caracterizacion cin´ etica de un consorcio´ microalga

1

Caracterizacion cinetica de un consorciomicroalga-bacteria con potencial de degradacion de

fenol en aguas residualesAndrea Nataly Bernal BaezAsesor:Andres Gonzalez Barrios

Resumen—El manejo de aguas residuales industrialesprovenientes de petroquımicas cuenta con grandes retospara el tratamiento de contaminantes ambientales. Por estarazon se estudia el potencial que tiene el consorcio microalga(Chlamydomonas reinhardtii) - bacteria (Microbacteriumparaoxydans (C7A)) para mejorar de manera representativa ladegradacion de fenol en aguas que requieren de tratamiento.Para ello, se analizo el comportamiento del consorcio, de lasmicroalgas y de las bacterias en presencia de fenol a tresdiferentes concentraciones (25, 50 y 75 ppm) en medio bajode sales TAP. Con los resultados de las concentraciones defenol en el tiempo se determino que no hubo degradacion deeste compuesto organico en el cultivo de microalgas. Por elcontrario, las bacterias C7A y el consorcio sı degradaron elfenol en el medio, con porcentajes de remocion del 40 % y100 % respectivamente. Finalmente, al evaluar los parametroscineticos de un modelo de degradacion con un diseno factorial,teniendo como variable de respuesta la tasa de crecimiento delos microorganismos, se determino que la degradacion de fenolpor parte del consorcio es mas efectiva que la degradacionllevada a cabo por un cultivo puro de bacterias. Las mayoresvelocidades de degradacion reportadas fueron de 0.0208 (1/hr)para las bacterias y de 0.0265 (1/hr) para el consorcio.

Palabras clave: Fenol, aguas residuales, consorcio, degradacion,Monod

I. INTRODUCCION

LAS aguas residuales industriales provenientes depetroquımicas contienen altas concentraciones de

amonio, cianuro, naftaleno, compuestos heterocıclicos denitrogeno (HNC), y fenoles, entre otros [1]. De ellos, elgrupo de compuestos que mas demanda de oxıgeno y decarbono organico requieren son los fenoles. Este compuestogeneralmente se deriva de las aguas residuales de los procesosde craqueo catalıtico [2].

El fenol es considerado como un contaminante peligrosoen las aguas segun la Agencia de proteccion del medioambiente de los Estados Unidos [3]. Es por esto que lasaguas contaminadas con este compuesto deben recibir unmanejo a adecuado. Algunos de los tratamientos realizadospor las petroquımicas incluyen tecnicas fısiscas y quımicascomo coagulacion, floculacion y filtracion para eliminar loscontaminantes que se encuentran en suspensiones.

Tambien, algunas realizan un manejo biologico que incluyeequipos como filtros rotatorios, tratamientos aerobicos oanaerobicos con microorganismos en cuerpos de agua eincluso la depuracion biologica por lodos activados [2].

Actualmente, existen tecnologıas de remediacion quepermiten remover los fenoles de los sistemas tales comoozonizacion, uso de carbon activado, adsorcion y oxidacionquımica; no obstante, estos tratamientos son de alto costo ycomplejidad, sin mencionar los posibles productos secundariosque se pueden llegar a tener [4]. Es por esto que se hanbuscado alternativas que incluyen metodos biologicos paramejorar el tratamiento de los compuestos fenolicos en el agua.

En el campo de la biotecnologıa ambiental, labiorremediacion es uno de los metodos mas estudiadospara este tratamiento [5], que en la mayorıa de los casosincluyen microorganismos como microalgas y bacterias. Lasmicroalgas son microorganismos fotosinteticos capaces deadaptarse a nuevos ambientes y poseen altas tasa de fijacionde CO2. De igual manera, pueden recuperar nutrientescomo el nitrogeno y el fosforo dentro de aguas residuales,mejorando ası su calidad [6]. En cuanto a las bacterias,muchas cepas aisladas han sido utilizadas para investigacionen bioremediacion al degradar compuestos como el fenol [1].

Las microalgas Chlamydomonas reinhardtii pertenecen ala clasificacion de algas verdes eucariotas (Chloropphyta) [7].Estas poseen dos flagelos que le permiten movilidad y hacenparte de su reproduccion sexual. De igual manera, tienen unagran adaptacion a ambientes en los que la disposicion deagua es limitada y ademas tienen la capacidad de crecer en laoscuridad utilizando acetato como fuente de carbono. Estasmicroalgas son utilizadas dentro de la investigacion a nivelgenetico y molecular por el conocimiento de su estructura yfuncion, ademas de su facilidad para cultivar [8].

