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ANÁLISE E CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DA PIABANHA

Brycon insignis STEINDACHNER, 1877 (PISCES, CHARACIDAE)

EDUARDO SHIMODA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

FEVEREIRO - 2004



EDUARDO SHIMODA

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal

Orientador: Prof. Dalcio Ricardo de Andrade

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ FEVEREIRO - 2004



EDUARDO SHIMODA

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal

Aprovada em 27 de fevereiro de 2004

Comissão Examinadora

_____________________________________________ Prof. Manuel Vazquez Vidal Junior

_____________________________________________

Prof. José Frederico Straggiotti Silva

_____________________________________________ Prof. Hugo Pereira Godinho

_____________________________________________ Prof. Dalcio Ricardo de Andrade

Orientador

ii

Á minha mãe Yukiko,

ao meu pai Jin,

aos meus irmãos Cláudio e Daniel,

à minha noiva Karla,

ao meu orientador Dalcio,

DEDICO

iii

AGRADECIMENTO

Expresso meus agradecimentos a todos que direta e indiretamente colaboraram na

realização deste trabalho.

Em especial, agradeço:

Ao prof. Dalcio Ricardo de Andrade, pela competente orientação e colaboração e

pela, não menos presente e importante, amizade, compreensão, estímulo e

cobranças, na vida profissional/acadêmica e na vida pessoal.

Ao doutorando e amigo Manuel Vazquez Vidal Júnior, pela amizade, pelas

sugestões e auxílio na co-orientação.

Ao amigo George Shigueki Yasui, pela amizade, pelas sugestões e auxílio na coleta

dos dados.

À Pós-Graduação em Produção Animal da Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, pela oportunidade concedida.

À FENORTE e à FAPERJ, pelo apoio financeiro para realização dos experimentos.

iv

À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Projeto Piabanha,

especialmente ao amigo Guilherme Souza, pelas instalações, animais,

equipamentos e funcionários, cedidos para realização deste trabalho.

Aos professores José Frederico Straggiotti Silva, Hugo Pereira Godinho, pela

amizade, sugestões e auxílio na orientação dos trabalhos.

Aos técnicos Carla, Fausto, Vânia, Cláudio, Acácio, pela amizade e pronta

disponibilidade no empréstimo de equipamentos.

A minha noiva Karla Rangel Ribeiro, pelo convívio, amizade e paciência.

Aos amigos Rodrigo Brandão Barreto, Hebert Vasconcelos, Paulo (LMGA), Roberto,

Antônio Peixoto Albernaz, José Leonardo Gualberto Ramos, Ioanes Sideres,

Apóstolos Sideres Júnior, Antônio Guerra, Douglas Vitoi, Gerson Nakazato, Luiz

Alberto de Nardi, dentre outros, pela amizade e convívio.

Aos professores e funcionários da Universidade Estácio de Sá, da Facastelo, do

CEFET, da FAETEC – João Barcellos Martins, do Sistema Educacional Único, dos

Cursos Pré-Vest/UENF e Opção 1, dos Colégios Salesiano, PA, Batista, CEFA,

Alpha, Pró-Uni/Anglo, Vest/Exame, pela amizade e convívio.

Aos meus alunos e ex-alunos, pelo grande aprendizado que me proporcionaram.

A todos que, por um momento de descuido e esquecimento indesculpável não foram

citados, mas que contribuíram sobremaneira para que eu pudesse chegar até aqui, e

que merecem minha eterna gratidão.

v

BIOGRAFIA

EDUARDO SHIMODA, filho de Jin Shimoda e Yukiko Shimoda, nasceu em

Campinas, SP, em 19 de março de 1973.

Em dezembro de 1990, formou-se auxiliar técnico Bioquímico pela Escola

Técnica Estadual Conselheiro Antônio Prado, Campinas, SP.

Em dezembro de 1995, graduou-se em Zootecnia pela Universidade Federal

de Viçosa, Viçosa, MG.

Em março de 1999, obteve o título de mestre em Produção Animal, na área

de Nutrição e Produção Animal, pela Universidade Estadual do Norte Fluminense,

Campos dos Goytacazes, RJ.

Em março de 1999, foi admitido no Programa de Pós-Graduação em

Produção Animal, em nível de Doutorado, da Universidade Estadual do Norte

Fluminense, realizando seus estudos na área de Nutrição e Produção Animal.

Em agosto de 1999, ingressou na Universidade Estácio de Sá e na

Faculdade de Castelo (ES), onde leciona até hoje.

Em 27 de fevereiro de 2004, submeteu-se aos exames finais de defesa de

tese.

vi

CONTEÚDO

RESUMO..........................................................................................................viii

ABSTRACT ......................................................................................................x

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................012

1.1. IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO SÊMEN DE PEIXES .......................012

1.2. SITUAÇÃO ATUAL DE ESPÉCIES DA BACIA DO RIO PARAÍBA

DO SUL .................................................................................................014

1.3. A PIABANHA.........................................................................................015

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................017

CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA E ESPERMATÓCRITO DO

SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis CULTIVADA EM TANQUES .............019

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................021

2. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................025

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................027

4. CONCLUSÕES.............................................................................................032

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................033

MOTILIDADE ESPERMÁTICA NA PIABANHA Brycon insignis:

EFEITOS DA OSMOLARIDADE E DA INDUÇÃO HORMONAL COM

EXTRATO BRUTO DE HIPÓFISE E UTILIZAÇÃO DO ANALISADOR

DE MOTILIDADE ESPERMÁTICA ASSISTIDA

vii

POR COMPUTADOR (CASA)..........................................................................037

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................039



4. CONCLUSÕES.............................................................................................057


ANÁLISE QUÍMICA DO PLASMA SEMINAL DA PIABANHA Brycon insignis..063

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................065



4. CONCLUSÕES.............................................................................................078


DETERMINAÇÃO DA RAZÃO ÓTIMA DE ESPERMATOZÓIDES

POR OVÓCITO NA PIABANHA Brycon insignis ..............................................085

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................087



4. CONCLUSÕES.............................................................................................097


CONSERVAÇÃO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis POR

RESFRIAMENTO A 4oC E POR CONGELAMENTO EM N2 LÍQUIDO.............101

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................104



4. CONCLUSÕES.............................................................................................118


viii

RESUMO

SHIMODA, EDUARDO. D.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Fevereiro/2004. Análise e criopreservação do sêmen da piabanha Brycon insignis Steindachner, 1877 (Pisces, Characidae). Dalcio Ricardo de Andrade (orientador), Manuel Vazquez Vidal Júnior, José Frederico Straggiotti Silva e Hugo Pereira Godinho.

A piabanha é uma espécie de peixe da bacia do rio Paraíba do Sul cuja população

vem escasseando rapidamente nos últimos anos. As estratégias atuais para

conservação da espécie consistem na implantação de centros de reprodução que,

embora permitam o repovoamento, trabalham com poucos reprodutores. Em

decorrência disto, verifica-se perda da biodiversidade genética. O objetivo deste

trabalho foi estudar aspectos relacionados à análise seminal e à conservação do

sêmen da piabanha Brycon insignis. Quanto à análise microscópica, foi verificada

concentração espermática média de 24,38 x 109 espermatozóides/mL e

espermatócrito de 16,14%. Os dois parâmetros se correlacionam significativa

(P<0,01; R2 = 75,9%) e positivamente segundo a equação de regressão:

� �14,01.109 + 0,6428.109.X. Verificou-se que o peso e o comprimento-padrão da

piabanha não têm influência sobre a concentração espermática ou sobre o

espermatócrito. No que se refere à motilidade, observou-se que os espermatozóides

da piabanha não são ativados quando diluídos em soluções que contenham

concentrações de NaCl superiores a 1,2%, podendo estas serem utilizadas em pré-

diluições não ativadoras da motilidade. Com base nesta informação foi testada uma

metodologia de análise subjetiva da motilidade em duas etapas, consistindo em (1)

ix

uma pré-diluição não ativadora da ordem de 1:100 (20 µL de sêmen diluídos em 2

mL de NaCl 1,2%) e (2) uma diluição ativadora da ordem de 1:5 (50µL da pré-

diluição + 250 µL de NaHCO3 1%), sendo, desta maneira, possível observar os

espermatozóides de forma individualizada e a ativação de todos simultaneamente.

Verificou-se, ainda, que a indução hormonal com extrato bruto de hipófise de carpa

aumenta a motilidade espermática subjetiva no sêmen da piabanha, quando esta foi

inferior a 80% antes do tratamento. Para evitar subjetividade na análise da

motilidade, foi adaptada uma configuração do analisador de motilidade

computadorizado para análise do sêmen de piabanha, que permite a obtenção de

parâmetros como percentual de espermatozóides móveis, percentual de

espermatozóides progressivos e freqüência de batimento flagelar. No que diz

respeito à capacidade fecundante do sêmen, foram testadas várias proporções

espermatozóides por ovócito, sendo encontrada a proporção ótima de 314.428 de

espermatozóides por ovócito. Ainda com relação à caracterização do sêmen, foi

procedida a análise química do plasma seminal da piabanha, sendo obtidos os

seguintes resultados: pH = 8,47±0,286; [K+] = 36,1±2,72mM; [Ca+2] = 0,96±0,088mM;

[Mg+2] = 0,89±0,073mM; [Na+] = 67,1±4,00mM; [Cl-] = 85,0±3,56mM; Osmolaridade

286,9±24,6mOsm; [proteína] = 1,02±0,168mg/mL. Outro objetivo do trabalho foi

verificar a possibilidade de conservação do sêmen por resfriamento e por

criopreservação. Foi possível manter o sêmen resfriado a 4 oC por até 4 horas sem

que ocorresse perda de viabilidade. Quanto à criopreservação, verificou-se que a

proporção de 1 parte de sêmen para 5,2 partes de diluente (DMSO 10%, gema de

ovo 10% e glicose 5%) é a recomendada para o sêmen de piabanha.

Termos de indexação: criopreservação de sêmen, resfriamento de sêmen,

motilidade espermática, concentração espermática, espermatócrito, análise seminal,

análise química, sêmen de peixes, piabanha.

x

ABSTRACT

SHIMODA, EDUARDO. D.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Analisys and cryopreservation of piabanha Brycon insignis Steindachner, 1877 (Pisces, Characidae) sperm. Dalcio Ricardo de Andrade (advisor), Manuel Vazquez Vidal Júnior, José Frederico Straggiotti Silva and Hugo Pereira Godinho.

Piabanha is a specie of fish from Paraiba do Sul river basin whose population is

presenting a fast decrease in the recent years. The current strategies for

conservation of the species consist in implantation of reproduction centers that,

although provide the stock replacement, work with few spawners. In result, loss of

genetical biodiversity is verified. The objective of this work was to study aspects

related to seminal analysis and conservation of piabanha Brycon insignis semen.

Concerning the microscopical analysis, was verified an average concentration of

24,38 x 109 spermatozoa/mL and spermatocrit of 16,14%. Both parameters

correlated significantly (P<0,01; R2 = 75,9%) and positively according to the

regression: � �� 9.X. It was verified that the weight and the

standard-length of piabanha do not shown influence on concentration or

spermatocrit. With reference to motility, was observed that piabanha spermatozoa

were not activated when diluted in solutions containing concentrations of NaCl above

1,2%, being suitable to be used in non activator pre-dilutions of the motility. Based in

this information a methodology for subjective analysis of the motility in two stages

was tested, consisting of (1) a non activator pre-dilution with 1:100 rate (20 µL of

semen diluted in 2 mL of NaCl 1,2%) and (2) activator dilution with 1:5 rate (50µL of

the 250 pre-dilution + 250µL of 1% NaHCO3), becoming, by this way, feasible to

xi

observe spermatozoa individually and with simultaneous activation of them. It was

verified, in addition, that hormonal induction with crude pituitary extract of carp

increases the subjective spermatic motility in piabanha semen when it was lower than

80% before the treatment. To prevent subjectivity in the analysis of the motility, a

configuration of the computer assisted sperm analysis (CASA) was adapted for

piabanha sperm what allows the attainment of several parameters, as percentage of

motile spermatozoa, percentage of progressive spermatozoa and flagelar beat

frequence. In respect to the fecundation ability of the semen, some ratios of

spermatozoa per oocyte was tested, being found the optimum ratio of 314428

spermatozoa per oocyte. Even with relation to the characterization of the semen, it

was proceeded a chemical analysis of the seminal plasma of Piabanha, being found

the following results: pH=8,47±0,286; [K+] = 36,1±2,72mM; [Ca+2] = 0,96±0,088mM;

[Mg+2] = 0,89±0,073mM; [Na+] = 67,1±4,00mM; [Cl-] = 85,0±3,56mM; Osmolarity =

286,9±24,6mOsm; [protein] = 1,02±0,168mg/mL. Another aim of this work was to

verify the possibility of conservation of the semen by cooling and criopreservation. It

was possible to keep the semen cooled at 4oC for up to 4 hours without viability

decreasing. Regarding to criopreservation, it was verified that the ratio of 1 semen

part for 5,2 parts of diluent (DMSO 10%, egg yolk 10% and glucose 5%) is the

recommended one for piabanha sperm.

12

1. INTRODUÇÃO

1.1. IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO SÊMEN DE PEIXES

Apesar da relevância do processo de desova induzida (hipofisação) na

produção de alevinos, pouca importância tem sido dada aos estudos de sêmen de

peixes. Conhecimentos básicos, nesta área, são cada vez mais solicitados,

principalmente, em função da necessidade de se dispor cada vez mais de sêmen

congelado de boa qualidade e de uma maior capacidade fecundante e viabilidade

do sêmen fresco.

O Brasil apresenta grande diversidade de espécies nativas e de recursos

genéticos que não são encontradas naturalmente fora da América do Sul. Muitas

dessas espécies, entretanto, têm tido sua população reduzida, de forma rápida, em

função de uma série de fatores. A poluição, a sobrepesca, a urbanização e a

introdução de espécies exóticas são alguns desses fatores que podem ser citados,

independentemente do tipo de reprodução da espécie, como contribuidores para

redução do estoque de peixes.

Outros fatores estão relacionados à estratégia reprodutiva de muitas espécies

nativas. Essas realizam migração reprodutiva ascendente, desovando em lagos

marginais recém-inundados por ocasião do aumento do nível dos rios na época das

chuvas. Segundo CAROLSFELD e HARVEY (1999), a pesca em período de defeso

e a construção de barragens são fatores que estão levando ao declínio nos estoques

de peixe, especialmente as espécies de piracema. Passagens para peixes que

permitem a migração rio acima e telas que mantêm os alevinos longe das turbinas,

quando estes migram rio abaixo, funcionam bem para apenas com algumas

13

espécies. O fato é que tem sido verificada significativa redução de algumas espécies

de peixes, tornando-se urgente o desenvolvimento de tecnologias que permitam sua

sobrevivência.

Uma das estratégias que têm sido utilizadas é a implantação de programas de

repovoamento. Por exemplo, muitas companhias hidrelétricas instalam estações de

piscicultura com objetivo de produção e soltura de alevinos nos rios. Entretanto,

TOLEDO FILHO et al. (1992) citam problemas que podem estar relacionados ao

procedimento adotado nessas estações. Dentre estes, a utilização de poucos

reprodutores para produção dos alevinos. A percentagem de sobrevivência da prole,

na natureza, é mínima quando comparada à obtida nas estações de piscicultura.

Desta forma, embora o número de alevinos utilizados no repovoamento seja

considerável, a diversidade genética destes é muito pequena. Isto implica perdas na

heterozigosidade e na diversidade alélica. Ainda segundo os mesmos autores, a

geração F1 do estoque reprodutor usado no repovoamento, potencialmente,

apresenta efeitos da consangüinidade e da deriva genética. Não obstante,

populações domesticadas há muito tempo e que foram selecionadas para

domesticação já estão adaptadas às condições artificiais das estações de

aqüicultura e, quando introduzidas nos rios, apresentarão menores chances de

sobrevivência e crescimento do que as selvagens nativas.

A implantação de bancos genéticos, incluindo a de sêmen criopreservado,

constitui solução potencial para minimizar perdas decorrentes da ação

antropogênica sobre os peixes nativos, garantindo a diversidade genética em

programas de repovoamento.

A estratégia para redução de recursos inclui o desenvolvimento de técnicas

de reprodução artificial, de larvicultura e alevinagem, de coleta e de criopreservação

de sêmen. Amostras de sêmen de peixes obtidos na natureza seriam

criopreservadas e parte delas utilizadas nos procedimentos de desova artificial para

repovoamento. O restante seria mantido em bancos para conservação dos recursos

genéticos.

Segundo LUBZENS et al. (1997) pode ser citada uma série de benefícios

relacionados ao desenvolvimento de técnicas de criopreservação de gametas,

como: facilidade de implantação de programas de melhoramento genético;

viabilidade de aproveitamento de desovas quando se verifica falta de sincronia de

maturação de machos e fêmeas; proteção dos estoques de reprodutores contra

14

patógenos oriundos de novas linhagens introduzidas no plantel; facilidade de

transporte de material genético; além da possibilidade de conservação de recursos

genéticos de espécies cujas populações venham escasseando.

A determinação das características físicas, químicas e microscópicas do

sêmen de uma espécie de peixe é essencial para o estabelecimento de protocolos

de congelamento do sêmen. A partir destas características torna-se possível, por

exemplo, a obtenção de soluções diluentes, utilizadas no congelamento, que não

ativem os espermatozóides.

1.2. SITUAÇÃO ATUAL DE ESPÉCIES DA BACIA DO RIO PARAÍBA DO SUL

A bacia do rio Paraíba do Sul exibe, no presente, expressiva alteração na

qualidade da água. Embora em pontos localizados se evidenciem concentrações de

poluentes diferenciados, a bacia como um todo se notabiliza por exibir altas

concentrações de sólidos (em especial sedimentos) em suspensão, derivados

principalmente dos processos erosivos que se estabelecem nas margens fortemente

desmatadas.

A transformação de grandes rios de águas límpidas em sistemas com altas

cargas de sedimentos em suspensão é um processo com rebatimentos em diversos

grupos da fauna aquática, tendo sido apontado como a causa de extinção de

diversas espécies de peixes na região neártica.

Segundo BIZERRIL (1998), a ausência de dados acerca da ictiofauna

presente no rio Paraíba do Sul, em períodos anteriores aos grandes

desmatamentos, impede avaliar a magnitude desse processo impactante sobre a

fauna local ou, ainda, identificar a ocorrência de extinções dele derivadas. Pode-se,

contudo, inferir que essa alteração ambiental mostra-se mais atuante sobre grupos

que dependem da orientação visual para a captura de presas, podendo ser,

portanto, uma das múltiplas causas que vêm contribuindo para o declínio das

espécies de Brycon na bacia. Ainda segundo BIZERRIL (1998), o processo de

extinção de espécies se dá em escalas de tempo distintas, podendo ser rapidamente

evidenciado quando do desaparecimento de determinadas taxas ou reduções

progressivas nos estoques de sua população, como se verifica com grupos como

Standachneridion parahybae e Brycon spp.

15

A população da pirapitinga do sul Brycon opalinus, por exemplo, vem

sofrendo declínio, principalmente, em rios do Vale do Paraíba, um de seus hábitats

naturais, em conseqüência de fatores que interferem no comportamento migratório

das espécies reofílicas, dentre eles, o desmatamento marginal dos rios, a poluição e

a construção de barragens hidrelétricas. Diante deste fato, programas de

povoamento e de repovoamento de rios e de reservatórios tornam-se necessários

(TORLONI, 1992).

Em outras situações, de detecção menos simples, a fragmentação no hábitat

conduz à gradual redução na diversidade genética das populações afetadas,

gerando, em longo prazo, seu desaparecimento.

1.3. A PIABANHA

Piabanha é a denominação regional de espécie de peixe de água doce,

caracterizada por suas escamas prateadas, pertencente à família Characidae,

subfamília Bryconinae, gênero Brycon, classificada como Brycon insignis por

Steindachner, em 1877 (FOWLER, 1950). É considerada espécie de grande porte,

atingindo aproximadamente 8,0 a 10,0 kg de peso (NOMURA, 1984; SANTOS, 1987;

PEREIRA, 1986). Hoje considerado um peixe raro, é encontrado somente nas

cabeceiras dos rios e na foz do Rio Paraíba do Sul (PROJETO PIABANHA, dados

não publicados). Possui o abdômen róseo e o dorso prateado. A mandíbula é

projetada para a frente e a cabeça é achatada, duas características gerais de peixes

predadores. Na década de 50, chegou a ocupar lugar de destaque na economia de

certos municípios da região, sendo a 4a espécie mais capturada na pesca comercial

(MACHADO e ABREU, 1952). Quanto ao hábitat, aparece em corredeiras,

principalmente, no tombo das cachoeiras.

