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B REGULAMENTO (CE) N. o 152/2009 DA COMISSO

de 27 de Janeiro de 2009

que estabelece os mtodos de amostragem e anlise para o controlo oficial dos alimentos para animais

(Texto relevante para efeitos do EEE)

(JO L 54 de 26.2.2009, p. 1)

Alterado por:

Jornal Oficial

n. pgina data

M1 Regulamento (UE) n. o 278/2012 da Comisso de 28 de maro de 2012 L 91 8 29.3.2012 M2 Regulamento (UE) n. o 51/2013 da Comisso de 16 de janeiro de 2013 L 20 33 23.1.2013 M3 Regulamento (UE) n. o 691/2013 da Comisso de 19 de julho de 2013 L 197 1 20.7.2013 M4 Regulamento (UE) n. o 709/2014 da Comisso de 20 de junho de 2014 L 188 1 27.6.2014

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REGULAMENTO (CE) N. o 152/2009 DA COMISSO

de 27 de Janeiro de 2009

que estabelece os mtodos de amostragem e anlise para o controlo oficial dos alimentos para animais

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CE) n. o 882/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 29 de Abril de 2004, relativo aos controlos oficiais realizados para assegurar a verificao do cumprimento da legislao relativa aos alimentos para animais e aos gneros alimentcios e das normas relativas sade e ao bem-estar dos animais ( 1 ), nomeadamente o n. o 4, alneas a), b) e c), do artigo 11. o ,

Considerando o seguinte:

(1) Para efeitos da execuo da Directiva 70/373/CEE, foram adoptados os seguintes diplomas, que permanecem em vigor nos termos do n. o 2 do artigo 61. o do Regulamento (CE) n. o 882/2004:

Primeira Directiva 71/250/CEE da Comisso, de 15 de Junho de 1971, que fixa os mtodos de anlise comunitrios para o controlo oficial dos alimentos para animais ( 2 );

Segunda Directiva 71/393/CEE da Comisso, de 18 de Novembro de 1971, que fixa os mtodos de anlise comunitrios para o controlo oficial dos alimentos para animais ( 3 );

Terceira Directiva 72/199/CEE da Comisso, de 27 de Abril de 1972, que fixa os mtodos de anlise comunitrios para o controlo dos alimentos para animais ( 4 );

Quarta Directiva 73/46/CEE da Comisso, de 5 de Dezembro de 1972, que estabelece mtodos de anlise comunitrios para o controlo oficial dos alimentos para animais ( 5 );

Primeira Directiva 76/371/CEE da Comisso, de 1 de Maro de 1976, que fixa as formas de recolha comunitrias de amostras para o controlo oficial dos alimentos para animais ( 6 );

Stima Directiva 76/372/CEE da Comisso, de 1 de Maro de 1976, que fixa os mtodos de anlise comunitrios para o controlo oficial dos alimentos para animais ( 7 );

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( 1 ) JO L 165 de 30.4.2004, p. 1. Rectificao no JO L 191 de 28.5.2004, p. 1. ( 2 ) JO L 155 de 12.7.1971, p. 13. ( 3 ) JO L 279 de 20.12.1971, p. 7. ( 4 ) JO L 123 de 29.5.1972, p. 6. ( 5 ) JO L 83 de 30.3.1973, p. 21. ( 6 ) JO L 102 de 15.4.1976, p. 1. ( 7 ) JO L 102 de 15.4.1976, p. 8.

Oitava Directiva 78/633/CEE da Comisso, de 15 de Junho de 1978, que fixa os mtodos de anlise comunitrios para o controlo oficial dos alimentos para animais ( 1 );

Nona Directiva 81/715/CEE da Comisso, de 31 de Julho de 1981, que estabelece a fixao de mtodos de anlise comunitrios para controlo oficial dos alimentos dos animais ( 2 );

Dcima Directiva 84/425/CEE da Comisso, de 25 de Julho de 1984, que estabelece a fixao de mtodos de anlise comunitrios para fiscalizao oficial dos alimentos dos animais ( 3 );

Directiva 86/174/CEE da Comisso, de 9 de Abril de 1986, que fixa o mtodo de clculo do valor energtico dos alimentos compostos destinados s aves de capoeira ( 4 );

Dcima primeira Directiva 93/70/CEE da Comisso, de 28 de Julho de 1993, que fixa mtodos de anlise comunitrios para o controlo oficial dos alimentos para animais ( 5 );

Dcima segunda Directiva 93/117/CE da Comisso, de 17 de Dezembro de 1993, que fixa mtodos de anlise comunitrios para o controlo oficial dos alimentos para animais ( 6 );

Directiva 98/64/CE da Comisso, de 3 de Setembro de 1998, que fixa mtodos de anlise comunitrios para a determinao dos aminocidos, das matrias gordas em bruto e do olaquindox nos alimentos para animais e altera a Directiva 71/393/CEE ( 7 );

Directiva 1999/27/CE da Comisso, de 20 de Abril de 1999, que fixa mtodos de anlise comunitrios para a determinao do amprolium, do diclazuril e do carbadox nos alimentos para animais, altera as Directivas 71/250/CEE e 73/46/CEE e revoga a Directiva 74/203/CEE ( 8 );

Directiva 1999/76/CE da Comisso, de 23 de Julho de 1999, que estabelece mtodos de anlise comunitrios para a determinao da lasalocido de sdio em alimentos para animais ( 9 );

Directiva 2000/45/CE da Comisso, de 6 de Julho de 2000, que estabelece mtodos de anlise comunitrios para a determinao da vitamina A, da vitamina E e do triptofano nos alimentos para animais ( 10 );

Directiva 2002/70/CE da Comisso, de 26 de Julho de 2002, que estabelece os requisitos para a determinao dos nveis de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina nos alimentos para animais ( 11 );

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( 1 ) JO L 206 de 29.7.1978, p. 43. ( 2 ) JO L 257 de 10.9.1981, p. 38. ( 3 ) JO L 238 de 6.9.1984, p. 34. ( 4 ) JO L 130 de 16.5.1986, p. 53. ( 5 ) JO L 234 de 17.9.1993, p. 17. ( 6 ) JO L 329 de 30.12.1993, p. 54. ( 7 ) JO L 257 de 19.9.1998, p. 14. ( 8 ) JO L 118 de 6.5.1999, p. 36. ( 9 ) JO L 207 de 6.8.1999, p. 13.

( 10 ) JO L 174 de 13.7.2000, p. 32. ( 11 ) JO L 209 de 6.8.2002, p. 15.

Directiva 2003/126/CE da Comisso, de 23 de Dezembro de 2003, relativa ao mtodo analtico para a determinao de constituintes de origem animal no quadro do controlo oficial dos alimentos para animais ( 1 ).

(2) Uma vez que a Directiva 70/373/CEE foi substituda pelo Regulamento (CE) n. o 882/2004, afigura-se adequado substituir os actos de execuo daquela directiva por um nico regulamento. Em simultneo, os mtodos devem ser adaptados luz da evoluo dos conhecimentos cientficos e tcnicos. Deve ainda suprimir-se os mtodos que deixaram de ser vlidos para a finalidade pretendida. Embora esteja prevista a actualizao, em tempo til, das disposies relativas amostragem a fim de ter em conta os progressos recentes em matria de produo, armazenagem, transporte e comercializao de alimentos para animais, convm manter, por enquanto, as disposies existentes aplicveis amostragem.

(3) As Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE devem, pois, ser revogadas.

(4) As medidas previstas no presente regulamento esto em conformidade com o parecer do Comit Permanente da Cadeia Alimentar e da Sade Animal,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

M3

Artigo 1. o

A amostragem para efeitos de controlo oficial de alimentos para animais, em especial no que se refere determinao de constituintes, incluindo material que contenha ou consista em ou que seja produzido a partir de organismos geneticamente modificados (OGM), de aditivos para a alimentao animal, como definidos pelo Regulamento (CE) n. o 1831/2003 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 2 ), ou de substncias indesejveis, na aceo da Diretiva 2002/32/CE do Parlamento Europeu e do Conselho ( 3 ), efetuada em conformidade com os mtodos indicados no anexo I.

O mtodo de amostragem estabelecido no anexo I aplicvel para o controlo de alimentos para animais no que se refere determinao de resduos de pesticidas, como definidos no Regulamento (CE) n. o 396/2005 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 4 ), e para o controlo da conformidade com o Regulamento (UE) n. o 619/2011.

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Artigo 2. o

A preparao das amostras para anlise e a expresso dos resultados efectuam-se de acordo com os mtodos descritos no anexo II.

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( 1 ) JO L 339 de 24.12.2003, p. 78. ( 2 ) JO L 268 de 18.10.2003, p. 29. ( 3 ) JO L 140 de 30.5.2002, p. 10. ( 4 ) JO L 70 de 16.3.2005, p. 1..

Artigo 3. o

As anlises para efeitos de controlo oficial dos alimentos para animais efectuam-se de acordo com os mtodos descritos no anexo III (Mtodos de anlise para o controlo da composio das matrias-primas para a alimentao animal e dos alimentos compostos para animais), no anexo IV (Mtodos de anlise para o controlo do teor dos aditivos autorizados nos alimentos para animais), no anexo V (Mtodos de anlise para o controlo das substncias indesejveis nos alimentos para animais) e no anexo VI (Mtodos de anlise para a determinao dos constituintes de origem animal para o controlo oficial dos alimentos para animais).

Artigo 4. o

O valor energtico dos alimentos compostos destinados a aves de capoeira calculado em conformidade com o disposto no anexo VII.

Artigo 5. o

Usam-se, para efeitos de confirmao, os mtodos de anlise descritos no anexo VIII para o controlo da presena ilegal de aditivos que j no esto autorizados nos alimentos para animais.

Artigo 6. o

So revogadas as Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE.

As referncias s directivas revogadas devem entender-se como sendo feitas para o presente regulamento e devem ser lidas de acordo com os quadros de correspondncia constantes do anexo IX.

Artigo 7. o

O presente regulamento entra em vigor no vigsimo dia seguinte ao da sua publicao no Jornal Oficial da Unio Europeia.

aplicvel a partir de 26 de Agasto de 2009.

O presente regulamento obrigatrio em todos os seus elementos e directamente aplicvel em todos os Estados-Membros.

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ANEXO I

MTODOS DE AMOSTRAGEM

1. OBJETO E MBITO DE APLICAO

As amostras destinadas ao controlo oficial de alimentos para animais so recolhidas de acordo com os mtodos seguidamente indicados. As amostras assim obtidas sero consideradas representativas das pores amostradas.

