

32

99

47

55

70

27

99

24

29

52

98

67

55

39

52

55

58

67

38

37

96

55

36

45

46

36

54

23

5

51

72

63

53

75

38

84

99

45

23

40

54

59

99

37

86

43

43

13

99

51

86

81

73

96

37

61

66

81

30

42

40

53

32

55

18

38

25

31

26

9

20

50

42

50

55

87

53

32

58

63

82

36

29

30

30

25

0.02

A. veronii /culicicola

A. sobria

A. simiae

A. molluscorum

Aeromonas spp.

A. hydrophila

A. aquariorum

A. trota

A. jandaei

A. caviae

A.schubertii

A. bivalvium

A. eucrenophila

A. tecta

A. encheleia

A. salmonicida

A. bestiarum

A. popoffii

A. media

A. allosacharophila

MDC181P5 1.1

MDC57MDC41

MDC260

MDC39T

MDC28T

MDC100

MDC561MDC1TA

MDC12MDC45

MDC99

MDC17T

MDC105

MDC103MDC104

MDC10T

MDC219

MDC241

MDC250MDC273

MDC149T

MDC30MDC9

MDC23

MDC15F27.1b

F27.1a

MDC165

MDC162

P6

N1.1

F5B1

MDC34

MDC11T

MDC4

MDC26

MDC19T

MDC148

MDC25

MDC44

MDC5MDC24

MDC64

MDC16T-A.HG11

MDC63

MDC37TMDC14

MDC93

F9=MDC2464

MDC91T

MDC92

MDC94

MDC95MDC20T

MDC74

MDC72

MDC73

MDC43

F1BC1a1

F7R

MDC256

P2.1b

F7AMDC147

P2.1a

MDC32T

MDC21

MDC146

MDC181P5 1.1

MDC57MDC41

MDC260

MDC39T

MDC28T

MDC100

MDC561MDC1TA

MDC12MDC45

MDC99

MDC17T

MDC105

MDC103MDC104

MDC10T

MDC219

MDC241

MDC250MDC273

MDC149T

MDC30MDC9

MDC23

MDC15F27.1b

F27.1a

MDC165

MDC162

P6

N1.1

F5B1

MDC34

MDC11T

MDC4

MDC26

MDC19T

MDC148

MDC25

MDC44

MDC5MDC24

MDC64

MDC16T-A.HG11

MDC63

MDC37TMDC14

MDC93

F9=MDC2464

MDC91T

MDC92

MDC94

MDC95MDC20T

MDC74

MDC72

MDC73

MDC43

F1BC1a1

F7R

MDC256

P2.1b

F7AMDC147

P2.1a

MDC32T

MDC21

MDC146F8

MDC87T

MDC88

MDC574

MDC575

MDC2T

MDC18-A.G501MDC2374

MDC54T

MDC55MDC51

MDC52

MDC33

MDC40T

MDC49MDC48

MDC2475F4A

MDC240

P3.1b1MDC27

F25.2.1

MDC231

P4.2

MDC35TMDC13T

MDC578

MDC582

MDC580

MDC579

MDC581

MDC38T

MDC36

MDC90

MDC89

MDC576

MDC577MDC317

MDC573

MDC442

MDC259

MDC2406MDC310

MDC47

MDC318

100

100

47

52

100

92

99

99

81

52

99

99

99

67

83

99

41

25

98

98

52

32

68

60

32

99

47

55

70

27

99

24

29

52

98

67

55

39

52

55

58

67

38

37

96

55

36

45

46

36

54

23

5

51

72

63

53

F8

MDC87T

MDC88

MDC574

MDC575

MDC2T

MDC18-A.G501MDC2374

MDC54T

MDC55MDC51

MDC52

MDC33

MDC40T

MDC49MDC48

MDC2475F4A

MDC240

P3.1b1MDC27

F25.2.1

MDC231

P4.2

MDC35TMDC13T

MDC578

MDC582

MDC580

MDC579

MDC581

MDC38T

MDC36

MDC90

MDC89

MDC576

MDC577MDC317

MDC573

MDC442

MDC259

MDC2406MDC310

MDC47

MDC318

100

100

47

52

100

92

99

99

81

52

99

99

99

67

83

99

41

25

98

98

52

32

68

60

32

99

47

55

70

27

99

24

29

52

98

67

55

39

52

55

58

67

38

37

96

55

36

45

46

36

54

23

5

51

72

63

53

75

38

84

99

45

23

40

54

59

99

37

86

43

43

13

99

51

86

81

73

96

37

61

66

81

30

42

40

53

32

55

18

38

25

31

26

9

20

50

42

50

55

87

53

32

58

63

82

36

29

30

30

25

0.02

A. veronii /culicicola

A. sobria

A. simiae

A. molluscorum



Na tabela 4 estão representadas as espécies de Aeromonas identificadas por

sequenciação do gene gyrB, bem como a referência dos isolados.

Tabela 4 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene gyrB

Neste estudo e de acordo com a tabela 4 e 5 a espécie com maior incidência foi

a espécie Aeromonas hydrophila (n=10), com uma percentagem de 29,4%. Estes

Referência dos isolados Identificação das espécies por gyrB

F1BC1a1 (MDC2510); F1BC1a2; F1BC2;

F1BA1; F1BA3 Aeromonas spp.