Dentro de las posibles interacciones de los microorganismosa la hora de formar un consorcio es que funcionen de maneracoordinada y complementaria para potenciar los procesosmetabolicos individuales de los organismos [9].

2

Una de las interacciones es una relacion de mutualismo enla cual la microalga le provee oxıgeno y fuentes de carbonoa la bacteria, elementos requeridos en el proceso aerobicode metabolizar contaminantes organicos, y a cambio de esto,la bacteria provee a la microalga CO2 proveniente de larespiracion celular para completar su ciclo fotosintetico [10].

De acuerdo a Mora y colaboradores [11], los consorciosde microalga-bacteria tienen un gran potencial para mejorarla degradacion de fenol en el agua, dada la relacionmutualista que se establece. Se encontro que la remocionde este compuesto organico daba mejores resultados aconcentraciones bajas de fenol. Adicionalmente, se establecioque la proporcion de pre-inoculo mas favorable es 2:1(bacteria-alga) y que las especies de microalga-bacteria quetuvieron mejores resultados en la conformacion del consorciofueron Chlamydomonas reinhardtii y Microbacteriumparaoxydans, respectivamente [11].

Dada la importancia del tratamiento de aguas residuales ylos resultados obtenidos por Mora y colaboradores [11], coneste proyecto se busca ajustar los resultados de la degradacionde fenol a un modelo cinetico con el que se pueda cuantificarsi la degradacion de fenol por parte del consorcio es masefectiva que la degradacion de los cultivos individuales deMicrobacterium paraoxydans y Chlamydomonas reinhardtii.

II. MATERIALES Y METODOS

II-A. Microorganismos

Microalgas

Las microalgas Chlamydomonas reinhardtii CC503cw92mt+ fueron cultivadas en medio de sales Tris-acetato-fosfato (TAP); las especificaciones del medio se encuentranen la seccion II-B. Periodicamente se le realizaron una seriede pases para mantener la cepa activa, la cual fue mantenıaen agitacion continua a 200 rpm y con luz led blanca.

Bacterias

Las bacterias Microbacterium paraoxydans (C7A) BAB-4119 fueron cultivadas inicialmente en medio Luria Bertani(LB) en placa (ver especificaciones en seccion II-B). Una vezobtenido el aislamiento de la cepa, se comenzo el proceso deaclimatacion de la bacteria al medio TAP. Luego de 3 pases demedio lıquido, se considero que esta se encontraba adaptada aeste medio menos rico en nutrientes, como lo es el medio TAPen comparacion al medio LB. Las bacterias fueron incubadas a30◦C con agitacion de 100 rpm y al igual que a las microalgas,se le realizaron pases para mantener la cepa activa.

II-B. Medios

A continuacion se muestran las composiciones correspon-dientes para cada uno de los medios utilizados para loscultivos.

Luria Bertani (LB)

Tabla 1: Composicion medio LB

Tris-acetato-fosfato (TAP)

Tabla 2: Composicion medio TAP

II-C. Montaje y condiciones de operacion

La figura 1 muestra la incubadora en la cual crecieron loscultivos. El montaje se realizo en erlenmeyers de 1 L contapones que incluıan una perforacion por la cual pasaba unamanguera que conectaba el interior del erlenmeyer con laatmosfera. La manguera permanecıa cerrada con clips queimpedıan el flujo en cualquier direccion. Los montajes fueronpuestos en la incubadora para microalgas a una temperaturade 27◦C y 100 rpm por 5 dıas. Dentro de la incubadora seubico una chaqueta de leds para garantizar la iluminacionconstante que las microalgas necesitan para su crecimiento.

II-D. Crecimiento microorganismos

Para determinar el crecimiento de las bacterias se uso elespectrofotometro UV a una longitud de onda de 620 nm. Sereporto la densidad optica del microorganismo cada 12 horasdurante 5 dıas. En el caso de las microalgas, se realizo unconteo celular en la camara de Neubauer para determinar laconcentracion de celulas en el tiempo, igualmente, cada 12horas durante 5 dıas.

3

Figura 1: Montaje experimental. Incubadora para microalgascon adaptacion de luces led.