O objetivo das amostras representativas obter uma pequena frao de um lote, correspondendo a determinao de quaisquer caractersticas particulares dessa frao ao valor mdio das caractersticas do lote. O lote amostrado colhendo repetidamente amostras elementares em vrias posies nicas do lote. Essas amostras elementares so combinadas misturando-as de forma a obter uma amostra global a partir da qual so preparadas amostras finais representativas por diviso representativa.

Se a inspeo visual revelar uma diferena de qualidade entre as pores amostradas do alimento para animais e o resto do alimento para animais do mesmo lote, essas pores devem ser separadas do resto do alimento para animais e ser tratadas como sublote separado. Se no for possvel dividir o alimento para animais em sublotes separados, o produto em causa amostrado como lote nico. Nesses casos, esse facto ser mencionado no relatrio de amostragem.

Sempre que um alimento para animais amostrado em conformidade com as disposies do presente regulamento no satisfaa os requisitos da UE e faa parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrio, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequncia de uma avaliao rigorosa, no sejam detetados indcios de que o resto do lote no cumpre os requisitos da UE.

2. DEFINIES

Lote: quantidade identificada de alimentos para animais que se presume ter caractersticas uniformes, nomeadamente a origem, a variedade, o tipo de embalagem, o embalador, o expedidor ou a rotulagem; no caso de um processo de produo, uma quantidade do produto fabricada por uma unidade de produo de uma nica unidade fabril que utilize parmetros de produo uniformes ou por vrias dessas unidades, quando produzida em ordem sequencial e armazenada em conjunto.

Poro amostrada: lote ou uma parte identificada do lote ou sublote.

Amostra selada: amostra selada de modo a impedir qualquer acesso amostra sem quebrar ou remover o selo.

Amostra elementar: quantidade colhida num ponto da poro amostrada.

Amostra global: conjunto de amostras elementares colhidas da mesma poro amostrada.

Amostra reduzida: parte da amostra global, obtida a partir desta atravs de um processo de reduo representativa.

Amostra final: parte da amostra reduzida ou da amostra global homogeneizada.

Amostra laboratorial: amostra destinada ao laboratrio (como recebida pelo laboratrio), que pode ser uma amostra final, reduzida ou global.

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3. DISPOSIES GERAIS

Pessoal de amostragem: as amostras so colhidas por pessoas autorizadas para o efeito pela autoridade competente.

A amostra tem de ser selada de modo a impedir qualquer acesso amostra sem quebrar ou remover o selo. A marca do selo tem de ser claramente identificvel e visvel. Em alternativa, a amostra pode ser colocada num recipiente que ter de ser fechado de forma a no permitir a sua abertura sem danificao irreversvel e a impedir a sua reutilizao.

Identificao da amostra: a amostra tem de estar marcada de modo indelvel e identificada de forma a garantir uma relao inequvoca com o relatrio de amostragem.

Tm de ser obtidas, pelo menos, duas amostras finais a partir de cada amostra global: no mnimo, uma amostra para controlo (da aplicao) e uma destinada ao operador da empresa do setor dos alimentos para animais (para efeitos de recurso). Pode, eventualmente, ser obtida uma amostra final para efeitos de arbitragem. Caso a amostra global completa esteja homogeneizada, as amostras finais so obtidas a partir da amostra global homogeneizada, desde que esse procedimento no colida com as regras dos Estados-Membros em matria de direitos do operador.

4. EQUIPAMENTO

4.1. O equipamento destinado colheita de amostras deve ser fabricado com materiais que no contaminem os produtos amostrados. O equipamento destinado a ser utilizado vrias vezes tem ser fcil de limpar para evitar contaminaes cruzadas.

4.2. Equipamento recomendado para a amostragem dos alimentos slidos

4.2.1. Amostragem manual

4.2.1.1. P de fundo plano e bordos verticais

4.2.1.2. Sonda de fenda longa ou compartimentada. As dimenses da sonda tm de ser adequadas s caractersticas da poro amostrada (profundidade do recipiente, dimenses do saco, etc.) e ao tamanho das partculas que compem o alimento.

Se a sonda tiver vrias aberturas, para garantir que a amostra colhida em diferentes stios, as aberturas devem ser separadas por compartimentos ou por aberturas sequenciais.

4.2.2. Amostragem mecnica

Podem ser utilizados aparelhos mecnicos apropriados para a amostragem de alimentos em movimento. Neste contexto, apropriados significa que, pelo menos, toda a seco do caudal amostrada.

A amostragem de alimentos em movimento (em caudais elevados) pode ser efetuada por sistemas automticos de recolha de amostras.

4.2.3. Divisor

Quando possvel e apropriado, devem ser utilizados aparelhos destinados a dividir a amostra em partes aproximadamente iguais, para a preparao de amostras reduzidas de uma forma representativa.

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5. REQUISITOS QUANTITATIVOS QUANTO AO NMERO DE AMOSTRAS ELEMENTARES

Os requisitos quantitativos estabelecidos nos pontos 5.1 e 5.2 no que se refere ao nmero de amostras elementares so aplicveis a pores com uma dimenso mxima de 500 toneladas e que podem ser amostradas de forma representativa. O procedimento de amostragem descrito igualmente vlido para quantidades superiores poro mxima prescrita, desde que o nmero mximo de amostras elementares indicado nos quadros seguintes seja ignorado, passando a ser determinado pela frmula de raiz quadrada apresentada na parte respetiva do procedimento (ver ponto 5.3), e na condio de a dimenso mnima da amostra global ser aumentada proporcionalmente. Tal no impede que um lote grande possa ser dividido em sublotes de menor dimenso e que cada sublote seja amostrado em conformidade com o procedimento descrito nos pontos 5.1 e 5.2.

A dimenso da poro amostrada tem de ser suficiente para permitir a amostragem de todas as partes que a compem.

Para lotes ou sublotes muito grandes (> 500 toneladas) e para lotes cujo transporte ou armazenagem no permita uma amostragem segundo o procedimento estabelecido nos pontos 5.1 e 5.2 do presente captulo, deve aplicar-se o procedimento de amostragem indicado no ponto 5.3.

Se for legalmente exigida ao operador da empresa do setor de alimentos para animais a aplicao do presente regulamento no mbito de um sistema obrigatrio de controlo, o operador pode divergir dos requisitos quantitativos estabelecidos no presente captulo, para ter em conta determinadas caractersticas operacionais, desde que demonstre cabalmente autoridade competente a equivalncia do procedimento de amostragem em termos de representatividade e aps autorizao dessa autoridade.

Em casos excecionais, quando no seja possvel aplicar o mtodo de amostragem previsto no que diz respeito aos requisitos quantitativos, devido a danos comerciais inaceitveis do lote (relacionados com o tipo de embalagem, meios de transporte, armazenagem, etc.), pode ser aplicado um mtodo de amostragem alternativo, desde que seja to representativo quanto possvel e esteja plenamente descrito e documentado.

5.1. Requisitos quantitativos das amostras elementares respeitantes ao controlo de substncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos para animais

5.1.1. Alimentos slidos a granel

Dimenso da poro amostrada Nmero mnimo de amostras elementares

2,5 toneladas 7

> 2,5 toneladas 20 vezes o nmero de toneladas que constituem a poro amostrada (*), at 40 amostras elementares

(*) Sempre que o nmero obtido for fracionrio, deve ser arredondado para o inteiro imediatamente superior.

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5.1.2. Alimentos lquidos a granel


2,5 toneladas ou 2 500 litros 4 (*)

> 2,5 toneladas ou > 2 500 litros 7 (*)

(*) No caso de no ser possvel homogeneizar o lquido, o nmero de amostras elementares tem de ser aumentado.

5.1.3. Alimentos embalados

Os alimentos para animais (slidos e lquidos) podem ser embalados em sacos, latas, barricas, etc., que so referidos no quadro enquanto unidades. As unidades de grande dimenso ( 500 kg ou litros) tm de ser amostradas em conformidade com as disposies estabelecidas para os alimentos a granel (ver pontos 5.1.1 e 5.1.2).

Dimenso da poro amostrada Nmero mnimo de unidades a partir do qual deve ser obtida (pelo menos) uma

amostra elementar (*)

1 a 20 unidades 1 unidade (**)

21 a 150 unidades 3 unidades (**)

151 a 400 unidades 5 unidades (**)

> 400 unidades do nmero de unidades que compem a poro amostrada (***), at 40 unidades

(*) Sempre que a abertura de uma unidade possa afetar a anlise (p. ex., no caso de alimentos hmidos perecveis), a amostra elementar composta pela unidade no aberta.

(**) Para unidades cujo contedo no exceda 1 kg ou 1 litro, a amostra elementar composta pelo contedo de uma unidade de origem.

(***) Sempre que o nmero obtido for fracionrio, deve ser arredondado para o inteiro imediatamente superior.

5.1.4. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber

Ser considerado, no mnimo, um bloco ou pedra para lamber por cada poro amostrada de 25 unidades e, no mximo, quatro destes produtos.

Para blocos ou pedras para lamber cujo peso unitrio no exceda 1 kg, a amostra elementar composta pelo contedo de um bloco ou pedra para lamber.

5.1.5. Forragens e outros alimentos grosseiros

Dimenso da poro amostrada Nmero mnimo de amostras elementares (*)

5 toneladas 5

> 5 toneladas 5 vezes o nmero de toneladas que constituem a poro amostrada (**), at 40 amostras elementares

(*) um facto que, em certas situaes (p. ex. na silagem) no possvel recolher as amostras elementares exigidas, sem causar danos inaceitveis ao lote. Nessas situaes, pode ser aplicado um mtodo alternativo de amostragem, devendo um guia para a amostragem desses lotes ser elaborado antes da entrada em aplicao do presente regulamento.

(**) Sempre que o nmero obtido for fracionrio, deve ser arredondado para o inteiro imediatamente superior.

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5.2. Requisitos quantitativos das amostras elementares respeitantes ao controlo de constituintes ou substncias suscetveis de no estar repartidos uniformemente nos alimentos para animais

Estes requisitos quantitativos das amostras elementares devem ser aplicados nas seguintes situaes:

controlo de aflatoxinas, cravagem do centeio, outras micotoxinas e impurezas botnicas prejudiciais nas matrias-primas para alimentao animal,

controlo da contaminao cruzada por um constituinte, incluindo material GM, ou por uma substncia suscetveis de no estar repartidos de forma uniforme nas matrias-primas para alimentao animal.

Sempre que a autoridade de controlo suspeitar fortemente de que essa distribuio no uniforme tambm se verifica em caso de contaminao cruzada por um constituinte ou substncia em alimentos compostos, podem ser aplicados os requisitos quantitativos previstos no quadro abaixo.


< 80 toneladas Ver requisitos quantitativos no ponto 5.1. O nmero de amostras elementares a colher tem ser multiplicado por 2,5.