Segundo SALGADO et al. (1997), o período reprodutivo da espécie estende-

se de dezembro a fevereiro, o macho está apto a se reproduzir no segundo ano de

vida quando alcança cerca de 20,0 cm de comprimento, e a fêmea, a partir do

terceiro ano de vida, após atingir 25,0 cm de comprimento total. A fecundação dos

óvulos é externa e a desova ocorre quando o nível das águas está em ascensão em

virtude das chuvas de verão. A incubação dos ovos é realizada em lagoas marginais

ou em áreas de remanso, onde os alevinos encontram alimento e refúgio para seu

desenvolvimento. A sobrevivência dessa espécie encontra-se bastante ameaçada

16

pela poluição do rio Paraíba decorrente do lançamento de esgoto doméstico,

industrial e agropecuário, como também pela introdução do dourado (Salminus

maxillosus), um voraz predador. Estes fatores comprometeram seriamente a

perpetuação dessas espécies.

Quanto ao hábito alimentar, a piabanha é ictiófaga e insetívora quando jovem,

e herbívora e frugívora quando adulta. Durante a larvicultura da piabanha é comum

verificar-se canibalismo entre indivíduos, o que pode reduzir substancialmente o

número de alevinos produzidos. Para se minimizarem as perdas, normalmente são

usadas larvas de outras espécies de peixe, como o curimbatá, que servem como

alimento para as piabanhas.

No que se refere a sua utilização, é considerada espécie de alto valor

comercial e muito apreciada pela resistência à captura com anzol na pesca

esportiva.

A exploração para fins comerciais é ainda praticamente inexistente, tendo as

estações de piscicultura com criação de piabanhas apenas fins conservacionistas.

Dentre as estações, tem-se a da CESP, localizada em Paraibuna, SP, e a do Projeto

Piabanha, em Itaocara, RJ. Esta última tem desenvolvido projetos para

aperfeiçoamento da produção de alevinos, que são utilizados para repovoamento no

rio Paraíba do Sul.

Os objetivos deste trabalho foram caracterizar química e microscopicamente

o sêmen da piabanha, verificando a influência de alguns fatores, além de

desenvolver metodologia que permita a criopreservação deste sêmen para formação

de bancos genéticos.

Os artigos a seguir foram editorados com base nos critérios da Revista

Brasileira de Zootecnia, publicada pela Sociedade Brasileira de Zootecnia, com

adaptações às normas para redação de tese da UENF.

17

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

BIZERRIL, C.R.S.F., ARAÚJO, L.M.N., TOSIN, P.C. (1998) Contribuição ao

conhecimento da Bacia do rio Paraíba do Sul – Coletânea. ANEEL/CPRM.

CAROLSFELD, J., HARVEY, B. (1999) Conservação de recursos genéticos de

peixes: teoria e prática. Curso de Treinamento Brasileiro. Tradução de Hugo

Pereira Godinho. Victoria, Canadá:World Fisheries Trust, 47 p.

FOWLER, H. W. (1950) Os Peixes de Água Doce do Brasil. Arquivos de Zoologia,

6:333-340.

LUBZENS, E., DAUBE, N., PEKARSKY, I., MAGNUS, Y., COHEN, A.,

YUSEFOVICH, F., FEIGIN, P. (1997) Carp (Cyprinus carpio L.) spermatozoa

cryobanks – Strategies in research and application. Aquaculture, 155:13-30.

MACHADO, C.E.M., ABREU, E.C.F. (1952) Notas preliminares sobre a caça e a

pesca no Estado de São Paulo - I) A pesca no vale do Paraíba. Boletim de

Industria Animal, 13:145-160.

NOMURA, H. (1984) Dicionário dos Peixes do Brasil. Brasília, Editerra, 482 p.

PEREIRA, R. (1986) Peixes de Nossa Terra. 2a Ed. , Editora Nobel, 129 p.

SALGADO, A.F.G., CHAIN, M.G., GIRARDI, L., FARIA, C.A. (1997) A conservação

da piabanha (Brycon insignis) na Bacia do Rio Paraíba do Sul. Relatório Técnico-

CESP, p. 1-28.

SANTOS, E. (1987) Peixes de Água Doce (Vida e Costumes dos Peixes do Brasil) 4a

Ed. Editora Itatiaia Ltda.

18

TORLONI, C.E.C. (1992) Manejo dos recursos pesqueiros nos reservatórios da

CESP. São Paulo:CESP-SP. 16p. (Série Pesquisa e Desenvolvimento, 63).

19

CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA E ESPERMATÓCRITO DO SÊMEN DA

PIABANHA Brycon insignis CULTIVADA EM TANQUES

RESUMO: A concentração espermática é normalmente determinada através da

contagem dos espermatozóides em câmaras volumétricas, após a diluição. O

processo, entretanto, é relativamente demorado e necessita de um microscópio para

ser realizado. O espermatócrito é obtido centrifugando-se o sêmen não diluído e

verificando-se a percentagem em volume ocupada pelo precipitado. O objetivo deste

trabalho foi, portanto, estabelecer uma equação de regressão entre os parâmetros

concentração espermática e espermatócrito do sêmen de piabanha. Os exemplares

(n=29) de piabanha Brycon insignis foram hipofisados, sendo posteriormente

realizada a coleta de sêmen. O espermatócrito foi determinado utilizando-se mini-

centrífuga. A concentração espermática foi verificada por contagem em câmara de

Neubauer, após diluição. A concentração espermática verificada (média±desvio

padrão) foi de 24,38 ± 3,84 x 109 espermatozóides / mL, e o espermatócrito foi de

16,14±5,20 %. A equação de regressão: � � �!#"%$ �&' ($ 9 + 0,6428.109.X foi

significativa (P<0,01) e apresentou R2 ajustado = 0,75. Deste modo, é possível

estimar a concentração através da determinação do espermatócrito.

Termos de indexação: concentração espermática; espermatócrito; análise seminal;

piabanha.

20

ABSTRACT: SPERM CONCENTRATION AND SPERMATOCRIT OF SEMEN

FROM PIABANHA Brycon insignis, CULTURED IN EARTHEN POND

Sperm concentration commonly is determined through the counting of spermatozoa

in volumetric chambers after the dilution. The process, however, is relatively slow and

needs a microscope to be carried. The spermatocrit is obtained by centrifugation of

not-diluited sperm and verifying the percentage of the total volume occupied by the

precipitated sample. The objective of this work was, therefore, to establish a

regression among the parameters spermatocrit and concentration in piabanha sperm.

The specimen (n=29) of piabanha Brycon insignis was induced with crude pituitary

extract of carp, being later carried for semen collection. The spermatocrit was

determined using mini-centrifugal machine. The spermatical concentration was

verified by counting in “Neubauer chamber”, after dilution. The verified spermatical

concentration (average±standard deviation) was 24,38±3,84x109 spermatozoa/mL,

and the spermatocrit was 16,14±5,20 %. The regression model: )+*-,/.#0%1,�2�,�1 9 +

0,6428.109.X was significant (P<0,01) and presented an adjusted R2 = 0,75. Thus,

the estimation of spermatical concentration using the spermatocrit data is feasible.

Key words: sperm concentration; espermatocrit; seminal analysis; piabanha.

21

1. INTRODUÇÃO

A piabanha Brycon insignis é uma espécie de peixe encontrada,

naturalmente, apenas na bacia do rio Paraíba do Sul e cuja população vem

escasseando rapidamente em função de ações antropogênicas.

A preservação da espécie tem sido tentada por meio de desenvolvimento de

tecnologia de desova artificial em cativeiro. O procedimento adotado atualmente

consiste na indução hormonal dos reprodutores e posterior extrusão dos gametas. A

fecundação ocorre mediante adição de solução ativadora da motilidade espermática.

Os cuidados com relação ao manejo do sêmen utilizado no processo

resumem-se à verificação do volume adicionado e ao ato de se evitar seu contato

com água antes da mistura com os ovócitos. Entretanto, a análise mais detalhada de

parâmetros relacionados à qualidade seminal, como a concentração espermática,

poderia proporcionar maiores índices de fertilização.

A concentração ou densidade espermática expressa a quantidade de

espermatozóides por volume de sêmen, podendo ser determinada através de

contagem em câmaras volumétricas, mediante diluição do esperma. Valores de

concentração, assim como suas variações de acordo com o peso e idade do peixe,

época do ano, freqüência de coleta e porção do ejaculado foram estudados por

diversos autores, inclusive no Brasil.

Segundo CARVALHO (2001), a determinação da concentração espermática

constitui importante passo que permite a otimização do sêmen em processos de

22

desova induzida de peixes rotineiramente utilizados em laboratórios de reprodução,

evitando-se utilizações inadequadas de espermatozóides por ovócito.

Dentre as várias espécies de peixe existentes no país, algumas já foram

estudadas quanto à concentração espermática, sendo relativamente alta a variação

intra e inter-específica (tabela 1).

Tabela 1 – Concentração espermática no sêmen de algumas espécies brasileiras de

água doce

Nome comum / Espécie Concentração espermática* Autor

Piabanha / Brycon insignis 24,4 – 25,1 ANDRADE-TALMELLI et al. (2003)

Pacu / Piaractus mesopotamicus 31,7 – 43,1 SHIMODA (1999)

19,2 – 26,6 GODINHO e COSER (1995) Curimbatá / Prochiludus marggravii

8,6 – 28,7 SHIMODA et al. (1997)

Bagre / Rhamdia hilarii 66,5 KAVAMOTO e SILVEIRA (1986)

13,3 – 20,5 GODINHO e COSER (1995) Curimbatá / Prochilodus lineatus

14,1 – 20,3 RIBEIRO (2001)

Dourado / Salminus maxillosus 4,3 – 10,8 GODINHO e COSER (1995)

Piapara / Leporinus elongatus 7,0 – 16,0 GODINHO e COSER (1995)

Pintado / Pseudoplatystoma coruscans 8,0 – 16,0 GODINHO e COSER (1995)

Piau-açu / Leporinus macrocephalus 11,2 ± 2,8 RIBEIRO (2001)

* espermatozóides x 109 / mL.

Outros estudos relacionados à concentração espermática também foram

realizados.

No que se refere à correlação entre a concentração espermática e o peso

dos peixes, não foi notada significância entre os dois parâmetros no Scophthalmus

maximus, na faixa de peso entre 1,4 e 3,2 Kg (SUQUET et al., 1992). A ausência de

correlação significativa também foi verificada em trutas Oncorhynchus mykiss em

trabalho realizado por KAVAMOTO et al. (1987).

Com relação à freqüência de amostragem e à época do ano, foi observado

que, quando as amostragens no turbot Scophthalmus maximus ocorreram

regularmente por dois meses, a concentração observada ao fim da coleta foi

significativamente menor nas coletas semanais e quinzenais quando comparadas a

23

amostragens mensais (SUQUET et al., 1992). Em truta Oncorhynchus mykiss, um

similar decréscimo também é observado para as mesmas freqüências de

amostragem (BUYUKHATIPOGLU e HOLTZ, 1984). Experimento realizado por

OLIVEIRA et al. (1991) revelou gradativa redução na concentração espermática de

carpas Cyprinus carpio nas coletas seminais periódicas (período total = 71 dias). De

forma semelhante, FAUVEL et al. (1999) realizou experimentos com Dicentrarchus

labrax e verificou que a concentração espermática decresce ao longo do período

reprodutivo. O valor máximo obtido foi de 60 x 109 espermatozóides/mL e, em

função de freqüentes coletas, o período reprodutivo foi encurtado.

Outro campo de estudo envolvendo a concentração espermática diz respeito

aos métodos utilizados para sua determinação. Um desses métodos, que permite a

determinação do número de espermatozóides por mL de sêmen, é a contagem em

câmara hematimétrica de Neubauer. Este procedimento foi utilizado por diversos

autores no Brasil (TAITSON e GODINHO, 2003; ANDRADE-TALMELLI et al., 2001;

SILVEIRA et al., 1990; KAVAMOTO et al., 1987; SILVEIRA et al., 1985; KAVAMOTO

et al., 1985, dentre outros) e em outros países (CIEREZKO e DABROWSKI, 1993;

FAUVEL et al., 1993; VILLANI e CATENA, 1991; KAZANOV, 1981; BILLARD et al.,

1971, dentre outros).

A utilização da câmara de Neubauer, entretanto, apresenta alguns

inconvenientes. TATSON E GODINHO (2003) afirmam que há necessidade de se

esperar a precipitação dos espermatozóides no fundo da câmara e que, para sua

utilização, é preciso realizar altas diluições, que poderiam incorrer em erros.

Métodos alternativos têm sido propostos, podendo-se citar a contagem na

câmara de Makler (TATSON e GODINHO, 2003; RIBEIRO, 2001; RAVINDER et al.,

1997; LAHNSTEINER et al., 1998), a espectrofotometria (SILVEIRA et al., 1987;

CIERESZKO e DABROWSKI, 1993) e o espermatócrito (RIBEIRO, 2001; LIM et al.,

2002; POOLE e DILLANI, 1998; CIERESZKO e DABROWSK, 1993; KAVAMOTO et

al., 1986).

A análise de regressão entre os parâmetros número total de

espermatozóides e espermatócrito (em mm) revelou-se significativa (P<0,05) em

algumas espécies de peixes estudadas, sendo recomendada a utilização das

equações de regressão para determinação rápida e acurada da concentração

espermática. CIERESZKO e DABROWSKI (1993) obtiveram correlações

significativas (P<0,0001) para entre a concentração espermática, calculada a partir

24

de contagem em câmara de Neubauer, e o espermatócrito, nas espécies

Oncorhynchus mykiss (R2 = 95,5%), Coregonus clupeaformis (R2 = 79,1%) e Perca

flavescens (R2 = 95,8%). A equação da regressão número total de espermatozóides

x espermatócrito (em mm) revelou-se significativa (P<0,05) para a espécie

Prochilodus scrofa, apresentando R2 = 0,95 (KAVAMOTO et al., 1986). Em amostras

seminais de Rhamdia hilarii (KAVAMOTO e SILVEIRA, 1986) e Onchorynchus

mykiss (KAVAMOTO e SILVEIRA, 1985), foram obtidos coeficientes de correlação

de 0,85 e 0,75, respectivamente.

Em contraste com estudos citados, não foi obtida correlação significativa no

turbot Scophthalmus maximus (SUQUET et al., 1994). As espermátides, que

possuem um volume muito maior que os espermatozóides, são freqüentemente

observadas em amostras seminais de turbot ao início do período de espermiação.

Além disso, alterações morfológicas no espermatozóide podem ser verificadas no

final do período de espermiação. Estes dois fatos podem contribuir para a variação

no valor do espermatócrito do turbot.

O objetivo deste trabalho foi verificar a viabilidade de utilização do

espermatócrito como método para determinação da concentração espermática, bem

como verificar a influência do peso e do comprimento-padrão sobre a concentração

e o espermatócrito.

25

2. MATERIAL E MÉTODOS

Exemplares da espécie Brycon insignis foram pescados no rio Paraíba do

Sul e transportados até a Estação Experimental do Projeto Piabanha, localizado no

Município de Itaocara – RJ, distante 110 km do Município de Campos dos

Goytacazes – RJ. Após domesticação, esses peixes foram submetidos ao

procedimento de desova induzida, originando a primeira geração de filhos (F1).

Estes, por sua vez, foram criados na Estação recebendo ração extrusada na fase

adulta a uma proporção de 2% do peso vivo/dia, em tanques com aproximadamente

600 m2 e densidade de estocagem de 800g de peixe/m2 de lâmina d´água, até

atingirem maturidade sexual com 2 ou 3 anos de idade. Os experimentos

transcorreram durante a estação natural de reprodução, entre os meses de outubro

e fevereiro.

Os peixes foram despescados dos tanques externos de cultivo, sendo os

machos que apresentaram elevado grau de maturação (vertência de sêmen sob

compressão abdominal) selecionados e transportados até o laboratório, onde foi

procedida a biometria (medição do peso e comprimento-padrão) dos animais. Os

exemplares utilizados apresentaram peso médio de 229,03 g e comprimento médio

de 25,66 cm.

A seguir, procedeu-se a hipofisação, segundo WOYNAROVICH e HORVATH

(1985), utilizando-se 0,5 mg de extrato bruto pituitário de carpa/Kg PV, sendo, então,

os exemplares colocados em um tanque interno do laboratório, na presença de

fêmeas.

26

O sêmen foi extrusado 240 h.grau após a hipofisação, através de massagem

abdominal no sentido ântero-posterior, sendo coletado em tubos de vácuo de 5 mL

para posterior análise. O poro urogenital assim como as regiões adjacentes foram

devidamente secos e limpos e as porções do sêmen contaminadas com sangue e/ou

urina descartadas.

Para determinação da concentração espermática, as amostras seminais,

coletadas a partir de 29 exemplares de piabanha, foram diluídas (1:1000) em 20 mL

de solução de formol-salina (HANCOCK, 1957), utilizando-se uma pipeta de

Eppendorff (0,02 mL). As amostras foram mantidas em local fresco e sombreado,

sendo procedida a contagem ao microscópio de pelo menos 300 espermatozóides

(aumento de 400 vezes) na câmara hematimétrica de Neubauer "improved", no dia

seguinte à coleta, segundo SILVEIRA et al. (1987). A contagem foi repetida 4 vezes,

sendo o resultado individual da concentração de cada exemplar uma média das 4

contagens multiplicadas por 1000.

O espermatócrito foi determinado a partir das amostras (não diluídas) dos

mesmos 29 exemplares de piabanha, sendo as amostras analisadas no mesmo dia

da coleta. Alíquotas de sêmen foram coletadas em tubos capilares de 75 mm e

analisadas em mini-centrífuga portátil Bayer Diagnostics, equipada com um rotor de

tubos capilares, a 11.500 rpm durante 15 min, sendo o resultado expresso em

percentagem de volume ocupado pelo precipitado em relação ao volume total

(CIERESZKO e DABROWSKI, 1993).

A equação de regressão, entre os parâmetros espermatócrito x

concentração, teve sua significância testada pelo teste F (PIMENTEL GOMES,

2000). Foram avaliados, ainda, os efeitos do peso e do comprimento-padrão sobre

os parâmetros concentração espermática e espermatócrito. Médias, desvios-

padrão, limites de confiança (P<0,05) e coeficientes de variação dos parâmetros

peso, comprimento-padrão, concentração espermática e espermatócrito também

foram calculados. As análises estatísticas foram realizadas no aplicativo SAEG –

Sistema de Análises Estatísticas e Genéticas.

27

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dados individuais, médias, medidas de dispersão (desvio-padrão,

coeficiente de variação) e valores máximos e mínimos relacionados à biometria, à

concentração espermática e ao espermatócrito da piabanha podem ser observados

na tabela 2.

O tratamento hormonal com extrato bruto pituitário de carpa, na dosagem de

0,5 mg por kg de peso vivo, foi utilizado no intuito de estimular a produção seminal

das piabanhas. SILVEIRA et al. (1987) também induziram hormonalmente a

reprodução dos exemplares, entretanto, com gonadotropina coriônica humana

(HCG), na dosagem de 5 UI/g de peso vivo. Segundo BILLARD (1987), a

estimulação hormonal pode induzir aumento no volume de sêmen. SHIMODA et al.

(1997) não encontraram diferenças significativas no volume de sêmen de

Prochilodus marggravii hipofisados e não hipofisados, embora o volume obtido tenha

sido superior nos primeiros. GARCIA (1993) obteve aumento significativo em

resposta à aplicação de LHRHa em Siganus guttatus. No presente experimento, a

aplicação de hipófise teve como objetivo aumentar o volume de sêmen produzido e

simular o procedimento rotineiro utilizado nas estações de piscicultura, proposto por

WOYNAROVICH e HORVATH (1983).