F1BA2.1; F1BA2.1 Aeromonas encheleia

F9 (MDC2464); F9Ap Aeromonas tecta

P5. 1.1 Aeromonas veronii

F4A Aeromonas hydrophila

P3. 1b1 Aeromonas hydrophila

P4. 2 Aeromonas hydrophila

F25. 1; F25. 2.1; F25. 3; F24. 2 Aeromonas hydrophila

F7R Aeromonas eucrenophila

F7A Aeromonas eucrenophila

F8 Aeromonas eucrenophila

P2. 1a Aeromonas eucrenophila

P2. 1b Aeromonas eucrenophila

P6 Aeromonas bestiarum

F5.B1; F5.B2 Aeromonas bestiarum

F27. 1a; F27. 2 Aeromonas bestiarum

F27. 1b Aeromonas bestiarum

N1.1 Aeromonas bestiarum



resultados são semelhantes aos obtidos por Villari e colaboradores em 2003 num estudo

realizado a partir de águas naturais minerais.

No México, Castro-Escarpulli e colaboradores (2003), a partir de águas de

diferentes origens referem percentagens semelhantes para a espécie de Aeromonas

hydrophila, e os mesmos resultados foram referenciados por Tequianes-Bravo et al.,

2005 em amostras de água potável. Para estes autores a alta frequência de Aeromonas

hydrophila sugere que águas contaminadas por estes microrganismos apresentam um

potencial risco de infecções ao Homem, dado que algumas estirpes de Aeromonas

possuem um vasto conjunto de factores de virulência como enterotoxinas, citotoxinas e

aerolisinas (Nzeako et al., 1991; González-Serrano et al., 2002). Num trabalho de Kosal

e colaboradores (2007) a prevalência desta espécie foi de 46%, no entanto num estudo

efectuado por Razzolini e colaboradores (2008) com o intuito de detectar Aeromonas e

suas toxinas em águas de reservatórios e fontanários os valores obtidos foram de 15,7%.

Neste trabalho e relativamente às espécies Aeromonas bestiarum, Aeromonas

eucrenophila e Aeromonas caviae (n=2), a percentagem obtida foi de 21%, 15% e 6%

respectivamente. De Aeromonas encheleia, Aeromonas veronii, Aeromonas tecta apenas

foi isolada 1 estirpe pertentente a cada uma das espécies.

Uma particularidade dos resultados deste estudo reside no facto de todas as

espécies consideradas patogénicas para o Homem (Aeromonas hydrophila, Aeromonas

veronii biotype sobria e Aeromonas caviae), foram por nós identificadas o que é de

extrema importância quando se considera a sua ampla distribuição ambiental, tendo

como origem poços. Clínicamente estas espécies são as mais importantes (Figueras,

2005; Edberg et al., 2007

4.2.2. Identificação de isolados bacterianos por sequênciação do gene

gyrA

A sequenciação nucleotídica do gene gyrA (Martínez-Murcia et al. (MS

submitted) foi realizada a 5 estirpes bacterianas presuntivas de Aeromonas e os

resultados da sequenciação estão representadas na tabela 5.



Tabela 5 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene gyrA

Da análise da tabela 5 podemos referir que a espécie Aeromonas hydrophila foi

isolada tanto em Fontes como em Poços, o que é bem demonstrativo da sua ubiquidade.

A espécie Aeromonas caviae foi também por nós identificada. É de salientar que ambas

as espécies A. hydrophila e A. caviae pertencem a uma das três espécies consideradas

clinicamente patogénicas para o Homem (Borchardt et al., 2003; Tsai et al., 2006),

sendo que A. hydrophila está intimamente associada a septicémia em doentes

queimados (Chin-Cheng Lai et al., 2007).

4.3. Isolados identificados como Aeromonas spp. ________________________________________________________

Os resultados da análise filogenética pela sequenciação do gene gyrB

revelaram a presença de um grupo de estirpes distinta de todos os grupos filogenéticos

que representam as espécies de Aeromonas descritas e/ou dos grupos de homologia

DNA-DNA formados dentro deste género.

Como forma de confirmar a formação desse grupo independente constituido

pelos isolados de Aeromonas spp., foi realizada a sequenciação do gene rpoD para a

estirpe MDC 2510. O fragmento de rpoD amplificado foi de 859 pb, dos quais foram

sequenciados entre 722 a 850 nucleótidos, o que representa cerca de 45% da proteína

não englobando o centro activo da proteína.

Quando se realizou o alinhamento desta estirpe com as sequências da base de

dados do MDC foi comparado um fragmento contínuo de 683 pb, este apresenta 252

posições variáveis, o que corresponde a 36,9% da sequência total comparada.

A árvore filogenética obtida dessa análise encontra-se na figura 6.

Referência dos isolados Identificação das estirpes gyrA

F2.1 Aeromonas hydrophila

F2.2a2 Aeromonas hydrophila

P1.a1 Aeromonas hydrophila

P3.1a Aeromonas caviae

P3.1aa Aeromonas caviae



Figura 6. Arvore filogenética baseada na sequência do gene rpoD.

