UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS

AVALIACcedilAtildeO DOS EFEITOS DE UM EXTRATO BRUTO DE

CIANOBACTEacuteRIAS CONTENDO MICROCISTINAS SOBRE O

DESEMPENHO REPRODUTIVO E A EMBRIOFETOTOXICIDADE DE

RATOS

Aluno Cristhiano Sibaldo de Almeida

Natal2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS

AVALIACcedilAtildeO DOS EFEITOS DE UM EXTRATO BRUTO DE

CIANOBACTEacuteRIAS CONTENDO MICROCISTINAS SOBRE O

DESEMPENHO REPRODUTIVO E A EMBRIOFETOTOXICIDADE DE

RATOS

Defesa apresentada ao Programa de

Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias

Farmacecircuticas do Centro de Ciecircncias

da Sauacutede da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte como requisito

para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre

em Ciecircncias Farmacecircuticas

Aluno Cristhiano Sibaldo de Almeida

Orientadora Profa Dra Paula da Silva Kujbida

Co-Orientadora Profa Dra Aline Schwarz

Natal2013

AGRADECIMENTOS

A DEUS por saber que sempre esteve estaacute e estaraacute ao meu lado me amando

protegendo amparando cuidando mesmo sabendo que sou imperfeito e pecador

Aos meus pais Gilson Candido e Rosilene Sibaldo pelo incondicional amor e por

saber que posso contar sempre que preciso

A minha irmatilde Thays Sibaldo sempre do meu lado em todos os momentos e

situaccedilotildees da vida

Aos meus sobrinhos Gabrielly Joatildeo e Thaiacutela ensinado a cada dia que a vida eacute

simples e bela dependendo do ponto de vista que vocecirc a vecirc

A Laiacutes Sibaldo e Pedro Natan pelos momentos de descontraccedilatildeo importantes para equilibrar os momentos de stress vividos durante todo o mestrado e pela calorosa recepccedilatildeo nesta cidade

Aos meus tios Joseacute Sibaldo e Rosa Maria Sibaldo pelo apoio paciecircncia e por conceder que durante todo o mestrado pudesse estaacute junto agrave eles no seio da sua famiacutelia proporcionando um verdadeiro lar

A todos meus familiares especialmente a Beth e Cristina pelas palavras de conforto em momentos difiacuteceis durante a caminhada

As minhas avoacutes Zeacutelia e Aurea pelas oraccedilotildees diaacuterias oferecidas a mim

A minha orientadora Professora Drordf Paula da Silva Kujbida por seu apoio amizade compreensatildeo companheirismo dedicaccedilatildeo competecircncia e por toda atenccedilatildeo e sugestotildees fundamentais para a conclusatildeo deste trabalho

Aos professores Aline Schwarz Dulce Lima Ivoneide Costa Claacuteudia Nunes Ernani Pinto que destinaram parte de seu precioso tempo para participarem desta pesquisa

Aos meus amigos que de uma forma ou de outra contribuiacuteram com sua amizade e com sugestotildees efetivas para a realizaccedilatildeo deste trabalho gostaria de expressar minha profunda gratidatildeo

Ao Programa de Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte ndash UFRN pelo apoio agrave minha participaccedilatildeo no

mestrado

A CAPES pela bolsa concedida durante o tempo de curso

SUMAacuteRIO

LISTA DE TABELAS vii

LISTA DE FIGURAS ix

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS xi

RESUMOxiii

ABSTRACT xiv

1 INTRODUCcedilAtildeO 15

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEORICA 16

21CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS 16

211 Microcistinas 22

2111 Absorccedilatildeo 24

2112 Mecanismo toacutexico das microcistinas 25

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS 26

221 Produccedilatildeo de gametas 27

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos 27

212 Produccedilatildeo de gametas masculinos 28

222 O ciclo estral 31

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO 32

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE 36

3 OBJETIVOS 39

31 OBJETIVO GERAL 39

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 39

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 40

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS 40

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas 40

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria 41

42 ANIMAIS 41

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE 42

431 Acasalamento 42

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs 44

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras 44

434 Coleta de sangue 45

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47

4371 Estudo visceral 47

4372 Estudo esqueleacutetico 47

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49

442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49

443 Acasalamento 49

444 Eutanaacutesia dos machos 50

445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos

machos tratados 50

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50

451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53

47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54

5 RESULTADOS 55

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75

6 DISCUSSAtildeO 77

7 CONCLUSAtildeO 84

REFEREcircNCIAS 85

ANEXO I101

ANEXO II103

vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

18

TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano

20

TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

21

TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

56

TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

57

TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

59

TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

60

TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

61

TABELA 9

Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

62

TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

63

TABELA 11

Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

65

viii

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

65

TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

66

TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

67

TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias

71

TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

71

TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

72

TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

73

TABELA 19

Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

75

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS

AVALIACcedilAtildeO DOS EFEITOS DE UM EXTRATO BRUTO DE

CIANOBACTEacuteRIAS CONTENDO MICROCISTINAS SOBRE O

DESEMPENHO REPRODUTIVO E A EMBRIOFETOTOXICIDADE DE

RATOS

Defesa apresentada ao Programa de

Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias

Farmacecircuticas do Centro de Ciecircncias

da Sauacutede da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte como requisito