28

Tabela 2 - Dados individuais, médias (X), desvios-padrão (S), coeficientes de

variação (C.V.), valores mínimos e máximos, e intervalos de confiança (I.C. –

P<0,05) da biometria (peso e comprimento-padrão), da concentração espermática e

do espermatócrito do sêmen do Brycon insignis (piabanha) hipofisado

Exemplar Peso (g)

Comprimento-padrão (cm)

Concentração espermática

(x109 sptz*/mL)

Espermatócrito (%)

1 297 28 21,6 12 2 250 25 31,5 27 3 216 25 22,1 17 4 227 26 27,3 19 5 254 27 18,7 7 6 194 24 29,9 21 7 206 24 24,9 18 8 228 26 21,6 13 9 253 26 23,4 20 10 248 27 23,4 17 11 186 22 23,0 15 12 238 26 28,7 22 13 215 25 24,5 14 14 250 26 23,0 16 15 235 26 21,1 13 16 207 26 20,7 4 17 222 24 32,5 23 18 230 27 25,7 21 19 197 25 24,9 18 20 219 25 27,8 19 21 236 26 18,0 10 22 214 26 19,4 6 23 184 23 27,5 18 24 254 27 22,1 15 25 237 27 25,7 17 26 267 28 27,2 20 27 228 25 29,3 20 28 192 24 20,0 12 29 258 28 21,6 14 X 229 25,7 24,38 16,14 s 26,36 1,47 3,84 5,2

C.V. (%) 11,51 5,73 15,74 32,23 I.C. (P<0,05) - - 22,92 - 25,84 14,16 - 18,12

* sptz = espermatozóides.

No experimento realizado, as concentrações mínima e máxima, em

espermatozóides x 109 / mL, foram de 22,9 e 25,8, respectivamente. Esta variação

foi próxima à obtida por ANDRADE-TALMELLI (2003), trabalhando também com a

piabanha, porém, menor do que a verificada na maioria das espécies brasileiras de

29

água doce (tabela 1). Possivelmente, a variação relativamente baixa nas

concentrações espermáticas verificadas neste trabalho foi em função da

homogeneidade do grau de maturidade da maioria dos exemplares, ao contrário do

que pode ter ocorrido nas outras espécies citadas na tabela 1. Mesmo apresentando

vertência de sêmen sob compressão do abdômen, os peixes poderiam apresentar-

se em diferentes pontos da curva de produção seminal. Variações individuais numa

mesma espécie podem ocorrer. Nas estações de piscicultura, é comum, durante a

seleção de reprodutores que serão submetidos à indução hormonal, encontrarem-se

vários exemplares vertendo sêmen mediante massagem abdominal. Entretanto,

estes peixes, considerados maduros, muitas vezes podem não estar no ápice da

produção espermatogênica. No Brasil, OLIVEIRA et al. (1991), trabalhando com a

carpa Cyprinus carpio, realizaram coletas periódicas, durante 71 dias, sendo obtida

uma regressão cúbica entre os parâmetros volume de sêmen e dia de coleta

(P<0,01). CLEMENS e GRANT (1965) observaram que o volume de sêmen de uma

carpa aumentou até o 48o dia, declinando em seguida.

O valor médio de concentração espermática (tabela 2), obtido no sêmen dos

peixes hipofisados, de 24,38 x 109 espermatozóides/mL, foi muito próximo ao da

concentração de 24,76 x 109 espermatozóides/mL, verificado também por

ANDRADE-TALMELLI et al. (2001) em piabanhas não hipofisadas.

O espermatócrito, por outro lado, apresentou coeficiente de variação

relativamente alto (32%). A explicação para este coeficiente de variação talvez seja

a presença de algumas células da linhagem germinativa que não os

espermatozóides, como por exemplo espermátides. Estas puderam ser observadas

ao microscópio quando da contagem em câmara de Neubauer. Entretanto, a

observação ao microscópio permite a contagem exclusivamente dos

espermatozóides, enquanto que o espermatócrito é medido em função do volume

proporcional das frações precipitadas na centrifugação. Este fato tem especial

importância quando se considera que as espermátides têm volume

significativamente maior e sua presença poderia alterar bastante o espermatócrito.

No que se refere a relação entre concentração espermática e

espermatócrito, a figura 1 mostra que os dois parâmetros se relacionam

intimamente. Percebe-se que, de forma geral, quanto maior a concentração

espermática, maior o espermatócrito.

30

A partir desses valores de concentração espermática e espermatócrito foi

obtida a seguinte equação de regressão:

35476�8#9%:6�;'6(:

9 + 0,6428.109.X

Onde: 3 <>=@?BADC�EFAHGJI'K�L

ão estimada (sptz/mL)

X = Espermatócrito (%)

A regressão foi significativa (P<0,01) e mostrou alto coeficiente de

determinação (R2 = 75%), o que evidencia a relação entre os dois parâmetros. É

possível, portanto, estimar a concentração espermática a partir da obtenção do

espermatócrito.

Este resultado encontrado corrobora CIERESZKO e DABROWSKI (1993),

que verificaram a possibilidade da estimativa da concentração a partir do

espermatócrito de truta arco-íris Oncorhynchus mykiss, sendo o coeficiente de

determinação obtido superior ao verificado neste experimento (R2=95,5%).

Figura 1: Concentração espermática e espermatócrito obtidos a partir da piabanha

Brycon insignis hipofisada (n=29).

31

No Brasil, também foi possível estabelecer a correlação para a espécie

Prochilodus scrofa, cuja equação de regressão apresentou R2 = 0,95 (KAVAMOTO

et al., 1986).

Embora o coeficiente de determinação obtido neste experimento tenha sido

inferior ao verificado nas espécies anteriormente citadas, o valor é muito próximo ao

verificado por KAVAMOTO et al. (1985), que trabalharam com Onchorynchus

mykiss e obtiveram R2 = 0,75.

Por outro lado, SUQUET et al. (1994), trabalhando com o turbot

Scophthalmus maximus, não obtiveram correlação significativa entre os parâmetros

concentração espermática e espermatócrito. Segundo esses autores, espermátides

são freqüentemente observadas em amostras seminais da espécie ao início do

período de espermiação. Embora a presença de espermátides tenha sido observada

neste experimento, a quantidade mostrou-se reduzida, já que a maioria dos peixes

utilizados encontravam-se em meio à estação reprodutiva, inclusive, sendo

verificadas fêmeas com elevado grau de maturação gonadal que estavam sendo

utilizadas para desova.

Nenhuma das demais correlações testadas, entre peso x concentração,

peso x espermatócrito, comprimento-padrão x concentração e comprimento-padrão x

espermatócrito, foi significativa (P<0,05). Esse resultado corrobora SUQUET et al.

(1992) e KAVAMOTO et al. (1987), que não verificaram influência do peso dos

peixes sobre a concentração espermática. Cabe ressaltar que, neste trabalho, os

peixes apresentaram portes semelhantes, hajam vista, os baixos coeficientes de

variação observados no peso, de 11,5%; e no comprimento-padrão, de 5,7%.

32

4. CONCLUSÕES

A concentração espermática da piabanha (média = 24,38 x 109

espermatozóides/mL) apresenta baixa variação entre indivíduos (CV = 15,7%),

enquanto que o espermatócrito (média = 16,14%) é mais variável (CV = 32,2%).

A equação de regressão: M N OQPRTSUOWV'O(S 9 + 0,6428.109 X revelou-se

significativa (P<0,01; R2 = 75,9%), sendo possível, a partir do espermatócrito (X), em

%, estimar a concentração espermática (M ), em espermatozóides/mL, do sêmen de

piabanha.

O peso e o comprimento-padrão da piabanha não têm influência sobre a

concentração espermática ou sobre o espermatócrito.

33

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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37

MOTILIDADE ESPERMÁTICA NA PIABANHA Brycon insignis: EFEITOS DA

OSMOLARIDADE E DA INDUÇÃO HORMONAL COM EXTRATO BRUTO DE

HIPÓFISE E UTILIZAÇÃO DO ANALISADOR DE MOTILIDADE ESPERMÁTICA

ASSISTIDA POR COMPUTADOR (CASA)

RESUMO: A motilidade espermática é normalmente determinada subjetivamente

após a simples adição de duas gotas de água a uma gota de sêmen e sua

observação ao microscópio. Entretanto, devido à necessidade de altas diluições

para observação individualizada e ativação simultânea dos espermatozóides e à

subjetividade da análise, os resultados obtidos são variados e, possivelmente,

imprecisos. O objetivo deste trabalho foi, portanto, desenvolver protocolos que

permitam a avaliação mais acurada da motilidade espermática. Inicialmente foi

determinado o procedimento de diluição em duas etapas: (1) uma pré-diluição não

ativadora e (2) uma diluição ativadora. Uma gota de sêmen de 3 piabanhas

hipofisadas foi colocada sobre uma lâmina, ao microscópio, adicionando-se duas

gotas de solução de NaCl com diferentes osmolaridades. Soluções com 410mOsm

ou mais não ativaram a motilidade espermática, podendo essas ser utilizadas como

pré-diluidora (1) na proporção de 20 µL de sêmen para 2 mL de solução não

ativadora. A seguir, 50 µl da solução 1 (sêmen + diluente não ativador) foram

misturados com 250 µL da solução ativadora (2) de NaHCO3 1%. Utilizando este

procedimento, foi realizada a adaptação da configuração do analisador de motilidade

computadorizado, a partir de configuração estabelecida para a carpa, para

determinação de parâmetros de atividade espermática da piabanha. Foram

utilizadas amostras seminais de duas piabanhas, sendo obtidos os seguintes

resultados: espermatozóides móveis = 95%; espermatozóides móveis com

movimento progressivo = 65%; velocidade na trajetória média = 15,6 µm/s;

velocidade progressiva = 11,0 µm/s; velocidade curvilinear = 29,4 µm/s; freqüência

de batimento flagelar = 28,8 Hz. A hipofisação aumentou a motilidade espermática,

quando esta foi inferior a 80% antes do tratamento.

Termos de indexação: motilidade espermática, análise de sêmen, piabanha,

hipofisação, analisador de motilidade espermática assistida por computador (CASA).

38

ABSTRACT: MOTILITY OF PIABANHA Brycon insignis SPERM: EFFECTS OF

OSMOLARITY AND HORMONAL INDUCTION WITH CRUDE PITUITARY

EXTRACT OF CARP AND THE UTILIZATION OF COMPUTER ASSISTED SPERM

ANALYSIS (CASA)

The motility commonly is determined subjectively after the simple addition of two

drops of water to one drop of semen and observation on microscope. However, due

to necessity of high dilutions for individual observation and simultaneous activation of

the spermatozoa and the subjectivity of the analysis, results are varied and, possibly,

inexact. The objective of this work was, therefore, to develop protocols that allow an

accurate evaluation of the motility. Initially the procedure of dilution was determined

in two step: (1) a non-activator pre-dilution and (2) an activator dilution. A semen drop

from 3 hipophysed piabanha was placed on a blade, to the microscope, adding two

drops of solution of NaCl with different osmolarities. Solutions containning 410mOsm

or more doesn’t activated the motility, being able for using as pre-diluent (1), in the

ratio of 20 µL of semen for 2 mL non-activator solution. Next, 50 ml of solution 1

(semen + non-activator diluent) was mixed to 250 µL of the activator solution (2) of

1% NaHCO3. Using this procedure, a configuration of the computer assisted sperm

analysis (CASA) was done, starting from an established configuration for the carp, for

the determination of parameters of activity of spermatozoa of piabanha. Two seminal

samples of piabanha were used, being obtained the following results: motile

spermatozoa = 95%; progressive spermatozoa = 65%; average-path velocity = 15,6

mm/s; Straight-line velocity = 11,0 µm/s; track speed or curvilinear velocity = 29,4

µm/s; flagelar beat frequency = 28,8 Hz. The treatment with crude pituitary extract of

carp increased the motility, when this was lower than 80% before the inducing

treatment.

Index terms: spermatical motility; semen analysis, piabanha, hipophysation,

computer assisted sperm analysis (CASA)

39

1. INTRODUÇÃO

Vários pesquisadores brasileiros têm-se interessado pela reprodução

induzida de espécies reofílicas. Assim, foram desenvolvidos trabalhos com mandi,

Pimelodus maculatus (FENERICH et al., 1974), curimbatá, Prochilodus scrofa

(CASTAGNOLLI e CYRINO, 1980; FENERICH-VERANI et al., 1984), curimatã-pacu,

Prochilodus margravii (SATO et al., 1996), pacu, Piaractus mesopotamicus

(CASTAGNOLLI e DONALDSON, 1981; GODINHO e GODINHO, 1986;

BERNARDINO et al., 1987), que são espécies de alto valor comercial e indicadas

para piscicultura.

O procedimento da desova induzida por aplicação de extrato bruto de

hipófise de carpa (EBHc), preconizado atualmente, sugere apenas uma proporção

de machos e fêmeas (WOYNAROVICH e HORVATH, 1983; VALENCIA e

PUENTES, 1989; CASTAGNOLLI, 1992), sendo comum a utilização do sêmen de

um único macho para fertilização dos ovócitos de uma fêmea, desde que a

quantidade de sêmen produzida por esse macho seja considerável. Em geral, não

há qualquer cuidado com a qualidade do sêmen utilizado. Entretanto, o requisito

principal que garante maior eficácia da fecundação é o número de espermatozóides

com motilidade progressiva e retilínea por ovócito. Baixas fecundidades podem ser

motivadas por alguns fatores relacionados à qualidade seminal: número reduzido de

espermatozóides (baixo volume seminal, azoospermia ou hipospermia) ou atividade

baixa (hipocinese, baixos vigor e turbilhonamento ou restrito tempo de

movimentação). Segundo RANA et al. (1995), altas variações individuais na

40

qualidade do sêmen podem ocorrer em função da variabilidade genética, da

contaminação com urina/fezes ou do envelhecimento intratesticular dos

espermatozóides.

Segundo SILVEIRA et al. (1988), a avaliação das características seminais é

importante na rotina de reprodução artificial em qualquer espécie animal. Para

descrição de um perfil espermático são analisadas as características físicas do

sêmen (volume, turbilhonamento, motilidade, vigor e concentração) e ainda as

características morfológicas dos espermatozóides (FONSECA et al., 1992). A

determinação do volume de sêmen coletado, do número de espermatozóides por

milímetro cúbico e da motilidade faz parte do trabalho rotineiro de um centro de

inseminação artificial (SALISBURY e VANDERMARK, 1964).

Estudos sobre a motilidade espermática de peixes são restritos a um

limitado número de espécies. Segundo BILLARD e COSSON (1992),

aproximadamente 20 espécies são estudadas, muito embora mais de 20.000 sejam

conhecidas. Ainda segundo estes autores, todas as observações sobre motilidade e

estudos bioquímicos relatados são realizadas mediante diluição do sêmen. Uma vez

que a duração da motilidade é curta (1-2 min para os espermatozóides da maioria

das espécies) e o movimento espermático varia durante a fase de motilidade, a

diluição é uma peça chave para determinação da dinâmica de ativação. Ainda

segundo os mesmos autores, a sobreposição dos fatores de inibição (altas

concentração de potássio e osmolaridade), que acarretaria a ativação simultânea de

todos os espermatozóides viáveis, somente poderia ser obtida mediante uma

diluição seminal da ordem de 1000 vezes. Esta diluição poderia iniciar a motilidade

de forma simultânea em 100% dos espermatozóides potencialmente ativáveis. A

menores diluições, apenas alguns dos espermatozóides são ativados após mistura

com diluente, enquanto que outros se tornam progressivamente ativos

posteriormente. Ativações posteriores são observadas de 15 seg a 3 min após a

diluição. Esses autores propõem um procedimento, dividido em duas etapas, para

eficiente obtenção desta ativação:

1) uma diluição não ativadora, de 100 vezes, em solução com uma

concentração de K+ iso ou hipermolar e uma osmolaridade igual ou superior ao fluido

seminal e,

2) outra diluição, ativadora, com água destilada, da ordem de 20 vezes.

41

Variações na pressão osmótica induzem a motilidade espermática em

muitas espécies de peixe (SUQUET et al., 1994). Meios hipotônicos ativam a

motilidade do espermatozóide em ciprinídeos tais como o Carassius auratus e a

carpa (MORISAWA et al., 1983). A diluição em meio hipertônicos inicia o movimento

espermático em peixes marinhos tais como o Gadus morhua (MORISAWA, 1985),

Serranus subligarius (BILLARD, 1978), Sparus sarba (CHAMBEYRON e ZOHAR,

1990) e Mugil cephalus (LEE et al., 1992). Em salmonídeos, alta pressão osmótica

(400 mOsmol/kg) inibe a motilidade do espermatozóide (TURDAKOV, 1970;

MORISAWA e SUZUKI, 1980). Experimentalmente, uma alta pressão osmótica pode

ser utilizada fixamente acompanhada de alta concentração de potássio para inibir a

motilidade, por exemplo, durante a diluição do sêmen antes da criopreservação

(BILLARD e COSSON, 1992). Em ciprinídeos, a pressão osmótica é o principal fator

que inibe a motilidade (MORISAWA e SUZUKI, 1980; MORISAWA et al., 1983),

sendo a atividade espermática ativada em meios com pressões osmóticas inferiores

a 150-200 mM (PLOUIDY e BILLARD, 1982; MORISAWA et al., 1983).

Significativos progressos na avaliação da motilidade espermáticos em peixes

têm sido obtidos com a utilização de gravação em vídeo e análise posterior a partir

de um monitor de vídeo (TRIPPEL e NEILSON, 1992; IWAMATSU et al., 1993) ou

iluminação estroboscópica e microscopia de campo escuro (COSSON et al., 1985).

RAVINDER et al. (1997) afirmam que são necessários métodos rápidos,

acurados e objetivos para o conhecimento do mecanismo de iniciação da motilidade

espermática em peixes. Usualmente, a ativação dos espermatozóides tem sido

avaliada apenas pela percentagem de móveis e a duração da motilidade. Alguns

poucos trabalhos, como os de COSSON et al. (1985) e ODA e MORISAWA (1993),

avaliam de forma mais detalhada a atividade espermática, apresentando a

velocidade dos espermatozóides e a freqüência de batimento flagelar, medidos

mediante análise de vídeo-micrografia.

Segundo VAN LOOK et al. (2000), o software CASA (analisador de

motilidade espermática assistida por computador) tem sido amplamente utilizado

para examinar a qualidade do sêmen de aves e mamíferos, sendo a sua aplicação

recente em estudos nos peixes. Parâmetros de motilidade espermática

apresentados pelo programa, como percentagem de espermatozóides móveis,

velocidade curvilinear, freqüência de batimento flagelar, dentre outros, poderiam

estar diretamente relacionados a taxa de fertilização e permitiriam predizer o

42

potencial reprodutivo de um indivíduo. Ainda segundo os autores, o programa

permite a obtenção de resultados quantitativos e a avaliação rápida da motilidade

espermática, que poderiam, inclusive, ser utilizados para análise de poluentes

ambientais sobre os reprodutores na natureza. Na aqüicultura, seria possível

observar o efeito da manipulação da temperatura, fotoperíodo e condições de

cultivo, além de possibilitar a verificação da viabilidade de meios diluentes e

crioprotetores para o congelamento de sêmen.

O objetivo deste trabalho foi, portanto, verificar a influência da osmolaridade

sobre a motilidade espermática da piabanha e, assim, desenvolver protocolos que

permitam a avaliação mais acurada da motilidade espermática. Além disso, foi

observada a influência da aplicação de EHBc sobre a motilidade.

43


2.1. PROCEDÊNCIA

Exemplares da espécie Brycon insignis foram pescados no rio Paraíba do

Sul e transportados até a Estação Experimental do Projeto, localizado no município

de Itaocara – RJ, distante 110 km do município de Campos dos Goytacazes – RJ.

Após domesticação, estes peixes foram submetidos ao procedimento de desova

induzida, originando a primeira geração de filhos (F1). Estes, por sua vez, foram

criados na Estação, recebendo ração extrusada a uma proporção de 2% do peso

vivo/dia, em tanques com aproximadamente 600 m2 e densidade de estocagem de

800g de peixe/m2 de lâmina d´água, até atingirem maturidade sexual, com 2 ou 3

anos de idade.

Os peixes foram despescados dos tanques externos de cultivo, sendo os

machos que apresentaram elevado grau de maturação (vertência de sêmen sob

compressão abdominal) selecionados e transportados até o laboratório, onde foi

procedida a biometria (medição do peso e comprimento) dos animais. Destes

animais selecionados, foi realizada a coleta de sêmen. O poro uro-genital, assim

como as regiões adjacentes foram devidamente secas e limpas e as porções do

sêmen contaminadas com sangue e/ou urina descartadas.

