avaliação da resposta humoral poliespecífica intratecal em...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
Rafael Paternó Castello Dias Carneiro
Avaliação Da Resposta Humoral Poliespecífica Intratecal Em Pacientes Brasileiros Com Esclerose Múltipla
CAMPINAS
2016
Rafael Paternó Castello Dias Carneiro
Avaliação Da Resposta Humoral Poliespecífica Intratecal Em Pacientes Brasileiros Com Esclerose Múltipla
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Médicas na Área de Concentração em Neurologia.
ORIENTADOR: Leonilda Maria Barbosa dos Santos COORIENTADOR: Carlos Otávio Brandão
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO RAFAEL PATERNÓ CASTELLO DIAS CARNEIRO, E ORIENTADO PELA PROFa. DRa. LEONILDA MARIA BARBOSA DOS SANTOS
CAMPINAS
2016
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/04565-0; FAPESP, 2010/10725-4
Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas Ana Paula de Morais e Oliveira - CRB 8/8985
Dias-Carneiro, Rafael Paternó Castello, 1985- D543a DiaAvaliação da resposta humoral poliespecífica intratecal em pacientes
brasileiros com Esclerose Múltipla / Rafael Paternó Castello Dias Carneiro. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
DiaOrientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos. DiaCoorientador: Carlos Otávio Brandão. DiaDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Dia1. Esclerose múltipla. 2. Líquido cefalorraquidiano. 3. Bandas oligoclonais. 4. Proteinas do líquido cefalorraquidiano. 5. Brasil. I. Santos, Leonilda Maria Barbosa dos,1950-. II. Brandão, Carlos Otávio. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: The humoral, polyspecific, intrathecal immune response in Brazilian patients with Multiple Sclerosis Palavras-chave em inglês: Multiple sclerosis Cerebrospinal fluid Oligoclonal bands Cerebrospinal fluid proteins Brazil Área de concentração: Neurologia Titulação: Mestre em Ciências Médicas Banca examinadora: Leonilda Maria Barbosa dos Santos [Orientador] Marcondes Cavalcante França Junior Heloisa Helena Ruocco Data de defesa: 27-01-2016 Programa de Pós-Graduação: Ciências Médicas
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
RAFAEL PATERNÓ CASTELLO DIAS CARNEIRO
ORIENTADOR: LEONILDA MARIA BARBOSA DOS SANTOS
COORIENTADOR: CARLOS OTÁVIO BRANDÃO
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. LEONILDA MARIA BARBOSA DOS SANTOS
2. PROF. DR. MARCONDES CAVALCANTE FRANÇA JR.
3. PROFA. DRA. HELOÍSA HELENA RUOCCO
Programa de Pós-‐-‐Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-‐-‐se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: DATA DA DEFESA [27/01/2016]
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho e seus resultados aos meus avós paternos Eurico e
Nira, que não puderam estar aqui até o fim, mas participaram, apaixonados
torcedores, de cada conquista dos seus herdeiros.
À avó Regina, pelo exemplo incansável de força e perseverança.
Aos meus pais, por tudo que não cabe em papel.
(E ao Nino, avô quase mitológico, cujas histórias povoaram meu
imaginário infantil).
AGRADECIMENTOS
Agradeço, em primeiro lugar, ao meu pai, Dr. José Carlos Dias Carneiro,
meu maior exemplo, por ter me encaminhado à Medicina e por me incentivar
sempre a buscar novos desafios.
À minha mãe, Maria Ninel, que me ensinou que os maiores gestos de
amor não são sempre carinhos (mas que sempre tem um carinho para
dispensar).
Ao André, que me ensina a ser um irmão, filho e médico melhor.
À Gabriela, que escolheu continuar lendo por cima do meu ombro para
sempre.
Ao Davy, Alê e Bruno, amigos da vida toda, irmãos escolhidos.
À Santa Casa pela formação médica e em Neurologia a ferro e fogo.
À Unicamp, por ter me recebido de braços abertos, especialmente nas
figuras da Professora Leonilda, Dr. Carlos Otávio e Felipe, que me ensinaram a
ser um pesquisador começando pelo zero.
Aos colegas do Laboratório, Adriel, Allinny, Marília, Vinícius, Verônica,
pela amizade e auxílio ao longo deste período. Sem o esforço conjunto do
grupo, nada teria sido possível.
RESUMO
Esclerose Múltipla (EM) é a mais comum dentre as doenças desmielinizantes idiopáticas do Sistema Nervoso Central (SNC). O diagnóstico da EM é clínico e radiológico, porém a resposta humoral intratecal detectável no Líquido Cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com EM é um dos sinais mais frequentes e estáveis da doença do SNC, e classicamente é detectada pela pesquisa de bandas oligoclonais de IgG restritas ao LCR (BOC-IgG), observadas em até 98% dos pacientes de séries europeias. Diversos estudos demonstraram a presença de uma resposta humoral poliespecífica intratecal contra antígenos virais, sendo os Vírus do Sarampo (MV), da Rubéola (RV) e Varicela Zoster (VZV) os mais frequentes, ocorrendo em até 94% dos pacientes. A especificidade deste método é superior à das BOC-IgG. A detecção de anticorpos específicos contra esses ou outros antígenos depende de exposição prévia, seja por contato com o agente ou através de vacinação, e não representa um quadro infeccioso agudo, mas um estado de ativação imunológica crônico. Na população brasileira a presença de BOC-IgG se mostrou variável entre diferentes séries, porém aparenta ser menor do que a observada na literatura internacional. A resposta poliespecífica intratecal não foi avaliada em nosso meio, em que uma menor prevalência da doença e menor frequência das BOC-IgG representam um desafio diagnóstico.
O objetivo principal deste estudo é analisar a sensibilidade e especificidade diagnósticas da síntese intratecal de anticorpos contra os vírus MV, RV, VZV, Herpes tipos 1 e 2 (HSV) e Vírus Epstein-Barr (EBV) em um grupo de pacientes brasileiros portadores de Esclerose Múltipla e comparar sua acurácia com as BOC-IgG em pacientes com EM, outras doenças inflamatórias do SNC e pacientes sem doença inflamatória. Foram recrutados pacientes com suspeita de doenças desmielinizantes submetidos à punção lombar para investigação diagnóstica no Ambulatório de Esclerose Múltipla do HC-Unicamp. O Comitê de Ética autorizou a realização do estudo e os pacientes assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Amostras pareadas de soro e LCR foram avaliadas quanto a presença de BOC-IgG e quantificação de anticorpos específicos. Índice de anticorpo (AI) foi calculado conforme descrito na literatura e valores de AI ≥ 1,5 foram considerados representativos de síntese intratecal. Dentre 63 pacientes avaliados, 33 receberam diagnóstico de EM, 4 pacientes tiveram o diagnóstico de uma forma pré-clínica de Esclerose Múltipla, sendo uma RIS e 3 CIS. Seis casos tiveram diagnóstico de doenças neurológicas inflamatórias ou infecciosas (DNII) e 20 pacientes de outras doenças neurológicas (ODN). BOC-IgG foram detectadas em 72% dos pacientes com EM, com
especificidade de 96%. A sensibilidade da detecção de síntese intratecal de anticorpos foi 67%, com especificidade de 81%. O vírus mais frequente foi MV (52%). Uma avaliação combinada de BOC-IgG e resposta intratecal poliviral mostrou sensibilidade de 88%, especificidade 92% e acurácia 90%. O estudo permite concluir que a avaliação da resposta humoral poliespecífica intratecal aumentou a sensibilidade para detecção de síntese intratecal de imunoglobulinas em nossa população quando comparado ao uso isolado das BOC-IgG restritas ao LCR.
Palavras-chave: Esclerose Múltipla. Líquido Cefalorraquidiano. Bandas Oligoclonais. Proteinas do Liquido Cefalorraquidiano. Brasil.
