MILENA FRONZA BROERING

EFEITOS DO EXTRATO DE Tithonia diversifolia

(Asteraceae) SOBRE A INFLAMAÇÃO INATA

Itajaí (SC) 2019

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

MILENA FRONZA BROERING

EFEITOS DO EXTRATO DE Tithonia diversifolia

(Asteraceae) SOBRE A INFLAMAÇÃO INATA

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. José Roberto Santin Coorientadora: Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão

Itajaí (SC) Maio 2019

“Dedico este trabalho primeiramente a minha mãe e meus avós maternos, cоm muito carinho е apoio, nãо mediram esforços para qυе еυ chegasse аté esta etapa dе minha vida. Às pessoas cоm quem convivi nesses espaços ао longo desses anos. А experiência dе υmа produção compartilhada cоm amigos foram а melhor experiência dа minha formação acadêmica.”

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente ao meu orientador, que foi essencial para

minha construção acadêmica. Obrigada pela orientação, seu grande

desprendimento em ajudar, todo o conhecimento repassado e amizade

sincera.

Às amizades que cultivei e às que ganhei durante esse período, pois

como diria Carlos Drummond de Andrade, fácil é ser colega, fazer

companhia a alguém, dizer o que ele deseja ouvir. Difícil é ser amigo para

todas as horas e dizer sempre a verdade quando for preciso. Obrigada a

vocês, Camila, Aline e Renata.

A minha colega de convívio diário, mesmo com todas as dificuldades,

fosse muitas vezes meu pilar de sustentação, Roberta.

Aos professores da banca examinadora Prof Dra Sandra, Prof Dra

Marcia, e em especial a minha Coorientadora Prof Dra. Nara, pelas

considerações e contribuições para a melhoria deste trabalho.

Aos demais docentes e funcionários do programa de mestrado em

Ciências Farmacêuticas que, em maior ou menor grau, contribuíram para

minha formação e que sempre estiveram abertos às minhas indagações.

Ao apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001.

“Cada um terá a vista da montanha que subir”

-Autor desconhecido

EFEITOS DO EXTRATO DE Tithonia diversifolia

(Asteraceae) SOBRE A INFLAMAÇÃO INATA

Milena Fronza Broering

Maio 2018

Orientador: José Roberto Santin, Doutor. Coorientadora: Nara Lins Meira Quintão, Doutora. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 102

Tithonia diversifolia é uma espécie amplamente empregada na medicina popular de vários países para o tratamento de malária, diabetes mellitus, dor de garganta, doenças do fígado, cólicas menstruais e processos inflamatórios. Alguns trabalhos já relataram seu efeito anti-inflamatório, no entanto, sua ação direta sobre a infiltração de leucócitos e os efeitos sobre os mecanismos adesivos e locomotores de neutrófilos, bem como seus efeitos antinociceptivos pouco reportados. Neste contexto, no presente trabalho foram investigados os efeitos anti-inflamatórios do extrato etanólico bruto obtido das partes aéreas de T. diversifolia sobre a inflamação induzida por lipopolissacarídeo (LPS) ou carragenina, bem como os mecanismos envolvidos na inibição da migração e secreção de neutrófilos. A atividade anti-inflamatória foi investigada utilizando o modelo de inflamação induzida por carragenina no tecido subcutâneo de camundongos Swiss machos tratados oralmente com o extrato de T. diversifolia (0,1, 1 ou 3 mg/kg). O influxo de leucócitos foi mensurado por microscopia óptica, a avaliação da secreção de mediadores químicos (TNF, IL-1β, IL-6 e CXCL1) in vivo foi realizada por ELISA. Ensaios in vitro com neutrófilos murinos recrutados com glicogênio de ostra e tratados com o extrato (0,1 - 100 µg/mL) foram realizados para avaliar a quimiotaxia induzida por N-formil-metionina-leucina-fenilalanina (fMLP), produção de NO2 induzida por LPS, viabilidade celular, produção de citocinas (TNF, IL-1β, IL-6 e CXCL1) e a expressão das moléculas de adesão CD18 e CD62L. Também foram avaliadas as propriedades de resolução pelo ensaio de fagocitose in vitro e analgésica utilizando o monofilamento de Von Frey. Os dados obtidos demonstraram que o tratamento oral com extrato de T. diversifolia promoveu redução na migração de neutrófilos, bem como diminuição nos níveis de TNF e IL-1β no exsudato, no entanto sem

alterar o extravasamento de proteínas. O tratamento in vitro com o extrato não alterou a expressão da molécula de adesão CD62L, mas foi capaz de promover redução da expressão de CD18, além de reduzir a secreção de TNF, IL-1β, IL-6 e de NO2

-. Frente ao estímulo do fMLP, neutrófilos reduziram a quimiotaxia quando tratados com diferentes concentrações de T. diversifolia. Não foi observado efeito citotóxico nas concentrações de T. diversifolia utilizadas. No ensaio de fagocitose in vitro, o extrato apresentou potencial e aturar na resolução da inflamação e ainda concentração de 3 mg/kg de T. diversifolia demonstrou potente ação analgésica no processo inflamatório. Em conjunto, os dados obtidos demostram que o extrato de T. diversifolia apresenta importantes ações anti-inflamatórias in vivo e in vitro, bloqueando as vias de migração de neutrófilos e a secreção de mediadores importantes para o processo inflamatório, sugerindo sua aplicação terapêutica em reações inflamatórias agudas.

Palavras-chave: Inflamação. Migração. Neutrófilos. Tithonia.

EFFECTS OF EXTRACT OF Tithonia diversifolia (Asteraceae) ON

INNATE INFLAMMATION

Milena Fronza Broering

May 2018

Supervisor: José Roberto Santin, Dr. Co-advisor: Nara Lins Meira Quintão, Dra. Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 102 Tithonia diversifolia is a species that is widely used in the folk medicine of several countries to treat malaria, diabetes mellitus, sore throat, liver diseases, menstrual cramps and inflammatory processes. Some studies have reported its anti-inflammatory effect, but there have been few reports on its direct action on leukocyte infiltration and its effects on the adhesive and locomotor mechanisms of neutrophils, as well as its antinociceptive effects. In this context, this work investigates the anti-inflammatory effects of crude ethanolic extract obtained from the aerial parts of T. diversifolia on the inflammation induced by lipopolysaccharide (LPS) or carrageenan, as well as the mechanisms involved in the inhibition of neutrophil migration and secretion. Anti-inflammatory activity was investigated using the carrageenan-induced inflammation model in the subcutaneous tissue of male Swiss mice treated orally with T. diversifolia extract (0.1, 1 or 3 mg/kg). Leukocyte influx was measured by optical microscopy. Evaluation of the secretion of chemical mediators (TNF, IL-1β, IL-6 and CXCL1) in vivo was performed by ELISA. In vitro assays were performed with murine neutrophils recruited with oyster glycogen and treated with the extract (0.1 - 100 µg/mL) to evaluate chemotaxis induced by N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine (fMLP), NO2 production-induced cell proliferation, cell viability, cytokine production (TNF, IL-1β, IL-6 and CXCL1) and the expression of CD18 and CD62L adhesion molecules. The resolution properties were also evaluated by in vitro and analgesic phagocytosis assay using Von Frey monofilament. The data obtained demonstrated that oral treatment with extract of T. diversifolia promoted a reduction in neutrophil migration, as well as a decrease in TNF and IL-1β levels in the exudate, however, but did not alter the extravasation of proteins. In vitro treatment with the extract did not alter the CD62L adhesion molecule expression, but was able to promote reduction of CD18 expression, as well as reducing the secretion of TNF, IL-1β, IL-6 and NO2-. Faced with fMLP stimulation, neutrophils reduced chemotaxis when treated with different concentrations of T. diversifolia. No cytotoxic effect was observed on the concentrations of T. diversifolia used. In the in vitro phagocytosis assay, the extract presented potential to act in the resolution of the inflammation and even the concentration of 3 mg/kg of T. diversifolia demonstrated potent analgesic

action in the inflammatory process. Taken together, the data show that the extract of T. diversifolia presents important anti-inflammatory actions in vivo and in vitro, blocking neutrophil migration pathways and the secretion of important mediators for the inflammatory process, suggesting its therapeutic application in acute inflammatory reactions. Keywords: Inflammation. Migration. Neutrophils. Tithonia.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Folhas e flores de T. diversifolia (Hemsl.) A. Gray. ................... 11

Figura 2. Estrutura química das três principais lactonas sesquiterpênicas obtidas de T. diversifolia. ............................................................................ 14

Figura 3. Esquema representativo da migração celular de leucócitos para o foco de lesão. ............................................................................................... 19

Figura 4. Esquema representativo da ativação molecular que proporciona a movimentação do neutrófilo ........................................................................ 21

Figura 5. Esquema dos diferentes tipos de neurônios sensoriais primários 26

Figura 6. Fluxograma da obtenção do extrato de T. diversifolia. ............... 29

Figura 7. Linha do tempo para o experimento de bolsa de ar..................... 31

Figura 8. Imagem representativa do poço do ensaio de quimiotaxia in vitro. ..................................................................................................................... 35

Figura 9. Efeitos do extrato de T. diversifolia no modelo de bolsa de ar induzida por carragenina ............................................................................. 39

Figura 10. Imagens histológicas do tecido subcutâneo dorsal de animais submetidos ao ensaio de bolsa de ar. ........................................................... 40

Figura 11. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a produção de citocinas no exsudato da bolsa de ar............................................................ 42

Figura 12. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a viabilidade celular de neutrófilos e fibroblastos murino (L929). ............................................... 43

Figura 13. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a produção de citocinas no sobrenadante de cultura de neutrófilos estimulados com LPS. 45

Figura 14. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a produção de NO2-

em neutrófilos estimulados com LPS. ......................................................... 46

Figura 15. Efeito do extrato de T. diversifolia na quimiotaxia de neutrófilos in vitro e na expressão das moléculas de adesão CD62L e CD18. ..................................................................................................................... 47

Figura 16. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a eferocitose de neutrófilos apoptóticos ................................................................................ 48

Figura 17. Frequência e limiar de dor inflamatória induzida por carragenina e tratada com T. diversifolia ........................................................................ 50

Figura 18. Resumo gráfico das ações anti-inflamatórias de T. diversifolia 60

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIES Anti-inflamatórios esteroidais AINES Anti-inflamatórios não-esteroidais AMeOH Extrato metanólico C5a Fração 5ª do sistema complemento CAMs Moléculas de adesão celular CD18 β2-integrina CD62E E-selectina CD62L L-selectina CD62P P-selectina COX-2 Ciclooxigenase 2 CXC Alfa-quimiocinas DAG Diacilglicerol DAMPS Padrão de resposta associado ao dano DAMPs Danos moleculares associados a patógenos DMEN Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DO Densidade ótica EA Extrato aquoso EEtOH Extrato etanólico bruto ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática eNOS Óxido nítrico síntase endotelial fMLP N-Formilmetionina-leucil-fenilalanina FPR Receptor de peptídeos formilados FPR2 Receptor de peptídeos formilados 2 FPR4 Receptor de peptídeos formilados 4 G-CSF Fator estimulante de colônias granulocítico GEFs Fator de troca de nucleotídeo de guanina GPCR Receptor acoplado a proteína G ICAM Molécula de adesão intercelular IL Interleucina iNOS Óxido nítrico síntase indutível IP3 Inositol trifosfato IRAK Receptor de IL associado a quinases

IRFs Fator regulador da transcrição de interferon JNK Quinase c-Jun-N-terminal L929 Fibroblasto murino de tecido conectivo adiposo LDL Lipoproteína de baixa densidade LOX-5 Lipoxigenase-5 LPS Lipopolissacarídeo LRE Extrato rico em lactonas sesquiterpênicas LTB4 Leucotrieno B4 MADCAM1 Molécula de adesão celular vascular e mucosal 1 MAPK 38 Proteína quinase p38 ativada por mitógenos MPO Mieloperoxidase MTT Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio MYD88 Gene de resposta primária de diferenciação mieloide 88 NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxigenase NF-ĸB Fator nuclear Kappa B NGF Fator de crescimento nervoso PAF Fator de ativação plaquetária PAG Substância cinzenta periaquedutal PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos PBS Solução tamponada com fosfato PDGF Fator de crescimento derivado de plaqueta PE Extrato polar PECAM-1 Molécula de adesão plaqueta endotelial PGE2 Prostaglandina E2

PIP3 Fosfatidilinsitol (3,4,5) trifosfato PKA Proteína quinase A PKC Proteína quinase C PRRs Receptor padrão de reconhecimento PSGL-1 Glicoproteína ligante de P-selectina-1 ROS Espécie reativa de oxigênio RVM Medula rostral ventromedial STAT3 Transdutores de sinais e ativadores de transcrição 3 STLs Lactonas sesquiterpênicas TACE Enzima de conversão do fator de necrose tumoral-α TLR Toll like receptor TNF Fator de necrose tumoral

TRAF-6 Fator 6 associado ao receptor de TNF TRIF TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β VCAM1 Molécula de adesão vascular VCAM-1 Molécula de adesão celular vascular 1 VEGF Fator de crescimento de células endoteliais VLA4 Integrina α4β1 WBC White blood cells – leucócitos sanguíneos

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 7

2 OBJETIVOS ............................................................................................. 9

2.1 Objetivo Geral ....................................................................................... 9

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 9

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................. 10

3.1 Tithonia diversifolia: aspectos químicos e biológicos ........................ 10

3.2 Processo inflamatório: aspectos gerais .............................................. 15

3.3 Processo doloroso: aspectos gerais.......... Erro! Indicador não definido. 4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................. 28

4.1 Obtenção do material botânico e preparo do EEB de T. diversifolia

.................................................................................................................... 28

4.2 Animais ................................................................................................ 29

4.3 Atividade anti-inflamatória in vivo - Inflamação no tecido subcutâneo dorsal (ensaio de bolsa de ar) ............................................... 30

4.3.1 Contagem total e diferencial de leucócitos e analise histológica ..... 31

4.4 Atividade anti-inflamatória in vitro ................................................... 31

4.4.1 Obtenção de neutrófilos migrados para o peritônio ......................... 32

4.4.2 Viabilidade celular (neutrófilos) ....................................................... 32

4.4.3 Determinação do NO e de citocinas .................................................. 32

4.4.4 Avaliação das moléculas de adesão .................................................. 33

4.5 Ensaio de viabilidade celular (L929) ................................................. 33

4.5.1 Linhagem celular e condições de cultivo .......................................... 33

4.5.2 Citotoxicidade (MTT) ........................................................................ 34

4.6 Ensaio de quimiotaxia in vitro ............................................................ 34

4.7 Ensaio de fagocitose in vitro ............................................................... 35

4.8 Avaliação da atividade analgésica do extrato ................................... 36

4.8.1 Análise do limiar mecânico de dor através do filamento de von Frey

.................................................................................................................... 36

4.8.2 Hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina ...................... 37

4.9 Análise estatística ................................................................................ 37

5 RESULTADOS ...................................................................................... 38

6.1 O extrato etanólico de T. diversifolia diminuiu a migração de neutrófilos para o foco de inflamação induzida por carragenina ......... 38

6.2 O extrato de T. diversifolia reduz a secreção de TNF e IL-1β no exsudato inflamatório induzido por carragenina ................................... 41

6.3 O extrato etanólico de T. diversifolia não afeta a viabilidade de neutrófilos e de fibroblastos (L929). ........................................................ 42

6.4 O extrato etanólico de T. diversifolia reduz a produção de citocinas e de NO2

- em neutrófilos estimulados com LPS ......................................... 43

6.5 O extrato et de T. diversifolia atua diretamente em neutrófilos, reduzindo a quimiotaxia e modulando a expressão de moléculas de adesão. ........................................................................................................ 46

6.6 O extrato de T. diversifolia promoveu a eferocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos ...................................................................... 48

6.7 O extrato de T. diversifolia reduz a dor inflamatória induzida por carragenina ................................................................................................ 50

7 DISCUSSÃO ........................................................................................... 51

8 CONCLUSÃO ........................................................................................ 59

REFERÊNCIAS ........................................................................................ 62

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1 INTRODUÇÃO A inflamação é um processo que se inicia normalmente em resposta à

presença de algum patógeno, ativando um sistema de reparo a fim de recuperar a homeostasia. Células e tecidos encontrados em locais de barreira podem ser constantemente expostos a agentes microbianos, químicos e físicos nocivos, podendo ocasionar a perda de função dos mesmos, seja por danos às células desse local ou por excessiva resposta inflamatória (GILROY; MAEYER, 2015; NOWARSKI; JACKSON; FLAVELL, 2017).