II-E. Cuantificacion de fenol

Cromatografıa lıquida (HPLC)

Se utilizo la cromatografıa lıquida para determinar las con-centraciones de fenol de cada una de las muestras recogidas.Para ello se utilizo el HPLC Aligent Technologies 1260Infinity que se encuentra equipado con una columna ZORBAXEclipse Plus C18 (4.6 x 100 mm, 5 µm), el cual se programopara un flujo de 1 mL/min con fase movil de 40% acetonitrilo60% agua a una temperatura de 30◦C [11] [12]. Previo a todaslas corridas, se llevo a cabo una curva de calibracion paraestandarizar el metodo de reconocimiento de fenol.

II-F. Modelo Cinetico

El crecimiento poblacional tiene una dependencia al tamanode la poblacion y es proporcional a una tasa de crecimientoespecıfica [13]. Matematicamente se puede expresar como laecuacion 1.

dN

dt= µN (1)

Donde N representa el tamano poblacional, en este casoel numero de celulas, y µ la tasa de crecimiento. Para cadauno de los experimentos realizados se determino la tasa decrecimiento representado por la pendiente de la grafica ln(N)vs. tiempo.

La degradacion del fenol en el consorcio y en las bacteriasfue cuantificada mediante un modelo de degradacion. Dentrode los modelos cineticos mas utilizados para las cineticas decrecimiento y degradacion esta el modelo de Monod [14]. Eneste modelo, la tasa especıfica de crecimiento µ depende dela tasa maxima de crecimiento por sustrato y de la constantede afinidad como lo muestra la ecuacion 2.

µ = µmaxS

Ks + S(2)

Donde µmax representa la tasa maxima de sustrato utili-zado por unidad de biomasa (mg sustrato/mg biomasa) y Ks

representa el coeficiente de saturacion media. Los parametroscineticos fueron determinados mediante una regresion nolineal con mınimos cuadrados en el software MATLAB. Paraencontrar el grado de correlacion entre los datos simulados yexperimentales, se determinaron los valores del coeficiente deregresion para cada uno de los experimentos, y de esta maneradeterminar la validez del modelo.

II-G. Diseno de Experimentos

En cuanto al diseno de experimentos se utilizo lametodologıa sugerida por Coleman y Montogomery [15]. Enprimer lugar se reconocieron los objetivos y alcances delproyecto, que para este caso fue realizar una caracterizacioncinetica a nivel individual y del consorcio microalga-bacteriaque describiera el crecimiento de cada una de las especies delconsorcio y la degradacion de fenol a bajas concentracionesen el agua. Teniendo esto en mente, se definieron los factoresy los niveles como sigue:

Tabla 3: Factores y niveles experimentos

Factores Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3Concentracion 25 ppm 50 ppm 75 ppm

Microorganismo Micro-alga Bacteria Consorcio

De acuerdo a lo anterior, se tiene el factor concentraciony el factor microorganismo cada uno con 3 niveles.Luego de tener claros los 2 factores y los 3 niveles, sedetermino como variable de respuesta la tasa de crecimientoasociada a la degradacion de fenol (µ) puesto que seesta evaluando que factor presenta una mayor degradacionsegun la caracterizacion cinetica. En lo que concierne ala parte experimental, se llevo a cabo un experimento yuna replica. De igual manera, se realizaron experimentosde control constituidos por medio con fenol sin ninguntipo de microorganismo inoculado para cada una de lasconcentraciones.

En vista de los factores y niveles, se escogio un disenofactorial de multiples niveles para evaluar el comportamientode la variable de respuesta.

4

III. RESULTADOS

III-A. Crecimiento microorganismos

En primera instancia se evaluo el crecimiento de cada uno delos microorganismos. Para las bacterias se utilizo la densidadoptica y para las microalgas el conteo celular en el microsco-pio. En la evaluacion del crecimiento en el consorcio se utili-zaron los mismos metodos para cada tipo de microorganismocon el fin de que no se generaran interferencias al obtenerla densidad optica, puesto que al utilizar el microscopio esmas factible diferenciar estos microorganismos de acuerdo a sucolor y morfologıa. A continuacion se presentan los resultadosde crecimiento para cada uno de los factores microorganismo.

Chlamydomonas Reinhardtii

0 20 40 60 80 100 1200

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

x 107

Tiempo (h)

Concentr

ació

n a

lgas (

célu

las/m

L)

Figura 2: Curva crecimiento microalgas en medio TAP a 25ppm de fenol.