ABSTRACT
Multiple Sclerosis (MS) is the most common idiopathic demyelinating disease of the Central Nervous System (CNS). Diagnosis of MS is clinical with radiological support. An intrathecal humoral response detectable in the Cerebrospinal Fluid (CSF) of MS patients is one of the most stable signs of the disease, and is classically detected by means of IgG Oligoclonal Bands (IgG-OCB) restricted to the CSF in up to 98% of european MS patients. In the Brazilian population IgG-OCB positivity varies among case series, but seems to be inferior to the observed in international literature. Studies have demonstrated the presence of an intrathecal, humoral, polyspecific response against viral antigens in up to 94% of MS patients, with antibodies against Measles (MV), Rubella (RV) and Varicella Zoster (VZV) being the most frequently detected. Specificity of a polyviral response is higher than that of IgG-OCB. Detection of antibodies against these or other viruses is dependent on previous exposition to the agent in the environment or via vaccination, and doesn’t characterize present infection, but rather a chronic state of immunologic activation. This method has not been assessed in our country, where a lower prevalence of MS and lower frequency of IgG- OCB represent a diagnostic challenge. The objective of this study is to evaluate sensitivity and specificity of the detection of intrathecal antibody synthesis against MV, RV, VZV, Herpes simplex virus 1 and 2 (HSV) and Epstein-Barr Virus (EBV) in a group of Brazilian MS patients and compare their accuracy compared to IgG-OCB in patients diagnosed with MS, other inflammatory and infectious CNS diseases (IIND) and patients with other neurologic diseases (OND). We recruited patients from our MS clinic with suspected demyelinating disease who underwent lumbar puncture as part of investigation. Approval was obtained from the local ethics committee and all patients signed an informed consent. Paired samples of CSF and sera from patients were analysed for presence of IgG-OCB and quantification of specific antibodies. Antibody index (AI) was calculated as described in the literature and AI ≥ 1.5 was considered representative of intrathecal synthesis. 33 patients were diagnosed as MS, 4 patients as a pre-diagnostic form of MS, 6 patients as IIND and 20 patients as OND. IgG-OCB were detected in 72% MS patients, with a 96% specificity. Sensitivity of the detection of a intrathecal antibody synthesis was 67% and specificity 81%. Measles antibody was the most frequently detected (52%). A combined approach of IgG-OCB and polyviral response detection showed a sensitivity of 88%, specificity of 92% and accuracy of 90%. This study concludes that evaluation of polyspecific intrathecal humoral response raised the sensitivity of intrathecal Ig synthesis detection in our population when compared to IgG-OCB alone.
Keywords: Multiple Sclerosis. Cerebrospinal fluid. Oligoclonal Bands. Cerebrospinal fluid proteins. Brazil.
.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Dados demográficos da população estudada
Tabela 2. Análise Quimiocitológica do LCR
Tabela 3. Análise da Síntese Intratecal de Anticorpos
Tabela 4. Detecção da Síntese Intratecal dos anticorpos contra Sarampo (M), Rubéola (R), Varicela Zoster (Z), Herpes simplex (H) e EBV na população estudada.
Tabela 5. Sensibilidade, Especificidade, Acurácia para a detecção da presença de síntese intratecal de IgG e síntese de anticorpos contra antígenos específicos virais
Tabela 6. Análise Comparativa da Síntese Intratecal contra antígenos virais em pacientes com Esclerose Múltipla
SUMÁRIO
1. Introdução........................................................................................pg 13
2. Objetivos .........................................................................................pg 25
3. Pacientes e Métodos.......................................................................pg 26
4. Resultados.......................................................................................pg 29
5. Discussão.........................................................................................pg 36
6. Conclusões......................................................................................pg 40
7. Referências......................................................................................pg 41
8. Apêndice..........................................................................................pg 44
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Históricos da Esclerose Múltipla
Acredita-se que o relato mais antigo de Esclerose Múltipla (EM) na história
date do século XIV, na Holanda, onde teria vivido Lidwina de Schiedam (1380-1433). A
partir dos dezesseis anos Lidwina foi acometida por uma série de sintomas, iniciados
com dificuldade para caminhar. Aos 19 anos apresentava paralisia de ambos os
membros inferiores e alterações visuais. Os registros descrevem períodos de melhora
e piora, até seu falecimento aos 54 anos1–3. As fases de remissão da doença,
atribuídas a prolongados períodos de jejum e oração renderam-lhe, em 1890, a
canonização pelo Papa Leão XIII.
Quatro séculos depois, na Inglaterra, as anotações do diário pessoal de
Augustus D’Esté, neto ilegítimo de Jorge III da Inglaterra, relatam a evolução de 26
anos de sua doença, diagnosticada retrospectivamente como EM1,3. Também da
Inglaterra, no início do século XX há um relato semelhante, no livro The Journal of a
Disappointed Man, de W.N.P. Barbellion, nom-de-plume do naturalista britânico Bruce
Frederick Cummings (1889 – 1919), um registro acurado dos sintomas e impressões
do autor ao longo da evolução da doença4.
Na literatura médica a história da Esclerose Múltipla se inicia com a
descrição por Carlswell e Cruveilhier, na primeira metade do século XIX, do achado de
placas de significado desconhecido na medula de sujeitos de autópsia. Em 1835
Carlswell faz a primeira descrição clinicopatológica, definindo a doença como “afecção
medular com paraplegia” e no ano de 1849, Friedrich Theodor von Frerichs elabora a
descrição clínica e características da doença3. As primeiras descrições detalhadas dos
aspectos clínicos e anatomopatológicos da Esclerose Múltipla, válidos até os dias de
hoje, são de Jean-Martin Charcot. Em sua extensa obra sobre o assunto, Charcot
define a doença como “uma entidade clinicopatológica distinta, apresentando lesões
disseminadas no espaço e no tempo, apresentando períodos de agudização e
14
remissão, comprometimento principalmente da mielina, especialmente nas regiões
periventriculares, nervo óptico e medula espinhal”. Suas observações sobre
disseminação da doença no tempo e no espaço guiam até hoje a investigação de
pacientes com suspeita de EM, e o termo sclerose en plaques, cunhado por um de
seus discípulos nas discussões do Hospital Salpetriére, é usado até os dias de hoje na
literatura francesa.
1.2 Aspectos Demográficos e Epidemiológicos
Esclerose Múltipla é a mais comum dentre as doenças desmielinizantes
idiopáticas do Sistema Nervoso Central5 e afeta mais frequentemente mulheres, numa
proporção de 2,3:1, segundo revisões mais recentes da literatura6. As primeiras
manifestações clínicas costumam aparecer dos 20 aos 40 anos de idade 7–9. É a
doença neurológica mais comum em jovens, e principal causa de incapacidade não
decorrente de trauma nesta faixa etária6,10. Historicamente foi observado um gradiente
de prevalência, sendo esta mais elevada nas latitudes mais altas, e nas décadas de 60
e 70 do século passado foi proposta a divisão do mundo em zonas de risco para
desenvolvimento da doença. Foram consideradas zonas de risco elevado aquelas com
prevalências acima de 30 casos por 100.000 habitantes, incluindo o Norte da Europa e
dos Estados Unidos, o Sul do Canadá, a Nova Zelândia e o sudeste da Austrália. A
zona de médio risco abrangia os locais com prevalência calculada ou estimada entre 5
e 25 casos por 100.000 habitantes, e incluía o restante da Europa Ocidental e
Mediterrâneo. Os demais locais, com prevalências abaixo de 5 casos por 100.000
habitantes, foram consideradas áreas de baixo risco para Esclerose Múltipla, incluindo
Ásia, África, Alasca, Groenlândia e América Latina11. Considerando essa distribuição
particular, Poser propôs em dois artigos uma possível relação com a saga nórdica,
notando que muitos dos locais do planeta em que a prevalência de EM era mais
15
elevada foram alvo de viagens exploratórias, campanhas militares, rotas comerciais e
colônias de povoamento viking. 12,13
A partir da década de 80 do século passado, possivelmente por
aumento da incidência de EM nas latitudes mais baixas, vem sendo observado uma
diminuição no gradiente de prevalência entre as diferentes latitudes6. Em concordância
com essa tendência, um estudo de 1997 demonstrou uma prevalência de 15 casos
para 100.000 habitantes na cidade de São Paulo, 3 vezes maior que na década
anterior14. Analogamente, trabalhos mais recentes mostraram prevalências de 18,1/105
e 12,5/105 em Belo Horizonte e Uberaba, respectivamente. 15,16
1.3 Etiologia, Patogênese e Fisiopatologia
Embora a Esclerose Múltipla seja classicamente descrita como uma
doença inflamatória e desmielinizante, atualmente sabemos que há, desde o seu
princípio, um equilíbrio entre atividade inflamatória, que se manifesta na forma de
placas de desmielinização, e um processo neurodegenerativo, com perda de células
gliais, degeneração axonal e atrofia17–19.