80 toneladas 100

5.3. Requisitos quantitativos das amostras elementares no caso de lotes muito grandes

No caso de pores amostradas muito grandes (pores amostradas > 500 toneladas), o nmero de amostras elementares a colher = 40 amostras elementares + toneladas em relao ao controlo das substncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos para animais, ou 100 amostras elementares + toneladas em relao ao controlo de constituintes ou substncias suscetveis de no estar distribudos uniformemente nas matrias-primas para alimentao animal.

6. REQUISITOS QUANTITATIVOS DA AMOSTRA GLOBAL

necessria uma nica amostra global por poro amostrada.

Natureza dos alimentos para animais Dimenso mnima da amostra global (*) (**)

6.1. Alimentos a granel 4 kg

6.2. Alimentos embalados 4 kg (***)

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necessria uma nica amostra global por poro amostrada.

Natureza dos alimentos para animais Dimenso mnima da amostra global (*) (**)

6.3. Alimentos lquidos ou semilquidos

4 litros

6.4. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber:

6.4.1. Peso unitrio superior a 1 kg 4 kg

6.4.2. Peso unitrio no superior a 1 kg

Quatro blocos ou pedras de origem

6.5. Forragem e outros alimentos grosseiros

4 kg (****)

(*) No caso de o alimento para animais amostrado ter elevado valor, pode ser obtida uma quantidade mais pequena de amostra global na condio de este facto estar descrito e documentado no relatrio de amostragem.

(**) Em conformidade com as disposies do Regulamento (UE) n. o 619/2011 da Comisso, de 24 de junho de 2011, que estabelece os mtodos de amostragem e anlise para o controlo oficial dos alimentos para animais no que respeita presena de material geneticamente modificado cujo procedimento de autorizao est pendente ou cuja autorizao expirou (JO L 166 de 25.6.2011, p. 9), a amostra global para controlar a presena de material geneticamente modificado tem de conter, pelo menos, 35 000 sementes/gros. Tal significa que para o milho a dimenso da amostra global deve ser de pelo menos 10,5 kg e para a soja de 7 kg. No caso de outras sementes e gros de cereais como a cevada, o paino, a aveia, o arroz, o centeio, o trigo e a colza, a dimenso da amostra global de 4 kg corresponde a mais de 35 000 sementes.

(***) No caso de alimentos embalados, pode tambm no ser possvel atingir a dimenso de 4 kg para a amostra global devido dimenso das unidades individuais.

(****) No caso de forragem e alimentos grosseiros com baixa densidade relativa (por exemplo, o feno e a palha), a amostra global deve ter uma dimenso mnima de 1 kg.

7. REQUISITOS QUANTITATIVOS DAS AMOSTRAS FINAIS

Amostras finais

exigida a anlise de, pelo menos, uma amostra final. A dimenso da amostra final destinada a anlise no pode ser inferior s quantidades seguintes:

Alimentos slidos 500 g (*) (**) (***)

Alimentos lquidos ou semilquidos 500 ml (*)

(*) Em conformidade com as disposies do Regulamento (UE) n. o 619/2011, a amostra final para o controlo da presena de material geneticamente modificado deve conter, pelo menos, 10 000 sementes/gros. Tal significa que para o milho a dimenso da amostra final deve ser de pelo menos 3 000 g e para a soja de 2 000 g. No caso de outras sementes e gros de cereais como a cevada, o paino, a aveia, o arroz, o centeio, o trigo e a colza, a dimenso da amostra final de 500 g corresponde a mais de 10 000 sementes.

(**) Se a dimenso da amostra global for significativamente inferior a 4 kg ou litros (ver notas de rodap, ponto 6), tambm pode ser colhida uma quantidade menor de amostra final na condio de este facto estar descrito e documentado no relatrio de amostragem.

(***) Em caso de amostragem de leguminosas de gro, cereais em gro e frutos de casca rija para determinao de resduos de pesticidas, a dimenso mnima da amostra final de 1 kg em conformidade com as disposies da Diretiva 2002/63/CE da Comisso (JO L 187 de 16.7.2002, p. 30).

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8. MTODO DE AMOSTRAGEM PARA LOTES MUITO GRANDES OU LOTES ARMAZENADOS OU TRANSPORTADOS DE MODO A NO PERMITIR UMA AMOSTRAGEM DE TODO O LOTE

8.1. Princpios gerais

Sempre que o tipo de transporte ou armazenagem de um lote no permita colher amostras elementares em todo o lote, a amostragem deve ser, de preferncia, efetuada enquanto o lote estiver em movimento.

No caso de grandes armazns destinados a alimentos para animais, os operadores devem ser incentivados a instalar equipamentos nos armazns que permitam uma amostragem (automtica) em todo o lote armazenado.

Em caso de aplicao dos procedimentos de amostragem previstos no presente captulo 8, o operador da empresa do setor de alimentos para animais ou o seu representante so informados acerca desses procedimentos. Se os referidos procedimentos de amostragem forem questionados pelo operador ou pelo seu representante, o operador ou o seu representante deve permitir que a autoridade competente proceda amostragem em todo o lote a suas expensas.

8.2. Lotes grandes transportados por navio

8.2.1. Amostragem dinmica de lotes grandes transportados por navio

A amostragem de lotes grandes nos navios deve ser preferencialmente realizada enquanto o produto est em movimento (amostragem dinmica).

A amostragem feita por poro, podendo os pores estar fisicamente separados. Todavia, os pores so esvaziados parcialmente um aps outro, deixando essa separao fsica inicial de existir aps a transferncia para as instalaes de armazenamento. A amostragem pode, portanto, ser efetuada em funo da separao fsica inicial ou da separao existente aps transferncia para as referidas instalaes.

A descarga de um navio pode durar vrios dias. Normalmente, as amostras tm de ser colhidas a intervalos regulares durante todo o perodo de descarga. Contudo, nem sempre possvel ou apropriado para um inspetor oficial estar presente para amostragem durante toda a operao de descarga. Por conseguinte, permitida a amostragem de uma parte (poro amostrada) da totalidade do lote. O nmero de amostras elementares determinado em funo da dimenso da poro amostrada.

Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrio e seja considerado que essa parte do lote no satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequncia de uma avaliao rigorosa, no sejam detetados indcios de que o resto do lote no cumpre os requisitos da UE.

Mesmo quando a amostragem oficial efetuada de forma automtica, necessria a presena de um inspetor. Contudo, se a amostragem automtica utilizar parmetros preestabelecidos que no possam ser alterados durante a amostragem e se as amostras elementares forem recolhidas num recipiente selado, impedindo qualquer possvel fraude, a presena de um inspetor s exigida no incio da amostragem, de cada vez que tenha de ser mudado o recipiente das amostras, e no final da amostragem.

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8.2.2. Amostragem esttica de lotes transportados por navio

No caso de a amostragem ser realizada de forma esttica, tm de ser aplicados os procedimentos previstos para as instalaes de armazenagem (silos) acessveis pelo topo (ver ponto 8.4.1).

A amostragem tem de ser efetuada atravs da parte acessvel (do topo) do lote/poro. O nmero de amostras elementares determinado em funo da dimenso da poro amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrio e seja considerado que essa parte do lote no satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequncia de uma avaliao rigorosa, no sejam detetados indcios de que o resto do lote no cumpre os requisitos da UE.

8.3. Amostragem de lotes grandes armazenados em armazns

A amostragem tem de ser efetuada atravs da parte acessvel do lote. O nmero de amostras elementares determinado em funo da dimenso da poro amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrio e seja considerado que essa parte do lote no satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequncia de uma avaliao rigorosa, no sejam detetados indcios de que o resto do lote no cumpre os requisitos da UE.

8.4. Amostragem de instalaes de armazenagem (silos)

8.4.1. Amostragem de silos (facilmente) acessveis pelo topo

A amostragem tem de ser efetuada atravs da parte acessvel do lote. O nmero de amostras elementares determinado em funo da dimenso da poro amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrio e seja considerado que essa parte do lote no satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequncia de uma avaliao rigorosa, no sejam detetados indcios de que o resto do lote no cumpre os requisitos da UE.

8.4.2. Amostragem de silos no acessveis pelo topo (silos fechados)

8.4.2.1. S i l o s n o a c e s s v e i s p e l o t o p o ( s i l o s f e c h a d o s ) c o m d i m e n s o > 1 0 0 t o n e l a d a s

Os alimentos para animais armazenados neste tipo de silos no podem ser amostrados de forma esttica. Por conseguinte, sempre que os alimentos para animais no silo tenham de ser amostrados e no exista possibilidade de mov-los, estabelecido um acordo com o operador no sentido de informar o inspetor sobre o momento em que o silo ser descarregado, para que possa ser realizada uma amostragem dinmica dos alimentos.

8.4.2.2. S i l o s n o a c e s s v e i s p e l o t o p o ( s i l o s f e c h a d o s ) c o m d i m e n s o < 1 0 0 t o n e l a d a s

O procedimento de amostragem envolve a introduo num recipiente de uma quantidade de 50 kg a 100 kg e a recolha de uma amostra a partir dessa quantidade. A dimenso da amostra global corresponde a todo o lote e o nmero de amostras elementares determinado em funo da quantidade libertada do silo para o recipiente de amostragem. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrio e seja considerado que essa parte do lote no satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequncia de uma avaliao rigorosa, no sejam detetados indcios de que o resto do lote no cumpre os requisitos da UE.

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8.5. Amostragem de alimentos a granel em contentores grandes fechados

Muitas vezes, estes lotes s podem ser amostrados quando descarregados. Por vezes, no possvel proceder descarga no ponto de importao ou de controlo, devendo a amostragem ter lugar quando os contentores so descarregados.

9. INSTRUES RELATIVAS COLHEITA, PREPARAO E AO ACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRAS

9.1. Disposies gerais

As amostras devem ser colhidas e preparadas to rapidamente quanto possvel, tendo em conta as precaues necessrias para evitar que o produto seja alterado ou contaminado. Os instrumentos assim como as superfcies e os recipientes destinados a receber as amostras tm de estar limpos e secos.

9.2. Amostras elementares

As amostras elementares tm de ser colhidas aleatoriamente em toda a poro de amostragem e apresentar dimenses aproximadamente equivalentes.

As amostras elementares tm uma dimenso mnima de 100 g ou 25 g em caso de alimentos grosseiros ou de forragem com baixa densidade relativa.

Sempre que, em conformidade com as regras dos procedimentos de amostragem estabelecidas no ponto 8, tenham de ser colhidas menos de 40 amostras elementares, a dimenso dessas amostras determinada em funo da dimenso exigida para a amostra global (ver ponto 6).