2.2. EFEITO DA OSMOLARIDADE SOBRE A MOTILIDADE ESPERMÁTICA

Imediatamente após a extrusão, as amostras seminais de três exemplares de

piabanha foram colocadas na maleta térmica e mantidas a 4oC. Em função da alta

44

concentração espermática, foi adaptado o procedimento descrito por BILLARD e

COSSON (1992) para avaliação da motilidade subjetiva.

O primeiro passo consistiu na preparação de um pré-diluente que não

ativasse a motilidade. Para tal, a uma gota de sêmen foram adicionadas duas gotas

de soluções salinas com diferentes concentrações e osmolaridades, cujos valores

estão apresentadas na tabela 1.

Tabela 1 - Concentrações (g de NaCl/100 mL de água destilada) e osmolaridades

(mOsm) das soluções testadas para verificação da motilidade espermática no sêmen

de piabanha Brycon insignis.

Concentração (%) Osmolaridade (mOsm)

0 0

0,2 68,38

0,4 136,75

0,6 205,13

0,8 273,50

1,0 341,88

1,2 410,26

1,4 478,63

1,6 547,01

Após a avaliação da concentração de NaCl que permitiria a pré-diluição de

modo a não ativar a motilidade espermática, foi testada a solução de NaHCO3 1%

para verificação da ativação espermática. Inicialmente 20 µL de sêmen foram

diluídos em 2 mL de NaCl 1,2%. Em seguida, 50 µL desta mistura foram colocados

numa lâmina ao microscópio pré-focalizado. Adicionaram-se, então, 250 µL de

NaHCO3 1%, sendo avaliada a presença de motilidade espermática ao microscópio

ótico comum, na lâmina, em aumento de 400 vezes (ocular de 10 e objetiva de 40).

45

2.3. EFEITO DA INDUÇÃO HORMONAL SOBRE A MOTILIDADE ESPERMÁTICA

Exemplares de piabanha, com vertência de sêmen mediante compressão

abdominal, foram selecionados de tanques externos e transportados ao Laboratório

de Reprodução do Projeto Piabanha. Os peixes foram medidos e pesados para que

então fossem induzidos hormonalmente utilizando-se extrato bruto de hipófise de

carpa, segundo WOYNAROVICH e HORVATH (1985). No ato da aplicação, foi

coletada uma gota de sêmen de cada exemplar, em uma lâmina histológica. A gota

de sêmen foi analisada subjetivamente quanto a sua motilidade acrescentando-se

duas gotas de NaHCO3 1%. Os peixes foram marcados e mantidos no tanque

interno do laboratório por 200 horas-graus, após o que, foi procedida nova coleta de

sêmen para análise de motilidade subjetiva. A análise pós-hipofisação foi realizada

por meio da metodologia em duas etapas: (1) a pré-diluição não ativadora e (2) a

diluição ativadora. Para tal, foram adicionados 20µL sêmen a 2 mL de NaCl 1,2% já

presente no tubo. A diluição ativadora (1:5) consistiu na retirada de 50 µL da mistura

"sêmen + solução não ativadora", colocação numa lâmina, num microscópio pré-

focalizado, e na adição de 250 µL de solução de NaHCO3 1%.

Os resultados obtidos foram agrupados de acordo com a motilidade pré-

hipofisação. O primeiro grupo foi constituído por amostras que apresentaram

motilidades subjetivas pré-hipofisação inferiores a 80%, sendo o outro grupo

constituído por valores iguais ou superiores a 80% (escala 5 de motilidade, segundo

CAROLSFELD et al., 2003). A partir destes dados, foram obtidas as médias, os

desvios-padrão, os valores máximos e mínimos das motilidades verificadas antes e

após a hipofisação. Foram verificadas a correlação entre estas motilidades e a

comparação entre as duas médias.

2.4. MOTILIDADE ESPERMÁTICA COM O ANALISADOR DE MOTILIDADE

ESPERMÁTICA ASSISTIDA POR COMPUTADOR (CASA)

Antes da realização das análises com o CASA, foi necessário o

desenvolvimento de um protocolo que permitisse a leitura pelo software. Assim, dois

machos de piabanha foram selecionados pela vertência de sêmen mediante

massagem abdominal e embalados em sacolas plásticas contendo água e oxigênio,

sendo posteriormente encaminhados vivos para o Laboratório de Melhoramento

Genético Animal – CCTA / UENF, para análise de motilidade espermática. Desde a

captura até a coleta de sêmen transcorreram aproximadamente 2 horas e meia,

46

sendo utilizado, para tranqüilizar os peixes durante o transporte, 0,5 mL de

benzocaína por litro de água.

No laboratório, o sêmen foi coletado em tubos plásticos de Eppendorf. Para

isto, o poro urogenital assim como as regiões adjacentes foram devidamente secos e

limpos, sendo as porções do sêmen contaminado com fezes, urina e sangue

descartadas. As amostras seminais foram submetidas ao procedimento de diluição

em duas etapas.

Após essa diluição, o material foi observado utilizando-se o microscópio de

contraste de fase, triocular (objetiva 10 x), com uma câmera CCD acoplada,

conectada a um microcomputador utilizando o programa CEROS – versão 10,

modelo Hamilton.

A configuração utilizada inicialmente foi a mesma descrita por RAVINDER et

al. (1997), que trabalharam com carpa Cyprinus carpio. Os parâmetros utilizados

estão presentes na tabela 4.

Foram feitas leituras consecutivas com diferentes porções de amostras

seminais, sendo os parâmetros ajustados de acordo com os resultados

apresentados até que os valores de percentagem de espermatozóides móveis

fossem compatíveis com o encontrado pela análise subjetiva.

O ajuste da configuração foi baseado principalmente na tela de Controle de

Qualidade por tamanho (QC by size) e por intensidade (QC by Intensity). Uma vez

sendo realizadas a leitura e obtenção dos resultados com o protocolo descrito por

RAVINDER et al. (1997), foram feitas modificações para análise específica do

sêmen de piabanha. Estas modificações permitiram a obtenção dos resultados de

forma compatível com a análise subjetiva.

Após a adaptação de nova configuração específica para análise do sêmen

de piabanha, foi possível analisar as seguintes variáveis da motilidade espermática:

- Percentual de espermatozóides móveis

- Percentual de espermatozóides móveis com movimento progressivo

- Velocidade na trajetória média (average-path velocity – VAP)

- Velocidade progressiva (Straight-line velocity – VSL)

- Velocidade curvilinear (track speed ou curvilinear velocity – VCL)

- Freqüência de batimento flagelar (beat frequence – BCF)

Com base na trajetória percorrida pelo espermatozóide, são obtidos alguns

parâmetros conforme se observa na figura 1.

47

Figura 1: Parâmetros relacionados à motilidade espermática medida ou calculada

pelo analisador de motilidade computadorizado. Os círculos preenchidos

correspondem ao posicionamento da cabeça do espermatozóide no momento em

que uma imagem é capturada pelo computador para análise. VAP – Velocidade na

trajetória média; VSL – Velocidade progressiva; VCL – Velocidade curvilinear; ALH -

Amplitude do deslocamento lateral da cabeça do espermatozóide; BCF – Freqüência

de batimento flagelar.

48


3.1. AVALIAÇÃO SUBJETIVA DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA

Os dados relacionados ao efeito de diferentes concentrações salinas sobre o

sêmen da piabanha são apresentados na tabela 2 e na figura 2.

Considerando que a osmolaridade média do plasma seminal da piabanha é

de 286 mOsm, é possível verificar que, quando o sêmen é diluído em soluções cujas

osmolaridades (de 0 a 274 mOsm) sejam inferiores a do plasma seminal,

praticamente todos os espermatozóides são ativados. A inibição parcial ou total dos

espermatozóides ocorre quando a diluição é realizada em soluções com

osmolaridades superiores a do plasma. O exemplar de número 2 (tabela 2)

apresentou 0% de motilidade quando a diluição ocorreu em solução de 341,88

mOsm. Entretanto, os outros dois exemplares testados apresentaram alguma

motilidade na mesma situação. A partir de 410,26 mOsm nenhum dos exemplares

apresentou qualquer tipo de ativação espermática. Estes resultados corroboram

TURDAKOV (1970) e MORISAWA e SUZUKI (1980), que trabalharam com

salmonídeos e verificaram que a alta pressão osmótica (400 mOsm) inibe a

motilidade espermática. LINHART et al. (1999) também observaram que os

espermatozóides da tilápia Oreochromis mossambicus são ativados quando a

osmolaridade da solução diluente varia de 0 a 333 mOsm.

49

1,6% NaCl (547 mOsm)

0%

0%

0%

0%

0%

-


0%

0%

0%

0%

0%

-


0%

0%

0%

0%

0%

-


30%

0%

20%

16,67%

15,28%

91,65%


95%

90%

90%

91,67%

2,89%

3,15%


95%

90%

90%

91,67%

2,89%

3,15%

0,4% NaCl (137mOsm)

95%

90%

90%

91,67%

2,89%

3,15%

0,2% NaCl (68 mOsm)

95%

90%

90%

91,67%

2,89%

3,15%

Motilidade espermática (em %) a diferentes concentrações de NaCl (em %) e osmolaridades (em mOsm)

0,0% NaCl (0mOsm)

95%

90%

90%

91,67%

2,89%

3,15%

TABELA 11: Taxas de fertilização (em %) da piabanha Brycon insignis (n=3) verificadas com diferentes proporções de espermatozóides por ovócito – Dados individuais, médias, desvios-padrão e Coeficientes de Variação (C.V. - %).

Peixe 1

Peixe 2

Peixe 3

Média

Desvio-padrão

C.V.(%)

50

0

20

40

60

80

100

0,0% (0)

0,2% (68)

0,4%(137)

0,6%(205)

0,8%(274)

1,0%(342)

1,2%(410)

1,4%(479)

1,6%(547)

Concentração de NaCl em % (Osmolaridade em mOsm)

Mot

ilida

de E

sper

mát

ica

Sub

jetiv

a (%

)

Figura 2: Motilidade espermática subjetiva do sêmen de piabanha Brycon insignis

submetidas a soluções de NaCl com diferentes osmolaridades.

SHIMODA (1999), SILVEIRA et al. (1985, 1990), OLIVEIRA et al. (1991),

KAVAMOTO e SILVEIRA (1986) e KAVAMOTO et al. (1986) procederam à ativação

dos espermatozóides adicionando duas gotas de água a uma gota de sêmen.

Entretanto, essa metodologia não proporciona a ativação simultânea de todos os

espermatozóides (BILLARD e COSSON, 1992). A diluição requerida para obtenção

de eficiente ativação de todos os espermatozóides é relativamente alta (1/1000). A

metodologia utilizada ainda hoje em alguns centros de pesquisa no país, baseada

em diluições menores, além de ser baseada em um critério subjetivo de avaliação,

não permite a ativação simultânea de 100% dos espermatozóides. Isto se constitui

em um problema na avaliação de motilidade, pois o espermatozóide dos peixes tem

curto período de atividade após a ativação. No presente trabalho, a metodologia de

diluição em duas etapas mostrou-se eficiente, verificando-se que praticamente todos

os espermatozóides foram ativados e que, pela diluição total de 1:500 (1:100 na pré-

diluição não ativadora e 1:5 na diluição ativadora), foi possível observar os

espermatozóides individualizados, o que permitiu a avaliação mais acurada da

percentagem de espermatozóides com motilidade.

51

3.2. EFEITO DA INDUÇÃO HORMONAL SOBRE A MOTILIDADE ESPERMÁTICA

Os dados individuais, médias e medidas de dispersão, das motilidades

espermáticas subjetivas do sêmen da piabanha, antes e após a hipofisação, estão

apresentados na tabela 3.

As médias das motilidades espermáticas subjetivas de piabanhas, antes e

após a hipofisação, não mostraram diferenças significativas (P<0,05), apesar do

valor numérico do sêmen coletado, após a hipofisação, ter sido maior. Não foi

verificada correlação significativa (P<0,05) entre a motilidade espermática antes e

após a hipofisação, considerando-se todos os indivíduos analisados.

A análise da motilidade dividida em dois grupos A e B, sendo A constituída

pelas amostras com 80% ou menos de motilidade, e B, com mais de 80%, permitiu a

identificação da influência da hipofisação apenas no grupo A (tabela 3).

No grupo B, com motilidades pré-hipofisação maiores que 80%, as amostras

seminais já apresentam alta qualidade, sendo classificadas no nível 5 (o mais alto)

da escala estabelecida por CAROLSFELD et al. (2003), mesmo antes do tratamento

hormonal, o que denota avançado estágio de maturação gonadal quando da

seleção. Devido aos altos valores, dificilmente haveria aumento na motilidade,

principalmente considerando-se que a percentagem mais alta de espermatozóides

móveis utilizada no presente trabalho foi de 95%. Não se verificaram, neste grupo,

diferenças significativas causadas pela hipofisação.

Com relação ao grupo A, com motilidades de até 80%, a indução hormonal

teve efeito significativo sobre este parâmetro. A média aumentou de 51,8% para

87,5%, após o tratamento com o EBHc. É possível que os indivíduos, inicialmente,

não se encontrassem em máxima maturação gonadal, o que foi obtido mediante a

hipofisação.

Desse modo, como não se procede rotineiramente a análise da motilidade

espermática, é recomendável a aplicação de EBHc para a desova induzida da

piabanha, para assim garantir altas motilidades. Se o exemplar estiver com alta

motilidade, esta será mantida e, caso a motilidade seja baixa, a hipofisação poderá

aumentá-la.

52

Tabela 3 - Valores individuais, média (X), desvio-padrão (s), coeficiente de variação

(CV) e valores mínimo (mín) e máximo (máx) das motilidades espermáticas

subjetivas (%), classificados nos grupos A (motilidades pré-hipofisação inferiores ou

iguais a 80%) e B (motilidades pré-hipofisação superiores a 80%), no sêmen da

piabanha, antes e após a hipofisação*

Motilidade (%) GRUPO No do exemplar Antes da hipofisação Após a hipofisação 25 0 85 6 20 80 30 25 90 17 30 80 28 30 90 18 45 95 21 50 95 1 65 75 16 65 90 9 75 90 8 80 80 10 80 95 15 80 90 26 80 90

A

X ±± s 51,8 ±± 27,0b 87,5 ±± 6,4a 2 90 90 5 90 60 13 90 90 19 90 95 22 90 95 24 90 85 27 90 95 29 90 20 31 90 90 32 90 95 3 95 95 4 95 90 7 95 90 11 95 95 12 95 95 14 95 50 20 95 90 23 95 80

B

X ±± s 92,2 ±± 2,6a 83,3 ±± 20,1a X ±± s 74,5 ±± 26,9a 85,2 ±± 15,6a C.V. 36,12 18,36 GERAL

Min – Máx 0 – 95 20 – 95 Médias seguidas pela mesma letra, numa mesma linha, não diferem entre si pelo

Teste t, ao nível de 5% de probabilidade.

Quanto às médias de espermatozóides móveis na piabanha hipofisada, o

resultado (85%) obtido no presente trabalho, é próximo do obtido por ANDRADE-

53

TALMELLI et al. (2001), que trabalharam também com a piabanha e verificaram

90,9% de espermatozóides móveis.

Com relação aos desvios-padrão observados nas duas situações, percebe-

se que, antes da hipofisação, ocorre maior variação. Isso talvez ocorra em função da

metodologia adotada para avaliação da motilidade. Antes da hipofisação, devido ao

volume pequeno de sêmen coletado para não estressar os peixes, foi possível

utilizar a metodologia de adição de duas gotas de NaHCO3 1% à 1 gota de sêmen. A

avaliação da motilidade tornou-se difícil devida à grande concentração espermática.

Foram visualizadas apenas ondas de movimentação espermáticas, o que dificultava

a avaliação mais precisa do percentual de espermatozóides móveis. A análise do

sêmen, após a hipofisação, foi realizada a partir do procedimento de diluição em

duas etapas, sendo a primeira não ativadora e a segunda ativadora. Com uma

diluição da ordem de 1:500, foi possível estimar melhor a percentagem de

espermatozóides com motilidade.

Ainda, o coeficiente de variação das piabanhas induzidas com EBHc, obtido

neste trabalho (C.V. = 18,4%), foi superior ao observado por ANDRADE-TALMELLI

et al. (2001), trabalhando com a mesma espécie induzida hormonalmente com hCG

(C.V. = 3,1%). Entretanto, os últimos autores determinaram a motilidade por meio da

adição de 2 gotas de NaHCO3 1% à 1 gota de sêmen. A observação visual dos

espermatozóides ao microscópio, utilizando-se este método, não é individualizada.

Na realidade, apenas podem ser observadas ondas de movimentação espermática.

Torna-se difícil, assim, determinar de forma acurada a percentagem de

espermatozóides móveis. Possivelmente amostras seminais analisadas, cuja

motilidade sejam acima de 70%, promovam o mesmo efeito visual caso a diluição

seja baixa (BILLARD e COSSON, 1992). Este fato, talvez, explique a pequena

variação existente entre os valores mínimo (85%) e máximo (95%) obtidos por

ANDRADE-TALMELLI et al. (2001), salvo a situação de todos os exemplares

realmente estarem em avançado estágio de maturação. Variações mais altas são

verificadas em outras espécies encontradas no Brasil quando é utilizado um

procedimento semelhante ao do presente trabalho. CARVALHO (2001), trabalhando

com a piapara Leporinus elongatus, e CRUZ (2001), estudando o curimbatá

Prochilodus lineatus, verificaram a motilidade espermática em soluções de NaCl com

várias concentrações. Dentre os tratamentos, os menores coeficientes de variação

observados foram de 29,9% e 10,2%, respectivamente.

54

3.3. MOTILIDADE ESPERMÁTICA COM O ANALISADOR DE MOTILIDADE

ESPERMÁTICA ASSISTIDA POR COMPUTADOR

Inicialmente, verificou-se que o software do CASA não contabilizava muitos

espermatozóides por considerá-los de tamanho inferior ao limite mínimo proposto

por RAVINDER et al. (1997). Foi realizado, então, o ajuste nos parâmetros tamanho

da cabeça imóvel, intensidade da cabeça imóvel, tamanho da cabeça estática

intensidade da cabeça estática. Os parâmetros ajustados para o sêmen de piabanha

estão apresentados na tabela 4.

Após a análise, foram obtidos os seguintes resultados: espermatozóides

móveis = 95%; espermatozóides móveis com movimento progressivo = 65%;

velocidade na trajetória média = 15,6 µm/s; velocidade progressiva = 11,0 µm/s;

velocidade curvilinear = 29,4 µm/s; freqüência de batimento flagelar = 28,8 Hz.

A alta percentagem de espermatozóides móveis (95%) atesta que os peixes

apresentavam-se maduros e aptos à indução hormonal quando da seleção.

O analisador de motilidade captura imagens sucessivas, identificando os

pontos onde o espermatozóide se encontra a cada imagem. São traçadas retas

entre estes pontos, sendo calculado o percurso total. A velocidade curvilinear (VCL)

encontrada foi de 24,9 µm/s, sendo calculada pela divisão do percurso (em µm) pelo

tempo de análise (em s). Já a velocidade na trajetória média (VAP), cujo valor

observado foi de 15,6 µm/s, é calculado traçando-se a trajetória média do

espermatozóide através dos pontos adquiridos pelo CASA. A velocidade progressiva

(11,0 µm/s) foi determinada calculando-se a distância entre o primeiro e o último

pontos observados e dividindo-se pelo tempo.