A. bivalbium

MDC30

MDC9

MDC23

MDC15

MDC149T

MDC165

MDC34

MDC4

MDC11T

MDC162

MDC26

MDC148

MDC25

MDC44

MDC19T

MDC5

MDC27

MDC240

MDC48

MDC231

MDC35T

MDC2475

MDC317

MDC259

MDC318

MDC573

MDC310

MDC47T

MDC442

MDC2406

MDC105

MDC104

MDC17T

MDC103

MDC-579

MDC581

MDC13T

MDC580

MDC578

MDC582

MDC577

MDC8

MDC90

MDC38T

MDC576

MDC3

MDC1T

MDC99

MDC45

MDC100

MDC12

MDC561

MDC28T

MDC181

MDC41T

MDC57

MDC39T

MDC260

MDC51

MDC52

MDC33

MDC49

MDC40T

MDC250

MDC273

MDC241

MDC219

MDC10T

MDC24-HG11

MDC63-encheleia-HG11

MDC16-HG11

MDC37T

MDC14

MDC64

MDC94

MDC95

MDC92

MDC91T

MDC93

F1BC1a1

MDC147

MDC256

MDC146

MDC32T

MDC21

MDC87

MDC88

MDC72

MDC74

MDC73

MDC20T

MDC43

MDC55

MDC54T

MDC2374

MDC18-HG13

MDC574

MDC575

MDC2T

70

100

45

100

100

97

60

63

100

100

100

53

76

81

100

74

36

99

78

46

61

100

100

76

57

39

38

100

66

68

93

89

100

98

85

34

46

57

28

36

100

55

34

39

100

100

34

56

100

100

100

100

99

100

62

45

63

100

98

34

60

100

34

24

100

40

39

97

100

43

53

91

100

46

81

100

79

55

55

32

52

22

58

48

42

65

71

48

14

100

39

42

17

24

19

45

0.02

A. popoffii

A. jandaei

A. bestiarum

A. salmonicida

A. hydrophila

A. aquariorum

A. sobria

A. media

A. trota

A. allosaccharophila

A. culicicola/ A. veronii

A. caviae

A. encheleia

A. simiae

A. tecta

A. molluscorum

A. schubertii

Aeromonas sp. (HG11)

A. eucrenophila

Aeromonas sp.

A. bivalbium

MDC30

MDC9

MDC23

MDC15

MDC149T

MDC165

MDC34

MDC4

MDC11T

MDC162

MDC26

MDC148

MDC25

MDC44

MDC19T

MDC5

MDC27

MDC240

MDC48

MDC231

MDC35T

MDC2475

MDC317

MDC259

MDC318

MDC573

MDC310

MDC47T

MDC442

MDC2406

MDC105

MDC104

MDC17T

MDC103

MDC-579

MDC581

MDC13T

MDC580

MDC578

MDC582

MDC577

MDC8

MDC90

MDC38T

MDC576

MDC3

MDC1T

MDC99

MDC45

MDC100

MDC12

MDC561

MDC28T

MDC181

MDC41T

MDC57

MDC39T

MDC260

MDC51

MDC52

MDC33

MDC49

MDC40T

MDC250

MDC273

MDC241

MDC219

MDC10T

MDC30

MDC9

MDC23

MDC15

MDC149T

MDC165

MDC34

MDC4

MDC11T

MDC162

MDC26

MDC148

MDC25

MDC44

MDC19T

MDC5

MDC27

MDC240

MDC48

MDC231

MDC35T

MDC2475

MDC317

MDC259

MDC318

MDC573

MDC310

MDC47T

MDC442

MDC2406

MDC105

MDC104

MDC17T

MDC103

MDC-579

MDC581

MDC13T

MDC580

MDC578

MDC582

MDC577

MDC8

MDC90

MDC38T

MDC576

MDC3

MDC1T

MDC99

MDC45

MDC100

MDC12

MDC561

MDC28T

MDC181

MDC41T

MDC57

MDC39T

MDC260

MDC51

MDC52

MDC33

MDC49

MDC40T

MDC250

MDC273

MDC241

MDC219

MDC10T

MDC24-HG11

MDC63-encheleia-HG11

MDC16-HG11

MDC37T

MDC14

MDC64

MDC94

MDC95

MDC92

MDC91T

MDC93

F1BC1a1

MDC147

MDC256

MDC146

MDC32T

MDC21

MDC87

MDC88

MDC72

MDC74

MDC73

MDC20T

MDC43

MDC55

MDC54T

MDC2374

MDC18-HG13

MDC574

MDC575

MDC2T

70

100

45

100

100

97

60

63

100

100

100

53

76

81

100

74

36

99

78

46

61

100

100

76

57

39

38

100

66

68

93

89

100

98

85

34

46

57

28

36

100

55

34

39

100

100

34

56

100

100

100

100

99

100

62

45

63

100

98

34

60

100

34

24

100

40

39

97

100

43

53

91

100

46

81

100

79

55

55

32

52

22

58

48

42

65

71

48

14

100

39

42

17

24

19

45

0.02

A. popoffii

A. jandaei

A. bestiarum

A. salmonicida

A. hydrophila

A. aquariorum

A. sobria

A. media

A. trota

A. allosaccharophila

A. culicicola/ A. veronii

A. caviae

A. encheleia

A. simiae

A. tecta

A. molluscorum

A. schubertii

Aeromonas sp. (HG11)

A. eucrenophila

Aeromonas sp.



Os resultados obtidos indicam que os isolados de Aeromonas spp. representam

linhas fiógenéticas independentes das descritas até ao momento. A utilização de

diversos genes que codificam funções essenciais (housekeeping) como gyrB, gyrA e

rpoD, graças a sua maior variabilidade intra e interespecífica, têm demonstrado ser

ferramentas úteis para a diferenciação da taxonomia do género Aeromonas (Martínez-

Murcia, 2008). As espécies de Aeromonas mais relacionadas com este novo grupo

formado são Aeromonas tecta e Aeromonas eucrenophila.