No caso de amostragem de pequenos lotes de alimentos embalados relativamente aos quais, de acordo com os requisitos quantitativos, tenha de ser colhido um nmero limitado de amostras elementares, cada amostra elementar ser composta pelo contedo de uma unidade de origem cujo contedo no exceda 1 kg ou 1 litro.

Em caso de amostragem de alimentos embalados constitudos por pequenas unidades (p. ex., < 250 g), a dimenso das amostras elementares depende da dimenso de cada unidade.

9.2.1. Alimentos a granel

Sempre que adequado, a amostragem pode ser efetuada aquando da movimentao do lote (carga ou descarga).

9.2.2. Alimentos embalados

Aps seleo do nmero requerido de unidades amostradas, como indicado no captulo 5, procede-se colheita de uma parte do contedo de cada unidade com o auxlio de uma sonda ou p. Sempre que necessrio, as amostras so colhidas depois de se esvaziar separadamente as unidades.

9.2.3. Alimentos lquidos ou semilquidos homogneos ou homogeneizveis

Aps seleo do nmero requerido de unidades amostradas, como indicado no captulo 5, procede-se colheita de uma quantidade em cada unidade aps se ter homogeneizado o contedo, se necessrio.

As amostras elementares podem ser colhidas aquando da descarga do produto.

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9.2.4. Alimentos lquidos ou semilquidos no homogeneizveis

Aps seleo do nmero requerido de unidades amostradas, como indicado no captulo 5, procede-se colheita das amostras a diferentes nveis.

As amostras podem igualmente ser colhidas aquando da descarga do produto, mas rejeitando as primeiras fraes.

Nos dois casos, o volume total colhido no pode ser inferior a 10 litros.

9.2.5. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber

Aps seleo do nmero requerido de blocos ou pedras para lamber amostradas, como indicado no captulo 5, pode ser colhida uma parte de cada bloco ou pedra. Em caso de suspeita de bloco ou pedra no homogneo, todo o bloco ou pedra pode ser colhido como amostra.

Para os blocos ou pedras para lamber cujo peso unitrio no exceda 1 kg, cada amostra elementar composta pelo contedo de um bloco ou pedra.

9.3. Preparao das amostras globais

As amostras elementares devem ser misturadas para formar uma s amostra global.

9.4. Preparao das amostras finais

O material da amostra global deve ser misturado cuidadosamente ( 1 ):

Introduzir cada amostra num recipiente apropriado. Tomar todas as precaues necessrias para evitar qualquer modificao da composio da amostra ou qualquer contaminao ou adulterao que possam ocorrer no decurso do transporte ou armazenagem.

No caso de controlo de constituintes ou substncias repartidos uniformemente nos alimentos para animais, a amostra global pode ser reduzida de forma representativa para, pelo menos, 2,0 kg ou 2,0 litros (amostra reduzida) ( 2 ) de preferncia utilizando um divisor mecnico ou automtico. Para controlar a presena de resduos de pesticidas em leguminosas de gro, cereais em gro e frutos de casca rija, a dimenso mnima da amostra reduzida ser de 3 kg. Se a natureza dos alimentos para animais no permitir a utilizao de um divisor ou no estiver disponvel um divisor, a amostra pode ser reduzida pelo mtodo dos quartos. A partir das amostras reduzidas, podem ser preparadas as amostras finais (para efeitos de controlo, recurso e arbitragem), tendo aproximadamente a mesma quantidade e respeitando os requisitos quantitativos indicados no captulo 7. No caso de controlo de constituintes, incluindo material geneticamente modificado, ou de substncias suscetveis de no estar repartidos uniformemente nas matrias-primas para alimentao animal, a amostra global deve ser:

completamente homogeneizada e depois dividida em amostras finais ou

reduzida para, pelo menos, 2 kg ou 2 litros ( 3 ), utilizando um divisor mecnico ou automtico. Apenas quando a natureza dos alimentos para animais no permita a utilizao de um divisor, pode a amostra, se necessrio, ser reduzida pelo mtodo dos quartos. Para controlar a presena de material geneticamente modificado no mbito do Regulamento (UE) n. o 619/2011, a amostra reduzida deve conter, pelo menos, 35 000 sementes/ /gros para obter amostras finais destinadas ao controlo, recurso e arbitragem contendo, no mnimo, 10 000 sementes de cereais [ver nota de rodap (**) no captulo 6 e nota de rodap (*) no captulo 7].

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( 1 ) Se necessrio, esmagar os aglomerados (separando-os eventualmente da massa e reconstituindo em seguida o todo).

( 2 ) Exceto no caso de alimentos grosseiros ou forragem com baixa densidade relativa. ( 3 ) Exceto no caso de alimentos grosseiros ou forragem com baixa densidade relativa.

9.5. Acondicionamento das amostras

Os recipientes so selados e rotulados de forma a impedir a sua abertura sem danificao do selo. O rtulo deve estar totalmente incorporado no selo.

9.6. Envio das amostras para o laboratrio

As amostras so enviadas sem atrasos desnecessrios para o laboratrio de anlises designado, juntamente com a informao necessria para proceder anlise.

10. REGISTO DA AMOSTRAGEM

Tem de ser efetuado um registo de cada amostra, identificando claramente cada poro amostrada e respetiva dimenso.

O registo deve igualmente mencionar qualquer desvio do procedimento de amostragem previsto no presente regulamento.

Alm de disponibilizado ao laboratrio de controlo oficial, o registo deve ser facultado ao operador da empresa do setor de alimentos para animais e/ou ao laboratrio designado pelo operador.

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ANEXO II

DISPOSIES GERAIS RELATIVAS AOS MTODOS DE ANLISE DOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS

A. PREPARAO DE AMOSTRAS PARA ANLISE

1. Objeto

Os procedimentos descritos infra referem-se preparao para anlise das amostras enviadas aos laboratrios de controlo, aps uma amostragem efetuada segundo o disposto no anexo I.

As amostras laboratoriais tm de ser preparadas de forma que as quantidades colhidas, como previsto nos mtodos de anlise, sejam homogneas e representativas das amostras finais.

2. Precaues a tomar

O procedimento de preparao da amostra adotado depende dos mtodos de anlise a utilizar e dos constituintes ou substncias a controlar. Importa, pois, garantir que o procedimento aplicado se adequa ao mtodo de anlise utilizado e aos constituintes ou substncias a controlar.

Todas as operaes tm de ser efetuadas de forma a evitar tanto quanto possvel a contaminao da amostra ou a alterao da sua composio.

Todas as trituraes, misturas e peneiramentos devem ser efetuados rapidamente, evitando ao mximo expor a amostra ao ar e luz. No se devem usar moinhos ou trituradores suscetveis de aquecer demasiado a amostra.

Recomenda-se a triturao manual para os alimentos particularmente sensveis ao calor. Deve ainda garantir-se que o equipamento no seja uma fonte de contaminao.

Caso a amostra no possa ser preparada sem uma variao significativa do seu teor em humidade, esse teor deve ser determinado antes e depois da preparao pelo mtodo estabelecido na parte A do anexo III.

3. Procedimento

3.1. Procedimento geral

A alquota de teste colhida da amostra final. No se recomenda o uso do mtodo dos quartos, dado que pode dar origem a alquotas de teste com uma elevada margem de erro de diviso.

3.1.1. A l i m e n t o s q u e p o d e m s e r m o d o s t a l c o m o s e e n c o n t r a m

Misturar a amostra final peneirada e recolh-la para um recipiente adequado, limpo, seco e com fecho hermtico. Misturar de novo a fim de garantir uma homogeneizao completa, imediatamente antes de colher a quantidade para anlise (alquota de teste).

3.1.2. A l i m e n t o s q u e p o d e m s e r m o d o s a p s s e c a g e m

Salvo indicao especfica em contrrio nos mtodos de anlise, secar a amostra final de maneira a baixar o seu teor de humidade para 8 % a 12 %, utilizando o processo de secagem indicado no ponto 4.3 do mtodo de determinao do teor de humidade referido na parte A do anexo III. Proceder, em seguida, como indicado no ponto 3.1.1.

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3.1.3. A l i m e n t o s l q u i d o s o u s e m i l q u i d o s

Recolher a amostra final para um recipiente adequado, limpo, seco e com fecho hermtico. Misturar cuidadosamente a fim de garantir uma homogeneizao completa, imediatamente antes de colher a quantidade para anlise (alquota de teste).

3.1.4. O u t r o s a l i m e n t o s

Caso a amostra final no possa ser preparada por qualquer dos processos acima indicados, utilizar outro processo de preparao apropriado que garanta que as quantidades colhidas para anlise (alquota de teste) so homogneas e representativas das amostras finais.

3.2. Procedimento especfico em caso de anlise por inspeo visual ou por microscopia ou quando toda a amostra global esteja homogeneizada

Em caso de exame por inspeo visual (sem utilizar um microscpio), toda a amostra laboratorial utilizada para exame.

Em caso de exame microscpico, o laboratrio pode reduzir a amostra global ou reduzir mais ainda a amostra reduzida. As amostras finais para efeitos de recurso e, eventualmente, de arbitragem, so colhidas segundo um procedimento equivalente ao procedimento adotado para obter a amostra final para efeitos de controlo da aplicao.

Caso toda a amostra global esteja homogeneizada, as amostras finais so colhidas da amostra global homogeneizada.

4. Armazenamento das amostras

Conservar as amostras a uma temperatura que no altere a sua composio. As amostras destinadas a anlise de vitaminas ou substncias particularmente sensveis luz devem ser armazenadas em condies que impeam que a amostra seja adversamente afetada pela luz.

B. DISPOSIES RELATIVAS AOS REAGENTES E EQUIPAMENTOS REQUERIDOS PELOS MTODOS DE ANLISE

1. Salvo indicao especfica em contrrio nos mtodos de anlise, todos os reagentes analticos devem ter grau de pureza para anlise (p.a.). Para a anlise de vestgios, a pureza dos reagentes tem ser controlada mediante um ensaio em branco. Consoante o resultado obtido, poder ou no vir a ser necessria a sua purificao suplementar.

2. Todas as operaes de preparao de solues, diluio e lavagem mencionadas nos mtodos de anlise sem indicaes quanto natureza do solvente ou diluente a utilizar significam que dever ser utilizada gua. Regra geral, a gua deve ser desmineralizada ou destilada. Em certos casos, indicados nos mtodos de anlise, essa gua tem de ser submetida a processos de purificao especficos.

3. Atendendo ao equipamento corrente normalmente presente nos laboratrios de controlo, o mtodo de anlise indica apenas o material especial ou os instrumentos e aparelhos que devam responder a determinadas condies. Esse material tem de estar bem limpo, em especial quando tm de ser determinadas quantidades nfimas de substncias.