A resposta inflamatória é caracterizada por vasodilatação, aumento da permeabilidade capilar, aumento do fluxo sanguíneo e recrutamento de leucócitos, principalmente de neutrófilos. Estas células são as primeiras a se acumularem no sítio da inflamação, sendo cruciais como primeira linha de defesa do sistema imune inato devido às suas funções fagocítica e microbicida. A resposta inflamatória por células imunes inatas e células residentes controlam o início da inflamação, a manutenção e a amplitude, bem como a duração da resposta inflamatória. As citocinas, produzidas e secretadas por neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, mastócitos e o endotélio são as responsáveis por modular o destino do processo inflamatório (SAVILL et al., 2002; HANADA; YOSHIMURA, 2002; FREIRE; VAN DYKE, 2013). O processo inflamatório geralmente acompanha um grupo de sintomas específicos, no qual está incluída a dor, um mecanismo de defesa fisiológico para prevenir danos adicionais a um organismo vivo. Durante o processo inflamatório, a dor é um sinal de que o processo está instalado, ocorrendo devido a uma cascata de mediadores químicos e citocinas que estimulam e sensibilizam as terminações nervosas no local de lesão (RO; CHANG, 2005).

Neste contexto, no Brasil extratos obtidos de plantas medicinais têm sido amplamente empregados na prática clínica ao longo do tempo. Os extratos obtidos a partir de plantas medicinais possuem vários fito-constituintes, com diversificados efeitos biológicos, destes, a maioria ainda desconhecidos (KANDHARE et al., 2015). Um gênero de grande importância é o Tithonia, distribuído em vinte e três espécies, sendo Tithonia diversifolia (Helms.) A. Gray uma das espécies mais estudadas. Esta espécie é nativa do Sudeste do México e da América Central, sendo atualmente distribuída em todo o mundo, incluindo o Brasil (JÁTEM-

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LÁSSER; RICARDI; ADAMO, 1998). No Brasil, T. diversifolia é popularmente conhecida como “girassol mexicano” ou "arnica”. Essa espécie é amplamente utilizada, não só no Brasil, mas também em outros países, na medicina popular como terapia para o tratamento de diversos quadros de doença, principalmente os correlacionados com processos inflamatórios (JÁTEM-LÁSSER; RICARDI; ADAMO, 1998).

Cientificamente, diversos estudos demonstram que extratos e metabólitos secundários isolados de folhas e inflorescências de T. diversifolia exibem importantes efeitos biológicos como, anti-inflamatório (OWOYELE et al., 2004; CHAGAS-PAULA, et al., 2011) antimalárico (OYEWOLE, et al., 2008), citotóxico (KURODA et al., 2007), gastroprotetor (SÁNCHES-MENDOZA et al., 2011) antimicrobiano (LIASU; AYANDELE, 2008; OBAFEMI et al., 2006), quimiopreventivo (GU et al., 2002) e anti-hiperglicêmico (ZHAO et al., 2012; LI et al., 2013).

Com relação à atividade anti-inflamatória, dados da literatura reportam que uma frações do extrato de T. diversifolia é capaz de diminuir a migração de células polimorfonucleares para o foco de lesão (CHAGAS-PAULA, et al., 2011). No entanto, não há relatos na literatura que contemplem os mecanismos envolvidos neste processo de inibição da quimiotaxia de células polimorfonucleares para o foco de lesão. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo investigar o mecanismo do extrato etanólico obtido das partes aéreas de T. diversifolia sobre a inflamação induzida por LPS ou carragenina, bem como elucidar os mecanismos de ação sobre as propriedades de migração de neutrófilos e secreção de mediadores, além de investigar os efeitos antinociceptivos do extrato.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Investigar o efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto obtido

das partes aéreas de T. diversifolia sobre a inflamação inata.

2.2 Objetivos Específicos

a) Avaliar os efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a migração celular,

extravasamento plasmático e secreção de proteínas, IL-1, IL-6, TNF e CXCL1 no modelo de bolsa de ar induzido por carragenina;

b) Verificar in vitro os possíveis efeitos citotóxicos do extrato de T. diversifolia sobre a viabilidade de neutrófilos, e avaliar a secreção de mediadores químicos por neutrófilos estimulados com LPS;

c) Avaliar a citotoxicidade do extrato de T. diversifolia sobre células de fibroblasto murino L929 utilizando o ensaio de MTT;

d) Avaliar os efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a expressão das moléculas de adesão leucocitárias CD62L e CD18 em neutrófilos murinos estimulados por LPS;

e) Determinar in vitro os efeitos inibitórios do extrato de T. diversifolia sobre a quimiotaxia de neutrófilos induzida por fMLP;

f) Averiguar o potencial do extrato de T. diversifolia sobre a fagocitose in vitro de neutrófilos apoptoticos;

g) Avaliar o limiar mecânico de dor em animais tratados com o extrato de T. diversifolia e submetidos ao modelo de dor inflamatória induzida por carragenina;

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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Tithonia diversifolia: aspectos químicos e biológicos

A biodiversidade brasileira é considerada uma fonte inesgotável de

substâncias biologicamente ativas. Diante disto, sua preservação é fundamental tanto pelo valor intrínseco dessa imensa riqueza biológica quanto pelo seu enorme potencial para a geração de novos fármacos. Ademais, populações concentradas em zonas rurais do Brasil dependem da medicina popular e tradicional para o tratamento de diversas condições patológicas, como por exemplo cicatrização de feridas, processos inflamatórios em geral, infecções microbianas ou parasitárias, lesões de pele e úlceras gástricas (ARAÚJO, 1979; ALVES; ROSA, 2007; MAZZARI; PRIETO, 2014; ABREU et al., 2015).

Segundo Maione et al. (2015), nos últimos 10 anos mais de 600 espécies de plantas foram empregadas para o tratamento de doenças inflamatórias de forma empírica. Dessas, a partir da extração, isolamento e identificação fitoquímica, associado a estudos in vivo e in vitro, obteve-se 47 espécies de plantas medicinais e 52 compostos isolados identificados cientificamente. Várias espécies possuem atuação sobre diferentes consequências da inflamação, como por exemplo, Annona squamosa L. (Annonaceae) impedindo a degranulação de neutrófilos (YEH et al., 2005), Garcinia mangostana L. (Clusiaceae) modulando a expressão da enzima óxido nítrico sintase indutível (iNOS) e ciclo-oxigenase-2 (COX-2) (FU et al., 2014) e Achyrocline satureioides (Asteraceae) modulando a expressão de moléculas de adesão e a secreção de mediadores inflamatórios (BARIONI et al., 2013).

Atualmente, as pesquisas visando a obtenção de medicamentos anti-inflamatórios estão focadas em agir em mecanismos desencadeantes da própria e não apenas nos sintomas, mais especificamente na resolução do processo e com efeitos adversos mínimos. Os fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) e esteroidais (AIES) são eficazes no tratamento dos sintomas clínicos específicos e produzem atenuação da inflamação, no entanto abordagens se concentram na iniciação da resposta inflamatória e muitos deles apresentam efeitos adversos (ALESSANDRI et al., 2013; HEADLAND; NORLING, 2015). Neste contexto, a busca por novos

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tratamentos, que apresentem eficácia e segurança é extremamente importante.

Asteraceae é a maior família dentre as Angiospermae, e muitos membros dessa família demonstram ter atividade farmacológica, atribuídos a sua composição fitoquímica, como polifenóis, flavonóides e diterpenóides (ERTÜRK;DEMIRBAG, 2003). A espécie Tithonia diversifolia (Helms.) A. Gray, comumente conhecida como calêndula de árvore ou girassol mexicano, é uma espécie com ampla distribuição ao redor do mundo, sendo sua origem controversa. Acredita-se que essa planta seja nativa do México e da América Central, podendo se adaptar a diferentes tipos de ambientes, principalmente em áreas tropicais e subtropicais da América, África, Ásia e Oceania (CHAGAS-PAULA et al., 2012; SÁNCHEZ-MENDOZA et al., 2011; MORONKOLA et al., 2006). Esta espécie é muitas vezes cultivada como planta ornamental devido suas folhas espessas e grandes, assim como suas inflorescências amarelas (JÁTEM-LÁSSER; RICARDI; ADAMO, 1998), como pode ser visualizado na Figura 1.

Figura 1. Folhas e flores de T. diversifolia (Hemsl.) A. Gray.

Fonte: B. navez. Imagem capturada em 19 de maio de 2006, 17:32.

Conhecida como Arnica, "arnica selvagem” na Venezuela e “Arnica

de La Montana” no México, é usada como remédio por muitos grupos étnicos de diversos continentes. Na medicina tradicional americana, o suco obtido de suas hastes e folhas é usado para tratar abcessos (JÁTEM-

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LÁSSER; RICARDI; ADAMO, 1998), enquanto no México, esta espécie é usada oralmente para o tratamento de sintomas da malária e topicamente para tratar hematomas e dores musculares (HEINRICH et al., 1998). No México, o uso desta espécie é de longa data, e ainda tem sido relatado seu uso em civilizações indianas antigas, contra doenças dermatológicas aplicando o pó das folhas torradas em hematomas, feridas e infecções da pele (HEINRICH, 2000). Além disso, o fato de as folhas de T. diversifolia serem usadas na prática Ayurveda reflete a profundidade histórico/cultural desta espécie (GECK et al., 2017).

Muitas classes de metabólitos secundários, principalmente terpenóides, foram isolados de espécies pertencentes ao gênero Tithonia. Os principais constituintes químicos de T. diversifolia pertencem à classe de lactonas sesquiterpênicas (STLs), flavonóides e derivados de ácido trans-cinâmico (principalmente ácido cafeoilquínico) (ZHAO et al., 2012). A maior ocorrência de hidrocarbonetos mono e sesquiterpenos, especialmente α-pineno e β-cariofileno, componentes estes de óleos essenciais, são geralmente encontrados em folhas e inflorescências de T. diversifolia (MORONKOLA et al., 2007). Dentre os compostos isolados de T. diversifolia, destacam-se as tagitininas. As tagitininas são as STLs mais estudadas dentro do gênero devido seu amplo espectro de atividades farmacológicas, sendo primeiramente isolados de uma espécie identificada anteriormente como T. tagitiflora que proporcionou a obtenção de seis germacranolídeos com nome de tagitininas A-F (PAL; KULSHRESHTHA, RASTOGI, 1976), sendo A, C e F as mais estudadas (CHAGAS-PAULA et al., 2012) (Figura 2).

Os efeitos biológicos pela espécie T. diversifolia podem ser atribuídos aos seus compostos majoritários, como ácidos clorogênicos, flavonóides, saponinas e principalmente as STLs. Estudos realizados em linhagens celulares, micro-organismos e animais mostraram um amplo espectro de bioatividades para diferentes partes e extratos de T. diversifolia. Neste contexto, destacam-se os efeitos anti-inflamatório e analgésico conforme demonstrado na tabela 1 (TAGNE, MARINO, CONSTANTINO, 2018). Destacam-se ainda o efeito antimalárico (OYEWOLE, et al., 2008), citotóxicos (KURODA et al., 2007), gastroprotetor (SÁNCHES-MENDOZA et al., 2011) antimicrobiano (LIASU; AYANDELE, 2008; OBAFEMI et al., 2006), quimiopreventivo (GU et al., 2002) e anti-hiperglicêmico (ZHAO et al., 2012; LI et al., 2013).

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Tabela 1. Atividade anti-inflamatória e antinociceptiva de T. diversifolia.

Atividade Biológica Extrato/Substância Referência

Anti-inflamatória

Inibição de NF-κB EA

Diversifolina, éter metílico de diversifolina, tirotundina

LIN et al., 2013

RUNGELER et al., 1998

EEtOH BORK et al., 1996, 1997

Fase aguda e crônica EMeOH OWOYELE et al., 2004

Modulação de complemento

EEtOH 80% COS et al., 2002

Indução da proliferação de MN

EA HIRANSAI et al., 2016

Inibição da geração de NO em RAW264.7

↓ edema (carragenina e óleo de cróton)

EMeOH SIJUADE et al., 2016

↓ migração de neutrófilos LRE, PE e infusão CHAGAS-PAULA et al., 2011

Redução IL-8, IL-6 e TNF Taginina A ABE et al., 2015

Apoptose de neutrófilos Taginina C ↓ MPO por neutrófilos Taginina F ↓ edema EA LIN et al., 1993

↓ geração de ânion superóxido

Lactonas sesquiterpenicas

HERRERA et al., 2007

Inibição de COX-1 e 5-LOX

EEtOH CHAGAS-PAULA et al., 2015

Antinociceptivo

Placa quente e formalina EMeOH

OWOYELE et al., 2004

Placa quente e dor mecânica

EMeOH SIJUADE et al., 2016

EA: extrato aquoso; EMeOH: extrato metanólico bruto; EEtOH: extrato etanólico bruto; PE: extrato polar; LRE: extrato rico em lactonas sesquiterpênicas; WBC: White blood cells – leucócitos; MN: monócitos Fonte: Adaptado de Tagne et al., (2018).