4.4. Caracterização fenotípica da estirpe MDC 2464

4.4.1 Métodos bioquímicos

Procedeu-se à caracterização fenótipica da estirpe com a referência MDC 2464

por métodos bioquímicos, por se tratar de uma espécie ainda não descrita em isolados

ambientais ao contrário do descrito por Demarta e colaboradores (2008) a espécie

Aeromonas tecta foi descrita em isolados clínicos, mediante utilização de genes

housekeeping como ferramentas de taxonomia e filogenia. Os perfis bioquímicos foram

comparados com a espécie tipo F518T

(MDC 91) obtida de amostras de fezes de criança

com diarreia em 1992, e outras estirpes de Aeromonas (MDC92, MDC93, MDC94,

MDC95).

Os resultados da caracterização fenotípica estão representados na tabela 6. O

isolado F9Ap que corresponde à estirpe com a referência MCD 2464 é oxidase e

catalase positiva, resistente ao agente vibriostático O/129 (150μg), apresenta

crescimento nas concentrações de 0 e 3% de NaCl. Fermenta a glucose com produção

de ácido e gás, e outros carboidratos como a maltose, manose e trealose. É negativa para

a lactose, sacarose, xilose celobiose e rafinose. Para as provas bioquímicas

complementares será de referir, que a estirpe analizada reduz os nitratos a nitritos, não

degrada o aminoácido triptofano, e revelou reacção negativa para a urease e Voges-

Proskaeur. Constata-se também a hidrólise da gelatina, esculina (48 horas), e lisina

descarboxilase (LDC). Relativamente ao teste da ornitina descarboxilase (ODC)

obtivemos um resultado positivo na estirpe tipo (MDC 91), como também para o

isolado deste estudo (MDC 2464). O resultado desta prova difere do descrito por

Demarta e colaboradores (2008) que referem poder ser variável. Todas as provas

bioquímicas não apresentaram diferenças.



Tabela 6. Perfil bioquímico das estirpes de A. tecta e do isolado MDC 2464

Legenda: ODC (Ornitina descarboxilase); LDC (Lisina descarboxilase); TSI (Triple Iron Sugar); + =

positivo; - = negativo

Nota: K/A- Acidez da Glucose e alcalinização da Lactose e Sacarose

Estirpes

Provas

MDC91 MDC92 MDC93 MDC94 MDC95 MCD2464

Ferm/Gás Ferm/Gás Ferm/Gás Ferm/Gás Ferm/Gás Ferm/Gás

Glucose + / + + / + + / - + / + + / + + / +

Lactose - / - - / - - / - - / - - / - - / -

Manose + / + + / - + / - + / + + / + + / +

Maltose + / + + / + + / - + / + + / + + / +

Sacarose - / - - / - - / - - / - - / - - / -

Xilose - / - - / - - / - - / - - / - - / -

Celobiose - / - - / - - / - - / - - / - - / -

Trealose + / + + / - + / - + / + + / + + / +

Rafinose - / - - / - - / - - / - - / - - / -

Inositol - / - - / - - / - - / - - / - - / -

Sorbitol - / - - / - - / - - / - - / - - / -

Manitol + / + + / - + / - + / - + / + + / -

Esculina - + + - - - (+ 48h)

ODC + + + + + +

LDC + + + + + +

Indol - - - - - -

Metil Red + + + + + +

Voges-Proskaeur

- - - - - -

Urease - - - - - -

Nitratos + + + + + +

Gelatina + + + + + +

Citrato + + + + + +

TSI K/A K/A K/A K/A K/A K/A



4.4.2. Sistema de biotipificação numérico API 20NE

Procedeu-se também à caracterização bioquímica do isolado MDC 2464,

recorrendo-se à utilização de um sistema miniaturizado sob a forma de kit, o API 20NE

(bioMerieux) (figura 7). A metodologia está descrita no quadro 11 (Material e

Métodos). Este procedimento justifica-se por se tratar de uma espécie ainda não descrita

em isolados ambientais ao contrário do descrito por Demarta e colaboradores (2008),

em que a espécie Aeromonas tecta foi descrita em isolados clínicos, mediante utilização

de genes housekeeping como ferramentas de taxonomia e filogenia.

Figura 7- Perfil do sistema de biotipificação numérico API 20NE do isolado MDC 2464

Pela figura 7 acima referida, é possível observar que o isolado de Aeromonas

tecta caracterizado bioquimicamente por API 20NE, revela pelo perfil de resultados a

ocorrência da degradação do aminoácido triptofano, ao contrário do verificado quando

se caracterizou fenotipicamente esta estirpe, o que é bem demonstrativo da contradição

dos resultados obtidos e da ambiguidade da identificação de espécies por métodos

fenotípicos. Para as restantes provas, os resultados obtidos foram similares aos estudos

realizados com o intuito de caracterizar bioquímicamente a estirpe por métodos

bioquímicos convencionais.

4.5. Caracterização bioquímica da espécie de Aeromonas spp.

4.5.1. Sistema de biotipificação numérica API 20NE

A espécie identificada como Aeromonas spp. refere-se aos isolados (F1BC1a1- MDC

2510 e F1BC1a2. Esta caracterização bioquímica efectuou-se por se tratar de uma



espécie ainda não descrita no género Aeromonas. Na figura 8 está representado o perfil

numérico dos isolados anteriormente referidos.