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C. APLICAO DOS MTODOS DE ANLISE E EXPRESSO DOS RESULTADOS

1. Procedimento de extrao

Vrios mtodos determinam um procedimento de extrao especfico. Regra geral, podem ser usados procedimentos de extrao diferentes do indicado no mtodo de anlise, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, a mesma eficincia de extrao que o procedimento mencionado no mtodo de anlise.

2. Procedimento de purificao

Vrios mtodos determinam um procedimento de purificao especfico. Regra geral, podem ser usados procedimentos de purificao diferentes do indicado no mtodo de anlise, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, resultados analticos equivalentes aos do procedimento mencionado no mtodo de anlise.

3. Nmero de determinaes

No caso de anlise de substncias indesejveis, se o resultado da primeira determinao for significativamente (> 50 %) inferior especificao a controlar, no so necessrias determinaes adicionais, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, necessrio um ensaio em duplicado (segunda determinao) para se excluir a possibilidade de contaminao cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. Para verificar a conformidade utilizada a mdia das duas determinaes, tendo em conta a incerteza de medio.

Nos casos em que o controlo incide sobre o teor declarado de uma substncia ou ingrediente, se o resultado da primeira determinao confirmar o teor declarado, ou seja, se o resultado analtico se situar dentro da gama de variao aceitvel desse teor, no so necessrias mais determinaes, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, necessrio um ensaio em duplicado (segunda determinao) para se excluir a possibilidade de contaminao cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. Para verificar a conformidade, utilizada a mdia das duas determinaes, tendo em conta a incerteza de medio.

Em certos casos, a gama de variao aceitvel encontra-se estabelecida na legislao, nomeadamente no Regulamento (CE) n. o 767/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 13 de julho de 2009, relativo colocao no mercado e utilizao de alimentos para animais, que altera o Regulamento (CE) n. o 1831/2003 do Conselho e revoga as Diretivas 79/373/CEE do Conselho, 80/511/CEE da Comisso, 82/471/CEE do Conselho, 83/228/CEE do Conselho, 93/74/CEE do Conselho, 93/113/CE do Conselho e 96/25/CE do Conselho e a Deciso 2004/217/CE da Comisso ( 1 ).

4. Notificao do mtodo de anlise utilizado

O relatrio de anlise deve mencionar o mtodo de anlise utilizado.

5. Notificao do resultado analtico

O resultado analtico, que deve ser expresso em conformidade com as indicaes dadas no mtodo de anlise e conter o devido nmero de algarismos significativos, pode, caso necessrio, ser corrigido em funo do teor de humidade apresentado pela amostra final antes da sua preparao para anlise.

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( 1 ) JO L 229 de 1.9.2009, p. 1.

6. Incerteza de medio e taxa de recuperao no caso da anlise de substncias indesejveis

No que diz respeito s substncias indesejveis na aceo da Diretiva 2002/32/CE, um produto destinado alimentao animal considerado no conforme com o limite mximo fixado se se considerar que o resultado analtico, relativo a um alimento com um teor de humidade de 12 %, ultrapassar o limite mximo tendo em conta a incerteza expandida de medio e a correo em funo da recuperao. Para avaliar a conformidade, usa-se a concentrao analisada, corrigida em funo da recuperao, e subtrai-se a incerteza expandida de medio. Este procedimento s aplicvel nos casos em que o mtodo de anlise permita estimar a incerteza da medio e a correo em funo da recuperao (por exemplo, no possvel no caso da anlise microscpica).

O resultado analtico ser apresentado do seguinte modo (na medida em que o mtodo de anlise utilizado permita estimar a incerteza de medio e a taxa de recuperao):

a) Corrigido em funo da recuperao, indicando o nvel de recuperao. Se a taxa de recuperao se situar entre 90 % e 110 % no necessrio efetuar a correo;

b) Como x +/ U, em que x o resultado analtico e U a incerteza expandida de medio, utilizando um fator de expanso de 2, que permite obter um nvel de confiana de cerca de 95 %.

Todavia, se o resultado da anlise for significativamente (> 50 %) inferior especificao a controlar e se a anlise se destinar exclusivamente a verificar a observncia das disposies legislativas, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados, o resultado analtico pode ser notificado sem correo em funo da recuperao e, nestes casos, no necessrio transmitir os valores da taxa de recuperao nem da incerteza de medio.

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ANEXO III

MTODOS DE ANLISE PARA O CONTROLO DA COMPOSIO DAS MATRIAS-PRIMAS PARA A ALIMENTAO ANIMAL E DOS

ALIMENTOS COMPOSTOS PARA ANIMAIS

A. DETERMINAO DA HUMIDADE

1. Objecto e mbito de aplicao

Este mtodo permite determinar o teor de humidade dos alimentos para animais. Se os alimentos contiverem substncias volteis, como por exemplo cidos orgnicos, deve ter-se em conta que, a par do teor de humidade, tambm se mede uma quantidade significativa de substncias volteis.

O mtodo no abrange a anlise dos produtos lcteos enquanto matrias- -primas para a alimentao animal, a anlise das substncias minerais e das misturas essencialmente compostas de substncias minerais, a anlise das gorduras e leos animais e vegetais nem a anlise das sementes e frutos oleaginosos.

2. Princpio

A amostra dessecada em condies definidas que variam em funo da natureza do alimento. A perda de massa determinada por pesagem. necessrio proceder a uma pr-dessecao sempre que se trate de alimentos slidos com um elevado teor de humidade.

3. Equipamento

3.1. Triturador construdo num material que no absorva a humidade, fcil de limpar e que permita uma triturao rpida e uniforme sem provocar aquecimento sensvel, que evite o mais possvel o contacto com o ar exterior, e que satisfaa as exigncias indicadas nos pontos 4.1.1 e 4.1.2 (por exemplo, microtrituradores de martelos ou com arrefecimento por gua, moinhos de cones desmontveis, trituradores de movimento lento ou de discos dentados).

3.2. Balana analtica com uma sensibilidade de 0,1 miligrama.

3.3. Recipientes secos de metal inoxidvel ou de vidro, munidos de uma tampa hermtica; superfcie til que permita obter uma repartio da amostra da ordem dos 0,3 g/cm 2 .

3.4. Estufa isotrmica ( 2 o C) de aquecimento elctrico, com uma regulao rpida da temperatura e convenientemente ventilada ( 1 ).

3.5. Estufa de vcuo, com aquecimento elctrico regulvel, munida de uma bomba de leo e quer de um dispositivo de introduo de ar quente seco, quer de um agente desidratante (por ex., xido de clcio).

3.6. Exsicador com placa de metal ou de porcelana espessa, perfurada, contendo um agente desidratante eficaz.

4. Procedimento

N.B.: As operaes descritas nesta seco devem ser efectuadas imediatamente aps a abertura das embalagens que contm as amostras. As anlises devem ser efectuadas pelo menos em duplicado.

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( 1 ) Para a dessecao dos cereais, assim como das farinhas e smolas grossas e finas, a estufa deve ter uma capacidade trmica tal que, regulada previamente temperatura de 131 o C, possa atingir de novo esta temperatura menos de 45 minutos aps a colocao do nmero mximo de amostras a secar simultaneamente. A estufa dever ainda ter uma ventilao tal que, secando durante 2 horas todas as amostras de trigo mole que pode conter, os resultados apresentem uma diferena inferior a 0,15 % relativamente aos resultados obtidos aps quatro horas de dessecao.

4.1. Preparao

4.1.1. A l i m e n t o s c o m e x c e p o d o s m e n c i o n a d o s n o s p o n t o s 4 . 1 . 2 e 4 . 1 . 3

Tomar pelo menos 50 g da amostra. Se for necessrio, triturar ou dividir de maneira apropriada para evitar qualquer variao do teor de humidade (ver ponto 6).

4.1.2. C e r e a i s e s m o l a s g r o s s a s

Tomar pelo menos 50 g da amostra. Moer em partculas, das quais pelo menos 50 % passem por uma peneira de malhas de 0,5 mm e no deixem mais de 10 % de resduos sobre outro crivo de malhas redondas de 1 mm.

4.1.3. A l i m e n t o s l q u i d o s o u p a s t o s o s , a l i m e n t o s c o n s t i t u d o s e s s e n c i a l m e n t e d e m a t r i a s g o r d a s

Tomar e pesar, com uma aproximao de 10 mg, cerca de 25 g da amostra, adicionar-lhe uma quantidade apropriada de areia anidra, com uma aproximao de 10 mg, misturar at obteno de um produto homogneo.

4.2. Dessecao

4.2.1. A l i m e n t o s c o m e x c e p o d o s m e n c i o n a d o s n o s p o n t o s 4 . 2 . 2 e 4 . 2 . 3

Tarar, com uma aproximao de 1 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximao de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 103 o C. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possvel, para evitar que a temperatura da estufa desa demasiado. Deixar secar durante quatro horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 103 o C. Colocar a tampa no recipiente, retirar este da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximao de 1 mg.

No caso de alimentos constitudos essencialmente de matrias gordas, efectuar uma dessecao suplementar de 30 minutos na estufa a 130 o C. A diferena entre as duas pesagens no deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

4.2.2. C e r e a i s , f a r i n h a s , s m o l a s g r o s s a s e f i n a s

Tarar, com uma aproximao de 0,5 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximao de 1 mg, cerca de 5 g da amostra triturada, repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 130 o C. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possvel, para evitar que a temperatura da estufa desa demasiado. Deixar secar durante duas horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 130 o C. Colocar a tampa no recipiente, retirar este da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximao de 1 mg.

4.2.3. Alimentos compostos contendo mais de 4 % de sacarose ou de lactose: matrias-primas para a alimentao animal tais como alfarroba, produtos cereais hidrolisados, germes de malte, rodelas de beterraba, solveis de peixe e acares; alimentos compostos com mais de 25 % de sais minerais contendo gua de cristalizao

Tarar, com uma aproximao de 0,5 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximao de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa de vcuo (3.5) previamente aquecida a uma temperatura entre 80 e 85 o C. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possvel, para evitar que a temperatura da estufa desa demasiado.

Elevar a presso a 100 Torr e deixar secar a esta presso durante quatro horas, quer sob uma corrente de ar seco e quente, quer por meio de um agente desidratante (cerca de 300 g para 20 amostras). Neste ltimo caso, desligar a bomba de vcuo quando a presso indicada tiver sido atingida. Contar o tempo de secagem a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 80 a 85 o C. Reduzir cuidadosamente a presso no interior da estufa at presso atmosfrica.

