20 Biotecnologia

Decifrando o genomaN ewton Portilho Carneiro 1

Andréa Almeida Carneiro"Cláudia Teixeira Guimarães?

Edilson Paiva4

Resumo - Os genes, unidades biológicas que determinam as características de umorganismo, estão contidos em moléculas de DNA presentes no núcleo das células.Portanto, o estudo do DNA é de fundamental importância para o entendimentode como as características de um organismo são formadas. Com o grande avançoalcançado pelas técnicas de Biologia molecular nas últimas décadas, hoje, somoscapazes de isolar e seqüenciar moléculas de DNA de maneira rotineira. A partir daotimização das técnicas de seqüenciamento, surgiram programas com o objetivo deseqüenciar genomas inteiros. Atualmente, estão depositados em bancos de dadosmais de 3 milhões de seqüências de DNA e, grande parte delas ainda não tem suafunção conhecida. O processo de caracterização da função gênica envolve um volumemuito maior de pesquisas e conhecimentos do que as etapas de isolamento eseqüenciamento. A função de um gene pode ser desvendada por meio de técnicas degenética direta ou reversa. Descrevem-se algumas das metodologias usadas para acaracterização da função gênica, bem como o potencial dos programas de seqüen-ciamento de genomas.

Palavras-chave: Genoma; Seqüenciamento; cDNA; Microarrays; Transposons; T-DNA.

INTRODUÇÃO

A estrutura tridimensional do DNA,definida por Watson e Crick em 1953, ésimilar para todos os seres vivos. Basica-mente, uma molécula de DNA consiste deduas cadeias de nucleotídeos mantidasjuntas por pontes de hidrogênio. Existemquatro nucleotídeos diferentes, cada umcontendo uma desoxirribose, um grupofosfato, e uma base púrica (adenina e gua-nina) ou pirimídica (timina e citosina). Nacadeia polinucleotídica, a desoxirribose eo fosfato estão sempre unidos por uma li-gação fosfodiester. Portanto, esta parte damolécula é muito regular. Em contraste, aordem e a quantidade das bases púricas e'pirimídicas, que formam uma cadeia deDNA, são altamente irregulares, variandode um organismo para outro. É exatamente

essa variação das bases que constitui oDNA, que produz as diferenças existentesentre os diversos genes.

SEQÜENCIAMENTODE FRAGMENTOS DE DNA

Nos anos 70, foram desenvolvidosprotocolos que permitiram o seqüencia-mento das bases que compõem qualquerfragmento de DNA purificado. No entanto,as técnicas de seqüenciamento têm-se tor-nado cada vez mais avançadas e autorna-tizadas, o que tem viabilizado os progra-mas de cooperação internacional com oobjetivo de seqüenciar os genes expres-sos, Expressed Sequencing Tags (ESTs),ou mesmo genomas inteiros, como sãoos casos do genoma humano, da bactériaShigella e de Arabidopsis. Com isso, a

quantidade de seqüências de DNA, atual-mente disponíveis, é tão grande que sãonecessários bancos de dados e programasde computador específicos para armazenare analisar todas elas. Os projetos de se-qüenciamentos, tanto de genomas comple-tos quanto apenas de ESTs, apresentamvantagens e desvantagens. No caso doseqüenciamento de todo o genoma, sãogeradas informações sobre regiões quecorrespondem a genes e aquelas que, em-bora não sejam transcritas, podem possuirfunções importantes na regulação gênicae manutenção da integridade do genoma.Nesse caso, o projeto envolve muito maistrabalho, uma vez que as regiões não-trans-critas podem atingir 90% do genoma.Assim, mesmo considerando todas as in-formações obtidas com o seqüenciamento

1Biólogo, Ph.D., Pesq. EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: newtonc@enpms.embrapa.br

2Bióloga, Ph.D., Pesq. CNPq/EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: andreactêcnpms.embrapabr

3Enga Agr«, D.Se., Pesq. EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: claudia@enpms.embrapa.br

4Eng"Agr«, Ph.D., Pesq. EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: edilson@enpms.embrapa.br

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de todo o genoma, o projeto tem sido viá-vel apenas para organismos com genomaspequenos. Aqueles organismos cujos ge-nomas são grandes, como é o caso da maio-ria das plantas cultivadas, a melhor opçãoé seqüenciar apenas os ESTs e tentar obtero máximo de informações com relação àssuas funções. Um sumário do número deseqüências de DNA ou ESTs disponíveisem bancos de dados de domínio público émostrado no Quadro 1.