Figura 8- Perfil do sistema de biotipificação numérico API 20NE dos isolados FBC1a1- MDC 2510 - e

FBC1a2

Pela figura 8 é possível observar que os resultados dos isolados de Aeromonas

spp., apresentam perfil bioquímico idêntico, com excepção da arginina dihidrolase que

para o isolado FBC1a (MDC 2510) deu resultado positivo, ao contrário do verificado

para o isolado FBC1a2) com reacção negativa às 24 horas, mas às 48 horas o resultado

desta prova foi positivo. Em ambos os isolados ocorreu a redução dos nitratos, indol e

urease positiva, hidrólise da esculina e gelatina, fermentação da glucose. De salientar

que o perfil numérico obtido para os isolados da espécie A. tecta (F9 e F9Ap) e

Aeromonas spp. (F1BC1a1 e F1BC1a2), com leitura às 24 horas não foi possível obter

qualquer identificação pela consulta no livro índex do sistema de biotipificação

respectivo. Este facto corrobora a necessidade de se fazer a identificação por métodos

genéticos como referido (Figueras et al., 2000; Castro-Escarpulli et al., 2003; Martínez-

Murcia et al., 2007; Hidalgo et al., 2008).

A caracterização bioquímica apresenta problemas ao nível das bactérias do

género Aeromonas, dado que o método de biotipificação numérica utilizado tem como

base de dados, resultados de ensaios em estirpes clínicas. Assim e de acordo com Díaz e

colaboradores (2006) é referido que num laboratório de análises microbiológicas de

águas, Aeromonas hydrophila é a espécie mais frequentemente identificada (62,5%),

Aeromonas caviae (20,3%), Aeromonas veronii biovar sobria (9,3%), e Aeromonas spp.

(7,8%). Tal como referido por vários autores sabe-se que os sistemas comerciais para

identificação bioquímica das espécies de Aeromonas são erróneos, existindo mesmo

sistemas que apenas incluem nas suas bases de dados a espécie Aeromonas hydrophila

(Vivas et al., 2000). No nosso trabalho essa dificuldade foi constatada, em ambas as



espécies (Aeromonas tecta e Aeromonas spp.). A escassa coincidência entre os métodos

de identificação fenotípica e genética é evidenciada pela falta de provas fenotípicas

claras e concisas para diferenciar entre espécies de Aeromonas. Diferenças entre a

identificação fenotipica/genética foram reportadas em estudos anteriores (Abbott et al.,

1998; Vivas et al., 2000; Park et al., 2003; Díaz et al., 2006), e está de acordo com os

nossos resultados. Hidalgo e colaboradores (2008) referem que 73,5% dos isolados

identificados fenotipicamente como A. hydrophila, mediante identificação genética

resultaram em A. hydrophila (22,4%), A. sobria (28,6%) e A. bestiarum (22,5%).

4.6. Perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos

_______________________________________________________________________________

Foi realizado o perfil de susceptibilidade, pelo método de difusão em disco

(Quadro 12, Material e Métodos) a 27 antibioticos de vários grupos em 34 estirpes. As

tabelas com os perfis individuais das estirpes em estudo encontram-se no anexo II. Os

resultados globais do perfil de susceptibilidade dos isolados obtidos apresentam-se na

figura 9.

Figura 9. Perfil de susceptibilidade a diferentes antibióticos dos isolados de Aeromonas em estudo

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

AMLAMC

TICTIMPRLTZP

ATMIPM

KFFOXCAZCTXCROCFPFEPFOSNACIPAKCN

TOBKSEC

STXTE

Resistente Sensível Intermédio



Ao longo dos vários anos, estudos relativos ao perfil de susceptibilidade a

diferentes antibióticos têm sido efectuados com estirpes Aeromonas de origem clínica e

ambiental (Overman e Janda, 1999; Huddleston et al., 2006; Palú et al., 2006). Pela

análise da figura 9 podemos verificar que as estirpes estudadas apresentaram uma

percentagem elevada de resistência à amoxicilina assim, os índices obtidos foram de

100%. Estudos anteriores (Vila et al., 2002; Radu et al., 2003) referem 100% de

resistência a estes antibióticos, referindo que as estirpes do género Aeromonas são

intrinsecamente resistentes à penicilina (Hatha et al., 2005). No entanto, nos trabalhos

de Saavedra e colaboradores (2004) apresentam-se valores de 35% de sensibilidade a

estes antibióticos. Em relação à cefalotina, cefalosporina de primeira geração, todas as

estirpes foram resistentes a este antibiótico, resultados obtidos também por Bizani e

Brandelli (2001).

Verificámos ainda que 85% das estirpes testadas eram resistentes à ticarcilina,

estando estes resultados em concordância com os obtidos por Blasco e seus

colaboradores em 2008, num estudo onde foi comparada a multiresistência de

patogénicos (Aeromonas spp., Pseudomonas spp. e Legionella spp.) isolados em água

de reservatórios, água engarrafada e sistemas de refrigeração.

Podemos constatar que as estirpes de Aeromonas estudadas apresentaram uma

elevada percentagem de sensibilidade à ureidopenicelina (piperaciclina). Á semelhança

do referido por Vila et al., (2002) e Fosse et al., (2003) verificamos que as

ureidopenicelinas se revelaram mais activas do que as carboxipenicelinas contra as

estirpes testadas, como se pode observar na figura 16, a percentagem de estirpes

sensível à piperaciclina é de 100%, enquanto a percentagem de estirpes sensível à

ticarcilina é de 5%.