para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre

em Ciecircncias Farmacecircuticas

Aluno Cristhiano Sibaldo de Almeida

Orientadora Profa Dra Paula da Silva Kujbida

Co-Orientadora Profa Dra Aline Schwarz

Natal2013

AGRADECIMENTOS

A DEUS por saber que sempre esteve estaacute e estaraacute ao meu lado me amando

protegendo amparando cuidando mesmo sabendo que sou imperfeito e pecador

Aos meus pais Gilson Candido e Rosilene Sibaldo pelo incondicional amor e por

saber que posso contar sempre que preciso

A minha irmatilde Thays Sibaldo sempre do meu lado em todos os momentos e

situaccedilotildees da vida

Aos meus sobrinhos Gabrielly Joatildeo e Thaiacutela ensinado a cada dia que a vida eacute

simples e bela dependendo do ponto de vista que vocecirc a vecirc

A Laiacutes Sibaldo e Pedro Natan pelos momentos de descontraccedilatildeo importantes para equilibrar os momentos de stress vividos durante todo o mestrado e pela calorosa recepccedilatildeo nesta cidade

Aos meus tios Joseacute Sibaldo e Rosa Maria Sibaldo pelo apoio paciecircncia e por conceder que durante todo o mestrado pudesse estaacute junto agrave eles no seio da sua famiacutelia proporcionando um verdadeiro lar

A todos meus familiares especialmente a Beth e Cristina pelas palavras de conforto em momentos difiacuteceis durante a caminhada

As minhas avoacutes Zeacutelia e Aurea pelas oraccedilotildees diaacuterias oferecidas a mim

A minha orientadora Professora Drordf Paula da Silva Kujbida por seu apoio amizade compreensatildeo companheirismo dedicaccedilatildeo competecircncia e por toda atenccedilatildeo e sugestotildees fundamentais para a conclusatildeo deste trabalho

Aos professores Aline Schwarz Dulce Lima Ivoneide Costa Claacuteudia Nunes Ernani Pinto que destinaram parte de seu precioso tempo para participarem desta pesquisa

Aos meus amigos que de uma forma ou de outra contribuiacuteram com sua amizade e com sugestotildees efetivas para a realizaccedilatildeo deste trabalho gostaria de expressar minha profunda gratidatildeo

Ao Programa de Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte ndash UFRN pelo apoio agrave minha participaccedilatildeo no

mestrado

A CAPES pela bolsa concedida durante o tempo de curso

SUMAacuteRIO

LISTA DE TABELAS vii

LISTA DE FIGURAS ix

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS xi

RESUMOxiii

ABSTRACT xiv

1 INTRODUCcedilAtildeO 15

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEORICA 16

21CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS 16

211 Microcistinas 22

2111 Absorccedilatildeo 24

2112 Mecanismo toacutexico das microcistinas 25

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS 26

221 Produccedilatildeo de gametas 27

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos 27

212 Produccedilatildeo de gametas masculinos 28

222 O ciclo estral 31

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO 32

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE 36

3 OBJETIVOS 39

31 OBJETIVO GERAL 39

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 39

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 40

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS 40

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas 40

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria 41

42 ANIMAIS 41

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE 42

431 Acasalamento 42

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs 44

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras 44

434 Coleta de sangue 45

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47

4371 Estudo visceral 47

4372 Estudo esqueleacutetico 47

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49

442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49

443 Acasalamento 49

444 Eutanaacutesia dos machos 50

445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos

machos tratados 50

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50

451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53

47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54

5 RESULTADOS 55

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75

6 DISCUSSAtildeO 77

7 CONCLUSAtildeO 84

REFEREcircNCIAS 85

ANEXO I101

ANEXO II103

vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

18

TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano

20

TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

21

TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

56

TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

57

TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

59

TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

60

TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

61

TABELA 9

Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

62

TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

63

TABELA 11

Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

65

viii

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

65

TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

66

TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

67

TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias

71

TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

71

TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

72

TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

73

TABELA 19

Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

75

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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AGRADECIMENTOS

A DEUS por saber que sempre esteve estaacute e estaraacute ao meu lado me amando

protegendo amparando cuidando mesmo sabendo que sou imperfeito e pecador

Aos meus pais Gilson Candido e Rosilene Sibaldo pelo incondicional amor e por

saber que posso contar sempre que preciso

A minha irmatilde Thays Sibaldo sempre do meu lado em todos os momentos e

situaccedilotildees da vida

Aos meus sobrinhos Gabrielly Joatildeo e Thaiacutela ensinado a cada dia que a vida eacute

simples e bela dependendo do ponto de vista que vocecirc a vecirc

A Laiacutes Sibaldo e Pedro Natan pelos momentos de descontraccedilatildeo importantes para equilibrar os momentos de stress vividos durante todo o mestrado e pela calorosa recepccedilatildeo nesta cidade

Aos meus tios Joseacute Sibaldo e Rosa Maria Sibaldo pelo apoio paciecircncia e por conceder que durante todo o mestrado pudesse estaacute junto agrave eles no seio da sua famiacutelia proporcionando um verdadeiro lar