0 20 40 60 80 100 1200

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4x 10

7

Tiempo (h)

Concentr

ació

n a

lgas (

célu

las/m

L)


Las figuras 2, 3 y 4 muestran la concentracion de algas(celulas/mL) de cada uno de los experimentos llevados acabo. La mayor concentracion de microalgas reportada fuepara el cultivo a una concentracion de fenol de 50 ppm con2x107 celulas/mL. Ası mismo, se observa que el crecimientode las microalgas no se ve afectado en presencia de fenol yaque en ninguno de los 5 dıas de experimentacion disminuyesu densidad.

Es importante resaltar que en las primeras muestras elcrecimiento es lento debido a que las microalgas se encuentranen etapa de acondicionamiento al medio en el que estancreciendo. Luego, se evidencia el crecimiento exponencial yhacia las 100 horas de experimentacion se ve representada lafase estacionaria como se aprecia en la figura 4. Aunque enlas figuras 2 y 3 no se hace evidente esta etapa, se consideraque las microalgas al final del tiempo experimental ya estabancerca a esta fase estacionaria.

0 20 40 60 80 100 1200

0.5

1

1.5

2

x 107

Tiempo (h)

Concentr

ació

n a

lgas (

célu

las/m

L)


Para las 3 concentraciones, los dos experimentos no mues-tran resultados similares a partir de las 60 horas pues lasdesviaciones en las muestran comienzan a ser mas altas. Estecomportamiento puede atribuirse en primer lugar al metodopara determinar la concentracion, que fue el conteo celular,pues el error para este metodo esta entre el 20 % - 30 % [16].En segundo lugar, se atribuye a una posible contaminacion delas microalgas debido a la facilidad de crecimiento de otrosmicroorganismos en el medio en que estas se encontrabancultivandose [18].

5

Microbacterium paraoxydans (C7A)

0 20 40 60 80 100 1200.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5x 10

8

Tiempo (h)

Concentr

ació

n b

acte

rias (

célu

las/m

L)

Figura 5: Curva crecimiento bacterias en medio TAP a 25 ppmde fenol.

En relacion con las bacterias, la mayor absorbanciareportada fue para el experimento con 50 ppm de fenol, estafue de 0.575, lo que representa una concentracion de 4.12x108

celulas/mL. A diferencia de las microalgas, las bacterias nomuestran una fase de acondicionamiento, principalmente seobserva la fase exponencial, entre las 0 y las 40 horas y lafase estacionaria de manera pronunciada.

0 20 40 60 80 100 1200

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5x 10

8

Tiempo (h)

Concentr

ació

n b

acte

rias (

célu

las/m

L)


0 20 40 60 80 100 1200

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

x 108

Tiempo (h)

Concentr

ació

n b

acte

rias (

célu

las/m

L)


Para el caso de las bacterias, las desviaciones entre muestrasdependieron completamente del nivel. En el caso del medioa 25 ppm (figura 5) y a 75 ppm (figura 7), hay mayordesviacion luego de las 40 horas de crecimiento, es decir enla fase estacionaria, en cambio, para una concentracion de 50ppm (figura 6), la mayor desviacion se encuentra en la faseexponencial.

Consorcio

Enseguida se describen los resultados de crecimiento en elconsorcio, analizados de acuerdo al factor microorganismo.

Chlamydomonas reinhardtii

El comportamiento de crecimiento de las microalgas en elconsorcio es similar a su crecimiento individual. Sin embargo,la ultima concentracion reportada es un orden de magnitudmenor al de las algas individuales.

Entre las 3 concentraciones de fenol, en donde se observaun menor crecimiento es en los experimentos de 25 ppm. Noobstante, en general el crecimiento de la microalga al estarcompartiendo medio con las bacterias C7A es menor. Estotiene relacion con la disponibilidad de fuentes de carbono enel medio.

6

0 20 40 60 80 1000

0.5

1

1.5

2

2.5

3x 10

6

Tiempo (h)

Concentr

ació

n a

lgas (

célu

las/m

L)

Figura 8: Curva crecimiento microalgas en consorcio. MedioTAP a 25 ppm de fenol.

