Biotecnologia no Melhoramento Animal

Dionéia Magda EverlingDoutoranda em Zootecnia Melhoramento Genético

O que é isso???

É qualquer técnica que utilize organismos vivos ou suas partes, para fazer ou modificar produtos, melhorar plantas ou animais ou desenvolver microorganismos para usos específicos.

Amplificação reprodutiva

• Reprodução animal: Limitação na capacidade natural na reprodução

• Capacidade de serviço

• Produção e qualidade de sêmen

• Número de progênie por reprodutoras

Inseminação Artificial• Processo de espermatogênese:

Bovinos 61 dias;

Eqüinos 55 dias;

Ovinos 47 dias e

Suínos 39 dias;

• Fatores que afetam a produção de espermatozóides

Idade

Ambiente

Níveis hormonais

Tamanho do testículo

Etapas da Inseminação Artificial• Seleção de machos

» Informações sobre os animais ( DEP)

• Coleta do sêmen» Vagina artificial» Eletro ejaculação » Métodos manuais

• Avaliação do sêmen» Motilidade» Concentração » Morfologia » volume

• Diluição do sêmen• Utilização do sêmen

» Fresco» Refrigerado» Congelado

Usos da Inseminação Artificial• Melhoramento genético• Diminuir a relação macho/fêmea• Organização de Testes de progênie• Acasalamento em diferentes raças • Absorção de raças que se deseja criar• Conservação de raças em perigo de extinção• Controle de doenças• Eliminação de custos de produção e manutenção de

machos no estabelecimento• Facilidade de coletas de dados sobre paternidade• Disseminação de genes superiores de animais

corretamente avaliados que levam ao aumento de produção

Transferência de embrião (TE)

• Definição: Implantar em fêmeas receptoras embriões produzidos por fêmeas doadoras (0 até 30 Embriões)

• No que consiste a TE???» Estimulação hormonal – superovulação» Inseminação Artificial ou fecundação Natural» Coleta e armazenamento de embriões» Preparação das receptoras e transferência

ETAPAS DA TE

• Seleção de doadoras para TE– Machos e fêmeas com genótipo comprovadamente

superiores– Escolha das características a serem melhoradas– Escolha das receptoras– Aspectos sanitários

• Superovulação– Resposta das doadoras ( 10 -15 % não respondem)– Hormônio mais utilizado FHS

ETAPAS DA TE

• Inseminação Artificial – 7 dias após o inicio da superovulação;– Utiliza-se sêmen congelado.

• Coleta de embriões– 6-7 dias após a IA;– Recuperação de embriões (transcervical)– PBS a 25°C, Ph 7,2– Sonda de coleta, fixada num dos cornos – Taxa embrião x corpo lúteo : 70 %

Etapas da TE

• Isolamento e classificação de embriões– Avaliação morfológica: microscopia óptica– Observa-se

» Tamanho;» Forma ;» Cor ;» Citoplasma;» Membrana pelúcida e vesículas

– 6 categorias ( excelente e não fecundado)

Etapas da TE

• Estocagem de embriões– Objetivo: Manter a viabilidade dos embriões

por varias horas ou dias fora do trato reprodutivo da fêmea

– A fresco: fêmeas aptas a transferência.– Congelado (Crio preservação): glicerol,

etileno-glicol, ISOCRIOGEN.– Técnicas de descongelamento: Banho maria,

re-hidratação

Etapas da TE

• Sincronização do ciclo estral das receptoras– Objetivo: conseguir que as fêmeas estejam

em cio no momento desejado tanto para a IA como TE.

– Melhora as chances de implantação, melhora a taxa de prenhes

– Hormônios utilizados: prostaglandina, progestagenos.

Etapas da TE• A transferência do embrião (inovulação)

– Objetivo: Posicionar o embrião no útero da receptora– Técnica: Não cirúrgica ( inovulação trans-cervical)– Local da introdução do pailletes: corno uterino com

deposição do embrião na junção útero-tubárica.– Resultado: 2 a 3 meses após a TE realiza-se o

diagnostico de gestação nas vacas receptoras, que 9 meses após a TE darão origem a animais geneticamente semelhantes a progênie das vacas doadoras de embriões e aos touros utilizados na IA.

FATORES QUE AFETAM A EFICÁCIA TE:

• Resposta individual de cada vaca a estimulação hormonal

• Nível técnico da equipe que conduz a TE;• Escolha das técnicas da coleta e TE;• Grau de sincronização do cio entre o ciclo estral das

fêmeas doadoras e receptoras;• Fertilidade natural das doadoras;• Qualidade do sêmen utilizado • Qualidade dos embriões• Nutrição e manejo dos animais OBS: Embriões normais, equipe capacitada,animais

saudáveis e em época de ciclo adequados : taxa de eficiência de 50 %.