A todos meus familiares especialmente a Beth e Cristina pelas palavras de conforto em momentos difiacuteceis durante a caminhada

As minhas avoacutes Zeacutelia e Aurea pelas oraccedilotildees diaacuterias oferecidas a mim

A minha orientadora Professora Drordf Paula da Silva Kujbida por seu apoio amizade compreensatildeo companheirismo dedicaccedilatildeo competecircncia e por toda atenccedilatildeo e sugestotildees fundamentais para a conclusatildeo deste trabalho

Aos professores Aline Schwarz Dulce Lima Ivoneide Costa Claacuteudia Nunes Ernani Pinto que destinaram parte de seu precioso tempo para participarem desta pesquisa

Aos meus amigos que de uma forma ou de outra contribuiacuteram com sua amizade e com sugestotildees efetivas para a realizaccedilatildeo deste trabalho gostaria de expressar minha profunda gratidatildeo

Ao Programa de Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte ndash UFRN pelo apoio agrave minha participaccedilatildeo no

mestrado

A CAPES pela bolsa concedida durante o tempo de curso

SUMAacuteRIO

LISTA DE TABELAS vii

LISTA DE FIGURAS ix

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS xi

RESUMOxiii

ABSTRACT xiv

1 INTRODUCcedilAtildeO 15

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEORICA 16

21CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS 16

211 Microcistinas 22

2111 Absorccedilatildeo 24

2112 Mecanismo toacutexico das microcistinas 25

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS 26

221 Produccedilatildeo de gametas 27

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos 27

212 Produccedilatildeo de gametas masculinos 28

222 O ciclo estral 31

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO 32

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE 36

3 OBJETIVOS 39

31 OBJETIVO GERAL 39

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 39

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 40

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS 40

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas 40

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria 41

42 ANIMAIS 41

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE 42

431 Acasalamento 42

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs 44

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras 44

434 Coleta de sangue 45

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47

4371 Estudo visceral 47

4372 Estudo esqueleacutetico 47

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49

442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49

443 Acasalamento 49

444 Eutanaacutesia dos machos 50

445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos

machos tratados 50

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50

451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53

47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54

5 RESULTADOS 55

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75

6 DISCUSSAtildeO 77

7 CONCLUSAtildeO 84

REFEREcircNCIAS 85

ANEXO I101

ANEXO II103

vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

18

TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano

20

TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

21

TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

56

TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

57

TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

59

TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

60

TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

61

TABELA 9

Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

62

TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

63

TABELA 11

Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

65

viii

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

65

TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

66

TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

67

TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias

71

TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

71

TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

72

TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

73

TABELA 19

Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

75

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

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SUMAacuteRIO

LISTA DE TABELAS vii

LISTA DE FIGURAS ix

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS xi

RESUMOxiii

ABSTRACT xiv

1 INTRODUCcedilAtildeO 15

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEORICA 16

21CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS 16

211 Microcistinas 22

2111 Absorccedilatildeo 24

2112 Mecanismo toacutexico das microcistinas 25

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS 26

221 Produccedilatildeo de gametas 27

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos 27

212 Produccedilatildeo de gametas masculinos 28

222 O ciclo estral 31

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO 32

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE 36

3 OBJETIVOS 39

31 OBJETIVO GERAL 39

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 39

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 40

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS 40

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas 40

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria 41

42 ANIMAIS 41

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE 42

431 Acasalamento 42

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs 44

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras 44

434 Coleta de sangue 45

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47

4371 Estudo visceral 47

4372 Estudo esqueleacutetico 47

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49

442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49

443 Acasalamento 49

444 Eutanaacutesia dos machos 50

445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos

machos tratados 50

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50

451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53

47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54

5 RESULTADOS 55

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75

6 DISCUSSAtildeO 77

7 CONCLUSAtildeO 84

REFEREcircNCIAS 85

ANEXO I101

ANEXO II103

vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

18

TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano

20

TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

21

TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

56

TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

57

TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

59

TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

60

TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

61

TABELA 9

Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

62

TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

63

TABELA 11

Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

65

viii

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

65

TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

66

TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

67

TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias

71

TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

71

TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

72

TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

73

TABELA 19

Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

75

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47

4371 Estudo visceral 47

4372 Estudo esqueleacutetico 47

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49

442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49

443 Acasalamento 49

444 Eutanaacutesia dos machos 50

445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos

machos tratados 50

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50

451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53

47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54

5 RESULTADOS 55

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75

6 DISCUSSAtildeO 77

7 CONCLUSAtildeO 84

REFEREcircNCIAS 85

ANEXO I101

ANEXO II103

vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

18

TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano

20

TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

21

TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

56

TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

57

TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

59

TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

60

TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

61

TABELA 9

Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

62

TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

63

TABELA 11

Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

65

viii

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

65

TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

66

TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

67

TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias

71

TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

71

TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

72

TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

73

TABELA 19

Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

75

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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86

AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is

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BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103

87

BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR

MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of

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JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK

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6 DISCUSSAtildeO 77

7 CONCLUSAtildeO 84

REFEREcircNCIAS 85

ANEXO I101

ANEXO II103

vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

18

TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano

20

TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

21

TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

56

TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

57

TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

59

TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

60

TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

61

TABELA 9

Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

62

TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

63

TABELA 11

Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

65

viii

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

65

TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

66

TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

67

TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias

71

TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

71

TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

72

TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

73

TABELA 19

Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

75

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

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vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