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Figura 2. Estrutura química das três principais lactonas sesquiterpênicas obtidas de T. diversifolia.

a) Tagitinina C; b) Tagitinina F; c) Tagitinina A. Fonte: Abe et al., 2015.

T. diversifolia apesar de possuir diversos efeitos biológicos relevantes

e comprovados, apresenta potencial tóxico, o qual deve considerado. Um estudo realizado por Elufioye et al. (2009) demonstrou o potencial tóxico agudo do extrato etanólico. Neste estudo foi evidenciado de forma dose-dependente efeitos tóxicos sobre células hepáticas. Na menor dose avaliada (400 mg/kg) após 30 minutos da administração, foi verificado dano periportal de hepatócitos, com presença de vacúolos. Estes efeitos foram reversíveis nos tratamentos agudo, porém em doses repetidas estes efeitos podem ser irreversíveis. De fato, um estudo realizado por Passoni et al. (2013), utilizando extrato aquoso, demonstrou os efeitos tóxicos na dose de 100 mg/kg em estudo crônico de 90 dias. Foram observados efeitos tóxicos sobre células hepáticas e renais. Entretanto, no mesmo estudo, doses de 10 mg/kg foram consideras seguras. Ainda, o autor relata que os principais compostos que apresentam toxicidade são as STLs e os ácidos clorogênicos. Adicionalmente, neste mesmo estudo foi demonstrado que o extrato promove redução na contagem de leucócitos, incluindo neutrófilos, no sangue. No entanto, esse efeito pode ser associado com o seu potencial anti-inflamatório.

Como reportado, a espécie T. diversifolia apresenta uma série de efeitos biológicos importantes, no qual destaca-se seu efeito anti-

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inflamatório. Neste contexto, estudos que esclareçam o papel do extrato de T. diversifolia sobre os processos de recrutamento de neutrófilos para o foco de lesão são importantes para a elucidação do seu mecanismo de ação anti-inflamatório, visto o papel relevante deste tipo celular na indução do processo inflamatório.

3.2 Processo inflamatório: aspectos gerais

Como conceito geral, a inflamação é uma resposta fisiopatológica do

organismo frente a um agente lesivo ou estímulo que interfere na homeostasia do organismo, com o intuito de recuperar o equilíbrio por meio de estímulos locais e sistêmicos. A resposta inflamatória envolve uma coordenada cascata de eventos incluindo mecanismos moleculares, celulares e fisiológicos. Vários mediadores (citocinas, quimiocinas, proteínas do complemento, aminas vasoativas e eicosanoides como a prostaglandina E2) controlam o início, duração e intensidade do processo, assim como a diferenciação e migração das células do sistema imune. Tão importante quanto a eliminação do agente lesivo, é o controle dessa resposta inflamatória. Um processo descontrolado/exacerbado é componente da patogênese de uma série de doenças, como artrite reumatoide, asma, doenças inflamatórias intestinais e aterosclerose (GILROY; MAEYER, 2015; HEADLAND; NORLING, 2015; ORTEGA-GÓMEZ; PERRETTI; SOEHNLEIN, 2013).

Macroscopicamente a inflamação é caracterizada pelo aparecimento dos cinco sinais cardinais: calor, rubor, edema, dor e perda de função, sendo os quatro primeiros descritos no 1º século dC pelo médico romano Aulus Cornelius Celsus e o quinto sinal foi uma característica observada pelo patologista alemão Rudolf Virchow no século 19. A perda de função pode resultar de dor que inibe a mobilidade ou de inchaço grave que impede o movimento na área. De forma geral, o processo inflamatório pode ser iniciado de duas formas distintas, a saber: 1) quando há uma lesão, ou seja, rompimento de células sem o envolvimento de microrganismos, chamada de inflamação asséptica; 2) induzido pela presença de bactérias, vírus, parasitas ou fungos, chamada de inflamação séptica (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015).

Independente do agente indutor, o processo é caracterizado por vasodilatação (alterações na microcirculação, em especial nas vênulas pós-

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capilares), aumento da permeabilidade dos capilares, devido a contração das células endoteliais, extravasamento de proteínas plasmáticas para o interstício extra-vascular, ocasionado pela diferença de pressão osmótica entre os compartimentos e o recrutamento de células polimorfonucleares dos vasos sanguíneos para o foco de lesão (FREIRE; VAN DIKE, 2013; GREEN et al., 2004). Para direcionar o sistema imune, as células hospedeiras do tecido possuem receptores que identificam o que é “próprio” de “não-próprio” promovendo uma resposta a esses estímulos. Os padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) presentes nos microrganismos e os padrões moleculares associados a dano (DAMPs) são fundamentais para o desenvolvimento da resposta. (JANEWAY; MEDZHITOV, 2002).

O desenvolvimento da resposta depende da secreção de substâncias pelas células residentes no tecido, da circulação e da parede microvascular. Participam da inflamação aminas vasoativas, como a histamina, 5-HT e bradicinina; substância P; fator de ativação plaquetária (PAF); derivados do ácido araquidônico; óxido nítrico (NO2

-); citocinas; componentes ativos do sistema complemento; e fatores da cascata da coagulação (POBER; SESSA, 2014). A resposta inflamatória aguda é uma sequência de eventos complexos, dentre eles a regulação genética, processo fundamental para que células inflamatórias produzam e secretem seus mediadores inflamatórios. A regulação genética que conduz à secreção de citocinas pró-inflamatórias de uma variedade de células é geralmente dependente da ativação transcricional por uma proteína nuclear, o Fator Nuclear κB (NF-κB). A ativação desse fator de transcrição pode ocorrer, por exemplo, pela ligação de LPS nos receptores tipo Toll (TLR), ou de IL-1 e TNF em seus respectivos recptores presentes na superfície celular (KARIN; BEM-NERIAH, 2000; LAWRENCE, 2009), bem como pela administração de carragenina (BASU et al., 2017).

A primeira etapa da resposta inflamatória aguda se inicia quando o tecido é exposto a uma lesão, onde inicialmente macrófagos e células dendríticas são responsáveis pela produção de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1β, IL-6, TNF e IL-8. Essas glicoproteínas de baixo peso molecular agem tanto de forma autócrina quanto parácrina, estimulando a produção de mais citocinas e de outras proteínas denominadas quimiocinas, principalmente as da família CXC, conhecidas como alfa-quimiocinas. As quimiocinas são responsáveis pelo evento conhecido como quimiotaxia, ou

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seja, atração de leucócitos circulantes para o foco de lesão, um exemplo é a CXCL1 (PALOMINO; MARTI, 2015; SUGIMOTO et al, 2016).

Os primeiros leucócitos a atingir o foco de lesão são os neutrófilos. Os neutrófilos são leucócitos polimorfonucleares, provenientes da medula óssea, com um núcleo formado por 2 a 5 lóbulos ligados entre si. Representa cerca de 50 a 60% dos leucócitos circulantes totais em humanos e em torno de 9 a 34% dos leucócitos em murinos. Esses agem principalmente por meio de fagocitose e eliminam microrganismos estranhos por mecanismos de morte intracelular, pela composição de seus grânulos (aníon superóxido, mieloperoxidase, proteases e lactoferrinas) e/ou extracelulares, destacando-se a netose, mecanismo esse que neutrófilos expelem seus material genético para lisar o agente lesivo. Além desses mecanismos destaca-se o burst oxidativo promovido pela NADPH oxidase (KARIN; LOWRENCE; NIZET, 2006; HÄGER et al., 2010; MANTOVANI et al, 2011).

Os neutrófilos se originam de células tronco e desenvolvem-se em um processo chamado de granulopoiese, que ocorre na medula óssea. O fator estimulador de colônia granulocítica (G-CSF) regula o ciclo de vida do neutrófilo, aumentando a proliferação celular, sobrevivência, diferenciação, tráfego e mobilização para manutenção do pool medular e periférico (ATHENS, 1963). Durante um processo inflamatório, o número de neutrófilos aumenta de forma acentuada. Com alterações do fluxo sanguíneo pela ação de mediadores inflamatórios, os neutrófilos circulantes passam a marginar o endotélio microvascular inflamado. Para tal, os neutrófilos se aderem fortemente ao endotélio, para que não sejam arrastados pela circulação sanguínea e retornem ao lúmen do vaso. Os neutrófilos aderidos devem, então, ultrapassar a parede vascular e migrar para os tecidos subjacentes (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).

O processo de extravasamento dos neutrófilos pode ser dividido em quatro etapas sequenciais: (1) rolamento (rolling), (2) ativação por estímulos quimiotáxicos, (3) aprisionamento e adesão e (4) migração

transendotelial (Figura 3) (LEY et al., 2007). Para que esses eventos

ocorram é necessária a presença de receptores expressos nas membranas celulares, os quais são denominados de moléculas de adesão. A regulação positiva das moléculas de adesão, como as selectinas, no endotélio e nos leucócitos é essencial para iniciar o recrutamento. As citocinas e quimiocinas promovem a expressão de CD62E (E-selectina) e CD62P (P-

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selectina) e nos leucócitos circulantes promove a expressão de CD62L (L-selectina) (KOLACZKOWSKA et al., 2013; MANTOVANI et al., 2011; ORTEGA-GÓMEZ, A.; PERRETTI, M.; SOEHNLEIN, 2013).

O papel das selectinas no rolamento de neutrófilos é mediado pela L-selectina, P-selectina e E-selectina que irão interagir. Enquanto a L-selectina é expressa nos leucócitos, a P-selectina e E-selectina são expressas pelo endotélio vascular inflamado. A E-selectina expressa fará a ligação a L-selectina possibilitando a interação leucócito-leucócito, de forma que os leucócitos aderidos e fragmentos derivados desses leucócitos facilitarão a captura de um segundo leucócito, ou seja, atuando como uma "ponte" para a adesão de mais células (SPERANDIO et al., 2003). O envolvimento da selectina pode desencadear tanto sinais nas células que é expressa quanto na célula que expressa seu ligante. Esses sinais são transmitidos por meio da ativação de receptores acoplados a proteína G (GPCRs) e diretamente por meio da ligação da selectina, possibilitando o rolamento dessa célula (LEY et al., 2007). A ligação aos GPCRs resulta na rápida ativação da PLC, que promove aumento no fluxo de Ca2+ intracelular e à geração de inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O efluxo de cálcio do retículo endoplasmático promove a ativação dos filamentos de actina e miosina presentes no leucócito, permitindo o rolamento dessa célula. (CLEMENS; LOWELL, 2015; KRAUSE et al., 1990).

Para que ocorra a aderência dessas células no endotélio vascular é necessária a presença de alguns fatores quimiotáxicos, quando está em movimento de rolling o neutrófilo responde a algumas substâncias quimiotáxicas, como a interleucina-8 (IL-8), proteína inflamatória do macrófago (MIP), algumas anafilotoxinas (C5a, C3a e o C5b67), fatores de ativação de plaquetas (PAF), além de vários receptores de peptídeos formilados (FPR) produzidos pela degradação de proteínas bacterianas durante a infecção [N-Formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP)]. A interação entre esses fatores e os receptores presentes nos neutrófilos, como citado no parágrafo anterior, induz uma modificação conformacional em outro conjunto de moléculas de adesão, as integrinas, aumentando a sua afinidade com as moléculas de adesão da superfamília das imunoglobulinas,

no endotélio (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).

As integrinas medeiam a adesão leucocitária, sendo a principal integrina envolvida na adesão a β2-integrina ou CD18 (BERLIM et al., 1995). Essa interação entre integrinas e moléculas de adesão celular

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(CAMs) é o que permite a firme adesão dos neutrófilos ao endotélio para posterior transmigração através da parede do vaso, a qual pode ocorrer de duas formas: paracelular (entre células endoteliais) ou transcelular (através de uma célula endotelial) (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; VESTWEBER, 2015) (Figura 3).

Figura 3. Esquema representativo da migração celular de leucócitos para o foco de lesão.

Os quatro eventos principais para a migração do leucócito estão destacados em negrito: rolamento, que é mediado por selectinas, ativação que é mediada por quimiocinas e adesão, que é mediada por integrinas. A transmigração para o tecido está demonstrada de forma paracelular. Fonte: adaptado de Kolaczkowska et al., 2013; Ley et al., 2007.

Uma vez que a célula polimorfonuclear atravessa o epitélio vascular

ocorre a migração para o sítio inflamatório de forma orientada e seguindo um gradiente de moléculas que estão dispersas ou ligadas a essa matriz extravascular. Essas substâncias, chamadas quimiotáxicas ou hapoptáxicas irão induzir mecanismos intracelulares responsáveis pela motilidade, senso de direção e polaridade da célula (LI et al., 2005).

A migração de neutrófilos é dependente de uma cascata de eventos moleculares necessários para a movimentação celular. Vários mecanismos parácrinos contribuem para o feedback positivo de ativação de neutrófilos, incluindo o mediador lipídico LTB4, quimiocinas e o componente granular

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mieloperoxidase. Esses mediadores atuam em receptores diferentes, como o BLT1 para LTB4 e as quimiocinas e o fMLP em receptores acoplados à proteína G, além da atuação de integrinas e ativação de receptor tipo Toll. Estudos mostram que as células respondem de forma diferenciada aos vários agentes quimiotáxicos e a diferentes gradientes do mesmo. Por exemplo, neutrófilos respondem melhor in vitro a estímulos externos, como o fMLP, em comparação com outros agentes como LTB4 e IL-8 (SWANEY et al., 2010; LIU et al., 2012).

Muitos tipos celulares, como leucócitos e fibroblastos, são capazes de migrar, e para que essas células se locomovam em uma direção, necessitam além de um gradiente de quimiocinas, de um processo compreendido como polarização celular. De antemão, esses tipos celulares devem ter uma parte da “frente” e de “trás” definidas. A polaridade celular refere-se a diferenças espaciais na forma, estrutura e função dentro de uma célula, embora os detalhes bioquímicos possam variar, como alguns dos princípios centrais, como feedback negativo e/ou positivo entre diferentes moléculas são comuns e essenciais para muitos sistemas de polaridade conhecidos, nesse caso, contribuindo para a migração orientada do leucócito proporcionando a movimentação dessas células (RIDLEY et al., 2008; ALTSCHULER et al., 2008).