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Abrir a estufa, tapar imediatamente o recipiente, retir-lo da estufa, deixar arrefecer durante 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximao de 1 mg. Proceder a uma dessecao complementar de 30 minutos na estufa de vcuo a uma temperatura entre 80 e 85 o C e pesar novamente. A diferena entre as duas pesagens no deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

4.3. Pr-dessecao

4.3.1. A l i m e n t o s , c o m e x c e p o d o s m e n c i o n a d o s n o p o n t o 4 . 3 . 2

Os alimentos slidos cujo teor de humidade elevado e torna a triturao difcil devem ser pr-dessecados como se segue:

Pesar, com uma aproximao de 10 mg, 50 g de amostra no triturada (pode efectuar-se uma diviso grosseira, se necessrio, no caso dos alimentos comprimidos ou aglomerados) num recipiente apropriado (por exemplo, numa placa de alumnio de 20 12 cm com um bordo de 0,5 cm). Deixar secar numa estufa a uma temperatura entre 60 e 70 o C at que o teor de humidade seja reduzido para um valor entre 8 e 12 %. Retirar da estufa, deixar arrefecer a descoberto no laboratrio durante uma hora e pesar com uma aproximao de 10 mg. Triturar imediatamente, como indicado no ponto 4.1.1 e efectuar a dessecao como indicado nos pontos 4.2.1 ou 4.2.3 segundo a natureza do alimento.

4.3.2. C e r e a i s

Os gros com uma taxa de humidade superior a 17 % devem ser pr- -dessecados como se segue:

Pesar, com uma aproximao de 10 mg, 50 g de gros no modos num recipiente apropriado (por exemplo, numa placa de alumnio de 20 12 cm com bordo de 0,5 cm). Deixar secar numa estufa durante 5 a 7 minutos, temperatura de 130 o C. Retirar da estufa, deixar arrefecer a descoberto no laboratrio durante duas horas e pesar, com uma aproximao de 10 mg. Moer imediatamente, como indicado no ponto 4.1.2 e efectuar a dessecao, como indicado no ponto 4.2.2.

5. Clculo dos resultados

O teor de humidade (X), em percentagem da amostra, dado pelas seguintes frmulas:

5.1. Dessecao sem pr-dessecao

X m m 0 m 100

em que:

m = massa inicial da amostra, em gramas, m 0 = massa da amostra seca, em gramas.

5.2. Dessecao com pr-dessecao

X p m 2 m 0 m 1 m 2 m m 1 B 100

m 100

1 m 1 m 0 m m 2

em que:

m = massa inicial da amostra, em gramas, m 1 = massa da amostra, depois da pr-dessecao, em gramas, m 2 = massa da amostra depois da triturao ou moagem, em gramas, m 0 = massa da amostra seca, em gramas.

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5.3. Repetibilidade

A diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve exceder 0,2 % do valor absoluto da humidade.

6. Observaes

Se for necessria uma triturao e dela resultar uma variao do teor de humidade do produto, os resultados da anlise que dizem respeito aos componentes do alimento devem ser corrigidos de acordo com o teor de humidade da amostra inicial.

B. DETERMINAO DA HUMIDADE NAS MATRIAS GORDAS ANIMAIS E VEGETAIS


O mtodo permite determinar o teor em humidade (gua e outras matrias volteis) das gorduras e dos leos animais e vegetais.

2. Princpio

A amostra seca a 103 o C at peso constante (a perda de peso entre duas pesagens sucessivas deve ser inferior a 1 mg). A perda de peso determinada por pesagem.

3. Equipamento

3.1. Cpsula de fundo plano, em material resistente corroso, dimetro: 8 a 9 cm, altura: cerca de 3 cm.

3.2. Termmetro com globo reforado e cmara de dilatao na extremidade superior, graduado de cerca de 80 o C a pelo menos 110 o C, comprimento: cerca de 10 cm.

3.3. Banho de areia ou placa de aquecimento elctrica.

3.4. Exsicador, contendo um agente desidratante eficaz.

3.5. Balana analtica.

4. Procedimento

Pesar, com uma aproximao de 1 mg, cerca de 20 g da amostra homogeneizada na cpsula (3.1) seca e com tara calculada, contendo o termmetro (3.2). Aquecer em banho de areia ou placa de aquecimento (3.3), agitando constantemente com a ajuda do termmetro, de modo a que a temperatura atinja 90 o C em cerca de 7 minutos.

Reduzir a intensidade do aquecimento, atendendo frequncia com que as bolhas sobem do fundo do recipiente. A temperatura no dever ultrapassar 105 o C. Continuar a agitar, raspando o fundo da cpsula at que cesse a formao de bolhas.

A fim de assegurar a eliminao total da humidade, repetir vrias vezes o aquecimento a 103 o C 2 o C, arrefecendo at 93 o C entre aquecimentos sucessivos. Em seguida deixar arrefecer no exsicador (3.4) at que atinja a temperatura ambiente e pesar. Repetir esta operao at que a perda de massa entre duas pesagens sucessivas no exceda 2 mg.

N.B.: Um aumento de massa da amostra aps aquecimento repetido indica uma oxidao da gordura. Neste caso, calcular o resultado a partir da pesagem efectuada imediatamente antes do comeo do aumento de massa.


O teor de humidade (X) em percentagem da amostra dado pela frmula:

X m 1 m 2 100 m

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em que:

m = massa da amostra em ensaio, em gramas, m 1 = massa da cpsula com o respectivo contedo, antes do aqueci

mento, em gramas, m 2 = massa da cpsula com o respectivo contedo, aps aquecimento,

em gramas.

Os resultados inferiores a 0,05 % devem ser registados com a referncia inferior a 0,05 %.

Repetibilidade

A diferena entre os resultados obtidos em duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve exceder 0,05 % em valor absoluto.

C. DETERMINAO DO TEOR DE PROTENA BRUTA


O presente mtodo permite determinar o teor de protena bruta dos alimentos para animais com base no teor de azoto, determinado pelo mtodo de Kjeldahl.

2. Princpio

A amostra mineralizada com cido sulfrico, na presena de um catalisador. A soluo cida alcalinizada por adio de uma soluo de hidrxido de sdio. O amonaco destilado e recolhido numa quantidade determinada de cido sulfrico, cujo excesso titulado com uma soluo-padro de hidrxido de sdio.

Alternativamente, o amonaco libertado destilado numa soluo de cido brico em excesso, seguido de titulao com uma soluo de cido clordrico ou sulfrico.

3. Reagentes

3.1. Sulfato de potssio.

3.2. Catalisador: xido de cobre (II) CuO ou sulfato de cobre (II) penta- -hidratado CuSO 4 5H 2 O.

3.3. Zinco granulado.

3.4. cido sulfrico, 20 = 1,84 g/ml.

3.5. cido sulfrico, soluo volumtrica padro, c(H 2 SO 4 ) = 0,25 mol/l.



3.8. Indicador vermelho de metilo; dissolver 300 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol, = 95-96 % (v/v).

3.9. Soluo de hidrxido de sdio (pode utilizar-se uma soluo de pureza tcnica), = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Hidrxido de sdio, soluo volumtrica padro, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Hidrxido de sdio, soluo volumtrica padro, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Pedra-pomes granulada, lavada em cido clordrico e inflamada.

3.13. Acetanilida (p.f.=114 o C, teor de N = 10,36 %).

3.14. Sacarose (isenta de azoto).

3.15. cido brico (H 3 BO 3 ).

3.16. Soluo de indicador vermelho de metilo: dissolver 100 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol ou metanol.

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3.17. Soluo de verde de bromocresol: dissolver 100 mg de verde de bromocresol em 100 ml de etanol ou metanol.

3.18. Soluo de cido brico (10 g/l a 40 g/l, em funo do equipamento utilizado).

Se se aplicar a deteco colorimtrica do ponto final, deve adicionar-se os indicadores vermelho de metilo e bromocresol s solues de cido brico. Se se preparar um litro de soluo de cido brico, adicionam-se, antes de ajustar o volume, 7 ml de soluo de indicador vermelho de metilo (3.16) e 10 ml de soluo de verde de bromocresol (3.17).

O pH das solues de cido brico preparadas pode diferir em funo da gua usada. Por vezes, necessrio efectuar um ajuste com um pequeno volume de uma soluo alcalina a fim de obter um resultado positivo no ensaio em branco.

Nota: Com a adio de cerca de 3 a 4 ml de NaOH (3.11) a um litro de cido brico 10 g/l consegue-se normalmente um bom ajuste. A soluo deve ser armazenada temperatura ambiente e ao abrigo da luz e de fontes de vapores de amonaco.

3.19. cido clordrico, soluo volumtrica padro, c(HCl) = 0,10 mol/l.

Nota: Podem usar-se outras concentraes das solues volumtricas (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, e 3.19) desde que se efectue a respectiva correco no clculo dos resultados. As concentraes devem sempre ser expressas com quatro casas decimais.

4. Equipamento

Equipamento adequado para efectuar a mineralizao, a destilao e a titulao pelo mtodo de Kjeldahl.

5. Procedimento

5.1. Mineralizao

Pesar, com uma aproximao de 0,001 g, 1 g de amostra e transferi-la para o recipiente do aparelho de mineralizao. Adicionar 15 g de sulfato de potssio (3.1), uma quantidade adequada de catalisador (3.2) [0,3 a 0,4 g de xido de cobre (II) ou 0,9 a 1,2 g de sulfato de cobre (II) penta-hidratado], 25 ml de cido sulfrico (3.4) e, se necessrio, alguns grnulos de pedra-pomes (3.12), misturando.

Comear por aquecer moderadamente a mistura, agitando ocasionalmente se necessrio, at carbonizao completa da massa e o desaparecimento da espuma. Aquecer seguidamente de um modo mais vigoroso at ebulio; o aquecimento adequado quando se observar a condensao do cido nas paredes do recipiente. Evitar o sobreaquecimento lateral e a adeso de partculas orgnicas s paredes.

Quando a soluo ficar lmpida e assumir um tom verde claro, continuar a ebulio durante mais duas horas, arrefecendo de seguida.

5.2. Destilao

Adicionar cuidadosamente uma quantidade de gua adequada para a dissoluo completa dos sulfatos. Deixar arrefecer e adicionar, se necessrio, alguns grnulos de zinco (3.3). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2.1 ou 5.2.2.

5.2.1. D e s t i l a o c o m r e c o l h a e m c i d o s u l f r i c o

Colocar no balo de recolha do dispositivo de destilao 25 ml, rigorosamente medidos, de cido sulfrico (3.5) ou (3.7), em funo do teor presumido de azoto. Adicionar algumas gotas de vermelho de metilo (3.8).

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Adaptar o recipiente de mineralizao ao refrigerante do dispositivo de destilao, imergindo a extremidade do refrigerante no lquido contido no balo de recolha, at uma profundidade mnima de 1 cm (ver a observao 8.3). Juntar cuidadosamente 100 ml de soluo de hidrxido de sdio (3.9) ao recipiente de mineralizao, evitando perdas de amonaco (ver a observao 8.1). Aquecer o recipiente at destilao completa do amonaco.