18

TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano

20

TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

21

TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

56

TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

57

TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

59

TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

60

TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

61

TABELA 9

Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

62

TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

63

TABELA 11

Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

65

viii

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

65

TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

66

TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

67

TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias

71

TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

71

TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

72

TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

73

TABELA 19

Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

75

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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viii

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

65

TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

66

TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

67

TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias

71

TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

71

TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

72

TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

73

TABELA 19

Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

75

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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86

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ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis

24

FIGURA 2

Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

43

FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides

43

FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

44

FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo

45

FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

46

FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar

51

FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato

58

FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

64

FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)

68

x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

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x

FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

70

FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias

74

FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados

com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As

setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular

Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As

setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos

tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte

histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com

aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H

mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

76

xi

LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS

Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco

ALT Aspartato aminotransferase

ANOVA

Analise de Variacircncia

ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

AST Alanina aminotransferase

COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal

CYNs Cilindrospermopsinas

D-ala D-alanina

DG Dia da gestaccedilatildeo

D-Glu Aacutecido glutacircmico

D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico

EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay

FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede

GV Valor Diretriz

HbCO Caboxihemoglobina

Met-Hb Metehemoglobina

HiCN Cianometehemoglobina

HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia

ip Intraperitoneal

ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia

KOH Hidroacutexido de potaacutessio

LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem

xii

LR Leucina-Argenina

MC-LR Microcistina-LR

MCs Microcistinas

Mdha N-metil deidroalanina

min Minuto

MO Medula Oacutessea

MS Ministeacuterio da Sauacutede

ND Natildeo identificado

NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)

OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede

p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica

RR Arginina-Arginina

SAX Saxitoxina

TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada

vv VolumeVolume

YA Tirosina-Lanina

xiii

RESUMO

A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao

abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de

muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo

serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de

tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite

maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar

presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica

Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves

cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de

animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo

do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos

machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante

processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi

analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e

quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado

nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o

referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual

ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem

portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de

risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se

assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel

distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS

em sua legislaccedilatildeo

xiv

ABSTRACT

The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the

population can create public health problems for many species could produce

potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional

procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the

maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking

water distributed to the population creating a chronic exposure There is little

information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work

aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of

cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of

pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of

microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater

reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and

its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was

observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100

or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on

reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed

any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract

above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or

greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the

development of this work contributed to better assess public health risk as the oral

exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable

limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries

that use the LMP established by WHO in its legislation

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de

aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E

SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas

nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)

Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas

cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E

BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via

intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a

toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda

Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo

prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a

populaccedilatildeo estaacute exposta

Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo

provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave

populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o

valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo

(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido

a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com

camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell

et al 1994)

Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das

cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006

STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas

cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et

al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo

oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o

desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas

nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a

concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo

somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de

mamiacuteferos

16

2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS

As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas

celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema

fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)

(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar

fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos

procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto

em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de

desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem

estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et

al 2003)

Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam

problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade

antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o

aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas

bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias

definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER

2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na

superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros

de profundidade (FUNASA 2003)

A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem

muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de

cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e

pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os

periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila

as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do

Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical

da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o

ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A

toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das

17

alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema

(FUNASA 2003)

A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa

ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos

daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio

ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede

puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO

1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias

serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as

floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)

Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo

Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis

Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)

(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)

As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)

cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas

anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)

As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das

cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede

celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas

cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas

elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco

estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores

acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na

competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o

domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que

essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE

1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)

As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a

sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e

lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo

determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como

hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008

18

VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os

mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas

Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra

Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade

Hepatotoxinas

Microcistinas

(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]

Nodularinas

(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)

Promotor de tumor inibidor de fosfatases

[Ueno et al 1996]

Cilindrospermopsinas

(Alcaloacuteide)

Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith

2004]

Neurotoxinas

Saxitoxina e seus anaacutelogos

(Alcaloacuteide)

Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]

Anatoxina-a

(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina

[Osswald et al 2007]

Homoanatoxina

(Alcaloacuteide)

Anatoxina-a(s)

(Eacutester metiacutelico)

Organofosforado natural que age como inibidor

irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo

de salivaccedilatildeo) [Van

Apeldoorn et al 2007]

19

Toxinas

Estrutura molecular

Modo de toxicidade

Dermatotoxinas

Aplisiatoxina

(Bilactona fenoacutelica)

Causam dermatite [van

Apeldoorn et al 2007]

Lingbiatoxina-a

(Alcaloacuteide indoacutelico)

Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo

gastrintestinal [Osborne et

al 2001]

Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se

tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998

BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada

por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas

cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado

(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees

provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)

No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua

potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando

um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em

Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram

distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise

Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica

aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998

CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)

Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)