A etiologia da EM é muito estudada e discutida, e hoje acredita-se que a
doença decorra tanto da ação independente quanto da interação entre fatores
genéticos e ambientais7,17,20,21. Estudos mostram que há um aumento na taxa de
recorrência familial na EM17, chegando a 25% em gêmeos monozigóticos, e caindo
progressivamente para gêmeos dizigóticos, irmãos, pais/filhos e parentes de segundo
e terceiro grau, sugerindo uma susceptibilidade de natureza poligênica20,22. Os fatores
ambientais possivelmente implicados no surgimento da Esclerose Múltipla são
diversos, abrangendo desde infecções, como Vírus Epstein-Barr (EBV), Vírus Herpes
Humano tipo 6 (HHV-6) e Chlamydia pneumoniae 23, até baixa exposição solar,
carência de Vitamina D e tabagismo21. Uma teoria em voga atualmente, conhecida
16
como teoria da higiene, sugere que a exposição mais tardia a patógenos virais comuns
da infância pode desencadear uma resposta imunológica aberrante, relacionada ao
desenvolvimento de EM e outras doenças autoimunes17,21.
O estudo dos mecanismos imunopatológicos através dos quais se
perpetua uma resposta imunológica não específica circunscrita ao Sistema Nervoso
Central avançou consideravelmente nos últimos anos, porém grande parte do
processo permanece obscuro. Aparentemente a lesão se inicia com uma quebra da
barreira hematoencefálica (BHE), possivelmente por conta de doença infecciosa. Se
houver, com a quebra da BHE, passagem de linfócitos sensibilizados contra
componentes da bainha de mielina ou oligodendrócitos, dá-se início a um processo
inflamatório agudo principalmente na substância branca, embora não exclusivamente.
O processo inflamatório é de natureza autoimune23, e atribuído inicialmente a uma
incapacidade das células T helper reguladoras modularem a atividade das células T
helper efetoras19. A resposta imunológica na Esclerose Múltipla é predominantemente
do tipo celular, previamente creditada a Linfócitos T helper 1 (Th1).
Há evidências de que linfócitos T de pacientes sadios são naïve, enquanto
nos pacientes com EM apresentam fenótipo ativado, reativo a componentes da mielina
e são, de modo geral, mais inflamatórios. A capacidade de gerar doença no sistema
nervoso central (SNC) é determinada pelo perfil de citocinas produzidas por essa
população de linfócitos. Estudos mais recentes identificaram grande quantidade de
Interleucina 17 (IL-17) em lesões desmielinizantes de EM, e hoje acredita-se que os
Linfócitos T produtores de IL-17, denominados por esse motivo Th17, sejam os
principais efetores, sob estímulo de Interleucina 23 (IL-23). Um estudo demonstrou
que camundongos deficientes para IL-23 não desenvolvem Encefalite Autoimune
Experimental (EAE), o modelo animal da Esclerose Múltipla19,23.
17
1.4 As formas clínicas e Sintomas de Esclerose Múltipla
A Esclerose Múltipla pode apresentar, em sua evolução, períodos de piora
(denominados surtos ou exacerbações), fases de estabilidade e, eventualmente,
acúmulo de déficits e progressão da incapacidade. Essas diferentes formas clínicas
podem aparecer de forma isolada ou coexistir. Aceitavam-se quatro formas clínicas da
doença, conforme definição em 199624, porém esses critérios foram recentemente
revistos e bem aceitos, com a exclusão de um dos fenótipos (a chamada forma
Progressiva com Surtos), caracterização das Síndrome Clinicamente e
Radiologicamente Isoladas e o acréscimo de modificadores caracterizando a atividade
e evolução da doença25.
A Sindrome Clinicamente Isolada é a denominação do primeiro evento
clínico de uma doença com sinais de desmielinização inflamatória, mas que ainda não
preenche critérios para Esclerose Múltipla por falta de disseminação cronológica. A
revisão dos critérios diagnósticos em 2010, possibilitando a confirmação de
disseminação temporal em um único exame de ressonância magnética, reduziu o
número de pacientes que podem receber essa classificação25. A Síndrome
Radiologicamente Isolada consiste no achado incidental de lesões de aspecto
desmielinizante em uma Ressonância Magnética na ausência de achados clínicos.
Embora achados de imagem possam ser inespecíficos, estes pacientes devem ser
seguidos prospectivamente pelo risco de desenvolvimento de EM. Este risco é maior
para pacientes com presença de lesões típicas na RNM de encéfalo, lesões
medulares, lesões com captação de contraste e alterações no exame de líquido
cefalorraquidiano25.
A forma remitente-recorrente (EMRR) é a apresentação inicial de 80-85%
dos pacientes 17,26, caracterizada por surtos bem definidos e ausência de progressão
dos déficits entre surtos. Os surtos são definidos como pioras observadas ou relatadas
dos sintomas neurológicos, durando 24 horas ou mais, na ausência de febre ou
18
infecção27. Os surtos geralmente evoluem em alguns dias a semanas, estabilizam e
habitualmente apresentam melhora total ou parcial, espontaneamente ou em resposta
a corticosteroides26.
A forma primariamente progressiva (EMPP) é aquela caracterizada, desde
o princípio do quadro, por uma evolução constante dos déficits neurológicos. Cerca de
20% dos pacientes tem essa apresentação17. A velocidade de progressão pode variar,
sendo admitidos períodos de estabilidade clínica e até mesmo de melhora discreta25.
O déficit mais comum é dificuldade progressiva de marcha.
Estima-se que a maior parte dos pacientes com EMRR evoluirá, após um
determinado tempo, para a forma secundariamente progressiva da doença17,
caracterizada por uma evolução inicialmente remitente-recorrente, seguida por uma
fase em que há acúmulo progressivo de déficits. Assim como na forma primariamente
progressiva, são aceitos períodos de estabilidade e melhora clínica, bem como
eventuais surtos25.
Estes três fenótipos nucleares, EMRR, EMPP e EMSP, agora recebem
também modificadores que buscam melhor detalhar o momento clínico. Deve ser
identificado se o paciente está em atividade e se a doença está progredindo. Atividade
da EM pode ser identificada através da presença de novas lesões ou aumento do
volume de lesões anteriores em um novo exame de imagem, ou pela ocorrência de um
surto. O acúmulo de déficits pode ser avaliado clinicamente, por exemplo pela piora do
EDSS ou marcha cronometrada. Em pacientes com doença remitente-recorrente, cuja
piora se deve a surtos frequentes ou recuperação incompleta após um surto, opta-se
pela terminologia “em piora” (i.e. EMRR – em atividade e em piora), em detrimento a
progressão, termo reservado para pacientes em fase progressiva, em que a piora se
dá gradualmente ao longo do tempo.
19
A Esclerose Múltipla pode se apresentar com uma extensa gama de sinais
e sintomas neurológicos localizatórios, e outros não localizatórios, como disfunção
cognitiva, transtornos psiquiátricos, Fenômeno de Uhthoff e Sinal de Lhermitte 17,26. A
prevalência das diferentes manifestações parece ser influenciada pela idade de início
da doença e pela forma clínica, sendo a neurite óptica mais comum nos pacientes
jovens e mais rara após os 30 anos8. Alterações sensitivas, oftalmoparesia
internuclear e neurite óptica também são frequentes como forma de apresentação de
doença remitente-recorrente 26. As formas progressivas da doença parecem
apresentar mais frequentemente uma síndrome medular progressiva, com paraparesia
e espasticidade como sintomas iniciais26. Os principais sinais e sintomas de Esclerose
Múltipla e suas respectivas topografias estão resumidos na Figura 1. As alterações
mais precoces da EM podem ser atribuídas a bloqueios de condução em
determinadas fibras, enquanto o acúmulo de déficits característico da fase de
predomínio neurodegenerativo é devido a lesão axonal e morte celular. Ademais, com
a evolução da doença perde-se, progressivamente, os mecanismos de reparo
responsáveis pela remielinização, que ocorre nas fases iniciais10. Os sintomas
neurológicos podem ser deficitários (baixa acuidade visual, paresias, hipoestesias),
positivos (parestesias, neuralgia trigeminal, Sinal de Lhermitte) e transitórios, como o
Fenômeno de Uhthoff. Os fenômenos negativos podem ser atribuídos a diminuição da
velocidade de condução ou mesmo sua interrupção nos axônios desmielinizados. Os
fenômenos positivos podem advir de hiperexcitabilidade do axolema exposto pela
desmielinização, ou da transmissão inadequada do impulso entre dois axônios
desmielinizados adjacentes. Fenômeno de Uhthoff é o nome dado à piora transitória
dos sintomas observada nos pacientes de Esclerose Múltipla em decorrência de
aumento da temperatura corporal após um banho quente ou exercício físico10,17. A
razão para esse fenômeno é uma mudança nas propriedades elétricas dos axônios
20
desmielinizados causada pelo aumento da temperatura. Os fenômenos cognitivos são
atribuídos, por sua vez, a perda de células gliais, neurônios e sinapses10.