Com o seqüenciamento massivo deDNAs, o isolamento de um gene passoua não ser mais um problema. O grandedesafio agora é saber qual a função dessesgenes seqüenciados. Várias seqüênciasde DNA, inicialmente incorporadas embancos de dados, tiveram suas funçõesdeterminadas a partir de estudos deta-lhados de Biologia molecular. Atualmente,com o grande número de seqüências jádepositado nos bancos de dados, muitasvezes, a função de uma seqüência gênicapode ser deduzida em comparações por ho-mologia com aquelasjáexistentes (Fig. 1).Entretanto, grande parte das seqüênciasde DNA, incorporadas aos bancos de da-dos, não apresenta homologia significativacom as seqüências, cujas funções já sãoconhecidas. Assim, toma-se necessário umgrande investimento em pesquisas paradesvendar a função dos vários genes res-ponsáveis pelas funções vitais de umorganismo.

A função de um gene pode ser estudadaatravés da genética direta ou da genéticareversa. Genética direta é um processo queenvolve inicialmente a análise do fenótipode um organismo e, em seguida, o isola-mento e a identificação do gene respon-sável pela característica estudada. Já agenética reversa, como o próprio nomeindica, é o processo inverso à genéticadireta, inicia-se mutando um gene, intro-duzindo-o no organismo de interesse eestudando o fenótipo resultante (Fig. 2).Os processos de genética direta forammuito usados na década de 80. Com o de-senvolvimento dos projetos de genomas ea disponibilidade de genes com seqüênciascaracterizadas, a genética reversa tomouum grande impulso.

QUADRO 1 - Sumário do número de seqüências de diferentes organismos depositados em ban-cos de dados

Organismo Nome científico ESTsseqüenciados

Homem Homo sapiens 1.631.323

Camundongo Mus musculus + domesticus 786.324

Rato Rattus sp. 128.948

Mosca-das- frutas Drosophila melanogaster 86.121

Nematóide Caenorhabditis elegans 72.567

Arroz Oryza saliva 47.141

Arabidopsis Arabidopsis thaliana 45.752

Milho Zea mays 41.848

Tomate Lycopersicon esculentum 43.436

Soja Glycine max 27.158

Levedura Saeeharomyees eerevisiae 3.041

Pinus Pinus taeda 7.554

Canola Brassiea napus 1.702

Algodão Gossypium hirsutum 8.025

Total(l) 3.203.327

FONTE: List... (1999).

(l) Inclui o resultadodo seqüenciamentode todos os organismos depositados no banco de dados.

Milho ATG GGT AAG GAG AAG TCC CAC ATC AAC ATT GTG GTT ATT GGC

Arroz ATG GGT AAG GAG AAG ACG CAC ATC AAC ATT GTG GTC ATT GGC

Trigo ATG GGT AAA GAG AAG TTT CAC ATC AAC ATT GTG GTC ATT GGC

Rato ATG GGC AAG GAG AAG ACA CAC ATC AAC ATT GTG GTC ATT GGC

Homem ATG GGC AAG GAG AAG ACC CAC ATC AAC ATC GTG GTC ATC GGC

Galinha ATG GGC AAG GAG AAG ATC CAT ATT AAC ATT GTG GTC ATT GGC

Figura 1 - Alinhamento da seqüência do gene fator de elongamento lA de váriosorganismos

Genética direta

Fenótipo --------------------~. Gene

Genética reversa

Gene --------------------1.. Fenótipo

Figura 2 - Genética direta e reversoNOTA: Genética direta é a identificação do gene a partir de um fenótipo. Genéticareverso é a identificação de um fenótipo a partir de um gene.