5.2.2. D e s t i l a o c o m r e c o l h a e m c i d o b r i c o

Sempre que a titulao do teor de amonaco no destilado for realizada manualmente, aplica-se o procedimento mencionado a seguir. Se a unidade de destilao for totalmente automatizada e incluir a titulao do teor de amonaco no destilado, seguir as instrues do fabricante.

Colocar um balo de recolha com 25 a 30 ml da soluo de cido brico (3.18) sob a sada do refrigerante de forma que o tubo de sada se situe sob a superfcie da soluo de cido brico em excesso. Regular a unidade de destilao de forma a adicionar 50 ml da soluo de hidrxido de sdio (3.9). Colocar a unidade de destilao em funcionamento de acordo com as instrues do fabricante e destilar o amonaco libertado com a adio da soluo de hidrxido de sdio. Recolher o destilado na soluo de cido brico. A quantidade de destilado (durao da destilao por arrastamento de vapor) depende da quantidade de azoto na amostra. Seguir as instrues do fabricante.

Nota: Numa unidade de destilao semiautomtica, a adio de hidrxido de sdio em excesso e a destilao por arrastamento de vapor so realizadas automaticamente.

5.3. Titulao

Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.3.1 ou 5.3.2.

5.3.1. c i d o s u l f r i c o

Titular o excesso de cido sulfrico existente no balo de recolha com a soluo de hidrxido de sdio (3.10) ou (3.11), em funo da concentrao de cido sulfrico utilizada, at atingir o ponto final.

5.3.2. c i d o b r i c o

Com o auxlio de uma bureta, titular o contedo do balo de recolha com a soluo volumtrica padro de cido clordrico (3.19) ou com a soluo volumtrica padro de cido sulfrico (3.6) e registar o volume de soluo titulante usada.

Se se aplicar a deteco colorimtrica do ponto final, este atingido assim que a soluo comea a mudar de cor para rosa. A leitura da bureta feita com uma aproximao de 0,05 ml. A visualizao do ponto final pode ser facilitada pelo uso de uma placa de agitao magntica dotada de iluminao ou de um detector fotomtrico.

Esta operao pode ser feita automaticamente se se usar um dispositivo de destilao por arrastamento de vapor com titulao automtica.

Para o funcionamento do destilador ou destilador/titulador, seguir as instrues do fabricante.

Nota: Quando se usa um sistema de titulao automtica, a titulao comea assim que se d incio destilao e usa-se a soluo de cido brico a 1 % (3.18).

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Se se recorrer a uma unidade de destilao totalmente automatizada, a titulao do amonaco tambm se pode fazer com a deteco do ponto final atravs de um sistema potenciomtrico de medio do pH.

Neste caso, usa-se um titulador automtico com um medidor de pH. O medidor de pH deve estar devidamente calibrado no intervalo de pH 4 a 7, segundo procedimentos laboratoriais normais.

O ponto final da titulao atingido a um pH de 4,6, correspondente ao ponto de inflexo da curva de titulao (ponto de maior declive).

5.4. Ensaio em branco

Com vista a confirmar a ausncia de azoto nos reagentes, efectuar um ensaio em branco (mineralizao, destilao e titulao) utilizando 1 g de sacarose (3.14) em vez da amostra.


Os clculos efectuam-se em conformidade com o referido nos pontos 6.1 ou 6.2.

6.1. Clculo para a titulao efectuada segundo o mtodo exposto em 5.3.1

O teor de protena bruta, expresso em percentagem em massa, dado pela frmula seguinte:

V 0 V 1 c 0,014 100 6,25 m

em que:

V 0 = Volume, expresso em ml, de NaOH (3.10 ou 3.11) utilizado no ensaio em branco.

V 1 = Volume, expresso em ml, de NaOH (3.10 ou 3.11) utilizado na titulao da amostra.

c = Concentrao, expressa em mol/l, da soluo de hidrxido de sdio (3.10 ou 3.11).

m = Massa da amostra, expressa em gramas.

6.2. Clculo para a titulao efectuada segundo o mtodo exposto em 5.3.2

6.2.1. T i t u l a o c o m c i d o c l o r d r i c o


V 1 V 0 c 1,4 6,25 m

em que:

m = Massa da amostra, expressa em gramas. c = Concentrao, expressa em mol/l, da soluo volumtrica padro

de cido clordrico (3.19). V 0 = Volume, em ml, de cido clordrico utilizado no ensaio em branco. V 1 = Volume, em ml, de cido clordrico utilizado na titulao da

amostra.

6.2.2. T i t u l a o c o m c i d o s u l f r i c o


V 1 V 0 c 2,8 6,25 m

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em que:

m = Massa da amostra, expressa em gramas. c = Concentrao, expressa em mol/l, da soluo volumtrica padro

de cido sulfrico (3.6). V 0 = Volume, em ml, de cido sulfrico (3.6) utilizado no ensaio em

branco. V 1 = Volume, em ml, de cido sulfrico (3.6) utilizado na titulao da

amostra.

7. Verificao do mtodo

7.1. Repetibilidade

A diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve exceder:

0,2 %, em valor absoluto, para teores de protena bruta inferiores a 20 %,

1,0 % do maior dos valores, para teores de protena bruta compreendidos entre 20 % e 40 %,

0,4 %, em valor absoluto, para teores superiores a 40 %.

7.2. Exactido

Efectuar a anlise (mineralizao, destilao e titulao) de 1,5 a 2,0 g de acetanilida (3.13), na presena de 1 g de sacarose (3.14); 1 g de acetanilida dever consumir 14,80 ml de cido sulfrico (3.5). A taxa de recuperao deve ser de, pelo menos, 99 %.

8. Observaes

8.1. O equipamento utilizado pode ser de tipo manual, semiautomtico ou automtico. Se for necessrio efectuar uma operao de transferncia entre os processos de mineralizao e destilao, no devero observar-se perdas. Se o recipiente do dispositivo de destilao no se encontrar munido de uma ampola de carga, adicionar o hidrxido de sdio imediatamente antes de adaptar o recipiente ao refrigerante, vertendo o lquido cuidadosamente ao longo das paredes.

8.2. Se o resduo da mineralizao solidificar, recomear o processo, utilizando um volume de cido sulfrico (3.4) superior ao especificado.

8.3. No caso de produtos com baixo teor de azoto, o volume de cido sulfrico (3.7) a adicionar ao balo de recolha pode ser reduzido, se necessrio, para 10 ou 15 ml e diludo para 25 ml com gua.

8.4. Em anlises de rotina, pode recorrer-se a mtodos alternativos para a determinao da protena bruta, mas o mtodo Kjeldahl descrito na presente parte C o mtodo de referncia. Deve demonstrar-se, para cada matriz individualmente, a equivalncia dos resultados obtidos com o mtodo alternativo (por exemplo, DUMAS) em comparao com o mtodo de referncia. Dado que os resultados obtidos com mtodos alternativos, mesmo depois de verificada a sua equivalncia, podem apresentar um pequeno desvio em relao aos resultados derivados do mtodo de referncia, necessrio mencionar no relatrio analtico o mtodo de anlise usado na determinao da protena bruta.

D. DETERMINAO DA UREIA


Esta tcnica permite determinar o teor de ureia em alimentos para animais.

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2. Princpio

Suspende-se a amostra em gua juntamente com um agente clarificante e filtra-se. Determina-se o teor de ureia do filtrado, aps a adio de 4- -dimetilaminobenzaldedo (4-DMAB), medindo a densidade ptica a um comprimento de onda de 420 nm.

3. Reagentes

3.1. Soluo de 4-dimetilaminobenzaldedo: dissolver 1,6 g de 4-DMAB em 100 ml de etanol a 96 % e juntar 10 ml de cido clordrico ( 20 : 1,19 g/ml). O tempo de conservao mximo deste reagente de duas semanas.

3.2. Soluo de Carrez I: dissolver em gua 21,9 g de acetato de zinco, Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O, e 3 g de cido actico glacial. Perfazer o volume de 100 ml com gua.

3.3. Soluo de Carrez II: dissolver em gua 10,6 g de ferrocianeto de potssio K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O. Perfazer o volume de 100 ml com gua.

3.4. Carvo activado, no absorvente da ureia (a verificar).

3.5. Soluo de ureia a 0,1 % (m/v).

4. Equipamento

4.1. Misturador (agitador): cerca de 35 a 40 rotaes por minuto.

4.2. Tubos de ensaio: 160 16 mm, com tampa esmerilada.

4.3. Espectrofotmetro.

5. Procedimento

5.1. Anlise da amostra

Pesar, com uma aproximao de 1 mg, 2 g de amostra, introduzi-la com 1 g de carvo activado (3.4) num balo volumtrico de 500 ml. Juntar 400 ml de gua e 5 ml de soluo de Carrez I (3.2), agitar durante cerca de 30 segundos e juntar em seguida 5 ml de soluo de Carrez II (3.3). Misturar durante 30 minutos no misturador. Completar o volume com gua, agitar e filtrar.

Recolher 5 ml de filtrado lmpido e incolor e transferi-los para os tubos de ensaio de tampa esmerilada, juntar 5 ml de soluo de 4-DMAB (3.1) e misturar. Colocar os tubos em banho-maria a 20 o C ( 4 o C). Decorridos 15 minutos, medir a densidade ptica da soluo de amostra, com o espectrofotmetro a 420 nm. Comparar com a soluo de reagentes feita no ensaio em branco.

5.2. Curva de calibrao

Recolher volumes de 1, 2, 4, 5 e 10 ml de soluo de ureia (3.5), introduzi-los em bales volumtricos de 100 ml, completando os volumes com gua. De cada um dos bales, retirar 5 ml de soluo e juntar 5 ml de soluo de 4-DMAB, homogeneizar e medir a densidade ptica, como referido, por comparao com uma soluo de referncia com 5 ml de 4-DMAB e 5 ml de gua, isenta de ureia. Traar a curva de calibrao.


A partir da curva de calibrao, determinar a quantidade de ureia na amostra.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7. Observaes

7.1. Para teores de ureia superiores a 3 %, reduzir a amostra de ensaio para 1 g, ou diluir a soluo inicial, para que o teor de ureia por cada 500 ml no seja superior a 50 mg.

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7.2. Para teores de ureia pouco elevados, aumentar o peso da amostra de ensaio, sem deixar no entanto que a quantidade de amostra para anlise impea o filtrado de ficar lmpido e incolor.