1.5 Diagnóstico de Esclerose Múltipla
O diagnóstico da EM é eminentemente clínico, sendo necessário a
presença de sintomas atribuíveis a lesões focais do SNC, comprovação de
disseminação no espaço e no tempo e exclusão de outras doenças com
TOPOGRAFIA SINTOMAS SINAIS
Déficit cognitivo Hemiférios Cerebrais Sinais de lesão do Neurônio Motor Superior Déficits sesitivos e motores dimidiados
Alterações do Afeto (Principalmente Depressão) Epilepsia Déficits Focais
Nervo Óptico Baixa acuidade visual dolorosa Escotomas, redução da acuidade visual, discromatopsia, defeito pupilar aferente relativo
Tremor Cerebelo e Vias Cerebelares Incoordenação e Desequilíbrio
Tremor cineticopostural, disartria Ataxia axial e apendicular
Tronco Cerebral Nistagmo, oftalmoplegia internuclear Diplopa, oscilopsia Vertigem Dificuldade para engolir e falar Labilidade emocional
Disfagia, disartria Síndrome Pseudobulbar
Medula Espinhal Fraqueza Sinais de lesão do Neurônio Motor Superior Rigidez e espasmos Espasticidade
Outros Incontinência Urinária Disfunção Erétil Constipação Dor
Figura'1.!Sinais!e!Sintomas!de!Esclerose!Múltipla
Traduzido e adaptado de Compston & Coles, 2008
21
características semelhantes28. Disseminação espacial (DIS) se refere a confirmação
da presença de lesões em diferentes topografias no Sistema Nervoso Central,
enquanto disseminação temporal (DIT) é caracterizada com a comprovação de
períodos cronológicos distintos de atividade da doença. Através da história foram
utilizados diversos critérios para o diagnóstico de Esclerose Múltipla, sendo os mais
antigos baseados apenas na observação clínica, e desta forma o diagnóstico se dava
através da identificação de dois ou mais episódios de déficits neurológicos distintos,
separados por um período de tempo, e não explicados por outra condição clínica. Com
a evolução dos métodos paraclínicos, como os potenciais evocados, exames de
imagem e análise do líquido cefalorraquidiano, os critérios diagnósticos passaram por
modificações. Atualmente considera-se como padrão ouro os critérios de McDonald,
publicados inicialmente em 2001 e revisados em 2005 e 2010. Estes critérios definiram
parâmetros para o uso da Ressonância Nuclear Magnética (RNM) como forma de
determinação de DIS e DIT27–30. Na última revisão, em 2010, foram propostos critérios
mais simples, possibilitando comprovação de DIS e DIT em um único exame, levando
a um aumento da sensibilidade27,28.
O diagnóstico da Forma Remitente-Recorrente, de acordo com a
revisão mais recente dos critérios pode ser dado, então, por a.) 2 ou mais surtos com
evidência clínica de 2 ou mais lesões, incluindo relato histórico, sem necessidade de
confirmação de DIS ou DIT por imagem; b.) 2 ou mais surtos, com evidência clínica de
uma lesão e DIS confirmada em RNM (ou novo surto com topografia diferente); c.) 1
surto, evidência clínica de 2 ou mais lesões e DIT confirmada por RNM (ou aguardar
novo surto); d.) 1 surto, evidência clínica de 1 lesão, confirmação de DIS e DIT pela
RNM (ou aguardar um novo surto). O quadro descrito no último item é caracterizado
como uma Síndrome Clinicamente Isolada (CIS), e foi o mais beneficiado pela revisão
dos critérios, uma vez que é possível fazer o diagnóstico de EM com apenas um surto.
Além disso, em casos de CIS em que não é comprovada DIT, a presença de lesões
22
com hipersinal em T2/FLAIR e confirmação de síntese intratecal de imunoglobulinas
pelo LCR predizem um alto risco de conversão para EM17,31.
O termo RIS (Síndrome Radiológica Isolada) foi recentemente introduzido
para descrever pacientes assintomáticos com lesões sugestivas de Esclerose Múltipla
na RNM. Esses pacientes, submetidos a RNM por queixas não relacionadas a doença
desmielinizante, podem evoluir com estabilidade das lesões, disseminação
assintomática no controle evolutivo, ou mesmo com conversão para Esclerose Múltipla
clinicamente manifesta32.
O diagnóstico da forma Primariamente Progressiva de EM, pelos critérios
revistos de 2010, é dado por comprovação prospectiva ou retrospectiva de progressão
por um ano, associado a dois dos três seguintes critérios: a.) evidência de DIS em
RNM do encéfalo; b.) evidência de DIS em RNM da coluna; c.) Presença de Bandas
Oligoclonais ou índice de IgG elevado no LCR27.
A análise do líquido cefalorraquidiano (LCR) foi descartada na última revisão do
Painel Internacional como critério diagnóstico para a forma remitente recorrente,
porém permanece como critério de suporte para o diagnóstico da forma primariamente
progressiva, e sua avaliação é essencial na confirmação da natureza inflamatória e
desmielinizante da doença, bem como para descartar doenças com apresentação
semelhante a Esclerose Múltipla.
1.6 Papel do Líquido Cefalorraquidiano na Esclerose Múltipla
A resposta humoral intratecal detectável no LCR de pacientes com EM é um
dos sinais mais frequentes e estáveis de doença do SNC, e classicamente é avaliada
por um aumento no índice de IgG LCR/soro, pelo Diagrama de Reiber ou pela
presença de bandas oligoclonais (BOC) de IgG, encontradas em até 98% dos
pacientes33. Análises seriadas do LCR de pacientes com EM mostram que o padrão
23
das BOC é variável entre indivíduos, porém estável para um mesmo paciente, e sua
expressão não é habitualmente modificada pelo tratamento, exceto no uso de
natalizumabe34. As bandas oligoclonais, quando identificadas no LCR, revelam a
síntese intratecal de imunoglobulinas, e podem estar presentes em uma série de
doenças, habitualmente de natureza infecciosa, como a Mielopatia por HTLV,
Neuroborreliose ou Neurolues35,36. O exame de LCR sugestivo de EM é caracterizado
por pleocitose linfomonocitária discreta, abaixo de 50 células por milímetro cúbico e
presença de bandas oligoclonais de IgG não isoladas no sangue ou índice de IgG
aumentado, denotando síntese intratecal de imunoglobulinas29. Considera-se
pleocitose uma contagem superior a 4 células nucleadas/µl37. Recentemente vem-se
tentando relacionar possíveis marcadores identificados no LCR com o prognóstico da
doença31. A análise liquórica foi suprimida na última revisão dos critérios diagnósticos
para EMRR27.