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TÉCNICASDE GENÉTICA REVERSAUSADAS PARA MANIPULARGENES E PRODUZIRORGANISMOS MUTANTES

As técnicas de recombinação homó-Ioga, anti-senso e co-supressão podem serusadas para alterar um gene conhecido,fazendo com que ele se torne não-funcio-nal. As plantas transgênicas são impor-tantes ferramentas científicas para auxiliarna identificação da função gênica.

Recombinação homóloga

A recombinação homóloga é a alteraçãode uma pequena parte da seqüência de umgene de interesse que, geralmente, é feitacom a incorporação de um gene marcadore a reintrodução desse gene mutado noorganismo de origem. Uma vez dentro doorganismo de interesse, o gene mutado tema capacidade de substituir o gene nativopela recombinação homóloga criando umorganismo mutante. Um gene marcadorpode ser o gene bar de seleção para o her-bicida PPT. As plantas contendo o genemodificado com o marcador são seleciona-das na presença do herbicida e, após ficardemonstrada a incorporação do gene mo-dificado no genoma da planta transfor-mada, e~sa é autofecundada. Por estudosmoleculares é possível identificar a plantaque tenha apenas o alelo modificado emhomozigose (Fig. 3, p.63). A planta horno-zigota para o gene modificado de interessepode ou não demonstrar um fenótipo apa-rente. No entanto, aquelas cujos fenótipossão evidentes podem constituir uma formarápida de correlacionar o fenótipo com ogene modificado. Métodos de disrupçãoda função gênica via recombinação homó-Ioga têm sido descritos para leveduras eratos (Melton, 1994 e Goffeau et aI., 1996),sendo que poucos casos têm sido descri-tos em plantas. Uma aplicação com suces-so da recombinação homóloga em plan-tas foi demonstrada para o gene AGLMADS-box em Arabidopsis (Kempim et aI.,1997).

Anti-sensoA metodologia de anti-senso envolve

a introdução na célula de moléculas deRNA ou de DNA, construídas artificial-mente, que sejam complementares (anti-senso) ao RNA mensageiro (mRNA) dogene de interesse. Uma das explicaçõespara oRNA anti-senso causar mutação noorganismo transformado é o fato de queestas moléculas de RNA ou de DNA artifi-ciais se ligam ao mRNA celular inativan-do-o (Fig. 4, p.63). Usando esta tecnologiao anti-senso do gene da chalcone sintase(chs) , responsável pela pigmentação dasflores, foi introduzido em plantas de petúniae de tabaco, resultando em plantas comalteração na pigmentação das suas flores(fenótipo mutante) (Krol et aI., 1988).Sheehy et aI. (1988) também utilizarama tecnologia do anti-senso para inibir aprodução de enzimas responsáveis pelodesenvolvimento do fruto do tomate, pro-duzindo assim um tomate mutante com oamadurecimento retardado.

Co-supressão

Na técnica de co-supressão, um genede interesse é engenheirado, por meio detécnicas de Biologia molecular, para super-expressar uma proteína de interesse. Umavez que a célula possui uma maquinariaminuciosamente ajustada, qualquer alte-ração nos níveis de expressão de uma pro-teína produz uma grande confusão nosmecanismos de regulação celular. Comoconseqüência, na maioria das vezes, a su-perexpressão de uma proteína na célula fazcom que a produção dessa proteína sejadesligada e, ao contrário do que seria espe-rado, o organismo mutante não produz aproteína de interesse. Embora seja difícilcompreender como a superexpressão deum gene possa ocasionar a diminuição dasíntese de sua proteína, vários experimen-tos têm sido realizados demonstrando aocorrência desse fato. O primeiro resultadode co-supressão foi obtido por meio de umestudo envolvendo a variação da coloraçãodas flores de petúnia pela introdução dogene chs sob o controle do promotor 35S(Napoli et a!., 1990). No entanto, o mecanis-mo que impede a expressão de genes endó-genos por meio da co-supressão ainda nãoé totalmente entendido.