Relativamente às cefalosporinas testadas verificamos que a percentagem de

estirpes resistentes à cefalotina (100%), a única cefalosporina de 1ª geração testada,

estava de acordo com os valores obtidos noutros trabalhos (Bizani e Brandelli, 2001).

No que se refere à cefalosporina de 2ª geração testada, a cefoxitina, 9% das estirpes

analisadas eram resistentes. No estudo de Costa e colaboradores em 2002 com estirpes

obtidas num matadouro de frangos e no estudo de Palú e colaboradores em 2006 com

estirpes obtidas de alfaces foram obtidos valores de resistência à cefoxitina (32%)

superiores aos obtidos no nosso estudo. Para as cepalosporinas de 3ª e 4ª geração



obtivemos valores de 100% de sensibilidade revelando-se assim efectivas contra

Aeromonas spp.. Estes resultados semelhantes aos obtidos em vários estudos, (Kãmpfer

et al., 1999; Bizanni e Brandelli, 2001; Fosse et al., 2003; Sader e Jones, 2005), em que

todas as estirpes analisadas querem de origem ambiental, quer de origem clínica eram

susceptíveis a este subgrupo de antibióticos. Por outro lado os resultados por nós

obtidos de isolados de Aeromonas spp., em águas não tratadas para consumo humano,

estão de acordo com os de Ottaviani e colaboradores (2006) num estudo que visou

pesquisar a presença deste género em melhixões no mar Adriático.

Constatamos ainda, que da associação do inibidor de β-lactamases, o ácido

clavulânico com a aminopenicilina, amoxicilina, permitiu reduzir a resistência deste

antibiótico de 100% para 56% o que revela a sua eficiência. Este inibidor quando

associado à carboxipenicilina, ticarcilina, essa diminuição não foi tão significativa pois

passou de 85% para 68%, o que corresponde a uma redução de 17%. Estes resultados

estão de acordo com os obtidos noutros estudos (Vila et al., 2002; Saavedra et al.,

2004). Relativamente ao tazobactam, constatamos que da sua associação à

ureidopenicelina (piperaciclina) não houve qualquer eficiência, pois todas as estirpes

eram sensíveis.

Os nossos resultados revelaram que 100% das estirpes estudadas eram

sensíveis ao aztreonamo o que está de acordo com outros estudos publicados (Ko et al.,

1996; Kãmpfer et al., 1999; Sader e Jones, 2005). No entanto, no estudo de Koksal e

colaboradores (2007), com estirpes isoladas de água para consumo em Istambul-

Turquia, para este antibiótico foram obtidos índices de sensibilidade de 89% e no

trabalho de Díaz e colaboradores (2006), com estirpes isoladas de água apenas 58% das

estirpes eram sensíveis ao aztreonamo.

Para o carbapenemo testado, imipenemo, 3% das estirpes apresentaram resistência, 12%

foram consideradas intermédias e as restantes 84% sensíveis. Estes resultados são de

realçar pelo facto de este antibiótico ser de último recurso em estirpes nosocomiais

multiresistentes, nomeadamente Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni

como é referido em vários trabalhos (Hughes et al., 2002; Hsueh et al., 2005; Poirel e

Nordmann (2006); John e McGowan (2006). Em estudos anteriores obtiveram-se, no

que se refere ao imipenemo, estirpes de origem clínica e ambiental com resistência a

este carbapenemo (Hughes et al., 2002; Obi et al., 2007; Koksal et al., 2007). De referir



que no nosso estudo a estirpe Aeromonas eucrenophila foi a que apresentou resistência

a este agente antibacteriano.

No presente trabalho verificou-se que para as quinolonas testadas todas as

estirpes de Aeromonas eram sensíveis à ciprofloxacina (Penders e Stobberingh, 2008),

enquanto a sensibilidade revelada ao ácido naladíxico foi de 91%. Castro-Escarpulli e

colaboradores (2003) reportam que 58,5% das estirpes de peixe congelado para

consumo, que analisaram, eram resistentes à ciprofloxacina, Koksal e colaboradores

(2007) referem para ambos os antibióticos valores de 1% e 2% respectivamente.

Em vários estudos é referida a susceptibilidade das estirpes de Aeromonas, aos

aminoglicosídeos testados com diferentes origens, (Kãmpfer et al., 1999; Vila et al.,

2002; Palú et al., 2006). Neste estudo, a estreptomicina revelou ser o menos efectivo,

com 44% das estirpes analisadas a apresentarem-se resistentes. Em 2007 Akinbowale e

colaboradores obtiveram valores de resistência semelhantes (33%) em estirpes isoladas

de trutas na Austrália. Em contrapartida, outros autores, referiram valores de resistência

para este antibiótico superiores, 65% em estirpes isoladas de água de dois rios Europeus

(Goñi-Urriza et al., 2000), e 75% em estirpes isoladas de peixe congelado para

consumo, no México (Castro-Escarpulli et al., 2003). Para os restantes

aminoglicosídeos verificamos que 100% das estirpes estudadas eram sensíveis à

amicacina, canamicina, gentamicina, e tobramicina, valores comparáveis aos obtidos em

outros estudos (Overman e Janda, 1999; Castro-Escarpulli et al., 2003).