20

Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem

graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite

maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E

BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio

da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e

responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de

cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses

oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por

meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e

passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia

da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-

se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram

recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos

permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel

TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em

aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de

potabilidade da aacutegua para consumo humano

TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO

PERMITIDO (microgL)

MICROCISTINAS 1

CILINDROSPERMOPSINAS 1

SAXITOXINA 3

Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914

do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas

observando os valores limites

Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento

de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de

cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo

Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de

potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de

vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento

21

dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo

para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel

de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel

de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para

sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns

indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3

Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua

distribuiacuteda pelas companhias de tratamento

Niacutevel Valores indicativos

Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume

Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume

Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume

Niacutevel 3

- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade

(Adaptada de FUNASA 2003)

Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que

resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com

cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em

atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo

consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS

2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al

2009)

Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo

ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)

ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs

e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus

22

e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas

hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por

hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente

Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida

ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a

coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo

apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua

(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta

a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados

pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os

efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre

os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas

cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)

211 Microcistinas

As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido

isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e

EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que

produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E

BARTRAM 2003 DAWSON 1998)

As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal

(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas

como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica

unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina

(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e

AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete

aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica

(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina

(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido

glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-

β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-

metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil

deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A

23

presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs

(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de

destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade

das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)

A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve

como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a

MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A

combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas

diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de

metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido

Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e

CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e

HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA

(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais

de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)

24

R1 R2

MC-LR Leucina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YA Tirosina Alanina

MC-LA Leucina Alanina

MC-RA Arginina Alanina

MC-AR Alanina Arginina

MC-FR Fenilalanina Arginina

MC-FA Fenilalanina Alanina

FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas

posiccedilotildees variaacuteveis

A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do

anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e

HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No

Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes

resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)

com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al

1994)

2111 Absorccedilatildeo

Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido

estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio

extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute

25

ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE

2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente

natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC

2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina

(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares

(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina

se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana

como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003

ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem

expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs

para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC

rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e

BRACARENSE 2008)

2112 Mecanismo toacutexico das MCs

A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e

crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do

hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando

hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos

hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura

dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa

(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave

retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares

sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees

(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)

Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de

sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e

HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos

hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos

tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs

(FUNASA 2003)

As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as

quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al

2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o

26

mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo

celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a

MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees

ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute

mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)

Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se

As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no

desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por

existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no

desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)

22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS

A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das

espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em

mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual

produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo

embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal

crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo

(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico

ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo

discutidos no item 221

O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)

enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o

processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio

luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de

resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou

emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores

ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em

alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo

Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade

impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento

entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a

fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que

levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas

27

fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de

imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado

epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua

origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por

envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da

cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)

Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a

mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado

mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada

proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro

pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes

devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al

2002)

221 Produccedilatildeo de gametas

O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na

fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado

durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute

reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e

a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas

germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo

durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)

2211 Produccedilatildeo de gametas femininos

A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas

germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais

internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e

LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda

na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007

BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas

continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo

origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito

primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal

seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)

28

Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica

camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo

primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e

a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio

(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)

A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila

antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que

as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia

inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico

(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos

ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na

ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride

ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a

fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)

Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos

que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)

O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser

dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na

porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e

veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em

diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor

feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais

femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que

contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse

oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da

fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)

2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos

O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo

mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES

et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como

estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior

dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No

primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo

29

estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos

macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)

Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas

de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso

ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees

testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al

2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela

tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)

A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico

para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade

normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)

As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira

sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de

desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores

para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e

HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas

funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)

A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60

dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias

(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que

resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras

(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente

diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA

2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser

divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo

meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)

Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias

seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada

espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois

espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de

divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides

parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional

assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de

cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios

30

sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da

metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)

As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de

modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como

espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no

interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam

as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma

vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o

epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a

maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute

o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a

quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)

A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da

espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que

eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo

(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas

relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de

Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial

reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor

agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e

levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito

citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma

crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis

(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar

promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados

antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos

(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos

testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade

iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide

(SUTER et al 1997)

31

222 O ciclo estral

Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da

fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade

sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo

ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA

2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro

diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)

Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila

diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as

ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e

anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas

e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et

al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade

hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases

de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no

metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais

estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata

As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto

metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE

PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves

influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al

(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo

estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com

que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais

Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas

quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no

periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem

diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns

autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto

estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo

mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach

(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias

entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos

32

durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a

facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na

determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e

Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade

e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona

Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na

receptividade sexual

O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro

comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura

espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais

proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose

eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a

inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do

indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de

substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)

Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes

locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)

A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final

(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel

maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma

estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a

capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal

(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de

impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo

(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo

entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute

retomado (SANTOS 2002)

23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento

durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e

PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas

agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas

alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego

33

ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles

recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a

beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente

o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas

macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias

mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)

A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o

organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida

do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes

da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o

desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade

(NIHI E LOURENCcedilO 2011)

Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do

desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria

protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)

Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de

moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a

determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)