Mutação por inserçãode transposon

Transposons são elementos de DNAque têm a capacidade de sair de uma regiãodo genoma e incorporar em outra. Sendo omovimento dos transposons um processoaleatório, quando estes elementos "pulam"em um genoma podem inserir no meio deum gene tornando-o inativo. Em plantas,uma série de transposons tem sido usadacomo ferramentas, tanto na genética dire-ta quanto na reversa, para isolamento ecaracterização de genes ou fenótipos. Oprincípio da técnica está descrito na Fi-gura 5, p.63. O primeiro gene de plantacIonado por transposons via genética di-reta foi o gene "bronze" de milho que co-difica UDP-glucose: flavonóide3-0-gluco-siltransferase, uma enzima da via metabó-lica das antocianinas (Fedoroff et a!., 1984).

A genética reversa usando mutantespor inserção de transposons foi descritainicialmente em Drosophila melanogaster(BaIlinger & Benzer, 1989 e O'Hare, 1990).Essa metodologia baseia-se em uma reaçãode Polimerase Chain Reaction (PCR), uti-lizando um primer complementar ao finaldos transposons e outro complementar aofinal do gene (Rosenzweig et aI., 1983 eEmmons & Yesner, 1984). Desta forma, osprodutos de PCR só serão obtidos se umtransposon estiver inserido no gene deinteresse. Genes que tiveram sua expressãoalterada pela inserção do transposon serãorecuperados por meio da amplificação doDNA extraído do indivíduo com fenótipomutante, utilizando um par de primerespe-cífico (Zwaal et aI., 1993). Esse processotem sido utilizado na identificação de genesem Caenorhabditis elegans (Rushforthet a!., 1993 e Plasterk, 1993)e milho (Bensenet aI., 1995).

A família dos transposons Mutator(Mu) apresenta alta taxa de mutação e temalto grau de conservação nas extremidadesdas seqüências invertidas (Walbot, 1992).Essas duas características são bastanteinteressantes, pois ajudam a selecionaralei os que contenham os elementos Mu,cuja seqüência é previamente conhecida.Inserções dos elementos Mu podem seridentificadas pela amplificação por PCR.

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o gene mutado pode então ser recupe-rado e propagado em sementes F2. Outrosaspectos importantes desse processo é queo número de transposições e o número decópias do transposon Mu na planta sãofatores essenciais para a análise de ummenor número de plantas. A tecnologia decaracterização de funções gênicas atravésdo Mu foi utilizada pela primeira vez emmilho pela Pioneer Hi-Bred Co., e foi de-nominada Trait Utility System (TUSC)(Fig. 6). Bensen et aI. (1995) utilizaram atécnica do TUSC para caracterizar o mu-tante Anther earl (Anl), cujo produto gê-nico está envolvido na síntese do primeirointermediário tetracíc\ico na via da biossín-tese de giberelina (GA). A mutação Anlresultou em um fenótipo responsivo a GA,caracterizado por uma altura reduzida deplanta, atraso na maturidade e o desenvol-vimento de flores perfeitas em espigas nor-malmente pestiladas.