USOS da TE

• Obtenção de maior número de progênie de fêmeas de alto valor genético;

• Expansão rápida de núcleos de vacas selecionadas;

• Controle na transmissão de doenças;• Comércio de embriões;• Teste de homozigose para genes dominantes.• Conservação de raças em perigo de extinção,

pela crio-preservação

Limitações da TE

• Impacto menor no melhoramento genético do que a IA;

• Tecnologia complexa e mais cara;

• Uso de mão de obra especializada.

SEXAGEM DE SEMÊN• Determinação do sexo do espermatozóide: Y ou X• Vantagens:

• Melhor programação das populações• Maior ganho na produção de carne e leite• Facilidade em direcionar reposição de matrizes• Ganhos genéticos e redução de tempo na seleção de plantéis• Garantia de acurácia acima de 85% na determinação do sexo• Melhor direcionamento nos testes de progênies• Poder de decisão passa para as mãos do pecuarista

• A aplicação comercial de sêmen sexado já existe no Brasil de 2004.• Atualmente a acurácia fica em torno de 90 %.• Devido ao alto custo, em relação ao sêmen não sexado,

recomenda-se utilização de fêmeas com bom histórico reprodutivo, e em condições ideais de mineralização, vermifugação, vacinação e conforto

Fertilização IN VITRO

• Definição : Embriões são produzidos fora do corpo da fêmea

• Etapas:• Coleta de ovócitos na fêmea: Laparosopia• Maturação dos ovócitos in vitro;• Capacitação dos espermatozóides;• Desenvolvimento do embrião até blastocisto.• Implantaçãoes de embriões nas femeas

receptoras.OBS: Eficiência da técnica até 40% (embriões

viáveis / ovócito maduro)

Sexagem de embriões

• É a disponibilidade de embriões cujo o sexo já esteja previamente determinado.

• Técnica: Amplificação enzimática dirigida de DNA ( PCR), com kit comercial.

• Vantagem: Produção de machos ou fêmeas de acordo com os objetivos da produção

• Desvantagens: As técnicas ainda são caras e sujeita a erros

CLONAGEM• Definição: a clonagem é um processo de reprodução

assexuada, onde são obtidos indivíduos geneticamente iguais (microorganismo, vegetal ou animal) a partir de uma célula-mãe

• Ocorre de forma natural ano caso de gêmeos univitelíneos

• É um meio de propagação comum em plantas, bactérias e protozoários

• Ainda não existe comercialmente a venda de embriões clonados

• Uso no melhoramento: Possibilidade da multiplicação de animais geneticamente superiores em larga escala.

• Desvantagem no melhoramento genético: Perda da variabilidade genética, no aspecto de resistência a doenças, fatores climáticos

Animais trangênico

• Definição : Possui em seu genoma um DNA estranho (de outra espécie geralmente), integrado de forma estável, em que se transmite a sua descendência de acordo com as leis de genética Mendeliana.

• Técnica: micro manipulação ou virus: introdução, modificação ou inativação de um gene.

• Aplicação no melhoramento: aumento de produção: carne, lã, resistência a doenças, e modificação de produtos (maciez da carne, nível colesterol da carne, lactose)

• Limitação: técnica ainda em desenvolvimento, aceitação quanto ao consumo dos produtos, pouco connheimento sobre os efeitos na saúde humana.

Estudo com animais trangênicos

• Suínos: bGH ( hormônio de crescimento bovino) – Vantagens: aumento do crescimento; aumento na

conversão alimentar; mudança na composição da carcaça; redução da espessura de gordura subcutânea

– Efeitos adversos: aumento dos níveis circulantes do plasma ( ulceras, artrites problemas cardíacos, dermatites e IR: pouco tempo de vida)

• Bovino: lacto albumina ( proteína humana)– Esse leite transgênico é mais nutritivo para humanos

que o leite natural, e poderia ser introduzido na alimentação de crianças com carência de nutrientes específicos .

Controle na produção de Animais trangênicos

• Comissão do Codex alimentarius (Lei alimentar ou Código alimentar, em latim), estabelecida conjuntamente pela FAO (Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a Alimentação) e pela OMS (Organização Mundial da Saúde), está trabalhando em colaboração com vários países, dentre eles o Brasil, com o objetivo de criar normas de aplicação internacional visando a segurança de alimentos produzidos a partir desses animais.

MARCADORES GENÉTICOS

• Identificar ou etiquetar alguma coisa• 1923: feijão com ausência de cor escura no tegumento x

tamanho do semente : seleção de forma indireta (tegumento claro = marcador

• Qualidade de um bom marcador» Herdável» Fácil observação» Herdabilidade alta» Intimamente relacionado ao aleloque desejamos selecionar

• OBS: Essas qualidades tornam mas eficientes a seleção indireta

• Os marcadores genéticos podem ser morfológiocos e moleculares.