55

Tabela 4 - Configuração para utilização do CASA para o sêmen da piabanha Brycon

insignis, adaptado a partir de RAVINDER et al. (1997)

PARÂMETRO RAVINDER et al. (1997)

Adaptação sêmen a fresco

Imagens adquiridas

(Frame Acquired) 20 50

Taxa de aquisição das imagens

(Frame Rate) 25 Hz 60 Hz

Contraste mínimo

(Minimun Contrast) 6 20

Tamanho mínimo da célula

(Minimum Cell Size) 8 5

Contraste mínimo da célula estática

(Minimum Static Contrast) 6 30

Limiar mínimo de trajetória linear

(Straightness, Threshold – STR) 80% 80%

Tamanho da cabeça imóvel

(Head Size, Non-motile) 8 Pixels 2 Pixels

Intensidade da cabeça imóvel

(Head Intensity, Non-motile) 150 20

Tamanho da cabeça estática

(Static Head Size) 0,3 a 2,0 0,15 a 9,79

Intensidade da cabeça estática

(Static Head Intensity) 0,3 a 2,0 0,12 a 2,90

Magnificação

(Magnification) 1,95 2,04

Segundo KIME et al. (2001), a utilização do analisador de motilidade

computadorizado, além de permitir a avaliação rápida e precisa de parâmetros

relacionados à atividade espermática, proporciona condições para monitorar os

efeitos de metais pesados, seleção de reprodutores, avaliação dos métodos de

criopreservação e otimização do procedimento de desova artificial. Não obstante, o

56

teste de fertilização, também utilizado para avaliação da qualidade seminal,

freqüentemente incorre em problemas relacionados à qualidade dos ovócitos, além

de ser um teste operacionalmente difícil. Deste modo, espera-se que o presente

trabalho contribua para futuros estudos envolvendo o sêmen da piabanha.

Ainda, as adaptações da configuração do analisador de motilidade

computadorizado e da metodologia de diluição em duas etapas, proposta por

BILLARD e COSSON (1992), obtidas no presente trabalho podem proporcionar

avaliação mais acurada da motilidade. Estes procedimentos, uma vez estabelecidos,

permitem determinar a freqüência de batimento flagelar que, segundo os últimos

autores, é o parâmetro que melhor avalia a qualidade espermática, em função da

correlação direta com a capacidade fecundante.

57

4. CONCLUSÕES

1. Os espermatozóides da piabanha não são ativados quando diluídos em soluções

que contenham concentrações de NaCl superiores a 1,2%, podendo estas ser

utilizadas em pré-diluições não ativadoras da motilidade.

2. A metodologia de análise subjetiva da motilidade em duas etapas consistindo em

(1) uma pré-diluição não ativadora da ordem de 1:100 (20 µL de sêmen diluídos em

2 mL de NaCl 1,2%) e (2) uma diluição ativadora da ordem de 1:5 (50µL da pré-

diluição + 250 µL de NaHCO3 1%), permite a observação visual dos

espermatozóides de forma individualizada e a ativação de todos simultaneamente.

3. A indução hormonal com extrato bruto de hipófise de carpa aumenta a motilidade

espermática no sêmen da piabanha, desde que a motilidade, antes do tratamento,

seja de até 80%. Caso os valores, mesmo antes da hipofisação, sejam altos, a

motilidade não é afetada.

4. Foi adaptada uma configuração do analisador de motilidade espermática assistida

por computador para análise do sêmen de piabanha, que permite a obtenção de

parâmetros como percentual de espermatozóides móveis, percentual de

espermatozóides progressivos e freqüência de batimento flagelar.

58




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63

ANÁLISE QUÍMICA DO PLASMA SEMINAL DA PIABANHA Brycon insignis

RESUMO: A determinação das características químicas do sêmen de uma espécie

de peixe é essencial para o estabelecimento de protocolos de congelamento do

sêmen. A partir destas características torna-se possível, por exemplo, a obtenção de

soluções diluentes, utilizadas no congelamento, que não ativem os

espermatozóides. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar quimicamente o

plasma seminal da piabanha Brycon insignis. Foram despescados 13 machos de

piabanha pertencentes à Estação Experimental do Projeto Piabanha, localizada em

Itaocara (RJ), que apresentaram vertência de sêmen mediante compressão

abdominal. Estes peixes foram transportados ao Laboratório de Reprodução e

induzidos hormonalmente com 0,5 mg de extrato bruto de hipófise/Kg de peso. Após

200 horas-grau, o sêmen foi coletado em tubos de vácuo por massagem abdominal.

Procedeu-se a centrifugação do sêmen e retirada do plasma seminal, que foi

congelado. O material foi transportado à Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro, onde foram realizadas as análises laboratoriais. Os resultados obtidos

foram os seguintes (média±desvio-padrão): pH=8,47±0,286; [Na+] = 67,05±4,00 mM;

[K+] = 36,09±2,72 mM; [Ca+2] = 0,962±0,088 mM; [Mg+2] = 0,887±0,073 mM; [Cl-] =

84,99±3,56 mM; [proteína] = 1,025±0,168 mg/mL; osmolaridade = 286,92±24,6

mOsm.

Termos de indexação: análise química, plasma seminal, osmolaridade, concentração

de íons, piabanha.

64

ABSTRACT: CHEMICAL ANALISYS OF SEMINAL PLASMA OF PIABANHA Brycon

insignis

The determination of the chemical seminal characteristics in a species of fish is

essential for the establishment of protocols for semen freezing. After the obtaining of

this characteristics, it becomes possible, for example, to do diluents solutions used in

the freezing process, that do not activate the spermatozoa. Thus, the objective of this

work was to analyse chemically the seminal plasma of piabanha Brycon insignis. For

that, 13 males of piabanha were collected, from the Experimental Station of the

Piabanha Project, located in Itaocara (Rio de Janeiro State), which presented semen

with gentle stripping. These fish was carried to Laboratory of Reproduction and was

hormonally induced with 0,5 mg of crude extract hypofisis/Kg of weight. After 200

hours-degree, the semen was collected in vacuum tubes with stripping. Sperm

centrifugation was proceeded and plasma seminal was retired and frozen. This

material was carried to Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,

where the laboratorial analyses was developed. The reached results was:

(average±standard-deviation): pH = 8,47±0,286; [Na+] = 67,05±4,00 mM; [K+] =

36,09±2,72 mM; [Ca+2] = 0,962±0,088 mM; [Mg+2] = 0,887±0,073 mM; [CL-] =

84,99±3,56 mM; [protein] = 1,025±0,168 mg/mL; osmolarity = 286,92±24,6 mOsm.

Index Terms: chemical analysis, seminal plasma, osmolarity, ions concentrations,

piabanha.

65

1. INTRODUÇÃO

No Brasil, estudos sobre sêmen de peixes (TATSON e GODINHO, 2003;

ANDRADE-TALMELLI et al., 2001; CAROLSFELD et al., 1990, 2003; CARVALHO,

2001; CÓSER et al., 1984, 1987, 2000; KAVAMOTO e SILVEIRA, 1986;

KAVAMOTO et al., 1985, 1986, 1987, 1989; OLIVEIRA et al., 1991; RIBEIRO, 2001;

SILVEIRA et al., 1984, 1985a, 1985b, 1987, 1988, 1990; SILVA, 2000; SHIMODA et

al., 1997) não incluíram a caracterização química do plasma seminal, sendo esta

caracterização restrita até recentemente a trabalhos no exterior. O primeiro trabalho

no país foi realizado com o pacu Piaractus mesopotamicus, que teve a descrição das

suas características químicas procedidas por SHIMODA (1999).

Segundo TAN-FERMIN et al. (1999), a diluição do sêmen em solução com

mesma composição do plasma seminal permite melhor aproveitamento da sua

capacidade fecundante, principalmente, levando-se em conta que a quantidade de

sêmen utilizada em procedimentos rotineiros de desova induzida são maiores do que

o necessário. Este melhor aproveitamento é especialmente vantajoso em espécies

como o Clarias macrocephalus, cuja forma de obtenção de sêmen é por meio do

sacrifício do macho e a maceração dos testículos.

Ainda, a diluição do sêmen tem sido utilizada para aumentar o seu

aproveitamento em salmonídeos e na tilápia (OHTA e ISAWA, 1996). TAN-FERMIN

et al. (1999) afirmam que o uso de diluentes pode estabilizar as condições físico-

químicas durante a estocagem do sêmen, prolongando a viabilidade dos

espermatozóides. Os mesmos autores obtiveram um plasma seminal artificial, a

66

partir da análise do natural, e verificaram aumento nas taxas de fertilização,

reduzindo a necessidade de sacrifício de machos do Clarias macrocephalus.

Para criopreservação do sêmen de peixes, a metodologia atual consiste em,

inicialmente, diluí-lo em soluções contendo crioprotetores. Entretanto, em peixes de

água doce, se esta solução apresentar osmolaridades inferiores ao do plasma

seminal, os espermatozóides são ativados, após o que sua viabilidade é de

aproximadamente 1 min (BILLARD e COSSON, 1992). É interessante, portanto, a

verificação da osmolaridade do plasma para conhecimento mais aprofundado do

comportamento dos espermatozóides em soluções com diferentes concentrações

osmóticas.

A influência de outros parâmetros relacionados às características químicas

do plasma seminal de peixes foi analisada por alguns autores. O pH do meio onde

ocorre a fertilização tem grande influência sobre o sucesso da fertilização (BILLARD

et al., 1974), pois a motilidade espermática varia em diferentes pHs.

A motilidade do espermatozóide de truta é inibida em pH menor que 7,5

(BAYNES et al., 1981; BILLARD e COSSON, 1988, 1989; ROBITAILLE et al., 1987),

valor este inferior ao pH do sêmen e do plasma seminal. Entretanto, o acréscimo de

Ca+2 e de Mg+2 podem reduzir esta inibição.

NOMURA (1964) encontrou pH de 8,0 a 8,2 no sêmen de truta e 8,2 a 8,3 no

plasma seminal, enquanto que MORISAWA e MORISAWA (1988) observaram pH

médio de 7,99 no fluido seminal.

Baixas variações individuais são observadas no pH do fluido seminal na

maioria das espécies já estudadas. O pH já foi determinado no fluido seminal de

alguns peixes: pacu Piaractus mesopotamicus: 8,74±0,17 (SHIMODA, 1999);

Scophthalmus maximus: 7,31±0,03 (SUQUET et al., 1993); Sparus sarba: 7.83±0.04

(CHAMBEYRON e ZOHAR, 1990); Salmo salar: 8.25±0.03 (HWANG e IDLER,

1969); Oncorhynchus keta: 8.15±0.07 (MORISAWA e MORISAWA, 1988);

Oncorhynchus mykiss: 7.99±0.06 (MORISAWA e MORISAWA, 1988); carpa:

7.96±0.03 (PLOUIDY e BILLARD, 1982); 8.50±0.00 (KOENIG et al., 1978).Embora

os desvios-padrão citados sejam baixos, durante o período de espermiação têm sido

reportadas variações no pH do plasma seminal em Salmo salar (PIIRONEN, 1985) e

na tilápia (KRUGER et al., 1984).

67

A osmolaridade (que apresenta influência da concentração de íons) e a

concentração de potássio podem determinar a atividade dos espermatozóides num

dado meio diluente.

As concentrações de vários íons nos fluídos sangüíneo e seminal do

Carassius auratus foram obtidas por MORISAWA et al. (1983) sendo,

respectivamente: Na+, 123 e 96; K+, 2.4 e 70.2; Ca+2, 3.1 e 2.1; Mg+2, 1.0 e 1.1; Cl-,

110 e 128 mM. Da mesma maneira, estudando a carpa Cyprinus carpio, obtiveram: :

Na+, 135 e 75; K+, 4.6 e 82.4; Ca+2, 2.9 e 2.0; Mg+2, 1.0 e 0.8; Cl-, 118 e 112 mM.

Ainda com relação às concentrações de alguns íons e à osmolaridade do plasma

seminal da carpa, outros estudos foram realizados, conforme mostra a tabela 1.

Tabela 1 - Concentração de íons (mM), osmolaridade (mOsm) e pH do plasma

seminal de carpa Cyprinus carpio segundo alguns autores

PARÂMETRO DA ANÁLISE QUÍMICA

AUTORES Na+

(mM)

K+

(mM)

Ca+2

(mM)

Mg+2

(mM)

Osmola-ridade

(mOsm) pH

CLEMENS e GRANT (1965) 91,3 65,2 12,5 0,02 - -

PLOUIDY e BILLARD (1982) 75,0 82,4 2,0 0,8 - -

KRUGER et al. (1984) 71,0 79,0 2,7 - 346 7,53

MORISAWA et al. (1983) verificaram que os espermatozóides de ciprinídeos

(carpa Cyprinus carpio, goldfish Carassius auratus, Carassius carassius e duas

espécies de “dace” Tribolodon hakonensis e T. taczanowskii) permanecem imóveis

quando o sêmen é diluído em soluções de NaCl, KCl, manitol e glicose iso-

osmolares em relação ao plasma seminal. Ainda segundo estes autores, o potássio

aumenta a viabilidade e velocidade do movimento espermático quando em

concentrações menores do que o do fluido seminal, enquanto que o sódio e os não-

eletrolíticos são menos efetivos. O decréscimo da osmolaridade também pode ter

participação na iniciação da motilidade.

O potássio é o maior componente do fluido seminal, apresentando

concentração 23-30 vezes maior do que no fluido sangüíneo. O conteúdo de

potássio é muito maior em espécies marinhas quando comparado a peixes de água

doce. Entre estes últimos, os ciprinídeos são os que apresentam os maiores valores

68

de concentração de potássio. O plasma seminal dos ciprinídeos e salmonídeos

contém mais potássio do que o plasma sanguíneo. Entretanto, ocorrem similares

concentrações nos dois plasmas de Scophthalmus maximus (GAUMET, 1994).

STOSS (1983) associou a imobilidade do espermatozóide de truta com a

alta concentração dos íons K+ no fluido seminal. Entretanto, BILLARD e COSSON

(1992) obtiveram indicadores de que a inibição da motilidade pelos íons K+ varia

durante a estação reprodutiva. No início e no final do período de espermiação, uma

alta percentagem de espermatozóides tornou-se imóvel mesmo em presença de 40

e 80 mM K+. Verificaram ainda que íons Na+ e altas concentrações de Ca+2 podem

sobrepor o efeito inibitório do íon K+.

A concentração de potássio (mmol/L), no fluido seminal, já foi determinada

para algumas espécies: Scophthalmus maximus: 3.8±0.3 (SUQUET et al., 1993);

Salmo salar: 27,5±1,0 (AAS et al., 1991) e 22,0±1,3 (MORISAWA, 1985);

Oncorhynchus mykiss: 32,5±2,1 (MORISAWA e MORISAWA, 1988); Salvelinus

fontinalis: 25,1±6,1 (MARSHALL, 1986); carpa: 43,5 (PLOUIDY e BILLARD, 1982);

goldfish Carassius auratus: 70,2±1,7 (MORISAWA, 1985) e 55,2±1,4 (GRANT et al.,

1969).

Diversas observações indicam que uma concentração de Ca+2 externo é

necessária para iniciar a motilidade. Condições que limitam a entrada de cálcio no

interior da célula (tal como uma retirada do cálcio no meio externo ou bloqueio dos

canais de entrada) reduzem a motilidade espermática. MORISAWA (1985) sugere

que o influxo de cálcio deva ocorrer nos primeiros passos da iniciação da motilidade,

sob o controle das concentrações externas de potássio e hidrogênio.

Em salmonídeos, é sugerido que as proteínas do líquido seminal

desempenham um papel protetor no espermatozóide (BILLARD, 1983). Na

Oncorhynchus mykiss, uma concentração mais alta de proteína é verificada ao início

da espermiação (SANCHEZ-RODRIGUEZ et al., 1978). No Scophthalmus maximus,

observa-se concentração protéica elevada no plasma seminal (acima de 8,8 mg/mL),

quando comparada a outras espécies (<2 mg/mL), sugerindo que haja a mesma

função protetora desempenhada em salmonídeos, uma vez que a percentagem de

espermatozóides móveis e a duração do movimento são reduzidas em altas taxas de

diluição, usando diluentes minerais, enquanto que são mantidas em um meio

suplementado com albumina bovina sérica (FAUVEL et al., 1993).

69

Foi determinada, ainda, a concentração protéica (mg/mL) na truta

Oncorhynchus mykiss (1,3±0,2, CIERESZKO e DABROWSKI, 1993) e na carpa

Cyprinus carpio (1,2, PLOUIDY e BILLARD, 1982; 0,4 a 3,8, KRUGER et al., 1984;

0,60, BELOVA, 1981).

O objetivo deste trabalho foi, portanto, caracterizar quimicamente o plasma

seminal da piabanha Brycon insignis submetida a hipofisação, a partir da obtenção

de dados relacionados ao pH e à osmolaridade, concentrações de proteína,

potássio, cloreto, sódio, magnésio e cálcio.

70


O presente trabalho foi desenvolvido com 13 peixes oriundos da Estação

Experimental do Projeto Piabanha, localizado no Município de Itaocara – RJ. As

análises laboratoriais foram realizadas utilizando a infra-estrutura existente nos

laboratórios dos Centros de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA) e

Biociênciais e Biotecnologias (CBB) da Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro (UENF), em Campos (RJ).

Os machos com vertência de sêmen mediante compressão abdominal foram

selecionados, transportados ao Laboratório de Reprodução e submetidos ao

procedimento de hipofisação proposto por WOYNAROVICH e HORVATH (1983),que

consistiu na aplicação de 0,5 mg de extrato bruto de hipófise por kg de peso. Os

peixes foram mantidos nos tanques internos do laboratório por 200 horas-grau, após

o que, as amostras seminais foram coletadas. A papila genital e adjacências foram

secas, sendo descartadas as amostras contaminadas com fezes e urina. O fluido

seminal foi separado dos espermatozóides em uma centrífuga para tubos Q-222T,

marca QUIMIS, a 3400 rpm (1809 g), durante 30 min.

Para determinação do pH foi utilizado um pHmetro WTW - pH 320/set – 1. A

determinação da concentração dos íons, no fluido seminal, foi realizada através de

um espectrofotômetro de absorção atômica de chama ZEISS - AAS 4 (MORISAWA

et al., 1983). O fluido seminal foi diluído em água destilada, 25 vezes para

determinação da concentração de cálcio; 125, para magnésio; 1250, para potássio e

sódio. Para determinação do conteúdo de proteínas foi utilizado o procedimento

proposto por BRADFORD (1975). Inicialmente, foi obtida a equação de regressão

entre as absorbâncias e as diversas concentrações de albumina bovina sérica

testadas. Posteriormente, as amostras de plasma seminal foram analisadas no

71

espectrofotômetro UV-160A - UV - Visible Recording Spectrophotometer Shimadzu.

O conteúdo protéico foi obtido a partir da equação de regressão, com base nas

absorbâncias observadas nas amostras.

72


Os dados individuais relativos à análise química do sêmen do Brycon

insignis (piabanha), bem como as médias, as medidas de dispersão (desvio-padrão

e coeficiente de variação), os valores máximos e mínimos e os intervalos de

confiança (P<0,05) são apresentados na tabela 2.

A média do pH (tabela 2), verificado no plasma seminal da piabanha Brycon

insignis (pH = 8,471 ± 0,286), é mais alta que as médias verificadas nos peixes

Scophthalmus maximus: 7,31±0,03 (SUQUET et al., 1993); Sparus sarba: 7.83±0.04

(CHAMBEYRON e ZOHAR, 1990); Salmo salar: 8.25±0.03 (HWANG e IDLER,

1969); Oncorhynchus keta: 8.15±0.07 (MORISAWA e MORISAWA, 1988);

Oncorhynchus mykiss: 7.99±0.06 (MORISAWA e MORISAWA, 1988); carpa

Cyprinus carpio: 7.96±0.03 (PLOUIDY e BILLARD, 1982); 8.50±0.00 (KOENIG et al.,

1978). Como se percebe, ocorrem baixas variações de pH entre os indivíduos

(desvio-padrão) de uma mesma espécie, tanto na piabanha quanto nas espécies

citadas.