Um projeto financiado pela NationalScience Foundation (NSF), coordenadopela Dra. Virginia Walbot da Universida-de de Stanford, Estados Unidos, tem porobjetivo demonstrar a funcionalidade degenes de milho, usando dois métodos com-plementares, o seqüenciamento de DNAgenômico flanqueando as inserções dotr~msposon Mu e a identificação e caracte-rização dos indivíduos mutantes contendoesses transposons. Um banco de mutantesestá sendo criado, utilizando-se plantastransformadas com os elementos Mucontendo o plasmídeo Bluescript (Fig. 7).A nova inserção contendo o transposonpoderá ser seletivamente c\onada em E.coli, gerando uma biblioteca de mutaçãoinsercional para análise de DNA. Cadaplanta F2 será autofecundada e as semen-tes serão estocadas no Maize GeneticsCooperative Stock Center, um órgão es-pecialmente criado para armazenar os esto-ques de sementes mutadas. Os usuáriospoderão utilizar a técnica de PCR paraseleção de uma coleção de plasmídeos quefoi inserida em genes de interesse. A esti-mativa é de que 50 mil ESTs, flanqueadospelo transposon Mu, sejam completamenteseqüenciados durante o primeiro ano doprojeto. Sendo que o objetivo final é se-

Multiplicação da planta

AutofecundaçãoColeção de 40.000 mutantes --. para manter

estoques

Agrupamento de folhas dasplantas mutantes

Hibridização e identificação das plantas mutadas

G\*.~••9.~...,W;, '.~••••• fi. ';t' .!...,

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Planta contendoTransposon ativo

VVVVVVVVr(JVVVVr(J(JVVVr(J(JVV\I(J(J Extração de DNA

Primers~__ -I~Transposon

••••••

o Transposon O

PCR

Figura 6 - Trait Utility System in Corn (TUSC)NOTA: Plantas contendo transposons ativos são multiplicadas para a montagem de uma biblioteca

de mutantes. Conhecendo a freqüência com que o transposon se multiplica e insere emregiões codantes, pode-se calcular teoricamente o número necessário de plantas, para terum transposon em cada gene. Cada planta mutante é autofecundada e as sementesestocadas. Uma reaçõo de PCRé feita com DNA extraído de folhas de grupos de plantasdessa biblioteca de mutantes, usando um primer do transposon e um primer do gene (aseqüência de ambos é conhecida). A hibridizoção é feita para auxiliar no escrutínio de umgrande número de plantas. Os grupos de plantas ,cujo sinal foi positivo são subdivididos atéque seja encontrada a planta que contenha o transposon inserido no gene. Para aumentara chance de encontrar a planta mutante, testa-se uma série de primers de um único gene,simultaneamente.

qüenciar cerca de 150 mil segmentos deDNA genômico.

MutaCjão por Inserçõede T-DNA

O T-DNA é um segmento de DNA pre-sente no plasmídeo Ti (DNA não-cromos-sômico) de Agrob,acterium tumefaciens,

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uma bactéria de solo que causa tumores,quando infecta plantas. O tumor é causadopela capacidade da bactéria em transfe-rir seu T-DNA para as células vegetais. OT-DNA contém genes que codificam hor-mônios e aminoácidos necessários para asobrevivência da agrobactéria dentro dasplantas. Cientistas descobriram que podiam

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alterar este fragmento de DNA substituin-do os genes nativos por qualquer gene deinteresse, e que esses novos genes continua-riam sendo transferidos para as plantas pe-lo sistema mediado pela bactéria. A partirdessa descoberta, o T-DNA passou a serusado como uma ferramenta nas genéticasdireta e reversa de maneira semelhante aostransposons. O T-DNA insere-se aleatoria-mente no meio de genes tomando-os não-funcionais e produzindo um organismo mu-tante (Fig. 8). A função do gene Agamousde Arabidopsis foi caracterizada como sen-do um regulador transcricional necessáriopara o desenvolvimento floral, utilizandoessa metodologia (Yanofsky et aI., 1990).