De acuerdo a los resultados de la seccion III-B, mientrasesta disponible el fenol, las bacterias en el consorcio loutilizan como sustrato, en el momento en que este esdegradado, la fuente de carbono para las microalgas y paralas bacterias sera el acido acetico del medio TAP. Por ende,entrarıan en un estado de competicion por este sustrato, ycomo muestran los resultados, las bacterias siguen creciendo(figuras 11, 9 y 10) mientras el crecimiento de las microalgasse ve disminuido.

0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11x 10

6

Tiempo (h)

Concentr

ació

n a

lgas (

célu

las/m

L)


0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

4

5

6

7

x 106

Tiempo (h)

Concentr

ació

n a

lgas (

célu

las/m

L)


Finalmente, el crecimiento de las microalgas en consorciono es tan uniforme ya que se presentan desviaciones querondan entre 1,000,000 celulas/mL para las concentraciones de25 ppm y 75 ppm a lo largo de los 5 dıas de experimentacion.

Microbacterium paraoxydans (C7A)

0 20 40 60 80 100 1201

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5x 10

8

Tiempo (h)

Concentr

ació

n b

acte

rias (

célu

las/m

L)

Figura 11: Curva crecimiento bacterias en consorcio. MedioTAP a 25 ppm de fenol.

En contraste con las microalgas, las bacterias sı alcanzaronvalores de densidad mas altos que los valores de un cultivoindividual de bacterias. El valor mas alto reportado fue de0.809 para el experimento de 75 ppm. Los demas valoresestan cercanos a una densidad optica de 0.7, es decir a unaconcentracion de 5.6x108 celulas/mL.

7

Adicionalmente, en estas curvas de crecimiento se alcanza adistinguir el inicio de una segunda fase exponencial, lo que sedenomina crecimiento diauxico [17], que representa cambiosmetabolicos en los que los microorganismos cambian sufuente de carbono cuando hay mas de un sustrato en el mediouna vez se ha agotado la primera fuente. Estos resultados decrecimiento son coherentes con la concentracion de fenol enel medio, pues cercano a la hora 100 de experimentacion,ya no hay presencia de fenol en el consorcio, lo que quieredecir que las bacterias usan otro sustrato para seguir creciendo.

En comparacion con las microalgas, las bacterias C7Atuvieron resultados de crecimiento con 2 ordenes de magnitudde diferencia, pues para las microalgas la concentracioncelular esta alrededor de 1x106 celulas/mL mientras que paralas bacterias entre 1x108 celulas/mL.

0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

4

5

6x 10

8

Tiempo (h)

Concentr

ació

n b

acte

rias (

célu

las/m

L)


0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

4

5

6

7x 10

8

Tiempo (h)

Concentr

ació

n b

acte

rias (

célu

las/m

L)


Con estos resultados se puede afirmar que el crecimientoen consorcio favorece a las bacterias, muy probablementeporque son capaces de utilizar las 2 fuentes de carbonopresentes en el medio.

III-B. Cuantificacion de fenol y caracterizacion cinetica

Dentro del estudio de degradacion de fenol se llevaron acabo experimentos de control para determinar la influenciade la evaporacion de fenol al ambiente en los experimentos.Para ello se utilizo el mismo montaje sin ningun tipo demicroorganismos. Durante la ejecucion del experimento setomaron 10 muestras a lo largo de los 5 dıas, donde laconcentracion 1 corresponde a la concentracion inicial, esdecir al momento en que se agrega el fenol al medio y laconcentracion 10 corresponde a la concentracion final delexperimento. A continuacion se presentan los resultados dedichas evaluaciones a las diferentes 3 concentraciones en lasfiguras 14, 15 y 16.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Muestra

Concentr

ació

n F

enol (p

pm

)

Figura 14: Comportamiento control (medio TAP) a 25 ppm defenol.

Conforme a estos resultados, la variacion de fenol en losblancos no es significativa pues la desviacion estandar en gene-ral es menor a 5 ppm, es decir que dentro de los experimentossi existe algun cambio en la concentracion de este componentees debido a que los microorganismos lo estan degradandoy no porque se este evaporando en el ambiente. Con estotambien se puede afirmar que el montaje experimental fueutil dentro del manejo de los experimentos para disminuir elerror en la medida de la concentracion de fenol. Finalmente,es probable que las variaciones en las concentraciones seotorguen a errores de medicion en el cromatografo lıquidode acuerdo a la curva de calibracion utilizada en el metodo demedicion.