Incialmente, neutrófilos recebem os estímulos de agentes quimiotáxicos, que por sua vez atuam em receptores específicos na superfície celular. No caso do fMLP, ao se ligar ao receptor de peptídeos formilados do tipo 1 (FPR1) acoplado a uma proteína Gi, ocorre a dissociação das subunidades formadoras da proteína, em α e βλ, como resultado tem-se a rápida ativação de quatro vias principais: ativação de fosfatidilinositol-3-fosfato (PI3K); a ativação de uma família específica de quinases, as Rho GTPases (Rho e Rac); a ativação de proteína quinase C (PKC); e MAP quinase (MAPK) (FUMAGALLI et al., 2007; CHEN et al., 2009).

O acúmulo de PIP3 na parte “anterior” do neutrófilo leva a ativação do complexo WAVE1 pela Rac GTPase e consequente polimerização dos filamentos de actina que compreendem o lamelipódio da célula. Rac GTPases também são responsáveis por ativar NADPH oxidase promovendo a produção de ROS que resultam na inibição de PTEN (homologo de fosfatase e tensina) responsável por degradar PIP3, essa resposta amplifica a ativação do “polo dianteiro da célula (WEINER et al., 2002; WANG et al.,

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2002; WEINER et al., 2006; KUIPER et al., 2011). Outro mecanismo que contribui para a ativação desse polo da célula é a presença de ATP e adenosina, que ativam receptores puriginosos como o P2Y2 e A3, levando a polarização e migração de acordo com o gradiente quimioatrativo, respectivamente (CHEN et al., 2006). Já a parte “posterior”, é amparada pela Rho GTPase, que por sua vez resulta na contração dos filamentos de miosina, por meio da ativação de um segundo mensageiro, a quinase ROCK (XU et al., 2006) (Figura 4).

Figura 4. Esquema representativo da ativação molecular que proporciona a movimentação do neutrófilo

Loops de Amplificação de feedback intracelular e autócrino da função do neutrófilo estimulado com agente quimioatrativo e apresentando dois polos: “dianteiro” e “posterior”. Curiosamente, há uma inibição recíproca entre as características de "dianteiro" e "posterior", amplificando o processo de polarização. Fonte: adaptado de Németh & Mócsai, 2016.

A diferença de sinalização intracelular, que alterna entre o polo

dianteiro e posterior, é o que permite a movimentação da célula por meio da sua polarização. Ambos os mecanismos são ativados de forma não concomitante, ou seja, quando Rho/ROCK são ativadas, há inibição de Rac/PI3K/PIP3 (XU et al., 2006). As MAPK e PKC contribuem nesse processo de locomoção celular por meio da fosforilação de proteínas que resultam na ativação de fatores de transcrição, com consequente expressão de proteínas auxiliares nesse processo. As β2 integrinas medeiam a função de adesão ao endotélio e a matriz extravascular pelos neutrófilos, possibilitando a estabilidade dessa célula até a chegada ao tecido alvo (CHEN et al., 2009; MUELLER et al., 2010).

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Após a chegada no foco de lesão, neutrófilos geram substâncias químicas para potencializar sua ação microbicida e fagocítica, principalmente nos processos inflamatórios de longa duração. A principal enzima liberada pelos neutrófilos é a mieloperoxidase (MPO), a qual catalisa a formação do ácido hipocloroso que além de estar implicado na destruição de bactérias, pode induzir a danos teciduais. Embora o recrutamento de neutrófilos durante uma lesão seja essencial para a atividade do sistema imune inato, o recrutamento exacerbado promove um desequilíbrio nos processos inflamatórios, podendo ser prejudicial para o tecido (KEBIR et al., 2009; KLEBANOFF, 2005; NAUSEEF, 2007).

Embora exista a necessidade do processo inflamatório, e a presença de neutrófilos no local afetado, essa resposta precisa ser controlada, dessa forma inicia-se a segunda fase de uma resposta inflamatória, chamada resolução. Após exercer o seu papel no tecido, o neutrófilo entra em estado de apoptose, necessitando de um mecanismo de remoção, a fim de evitar danos provenientes do rompimento de membranas dessas células e extravasamento de substancias químicas tóxicas para o tecido. Consequentemente, a ausência do processo de resolução de forma completa leva a destruição tecidual mediada por neutrófilos e inflamação crônica, não ocorrendo assim, o retorno da homeostasia (ORTEGA-GOMÉZ; PERRETTI; SOEHNLEIN, 2013; VAN DYKE; SERHAN, 2003).

Na segunda etapa do processo inflamatório, para que o estado homeostático seja recuperado, são necessários que alguns eventos principais ocorram: a produção de mediadores pró-resolução que atuem na redução da migração de neutrófilos do sangue para o tecido, neutralização das vias de sobrevivência dessa célula no tecido e estimulo de vias de apoptose; eferocitose (fagocitose não flogística) dessas células por meio de ativação de macrófagos; reprogramação de macrófagos do estado pró-inflamatório para pró-resolução (STABLES, 2011).

Em geral, após 24 horas do início do processo inflamatório modifica-se o perfil de células migradas. Neutrófilos teciduais induzem a migração de monócitos ao liberar seus grânulos concomitantemente com proteínas como a azurocidina, LL37 e catepsina G, responsáveis por ativar receptores FPRs (formilpeptídeos) de monócitos em rolamento, promovendo a adesão e transmigração dessas células para o tecido. Observa-se então um número muito maior de células mononucleares em relação a neutrófilos no tecido. (SOEHNLEIN et al., 2010; ORTEGA-GOMÉZ; PERRETTI;

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SOEHNLEIN, 2013). A apoptose de neutrófilos no tecido é um dos eventos mais importantes no processo de resolução. Após exercerem seu papel no processo de remoção do agente inflamatório, essas células entram no estágio de morte programada, sendo a sua sobrevida de aproximadamente 18-24 horas. Mecanismos de sobrevivência celular atuam sobre os neutrófilos, impedindo as vias naturais de apoptose, como a atuação das caspases, sendo o principal fator de sobrevivência, a liberação de TNF por macrófagos teciduais inflamatórios (ORTEGA-GOMÉZ; PERRETTI; SOEHNLEIN, 2013).

Interessantemente, neutrófilos em apoptose liberam mediadores que inibem a migração de mais neurófilos para o tecido, como a Anexina A1, uma proteína abundante no citoplasma dessas células, que quando translocada para a membrana e ligada ao seu receptor promove a redução da adesão e migração de leucócitos (PERRETTI et al, 2002; DALLI et al, 2012). Ainda, neutrófilos em apoptose produzem um conjunto de sinais denominados de find me e eat me, responsáveis pela atração e reconhecimento por macrófagos que farão o clearance desse local. Os principais sinalizadores de find me, responsáveis pela atração dos macrófagos, são: lisofosfatidilcolina (LPC), esfingosídeo 1-fosfato (S1P) e nucleotídeos como ATP e UTP (ELLIOTT et al., 2009; GUDE et al., 2008; TRUMAN et al., 2008).

Após ser atraído aos neutrófilos é necessário um mecanismo de reconhecimento entre macrófagos e neutrófilos apoptóticos, a sinalização de eat me, responsável por esse reconhecimento entre as duas células ocorre por meio do principal peptídeo de reconhecimento derivado do domínio N-terminal da Anexina A1, a fosfatidilserina (PS) expressa na membrana é reconhecida por receptores como TIM4, BAI1, estabilina-2 e o receptor para produtos finais de glicação avançada, presentes na membrana do macrófago, para que em seguida ocorra a eferocitose da célula apoptótica (BLUME et al., 2012; HE et al., 2011; RAVICHANDRAN, 2011).

Macrófagos possuem uma plasticidade fenotípica, onde é observada mudanças na ação dessa célula dependente do estímulo que ela recebe. Antes da eferocitose, essa célula apresenta um fenótipo pró-inflamatório chamado macrófago M1, após, essa célula passa para um estado pró-resolução, secretando mediadores que contribuem para o reestabelecimento da homeostase, tornando-se o chamado macrófago M2 (ANDERS; RYU, 2011). Esse fenótipo M2 apresenta inibição na produção de citocinas pró-

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inflamatórias e de mediadores lipídicos inflamatórios, com concomitante aumento na transcrição de citocinas anti-inflamatórias, que se caracteriza principalmente pela liberação de IL-10, TGF-1β e fator de crescimento de células endoteliais (VEGF) (FADOK et al., 1998). Além disso, a presença durante a fase de resolução de mediadores lipídicos principalmente derivados do ácido araquidônico como, lipoxinas e os derivados de ácidos graxos insaturados, como as resolvinas, maresinas e protectinas colaboram para a correta cicatrização e reparo tecidual (MARTINEZ et al., 2006; ENOCH; LEAPER, 2008; FRANÇA, 2015).

Ademais, um processo inflamatório exacerbado e ainda a falta de mecanismos que promovam a sua resolução é essencial para a instalação de um processo crônico que por consequência levará a mais danos teciduais bem como uma maior dificuldade de tratamento. Baseado no exposto até o momento, torna-se imprescindível a busca por novas estratégias farmacológicas que atuem de forma eficaz nas fases iniciais da inflamação, e sabendo-se que o Brasil detém uma flora rica de espécies utilizadas popularmente, e com princípios ativos ainda não desvendados as plantas são assim consideradas um alvo interessante para a pesquisa e desenvolvimentos de novos fármacos anti-inflamatórios.

Assim como o processo de resolução da inflamação, o processo doloroso é necessário para prevenir danos adicionais ao hospedeiro (RO; CHANG, 2005). Visto como um sintoma clínico, a dor, é conceituada pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) como uma experiência sensorial e emocional desagradável associada ao dano tecidual real ou potencial, demonstra afetar a relação fisiológica e psicológica, por isso, tornando-se um alvo científico adequado ao longo da história e principalmente, nos dias atuais (LOESER; TREEDE, 2008).

A capacidade neural de reconhecer um estímulo nocivo, denominada nocicepção, é o processo pelo qual estímulos térmicos, mecânicos ou químicos intensos são detectados por uma subpopulação de fibras nervosas periféricas, e está intimamente relacionada a sensação de dor. Por meio dessas fibras, chamadas nociceptores é possível diferenciar os estímulos que ativam o sistema nervoso somatosensorial periférico. Os nociceptores são excitados apenas quando a intensidade de estímulos atinge o limiar nocivo, o que lhes permitem detectar e responder seletivamente a estímulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al., 2009).

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Para que haja o processamento da dor é necessário que ocorra um estímulo na periferia nas fibras nervosas sensoriais nociceptivas. Quando esse estímulo chega ao limite de gerar um potencial de ação é criado um impulso nervoso. Esse se propaga através da fibra aferente primária até o sistema nervoso central (SNC) (IASP, 2018). Localizados nos gânglios da raiz dorsal para o corpo do gânglio trigêmeo, os corpos celulares dos nociceptores, possuem ramos axonais periféricos e centrais inervando tanto órgãos alvo como a medula espinhal (BASBAUM et al., 2009).

As fibras somatossensíveis periféricas são divididas em 3 grandes grupos, conforme demonstrado na figura 5. O primeiro deles são as fibras A-α, A-β ou A-γ, que são fibras mielinizadas, de rápida condutibilidade, envolvidas em contato e cinestesia, mas não estão envolvidos com a percepção nociva. O segundo tipo são fibras A-δ que são finas e lentamente condutoras e estão envolvidos com a sensação de dor. Algumas têm um limiar alto, respondendo apenas a intensa estimulação mecânica, e outros também respondem ao calor tanto em temperaturas nocivas como não-nocivas. As fibras de A-δ geralmente estão envolvidas na sensação de dor aguda. O terceiro tipo é a fibra C, estas são pequenas, não mielinizadas, dessa forma possuem baixa condutibilidade, são mais finas e respondem a estímulos nocivos irritantes, mecânicos, térmicos e químicos, muitas vezes, envolvidos na sensação de dor crônica (WATSON, 1981) (Figura 5).

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Figura 5. Esquema dos diferentes tipos de neurônios sensoriais primários

Fonte: Adaptado de Julius e Basbaum, 2001.

A transmissão sináptica entre as fibras aferentes primárias e neurônios do corno dorsal da medula espinal é mediada por neurotransmissores, aminoácidos excitatórios e inibitórios (TOD, 2010). Na maior parte do organismo, as fibras C e A-δ transmitem a informação nociceptiva da periferia até o corno dorsal da medula espinal. Neurônios de primeira ordem localizados nesta região fazem sinapse com neurônios de segunda ordem, formam as vias ascendentes, sendo o tálamo (responsável por informar que existe a sensação nociceptiva) e o córtex (responsável por discriminar o tipo de sensação nociceptiva) as regiões finais de projeções das vias nociceptivas. Estes neurônios recebem seus sinais sensoriais pela liberação de glutamato e substância P dos neurônios aferentes primários. Este processo excitatório envolve canais de cálcio e principalmente liberação de neurotransmissores (KUNER, 2010; WOOLF, 2010).

As vias descendentes da nocicepção originam-se do tronco cerebral e outras estruturas como córtex, tálamo, núcleo magno da rafe (NMR), substância cinzenta periaquedutal (PAG) e estruturas adjacentes da medula rostral ventromedial (RVM) que interagem com o corno dorsal da medula espinal (BOURNE; MACHADO; NAGEL, 2014). O mecanismo descendente modula a resposta nociceptiva por meio da execução de suas

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reações, atuando sobre fibras aferentes primárias e neurônios intrínsecos do corno dorsal (KUNER, 2010).

Como resultado de lesão tecidual, reatividade imune anormal ou lesão nervosa, tanto a dor aguda quanto a dor crônica estão frequentemente associadas a processos inflamatórios (LARNER, 2014). A dor de origem inflamatória resulta da ação de um estímulo desencadeante (mecânico, químico ou térmico) ou de um mediador que ativa esses neurônios periféricos sensibilizados (BASBAUM, 2009). Dessa forma a hiperalgesia inflamatória é resultante de mudanças funcionais da excitabilidade neuronal induzida por mediadores inflamatórios liberados diretamente pelas células danificadas pelo trauma tecidual ou pelo reconhecimento de um elemento estranho ao organismo por células residentes, como macrófagos e células dendríticas (LINLEY et al., 2010).