USO DE MICROARRAYSDE DNA PARA ESTUDAR AEXPRESSÃO DE GENESEM TODO O GENOMA DEUM ORGANISMO

O microarray é uma metodologia uti-lizada para comparar a expressão de umgrande número de genes simultaneamente.Este sistema baseia-se na impressão demilhares de clones de cDNAs em placas devidro através de um robô e, subseqüen-temente, de uma hibridização com duassondas marcadas com fluorescências di-ferentes.ern geral uma que emite uma corvermelha e outra verde. As sondas são con-juntos de cDNAs gerados a partir de célu-las ou tecidos em duas situações diferen-tes que se deseja comparar (resistência esuscetibilidade ao alumínio, por exemplo).Os resultados são produzidos sob formade diferentes intensidades de fluorescên-cia que são captadas por microscopia defluorescência a laser, em função dos dife-rentes níveis de expressão de cada gene.A imagem dos pontos fluorescentes é pro-cessada por computadores e programasespecíficos, sendo gerada uma grandequantidade de informação simultaneamen-te (Fig. 9, p.63).

Um robô é capaz de colocar 16 amostrasem 48 placas de vidro, lavar e secar a son-da para o próximo grupo de cDNA em 70segundos. Assim, cerca de 10 mil amostraspodem ser impressas em aproximadamen-te 12horas (Schena et aI., 1995). Vários sis-

Coleção de mutantestransgênioos contendo

transposon Mu

1Bibliotecas genômicas

de colunas e linhas --------1~~ Autofecundação

seqüeo!.meoto jPrimer Primer

êT:-IPBluescriPt]~~ • An!~ses

_ _J ~ mutantes

GeneFigura 7 - Projeto NSF coordenado pela Ora. Virginia Walbot (University of Stanford)NOTA: O transpason contendo uma marca de seleção para resistência à ampicilina em bactéria é

transferido para o milho por transformação. As plantas são multiplicadas e as bibliotecasgenômicas são feitas a partir de colunas e fileiras de plantas que contêm esses transposonsengenheirados inseridos aleatoriamente no genoma. Os plasmídeos originados da bibliotecagenômica contendo esses cassetes são seqüênciados e as plantas contendo os transposonsinseridos nos genes de interesse são identificados.

r>.\ T-DNA)''-.~

•••Transformação da planta

•••Autofecundação

Plantas mutantes

~~Ligação

iI•••

PCR inverso

Biblioteca genômica

~Isolamento de clones

Seqüenciamento ~

Figura 8 - T-ONA na produção de uma biblioteca de mutantesNOTA: Plantas de Arabidopsis são transformadas por agrobactéria contendo o T-DNA.Essas plantas

são autofecundadas e os mutantes analisados. O T·DNAcontendo uma marca de seleção é usa-do para criar bibliotecas genômicas. Os plasmídeos provenientes dessa biblioteca são se-qüenciados ou mesmo usados em reação de PCRcom primers específicos do gene e do T-DNA.

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específicas. As sondas, após se ligarem àproteína ou ao mRNA em estudo, são de-tectadas com o auxílio de técnicas de mi-croscopia. Uma vez conhecida a localizaçãoda molécula dentro de um organismo,podem ser programados experimentos maisrefinados para a definição de sua função.Técnicas de hibridizações in situ têm sidoamplamente utilizadas para localizar genesem cromossomos, tecidos e células dediversos organismos.

temas robotizados mais rápidos e eficientespara a impressão e processamento doscDNAs nas placas de vidro, além de meto-dologias cada vez mais sensíveis e precisaspara a detecção e análise dos resultados,têm sido desenvolvidos e disponibilizadospara os pesquisadores.

A tecnologia de microarrays não for-nece apenas informações sobre a funçãode genes anônimos, o que favorecerá bas-tante os processos de genética reversa, mastambém constitui uma ferramenta indis-pensável para estudos globais de expres-são gênica, com grandes aplicações nosestudos de Biologia molecular e Fisiologiavegetal.

apenas um dos géis ou que tenham a suaquantidade alterada são fortes candidataspara atuarem no controle do processo emestudo. A partir da identificação das pro-teínas de interesse pode-se isolar sua se-qüência gênica e caracterizá-Ia, utilizandoas técnicas de Biologia molecular.