O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs

compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e

esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo

facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI

e CUNHA 2006)

Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram

questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute

que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi

sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi

Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956

(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo

verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez

resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958

e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de

milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas

caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou

34

inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA

BERMUDEZ e SOUZA1999)

Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais

para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu

a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos

protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao

periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem

testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na

interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)

Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados

expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar

se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et

al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade

materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja

repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)

Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo

prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a

interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como

consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam

em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou

ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida

na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A

etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida

existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como

causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)

Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em

desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de

tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das

mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a

toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)

Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada

tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de

diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a

agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em

35

desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos

da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase

de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e

permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for

iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional

Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo

capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de

toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou

aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo

(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al

(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do

peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias

nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a

toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer

os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais

(GIAVINI e MENEGOLA 2001)

A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos

reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a

exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que

compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal

(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada

fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do

dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao

15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma

grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos

autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das

mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo

Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto

e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com

diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data

exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo

A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia

de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias

funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que

36

o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no

desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo

observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER

GUERRA 2004)

Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees

estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo

(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo

de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo

parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um

desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)

deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia

(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de

desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em

periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees

toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no

desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)

A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o

desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular

de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o

seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais

podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede

dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses

ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados

reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)

24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E

EMBRIOFETOTOXICIDADE

Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de

cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais

expostos (BU et al 2006)

Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou

distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos

37

machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na

concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda

a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou

que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade

teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo

para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200

600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff

e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade

do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR

purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses

que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da

gestaccedilatildeo

Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com

aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia

petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos

glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por

via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados

encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo

danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e

desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos

para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado

tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi

possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves

anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos

filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou

12 μgkgdia

Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de

camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no

epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de

MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram

que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-

LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do

espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos

38

Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando

expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados

dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo

materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos

experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a

(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O

resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de

toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da

gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128

gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade

morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses

administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente

investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores

(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se

encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no

ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os

animais do estaacutegio tardio (13-17)

Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na

reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e

os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de

cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos

por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole

39

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos

machos e fecircmeas e na prole

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com

floraccedilotildees de cianobacteacuterias

Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus

congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por

LC-MSMS e HILIC-FD

Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na

prole originada

Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de

embriofetotoxicidade da sua prole

Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)

Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso

corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos

Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de

dosagens bioquiacutemicas dos progenitores

40

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS

411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e

cianotoxinas

Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de

aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro

de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte

Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras

(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram

realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de

cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas

(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme

especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram

positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do

Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as

cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos

(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-

MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com

Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))

Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus

anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases

moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio

e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo

poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma

soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma

derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um

detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram

identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras

com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo

dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da

41

toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas

(GALVAtildeO et al 2009)

Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)

nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um

sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex

Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase

moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de

amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de

acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes

incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em

MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de

resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades

certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)

412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria

Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a

amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no

reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et

al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e

submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em

seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas

com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo

de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As

diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar

sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em

refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)

42 ANIMAIS

Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia

entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g

provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x

42

20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas

diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente

variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz

acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e

aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos

experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo

Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em

experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica

no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)

Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho

reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento

foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos

Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento

43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE

As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada

um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua

destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos

fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole

431 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas

fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi

avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das

caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09

(figura 2)

43

FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante

uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo

de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia

Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das

ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus

CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do

acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse

tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto

macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)

FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas

Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de

espermatozoides

44

O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo

do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada

em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As

fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento

durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por

grupo

432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes

grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua

destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes

concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os

tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com

auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso

corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna

e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo

FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar

433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras

As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas

agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o

anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de

pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada

amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)

45

Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram

exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos

luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua

extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a

remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram

expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)

Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim

esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para

posterior anaacutelise histopatoloacutegica

FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda

indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um

siacutetio de implantaccedilatildeo

434 Coleta de sangue

No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o

coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um

tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg

Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das

anaacutelises bioquiacutemicas

46

435 Avaliaccedilatildeo dos fetos

A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando

a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa

corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada

presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e

malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de

orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais

vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi

mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora

FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que

foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo

436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo

Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo

das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de

acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de

reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico

peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados

foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho

reprodutivo

47

Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas

Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados

Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)

x 100 nordm de corpos luacuteteos

Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees

Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)

x 100 nordm de implantaccedilotildees

437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade

Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora

foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico

4371 Estudo visceral

A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados

em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL

de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido

aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram

imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a

90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral

O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson

(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel

a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os

paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo

anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia

cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele

microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco

aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial

comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos

hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e

hemorragia peritoneal no fiacutegado

4372 Estudo esqueleacutetico

Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o

meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes

48

foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo

acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos

ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma

incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os

oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os

filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar

os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina

A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares

tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas

calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08

gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua

destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse

obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por

um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada

diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool

benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico

Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda

As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas

claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores

Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital

zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave

ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de

ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para

as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio

rudimentar assimeacutetrico

Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13

toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados

agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves

costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas

foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia

ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida

As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos

ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de

forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos

49

metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto

agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de

metatarso

44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL

Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo

por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40

ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida

(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e

eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo

441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada

contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram

expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O

grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram

administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)

aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi

administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)