A inespecificidade da identificação das Bandas Oligoclonais no diagnóstico da
Esclerose Múltipla cria a necessidade de se buscar outros marcadores diagnósticos. A
partir da década de 1990 diversos estudos com pacientes portadores de Esclerose
Múltipla demonstraram a presença de uma resposta humoral poliespecífica intratecal
contra diversos antígenos virais, sendo os Vírus do Sarampo, da Rubéola e Varicela
Zoster os mais proeminentes38,39. Baseado nessa observação foi proposto que a
Reação MRZ (MRZR) positiva, caracterizada pela presença de síntese intratecal de
anticorpos contra pelo menos 2 destes 3 antígenos, seria um marcador mais
específico para o diagnóstico da doença do que as bandas oligoclonais, uma vez que
demonstraria a presença de uma doença crônica já no momento dos primeiros
sintomas33. A base teórica para esta observação é que Imunoglobulinas da mesma
classe tem o mesmo tamanho molecular, e portanto a mesma permeabilidade da
barreira hematoencefálica38. Desta forma, a proporção entre o quociente LCR/soro de
IgG total e de IgG específico, em condições normais, deveria ser igual a 1,0. Um valor
24
maior indica a produção intratecal deste anticorpo. O cálculo do índice de anticorpo
específico (AI, do inglês Antibody Index) tem como objetivo discriminar anticorpos
patológicos, produzidos intratecalmente, daqueles originários da circulação, levando
em consideração a integridade da barreira individualmente. Nos casos em que há
produção de grandes quantidades de imunoglobulina intratecalmente pode ocorrer um
falso valor baixo de AI. Como sabemos que o quociente de albumina LCR/soro é um
indicador individualizado da função da barreira tanto no indivíduo normal quanto
naquele portador de alguma doença neurológica (com raras exceções em pacientes
muito jovens), propõe-se a correção AI = Qspec/QLim, em que QLim representa a fração
de IgG originária exclusivamente do sangue, calculada a partir do quociente de
albumina individual do paciente. O valor de referência para o AI é 0,7 a 1,3, e valores
iguais ou superiores a 1,5 indicam síntese intratecal deste anticorpo no SNC37,38,40.
A síntese intratecal destes anticorpos não representa uma resposta específica
à presença do vírus no sistema nervoso central, como já foi demonstrado pela
ausência de replicação viral por métodos de PCR41, mas sim a perpetuação de uma
resposta inflamatória restrita ao SNC na ausência deste estímulo. Estudos posteriores
demonstraram a ausência deste marcador em outras doenças neurológicas
autoimunes, como a Neuromielite Óptica42 e as Encefalites Paraneoplásicas43 ,
reforçando sua especificidade para o diagnóstico da Esclerose Múltipla. Há o relato de
dois pacientes com manifestações neurológicas relacionadas a colagenose44, ambos
os casos clinicamente superponíveis a Neuromielite Optica, porém com presença de
anticorpos antinucleares.
A reação MRZ foi observada, inicialmente, apenas em pacientes com a
presença de BOC33, o que justifica ter-se argumentado, que apresentaria sensibilidade
inferior à detecção de bandas. No entanto, foi recentemente publicada uma casuística
alemã com mais de 20% de positividade do MRZR em pacientes com Esclerose
Múltipla sem BOC detectáveis no LCR, o que sugere que a sensibilidade do método
25
pode ter sido subestimada45. Essa hipótese é corroborada por outro trabalho realizado
com amostras de LCR em que não foram detectadas bandas oligoclonais de IgG,
porém foi identificada a síntese intratecal de anticorpos contra pelo menos um
antígeno viral ou bacteriano entre seis pacientes testados46.
A frequência de anticorpos específicos contra esses vírus (e/ou outros) é
dependente da sua prevalência natural, bem como da cobertura vacinal da população
estudada42,43,45. A maior parte desses estudos foi realizada em populações
predominantemente caucasianas, de países do hemisfério norte, com prevalência
mais elevada de Esclerose Múltipla e políticas de vacinação distintas da praticada em
nosso meio. Ademais, a positividade para BOC em nossa população se mostrou
variável entre diferentes grupos, porém aparenta ser menor do que a observada na
literatura internacional47–49 e o MRZR mostra grande potencial como método
diagnóstico complementar, principalmente no início da doença, quando a sensibilidade
das BOC é ainda menor.
2. OBJETIVOS
O objetivo principal é analisar sensibilidade e especificidade diagnósticas da
síntese intratecal de imunoglobulinas G contra os vírus do Sarampo, da Rubéola,
Herpes tipos 1 e 2 e o Vírus Varicela Zoster em um grupo de pacientes brasileiros
portadores de Esclerose Múltipla. Os objetivos secundários são comparar a acurácia
do MRZR com as BOC de IgG, comparar o MRZR em pacientes com Esclerose
Múltipla, outras doenças inflamatórias do SNC e pacientes sem doença inflamatória e
avaliar a síntese intratecal de anticorpos contra o capsídeo viral do vírus de Epstein-
Barr (VCA-IgG) nos pacientes com EM e nos controles inflamatórios e não-
inflamatórios.
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3 a. Pacientes
Os pacientes foram selecionados no Ambulatório de Esclerose Múltipla do
Hospital de Clínicas da Universidade de Campinas entre os anos de 2005 e 2015. Este
ambulatório recebe pacientes de maior complexidade, encaminhados de outros
serviços de saúde para investigação de doenças desmielinizantes. Dentre os
pacientes identificados como preenchendo os critérios de inclusão da pesquisa, foi
possível realizar a análise da resposta poliespecífica intratecal em 63 casos. Foram
excluídos pacientes com diagnóstico inconclusivo e aqueles com volume insuficiente
de amostras de LCR ou soro para realização dos testes. O diagnóstico de Esclerose
Múltipla foi feito de acordo com os Critérios Revisados de McDonald27 e os
diagnósticos de outras doenças foram obtidos através de revisão de prontuário. Uso
de imunomoduladores e imunossupressores não foi considerado como critério de
exclusão.
Trinta e três pacientes receberam diagnóstico de Esclerose Múltipla e quatro
pacientes tiveram o diagnóstico de uma forma pré-clínica de Esclerose Múltipla, sendo
uma RIS e três CIS. Seis casos tiveram diagnóstico de doenças neurológicas
inflamatórias ou infecciosas (DNII), sendo uma Mielopatia por HTLV, uma
Ganglionopatia, uma Encefalite Paraneoplásica, uma Síndrome de Susac, uma
Neuromielite Óptica e um Neuro-Behçet. Oito pacientes tiveram diagnóstico final de
outras doenças neurológicas (ODN) consideradas não-inflamatórias, sendo duas
mielopatias compressivas, um tumor medular, um transtorno conversivo, uma
Neuropatia Óptica Isquêmica e três cefaleias primárias. Foram recrutados
adicionalmente 12 pacientes submetidos a punção lombar para investigação de
cefaleia e que receberam o diagnostico de cefaleias primárias para compor este grupo
de controle de pacientes sem doença inflamatória neurológica. Dentre os pacientes
27
incluídos não foi realizado a pesquisa de BOC-IgG em um caso, pesquisa de
Anticorpos contra EBV (quatro casos) e pesquisa de Anticorpos contra Herpes simplex
(sete casos) por motivo de volume de material insuficiente.
3 b. Métodos
b.1 Material Biológico
Foram coletadas amostras pareadas de sangue e LCR de cada paciente,
respectivamente, através de punção venosa periférica e punção lombar. As amostras
coletadas foram triadas para as análises citológicas, bioquímicas, microbiológicas e
sorológicas de rotina no Laboratório de Patologia Clínica do HC da Unicamp. Uma
alíquota do sangue e outra de LCR foram encaminhadas ao Laboratório de
Neuroimunologia (Instituto de Biologia) e armazenadas em freezer na temperatura
controlada de – 80ºC para análises posteriores.
b.2 Análise Laboratoriais
A análise quimiocitológica rotineira, envolvendo contagem global e diferencial
de células, quantificação de glicose, proteína total e lactato, foi realizada em todos os
pacientes pelo Laboratório de Patologia Clínica do HC-UNICAMP. Em casos
selecionados, conforme indicação da equipe de assistência, também foram realizados
outros testes como sorologias, quantificação de IgG, índice de IgG e pesquisa de
Bandas Oligoclonais.
Para a análise da síntese intratecal de anticorpos foi realizada a quantificação
da albumina e imunoglobulinas IgG no soro e LCR através de nefelometria, pesquisa
de BOC IgG através de focalização isoelétrica/imunofixação e a quantificação de
imunoglobulinas específicas contra antígenos dos vírus Sarampo, Rubéola, Varicela
28
Zoster, Herpes simples e Epstein-Barr pelo método ELISA. Para a quantificação dos
anticorpos específicos foi utilizado um sistema automatizado Immunomat Serion,
integrando lavadora e leitora ELISA, sistema de automação da pipetagem,
transportador de placas e sistema de incubação. A partir dos valores de albumina, IgG
total e IgG específica no soro e no LCR serão avaliados, conforme descrito em
literatura, os seguintes parâmetros: a função da barreira hematoencefálica (Quociente
Albumina, Qalb), a síntese intratecal de IgG total (Índice de IgG, QIgG) e a síntese
intratecal de IgG específica contra os vírus do Sarampo, Rubéola, Varicela Zoster e
Herpes Simples. A fórmula matemática foi descrita inicialmente por Reiber e Lange38.