73

pH

8,64

7,98

8,24

8,91

8,33

8,42

8,59

8,41

8,04

8,75

8,87

8,44

8,50

8,47

0,29

3,38

8,3 – 8,6

Na+

(mM)

71,0

65,4

63,7

75,4

62,1

63,2

73,0

64,9

66,4

66,5

68,9

64,0

67,2

67,1

4

5,97

65 – 70

K+

(mM)

38,4

33,7

35,7

39,1

34,8

29,9

36,1

36,2

38,4

40,0

36,4

33,5

37,0

36,1

2,72

7,56

34 – 38

Ca+2

(mM)

1,02

0,85

0,97

1,06

0,89

0,90

1,12

0,86

0,97

0,84

0,98

0,99

1,05

0,96

0,09

9,19

0,91 – 1,01

Mg+2

(mM)

0,78

0,96

0,84

0,80

0,85

0,87

1,00

0,94

0,79

0,92

0,96

0,87

0,95

0,89

0,07

8,23

0,85 – 0,93

Cl-

(mM)

90,1

88,4

75,6

84,0

85,5

87,1

85,2

86,4

84,7

85,0

84,5

87,1

81,3

85

3,56

4,19

83 – 87

proteína

(mg/mL)

0,988

1,027

1,216

0,846

1,075

1,119

0,769

0,980

1,174

0,842

1,094

1,345

0,855

1,02

0,17

16,43

0,9 – 1,1

Osmolari-dade

(mOsm)

270

240

320

310

310

280

290

300

260

270

270

290

320

286,9

24,6

8,58

269 – 302

Comprimen-to-padrão

(cm)

27

22

26

25

26

26

26

24

27

25

25

26

26

25,5

1,3

5,2

25 – 26

Peso

(g)

248

186

238

215

250

235

207

222

230

197

219

236

214

222,9

19,2

8,6

211 – 234

Tabela 2 – Dados individuais, médias (X), desvios-padrão (s), coeficientes de variação (C.V.) e limites de confiança (L.C.), relativos à biometria (peso e comprimento-padrão) e à análise química do plasma seminal do Brycon insignis (piabanha) hipofisado.

No do exemplar

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

X

S

C.V. (%)

L.C.

74

O fato de o pH do plasma seminal da piabanha ser superior ao obtido em

outras espécies é extremamente relevante, principalmente, quando se considera que

a motilidade do espermatozóide de truta é inibida em pH menor que 7,5 (BAYNES et

al., 1981; BILLARD e COSSON, 1988, 1989; ROBITAILLE et al., 1987). Esta inibição

ocorre em um pH (7,5) inferior ao pH do plasma seminal obtido por INABA et al.

(1958), de 7.96±0.04, e por MORISAWA e MORISAWA (1988) de 7.99±0.06. É

sugerido nestas espécies, portanto, que pode ocorrer inibição da atividade

espermática quando os espermatozóides encontram-se em meio com pHs muito

inferiores ao verificado no plasma seminal. Esta informação tem grande importância

de cunho prático, pois a ativação dos espermatozóides faz-se, na maioria das

estações de piscicultura, mediante a diluição do sêmen + massa de ovócitos em

água de torneira. Caso a água apresente pH ácido, boa parte dos espermatozóides

pode não ser ativada, o que culminaria num baixo percentual de ovócitos

fecundados. É interessante, portanto, que se realize uma análise da água utilizada

para fecundação, ou que se utilize água de pH padronizado, no intuito de evitar

ineficiência do processo.

A concentração de potássio no plasma seminal chega a ser de 23 a 30

vezes maior do que a verificada no plasma sangüíneo. Dentre os peixes de água

doce, os ciprinídeos são os que apresentam os maiores valores de concentração de

potássio. Ainda, o plasma seminal dos ciprinídeos e salmonídeos contém mais

potássio do que o plasma sanguíneo (GAUMET, 1994). Possivelmente esta situação

ocorra também na piabanha, espécie de água doce. Sugere-se que o potássio

desempenha papel de inibição à ativação espermática, que seria sobreposta

mediante diluição do sêmen e, conseqüentemente, fator de inibição, conforme será

discutido mais adiante.

No presente trabalho, foi observada concentração média de K+ de 36,092

mM (mmol/L) no plasma seminal da piabanha (tabela 2). Essa concentração é

inferior à verificada no Carassius auratus, de 70.2 mM, e na carpa Cyprinus carpio,

de 82.4 mM, ambas espécies estudadas por MORISAWA et al. (1983). A

concentração de potássio (mmol/L), no fluido seminal, já foi determinada para outras

espécies: Scophthalmus maximus: 3.8±0.3 (SUQUET et al., 1993); Salmo salar:

27,5±1,0 (AAS et al., 1991) e 22,0±1,3 (MORISAWA, 1985); Oncorhynchus mykiss:

32,5±2,1 (MORISAWA e MORISAWA, 1988); Salvelinus fontinalis: 25,1±6,1

(MARSHALL, 1986); carpa Cyprinus carpio: 43,5 (PLOUIDY e BILLARD, 1982);

75

goldfish Carassius auratus: 70,2±1,7 (MORISAWA, 1985) e 55,2±1,4 (GRANT et al.,

1969).

A concentração média de cálcio no plasma seminal de piabanha foi de

0,962mM, inferior à concentração verificada no Carassius auratus de 2,1 mM e da

verificada no Cyprinus carpio, de 2.0 mM (MORISAWA et al., 1983). Trabalhos que

determinaram a concentração de cálcio no plasma seminal, na literatura

internacional, são poucos e, no Brasil, inexistentes.

A concentração de magnésio (0,887 mM) obtida neste experimento foi

inferior ao verificado por MORISAWA et al. (1983) no Carassius auratus (1,1 mM), e

superior a verificada no Cyprinus carpio (0,8 mM). Situação semelhante ocorreu com

a concentração de cloreto, inferior na piabanha (84,992 mM) em relação ao C.

auratus (128 mM) e ao C. carpio (112 mM). Também a concentração (mmol/L) de

sódio (67,05mM), no pacu, foi inferior à verificada no C. auratus, de 96 mM, embora

superior à concentração observada no C. carpio, de 75mM.

Foi verificada a concentração média de 84,99 mmols Cl- / L nas amostras

seminais de piabanha hipofisada, valores estes menores do que os obtidos por

MORISAWA et al. (1983) trabalhando com Carassius auratus (120 mM) e Cyprinus

carpio (112 mM). Não foi realizada, entretanto, a determinação do teor de cloreto, no

Alburnus alburnus, estudado por LAHNSTEINER et al. (1996) e, nos salmonídeos,

estudados por LAHNSTEINER et al. (1993). O cloreto, além de ser utilizado na

preparação de soluções diluidoras para congelamento do sêmen, influencia na

osmolaridade, que pode inibir a atividade espermática.

O conteúdo protéico médio de 1,025±0,168 mg proteína/mL foi obtido na

piabanha, valor este inferior ao verificado na Oncorhynchus mykiss (1,3±0,2,

CIERESZKO e DABROWSKI, 1993) e na carpa (1,2, PLOUIDY e BILLARD, 1982).

Como se percebe, as concentrações de potássio, sódio, magnésio, cálcio e

cloreto obtidas nas piabanhas hipofisadas são inferiores às reportadas em outras

espécies não hipofisadas por diversos autores. Por outro lado, a concentração

espermática é compatível com o encontrado na literatura. Talvez a aplicação de

hormônios gonadotrópicos (hipófise) possa estimular a produção de sêmen, com

proporcional incremento na produção espermatogênica. Entretanto, este aumento no

volume seminal, via tratamento hormonal, possivelmente não consiga estimular, de

forma proporcional, a liberação de íons e de proteína para o plasma seminal de

maneira a manter as concentrações constantes. Em outras palavras, o aumento da

76

liberação de íons e proteínas, no sêmen, seria proporcionalmente menor do que o

aumento de volume seminal, ocorrendo a diluição destes componentes. Isto poderia

explicar as concentrações iônicas e protéicas mais baixas obtidas na piabanha

hipofisada em relação aos demais peixes não hipofisados.

Essa especulação, caso comprovada mediante a análise do plasma seminal

de exemplares não hipofisados, será importante no estabelecimento de

procedimentos visando o congelamento do sêmen. Por exemplo, na confecção de

meios diluentes para congelamento, deverão ser testadas soluções contendo

concentrações iônicas e protéicas baseadas na composição do sêmen de peixes

hipofisados e não hipofisados. É cogitada, ainda, a suplementação de proteína antes

do congelamento, visto que esta pode apresentar capacidade crioprotetora. Mais,

talvez o acréscimo de cálcio ao sêmen possa aumentar a eficiência da fertilização,

uma vez que já foi verificado que uma quantidade mínima deste íon é necessária

para iniciação da motilidade espermática.

Dentre os parâmetros da biometria e análise química, as correlações que

apresentaram significância estão presentes na tabela 3.

77

Tabela 3 - Valores das correlações entre parâmetros da biometria e da análise

química e suas respectivas significâncias

VARIÁVEIS CORRELACIONADAS CORRELAÇÃO SIGNIFICÂNCIA

peso x comprimento-padrão +0,7160 P<0,01

peso x [proteína] +0,5457 P<0,05

comprimento-padrão x [Ca+2] +0,5108 P<0,05

pH x [Na+] +0,6276 P<0,05

[Na+] x [K+] +0,5714 P<0,05

[Na+] x [Ca+2] +0,7028 P<0,01

[K+] x [proteína] -0,4901 P<0,05

comprimento-padrão x [Mg+2] -0,5337 P<0,05

[Cl-] x osmolaridade -0,6306 P<0,05

[Na+] x [proteína] -0,6417 P<0,01

peso x [Mg+2] -0,6598 P<0,01

78

4. CONCLUSÕES

O plasma seminal da piabanha hipofisada apresentou as seguintes

características químicas (média±desvio-padrão): pH=8,47±0,286; [Na+] = 67,05±4,00

mM; [K+] = 36,09±2,72 mM; [Ca+2] = 0,962±0,088 mM; [Mg+2] = 0,887±0,073 mM; [Cl-

] = 84,99±3,56 mM; [proteína] = 1,025±0,168 mg/mL; osmolaridade = 286,92±24,6

mOsm. Correlacionam-se positivamente os parâmetros peso x comprimento-padrão;

peso x [proteína]; comprimento-padrão x [Ca+2]; pH x [Na+]; [Na+] x [K+]; [Na+] x

[Ca+2] e, negativamente, peso x [Mg+2]; [Na+] x [proteína]; [Cl-] x osmolaridade;

comprimento-padrão x [Mg+2]; [K+] x [proteína].

79


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DETERMINAÇÃO DA RAZÃO ÓTIMA DE ESPERMATOZÓIDES POR OVÓCITO

NA PIABANHA Brycon insignis

RESUMO: A razão ideal de espermatozóides por ovócito tem sido determinada em

poucas espécies de peixe. A determinação desta razão permitirá o melhor

aproveitamento do sêmen de espécies ameaçadas de extinção. Este trabalho foi

realizado na Estação Experimental do Projeto Piabanha, em Itaocara (RJ), e

objetivou a determinação da razão ótima de espermatozóides por ovócito. Dois

machos e duas fêmeas, aptos à desova induzida, foram selecionados e

transportados ao Laboratório de Reprodução. Realizou-se a biometria, sendo os

peixes submetidos ao procedimento de indução hormonal com extrato bruto de

hipófise de carpa. Após 200 horas-grau, os peixes foram extrusados. Constituiu-se

um pool de ovócito e outro pool de sêmen. Foram colocados 2 g de ovócitos (peso

médio dos ovócitos: 701 ovócitos/g) em um copo plástico. A estas amostras foi

adicionado 1 mL de sêmen pré-diluído, de forma que a relação

espermatozóides/ovócito em cada tratamento foi de: T1=86.662, T2=173.324,

T3=259.986, T4=346.648 e T5=433.310. Cada tratamento teve 3 repetições. A

seguir, adicionaram-se 2 mL de NaHCO3 1% em cada copo, para ativação dos

espermatozóides. Após a hidratação dos ovos, estes foram transferidos para

incubadoras sendo verificada a percentagem de fertilização após o fechamento do

blastóporo. Foram observadas as seguintes taxas de fertilização, em relação ao

controle (média observada = 65,3%, média relativizada = 100%), nos tratamentos:

T1=35,7%, T2=53,1%, T3=79,1%, T4=93,4% e T5=87,8%. A percentagem de

fertilização (em relação ao controle) aumenta de forma linear com a razão de

espermatozóides por ovócito segundo a equação de regressão: X Y[Z(\�]%\�\_^0,0002297X (P<0,01; R2=0,98). A quantidade ideal de espermatozóides aumentou

até a proporção de 314.481 espermatozóides por ovócito, após o que, a taxa de

fertilização se estabiliza num platô de 88% em relação ao controle constituído sêmen

sem diluição.

Termos de indexação: razão ótima de espermatozóides por ovócito; teste de

fertilização; piabanha.

86

ABSTRACT: DETERMINATION OF THE OPTIMUM RATIO OF SPERMATOZOA

PER OOCYTE IN THE PIABANHA Brycon insignis

The optimum ratio of spermatozoa per oocyte has been determined in few species of

fish. The determination of this ratio will permit better exploitation of the semen of

extinguishing threatened species. This work was carried in the Experimental Station

of the Piabanha Project, in Itaocara (RIO DE JANEIRO STATE), and objectified to

determine the excellent amount of spermatozoa per oocyte. Two males and two

females able to induce spawning was selected and carried to the Laboratory of Fish

Reproduction. Biometric parameters were measured, and fish were induced to spawn

using crude pituitary extract of carp. After 200 degree-hour, the fish were stripped. A

pool of oocytes and another one of semen was done. 2 g of oocytes (average oocyte

weight: 701 ovocytes/g) was placed in a plastic cup. To these samples, 1mL of pre-

diluited sperm was added, so that form the spermatozoa/oocyte ratios in each

treatment: T1=86.662, T2=173.324, T3=259.986, T4=346.648 and T5=433.310. Each

treatment had 3 repetitions. Then, 2mL of NaHCO3 1% was added in each cup, for

activation of the spermatozoa. After eggs hidratation, it was transferred to incubators,

being verified the fertilization rate after the blastopore closure. The following

fertilization rates observed, in relation to the control (average observed = 65.3%,

relativezed average = 100%), in the treatments: T1=35,7%, T2=53.1%, T3=79.1%,

T4=93.4% and T5=87,8%. The fertilization rates (in relation to the control) increases

linearly with the spermatozoa per oocyte rate, according to the regression: `badc�eFfTe�e+ 0,0002297X (P<0,01; R2=0,98). The optimum amount of spermatozoa increased

until the ratio of 314.481 spermatozoa per oocyte, and subsequently the fertilization

rate stabilizes in a plateau of 88% in relation to control, constituted by semen without

dilution.

Index terms: optimum ratio of spermatozoa per ovocyte; fertilization test ; piabanha.

87

1. INTRODUÇÃO

Dentre as várias formas de se avaliar a qualidade espermática, o método

mais conclusivo é o teste de fertilização (RIBEIRO, 2001), sendo comum expressar o

seu resultado em percentagem de ovos que atingem a fase de fechamento do

blastóporo (CAROLSFELD et al., 2003). Embora o teste tenha sido utilizado com

alguma freqüência em experimentos de criopreservação de sêmen (SILVEIRA et al.,

1984 e 1990; KAVAMOTO et al., 1989; CÓSER et al., 1992; SILVA et al., 2000),

poucos são os trabalhos no Brasil que determinam a razão ótima de

espermatozóides por ovócito.

Segundo SUQUET et al. (2000), devido à dificuldade de obtenção de coleta

de ovócitos de boa qualidade, a capacidade fecundante do sêmen criopreservado

tem sido avaliada em poucas espécies. Outra dificuldade encontrada na avaliação

da capacidade fecundante é a coleta de quantidades precisas de ovócitos. Por

exemplo, os mesmos autores, ao coletarem 9 amostras consecutivas com 800 µL de

ova, observaram alto coeficiente de variação (66,5%) no número de ovócitos em

cada amostra. Uma alternativa é a coleta de amostras por peso. Entretanto,

correlações entre número de ovócitos e seu peso devem ser calculadas para cada

espécie, podendo haver variações individuais de acordo com as condições de cultivo

e as variações sazonais.

A capacidade fecundante tem sido usada para avaliação dos danos

causados na criopreservação. Na truta, foi verificada correlação positiva entre

percentagem de fertilização e a motilidade quando foram usadas baixas proporções

88

de espermatozóides por ovócito (< 200.000 espermatozóides/ovócito). Maiores

razões não permitiram evidenciar a correlação (MOCCIA e MUNKITTRICK, 1987).

Portanto, o conhecimento da proporção espermatozóides por ovócito é necessário

para avaliação da eficiência da criopreservação.

SILVEIRA et al. (1988) encontraram a razão de 200.000 espermatozóides

por óvulo como a ideal para Onchorynchus mykiss, obtendo 80,83% de fertilização,

resultado próximo ao encontrado por Billard et al. apud BLAXTER (1974), que

obtiveram 80,42% de fertilização utilizando a mesma razão. Ainda, segundo

SILVEIRA et al., 1988, tratamentos contendo de 10 a 100 mil espermatozóides por

óvulo apresentaram percentagens de fertilização variando de 19,17 a 49,17%,

diferindo de Billard et al. apud BLAXTER (1974), que encontraram entre 69,48 e

67,63% de fertilização, empregando de 20 a 150 mil células espermáticas por

óvulos.

SILVEIRA et al. (1984) obtiveram média de 78% de fertilidade quando

utilizaram em média 13 milhões de espermatozóides por óvulo de truta

Oncorhynchus mykiss.

KAVAMOTO et al. (1987) verificaram que as estimativas de fertilidade

revelam efeitos quadráticos do número de ovos incubados e motilidade direta

subjetiva (P<0,01), e efeitos cúbicos de números de ovos embrionados e número de

espermatozóides vivos por mL x 106/óvulo (P<0,05), trabalhando com Onchorynchus

mykiss.

SUQUET et al. (1995), trabalhando com a espécie marinha Scophthalmus

maximus, obtiveram fertilizações de 58,4 a 93,9% utilizando 6000 espermatozóides

por óvulo por um tempo de contato de 1 min entre gametas. Para valores inferiores,

o percentual de fertilização decresceu e tornou-se muito variável. Em amostras de

óvulos de baixa qualidade, este percentual foi muito variável mesmo para altas

razões espermatozóide / óvulo.

FAUVEL et al. (1999), trabalhando com Dicentrarchus labrax, obteve 6600

espermatozóides por ovócito como a proporção ótima para fertilização. Razões

superiores não apresentaram diferença significativa na percentagem de ovócitos

fecundados.

O objetivo deste trabalho foi, portanto, determinar a razão ótima de

espermatozóides por ovócito de piabanha.

89


Foram selecionados exemplares de piabanha de ambos os sexos, presentes

na estação experimental do Projeto Piabanha, em Itaocara (RJ), e que apresentaram

alto grau de desenvolvimento gonadal, sendo escolhidas as fêmeas que

apresentaram abdômen abaulado e papila genital avermelhada, e os machos que

apresentaram vertência de sêmen mediante massagem abdominal. Estes

exemplares foram transportados ao laboratório e submetidos ao procedimento de

hipofisação proposto por WOYNAROVICH e HORVATH (1985). As fêmeas, assim

que chegaram ao laboratório, receberam a dosagem preparatória de 0,5 mg de

extrato bruto de hipófise de carpa (EBHc) por quilograma de peso vivo. Decorridas

12 horas, as fêmeas receberam a dosagem final de 5,0 mg CPEc/Kg peso vivo,

enquanto os machos receberam a dosagem única de 0,5 mg CPEc/kg peso vivo.

Após 180 horas-grau, foi procedida a extrusão, primeiramente dos machos.

O sêmen foi coletado em tubos de vácuo de 10 mL, após secagem da papila genital

e das áreas adjacentes. Ambos os peixes liberaram mais do que 5 mL de sêmen.

Logo após a coleta, foi verificada a motilidade espermática subjetiva, conforme

procedimento descrito anteriormente. Ambas amostras apresentaram mais do 90%

de motilidade. Posteriormente, as amostras seminais foram misturadas para

constituição de um pool, cuja motilidade observada foi de 90%. Deste pool, foram

retiradas três alíquotas para determinação da concentração espermática. Foi

realizada, então, a pré-diluição do pool, misturando-se 1 mL do sêmen com 9 mL de

90

NaCl 1,2% (pré-diluição = 10 vezes). Esta solução foi, posteriormente, diluída

novamente, como se segue:

1) 200µL sêmen pré-diluído : 3800µL NaCl 1,2% (diluição total = 200 vezes)


1) 600µL sêmen pré-diluído : 3400µL NaCl 1,2% (diluição total = 66,7 vezes)



Após a diluição do sêmen, as amostras foram mantidas por

aproximadamente 15 min em maleta térmica com gelo, a 4oC.