Baseada em três etapas principais, a sensibilização inflamatória inicia-se com a liberação de mediadores devido ao dano tecidual, esses atuarão em receptores acoplados a proteína G ou a receptores de tirosina quinase nos terminais do nociceptor. A partir desse estímulo diferentes vias de sinalização são ativadas, culminando na fosforilação de receptores e canais iônicos. O resultado desses eventos resulta em uma mudança no limiar e cinética do nociceptor. Mediadores resultantes do processo inflamatório, como a PGE2, bradicinina (BK), fator de crescimento do nervo (NGF), 5-HT e histamina se ligam a receptores presentes no nociceptor. Esses mediadores atuam em receptores, atuando como transdutores situados em neurônios sensoriais para induzir mudanças complexas no processamento de sinal periférico e central. No caso da PGE2 e BK, ocorre a ativação de proteína quinase A (PKA) dependente de adenosina monofosfato cíclica (AMPc), a qual atua fosforilando canais de sódio e de potássio, facilitando o disparo da atividade elétrica da membrana neuronal e da proteína quinase C dependente de Ca2+/fosfolipídio (PKC) (CHUANG et al., 2001; GOLD; LEVINE; CORREA, 1998; MATSUMOTO et al., 2006). Todas essas alterações resultam no aumento de ativação celular gerando hiperalgesia.

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4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais e reagentes Agarose, solução tamponada com fosfato (PBS), carragenina

(lambda), corante giemsa, lipopolissacarídeo (LPS; sorotipo 026: B6), paraformaldeído, N-formil-metionil-leucilfenilalanina (fMLP), azul de tripan, 1- (4, O 5-dimetiltiazol-2-il) -3,5-difenilformazano (MTT), o glicogênio de ostra tipo II, reagente de Bradford, reagente de Griess, solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) foram adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O Meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEN) e o soro fetal bovino (BSF) foram adquiridos da Vitrocell (Campinas, SP, Brasil). Quetamina e xilazina foram adquiridas da Vetbrands (Paulínia, SP, Brasil). Todos os outros solventes foram de grau analítico. Os anticorpos anti-CD62L-ficoeritrina (PE) e anti-CD18-fluoresceína-isotiocianato (FITC) foram obtidos de BD Pharmigen (San Diego, CA, EUA). O TNF, IL-1, IL-6 e CXCL-1 foram quantificados usando kits comerciais da DuoSet R & D Systems (Minneapolis, MN, EUA). Os filtros de ar foram adquiridos da TPP (Swissterland).

4.2 Obtenção do material botânico e preparo do extrato de T.

diversifolia

As partes aéreas (folhas e caules) de T. diversifolia foram coletadas no

município de Itajaí (Latitude: -26.9083, Longitude: -48.6626) em agosto de 2017. A espécie foi identificada pelo botânico Renê Artur Ferreira, uma exsicata está em fase de preparo para deposito no Herbário Barbosa Rodrigues.

O extrato foi preparado sob supervisão da Profa. Dra. Ângela Malheiros no laboratório 308 do bloco E1 da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI). As partes aéreas foram colocadas para secagem em estufa de ar circulante por 7 dias. A produção do extrato foi dividida em duas extrações para melhor obtenção dos compostos presentes na planta, conforme apresentado na figura 5. Folhas e caules foram moídos

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manualmente onde obteve-se um peso seco de 80,715g. Após este processo o material vegetal foi colocado em maceração dinâmica por 6 horas a 700 rpm utilizando como solvente extrator etanol 95%. O extrato foi filtrado utilizando filtro de papel para retirada de resíduos e colocado em rota-evaporador a 60°C e em seguida na capela para secagem final do extrato. O resíduo da planta passou novamente por extração utilizando etanol 95%, em maceração estática por 6 dias. Foi realizado novamente o processo de filtragem, evaporação e secagem do extrato. Para o extrato da primeira maceração obteve-se um rendimento de 3,38g e para a segunda 2,49 g. Os dois extratos, ao final, foram misturados.

Figura 6. Fluxograma da obtenção do extrato de T. diversifolia.

Fonte: o autor.

4.3 Animais

Para realização dos experimentos, camundongos Swiss machos com 2

a 3 meses de idade e peso entre 25 e 35 g foram fornecidos pelo Biotério da

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Universidade do Vale do Itajaí - UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em salas com controle de temperatura (22-25ºC), umidade (40-60%) e ciclos controlados (claro/escuro, 12 horas cada), tendo ração e água ad libitum. Os animais foram ambientados por um período de 5 dias antes da realização dos experimentos. O projeto foi submetido ao comitê de ética de uso de animais (CEUA) da UNIVALI e aprovado sob o parecer nº 062/17. Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

4.4 Atividade anti-inflamatória in vivo - Inflamação no tecido subcutâneo dorsal (ensaio de bolsa de ar)

Um compartimento estéril denominado bolsa de ar foi desenvolvido

pela administração de 3 mL de ar estéril utilizando filtro (TPP Spritzen-Syringe-Filter 0,22 µm) acoplado a uma seringa no tecido subcutâneo da região dorsal de camundongos Swiss, os quais foram previamente anestesiados. Três dias após a primeira injeção de ar, um reforço foi realizado pela injeção de mais 3 mL de ar estéril, segundo o procedimento descrito por Sedgwick (1986) e por Jain e Parmar (2011).

Seis dias após a primeira injeção, os animais foram pré-tratados por via oral com extrato de T. diversifolia (0,1, 1 ou 3 mg/kg), indometacina (30 mg/kg, controle positivo) ou veículo solução tamponada de fosfato (PBS, controle negativo). Animais naive receberam somente PBS e a anestesia para a coleta do lavado da bolsa de ar, sem tratamentos farmacológicos. Uma hora após os tratamentos, uma solução de carragenina (1%) foi injetada diretamente na bolsa de ar. Quatro horas mais tarde, uma pequena incisão foi realizada na bolsa de ar para obtenção do lavado do infiltrado inflamatório.

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Figura 7. Linha do tempo para o experimento de bolsa de ar

Fonte: o autor.

4.4.1 Contagem total e diferencial de leucócitos e analise histológica

Com o conteúdo coletado da bolsa de ar, foram confeccionados esfregaços celulares para a contagem total e diferencial de leucócitos. Após o preparo dos mesmos, estes foram corados pelo método de May-Grünwald-Giemsa. A contagem celular diferencial (polimorfonucleares e mononucleares) foi realizada em microscópio óptico comum, com auxílio de objetiva de imersão (aumento de 1000 vezes), contando-se 100 células por lâmina. A contagem de leucócitos totais foi determinada em câmara de Neubauer. Os resultados foram expressos em número total de células por mL. Com o tecido da bolsa de ar foram realizadas analises histológicas. As lâminas foram preparadas utilizando a coloração de hematoxilina-eosina pela empresa Histocell (São Paulo).

4.4.2 Determinação de citocinas e proteínas no exsudato

As citocinas foram dosadas pelo método de ELISA de acordo com as

recomendações do fabricante. Foram avaliadas as seguintes citocinas: IL-1β, TNF, IL-6 e CXCL1.

A dosagem de proteínas foi feita pelo método de Bradford Este método é baseado na interação entre o corante Coomassie brilliant blue (BG-250) e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. 4.5 Atividade anti-inflamatória in vitro

32

4.5.1 Obtenção de neutrófilos migrados para o peritônio

Foram injetados 3 mL de solução de glicogênio de ostra (1%, i.p.) para estimular o recrutamento de leucócitos para cavidade peritoneal. Após um período de 4 horas, os animais foram novamente anestesiados e exsanguinados por secção da artéria carótida. Em seguida, 3 mL de PBS foram injetados na cavidade peritoneal e após suave massagem, as células foram removidas com auxílio de pipeta Pasteur. As células obtidas foram submetidas à centrifugação (600 g, 15 min, 4ºC) e o pellet formado foi ressuspendido em 1 mL de meio DMEN (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino. A quantificação total de neutrófilos foi feita em câmara de Neubauer. Um total de 1 x 106 neutrófilos foram adicionados por poço em placas de cultura de 96 poços, com volume final completado para 300 µL com meio DMEN, para obtenção da cultura celular empregada nos ensaios descritos abaixo.

4.5.2 Viabilidade celular (neutrófilos)

Para excluir possíveis efeitos citotóxicos do extrato de T. diversifolia sobre neutrófilos, ensaios de viabilidade celular foram realizados. Para tanto, neutrófilos foram mantidos em cultura por 18 horas com incubação simultânea de extrato de T. diversifolia (0,1, 1, 10 e 100 µg/mL) e LPS (5 µg/mL), em estufa de CO2 atmosfera úmida, a 37ºC 5% CO2. Vale ressaltar que este foi o maior período de incubação empregado neste estudo. Após o período de incubação, 10 µL de suspensão de neutrófilos foram acrescidos a 10 µL de azul de tripan e a quantificação das células viáveis (não coradas) foi realizada em câmara de Neubauer.

4.5.3 Determinação do NO e de citocinas

O NO foi indiretamente quantificado pela formação de seus

metabólitos nitrato (NO3-) e nitrito (NO2

-), utilizando a reação de Griess (GREEN et al., 1982). Para a quantificação indireta da produção de NO, neutrófilos foram mantidos em cultura por 18 horas com incubação simultânea do extrato de T. diversifolia (0,1, 1,10 e 100 µg/mL) estimulados ou não com LPS (5 µg/mL), em estufa de CO2. Após a incubação, a concentração de nitrito (NO2

-) foi determinada no sobrenadante das culturas

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de neutrófilos utilizando a reação de Griess (1% de sulfanilamida com 0,1% de α-naftiletilenodiamida, preparado no momento do uso) em placa de 96 poços.

A reação de NO2- com esse reagente produz uma coloração rósea, que

foi quantificada por meio da leitura das densidades óticas. Após 10 minutos de incubação em temperatura ambiente, a absorbância de cada amostra foi determinada em espectrofotômetro com comprimento de onda de 550nm. Curvas-padrão com concentrações previamente conhecidas de NO2

- (0 - 150 µM) também terão as densidades óticas determinadas, permitindo a quantificação dos valores de nitrito/nitrato, em µM, com auxílio da equação da reta.

No sobrenadante do cultivo de células foram mensurados os níveis de IL-1β, TNF, IL-6 e CXCL1 pelo método de ELISA, de acordo com o fabricando do kit. 4.5.4 Avaliação das moléculas de adesão

O efeito do extrato etanólico sobre a expressão de L-selectina e β2

integrina em neutrófilos foi investigado por citometria de fluxo. Neutrófilos foram obtidos do lavado peritoneal e incubados, na ausência ou presença do extrato aquoso de T. diversifolia (1, 10 ou 30 µg/mL), e simultaneamente estimulados ou não com LPS (5 µg/mL; 1 h). Subsequentemente, as células foram lavadas com PBS gelado e incubadas com anticorpo monoclonal anti-L-selectina conjugado com ficoeritrina (PE), ou anti-β2 integrina conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC), a 4°C durante 20 min no escuro. As células foram fixadas pela adição de solução de paraformaldeído (2%). As células foram então analisadas em citômetro de fluxo Accuri C6 (Becton e Dickinson, San Jose, CA, EUA), e dados de 10.000 eventos foram obtidos. Os resultados foram expressos como média de intensidade de fluorescência (MFI). 4.6 Ensaio de viabilidade celular (L929)

4.6.1 Linhagem celular e condições de cultivo

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As células utilizadas foram adquiridas do banco de células do Rio de Janeiro, fibroblastos murino linhagem NCTC clone 929 [L CELL, L-929], de origem de tecido conectivo adiposo. 4.6.2 Citotoxicidade (MTT)

As culturas celulares foram mantidas em estufa a 37 °C com 5% de

CO2. As células L929 foram plaqueadas (1x105) em microplacas de 96 poços e mantidas a 37°C com 5% de CO2. Após 2 horas, foram adicionados 10 µL do extrato de T. diversifolia (0,1, 1, 10, 100 µg/mL) Como controle positivo de citotoxicidade foi empregado dimetilsufóxido a 10% (DMSO). O crescimento celular foi revelado pelo ensaio de redução do (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-DiphenyltetrazoliumBr) (MTT) (Sigma Inc.). Após 21 horas de incubação a 37°C com 5% CO2 foram adicionados 10 µL de MTT (5 mg/mL) e a placa mantida mais 3 horas em estufa a 37°C e com 5% CO2. Ao término desse período, o sobrenadante foi retirado, e para a dissolução dos cristais de formazan formados pela redução do MTT foi adicionado 100 µL de DMSO. A densidade óptica (DO) de cada poço foi determinada em espectrofotômetro de microplacas em 570 nm (Asxys Expert Plus, Microplate Reader G020 150, Eugendorf, Salzburg, ÁUSTRIA) (BABICH; BORENFREUND, 1992; DENIZOT; LANG, 1986).

Os resultados em densidade ótica (DO) realizados em quadruplicata foram analisados após eliminação do background de migração das células de cada experimento, empregando como indicador a percentagem de migração foi calculada de acordo com Florão e colaboradores (2007).

4.7 Ensaio de quimiotaxia in vitro

Para a realização do ensaio foram utilizados neutrófilos obtidos de camundongos Swiss machos, recrutados com glicogênio de ostra, como previamente descrito anteriormente. Para realização do experimento foram utilizadas placas de 6 poços. Cada poço medindo 35 mm. Foi preparado um gel de agarose nas seguintes proporções: agarose (1,2%), HBSS (50%) e DMEN suplementado com 20% de SFB (50%). Foram colocados 3 mL de gel/poço. Após a solidificação, foram confeccionados poços no gel medindo 3,5 mm, em uma distância de 2,5 mm entre cada poço. Como agente

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quimiotáxico foi empregado fMLP na concentração de 0,1 µM. As células foram tratadas com extrato de T. diversifolia nas concentrações de 1, 10 e 100 µg/mL e em seguida colocadas nos poços laterais da placa na concentração de 1x107 cél/mL. Após 4 horas em estufa a 37°C, 5% CO2, o número de células migradas em direção ao poço central contendo o fMLP foi contabilizado (Figura 8).

Figura 8. Imagem representativa do poço do ensaio de quimiotaxia in vitro.

Os poços foram confeccionados com o auxílio de um punch e uma espátula. Neutrófilos foram colocados nos poços laterais (brancos), enquanto o agente quimiotáxico foi colocado no poço central (cinza). Fonte: O autor.

4.8 Ensaio de fagocitose in vitro

Os macrófagos foram obtidos através da lavagem do canal medular de

camundongos Swiss machos utilizando 2 mL de PBS gelado para lavagem de cada fêmur. O material coletado foi centrifugado, as células foram ressuspendidas em meio DMEN. A suspensão celular (1x107 células/mL) foi incubada em placa de 24 poços (30 µL/poço), sobre lamínula de vidro redonda, por duas horas, 37ºC com 5% CO2 para a aderência dos macrófagos. Após este período, os poços foram lavados três vezes com PBS estéril para a retirada das células não aderidas, e então foi adicionado o tratamento T. diversifolia (10 e 100 µg/mL). Após uma hora foram adicionados os neutrófilos senescentes (1x106 neutrófilos/poço).