LOCALIZAÇÃO CELULARDE UM rnRNA OU PROTEíNAPARA INFERIR SOBRE SUAFUNÇÃO

INTERAÇÃOPROTEíNA-PROTEíNA

Os genes são transcritos em moléculasmRNA que são traduzi das em proteínas.Essas são transportadas para locais espe-cíficos dentro da célula de um determina-do tecido ou organismo. Enquanto algunsgenes codificam para proteínas que sãoexpressas em todas as células de um in-divíduo durante toda a sua vida (genesconstitutivos), outros codificam para pro-teínas que são expressas apenas em algu-mas células, ou em um determinado períodode desenvolvimento, ou em resposta aalgum estímulo externo (genes tecidos-específicos). A localização de uma proteínaou de seu mRNA nas células ou tecidosonde são produzidos é uma importantefonte de informação que pode auxiliar nadeterminação da função de um gene ouproteína. Um dos princípios dessa meto-dologia é a identificação do mRNA ou daproteína de interesse por meio de sondas

A caracterização da função gênica podeser auxiliada por meio de estudos de inte-ração proteína-proteína in vitro e in vivo.A determinação de que uma proteína, cujafunção desconhecida interage com umaque é conhecida, pode sugerir que as duasproteínas fazem parte do mesmo processoou podem estar localizadas no mesmocompartimento celular. Estes testes podemser usados para verificar a existência deinteração entre duas proteínas conhecidas,identificar tanto as novas proteínas queinteragem com uma proteína em estudoquanto as regiões dentro de uma proteí-na que são importantes no processo dereconhecimento e da interação. Existe umgrande número de alternativas e variaçõespara estudar as interações entre proteínas(Fig, 10). Apesar de bastante informativas,

PROTEOMICS - ESTUDO DOPERFIL PROTÉICO DE UMORGANISMO

Cientistas têm utilizado o termo proteomicspara descrever as análises do perfil protéicode um organismo. O comportamento demuitas proteínas em um proteoma pode sermonitorado por meio de géis de eletroforeseem duas dimensões. Nesse processo, pro-teínas provenientes de células ou tecidosem duas condições fisiológicas diferentes(por exemplo, plantas resistentes e sensí-veis a uma determinada doença ou condi-ç~o de estresse) são extraídas, aplicadasem géis e comparadas qualitativa e quanti-tativamente. As proteínas presentes em

Produção da proteína "Y"~ em E. con (GSTTag)

Mi""," ~

~

Produção da proteína "X"em E. cal; (HisTag)Produção da proteína "X" ~ / Extrato de

em E. cal; (HlsTag) + l proteínas

M~"m ~

8Purificação em coluna Purificação em coluna

Westem 810tPurificação e caracterização das proteínas~ A L- ~B

Figura 10 - Identificação de interação proteína-proteína (in vitralNOTA: A - A proteíno de interesse é donoda em um vetor de expressão em bactéria que permite a sua purificaçãa em uma caluna de afinidade. Um extrata de

proteínas produzido nas células vegetais é também submetido à coluna que já contém fixada a proteína de interesse. A coluna é lavada e as proteínas queinteragirem com a proteína de interesse podem ser seqüenciadas ou usadas para produzir anticorpos que serãa utilizados em uma bibliateca de expressãode cDNA; B - Proteínas "X" e "Y" produzidas em E. col; são misturadas e passadas através de uma coluna de niquel. Se a proteína "Y" interagir com a "X",ambas ficarão retidas na coluna. O processa pade ser visualizada por anticarpas au raios X, casa a proteína "Y" esteja marcada com radioatividade.

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as reações in vitro podem mascarar osresultados reais, devido à impossibilidadede reproduzir in vitro todas as condiçõesexistentes nas células in vivo. Por essemotivo foram desenvolvidos protocolosque estudam a interação entre proteínasin vivo.