Foi realizada, então, a extrusão das fêmeas. Ambas se mostraram

preparadas fisiologicamente para a desova, haja vista a facilidade para a extrusão

dos ovócitos. Papila genital e regiões adjacentes foram secas, sendo a desova

coletada em bacias plásticas secas, uma para cada fêmea. A seguir, as desovas

foram misturadas para constituição de um pool, do qual foram retiradas três

amostras com aproximadamente 1 g cada (o peso exato foi anotado), sendo estas

amostras acondicionadas em tubos de vácuo de 10 mL, contendo formol para

contagem do número de ovócitos, realizada após 2 horas.

A partir do pool, foram retiradas amostras contendo 2,0 g cada, e estas

colocadas em copos plásticos de 300 mL numerados de acordo com o tratamento

utilizado. Em cada copo plástico, foi utilizado 1 mL de uma das diluições, sendo que

cada tratamento apresentou três repetições. Ato imediato ao acréscimo do sêmen

diluído, foram adicionados a cada copo plástico 2 mL de NaHCO3 1% para ativação

dos espermatozóides.

Considerando as diluições a partir do sêmen a fresco, cuja concentração foi

de 24,3 x 109 espermatozóides/mL, e que foi adicionado 1 mL de sêmen diluído nos

2g de ovócitos (701 ovócitos/g), chega-se às seguintes proporções de

espermatozóides por ovócito utilizadas em cada tratamento:

T1) 86.662 espermatozóides por ovócito





91

Os ovos foram, então, hidratados por 20 min utilizando-se água destilada,

após o que, foram transferidos para as incubadoras. Cada repetição foi colocada em

uma incubadora. Esta consistiu de uma garrafa transparente Pet de 2 L invertida

(figura 1). A entrada da água ocorreu pela parte inferior da garrafa invertida, ficando

os ovos oxigenados e em suspensão.

Figura 1: Incubadora (figura esquemática) utilizada para verificação da proporção

ótima de espermatozóides por ovócito de piabanha Brycon insignis.

Os ovos permaneceram na incubadora com acompanhamento do

desenvolvimento embrionário, sendo que, nas primeiras 8 horas, foi realizada

amostragem a cada 2 horas e, posteriormente, a cada 30 min. A verificação da

percentagem de fecundação ocorreu aproximadamente 10 h depois da colocação

dos ovos na incubadora (1h30min após a observação dos primeiros ovos com

fechamento do blastóporo).

A seguir foi obtida uma regressão do tipo Linear Response Plateau (LRP)

envolvendo taxa de fertilização (em relação ao controle) x proporção

espermatozóides por ovócito, sendo sua significância testada utilizando-se o

aplicativo SAEG. Foi considerado, como número ótimo de espermatozóides por

ovócito, o ponto de intersecção das duas retas.

92


As taxas de fertilização da piabanha, em diferentes proporções de

espermatozóides por ovócito, são apresentadas na tabela 1 e na figura 2.

A partir dos dados apresentados pode-se perceber que as taxas de

fertilização aumentam gradativamente até a proporção de 346.648 espermatozóides

por ovócito. Quando a proporção é aumentada para 433.310, a percentagem de

ovócitos fertilizados permanece praticamente a mesma. A tendência de estabilização

fica mais nítida se for verificada a média de fertilização do controle, em que foi usado

1 mL de sêmen sem diluição. A taxa de fertilização é apenas um pouco menor na

proporção de 433.310 espermatozóides por ovócito em relação ao controle,

teoricamente o maior valor possível nas condições experimentais.

Foi obtida equação de regressão do tipo "Linear Response Plateau" (LRP)

(P<0,01; R2 ajustado = 98,3%), que explica as taxas de fertilização em relação ao

controle, em função das proporções espermatozóides por ovócito.

93

17.389.444 sptz/ovócito (Controle*)

128,6%

64,3%

107,1%

100,0%

26,7%

26,7%

433.310 sptz/ovócito

94,9%

113,3%

55,1%

87,8%

24,3%

27,7%


120,9%

47,5%

111,7%

93,4%

32,7%

35,0%


108,7%

58,2%

70,4%

79,1%

21,5%

27,2%


23,0%

32,1%

104,1%

53,1%

36,3%

68,4%


35,2%

58,2%

13,8%

35,7%

18,1%

50,7%

Taxa de fertilização (em %) em relação ao controle (média observada = 65,3%) da piabanha Brycon insignis (n=3) verificadas em diferentes proporções de espermatozóides por ovócito - dados individuais, desvios-padrão e coeficientes de variação (C.V. - %)

Repetição 1

Repetição 2

Repetição 3

Média

Desvio-padrão

C.V. (%)

94

Figura 2: Linear Response Plateau (LRP) da taxa de fertilização (em relação ao

controle) em função da proporção espermatozóides por ovócito. Equação de

regressão (P<0,01; R2=0,983): g hji�kFl�k�k+mon�lTn�n�n�p�p�q�rDsutwvyxHz|{�}'~�{B�Dz��>��r�l%�� {fertilização, 314.481 espermatozóides/ovócito.

Inicialmente, a taxa de fecundação (Y), em relação ao controle, aumenta de

forma linear com a proporção espermatozóides por ovócito (X) seguindo a equação: � h�i�k�l%k�k�m�n�lTn�n�n�p�p�q�rFt�s

Onde: � ��D�W��|�� D��

ão; X = espermatozóides por ovócito

Até que atinge o valor de 87,8% de fertilização em relação ao controle, após

o que, permanece constante neste platô (taxa máxima de fertilização). A mínima

proporção necessária para que este platô de 87,8% de fertilização seja atingido é de

314.481 espermatozóides/ovócito, considerada a razão ótima para que ocorra o

máximo de fertilização na piabanha.

Segundo LAHNSTEINER (2000), a proporção ideal de espermatozóides por

ovócito depende do diâmetro dos ovócitos. De forma geral, quanto maiores os

ovócitos, maior a quantidade de espermatozóides necessários para garantir uma boa

percentagem de fertilização. O tamanho dos ovócitos foi citado em alguns trabalhos

em termos de quantidade de ovócitos por mL. No presente trabalho, o dado

disponível refere-se à quantidade de ovócitos por g, além do diâmetro ovocitário.

95

Entretanto, para efeito de comparação, pode-se considerar que as quantidades

presentes em 1 g e em 1 mL são praticamente iguais (GODINHO, 2004,

comunicação pessoal).

A razão ideal de aproximadamente 314 x 103 espermatozóides por ovócito

obtida na piabanha, considerando que 1 g (~ 1 mL) de ova apresentou cerca de 700

ovócitos, é compatível com a maioria dos trabalhos encontrados na literatura em

relação ao tamanho dos ovócitos (tabela 2).

Tabela 2 - Razão ótima de espermatozóides por ovócito de acordo com o tamanho

dos ovócitos em algumas espécies. Espécies de peixe com ovócitos maiores do que

a da piabanha são citadas acima desta e as, com ovócitos menores, abaixo

Espécie

Tamanho do ovócitos

(ovócitos/mL ou

diâmetro do ovócito)

Razão ideal sptz

x 103/ovócito Autor

Thymallus thymallus 40 ovócitos/mL 1200 – 1600 LAHNSTEINER (2000)

Esox lucius Diâmetro = 2 mm 700 MARCEL (1981)

200 SILVEIRA et al. (1988) Oncorhynchus mykiss Diâmetro = 4 mm 300 BILLARD (1975)

Coregonus lavaretus 150 ovócitos/mL 300 – 500 LAHNSTEINER (2000)

Hippoglossus hippoglossus Diâmetro = 3 mm 1600 SUQUET et al. (1995)

Brycon insignis 701 ovócitos/g Diâmetro = 1,3 mm

314 –

Cyprinus carpio 1500 ovócitos/g 13 MARCEL (1981)

Scophthalmus maximus Diâmetro = 1 mm 6 SUQUET et al. (1995)

As espécies Thymallus thymallus (LAHNSTEINER, 2000), Esox lucius

(MARCEL, 1981), Coregonus lavaretus (LAHNSTEINER, 2000), Hippoglossus

hippoglossus (SUQUET et al., 1995) apresentam ovócitos maiores do que as da

piabanha e, provavelmente por isso, necessitam de mais células espermáticas para

fecundar um ovócito. De forma análoga, as menores razões ótimas

espermatozóides/ovócito verificadas no Scophthalmus maximus (SUQUET et al.,

1995) e no Cyprinus carpio (MARCEL, 1981) podem ser explicadas pelo fato de seus

ovócitos serem menores do que os encontrados na piabanha. Por outro lado, a

96

mesma relação não foi verificada na truta Oncorhynchus mykiss que, apesar de

apresentar ovócitos de maior diâmetro, mostrou proporção ótima

espermatozóides/ovócito menor que a piabanha. Segundo SUQUET et al. (1995), a

distância que pode ser percorrida pelo espermatozóide, que depende da velocidade

espermática e tempo de motilidade, influencia na capacidade fecundante. Assim, é

possível que o espermatozóide de truta tenha movimento mais rápido e duradouro,

sendo necessária menor quantidade para fecundar um ovócito.

Considerando-se que, em média a concentração do sêmen da piabanha é

de aproximadamente 25 x 109 espermatozóides/mL e que cada 1 g de desova

apresenta cerca de 700 ovócitos, recomenda-se, na rotina de desova induzida da

piabanha, a utilização de pelo menos 0,9 mL de sêmen para cada 100 g de desova.

A determinação da razão ótima espermatozóides/ovócito também é

importante para avaliação de procedimentos de criopreservação de sêmen. O teste

de fertilização, se realizado com quantidades de sêmen excessivas pode não

proporcionar condições de identificar o melhor tratamento a ser utilizado, pois

eventuais diferenças entre metodologias podem ser atenuadas pelo aumento da

proporção de espermatozóides por ovócito. FAUVEL et al. (1998) criopreservaram o

sêmen do Dicentrarchus labrax e avaliaram a eficiência do processo realizando

testes de fertilização. Quando a proporção de espermatozóides por ovócito foi

relativamente baixa (35.103 sptz/ovócito), verificou-se redução significativa na

percentagem de ovócitos fecundados em relação ao sêmen a fresco, ao contrário do

verificado em proporções superiores, da ordem de 70.103 e 200.103 sptz/ovócito.

Eventuais diferenças nos tratamentos utilizados não puderam ser verificadas em

altas proporções. Deste modo, no que se refere a experimentos de criopreservação

do sêmen da piabanha, recomenda-se a utilização de, no máximo, 314.000

espermatozóides por ovócito.

97

4. CONCLUSÃO

A proporção ótima de espermatozóides por ovócito de piabanha é de

314.481, sendo recomendada, em rotinas de desova induzida de piabanha, a

utilização mínima de 0,9 mL de sêmen para cada 100 g de ovócitos. Em

experimentos de criopreservação do sêmen desta espécie, sugere-se a realização

de diluições de forma que a proporção máxima seja de 314.000 espermatozóides

por ovócito.

98


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100



101

CONSERVAÇÃO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis POR

RESFRIAMENTO A 4oC E POR CONGELAMENTO EM N2 LÍQUIDO

RESUMO: Dentre as espécies de peixe ameaçadas no Brasil se encontra a

Piabanha Brycon insignis. Uma alternativa viável para minimizar perdas na

biodiversidade da espécie é a coleta do seu sêmen na natureza, transporte sob

resfriamento e criopreservação para constituição de bancos genéticos. O objetivo

deste trabalho foi verificar a viabilidade do resfriamento como método de

preservação do sêmen da piabanha por curtos períodos e desenvolver

procedimentos para sua criopreservação. Para verificação da viabilidade do sêmen

mantido resfriado a 4oC, foi formado um pool a partir da mistura de amostras

seminais de 3 exemplares induzidos com extrato bruto de hipófise de carpa (EBHc).

Foi realizada a avaliação subjetiva da motilidade a cada 30 min, até que não fosse

verificado movimento espermático. Foram obtidos a equação de regressão do tipo

LRP e o tempo de resfriamento a partir da qual a motilidade começa a ser reduzida.

Com relação à criopreservação, foi utilizado um diluente constituído por DMSO 10%,

glicose 5% e gema de ovo 10%. Os exemplares foram induzidos hormonalmente

com EBHc, sendo formados 4 pools contendo sêmen de 3 piabanhas cada um. Após

a diluição em diferentes proporções diluente:sêmen, o sêmen foi envasado em

palhetas de 0,5 mL e congelado em um botijão de vapor de nitrogênio líquido. As

amostras foram descongeladas 1 a 3 dias após, sendo a eficiência de cada

proporção sêmen:diluente analisada com base em parâmetros medidos pelo

analisador de motilidade espermática assistida por computador (CASA). Verificou-se

que a motilidade espermática subjetiva foi mantida em amostras seminais resfriadas

a 4oC por até 3,9 h (motilidade estimada = 83%), após a que, começa a reduzir

segundo a equação: � � ��%�� – 23,45 X. Quanto ao experimento de

criopreservação, observou-se que os parâmetros espermatozóides (sptz) móveis,

sptz progressivos, as velocidades na trajetória média (VAP), progressiva (VSL) e

curvilinear (VCL) variam em função da proporção diluente:sêmen seguindo

equações cúbicas. Já a freqüência de batimentos flagelares (BCF) mostrou variação

de acordo com uma equação quadrática. As proporções diluente:sêmen em que se

verificaram os valores máximos a partir das equações foram: sptz móveis = 5,4:1;

sptz progressivos = 5,3:1; VAP = 4,9:1; VSL = 5:1; BCF = 6,0:1. No procedimento de

criopreservação do sêmen da piabanha, é recomendada a utilização de 5,2 partes

102

de diluente para 1 parte de sêmen, uma vez que esta proporção permite obtenção

de resultados superiores a 98% do máximo em todos os parâmetros mensurados.

Termos de indexação: criopreservação de sêmen, resfriamento de sêmen,

analisador de motilidade espermática assistida por computador (CASA), proporção

diluente:sêmen, piabanha.

103

ABSTRACT: SPERM CONSERVATION OF PIABANHA, BY COOLING AT 4oC AND

CYOPRESERVATION IN LIQUID NITROGEN

Amongst brazillian fish species potentially in extinguishing danger is the Piabanha

Brycon insignis. A viable alternative to minimize losses in the biodiversity of this

specie is the collection of it’s semen in the nature, transport under cooling and

cryopreservation for constitution of genetical stocks. The objective of this work was to

verify the viability of the cooling as method of preservation of piabanha semen under

short periods and the development of procedures for its cryopreservation. For

verification of the semen viability, it was cooled at 4oC, from a pool of sperm samples

of 3 induced specimens, induced with crude pituitary extract of carp (CPEc). The

subjective evaluation of motility was observed each 30 minutes, until espermatozoa

movement was not verified. We observed a regression with LRP model and the time

of cooling from which the motility starts to reduce. With relation to the

cryopreservation, was used a diluent constituted by 10% DMSO; 5% glucose and

10% egg yolk. The specimen were hormonally induced with CPEc, being formed 4

pools containning sperm from 3 piabanhas each. After the dilution in different ratios

diluent:sperm, sperm was stocked in 0,5 mL tubes and frozen in a dry-shipper. The

samples was thawing 1 to 3 days later, being the efficacy of each ratio diluent:sperm

analyzed on the basis of parameters measured by computer assisted sperm analysis

(CASA). It was verified that subjective motility in seminal samples cooled 4oC

maintained for up to 3,9 h (estimated motility = 83%), which starts to reduce

according to equation: ¡ ¢�£D¤#¥�¦U¢ - 23,45 X. Regarding to cryopreservation

experiment, was observed that the parameters motile spermatozoa (sptz),

progressive sptz, average-path velocity (VAP), Straight-line velocity (VSL) and track

speed or curvilinear velocity (VCL) varied according to diluter:sperm ratio following

cubical equations. The flagelar beating frequency (BCF) showed variation in

accordance with a quadratic model. The diluent:sperm ratio verified the maximum

values according to equations: motile sptz = 5,4:1; progressive sptz =5,3:1; VAP =

4,9:1; VSL = 5:1; BCF = 6,0:1. In the procedure of cryopreservation of piabanha

sperm, the use of 5,2 parts of diluter for 1 semen part is recommended, since this

ratio provide results above 98% of the maximum in all the measured parameters.

Index terms: cryopreservation of sperm, sperm cooling, computer assisted

sperm analysis (CASA); diluent:sperm ratio, piabanha.

104

1. INTRODUÇÃO

A piabanha Brycon insignis é uma espécie naturalmente existente apenas na

bacia do rio Paraíba do Sul, sendo que, em função de ações antropogênicas, sua

população vem diminuindo gradativamente. A sobrepesca, a captura em época de

desova, a poluição da água, o desmatamento, bem como a construção de

barragens, têm sido apontados como razões para a redução populacional não só da

piabanha, como também de várias outras espécies de peixes no Brasil

(CAROLSFELD e HARVEY, 1999).

Especificamente no que se refere à implantação de usinas hidroelétricas, as

espécies reofílicas, como a piabanha, sofrem significativa influência negativa. A

reprodução dessas espécies depende do fenômeno da piracema, sendo esta

inviabilizada com a construção de barragens. Medidas que visam reduzir o impacto

ecológico das usinas hidrelétricas incluem a construção de escadas de transposição.

Entretanto, sua eficiência é contestada, haja visto que as populações das espécies

reofílicas continuam em constante declínio (CAROLSFELD et al., 2003).

O desenvolvimento de técnicas de desova artificial de algumas espécies,

como o mandi Pimelodus maculatus (FENERICH et al., 1974), o curimbatá

Prochilodus scrofa (CASTAGNOLLI e CYRINO, 1980; FENERICH-VERANI et al.,

1984), o curimatã-pacu Prochilodus margravii (SATO et al., 1996), o pacu Piaractus

mesopotamicus (CASTAGNOLLI e DONALDSON, 1981; GODINHO e GODINHO,

1986; BERNARDINO et al., 1987), e a própria piabanha Brycon insignis (PROJETO

PIABANHA, dados não publicados), representa não só subsídio para produção

comercial destas espécies como também permitem a produção de alevinos para

repovoamento em casos de espécies ameaçadas. O domínio e a disseminação

105

destas técnicas constituem solução para o problema da redução quantitativa da

população de espécies como a piabanha. Entretanto, em função dos reprodutores

apresentarem grande fecundidade, estes, rotineiramente, são utilizados em

quantidades limitadas, o que implicaria perda de biodiversidade. Segundo

CAROLSFELD et al. (2003), a implantação de bancos genéticos, incluindo os de

sêmen criopreservado, representa estratégia eficaz para conservação do patrimônio

genético. O sêmen seria coletado a partir de peixes na natureza, transportado sob

resfriamento e, posteriormente, criopreservado.

Com relação à viabilidade de se manter o sêmen resfriado por curtos

períodos até que seja realizada a criopreservação, RANA (1995) afirma que a

estocagem de gametas e embriões de teleósteos por quatro horas ou até alguns

dias tem sido reportada em salmonídeos, carpa e em espécies de tilápia .

Em se tratando da carpa Cyprinus carpio é possível a conservação de

sêmen com boa motilidade a 2-5 oC por até 2 dias (BELOVA, 1981; HULATA e

ROTHBART, 1979). Entretanto, é verificada redução da motilidade e do conteúdo

intracelular de ATP após 8 horas de resfriamento. Também estudando a C. carpio,

RAVINDER et al. (1997) testaram várias soluções diluentes e três temperaturas de

resfriamento, sendo avaliados parâmetros como velocidade espermática e

freqüência de batimento flagelar. A temperatura de 5 oC, quando comparada a de 2

e 22 oC, foi a que apresentou melhores resultados, e as soluções diluidoras

avaliadas, após 24 h de manutenção a 5 oC, não demonstraram diferença

significativa na motilidade em relação ao sêmen a fresco.

No Brasil, MARQUES (2001) verificou a viabilidade do resfriamento

trabalhando com diversas espécies encontradas naturalmente no país, dentre as

quais citam-se: Brycon lundii (matrinchã), Piaractus mesopotamicus (pacu-caranha)

Prochilodus lineatus (curimbatá), Leporinus friderici (piau-três-pintas), Leporinus

elongatus (piapara), Prochilodus marggravii (curimatã-pacu), Pseudoplatystoma

coruscans (surubim/pintado) e Brycon orbignyanus (piracanjuba). Esse autor

verificou que o sêmen de L. elongatus e L. friderici mantém motilidades superiores a

30% mesmo após 7 h de manutenção sob resfriamento, o que permitiria sua

utilização em procedimentos de desova artificial destas espécies. Ainda, esse autor

verificou que essa motilidade de 30% pode ser encontrada no sêmen de pacu após

19 h de resfriamento.