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Os neutrófilos senescentes foram obtidos previamente da cavidade peritoneal de camundongos Swiss por meio da administração de glicogênio de ostra (1%, i.p.) e incubados em placa de 24 poços, com meio DMEN (1x106 neutrófilos/mL), por 18 horas a 37ºC com 5% CO2 para atingirem o estado de senescência. Após 30 minutos de incubação, o sobrenadante da cultura de eferocitose foi retirado e armazenado a -80ºC para posterior dosagem de TNF e IL-10. As lamínulas foram retiradas e lavadas 1 vez com PBS para retirada do excesso de neutrófilos senescentes e coradas com corante panótico. Posteriormente, as lamínulas secas foram coladas inversamente em lâminas de vidro com cola histológica. A leitura das lâminas montadas foi realizada em microscópio óptico com objetiva de imersão. Foram observados 200 macrófagos e o resultado da fagocitose de neutrófilos senescentes foi expressa em porcentagem. As dosagens de TNF e IL-10 foram realizadas pelo método de ELISA de acordo com as recomendações do fabricante.

4.9 Avaliação da atividade analgésica do extrato

4.9.1 Análise do limiar mecânico de dor através do filamento de von Frey

Os animais foram colocados individualmente em compartimentos de

acrílico transparente individuais (9 X 7 X 11cm) localizados em uma plataforma de arame elevada. Inicialmente, a frequência de resposta de retirada da pata posterior direita foi obtida através de 10 aplicações sequenciais do filamento de von Frey 0,6 g (VFH, Stoelting, Chicago, USA). Anotadas as frequências, os animais que obtiveram frequência de resposta menor que 50% foram estimulados com filamentos com gramaturas maiores, em escala logarítmica (1, 1,4, 2 e 4g), de forma crescente até obter-se 50% ou mais de resposta de retirada. Caso a frequência de retirada com o filamento de 0,6g tenha sido maior que 50%, o mesmo passa a ser estimulado com filamentos de menor gramatura (0,07, 0,16 e 0,4g) até obter 50% de resposta. O filamento no qual o animal respondeu no mínimo 50%, seguindo o método descrito acima, representou o limiar mecânico (Ex: 50% resposta com filamento 0,6g = limiar 0,6g) (COBO et al., 2012).

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4.9.2 Hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina

Para a indução da dor inflamatória, os camundongos receberam uma

injeção i.pl. de 50 µL de carragenina (300 µg/pata) na superfície plantar da pata posterior direita. Inicialmente, os animais foram pré-tratados com o T. diversifolia (3 mg/kg, v.o) ou indometacina (5 mg/kg), 1 hora antes da indução da hiperalgesia. Em seguida, os animais receberam uma injeção i.pl. de carragenina e então foram avaliados quanto à hiperalgesia mecânica através do monofilamento de von Frey, nos intervalos de 1, 3, 4 e 6 horas após a injeção de carragenina (WINTER; RISLEY; NUSS, 1962).

4.10 Análise estatística Os resultados obtidos nos experimentos foram expressos como média

± erro padrão da média (E.P.M.) e analisados estatisticamente por análise de variância com comparações múltiplas (ANOVA) e, quando necessário, foram utilizados como pós-teste o Teste de Tukey-Kramer ou Dunnett. Os dados foram analisados no programa GraphPadPrism, admitindo como significativamente estatístico o p<0,05. Os resultados obtidos neste estudo foram correlacionados com dados de estudos prévios reportados pela literatura.

38

5 RESULTADOS

5.1 O extrato etanólico de T. diversifolia diminuiu a migração de neutrófilos para o foco de inflamação induzida por carragenina

Foi avaliado primeiramente os efeitos do extrato de T. diversifolia

sobre a migração de neutrófilos in vivo, utilizando o modelo de inflamação induzida no tecido subcutâneo dorsal de camundongos com o uso de carragenina. Diferentes concentrações foram testadas, e o número de células migradas para a bolsa foi quantificado 4 horas após a injeção de carragenina ou PBS. Os dados apresentados na figura 9A demonstram que o extrato de T. diversifolia foi capaz de reduzir a migração de leucócitos para o local da inflamação de forma significativa nas concentrações de 1 e 3 mg/kg.

A redução na migração corresponde a um menor influxo de neutrófilos, como pode ser observado na figura 9B. O aumento de proteínas no espaço extravascular é uma consequência do aumento da permeabilidade vascular, desta forma a quantificação de proteína pode ser uma ferramenta interessante para avaliar a formação de edema. No entanto, quando avaliado o influxo de proteínas, não foi observada diferença significativa, demonstrando que o extrato não altera o volume da exsudação (Figura 9C).

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Figura 9. Efeitos do extrato de T. diversifolia no modelo de bolsa de ar induzida por carragenina

Bolsas de ar foram induzidas no tecido subcutâneo dorsal de camundongos Swiss. Os animais receberam tratamentos por via oral com extrato de T. diversifolia (0,1, 1 ou 3 mg/kg, p.o.), indometacina (30 mg/kg, p.o.), ou veículo uma hora antes da injeção de 2 mL de carragenina, o lavado do infiltrado inflamatório foi coletado 4 horas após a injeção de carragenina na bolsa de ar. A determinação do número total de células do exsudato (A) foi realizado em câmara de Neubauer por microscopia óptica e o valor diferencial (B) foi realizado em esfregaços corados com May-Grunwald Gimsa por microscopia óptica. (C) A dosagem de proteínas no exsudato foi mensurada pelo método de Bradford. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 6 animais em cada grupo. **p<0,01 e ***p<0,001 vs grupo controle. #p<0.05 vs naive.

A avaliação histológica demonstrou que a administração de

carragenina promove aumento no número de leucócitos nos revestimentos de pele e tecido que circundam a cavidade da bolsa (Figura 10). Embora a densidade celular não tenha sido quantificada dentro da membrana da bolsa de ar, uma diferença clara é visível entre as bolsas de ar de animais tratados com extrato de T. diversifolia e indometacina. Conforme observado nas inserções, o extrato diminui a infiltração celular nos revestimentos de pele e tecido que circundam a cavidade da bolsa (Figura 10). Esses achados, juntamente com os resultados demonstrados na figura 9, fornecem

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evidências adicionais de que a ação anti-inflamatória do extrato está intimamente relacionada ao bloqueio da migração celular. Visto que a concentração de 1 mg/kg do extrato T. diversifolia foi a melhor dose em relação a redução da migração celular, foram realizadas análises histológicas que comprovam microscopicamente a redução de leucócitos para o tecido inflamado quando comparado ao grupo controle (Figura 10). A análise histológica revelou a redução do número de leucócitos migrados para o tecido, bem como redução do edema no tecido conjuntivo.

Figura 10. Imagens histológicas do tecido subcutâneo dorsal de animais submetidos ao ensaio de bolsa de ar.

Bolsas de ar foram induzidas no tecido subcutâneo dorsal de camundongos Swiss. Os animais receberam tratamentos por via oral com extrato de T. diversifolia (1 mg/kg, v.o.), indometacina (30 mg/kg, v.o.), ou veículo uma hora antes da injeção de 2 mL de carragenina. O tecido da bolsa foi coletado 4 horas após a administração de carragenina. O tecido foi fixado, submetido

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a corte histológico e posteriormente corado pelo método de hematoxilina eosina (HE). Setas vermelhas indicam a presença de leucócitos, setas pretas tracejadas indicam edema.

5.2 O extrato de T. diversifolia reduz a secreção de TNF e IL-1β no exsudato inflamatório induzido por carragenina

Durante o processo inflamatório, mediadores químicos são secretados

pelas células residentes promovendo a resposta imune, bem como o influxo de neutrófilos. A fim de verificar a habilidade de T. diversifolia inibir a secreção de citocinas e quimiocinas, o exsudato foi coletado da bolsa de ar de animais tratados com T. diversifolia ou veículo, 4 horas após a injeção de carragenina na bolsa de ar. Foi avaliada apenas a menor concentração capaz de reduzir a migração celular, conforme dados apresentando na figura 9.

O extrato de T. diversifolia (1 mg/kg) foi capaz de reduzir de forma significativa as concentrações de TNF, IL-1β e CXCL1 no exsudato inflamatório (Figura 11 A, B e D), porém, não alterou os níveis de IL-6 (Figura 11C). É importante destacar que esse efeito foi similar ao encontrado para o fármaco indometacina (30 mg/kg).

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Figura 11. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a produção de citocinas no exsudato da bolsa de ar.

Bolsas de ar foram induzidas no tecido subcutâneo dorsal de camundongos Swiss. Os animais receberam tratamentos por via oral com extrato de T. diversifolia (0,1, 1 ou 3 mg/kg, p.o.), indometacina (30 mg/kg, p.o.), ou veículo uma hora antes da injeção de 2 mL de carragenina, o lavado do infiltrado inflamatório foi coletado 4 horas após a injeção de carragenina na bolsa de ar. A quantificação de citocinas foi realizada no exsudato pelo método de ELISA imunoensaio indireto e analisada a absorbância das amostras em espectrofotômetro. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 6 a 7 animais em cada grupo. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs grupo controle. #p<0,05 controle vs naive.

5.3 O extrato etanólico de T. diversifolia não afeta a viabilidade de neutrófilos e de fibroblastos (L929).

A citotoxicidade do extrato de T. diversifolia foi avaliada

primeiramente pela metodologia de exclusão por azul de Tripan utilizando neutrófilos coletados do peritônio de camundongos Swiss, pela metodologia de glicogênio de ostra. Foram contadas 100 células por amostra (total de 5/concentração). O grupo basal (célula + meio DMEN) apresentou uma viabilidade de 88% ± 1,8. O grupo LPS (célula + meio DMEN + 5 µg/mL LPS) apresentou uma viabilidade de 84,4% ± 2,1. Já o extrato nas concentrações utilizadas apresentou viabilidade, de 88,6% ±2,8 (0,1

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µg/mL), 85,2% ±2,7 (1 µg/mL), 90,6% ±1,1(10 µg/mL) e 84% ±4 (100 µg/mL), conforme demonstrado na figura 12A. Adicionalmente, foi realizado ensaio de MTT para verificar a citotoxicidade do extrato de T. diversifolia sobre fibroblastos murinos (L929). Os dados obtidos e apresentando na figura 10B demonstram que o extrato de T. diversifolia não apresenta citotoxicidade em todas as concentrações testadas (0,1 - 100 µg/mL), apresentando viabilidade média de 86,6%. Já o grupo controle tratado com DMSO, observou-se uma viabilidade média de 18%, conforme demonstrado na Figura 12B.

Figura 12. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a viabilidade celular de neutrófilos e fibroblastos murino (L929).

Neutrófilos foram obtidos da cavidade peritoneal de camundongos Swiss machos (glicogênio de ostra 1%, 4 horas). Neutrófilos (1x105) foram incubados na presença ou ausência de LPS (5µg/ml) juntamente com extrato de T. diversifolia (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL) por um período de 18 horas. A quantificação da viabilidade celular foi realizada pela técnica de exclusão com azul de trypan. Para neutrófilos, os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 5 animais em cada grupo. No ensaio de viabilidade utilizando MTT, fibroblastos foram incubados na presença do extrato de T. diversifolia (0,1, 1, 10 e 100 µg/mL) por um período de 21 horas. Após esse período as células foram incubadas por 3h com MTT. Para fibroblastos, os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 3 a 7 animais em cada grupo. ***p<0,01 vs grupo controle (DMSO 10%). #p<0,05 basal vs controle.

5.4 O extrato etanólico de T. diversifolia reduz a produção de citocinas e de NO2

- em neutrófilos estimulados com LPS Durante a inflamação, quando o neutrófilo se localiza no local da

lesão, ocorre a secreção de citocinas e NO2- por essa célula, com o intuito de

atrair mais células polimorfonucleares e combater o agente lesivo. Para

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avaliar este comportamento, neutrófilos foram obtidos por meio da injeção de glicogênio de ostra (1%) no peritônio de camundongos Swiss, as células foram coletadas e tratadas com extrato de T. diversifolia (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL) e mantidas em cultura por 18 horas, sendo estimuladas com LPS (5 µg/mL). Ao final de 18 horas, o sobrenadante da cultura foi coletado e utilizando o método de ELISA foram quantificadas as seguintes citocinas: TNF, IL-1β, IL-6 e CXCL1.

Os dados obtidos demonstraram que o extrato de T. diversifolia reduz de forma significativa a produção de TNF na concentração de 100 µg/mL, enquanto que para IL-1β houve redução significativa nas concentrações de 1, 10 ou 100 µg/mL e para IL-6 houve uma redução significativa nas concentrações de 0,1, 1 ou 10 µg/mL, conforme apresentado na figura 13A, B e C. Não foi observada diferença na concentração de CXCL1 (Figura 13D). No sobrenadante também foi mensurada a concentração de NO2

-. Os dados obtidos demonstraram que neutrófilos tratados com T. diversifolia apresentam marcadamente redução nas concentrações de NO2

- em todos as concentrações avaliadas (0,1, 1 ou 10 µg/mL), exceto na concentração de 100 µg/mL (Figura 14).

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Figura 13. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a produção de citocinas no sobrenadante de cultura de neutrófilos estimulados com LPS.

Neutrófilos foram coletados e estimulados ou não com LPS (5 µg/mL), e tratadas ou não com extrato de T. diversifolia nas concentrações de 0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL. A quantificação de citocinas foi realizada pelo método de ELISA imunoensaio indireto e analisada a absorbância das amostras em espectrofotômetro. (A) TNF, (B) IL-1β, (C) IL-6 e (D) CXCL1. Os valores expressam a média ± e.p.m. *p<0,05 e ***p<0,001 vs grupo LPS. #p<0,05 basal vs controle.

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Figura 14. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a produção de NO2- em

neutrófilos estimulados com LPS.

Neutrófilos foram obtidos da cavidade peritoneal de camundongos Swiss machos (glicogênio de ostra 1%, 4 horas). Neutrófilos (1x105) foram incubados na presença ou ausência de LPS (5 µg/mL) juntamente com extrato (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL) por um período médio de 18 horas. A quantificação de nitrito foi avaliada pela reação de Griess. Os valores expressam a média ± e.p.m. *p<0,05 e **p<0,01 vs grupo controle. #p<0,05 basal vs controle.

5.5 O extrato de T. diversifolia atua diretamente em neutrófilos, reduzindo a quimiotaxia e modulando a expressão de moléculas de adesão.

Para avaliar a ação direta do extrato de T. diversifolia nas propriedades

de locomoção do neutrófilo, foi realizado o ensaio de quimiotaxia in vitro induzido por fMLP. Na figura 15A é possível observar que neutrófilos não tratados respondem de forma significativa ao agente quimiotático fMLP, apresentando desta forma maior migração de células. No entanto, neutrófilos tratados com extrato de T. diversifolia apresentaram redução significativa frente ao estimulo quimiotáxico induzido por fMLP. Adicionalmente, demonstra-se que os dados foram dose dependente para esta avaliação.