Uma maneira efetiva para detecção deinteração in vivo é utilizar o sistema híbridode levedura. Esse processo constitui naconstrução de duas proteínas de fusão porEngenharia genética. Uma delas gera umhíbrido entre seqüências para um domínioque se liga ao DNA do fator de transcriçãoGal4 (aminoácidos 1-147) (Keegan et a!.,1986) e a proteína de interesse. Um se-gundo plasmídeo de expressão contém umaseqüência que ativa o fator de transcriçãoGal4 (aminoácidos 768-881) (Ma & Ptashne,1987), fundida com cDNAs. Estes são pro-venientes de bibliotecas de onde possamexistir genes candidatos. Desta forma, seas duas proteínas expressas na levedurasão capazes de interagir, o complexo resul-tante ativará a transcrição dos promotorescontendo sítios de ligação para o Ga14,gerando uma colônia azul em meio con-tendo um substrato apropriado (X-GAL).O sucesso dessa metodologia foi primeira-mente demonstrado pela interação Ga14-Gal80 (Ma & Ptashne, 1988), sendo maistarde generalizado por Fields & Song(I 989)(Fig. 11).

CONCLUSÃO

Desde a redescoberta das leis de GregorMendel, cientistas começaram a questionara natureza do gene. Que tipo de moléculaseria o gene? Como a informação contidaem uma molécula poderia ser transmitidapara as próximas gerações? Por que e comoapareceriam indivíduos mutantes?

Apenas em meados do século XX, coma descoberta da estrutura do DNA porWatson e Crick, essas e muitas outras ques-tões começaram a ser respondidas. Nasprimeiras três décadas após a compreensãoda estrutura do DNA, o conhecimento arespeito de sua biologia cresceu fantas-ticamente. Dentro desse período ficouentendida a natureza química dos genes,como a informação genética era armazenada,

Domínio de ligação do DNA 0--0 Domínio de ativação do DNA A

Domínio de ligação do DNA o--<> Proteína conhecida B

Domínio de ativação do DNA D--D Proteína desconhecida C

Interação entre as proteínas

I 1

~ comPleXORNApol! C:>I Lac Z D

Figura 11 - Interação proteína-proteína in vivoNOTA: A - O ativador de transcrição GAL4 possui dois domínios: um que se liga aa DNA e outro

que ativa a transcrição; B e C - Os dois domínios foram separados: o primeiro pode serfundido à proteína de interesse (B) e, o segundo, à proteína desconhecida (C); D - Ascolônias de levedura contendo os dois plasmídeos, cujas proteínas interagem serão azuisem meio contendo X·GAL (substrato para a enzima), devido à reconstituição do fator detranscrição GAL4 e à ativação do gene da beta-galactosidase (Iac Z).

de análise gênica, tanto individual quantoem larga escala, fornecerão um acesso ainformações sem precedentes para todasas áreas da Biologia. Dentre elas, a agro-pecuária será amplamente beneficiada, umavez que existe uma grande necessidadede identificar e estudar genes que sãoresponsáveis por conferir resistência adoenças, tolerância a estresses bióticos eabióticos, aumento da qualidade nutricionaldentre outras características de interesseeconômico.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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como as células respondiam a essa infor-mação e como ela era transmitida de umageração para outra.

A partir dos anos 70, cientistas come-çaram a aprender como manipular a molé-cula de DNA utilizando as técnicas deBiologia molecular. Inaugurou-se a era datecnologia do DNA recombinante, tambémdenominada de Engenharia genética. Desdeentão, a Biologia molecular tem experi-mentado grandes avanços tecnológicosque têm culminado em importantes fontesde conhecimento sobre a função, expres-são e regulação de genes em diferentesorganismos. Neste artigo foram mencio-nadas metodologias que têm por objetivoauxiliar a identificação gênica. Dentre elas,os microarrays têm revolucionado a aná-lise funcional de seqüências gênicas, umavez que, diferenças nos níveis de expressãode milhares de genes, podem ser detecta-das simultaneamente. Desta forma, váriosgenes ainda desconhecidos poderão tersuas funções biológicas desvendadasutilizando esse processo. As metodologias

Bioteenologia

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