7.3. Se a amostra contiver compostos azotados simples, tais como aminocidos, aconselhvel efectuar a medio da densidade ptica ao comprimento de onda de 435 nm.

E. DETERMINAO DAS BASES AZOTADAS VOLTEIS

I. POR MICRODIFUSO


O mtodo permite determinar o teor de bases azotadas volteis, expressas em amonaco, dos alimentos para animais.

2. Princpio

A amostra extrada com gua, a soluo clarificada e filtrada. As bases azotadas volteis so separadas por microdifuso com uma soluo de carbonato de potssio, recolhidas numa soluo de cido brico e tituladas com cido sulfrico.

3. Reagentes

3.1. cido tricloroactico, soluo a 20 % (m/v).

3.2. Indicador: dissolver 33 mg de verde de bromocresol e 65 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol a 95-96 % (v/v).

3.3. Soluo de cido brico: num balo volumtrico de 1 litro, dissolver 10 g de cido brico em 200 ml de etanol a 95-96 % (v/v) e 700 ml de gua. Juntar 10 ml de indicador (3.2). Misturar e, se necessrio, ajustar a colorao da soluo a vermelho claro, por adio de uma soluo de hidrxido de sdio. 1 ml desta soluo permite fixar, no mximo, 300 g de NH 3 .

3.4. Soluo saturada de carbonato de potssio: dissolver 100 g de carbonato de potssio em 100 ml de gua em ebulio. Deixar arrefecer e filtrar.

3.5. cido sulfrico 0,01 mol/l.

4. Equipamento

4.1. Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotaes por minuto.

4.2. Clulas de Conway (v. esquema) de vidro ou matria plstica.

4.3. Microburetas, com graduao de 1/100 ml.

5. Procedimento

Pesar, com uma aproximao de 1 mg, 10 g de amostra e introduzir num balo volumtrico de 200 ml com 100 ml de gua. Misturar ou agitar durante 30 minutos no misturador basculante. Adicionar 50 ml de soluo de cido tricloroactico (3.1), completar o volume com gua, agitar vigorosamente e filtrar num filtro de pregas.

Introduzir com a pipeta, na parte central da clula de Conway, 1 ml de soluo de cido brico (3.3) e, na parte perifrica, 1 ml do filtrado da amostra. Cobrir parcialmente com a tampa com silicone. Introduzir rapidamente na parte perifrica 1 ml de soluo saturada de carbonato de potssio (3.4) e fechar hermeticamente a tampa. Agitar suavemente a clula dando-lhe um movimento de rotao num plano horizontal, para misturar os dois reagentes. Deixar incubar durante quatro horas, pelo menos, temperatura ambiente, ou, ento, durante uma hora a 40 o C.

Titular as bases volteis na soluo de cido brico por meio de cido sulfrico (3.5), utilizando uma microbureta (4.3).

Efectuar um ensaio em branco aplicando o mesmo mtodo, na ausncia de amostra a analisar.

B

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1 ml de H 2 SO 4 0,01 mol/l corresponde a 0,34 mg de amonaco.


Repetibilidade

A diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve exceder:

10 % em valor relativo, para os teores de amonaco inferiores a 1,0 %,

0,1 % em valor absoluto, para os teores de amonaco iguais ou superiores a 1,0 %.

7. Observaes

Se o teor de amonaco da amostra for superior a 0,6 %, diluir o filtrado inicial.

CONWAY CELL

Scale 1/1

B

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II. POR DESTILAO


Este mtodo permite determinar o teor de bases azotadas volteis, expressas em amonaco, das farinhas de peixe que praticamente no contm ureia. S pode ser utilizado para os teores de amonaco inferiores a 0,25 %.

2. Princpio

A amostra extrada com gua, a soluo clarificada e filtrada. As bases azotadas volteis so separadas, no ponto de ebulio, por adio de xido de magnsio e recolhidas numa quantidade determinada de cido sulfrico cujo excesso titulado por meio de uma soluo de hidrxido de sdio.

3. Reagentes

3.1. cido tricloroactico, soluo a 20 % (m/v).

3.2. xido de magnsio.

3.3. Emulso antiespuma (silicone por ex.).

3.4. cido sulfrico 0,05 mol/l.

3.5. Soluo de hidrxido de sdio 0,1 mol/l.

3.6. Soluo de vermelho de metilo a 0,3 % em etanol a 95-96 % (v/v).

4. Equipamento

4.1. Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotaes por minuto.

4.2. Aparelho de destilao do tipo Kjeldahl.

5. Procedimento

Pesar, com uma aproximao de 1 mg, 10 g da amostra e introduzir num balo volumtrico de 200 ml com 100 ml de gua. Misturar ou agitar durante 30 minutos no misturador basculante. Adicionar 50 ml de soluo de cido tricloroactico (3.1), completar o volume com gua, agitar vigorosamente e filtrar num filtro de pregas.

Recolher uma quantidade do filtrado lmpido que seja adequada em funo da concentrao presumida de bases azotadas volteis (geralmente 100 ml). Diluir para 200 ml e adicionar 2 g de xido de magnsio (3.2) e algumas gotas de emulso antiespuma (3.3). O pH da soluo deve ser alcalino quando verificado com papel tornesol; se no o for, adicionar mais xido de magnsio (3.2). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2 e 5.3 da parte C do presente anexo relativa ao mtodo de determinao do teor de protena bruta.

Efectuar um ensaio em branco aplicando o mesmo mtodo, na ausncia de amostra a analisar.


1 ml de H 2 SO 4 0,05 mol/l corresponde a 1,7 mg de amonaco.


Repetibilidade

A diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve exceder, em valor relativo, 10 % de amonaco.

F. DETERMINAO DOS AMINOCIDOS (COM EXCEPO DO TRIPTOFANO)


O presente mtodo destina-se determinao do teor de aminocidos livres (naturais e de sntese) e aminocidos totais (ligados e livres) em alimentos para animais, utilizando um analisador de aminocidos.

B

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O mtodo aplicvel ao doseamento dos seguintes aminocidos: cistina/ /cistena, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, cido asprtico, cido glutmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina.

O mtodo no permite distinguir as formas D e L, nem os sais de aminocidos. No aplicvel ao doseamento do triptofano nem de derivados hidroxilados de aminocidos.

2. Princpio

2.1. Aminocidos livres

Os aminocidos livres so extrados com cido clordrico diludo. As macromolculas azotadas co-extradas so precipitadas com cido sulfossaliclico e removidas por filtrao. O pH do filtrado ajustado a 2,20. Os aminocidos so separados por cromatografia de troca inica e determinados fotometricamente a 570 nm, aps reaco com ninidrina.

2.2. Aminocidos totais

O procedimento a adoptar depende dos aminocidos a dosear. A cistina/ /cistena e a metionina necessitam de oxidao a cido cisteico e a metionina sulfona, respectivamente, antes da hidrlise. A tirosina determinada nos hidrolisados de amostras no oxidadas. Todos os restantes aminocidos referidos no ponto 1 podem ser determinados a partir de amostras oxidadas ou no oxidadas.

A oxidao realizada a 0 o C, com uma mistura cido perfrmico/fenol. O excesso de reagente de oxidao decomposto com bissulfito de sdio. A amostra, oxidada ou no, hidrolisada com cido clordrico (3.20) durante 23 horas. O pH do hidrolisado ajustado a 2,20. Os aminocidos so separados por cromatografia de troca inica e determinados fotometricamente a 570 nm (440 nm no caso da prolina), aps reaco com ninidrina.

3. Reagentes

Deve utilizar-se gua bidestilada ou de qualidade equivalente (condutividade inferior a 10 S).

3.1. Perxido de hidrognio, 30 % (m/m).

3.2. cido frmico, 98-100 % (m/m).

3.3. Fenol.

3.4. Bissulfito de sdio.

3.5. Hidrxido de sdio.

3.6. cido 5-sulfossaliclico di-hidratado.

3.7. cido clordrico (densidade aproximada 1,18 g/ml).

3.8. Citrato trissdico di-hidratado.

3.9. 2,2'-Tiodietanol (tiodiglicol).

3.10. Cloreto de sdio.

3.11. Ninidrina.

3.12. ter de petrleo, intervalo de ebulio: 40 a 60 o C.

3.13. Norleucina ou outro composto adequado, para ser usado como padro interno.

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3.14. Azoto gasoso (teor de oxignio inferior a 10 ppm).

3.15. 1-Octanol.

3.16. Aminocidos.

3.16.1. Substncias-padro referidas no ponto 1. Os produtos devem ser puros e no conter gua de cristalizao. Secar sob vcuo, com P 2 O 5 ou H 2 SO 4 , durante uma semana, antes de usar.

3.16.2. cido cisteico.

3.16.3. Metionina sulfona.

3.17. Soluo de hidrxido de sdio 7,5 mol/l.

Dissolver 300 g de NaOH (3.5) em gua, e perfazer o volume de 1 litro.

3.18. Soluo de hidrxido de sdio 1 mol/l.

Dissolver 40 g de NaOH (3.5) em gua e perfazer o volume de 1 litro.

3.19. Soluo de cido frmico/fenol.

Misturar 889 g de cido frmico (3.2) com 111 g de gua e adicionar 4,73 g de fenol (3.3).

3.20. Mistura de hidrlise (HCl 6 mol/l contendo 1 g de fenol/l).

Adicionar 1 g de fenol (3.3) a 492 ml de HCl (3.7) e perfazer com gua o volume de 1 litro.

3.21. Mistura de extraco (HCl 0,1 mol/l contendo 2 % de tiodiglicol). Diluir 8,2 ml de HCl (3.7) em cerca de 900 ml de gua, adicionar 20 ml de tiodiglicol (3.9) e perfazer com gua o volume de 1 litro (no misturar directamente os reagentes 3.7 e 3.9).

3.22. cido 5-sulfossaliclico, 6 % (m/v).

Dissolver 60 g de cido 5-sulfossaliclico (3.6) em gua, e perfazer o volume de 1 litro.

3.23. Mistura oxidante (cido perfrmico/fenol).

Misturar, num pequeno matraz, 0,5 ml de perxido de hidrognio (3.1) com 4,5 ml de soluo de cido frmico/fenol (3.19). Tapar e manter a 20-30 o C durante uma hora, de modo a obter cido perfrmico. Arrefecer num banho de gelo (15 minutos) e adicionar amostra.

Cuidado: evitar o contacto com a pele e utilizar vesturio de proteco.

3.24. Tampo citrato (0,2 mol Na + /l; pH = 2,20).

Dissolver 19,61 g de citrato de sdio (3.8), 5 ml de tiodiglicol (3.9), 1 g de fenol (3.3) e 16,50 ml de HCl (3.7) em cerca de 800 ml de gua. Ajustar o pH a 2,20. Perfazer o vol

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