106

No que se refere a criopreservação de sêmen de peixes, diversas

metodologias foram testadas em algumas espécies de peixe, embora os graus de

sucesso sejam muito variáveis. LUBZENS et al. (1997) afirmam que muitos métodos

de congelamento de espermatozóides têm sido desenvolvidos nos últimos 20 anos.

Ainda segundo os autores, apesar de ser possível a preservação de

espermatozóides por períodos curtos por meio de resfriamento, o congelamento em

nitrogênio líquido constitui a forma viável de manutenção dos gametas masculinos

por longos períodos. O procedimento prático envolve a mistura do sêmen com uma

solução contendo agentes crioprotetores, resfriamento das amostras e

congelamento/manutenção em nitrogênio líquido. Quando necessário, as amostras

são descongeladas para utilização no procedimento de fecundação artificial.

Segundo SUQUET et al. (2000), técnicas de manejo do sêmen têm sido

estabelecidas em muitas espécies de peixe de água doce, como ciprinídeos,

silurídeos e salmonídeos. Dentre estas técnicas, a conservação por criopreservação

desperta crescente interesse. Sob temperaturas próximas de 0oC, os

espermatozóides podem ser mantidos viáveis por algumas horas até dias,

dependendo da espécie, enquanto que gametas criopreservados podem ser

estocados teoricamente por muitos anos sem efeito deletério. Dentre as vantagens

relacionadas ao sêmen criopreservado, os autores citam: sincronização da

disponibilidade de gametas, utilização integral do sêmen coletado, facilidade de

transporte de gametas, impedimento da senescência do espermatozóide em

decorrência da coleta ao término do período reprodutivo, conservação de

variabilidade genética em populações domesticadas e a formação de bancos

genéticos para espécies ameaçadas.

LAHNSTEINER et al. (2000) publicaram uma revisão a respeito da

criopreservação de sêmen de ciprinídeos e afirmaram que, embora existam muitos

estudos na área, os conhecimentos desenvolvidos são ainda muito fragmentados.

Segundo esses autores, investigações detalhadas de parâmetros criobiológicos

ainda são ausentes e os protocolos de criopreservação derivam principalmente de

dados empíricos. A avaliação da eficiência dos tratamentos foi realizada mediante a

utilização do analisador de motilidade espermática assistida por computador (CASA),

sendo medidos a velocidade média dos espermatozóides e o índice de linearidade.

No congelamento de sêmen de carpa, alguns autores avaliaram a eficiência

do DMSO (dimetil-sulfóxido) como crioprotetor. WHITHLER (1982) obteve apenas de

107

1 a 20% de espermatozóides móveis após descongelamento. KUROKURA et al.

(1984) obtiveram mais de 70% de fertilização utilizando sêmen descongelado

grandes quantidades, mas baixas fertilidades quando a razão

espermatozóides/ovócito foi reduzida. COGNIE et al. (1989) também obtiveram

sucesso limitado: 70-80% de motilidade do espermatozóide descongelado, com

taxas de fertilização que não excediam os 40% mesmo com proporções

espermatozóides/ovócito 100 vezes superior ao encontrado com sêmen a fresco.

Cinco crioprotetores (Dimetil-sulfóxido – DMSO, glicerol, metanol e Dimetil-

Acetamida – DMA) já foram testados em sêmen de teleósteos (STOSS, 1983;

LEUNG e JAMIESON, 1991; SUQUET et al., 2000), sendo avaliadas proporções de

1 parte de sêmen : 1 parte de diluente até 1:20 (CHAO e LIAU, 2001).

Segundo CHAO e LIAU (2001), diferentes "containers" apresentam variadas

taxas de resfriamento/congelamento. O botijão utilizado para congelamento de

sêmen de mamíferos foi testado para sêmen de peixes, sendo adotado um sistema

em que a quantidade de nitrogênio líquido era medida e as amostras contendo

sêmen + diluente eram mantidas por determinado tempo a uma certa distância da

superfície do N2(l). Também foi testado uso de gelo seco, num procedimento que

consistia no contato direto das amostras (sêmen + diluente) sobre o CO2(s). São

usados, ainda, freezers programáveis, em que são estabelecidas curvas de

resfriamento, com diferentes taxas de resfriamento para cada faixa de temperatura.

Outra possibilidade é a utilização de botijões que promovem o congelamento em

vapor de nitrogênio (CAROLSFELD et al., 2003). Estes consistem de um recipiente

no qual o nitrogênio líquido é absorvido em material poroso que recobre as paredes.

As amostras são congeladas, então, em vapor de nitrogênio, procedimento este que

tem se mostrado eficaz na criopreservação de sêmen de várias espécies.

O objetivo deste trabalho foi verificar a viabilidade do resfriamento como

método de preservação do sêmen da piabanha por curtos períodos e desenvolver

procedimentos simples que permitam sua criopreservação.

108


O experimento foi realizado utilizando-se exemplares de piabanha Brycon

insignis cultivados em tanques de piscicultura da Estação Experimental do Projeto

Piabanha, localizado no município de Itaocara, RJ. Os peixes utilizados constituem a

F1 obtida a partir de exemplares coletados na natureza que, após domesticação,

foram submetidos ao processo de desova induzida. A densidade de estocagem foi

de aproximadamente 800 g de peixe/m2 de lâmina d´água, sendo fornecida ração

extrusada a uma proporção de 2% do peso vivo ao dia. Os tanques de terra, onde os

peixes foram mantidos, apresentaram cerca de 600 m2.

2.1. RESFRIAMENTO

Amostras seminais de 3 exemplares de piabanha induzidos hormonalmente

com extrato bruto de hipófise de carpa (EBHc), segundo WOYNAROVICH e

HORVATH (1983), foram analisadas subjetivamente quanto a sua motilidade,

conforme metodologia de diluição em duas etapas (BILLARD e COSSON, 1992). A

primeira diluição consistiu na mistura de 20 µL de sêmen com 2 mL de solução não

ativadora. A seguir, a 50 µl da mistura anterior foram adicionados 250 µL de

NaHCO3 1%, para ativação espermática. Esta última mistura foi realizada já no

microscópio, estando este pré-focalizado. Como as três amostras apresentaram

motilidades superiores a 80%, foi constituído um pool misturando-se 500 µL de cada

amostra. O pool apresentou motilidade de 90%. A seguir, este pool foi mantido em

um tubo de vácuo de 5 mL fechado, sob maleta térmica com gelo. A temperatura do

109

pool, medida nas condições citadas, variou de 3,0 a 4,5oC. A percentagem de

espermatozóides móveis foi medida a cada 30 min, até que não mais se

verificassem células com motilidade.

2.2. CRIOPRESERVAÇÃO

Amostras seminais coletadas após o procedimento de indução hormonal

com EBHc (WOYNAROVICH e HORVATH, 1983) foram avaliadas subjetivamente

quanto a motilidade espermática. Aquelas que apresentaram motilidade superior a

70% foram, então, selecionadas para a formação de 4 "pools". Cada "pool", com

volume total de 4500 µL, foi constituído pela mistura de 3 amostras seminais de

1500µL, sendo cada amostra oriunda de um peixe. Todos os "pools" apresentaram

motilidades superiores a 85%.

O diluente utilizado para a criopreservação foi preparado utilizando-se 10mL

de DMSO, 5g de glicose e 10mL de gema de ovo, sendo o volume completado para

100 mL com água destilada. Aproximadamente 30 minutos após a mistura, quando a

solução atingiu a temperatura ambiente, procedeu-se à diluição do sêmen. As

proporções diluente:sêmen utilizadas são apresentadas na tabela 1.

Tabela 1 - Quantidades de sêmen (µL) e de diluente (µL) nas diferentes proporções

utilizadas na criopreservação de sêmen de piabanha Brycon insignis

Proporção Volume de diluente (µl) Volume de sêmen (µl)

2:1 1000 500

4:1 2000 500

6:1 2000 250

8:1 2000 250

10:1 2000 200

12:1 2400 200

Após a mistura do sêmen com o diluente, foi realizada a verificação subjetiva

da motilidade espermática, sendo uma gota da mistura colocada sobre a lâmina e

observada ao microscópio. Nenhuma das diluições ativou a motilidade.

Posteriormente, foram adicionadas à gota presente na lâmina, duas gotas de

110

NaHCO3 1%. Verificou-se que, após 10 minutos de contato do diluente com o

sêmen, todas as diluições apresentavam motilidade superior a 80%. Durante todo

este procedimento, as amostras foram mantidas resfriadas a 4 oC.

Depois da mistura com o diluente e os 10 min de contato, as amostras

seminais foram envasadas em palhetas etiquetadas de 0,5 mL. Estas, por sua vez,

foram colocadas em hastes metálicas e introduzidas em um botijão de vapor de

nitrogênio líquido (Taylor-Wharton, modelo CP 65, Theodore, AL, EUA), conforme

HARVEY (2000).

As amostras permaneceram congeladas no botijão por 1 a 3 dias, após o

qual foram descongeladas. O procedimento consistiu na imersão de uma palheta de

cada vez em água a 30 oC por 7 segundos, evitando-se o contato da água com o

conteúdo da palheta. Após ser enxugada, foram procedidos um corte em uma das

extremidades da palheta e a retirada do conteúdo em uma placa de petri.

A atividade espermática foi avaliada após o procedimento de diluição em 2

etapas (BILLARD & COSSON, 1992). Foi utilizado o analisador de motilidade

espermática assistida por computador (CASA), marca Hamilton, sendo o material

observado com um microscópio de contraste de fase, triocular (objetiva 10 x), com

uma câmera CCD acoplada, conectada a um microcomputador utilizando o

programa CEROS – versão 10. A configuração (SETUP) utilizada foi adaptada a

partir de RAVINDER et al. (1997):

• Imagens adquiridas (Frame Acquired): 50

• Taxa de aquisição das imagens (Frame Rate): 60 Hz

• Contraste mínimo (Minimun Contrast): 20

• Tamanho mínimo da célula (Minimum Cell Size): 5

• Contraste mínimo da célula estática (Minimum Static Contrast): 30

• Limiar mínimo de trajetória linear (Straightness, Threshold – STR): 80%

• Tamanho da cabeça, imóvel (Head Size, Non-motile): 2 Pixels

• Intensidade da cabeça, imóvel (Head Intensity, Non-motile): 20

• Tamanho da cabeça, estática (Static Head Size): 0,15 a 4,23

• Intensidade da cabeça, estática (Static Head Intensity): 0,12 a 2,15

• Magnificação (Magnification): 2,04

Os parâmetros de atividade espermática obtidos para cada repetição nas

diferentes proporções foram os seguintes:

111

- espermatozóides móveis

- espermatozóides móveis com movimento progressivo

- velocidade na trajetória média

- velocidade progressiva

- velocidade curvilinear

- freqüência de batimento flagelar

2.3. Análises Estatísticas

Foi utilizado o aplicativo SAEG para determinação das médias verificadas

em cada tratamento (proporções diluente:sêmen). No experimento de resfriamento,

foi obtida equação de regressão do modelo LRP (Linear Response Plateau) que

permite estimar a motilidade espermática em função do tempo de manutenção sob

resfriamento. No que se refere à avaliação das proporções diluente:sêmen utilizadas

na criopreservação do sêmen da piabanha, foram obtidas equações de regressão

para cada parâmetro de atividade espermática e, a partir destas, foi estimada a

proporção diluente:sêmen que propiciaria o máximo de eficiência para o parâmetro.

112


3.1. RESFRIAMENTO

Os dados referentes às motilidades espermáticas avaliadas subjetivamente

a cada 30 min são apresentados na tabela 2. Na figura 1 é apresentada a curva

obtida com a equação de regressão do tipo LRP, evidenciando o momento em que a

motilidade espermática começa a decair.

Pode-se perceber, pelos dados da tabela 1, que a motilidade espermática

apresenta-se muito alta (90%) logo após a coleta (tempo de resfriamento = 0h). Este

valor permanece praticamente inalterado até 2 horas, após o que, começa a reduzir

lentamente. Após 4 horas de manutenção sob resfriamento, a queda passa a ser

mais brusca. Esta análise fica mais evidente, ao se observar a figura 1. Desde a

coleta do sêmen até 3,9 h de resfriamento, a motilidade estimada permanece

constante em torno de 83%. A partir deste período de armazenamento sob

resfriamento, a equação que permite estimar a motilidade (§ ¨@©Bª+«¬�®W¯ ão do tempo

(X) é a seguinte:

°5±7²�³W´µT¶²– 23,45 X (P<0,0001; R2 ajustado = 98%)

113

Tabela 2 - Motilidade espermática subjetiva do sêmen de piabanha mantido sob

resfriamento a 4 oC por diferentes tempos

TEMPO DE RESFRIAMENTO (h) MOTILIDADE ESPERMÁTICA SUBJETIVA (%)

0,0 90

0,5 85

1,0 85

1,5 85

2,0 85

2,5 80

3,0 80

3,5 75

4,0 75

4,5 70

5,0 60

5,5 50

6,0 35

6,5 20

7,0 5

7,5 0

8,0 0

Em termos de aplicação prática em procedimentos de desova induzida em

laboratório, segundo MARQUES (2001), amostras seminais mantidas resfriadas e

com motilidades de pelo menos 30% poderiam ser utilizadas. No presente

experimento, isto ocorre após 6 horas de resfriamento, tempo este próximo ao

observado com sêmen resfriado de L. elongatus e L. friderici, que apresentaram

viabilidade por até 7 horas de resfriamento. Em experimentos que visem à

criopreservação de sêmen coletado na natureza para formação de bancos

genéticos, a manutenção do sêmen resfriado a 4oC por até 4 horas pode ser

utilizada sem que ocorram perdas na motilidade espermática das amostras.

114

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Tempo de Resfriamento (h)

Mot

ilida

de E

sper

mát

ica

Sub

jetiv

a (%

)

(3,9)

Figura 1: Motilidade espermática subjetiva (%) do sêmen de piabanha Brycon

insignis mantido sob resfriamento a 4oC por diferentes períodos.

3.2. CRIOPRESERVAÇÃO

As médias de cada parâmetro de atividade espermática pós-

descongelamento avaliado pelo CASA, considerando-se as diferentes proporções

diluente:sêmen são apresentadas na tabela 3. Já as curvas obtidas pelas equações

de regressão para cada parâmetro de motilidade pós-descongelamento, avaliados

pelo CASA em função das proporções diluente:sêmen, são apresentadas na figura

2.

Os parâmetros pós-descongelamento espermatozóides (sptz) móveis, sptz

progressivos, velocidades na trajetória média (VAP), progressiva (VSL) e curvilinear

(VCL) variaram em função das proporções diluente:sêmen seguindo equações de

regressão cúbicas, enquanto que a freqüência de batimentos flagelares (BCF)

apresentou variações de acordo com uma curva quadrática. As equações de

regressão, seus coeficientes de determinação (R2 ajustado), suas significâncias e os

pontos de máxima são apresentados na tabela 4.

115

Tabela 3 - Médias dos parâmetros de avaliação da motilidade pós-descongelamento

medidos pelo CASA, considerando as diferentes proporções sêmen:diluente

DILUIÇÃO (diluente:sêmen) PARÂMETRO

2:1 4:1 6:1 8:1 10:1 12:1

Espermatozóides móveis (%) 13,2 70,6 86,5 59,8 22,4 0,0

Espermatozóides progressivos (%) 6,8 52,9 80,1 46,3 9,7 0,0

VAP (µm.seg-1) 25,1 42,2 68,0 28,6 8,6 0,0

VSL (µm.seg-1) 7,4 12,7 24,7 10,2 1,1 0,0

VCL (µm.seg-1) 28,3 47,1 81,6 34,2 10,3 0,0

BCF (Hz) 10,1 12,0 23,8 11,9 8,5 0,0

STR (%) 29,5 30,1 36,3 35,8 13,1 -

LIN (%) 26,19 26,96 30,27 29,76 10,70 -

As quantidades de diluente:sêmen que proporcionaram pontos de máxima,

em cada parâmetro de avaliação da motilidade, variaram de 4,9 a 6,0 partes de

diluente para 1 parte de sêmen. Para determinação da proporção ideal,

considerando que cada parâmetro apresentou um ponto ótimo, foram verificados os

valores obtidos (em % do valor máximo) aplicando-se as equações de regressão

com proporções de diluente:sêmen que variaram de 4,9 a 6,0. A proporção de 5,2

partes de diluente para 1 parte de sêmen foi a que apresentou melhores resultados,

com todos os parâmetros atingindo valores superiores a 98% do máximo estimado

(tabela 5), sendo esta recomendada para criopreservação do sêmen de piabanha.

116

a)

b)

c)

d)

e)

f)

Figura 2 - Valores dos parâmetros de motilidade pós-descongelamento medidos pelo

CASA em função das proporções diluente:sêmen. (a) espermatozóides móveis; (b)

espermatozóides progressivos; (c) velocidades na trajetória média – VAP; (d)

velocidade progressiva – VSL; (e) velocidade curvilinear – VCL; (f) freqüência de

batimento flagelar – BCF.

117

Tabela 4 - Equações de regressão dos parâmetros de motilidade medidos pelo

CASA (·¹¸ºF»�¼¾½�¿WÀ ão das proporções diluente:sêmen (X).

Parâmetro Equação de regressão R2 ajustado Significância Ponto de

máxima (X; Á Â sptz móveis Ã ÄuÅ�Æ Ç�ÇÉÈ 3 - 11,9X2 + 90,3X - 124,3 0,90 0,0001 (5,4; 85)

sptz progressivos Ê ËuÌ�Í Î(ÏÑÐ 3 - 12,2X2 + 89,7X - 130,7 0,74 0,0001 (5,3; 72)

VAP Ò ÓuÔ�Õ ÖD×ÙØ 3 – 7,9X2 + 54,9X – 59,0 0,63 0,0001 (4,9; 57)

VSL Ú ÛuÜ�ÝßÞáàÉâ 3 – 3,0X2 + 21,0X – 25,2 0,48 0,001 (5,0; 20)

VCL ã äuå�æ ç�èÑé 3 – 9,1X2 + 64,2X – 70,9 0,70 0,0001 (4,9; 67)

BCF êëä – 0,50X2 + 5,99X – 0,40 0,50 0,001 (6,0; 17)

A proporção diluente:sêmen de 5,2:1 é superior a utilizada por

CAROLSFELD et al. (2003) que, trabalhando com o mesmo diluente utilizado no

presente trabalho, diluíram o sêmen, para criopreservação de outras espécies

encontradas no Brasil, numa proporção de 3 partes de diluente para 1 de sêmen.

Entretanto, a percentagem de espermatozóides móveis obtidas no dourado

Salminus maxillosus, em torno de 70%, ficou abaixo da de 86% obtida no presente

trabalho com a piabanha, utilizando-se a proporção de 6:1. Em ambas espécies

estudadas, a ativação espermática ocorreu pela mistura do sêmen com solução de

NaHCO3 1%.

Tabela 5 - Comparação relativa dos valores estimados de cada parâmetro utilizando-

se as proporções diluente:sêmen recomendada (5,2:1) e a ótima para cada

parâmetro

Parâmetro

Proporção

recomendada

(X)

Valor

estimado ( ê�ì Proporção

ótima (X)

Valor máximo

estimado ( ê�ì Valor

recomendado

em relação ao

máximo (%)

sptz móveis 5,2:1 84,5 5,4:1 84,7 99,8

sptz progressivos 5,2:1 72,0 5,3:1 72,1 99,9

VAP 5,2:1 56,8 4,9:1 57,1 99,4

VSL 5,2:1 19,6 5,0:1 19,6 99,6

VCL 5,2:1 66,3 4,9:1 66,6 99,6

BCF 5,2:1 17,2 6,0:1 17,5 98,3

118

4. CONCLUSÕES

1- O sêmen da piabanha Brycon insignis apresenta altas motilidades quando

mantido por até 3,9 horas sob resfriamento a 4 ºC, após o que, começa a cair

segundo a equação: í = 174,21 – 23,45 X.

2- A utilização da proporção de 5,2 partes de diluente (DMSO 10%, glicose

5%, gema de ovo 10%) para 1 parte de sêmen foi a propiciou melhores resultados

na criopreservação do sêmen de piabanha.

119

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anÁlise e criopreservaÇÃo do sÊmen da piabanha … · verificou-se, ainda, que a indução...

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