A partir dos dados obtidos in vivo e in vitro, onde verificou-se a menor migração de neutrófilos, o próximo passo foi avaliar se o extrato atua de forma direta sobre a expressão de moléculas de adesão leucocitárias. A L-selectina (CD62L) e β2 integrina (CD18) no neutrófilo, medeiam a interação dessa célula com o epitélio vascular, e induzem a sinalização intracelular necessária para a migração dessa célula para o foco de lesão. Os

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dados apresentados na figura 15B e C demonstram que o extrato de T. diversifolia é capaz de reduzir a expressão de CD18 no neutrófilo de forma significativa, frente ao estímulo do LPS. No entanto não foi observada diminuição na expressão de CD62L. Juntos esses resultados demonstram que o extrato tem efeito sobre mecanismos responsáveis pela adesão, sem alterar o comportamento de rolling dos leucócitos.

Figura 15. Efeito do extrato de T. diversifolia na quimiotaxia de neutrófilos in vitro e na expressão das moléculas de adesão CD62L e CD18.

Camundongos Swiss foram estimulados com glicogênio de ostra (i.p.) promovendo quimiotaxia de neutrófilos. Para o ensaio de quimiotaxia in vitro (A) uma suspensão celular de neutrófilos (1x107) foi incubada com diferentes concentrações de T. diversifolia (1, 10 ou 100 µg/mL) durante 15 minutos e colocados frente ao estimulo do fMLP (1µM) sobre uma placa de agarose. As células foram contadas utilizando microscópio invertido no aumento de 20x. ***p<0,01 vs grupo veículo (fMLP, 1µM). Para o ensaio de moléculas de adesão neutrófilos foram coletados e estimulados ou não com LPS (5 µg/mL) e tratados ou não com extrato de T. diversifolia nas concentrações de 1, 10 e 30 µg/mL e posteriormente avaliadas a expressão das moléculas de adesão por citometria de fluxo. (B) CD62L/L-selectina. (C) CD18/β2 integrina. Os valores expressam a média ± e.p.m. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs grupo controle. #p<0,05 basal vs controle.

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5.6 O extrato de T. diversifolia promoveu a eferocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos

Com base nos resultados encontrados para inflamação, onde T.

diversifolia mostrou-se ativa em atenuar as fases iniciais do processo inflamatório, investigou-se a capacidade do extrato de T. diversifolia em agir na resolução do mesmo utilizando a metodologia de fagocitose in vitro de neutrófilos apoptóticos por macrófagos coletados da medula óssea de camundongos Swiss. A remoção de neutrófilos apoptóticos por macrófagos e de suma importância, além de reduzir a migração de neutrófilos, contribuiu para processo de recuperação da homeostasia no tecido inflamado. Para isso, foram avaliados dois eventos celulares: macrófagos realizando eferocitose ou não (Figura 16D e). Como demonstrado na figura 16A, T. diversifolia em concentrações de 10 e 100 µg/mL estimulou a eferocitose de neutrófilos apoptóticos. Além disso, promoveu redução nos níveis de TNF (Figura 16B) e promoveu aumento de IL-10 (Figura 16C), ambos dosados no sobrenadante da cultura durante a junção dos dois tipos celulares, contribuindo para o processo de resolução in vitro.

Figura 16. Efeitos do extrato de T. diversifolia sobre a eferocitose de neutrófilos apoptóticos

Foram empregados camundongos Swiss machos, os quais foram utilizados os fêmures para coleta de macrófagos. Após aderência dos macrófagos em placa de 24 poços, as células foram

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tartadas ou não com concentrações de 10 e 100 ug/mL de T. diversifolia. Em seguida os neutrófilos apoptóticos foram colocados em contato com os macrófagos tratados, onde permaneceram durante 25 minutos. Em seguida, o sobrenadante da cultura foi retirado e a lamínula que se encontrava no fundo de cada poço retirada para confecção das lâminas. A figura (A) representa o total de macrófagos fazendo fagocitose, (B) dosagem de TNF no sobrenadante da cultura, (C) dosagem de IL-10 no sobrenadante da cultura, (D) imagem microscópica de macrófagos fazendo fagocitose de neutrófilos apoptóticos representados pelo número 1, (E) imagem microscópica de macrófago em estado não fagocítico representado pelo número 2. As células foram contadas utilizando microscópio utilizando objetiva de 100x. Os valores expressam a média ± e.p.m. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs grupo controle. A avaliação estatística na dosagem de IL-10 foi realizada pelo Teste T * p= 0,05.

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5.7 O extrato de T. diversifolia reduz a dor inflamatória induzida por carragenina

A dor é considerada um sinal clássico de inflamação, sendo

ocasionada pela ativação de receptores presentes nos nociceptores localizados no local da inflamação por diferentes estímulos e mediadores durante o processo inflamatório. Para avaliar o efeito de T. diversifolia sobre a dor inflamatória foram injetados 300 µg de carragenina como agente algésico na pata direita de cada animal e a frequência e limiar mecânico de dor medido usando o monofilamento de Von Frey. Os animais receberam como tratamentos indometacina (5 mg/kg) e T. diversifolia (3 mg/kg). O extrato de T. diversifolia na concentração de 3 mg/kg reduziu a frequência de dor (Figura 17A) e aumentou o limiar de dor dos animais quando comparado ao grupo que não recebeu o tratamento (Figura 17B), demonstrando um grande potencial antinociceptivo para T. diversifolia.

Figura 17. Frequência e limiar de dor inflamatória induzida por carragenina e tratada com T. diversifolia

A dor inflamatória foi induzida pela injeção plantar de 300 µg/pata de carragenina, em camundonsgos Swiss fêmeos após tratamento com T. diversifolia (3 mg/kg) ou indometacina (5 mg/kg), sendo a frequência e limiar de dor mecânica medidos pelo monofilamento de Von Frey. (A) representa a frequência de dor apresentada pelos animais em diferentes intervalos de tempo; e (B) representa o limiar de dor em diferentes intervalos de tempo. Os valores expressam a média ± e.p.m. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs grupo controle.

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6 DISCUSSÃO

Empregando o modelo de inflamação induzida por carragenina foi

possível verificar que o extrato de T. diversifolia apresenta efeitos inibitórios sobre a migração de leucócitos, principalmente de polimorfonucleares, nas concentrações de 1 e 3 mg/kg, no entanto, sem alterar a permeabilidade vascular. Um estudo realizado por Cuzzocrea et al., (1999), propôs que o mecanismo inflamatório da carragenina está interligado com a produção de citocinas. Utilizando camundongos nocaute para IL-6 em modelo de pleurisia, foi possível observar que o grau de inflamação é significativamente atenuado na ausência dessa citocina regulatória, o mesmo foi observado quando empregou-se um antagonista de IL-6 previamente a injeção de carragenina. Esses achados indicam que a IL-6 endógena contribui para o desenvolvimento da inflamação induzida por carragenina. Essa citocina estimula a produção de outras citocinas com características inflamatórias, como TNF e IL-1β.

A ligação dessas citocinas aos seus respectivos receptores, leva diretamente a ativação do NF-κB, amplificando o processo inflamatório. Além disso, um estudo realizado por Basu et al., (2017) utilizando o edema de pata como base metodológica, observou que esse agente irritante induz a fosforilação do NF-κB e STAT3 e que a redução da expressão de COX-2 em células inflamatórias estimuladas por carragenina ou tecidos de pata de camundongo requerem a desativação de ambos fatores de transcrição (HOESEL; SCHMID, 2013). Ainda, Salvemini et al., (1996) destaca a importância na produção de NO para a geração de edema induzido por carragenina, uma vez que utilizando um bloqueador de iNOS o edema é significativamente reduzido (ARIAS-SALVATIERRA et al., 2011).

Esses dados corroboram com um estudo realizado por Chagas-Paula et al. (2011), que avaliou frações de T. diversifolia ricas em STLs, onde observou-se que o tratamento tópico com o extrato (0,05 e 0,5 mg) foi capaz de diminuir o edema de orelha induzido por óleo de Cróton, bem como a migração de leucócitos para o foco de lesão, porém sem alterar a exsudação inflamatória. Sugere-se, assim como no trabalho realizado por Chagas-Paula et al., (2012), que o extrato de T. diversifolia pode ser útil em processos que envolvam principalmente a migração celular e não em processos onde se

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tem como alvo a exsudação. Adicionalmente, a partir do tecido obtido da bolsa de ar, foram realizadas análises histológicas que comprovam a redução de leucócitos migrados para o tecido inflamado.

É visto também que TNF e CXCL1 são responsáveis pelo acúmulo de neutrófilos no sítio de inflamação, e que o excesso desse tipo celular neste local inflamado pode induzir a destruição do tecido. A diminuição na produção desses mediadores inflamatórios é então intimamente relacionada a progressão do processo inflamatório (CHEN et al., 2006; MENDES et al., 2014). Os resultados encontrados no presente estudo mostram que o extrato de T. diversifolia foi capaz de reduzir a migração celular e que isso pode estar relacionado a capacidade do extrato em reduzir a produção de citocinas pró-inflamatórias in vivo diretamente sobre macrófagos, uma vez que essa célula é responsável pela liberação inicial das citocinas e quimiocinas que estimulam a expressão das moléculas de adesão celular endotélio vascular.

As citocinas e quimiocinas são potentes glicoproteínas de baixo peso molecular, que tem como função principal mediar a comunicação intercelular podendo ser produzidas por vários tipos celulares, por exemplo, macrófagos e linfócitos principalmente, além de polimorfonucleares, células endoteliais e epiteliais, adipócitos e tecido conectivo. Estas moléculas orquestram uma variedade de processos que vão desde a regulação da inflamação local e sistêmica até a proliferação celular, metabolismo, quimiotaxia e reparo tecidual (DINARELLO, 2000; ZHANG; NA, 2007). Existem citocinas anti-inflamatórias e pró-inflamatórias e cada uma se ligará a um receptor específico, gerando uma cascata de sinalização que afetará a função celular. A maioria das citocinas é caracterizada por possuir meia vida curta e atuar de forma autócrina ou parácrina. Quando neutrófilos são expostos a um estímulo inflamatório, como a carragenina ou LPS, secretam citocinas como TNF, IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-12, além de aumentar a produção de quimiocinas, leucotrienos, prostaglandinas e proteínas do complemento. Todas estas moléculas em conjunto podem levar ao aumento da permeabilidade vascular e o recrutamento de células inflamatórias, como os neutrófilos (DINARELLO, 2007).

Os dados obtidos demonstraram que animais tratados com T. diversifolia na concentração de 1 mg/kg apresentam redução significativa nos níveis de IL-1β, TNF e CXCL1 conforme pode ser observado na figura 6. No entanto, não foi observada diferença significativa nos níveis de IL-6

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no exsudato. O TNF como agente pró-inflamatório, apresenta potente efeito pirogênico, sendo um dos primeiros mediadores da inflamação a aumentar em resposta a um patógeno. Além deste efeito, é responsável por induzir vasodilatação e aumentar a permeabilidade vascular. Já a IL-1β está relacionada a febre, redução do limiar de dor, vasodilatação e hipotensão. Outra importante propriedade pró-inflamatória da IL-1β é a sua capacidade de aumentar a expressão de moléculas de adesão, como ICAM-1 no mesênquima celular e VCAM-1 em células endoteliais (DINARELLO, 2011). A IL-6 atua como um pirógeno endógeno, induzindo a produção de PGE2 no cérebro, mas não no sangue periférico (DINARELLO et al., 1991).

Durante a inflamação aguda, monócitos, macrófagos e células endoteliais produzem IL-6, levando ao recrutamento de neutrófilos por meio da ativação de um subconjunto de quimiocinas e moléculas de adesão por células endoteliais, células musculares lisas e fibroblastos (MAUER et al., 2014). Neste contexto, o resultado encontrado in vivo para essa citocina, que não apresentou redução, pode estar relacionado ao fato de que a sua produção é também realizada no fígado, uma vez que esse órgão é responsável pela produção de algumas proteínas de fase aguda, como a IL-6, dessa forma pode estar ocorrendo uma compensação hepática em resposta a inflamação aguda em relação a esta citocina, captando assim, além da produção das citocinas pelas células inflamatórias, a produção hepática das mesmas.

Os dados obtidos com neutrófilos estimulados in vitro com LPS demonstraram que o extrato é capaz de promover uma redução significativa na produção de TNF, IL-1β e IL-6, resultado este que reforça aqueles encontrado por Abe et al., (2015) que testou três compostos isolados das folhas de T. diversifolia, Taginina A, C e F, utilizando neutrófilos in vitro, observando redução das mesmas citocinas, além de redução de CXCL1. A ligação do LPS ao receptor TLR-4 ativa vias intracelulares, dependente ou não da molécula adaptadora MyD88. Na via dependente de MyD88, o receptor de IL-1β associados a quinases 4 e 1 (IRAK-1 e IRAK-4) é recrutado para a molécula myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), onde resíduos de aminoácidos são fosforilados e recrutam o fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF-6).

Tanto o IRAK-1 quanto o TRAF-6 dissociam-se do receptor, o qual nesta condição ativa o complexo IKK, resultando na translocação dos

dímeros p50/p65 do NFκB para o núcleo. Além da ativação do NF-κB, a

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via dependente de MyD88 ativa proteínas quinases p38, ativadas por mitógenos (MAPK 38) e a quinase c-Jun-N-terminal (JNK). Na via independente de MyD88, o TLR-4 ativado recruta a molécula adaptadora

TRIF, levando à indução de IRFs e a translocação tardia de NF-κB. Ambas

as vias resultam na ativação do NF-κB, levando à síntese gênica de moléculas pró-inflamatórias, como citocinas, à expressão e ativação de enzimas, como a COX-2, expressão de moléculas de adesão e produção de NO2

- a partir da óxido nítrico síntase indutível (iNOS) (MIDWOOD et al., 2009; HE et al, 2013).

O mecanismo de atuação do extrato de T. diversifolia pode estar indo além da migração celular, sugere-se uma interferência no mecanismo de produção das citocinas, ou seja, atuando sobre fatores de transcrição pró-inflamatórios como NF-κB e STAT3, os quais podem ser ativados por LPS ou citocinas, o que leva a produção de mediadores que amplificam o processo inflamatório (HAYDEN; GHOSH, 2014). Além disso, outras possibilidade para a redução na concentração das citocinas avaliadas pode estar ligada ao extrato estar atuando diretamente na externalização do receptor TLR4, reduzindo a expressão desse receptor na superfície celular, ou seja, o neutrófilo não está sendo ativado pelo LPS, consequentemente não produzindo as citocinas inflamatórias. (VAURE; LIU, 2010).