AI = Qspec/QIgG, ou AI = Qspec/QLim nos casos em que QIgG > QLim.
b.3 ELISA
Para a quantificação de IgG contra os antígenos virais foram utilizados kits
comerciais SERION ELISA classic Herpes Simples 1+2 IgG, Varicela Zoster, Sarampo,
Rubéola e VCA (Antígeno do Capsídeo Viral do Vírus de Epstein-Barr). Os testes
foram utilizados conforme recomendação do fabricante, com diluição 1:2 para as
amostras de LCR e 1:400 para soro. Os testes foram realizados utilizando-se o
automatizador como já descrito.
O ELISA (Enzime linked Immunosorbent Assay) é um teste consagrado para a
detecção quantitativa e qualitativa de substâncias em amostras líquidas e utiliza
anticorpos ligados a enzimas para a detecção do analito e geração de um sinal
mensurável.
3.c Aspectos Éticos
29
Todos os procedimentos invasivos necessários (punção venosa periférica e
punção lombar) e eventuais exames complementares necessários foram indicados
pela equipe médica assistente. Os pacientes foram abordados pela equipe de
pesquisa e receberam inicialmente orientação verbal sobre os propósitos do trabalho e
foram convidados a participar. Os pacientes que concordaram foram apresentados ao
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), sendo instruídos a lê-lo
atentamente e a manifestar suas dúvidas. Uma vez esclarecidas as dúvidas, o TCLE
era assinado em duas vias, ficando uma delas em posse do paciente.
3.d Análise Estatística
Para descrever o perfil da amostra segundo as variáveis em estudo foram
feitas tabelas de frequência das variáveis categóricas com valores de frequência
absoluta (n) e percentual (%), e estatísticas descritivas das variáveis numéricas, com
valores de média, desvio padrão, valores mínimo e máximo e mediana. Para
comparação das variáveis numéricas entre os grupos foi utilizado o teste de Kruskal-
Wallis, seguido do teste post-hoc de Dunn para identificação das diferenças. Para as
variáveis categóricas foi utilizado o teste exato de Fisher. O nível de significância
adotado para o estudo foi de 5%. Para análise estatística foram utilizados os seguintes
programas computacionais:
• The SAS System for Windows (Statistical Analysis System), versão 9.4. SAS
Institute Inc, 2002-2008, Cary, NC, USA.
• SPSS Statistics, versão 21.0. IBM Inc, Chicago, Illinois, USA.
4. RESULTADOS
Os principais dados demográficos desta população de estudo compõe a Tabela
1, que demonstra não haver diferença entre as idades dos grupos. Houve predomínio
30
Tabela 1. Dados demográficos da população estudada
Esclerose Múltipla (n=33)
Formas Pré-Clínicas
(n=4)
DNII ODN
(n=6) (n=20)
Idade (anos)a,b 32,0
(18-59)
35,0
(25-37)
49,5
(34-64)
35,0
(18-57)
Gênero (F:M) 3,1 : 1 01:01 02:01 04:01
Follow-Up (anos)a
2,3
(0-22,1)
3,0±6,2
(0-13,5)
4,8
(3-21)
1,5
(n=8)
a.Mediana (minimo-maximo). b. p=0.063
feminino na população avaliada (2,9:1) e o tempo mediano de seguimento foi 3,5 anos
(0 - 22,1 anos). Pacientes foram acompanhados por 0-10 anos após a punção lombar
(mediana 0,93).
4.a Pacientes com Esclerose Múltipla
Dentre os 33 pacientes com Esclerose Múltipla, 25 eram do gênero feminino
(76%). Quatro apresentavam a forma Primariamente Progressiva da doença (12%) e
outros 4 tiveram o diagnóstico da forma Secundária Progressiva no momento da
análise (12%). Vinte e cinco pacientes mantinham-se na forma Surto-Remissão (76%).
O EDSS na primeira avaliação variou entre 0 e 7,0 (mediana: 2,5) e na última entre 0-
8,5 (mediana: 3,7).
Pacientes com forma Remitente Recorrente tiveram a punção realizada após
uma mediana de 2 anos do primeiro surto (mínimo:0, máximo: 28) e tiveram entre 1 e
7 surtos (mediana: 3,5).
31
4.b Pacientes com Formas Pré-Diagnósticas de Esclerose Múltipla
Uma paciente foi referida ao Serviço para avaliação de lesões desmielinizantes
assintomáticas, recebendo o diagnóstico de RIS. Após 5,5 anos de seguimento a
paciente se manteve sem evidência clínica de doença. Sua imagem de RNM
apresenta lesões com distribuição topográfica compatível com Esclerose Múltipla. Não
foram detectadas bandas oligoclonais de IgG em seu LCR. Análise dos índices de
anticorpo revelou uma resposta biespecífica (H+Z+, AI= 2,1 e 3,7 respectivamente).
Três pacientes, sendo dois do sexo masculino, receberam o diagnóstico de
CIS. Com tempos de follow-up variando de zero a 13,5 anos os pacientes ainda não
preenchiam critérios de disseminação temporal para confirmação diagnóstica de
Esclerose Múltipla. Dois destes pacientes possuíam presença de BOC-IgG no LCR,
um deles um índice elevado de anticorpos contra Sarampo, outro contra Sarampo,
Rubéola e Herpes Simples. O terceiro paciente não apresentava BOC-IgG no LCR e
manifestou resposta intratecal apenas contra EBV.
Estes pacientes foram excluídos da análise estatística uma vez que não
preencheram critérios para Esclerose Múltipla e tampouco para os grupos controles, e
foram relatados apenas de forma a ilustrar que a resposta poliespecífica intratecal
aparece precocemente.
4.c Pacientes dos grupos controle DNII e ODN
Dentre os pacientes do grupo DNII foi observado uma mediana de idade de
49,5 anos (mínima 34, máxima 64 anos), sem significância estatística quando
comparado ao grupo EM. Estes pacientes foram acompanhados por um mínimo de 2,7
e um máximo de 20,6 anos (mediana 5,7 anos).
32
Os pacientes do grupo ODN tinham entre 18 e 57 anos (mediana 35 anos) no
momento da coleta e foram acompanhados por uma mediana de 1,5 anos (mínima 0,1
e máxima 20,1 anos; n=8). Doze pacientes incluídos consecutivamente durante
investigação de cefaleias não foram seguidos e seus dados clínicos foram obtidos
apenas através de revisão de prontuário.
4.d Análise do Líquido Cefalorraquidiano e da Resposta Imune
Poliespecífica Intratecal
A análise quimiocitológica do LCR dos pacientes está demonstrada na Tabela
2. A avaliação da imunoprodução intratecal através da presença de BOC e Índice
Linear de IgG resultaram positivas, respectivamente, em 72% e 65% dos pacientes
com Esclerose Múltipla. Utilizando-se ambas as ferramentas, cinco pacientes (15,2%)
com EM não apresentaram evidência de síntese de IgG intratecal. BOC-IgG foram
detectadas adicionalmente em 2 pacientes com diagnóstico de CIS e em um paciente
do grupo DNII com diagnóstico de Síndrome de Susac. BOC-IgG não foram
identificadas em nenhum pacientes do subgrupo ODN. A análise do Índice Linear de
IgG de Link resultou positiva em um paciente do subgrupo DNII com diagnóstico de
Tabela 2. Análise Quimiocitológica do LCR a
Esclerose Múltipla (n=33)
Leucócitos (n/mm3) a, b
4,0 (1-17)
Proteínas (mg/dL)a,c
36,0 (21-70)
IgG (mg/dL)a,d
4,0 (2,3-11,0)
Formas Pré-Clínicas (n=4)
3,0 (3-4)
29,5 (28-84)
2,7 (2,3-3,9)
Doenças inflamatórias (n=5)
7,0 (3-56)
39,0 (18-95)
2,3 (0,8-3,6)
Doenças Não-Inflamatórias (n=20)
2,0 (1-4)
25,5 (11-47)
2,4 (1,0-4,6)
a. Mediana (mínimo – máximo) b. p<0.0001, DNIIxEM, DNIIxODN c. p=0.0063, EMxODN d. p<0.0001, EMxODN, EMxDNII
33
Neuro-Behçet e em uma paciente do subgrupo ODN com diagnóstico de Síndrome
Conversiva.