No nosso estudo detectamos um elevado número de estirpes resistentes à

eritromicina (89%) à semelhança do reportado noutros trabalhos (Kãmpfer et al., 1999;

Blasco et al., 2008), Koksal e colaboradores (2007) obtiveram 48%. Verificamos ainda

que 11% das estirpes revelaram sensibilidade a este antibiótico. Alguns autores referem

a existência de uma resistência intrínsica do género Aeromonas à eritromicina (Kãmpfer

et al., 1999). Relativamente ao sulfametoxazol-trimetoprim, 97% das estirpes eram

sensíveis a este antibiótico. Nos estudos de Palú e colaboradores (2006) as estirpes

analisadas de origem alimentar eram todas sensíveis, mas segundo Castro-Escarpulli e

colaboradores em 2003 obtiveram valores de resistência de 49%, valores muito

superiores aos obtidos por nós (3%). No que se refere ao cloranfenicol e à tetraciclina

verificou-se que todas as estirpes analisadas, eram sensíveis a estes antibióticos o que

está de acordo com (Penders e Stobberingh, 2008). De referir no entanto que Costa e



colaboradores (2002) descrevem que 75% das estirpes obtidas em diferentes pontos da

linha de abate de aves, eram resistentes à tetraciclina enquanto Koksal e colaboradores

(2007) num estudo efectuado em águas para consumo obtiveram valores de resistência

de 12% para este antibiótico.

A existência de multiresistência tem sido referida em estudos anteriores

(Morita et al., 1994; Radu et al., 2003; Ottaviani et al., 2006) e está de acordo com os

nossos resultados. Neste trabalho todas as estirpes estudadas apresentaram resistência a

três ou mais antibióticos.

Tabela 7- Resistência a múltiplos antibióticos das espécies de Aeromonas

Fénotipo de Resistência Isolados

AML, KF; E F8; F5B2; F27.2

AML; AMC; KF F7R

AML; TIC; KF; E P6

AML; AMC; KF; S F7A

AML; TIC; TIM; KF; E F2.1; F1BA2.1; F1BA2.2

AML; AMC; TIC; TIM; KF F2.2a2

AML; AMC; TIC; KF; E F5B1

AML; TIC; KF; S; E F27.1b; F1BC1a1; F1BC1a2

AML; AMC; TIC; TIM; KF; E P2.1a; F4A; F24.2; F25.1; F25.2.1; F25.3; N1.1; P31b1

AML; TIC; TIM; KF; S; E; F1BC2; F1BA1; F1BA3

AML; AMC; TIC; TIM; KF; S P5.1.1

AML; TIC; KF; S; E; SXT F27.1a

AML; AMC; TIC; TIM; KF; S; E F9; F9Ap; P4.2

AML; TIC; TIM; KF; FOX; NA; E P1a1

AML; AMC; TIC; TIM; IMP; KF; S; E P2.1b

AML; AMC; TIC; TIM; KF; FOX; NA; S; E P3.1a; P3.1aa

Huddleston e colaboradores (2006) referem no entanto a inexistência de

estirpes multiresistentes. Dos 34 isolados submetidos ao teste de sensibilidade a

antimicrobianos, 38% apresentaram resistência a seis antibióticos e 11,7% a sete, em



combinações diferentes. É de referir que em 6% das estirpes analizadas se detectou

multiresistência a nove antibióticos, sendo que a combinação dos antimicrobianos

verificada é a mesma. Estas estirpes foram identificadas como Aeromonas caviae, dados

estes que corroboram com os obtidos para a mesma espécie por Costa e colaboradores

(2003). Apesar da espécie A. caviae ser considerada de menor patogenicidade, quando

comparada à A. hydrophila a presença de estirpes dessa espécie, resistente a um amplo

espectro de antimicrobianos, deve ser motivo de preocupação.

A estirpe onde se detectou a ocorrência de resistência a oito antibióticos, entre

os quais imipenemo, foi a espécie Aeromonas eucrenophila. A multiresistência à

amoxicilina, cefalotina e eritromicina foi detectada em 9% das estirpes analisadas,

verificando-se a presença de resistência à amoxicilina e cefalotina em 100% das

estirpes.

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

____________________________________________________________________________________

Considerações Finais


As amostras de água não tratada para consumo humano, utilizadas neste

trabalho são provenientes de fontes, poços e nascentes, cujo controlo e frequência na

monitorização da qualidade microbiológica destas águas deverá ser de acordo com o

Decreto-lei 306/2007, sendo esta no entanto escassa ou nula. Pois estas águas não são

distribuídas pelas entidades gestoras responsáveis por essa distribuição, logo não existe

obrigatoriedade da realização desta análise. Desta forma o risco de transmissão de

bactérias patogénicas ou comensais é elevado.

O isolamento e a identificação de diferentes espécies de Aeromonas nas águas

não tratadas nesta região, sugerem uma elevada prevalência destas espécies, e reforça a

afirmação dos riscos que estas águas representam para a saúde pública pelo seu

consumo directo ou como veículo de contaminação de alimentos.

A sequenciação dos genes gyrB, gyrA e rpoD utilizados na metodologia para

identificação dos 34 isolados obtidos neste estudo mostraram ser bastante eficazes, o

que possiblitou a identificação de sete espécies distintas – Aeromonas hydrophila,

Aeromonas eucrenophila, Aeromonas caviae, Aeromonas tecta, Aeromonas veronii,

Aeromonas bestiarum e Aeromonas encheleia. É de referir que a espécie Aeromonas

tecta ainda não tinha sido descrita em isolados ambientais, tendo sido possível a sua

detecção neste trabalho pelas ferramentas utilizadas.