8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

5

10

15

20

25

30

35

40

Muestra

Concentr

ació

n F

enol (p

pm

)


1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

10

20

30

40

50

60

Muestra

Concentr

ació

n F

enol (p

pm

)


A continuacion se presentan los resultados de laconcentracion de fenol en el tiempo para cada uno delos factores a los diferentes niveles.

La figura 17 muestra los resultados para la concentracionde 25 ppm. Se observa que no hay presencia de fenoldespues del quinto dıa para las bacterias, mientras que en elconsorcio desde el cuarto dıa ya no hay fenol. Los reportesde desviaciones para el consorcio se encuentran entre 10 ppmy 15 ppm, lo que indica grandes variaciones en la toma dedatos debido a errores experimentales en la adicion de fenolal medio.

En cuanto a las algas, la concentracion de fenol disminuyealrededor de 15 ppm desde el dıa 7, ademas, desde este dıalas desviaciones de las mediciones aumentan. No obstante, losresultados para las microalgas a concentraciones de 50 ppm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

10

20

30

40

50

60

Muestra

Concentr

ació

n F

enol (p

pm

)

Consorcio

Algas

Bacterias

Figura 17: Degradacion de fenol en bacterias y el consorcioen medio TAP a 25 ppm de fenol.

(figura 18) y 75 ppm (figura 19) permanecen practicamenteconstantes y tienen desviaciones menores a 3 ppm. Esto indicaque a partir del dıa 6 el cultivo para la concentracion de 25ppm se contamino en alguno de los experimentos, por lo tantoarroja resultados como si la microalga estuviera degradandoel fenol, sin embargo, de acuerdo a [18], Chlamydomonasreinhardtii no degradan este compuesto a las condiciones enlas que fue cultivada.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

10

20

30

40

50

60

70

Muestra

Concentr

ació

n F

enol (p

pm

)

Consorcio

Algas

Bacterias


Para los 3 niveles de concentraciones utilizadas el consorciodegrado todo el fenol presente en el medio. Las bacteriasdegradaron todo el fenol en el nivel mas bajo del factor con-centracion, es decir a 25 ppm. En las demas concentracionessi hubo una disminucion importante en su concentracion, perono lograron degradarlo completamente pues su remocion esde aproximadamente 40%.

9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Muestra

Concentr

ació

n F

enol (p

pm

)

Consorcio

Algas

Bacterias


Uno de los comportamientos que se logra apreciar enalgunos experimentos es que se reporta una concentracionmayor en la muestra 2 que en la muestra inicial. Esto seatribuye a un error experimental en el que la toma de lamuestra no se realizo en el momento en que los cristales defenol se encontraban completamente disueltos en el medio.Por esta razon la segunda muestra puede reportar un mayornivel de fenol. Sin embargo, esto no significa que el fenoldeje de ser un sustrato y se vuelva un producto, pues en elmetabolismo de estos microorganismos no se encuentra laproduccion de este compuesto.

Ahora bien, los datos anteriormente presentados fueronutilizados para ser ajustados al modelo de Monod y deesta manera calcular los parametros cineticos cada uno delos factores. No obstante, dentro del modelo de Monodutilizado se plantea como sustrato el fenol, y de acuerdo alos resultados la microalga Chlamydomonas reinhardtii nodegrada este compuesto, por lo tanto se reporta su velocidadde degradacion utilizando como fuente de carbono el acidoacetico conforme a la literatura, esta es 0.14771 (1/h) [19].

El crecimiento de las microalgas fue mayor en el cultivopuro de acuerdo a las concentraciones celulares finales,pues, al estar en el consorcio, las microalgas presentabanun crecimiento con una concentracion aproximada de 6x106

celulas/mL al final de los 5 dıas, comparada con 2x106 en elcultivo individual. Estos resultados indican que su crecimientose veıa desacelerado en presencia de las bacterias, ademas,este se veıa afectado considerablemente cuando el fenol yahabıa sido degradado por las mismas. En estos casos, seconsidera que la disposicion de sustrato del medio, es decirel acido acetico, era mas restringida para las microalgas yaque las bacterias tambien utilizaban de esta fuente de carbonopara poder crecer una vez se acababa el fenol.

En cuanto a la bacteria pura y en consorcio, se calculo latasa de crecimiento de los microorganismos para cada nivelde concentracion, reportados en la tabla 4.