As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da

gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada

animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo

avaliados

442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida

A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos

grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de

tratamento 49-51

443 Acasalamento

O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia

de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

50

cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de

ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com

uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do

sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431

444 Eutanaacutesia dos machos

A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg

MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via

ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada

somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso

da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo

na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo

pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia

tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de

sangue (item 452)

445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos

tratados

As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram

submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433

(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado

esse procedimento)

A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos

machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no

item 436

45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS

Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue

perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52

dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra

Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)

51

451 Coleta de amostras de medula oacutessea

A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho

foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi

retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura

as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o

canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da

cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a

suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente

identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)

FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira

de um rato Wistar

452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico

No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado

ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com

seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi

cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico

disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um

tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)

por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises

bioquiacutemicas

52

Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de

contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio

oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi

utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica

do micro-hematoacutecrito

453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea

A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato

macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com

liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da

suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo

120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar

as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico

(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)

454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma

Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi

empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma

As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga

secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a

coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500

ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado

455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico

Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do

sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido

de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi

realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica

consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico

A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas

por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor

(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do

sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente

53

homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a

contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no

aumento de 400x

456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito

Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de

cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA

em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi

pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico

coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso

durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso

ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e

caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi

realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)

(Bioespectroreg PS22)

A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em

relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em

que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico

coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito

(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo

de leitura de hematoacutecrito

46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA

Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo

baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos

machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo

esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em

colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de

PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e

fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram

cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente

aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado

com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a

razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os

54

fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico

(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em

parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios

analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose

necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi

avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose

tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no

epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral

47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS

As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra

Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e

452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi

centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20

ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia

creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da

Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em

que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria

(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra

(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das

amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340

nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio

Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda

de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram

obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada

fabricante dos kits

48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre

os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005

Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-

Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias

55

5 RESULTADOS

51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS

Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio

Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para

cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de

identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-

MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para

identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)

A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a

de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi

observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -

LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela

4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente

sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR

A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de

cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de

massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)

caracteriacutestica de cada MC identificada

56

TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e

noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD

Nordm da Amostra

(ng de cianotoxinamL de aacutegua)

MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR

MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total

4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145

equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado

57

TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em

diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica

Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS

4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa

delicatiacutessima

5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima

6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima

14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense

16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense

17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis

26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima

27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa

28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii

29 Passagem das Traiacuteras

(Agosto2010)

C raciborskii M aeruginosa

32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense

33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii

58

00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0

1

2

3

6x10

Intens

5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)

5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)

RR LR

FR

AR

RA LA FAYR

A

9958

11007

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz

4544

5201

5314

5424 5701 6081 6394 67386897

+MS

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

400 450 500 550 600 650 mz

9519

9798

10057

10457

10757 11380 11848

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

10098

10297

10687

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz

9107

9327

9486 9697

+MS -Spectral Bkgrnd

0

10

20

30

Intens

[]

840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz

9537

9878

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

700 800 900 1000 1100 1200 mz

9107 9247

9447

9667

9837

10057

10243

+MS -Spectral Bkgrnd

0

20

40

60

80

100

Intens

[]

880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz

MC-FA

[M+H]+ 9447

[M+Na]+ 9667

MC-LA

[M+H]+ 9107

[M+Na]+ 9327

MC-FR

[M+H]+ 10297

MC-AR ou RA

[M+H]+ 9537

MC-RR

[M+2H]2+ 5201

MC-YR

[M+H]+ 10457

MC-LR

[M+H]+ 9958

B C

D E

GF

H

FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos

ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves

microcistinas identificadas no extrato

59

52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA

EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE

Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)

durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu

desempenho reprodutivo foi avaliado

A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos

luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a

cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo

houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes

tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo

TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Iacutendices reprodutivos Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109

Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178

Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033

Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram

obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados

na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores

similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada

(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a

taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e

040 respectivamente por ANOVA

60

TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas

prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20

dias de gestaccedilatildeo

Taxa () Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246

Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17

Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo

esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos

fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)

61

TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos

analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias

quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo

controle (aacutegua destilada) (tabela 9)

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250

Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018

62

TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA

A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso

corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram

comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20

em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo

Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ

Controle

ng de MCskg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos

ɵ Nuacutemero de fetos analisados

α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do

coraccedilatildeo

63

de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal

(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do

grupo controle

TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Dia Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167

4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161

6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192

8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156

10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201

12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254

14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308

16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227

18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393

20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias

gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20

dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das

ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs

(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

64

FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os

valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais

por grupo P gt005 como indicado por ANOVA

O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo

mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente

ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)

quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia

plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e

ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)