MARCADORES MORFOLOGICOS

• Fenótipo de fácil identificação • Normalmente determinada por único alelo.• Exemplo 1: planta de milho jovem verde clara x

esterilidade masculina ( fenótipo importante na produção de híbrido mas de difícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem alta probabilidade de serem herdados juntos)

• Exemplo 2: cor amarela do milho x teor de vitamina (o mesmo alelo para ambas características: mais fácil selecionara pela cor)

• Limitação dos marcadores morfológicos:• Ocorrência em numero reduzido• Muitas características de interesse econômico não tem marcador

morfológico• Muitos marcadores que apresentam baixa herdabilidade

Marcadores moleculares

• Marcadores de proteínas ( Produtos direto dos alelos);

• Marcadores que utilizam o próprio DNA (são os próprios genes ou seqüências de DNA situadas próxima ao gene de interesse):

» RFLP» PCR» AFLP» Microssatélites

Marcadores de proteínas -bioquímicos

• Mais comuns: isoenzimas ( esterases, fosfatases, peroxidases...)

• Procedimento consiste na extração e identificação da proteína.

• Exemplo: Cevada izoenzima esterase x resistencia um virus ( seleção indireta)

• Vantagem:– menor custo– Codominância: identifica homozigotos e heterozigotos

• Limitações:– Reduzida variabilidade– Marcadores em numero reduzido

Marcadores que utilizam o próprio DNA

• São os próprios genes ou seus vizinhos, isto é seqüências de DNA situadas próxima ao gene que se deseja marcar

• Vantagens;• Grande variabilidade entre indivíduos• Numero de marcadores suficientes para marcar todos os

alelos de todos os genes que se deseja marcar.

• Desvantagens:• Técnicas laboratoriais mais caras, que os bioquimicos e os

morfológicos

RFLP Significa polimorfismo de comprimentos de

fragmentos de restrição (obtidos por corte de fita dupla deDNA).

• Isolamento do DNA dos indivíduos• Enzimas de restrição que geram milhares de fragmentos• Separação por eletroforese ( tamanhos das seqüências)• Observa-se polimorfismo entre indivíduos diferentes• Hibridização com DNA marcado radioativamante

(sonda), P radioativo• Fotografia do fragmento identificado pela sonda• Admitindo-se que o fragmento de DNA identificado pela

sonda esteja intimamante ligado a um alalo de interesse, pode –se selecionar esse alelo por meio desse fragmento. Assim o fragmento RFLP funciona como um marcador ou etiqueta do alelo de interesse.

PCR Polymerase Chain Reaction

• Reação de polimerização em cadeia• É um método utilizado para amplificar, in vitro,

uma seqüência específica de DNA.• Ao contrario do RFLP que marca um segmento

do DNA, ocorre a síntese especifica de certos segmentos de DNA.

• Como ocorre?• Utilização de um pequeno segmento: Primer

(iniciador) de um segmento desejado.• Vários ciclos geram um número de seqüências

idênticas de DNA.

AFLP

• AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) Significa o Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados.

O AFLP combina a especificidade, resolução e poder de amostragem da digestão com enzimas de restrição e a praticidade e velocidade do PCR.

• ETAPAS– Clivagem com 2 enzimas de restrição;– Ligação de adaptadores específicos;– São sintetizados inicializadores complementares aos

adaptadores;– Amplificação seletiva ( reação de PCR)– Eletroforese.

Microssatélites

• Seqüências curtas (300 pb)

• Repetições em tandem (6 a 8 nucleotídeos = mais comuns TG/AC)

• Mais utilizada em mapeamento genético, devido a sua grande

• P= G+A

VP = VG + VA

Uso de marcadores no estudo de caracteres quantitativos

• Caracteres quantitativos– Controlados por vários genes de pequeno efeito– Sofrem maior influencia ambiental– Não se sabe quanto ele contribui para o fenótipo

• QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caractere quantitativo identificado por marcadores moleculares.

• Finalidade: determinar quanto de um caractere quantitativo é explicada por um ou mais marcadores

• Como os caracteres quantitativos são medidos por meio de médias os variâncias, pode-se ter idéia da porcentagem do fenótipo do caractere que é explicado pelo marcador.

QTL• São regiões cromossômicas relacionadas com

variação fenotípicas das características quantitativas

• Limitações:• Dificuldade de avaliação dos caracteres quantitativos aliados

a necessidade de ligação dos marcadores com os QTL• Dificuldade de obtenção dos próprios marcadores • Estudo difícil e trabalhoso

• Obs: Há necessidade de mais pesquisas para tornar mais eficientes o emprego dos marcadores moleculares no estudo das características quantitativas