Quando adicionamos às BOC-IgG a pesquisa da resposta imune intratecal
poliespecífica, apenas 1 paciente com diagnóstico de EM (3,0%) não apresentou
evidência de um processo inflamatório crônico do SNC. Na Tabela 3 encontram-se
ilustrados os dados pertinentes à presença de imunoprodução intratecal para todos os
grupos de pacientes. A detecção de um AI ≥ 1,5 dentre os antígenos virais M, R, Z e H
(resposta monoespecífica) teve sensibilidade de 67% para detectar Esclerose Múltipla,
semelhante àquela observada para a pesquisa de BOC-IgG, e especificidade de 81%.
Utilizando a marca de 2 ou mais índices positivos (resposta bi, tri e quadriespecífica) a
sensibilidade foi 52% e especificidade 92%.
A prevalência individual dos vírus está demonstrada na Tabela 4. Onze
pacientes (33%) não apresentaram resposta intratecal contra qualquer um dos vírus.
Cinco (15%) apresentaram resposta monoespecífica (M+=2, R+=1, V+=2); Dez
pacientes (30%) apresentaram resposta biespecífica (MR+=5, MZ+=1, MH+=2,
RZ+=2); Quatro apresentaram resposta triespecífica (12%) (MRZ+=3, MRH+=1) e 3
pacientes (10%) apresentaram resposta quadriespecífica. É importante ressaltar que
Tabela 3. Análise da Síntese Intratecal de Anticorpos Índice de IgG BOC-IgG
>0,7 Presente a a
Esclerose Múltipla 64,5% (n=33) (n=31)
MRZH ≥ 1
anticorpo b MRZH EBV ≥ 2
anticorpos c
71,9% 66,7% 51,5% (n=32)
58,1% (n=31)
Formas Pré- Zero Clínicas (n=4)
50% 75,0% 50,0% 75,0%
Doenças 16,7% inflamatórias (n=6)
16,7% 50,0% 16,7% 50,0%
Doenças Não- 5,0% Inflamatórias (n=20)
Zero 20,0% 5,0% 75,0%
a. p<0,0001 b. p=0.0006 c. p=0,0008
34
anticorpos contra Herpes simplex foram testados em um subgrupo de 29 pacientes
com EM.
As medianas dos AI individuais foram comparadas entre os grupos EM, DNII e
OND. Apenas o AI do Sarampo obteve significância estatística (p=0,018) diferenciando
EM, com mediana 1,6 (0 – 122,8) e OND com mediana 0,8 (0,1- 6,7).
A utilização de um critério de rastreio combinando a pesquisa de BOC-IgG
e/ou a reação MRZH biespecífica atingiu uma sensibilidade de 88% com
especificidade 92% e acurácia 90%(Tabela 5).
Tabela 4. Sensibilidade, Especificidade, Acurácia para a detecção da presença de síntese intratecal de IgG e síntese de anticorpos contra antígenos específicos virais
Esclerose Múltipla Controles
Sarampo 51,5% (17/33)
11,5% (3/26)
Sensibilidade: 51,5% Especificidade: 88,5%
Acurácia: 67,8%
Rubéola 45,5% (15/33)
11,5% (3/26)
Sensibilidade: 45,5% Especificidade: 88,5%
Acurácia: 64,4%
Varicella Zoster
33,3% (11/33)
7,7% (2/26)
Sensibilidade: 33,3% Especificidade: 92,3%
Acurácia: 59,3%
Herpes simplex
20,7% (6/29)
20,8% (5/24)
Sensibilidade: 20,7% Especificidade: 79,2%
Acurácia: 42,4%
Epstein Barr 60% (18/30)
69,2% (18/26)
Sensibilidade: 60,0% Especificidade: 30,8%
Acurácia: 44,1%
35
Tabela 5. Sensibilidade, Especificidade, Acurácia para a detecção da presença de síntese intratecal de IgG e síntese de anticorpos contra antígenos específicos virais
Presença ≥ 1 anticorpo MRZH
Esclerose ODN + Múltipla DNII
27% 67%
(22/33) (7/26)
Sensitivity: 67% Specificity: 73% Accuracy: 69%
Presença ≥ 2 anticorpo MRZH
55% 8% (18/33)
(2/26)
Sensitivity: 55% Specificity: 92% Accuracy: 71%
BOC-IgG 72% 4% (23/32) (1/26)
Sensitivity: 72% Specificity: 96% Accuracy: 83%
BOC-IgG ou ≥ 2 anticorpos MRZH
88% 8% (29/33) (2/26)
Sensitivity: 88% Specificity: 92% Accuracy: 90%
4.e Pesquisa de Síntese Intratecal de Anticorpos contra o Antígeno do
Capsídeo Viral do Vírus Epstein-Barr (VCA-IgG)
Em sessenta pacientes foi realizada a pesquisa de anticorpos contra o
Antígeno do Capsídeo Viral do Vírus Epstein-Barr (Anti-VCA-IgG). Dentre 30 pacientes
com Esclerose Múltipla, 18 (60%) apresentaram síntese intratecal contra este
antígeno. No grupo controle não-inflamatório 15 pacientes apresentaram AI ≥ 1,5 para
VCA-IgG no LCR (75%). O mesmo valor de 75% foi obtido para o grupo de 4
pacientes com formas pré-diagnósticas e 50% para o grupo de 6 pacientes com outras
doenças neurológicas.
O AI variou entre 0,3 e 5626,7. A mediana foi 2,3 para toda a casuística, 1,7
para o subgrupo de pacientes com EM, 2,6 para os subgrupos de formas pré-clínicas e
doenças inflamatórias e 5,4 para o grupo de doenças não inflamatórias. As diferenças
entre os grupos não atingiram significância estatística (p=0,063).
36
5. DISCUSSÃO
A distribuição de gêneros para nosso grupo de Esclerose Múltipla (3,1:1) é
compatível com o observado na literatura internacional6. Os pacientes apresentaram
evolução clínica típica no acompanhamento.
Uma resposta poliespecífica intratecal foi identificada em 89% dos pacientes
com BOC-IgG ausente e em uma paciente não testada para BOC-IgG. Resposta
MRZH biespecífica (n=2), triespecífica (n=2) ou quadriespecífica (n=2) esteve presente
em 60% dos pacientes com BOC-IgG ausente. A possibilidade de detecção de uma
resposta poliviral intratecal já havia sido demonstrada em pacientes com BOC-IgG
ausente39,46, e sua ocorrência foi confirmada em aproximadamente 50% dos pacientes
portadores de EM em que não se detectou a presença de BOC-IgG45, mostrando sua
utilidade como marcador substituto neste subgrupo de pacientes. Demonstramos que
o uso de uma ferramenta combinada, com a detecção de BOC-IgG e/ou 2 ou mais
anticorpos produzidos intratecalmente foi capaz de aumentar a sensibilidade e a
acurácia quando comparado com apenas a BOC-IgG.
A reação MRZH surge precocemente na EM, como demonstrado por sua
presença na CIS55,56 e seu papel conferindo risco de conversão a Esclerose Múltipla
Clinicamente Definida. Estes achados foram replicados em nosso subgrupo de formas
pré-clínicas, em que 3 pacientes (75%) apresentaram resposta contra ao menos um
dos antígenos virais, sendo uma resposta monoespecífica (M), uma biespecífica (ZH)
e uma triespecífica (MRH).
Em nossa população as frequências relativas da reposta antiviral foram
comparáveis ao observado por outros autores, sendo Sarampo o mais comum,
seguido por Rubéola e Varicela Zoster33,42,53,57, como demonstrado na Tabela 6. A
frequência das resposta individuais foi abaixo daquela observada em outros estudos,
especialmente os que incluem populações europeias33,39,42.