65

TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo

com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295

Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns

oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas

por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de

gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado

com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe no DG 20

TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia

de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Razatildeo (POPC)β

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024

Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001

Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β

Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

ɵ Rim esquerdo

A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso

relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas

prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve

66

diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero

graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)

quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do

peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso

corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo

TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos

(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua

destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo

MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo

Oacutergatildeo Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007

Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA

54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES

A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo

controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de

MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados

foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem

da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina

de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle

67

TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de

ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de

extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante

20 dias de gestaccedilatildeo

Paracircmetros Bioquiacutemicos

Controle

ng de MCsKg de peso corpoacutereodia

40 100 250

Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001

plt00001quando

comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA

55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES

A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com

porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com

aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo

68

]]]

FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante

20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)

ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

(E-H)

69

56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS

Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por

vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))

durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)

recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia

durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de

espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele

foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises

Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave

eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)

Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas

significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de

ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das

fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-

implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do

teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados

70

FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos

ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)

ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52

dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip

por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9

animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN

grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua

destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias e ciclofosfamida)

57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS

A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de

tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem

diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento

do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle

Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram

obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52

71

TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua

destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de

MCsKgdia (grupos T durante 52 dias

Dia Grupo CN Grupo T

4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11

8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12

12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15

16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21

20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21

24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21

28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25

32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21

36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23

40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29

44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19

48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23

52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)

A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo

nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16

Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a

ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os

animais do grupo controle negativo (grupo CN)

TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de

tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com

uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCsKgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo

No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com

Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia

Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06

Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14

72

ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas

fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram

submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo

pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17

mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados

com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando

comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou

diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)

TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no

52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

Rim esquerdo

A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo

oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo

Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso

relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos

animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a

partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato

macho apresentado no 52ordm dia de tratamento

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001

Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001

Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001

Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002

73

TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo

(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo

controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de

MCskgdia)

Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato

58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS

A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de

soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)

ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52

dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No

entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores

hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo

observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados

com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)

Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia

Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002

Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001

74

FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por

vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de

MCskgdia) durante 52 dias

59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue

cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com

extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo

hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos

(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito

hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue

cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do

dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos

estudados

75

TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados

por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng

de MCskgdia) durante 52 dias

Leucoacutecito da medula oacutessea

Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico

510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS

A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees

teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos

ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua

destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)

Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia

Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026

Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833

Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090

Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026

Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006

76

FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte

histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte

histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada

(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as

diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas

77

6 DISCUSSAtildeO

As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela

ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN

APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS

representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por

microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para

derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos

de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio

determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos

adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute

conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute

derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou

inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de

experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana

satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso

para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com

camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN

FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi

observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e

histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o

valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para

MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o

IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs

podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a

longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento

convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas

Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a

longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que

mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta

Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem

destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a

reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como

para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios

reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO

78

2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e

fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para

avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A

administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral

(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA

provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe

salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo

possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute

MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)

Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que

seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os

resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade

materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)

Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal

ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma

correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais

de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute

observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de

raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses

paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos

Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa

corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os

animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos

apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O

mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de

intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila

de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR

(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)

Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg

de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto

nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas

que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al

79

2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante

os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em

um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante

os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no

ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo

controle (ROGERS et al 2007)

Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo

apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado

por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo

ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram

expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses

resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no

peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante

14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M

aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do

grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)

A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante

indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO

et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos

testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram

semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um

fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos

fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250

ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que

administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia

durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)

na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso

do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem

tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo

da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso

corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e

nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo

80

Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das

substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de

oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al

2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute

importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem

que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)

Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos

femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo

vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na

reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a

toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos

reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram

diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais

tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de

MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)

Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo

apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando

comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)

Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes

administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M

aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa

do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com

a maior dose

Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem

seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo

a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de

hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o

que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o

aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da

filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo

hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e

YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No

entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em

81

ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava

relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)

Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma

diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com

soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)

quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua

destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng

de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico

renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos

relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente

satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na

gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis

seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE

MADIAS e LEVEY 1992)

Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo

nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens

bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana

Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em

camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no

experimento de toxicidade aguda

O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade

nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo

nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos

(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de

cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua

destilada)

Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes

sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns

pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias

quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi

et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na

contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito

82

de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)

Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na

medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de

hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de

medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias

contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma

alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos

das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)

No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada

ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal

permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o

desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo

calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais

reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado

alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que

fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no

ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato

antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes

nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram

capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo

A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no

desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais

ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a

substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a

concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos

resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da

organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de

alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia

(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996

WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se

avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia

estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de

cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez

que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas

83

progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram

resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado

semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que

trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000

μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo

nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma

malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR

purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por

via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128

μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem

natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de

camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de

CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle

Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo

a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo

foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram

encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam

extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de

MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle

Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por

vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo

causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho

reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes

tratadas

84

7 CONCLUSAtildeO

Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos

paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato

bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria

de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura

para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para

paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade

85

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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