Tabla 4: Tasa de crecimiento µ. Fenol como fuente de carbono

Experimento Microorganismo Concentracion Tasa de crecimiento(ppm) µ (1/hr)

E1 Bacteria 25 0.0044E1 Bacteria 50 0.0074E1 Bacteria 75 0.0085E1 Consorcio 25 0.0054E1 Consorcio 50 0.0099E1 Consorcio 75 0.0188E2 Bacteria 25 0.0037E2 Bacteria 50 0.0052E2 Bacteria 75 0.0067E2 Consorcio 25 0.0059E2 Consorcio 50 0.0113E2 Consorcio 75 0.0135

En general se puede apreciar que el crecimiento de losmicroorganismos aumenta conforme aumenta la concentracionde sustrato. Esto quiere decir que entre mas disponibilidad desustrato tienen los microorganismos, mayor crecimiento se vaa presentar hasta el momento en que se acabe dicha fuentede carbono, o bien, hasta que se presente una inhibicion porsustrato. Sin embargo, estos casos no se presentaron en losexperimentos realizados. Al tener las tasas de crecimiento, seutilizaron estos datos para la caracterizacion cinetica de losmicroorganismos. Para ello se utilizo un solver de mınimoscuadrados con el que se obtuvo los parametros cineticos,presentados en la tabla 5.

Tabla 5: Parametros cineticos crecimiento microorganismos

Experimento Microorganismo KS µmax RE1 Bacteria 35.542 0.0001 0.9679E1 Consorcio 57.433 0.0002 0.9931E2 Bacteria 18.136 0.0001 0.9703E2 Consorcio 49.976 0.0002 0.9825

0 10 20 30 40 50 60 70 800

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

Concentración (ppm)

Tasa d

e c

recim

iento

(1/h

r)

Datos experimentales

Modelo

Figura 20: Representacion datos experimentales de las bacte-rias y el modelo de crecimiento. Experimento 1.

10

Los coeficientes de correlacion (R) obtenidos son un ındicede que los parametros encontrados son una aproximacionde los datos experimentales. De igual manera, las figuras20, 21, 22 y 23 muestran el modelo y el ajuste de losdatos experimentales para cada uno de los 2 experimentosrealizados. De los resultados se observa que los parametrosµmax, es decir la tasa de sustrato utilizado por unidad debiomasa y Ks, que representa el coeficiente de saturacionmedia, son mayores para el consorcio.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

1

2

3

4

5

6

7

8x 10

−3


Tasa d

e c

recim

iento

(1/h

r)


Modelo

Figura 21: Representacion datos experimentales de las bacte-rias y el modelo de crecimiento. Experimento 2.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018


Tasa d

e c

recim

iento

(1/h

r)


Modelo

Figura 22: Representacion datos experimentales del consorcioy el modelo de crecimiento. Experimento 1.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016


Tasa d

e c

recim

iento

(1/h

r)


Modelo

Figura 23: Representacion datos experimentales del consorcioy el modelo de crecimiento. Experimento 2.

En minitab se realizo un analisis del diseno factorial convariable de respuesta como la tasa de crecimiento para lasbacterias y para el consorcio. En primer lugar se verificoque se cumplieran los supuestos estadısticos, es decir lanormalidad, la homocedasticidad y la aletoriedad. Luego serealizo la grafica de efectos principales (figura 24.)

Figura 24: Efectos principales para el diseno de 2 factores con3 niveles.

Con estos resultados se puede afirmar que efectivamentela degradacion es favorecida en el consorcio en comparacioncon las bacterias, ya que el promedio de tasas de crecimientoes mayor de acuerdo al analisis. Ası mismo, se observa unmayor crecimiento en el nivel mas alto de concentracion (75ppm) para ambos microorganismos.

11

De manera analoga a la forma en la que se calculo la tasade crecimiento, se calculo tambien la tasa de degradacionpara los microorganismos como se muestra en las figuras25 y 26. Las velocidades mas altas corresponden a laconcentracion mas baja, es decir 25 ppm. Esto se debe a quelos microorganismos acaban mas rapido con el sustrato si ladisponibilidad de este es reducida. No obstante, este resultadoes conforme a la concentracion de fenol en el medio. Si bienla velocidad de degradacion es mayor en el nivel mas bajo,el desempeno de los microorganismos en realidad es mejoren el nivel mas alto de concentracion dado que se presentaun mayor crecimiento de microorganismos al haber mayordisponibilidad de fuentes de carbono.