A análise filogenética demonstrou a existência de um grupo de estirpes que,

com base na sua relação com as restantes espécies do género Aeromonas poderá

representar uma espécie não descrita deste género.

No que se refere aos perfis de susceptibilidade aos antibióticos testados

conclui-se que a piperaciclina, o aztreonamo, as cepalosporinas de 3ª e 4ª geração e a

ciprofloxacina apresentavam boa actividade contra Aeromonas spp.

Detectou-se multiresistência em todos os isolados, sendo de salientar que em

6% das estirpes analisadas foi observada multiresistência a nove antibióticos.

Os resultados alertam para o facto de que isolados da mesma espécie podem

apresentar comportamentos de susceptibilidade diferente aos grupos de antibióticos.

6. BIBLIOGRAFIA

___________________________________________________________________________

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ANEXOS

_______________________________________________________

Anexo I

Perfil de susceptibilidade a antibióticos dos isolados identificados por 16s RNA

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano

AML AMC TIC TIM PRL TZP ATM IMP KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE

F1AA R R10

R R10

R11

S R R R R13

R14

R R R10

S R S S R14

I14

R R R I18

S S S

F1b R R R R S S S S R R S S R10

S S S S S S S S S S R I16 S S

F10AA R R R R R17

R17

R R11

R S S R R12

R15

R R S S R14

R9 R R

10 R

10 R

8 R

12 S R

9

F11B R R R R S S R S R R S R R S S S S S S S S S S R R10

S S

F11R R R R R S S R S R R S R R S S S S S S S S S S R R S S

F12 R R R R S S R S

R R S R10

R S S S S S S S S S I14

R I16

S S

F13 R R R R S S R S R R S R R S S S S S S S S S S R R10

S S

F281a R R R R S S S R11

R R S R12

I15

I19

S R I14

S S S S S S R R11

S S

F281b R R R R S S S R11

R R S R11

I17

I18

S R I17

S S S S S S R R12

S S

Anexo II

Perfil de susceptibilidade a antibióticos dos isolados identificados por gyrB, gyrA e

rpoD


ND-Não determinado

AML AMC TIC

TIM

PRL TZP ATM IPM KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE

F2.1 R S R R10

S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S

F2. 2a2 R R R R S S S S R S S S S S S S S S S S S S S S S S S

P3. 1a R R13

R10

R10

S S S S R10

R S S S S S S R S S S S S R11

R12

S S S

P3. 1aa R R13

R9 R

11 S S S S R

12 R S S S S S S R S S S S S R

11 R

11 S S S

P3. 1b1 R R11

R9 R

10 S

19 S S S R I

16 S S S S S S S S S S S S I

14 R

14 S S S

F4A R R13

R R12

S S S S

R S S S S S ND S S S S S S S S R S S S

F7R R R10

S

S S S S S R S S S S S S S S S S S S S I13

S S S S

F7A R R9 I

16 S S S S S R S S S S S S S S S S S S S R

11 S S S S

F9 R R7 R R S S S S R

8 S S S S S S S S S S S S S R

11 R

14 S S S

F9Ap R R R R S S S S R8 S S S S S S S S S S S S S R

11 R

14 S S S

P5.1.1 R R11

R R9 S S S I

15 R S S S S S S S S S S S S S R

11 S S S S

P2.1b R R10

R13

R12

S S S R13

R S S S S S S S S S S S S S R R S S S

P4.2 R R10

R13

R12

S S S I15

R S S S S S S S S S S S S S R10

R S S S

P1.a1 R I15

R10

R12

S S S S R R S S S S S S R S S S S S S15

R16

S S S

N1.1 R R R R S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S


AML AMC TIC TIM PRL TZP ATM IMP KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE

F8 R10

S S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S16

R11

S S S

F5B1 R R13

R S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R11

S S S

F5B2 R I16

I18

S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S

F24.2 R R R R S S S S

R S S S S S S S S S S S S S S R S S S

F25.1 R R R R S S S S R14

S S S S S S S S S S S S S S R S S S

F25.2.1 R R R R S S S S R10

S S S S S S S S S S S S S S R S S S

F25.3 R R R R S S S S R8 S S S S S S S S S S S S S S R S S S

F27.1a R I15

R I16

S S S S R S S S S S S S S S S S S S R11

R12

S R S

F27.1b R S20

R12

S S S S S R S S S S S S S S S S S S S R11

R12

S S S

F27.2 R I16

I16

I18

S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R15

S S S

P2.1a R R10

R13

R12

S S S I15

R S S S S S S S S S S S S S I12

R13

S S S

P6 R I15

R12

S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S

1BA3 R I15

R R10

S22

S S S R S S S S S S S S S S S S S R10

R16

S S S

1BA2.1 R I16

R R11

S24

S S S R S S S S S S S S S S S S S S15

R15

S S S

1BA2.2 R S18

R R13

S22

S S I15

R S S S S S S S S S S S S S S15

R12

S S S

1BC2 R I15

R6 R

13 S

22 S S S R S S S S S S S S S S

S16 S S R

10 R

15 S S S

1BA1 R I15

R R12

S22

S S S R S S S S S S S S S S18

S17

S S R12

R12

S S S

F1BC1a1 R I17

R I18


R S S S

F1BC1a2 R I17

R I17


R S S S

caracterizaÇÃo de aeromonas spp. isoladas de Águas nÃo tratadas para consumo humano

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