A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) é fundamental para a progressão de muitas doenças inflamatórias. As ROS são produzidas por células que estão envolvidas na resposta de defesa do hospedeiro, tais como leucócitos. Grandes quantidades de " NO2

- inflamatório" das células mieloides são geralmente geradas com grandes quantidades de ânion superóxido (O2-). Estes dois podem formar peroxinitrito (ONOO-), que medeia os efeitos citotóxicos do NO2

-, tais como danos no DNA, oxidação de LDL, formação de isoprostano, nitração da tirosina, inibição da aconitase e respiração mitocondrial (BECKMAN, 1996; GUZIK; KORBUT; ADAMEK-GUZIK, 2003). O NO2

- participa de uma série de funções durante o processo inflamatório, dependendo a via em que é produzido suas ações podem ser benéficas ou maléficas. Produzido a partir da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) esse mediador exerce a função de potente vasodilatador, auxiliando no aumento da permeabilidade vascular e permitindo o extravasamento de líquidos para o tecido. Por outro lado, quando produzido pela óxido nítrico sintase indutível (iNOS), presente na maioria das células inflamatórias (macrófagos, neutrófilos, etc.) esse agente

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químico pode atuar de forma flogística, causando dano tecidual e a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (GUZIK, T.; KORBUT, R.; ADAMEK-GUZIK, 2003).

A estimulação com LPS em neutrófilos induz a ativação do receptor TLR4, desencadeando a ativação de vias intracelulares, entre estas a produção de NO2

- pró-inflamatório, por meio do aumento da transcrição de genes que darão origem a iNOS pela translocação das subunidades pró-inflamatórias do NF-κB a sua região específica do DNA. A quantificação de NO2

- foi realizada utilizando-se o método de Griess. Os dados obtidos demonstraram que o tratamento com T. diversifolia foi capaz de promover redução na produção de NO2

- por neutrófilos, resultado este que corrobora com um estudo realizado por Hiransai et al., (2016), que observou redução na produção de NO2

- em células RAW264.7 tratadas com extrato aquoso de T. diversifolia.

O presente trabalho, assim como outros trabalhos já publicados, cita que o extrato T. diversifolia pode inibir o influxo de neutrófilos em tecidos inflamados (INOUE et al., 2006; CHU et al., 2012); entretanto, os mecanismos diretos do extrato sobre as funções adesivas e locomotoras dos neutrófilos nunca foram demonstrados. Para responder esta pergunta foi realizado ensaio de quimiotaxia in vitro. A quimiotaxia é o mecanismo primário pelo qual os movimentos celulares são dirigidos dentro de organismos multicelulares e é um componente importante do desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e respostas imunes. A quimiotaxia envolve uma complexa cascata de eventos, formação de complexos de sinalização, polarização celular, ativação de moléculas de adesão e reorganização do citoesqueleto celular (HEIT; KUBES, 2003).

O primeiro método que permitia quantificar as células migradas através de quimiotaxia foi a câmara de Boyden, um marco histórico no estudo de quimiotaxia (BOYDEN, 1962). Contudo, esse ensaio foi mostrando limitações, pois somente um gradiente quimiotáxico podia ser gerado, a velocidade de migração celular e o caminho que as células tomavam não podia ser determinado, observações em tempo real não eram possíveis e gradientes quimioatrativos muito intensos eram formados (HEIT, KUBES, 2003). Afim de resolver esses problemas foi desenvolvido o método denominado under-agarose assay (NELSON; QUIE; SIMMONS, 1975). Utilizando este modelo, foi possível verificar que o extrato de T. diversifolia reduz acentuadamente, e de forma dose-dependente, a

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quimiotaxia de neutrófilos induzida por fMLP, sugerindo que os compostos presentes no extrato podem afetar a expressão ou afinidade do receptor de fMLP, ou as vias intracelulares induzidas por este agente.

O fMLP é um peptídeo quimiotáxico derivado de proteínas bacterianas ou de proteínas mitocondriais endógenas, e funcionalmente se liga ao receptor FPR1 (MARASCO et al., 1984). Constitutivamente expressa na superfície de neutrófilos quiescentes, a expressão do receptor de FPR1 é rapidamente regulada positivamente em resposta a muitos estímulos inflamatórios (DORWARD et al., 2013). A ligação ao receptor FPR1 resulta na ativação da proteína G tipo Gi. Ocorre a conversão de GDP para GTP induzindo a dissociação da subunidade α da subunidade βγ. A subunidade α é responsável pela ativação do fator de troca de nucleotídeo de guanina (GEFs). GEFs são proteínas envolvidas na ativação de GTPases pequenas. Essas proteínas, por sua vez, agem como interruptores moleculares em vias intracelulares de sinalização. Assim, GEFs induz a ativação das GTPases Rho (Rho, Rac e proteína de controle de divisão celular 42). Estes, por sua vez, regulam a produção de ROS através da formação do complexo NADPH oxidase, bem como influenciam a adesão de leucócitos, a transmigração, a polimerização de actina e a fagocitose (YE et al., 2009).

Com base na literatura, sabe-se que T. diversifolia possui uma composição fitoquímica rica em alcaloides, taninos, flavonoides, saponinas, terpenoides e fenóis distribuídos nas suas folhas, raízes e galhos. Essas diferentes classes de compostos já demonstraram atividades biológicas relevantes, dentre elas anti-inflamatórias (OLAYINKA et al., 2015). Contudo a síntese de metabólitos secundários por uma planta depende de vários fatores, como a radiação solar, temperatura, pluviosidade, humidade e nutrientes do solo (SAMPAIO et al., 2016). Dificultando a identificação de componentes bioativos em um extrato bruto. Os sesquiterpenóides, diterpenóides e flavonoides são consideradas as principais classes encontradas na espécie T. diversifólia, sendo as lactonas sesquiterpênicas os principais sesquiterpenos isolados. Até agora os principais compostos estudados dessa classe são as tagininas, principalmente taginina A, C e F (CHAGAS-PAULA et al., 2012).

Com base na potente ação do extrato de T. diversifolia na quimiotaxia de neutrófilos in vivo e in vitro, e na sua atividade sobre a secreção de mediadores inflamatórios, os próximos experimentos foram realizados para

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elucidar a ação do extrato sobre a expressão de moléculas de adesão, as quais são responsáveis pela interação leucócito-endotélio, tendo papel importante e fundamental nos fenômenos inicias do processo de influxo de neutrófilos no tecido inflamado. Desta forma, foram avaliadas duas principais moléculas de adesão envolvidas no processo de migração celular para o tecido inflamado: CD62L ou L-selectina e CD18 ou β2-integrina. A expressão destas moléculas no endotélio quiescente é baixa, no entanto, na vigência de um processo inflamatório suas expressões são aumentadas, promovendo assim a firme adesão dos neutrófilos no endotélio vascular e a sua posterior transmigração. Já na matriz extravascular, os leucócitos migram de forma orientada em direção ao foco de lesão em resposta a agentes quimiotáxicos secretados por células residentes (VESTWEBER, 2015).

Os dados obtidos claramente demonstram que o extrato não provoca alterações na expressão de CD62L, no entanto, é possível observar alterações na expressão de CD18, molécula de adesão responsável pela firme adesão do neutrófilo ao epitélio vascular. A partir destes dados, é possível sugerir que o extrato de T. diversifolia reduz a migração de células através do vaso por inibir a adesão do neutrófilo, não alterando o processo de rolamento da célula sobre o endotélio vascular. É importante destacar que durante a inflamação, células endoteliais são ativadas por citocinas inflamatórias para expressar moléculas de adesão e sintetizar quimiocinas que são apresentadas na sua superfície luminal (MIDDLETON et al., 1997). Para que o leucócito possa aderir ao epitélio vascular é necessário que a CD62L expressa na membrana leucocitária seja clivada, permitindo a expressão das integrinas. A CD62L é uma glicoproteína transmembrana que medeia a interação adesiva inicial dos leucócitos com o epitélio vascular, proporcionando o movimento de rolling, sendo clivada rapidamente a partir da superfície de leucócitos ativados pela enzima de conversão do fator de necrose tumoral-α (TACE/ADAM17), uma metaloprotease de superfície celular (ZHAO et al., 2001), sendo sua expressão dependente dos níveis TNF (KERMARREC et al., 2005).

Os resultados encontrados tanto in vivo quando in vitro demonstram redução na concentração de TNF, sugerindo que essa redução possa estar relaciona a expressão CD62L. O resultado apresentado demonstra que não houve diminuição na expressão de CD62L sugerindo que compostos presentes no extrato de T. diversifolia possam estar interagindo e alterando a

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função de enzimas responsáveis pela clivagem dessa molécula de adesão. Sabe-se que uma resposta inflamatória persistente é a chave para o desenvolvimento da inflamação crônica, assim a resolução do processo é fundamental para recuperação da homeostase tecidual. A apoptose de neutrófilos e eferocitose dos mesmos são cruciais para a resolução bem-sucedida da resposta inflamatória aguda (ORTEGA-GÓMES; PERRETTI; SOEHNLEIN., 2013). A partir dos resultados encontrados in vivo e in vitro que demonstraram que T. diversifolia controla a exacerbação do processo inflamatório por diferentes mecanismos, investigou-se sua possível interação na resolução da inflamação. Durante a fase de resolução um segundo fenótipo de macrófagos é expresso, como citado anteriormente, o macrófago M2 é encontrado após a fagocitose de neutrófilos apoptóticos. Neutrófilos entram em apoptose após, em média, 18 horas no tecido, e iniciam uma cascata de sinalização responsável pela atração, reconhecimento e eferocitose pelos macrófagos (GUDE et al., 2008; ELLIOT et al., 2009).

Sabe-se que a resolução da inflamação é um processo controlado por mediadores endógenos anti-inflamatórios e pró-resolução e a mudança fenotípica dos macrófagos acompanha esses mecanismos pela produção de mediadores lipídicos com característica anti-inflamatória, como por exemplo, as resolvinas, responsáveis por estimular a eferocitose e resolução do processo por meio da inibição da produção de TNF (SERHAN et al., 2011; LEE et al., 2013). O extrato de T. diversifolia demonstrou promover a eferocitose e reduzir o nível de TNF de forma significativa no sobrenadante da cultura. Um dos mediadores que proporcionam a sobrevivência de neutrófilos é o TNF secretado por macrófagos do tipo M1, assim a redução dessa citocina pode estar associada a redução desse fenótipo celular no sítio inflamatório, como também ao aumento de resolvinas produzidas por macrófagos M2. Ainda, é importante destacar que esse mediador lipídico atua na inibição da translocação do NF-κB pró inflamatório, como sugerido por Lee et al., (2013). Ainda, o aumento na concentração de macrófagos anti-inflamatórios M2 é caracterizado pelo aumento de mediadores que contribuem para o reparo tecidual, destacando-se aqui o aumento de IL-10, que corrobora com a fase de resolução. Além disso, sabe-se que essa citocina é responsável por limitar a resposta inflamatória que poderia causar dano tecidual, em partes pelo bloqueio da ativação de NF-κB e induzindo a

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produção de mais mediadores de reparo (MOSSER; ZHANG, 2008; SANJABI et al., 2009).

Dados da literatura sugeriam que T. diversifolia poderia estar atuando como analgésico em processos inflamatórios. Estudos utilizando o extrato metanólico de T. diversifolia em concentrações que variavam de 50 a 200 mg/kg, observaram que nos modelos utilizados o extrato foi capaz de inibir a dor induzida por carragenina e formalina utilizando como testes a placa quente e teste de pressão, destaca-se ainda, como citado na revisão, que T. diversifolia apresenta efeitos tóxicos a partir de 10 mg/kg (OWOYELE et al., 2004; SIJUADE et al., 2016). Baseado nos resultados encontrados in vivo para a inflamação, foi investigado o potencial antinociceptivo do extrato etanólico de T. diversifolia na mesma concentração que apresentou melhor potencial anti-inflamatório, 3 mg/kg. Utilizando como modelo de dor inflamatória a carragenina, foi observada de forma significativa a redução na frequência e aumento no limiar de dor mecânica dos animais testados pelo monofilamento de Von frey, quando comparado aos animais que não receberam o extrato. Como a concentração utilizada está muito abaixo do que é relatado na literatura para o extrato, sugere-se novos estudos sobre a atuação de T. diversifolia nos mecanismos relacionados à dor inflamatória.

Com base nos estudos anteriores relacionados a mecanismos moleculares a produção de mediadores pró-inflamatórios e a presença de compostos bioativos na composição do extrato de T. diversifolia elucidada até o momento, os resultados do presente trabalho corroboram com a literatura, além de ampliar as possibilidades de atuação do mesmo.

7 CONCLUSÃO O extrato de T. diversifolia foi capaz de reduzir a migração de

neutrófilos para o sítio inflamatório, sendo esse efeito associado a capacidade de reduzir a expressão da molécula de adesão CD18. Também demonstrou redução dos níveis de TNF, IL-1β e CXCL1 no exsudato inflamatório. Ademais, in vitro utilizando neutrófilos, o extrato reduziu a secreção de TNF, IL-1β, IL-6 e NO2- por essa célula, além de reduzir a quimiotaxia in vitro de neutrófilos estimulados por fMLP. O extrato também demonstrou atuar na resolução da inflamação e como um potente analgésico no processo inflamatório induzido por carragenina. Em

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conjunto, os dados obtidos a partir dos estudos in vivo e in vitro demonstram o mecanismo de ação anti-inflamatório do extrato de T. diversifolia nas fases iniciais e de resolução do processo inflamatório, bem como no processo doloroso induzido pela inflamação, conforme pode ser observado na figura 18.

Figura 18. Resumo gráfico das ações anti-inflamatórias de T. diversifolia

Durante a resposta inflamatórias, neutrófilos são recrutados, e para atravessar o epitélio vascular precisam da interação entre moléculas de adesão como a CD18, que teve sua expressão reduzida quando células foram tratadas com T. diversifolia, este processo parece ser o mecanismo responsável pela redução do número de neutrófilos no exsudato inflamatório induzido por carragenina. T. diversifolia também foi capaz de diminuir a produção de citocinas no exsudado (TNF, IL-1β e CXCL1) e reduzir a produção diretamente em neutrófilos estimulados com LPS (TNF, IL-1β, IL-6 e NO2

-). Ainda, o extrato mostrou reduzir a ação quimiotáxica do fMLP, estimular a eferocitose e reduzir a dor inflamatória induzida por carragenina.

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Anexo A. Parecer de aprovação do projeto de pesquisa pelo Comitê de Ética para Uso de Animais da UNIVALI.