20 30 40 50 60 70 80

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018

0.02

0.022

Velo

cid

ad d

egra

dació

n (

1/h

r)


E2 Bacteria

E1 Bacteria

Figura 25: Velocidades degradacion bacterias.

20 30 40 50 60 70 800

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

Velo

cid

ad d

egra

dació

n (

1/h

r)


E2 Consorcio

E1 Consorcio

Figura 26: Velocidades degradacion consorcio

En comparacion con las bacterias, el consorcio reportavelocidades mayores en todos los niveles de concentracion,lo que quiere decir que metabolizan mejor el fenol. La mayorvelocidad de degradacion para las bacterias fue de 0.0208(1/hr) mientras que para el consorcio fue de 0.0265 (1/hr).

Tanto los resultados de crecimiento como los de degradacionindican que las bacterias en el consorcio tuvieron un mejordesempeno. Sin embargo, como el modelo utilizado noevidencia directamente el beneficio de la bacteria alencontrarse junto con la microalga y teniendo en cuenta queuno de los factores que influyen dentro de la biodegradacionde fenol es la disponibilidad y el contenido de oxıgeno [20],se estipula que la degradacion de fenol en el consorcio esmas eficiente, pues, una vez la microalga lleva a cabo elproceso de fotosıntesis, se dispone de mayor cantidad deO2 que la bacteria puede utilizar para degradar el fenol. Deigual manera, se especula una relacion de simbiosis entreestos dos microorganismos como se observa en la figura 27por la acomodacion que tienen las bacterias alrededor delas microalgas, la cual sugiere que se establece una relacionentre los microorganismos por su cercanıa.

Figura 27: Microscopıa consorcio C7A-microalga, muestrastenidas con fuscina (40X).

IV. CONCLUSION

La caracterizacion cinetica a nivel individual y delconsorcio microalga-bacteria arrojo resultados en los quese evidencia que la degradacion de fenol en el consorcioes mas efectiva que solo utilizando la bacteria. En primerainstancia, la degradacion del sustrato en el consorcio sellevaba a cabo durante los primeros 3 dıas, con un porcentajede remocion del 100 %, mientras que en los cultivos de lasbacterias aun habıa presencia de fenol al finalizar los 5 dıasde experimentacion, con un porcentaje de remocion promediodel 40 %.

12

La tasa de crecimiento relacionada a la degradacion defenol para una concentracion de 75 ppm, que fue en la que seevidencio un mayor crecimiento en el consorcio fue de 0.0138(1/hr), en cambio, las bacterias Microbacterium paraoxydansdemostraron una tasa de crecimiento de 0.0085 (1/hr).

Por otro lado, los cultivos de microalgas son resistentes a lapresencia de fenol ya que llevan un crecimiento con constanteaumento de densidad a lo largo del tiempo. Adicionalmente,se encontro que las microalgas Chlamydomonas reinhardtii noutilizan como fuente de carbono el fenol, en otras palabras, nodegradan fenol bajo las condiciones en que fueron cultivadas,por lo tanto no se realizo la caracterizacion cinetica para estemicroorganismo.

Se evidencio un crecimiento conjunto entre losmicroorganismos Chlamydomonas reinhardtii yMicrobacterium paraoxydans con una posible relacionsimbiotica en la que la bacteria C7A logro degradar elfenol de acuerdo a su biodisponibilidad. A pesar de queel crecimiento de la microalga se veıa disminuido por lapresencia de la bacteria, en ningun momento se presento unafase de muerte en la curva de crecimiento.

En cuanto a la caracterizacion cinetica de las bacteriasy el consorcio, los datos experimentales se ajustaron almodelo al tener coeficientes de correlacion superiores a 0.95,lo que le brinda validez a los resultados del estudio. Porconsiguiente, tanto los datos de las tasas de crecimiento comolas velocidades de degradacion encontradas son evidencia deque el consorcio se desempena mejor para degradar fenol abajas concentraciones.

Por ultimo, se concluye que la bacteria C7A y el consorciode microalga-bacteria degradaron fenol a concentraciones de25 ppm, 50 ppm y 75 ppm evidenciado por los cambios deconcentracion de sustrato en el tiempo, las tasas de crecimientoy su relacion directa con la degradacion de fenol conforme ala caracterizacion cinetica realizada.

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caracterizacion cin´ etica de un consorcio´ microalga

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