37
Tabela 6. Análise Comparativa da Síntese Intratecal contra antígenos virais em pacientes com Esclerose Múltipla na literatura internacional
MV RV ZV HV ≥ 1 AC ≥ 2 AC BOC
Jarius, S et cols, 20081 90% 76% N=42
76% X 90% 88% 93%
Bednarova, J et cols, 20052 68% 40% N=50
36% X 86% 46% 84%
3 Kulakowska, A et cols, 55% 63% 2012 N=27
50% 27% 81% 56% X
4 Robinson-Agramonte, M et 78% 30% cols, 2007 N=23
59% X 100% 48% 96%
Reiber, H et cols, 19985 78% 60% N=177
55% 28% 90% 67% 100% (n=94)
Este estudo 52% 46% N=33
33% 21% 67% 55% 72%
Este achado pode ser justificado pelas diferentes políticas vacinais empregadas. Após
seu desenvolvimento em 1968 a vacina contra o Sarampo foi largamente empregada
desde a década de 1970 na Alemanha58, enquanto no Brasil a oferta foi errática, e
políticas de vacinação com ampla cobertura nacional foram implementadas apenas a
partir da década de 1990, resultando na erradicação do Sarampo nos anos 2000. A
vacinação rotineira contra rubéola foi introduzida na Alemanha Ocidental em 1980 e na
Alemanha Oriental em 1986, sendo oferecida a partir da reunificação em 1991 em
conjunto com a vacina contra o Sarampo59. Na Suécia a vacinação maciça contra o
Sarampo foi introduzida em 1971, contra Rubéola em 1974 e a vacina tríplice viral
ofertada em duas doses na infância de forma pioneira a partir de 1982 No estado de
São Paulo a vacina SCR/MMR, ou tríplice viral, foi ofertada a partir de 1992, porém
apenas para crianças e nos anos 2001 e 2003 ocorreram campanhas de vacinação
em massa de mulheres como prevenção a Síndrome da Rubéola Congênita. Após
surto no ano de 2006 em que 70% dos acometidos foram adultos do sexo masculino,
nova campanha de vacinação maciça em 2008 levou a erradicação da doença no
território nacional em 2009. O Anticorpo contra Rubéola foi detectado em 15 pacientes
38
com EM em nosso grupo, apenas um deles do sexo masculino (7%), dado que não é
reproduzido para os demais antígenos testados (M: 24%, Z: 27%, H: 33%), que
tendem a acompanhar a distribuição entre gêneros da população estudada. Um dado
semelhantes é observado no estudo de Robinson-Agramonte e colaboradores57,
creditando a desproporção também à política vacinal cubana, que ofertava cobertura
apenas a mulheres.
Uma menor sensibilidade das BOC-IgG para a detecção de EM é relatada em
populações não caucasianas60–62 quando comparadas aos estudos em europeus
caucasianos33,39,54,63,64 . Algumas possíveis explicações são vieses diagnósticos, com a
crença por alguns pesquisadores de que haveria uma tendência ao sobrediagnóstico
em países com menor incidência de Esclerose Múltipla48, ou então vieses técnicos,
como o uso de técnicas não padronizadas para a pesquisa das BOC-IgG. Neste
trabalho, bem como nos outros trabalhos de nosso grupo, utilizamos a metodologia
considerada padrão-ouro para a detecção de BOC-IgG, focalização isoelétrica seguida
por immunoblotting50 e como já discutido previamente, os diagnósticos desta série
foram feitos em acordo com critérios clínicos sensíveis, específicos e atualizados27,
com suporte neurorradiológico. A presença de BOC-IgG em 72% dos pacientes
avaliados, aliada a dados de outros pesquisadores brasileiros47–49 descrevendo valores
entre 55 e 91% sugere que a BOC-IgG em nossa população tem uma frequência
intermediária entre o observado em populações europeias e asiáticas33,39,42,60,61. Com a
análise de MRZR neste grupo de pacientes pudemos comprovar a presença de
síntese intratecal de anticorpos em 97% dos pacientes com Esclerose Múltipla,
afastando a possibilidade de superdiagnóstico ou de mecanismos de doença distintos
entre nossa população e a população europeia. A menor prevalência individual dos
anticorpos específicos testados quando comparada com estudos europeus reforça o
conceito de que os anticorpos polivirais detectados no LCR não sugerem uma etiologia
infecciosa para a EM. Possivelmente, em um indivíduo com a adequada
39
suscetibilidade genética, múltiplos estímulos antigênicos podem ter o potencial de
desencadear o processo inflamatório crônico cujo fenótipo clínico-radiológico
denominamos Esclerose Múltipla e cujo reflexo imunológico mensurável é a
persistência de imunoprodução intratecal na ausência de um estímulo antigênico.
Resta por fim a possibilidade mais provável de haver um ou mais fatores
intrínsecos a essas populações, como particularidades imunogenéticas ou diferenças
na exposição ambiental a antígenos (naturais ou vacinais), que justifiquem as
variações pronunciadas na prevalência deste marcador.
A presença de síntese de anticorpos anti-EBV no LCR é infrequente em
pacientes com Esclerose Múltipla, e o Antígeno Núclear-1 do EBV (EBNA-1-IgG) foi
detectado mais frequentemente neste grupo de pacientes quando comparado com
VCA-IgG63,65,66. Em um estudo italiano, síntese intratecal contra estes antígenos foi
observada respectivamente em apenas 6 e 2% dos pacientes, contrastando com 60%
em nossa casuística. A frequência maior de VCA-IgG em pacientes com outras
doenças neurológicas, 69% em nosso subgrupo não-EM, também é descrita63. Um
estudo por Otto e colaboradores67 avaliou 24 pacientes com EBV-AI ≥ 1,5 quanto a
fração intratecal de anticorpos anti-EBV e presença de resposta poliviral concomitante,
concluindo que o EBV é parte do painel antigênico que compõe a resposta
poliespecífica intratecal, não encontrando evidência para um papel significativo da
infecção pelo EBV como um agente causal na Esclerose Múltipla.
Os dados obtidos neste trabalho sugerem que é possível que, em nossa
população, outros antígenos não pesquisados neste momento componham a resposta
poliespecífica intratecal. Uma ampla pesquisa de anticorpos séricos contra antígenos
possivelmente neurotrópicos e comuns em nosso meio poderia sugerir novos alvos
para a pesquisa. A elevada prevalência dos flavivirus em nosso meio, seu notório
neurotropismo e frequentes quadros parainfecciosos associados fazem destes
agentes um potencial grupo de interesse.
40
A pesquisa do EBNA-1-IgG em pacientes portadores de Esclerose Múltipla e
de outras doenças neurológicas poderá elucidar adicionalmente a inesperada elevada
frequência de VCA-IgG em nossa população
6. CONCLUSÕES
A Resposta Humoral Poliespecífica Intratecal foi observada neste grupo de
pacientes brasileiros, com sensibilidade de 67% e especificidade de 81% para a
detecção de Esclerose Múltipla. A avaliação deste método associado a pesquisa das
BOC-IgG aumentou a sensibilidade para detecção de síntese intratecal de
imunoglobulinas em nossa população quando comparado ao uso isolado das bandas
oligoclonais de IgG restritas ao LCR. O uso de um corte de 2 ou mais anticorpos com
AI ≥ 1,5 aumentou de forma importante a especificidade do teste combinado para
92%, com pouco prejuízo à sensibilidade (88%). A acurácia do critério combinado foi
90%, contra 69% do MRZH e 83% das BOC-IgG quando usados isoladamente.
Demonstramos em nossa casuística uma prevalência elevada de anticorpos
contra o antígeno do capsídeo viral do Vírus Epstein-Barr (VCA-IgG) tanto em
pacientes portadores de Esclerose Múltipla quanto nos grupos definidos como
controle. A pesquisa de síntese intratecal de VCA-IgG adicionou sensibilidade à
detecção da resposta imune intratecal, porém com baixa especificidade.
Este estudo corrobora dados prévios demonstrando que a presença da
resposta MRZ não é exclusiva de pacientes com BOC-IgG positiva.39,45,46
41
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44
APÊNDICES
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), conforme resolução 196/96. Projeto: Avaliação da Resposta Imune Poliespecífica Intratecal em Pacientes Brasileiros com Esclerose Múltipla. Parecer do CEP: 481.568 CAAE: 17272913.0.0000.5404
Pesquisador Responsável: Rafael Paternò Castello Dias Carneiro Data:________________
Justificativa e Objetivos: A Esclerose Múltipla (EM) é a mais comum entre as doenças inflamatórias desmielinizantes do sistema nervoso central. É uma doença que geralmente se inicia entre os 20 e os 40 anos de idade, e é uma das principais causas de incapacidade em pessoas jovens. A doença geralmente se manifesta como surtos, que podem deixar sequelas, e algumas vezes se apresenta como um quadro de piora contínua. Existem opções para o tratamento, que buscam diminuir o número de surtos e atrasar a evolução da doença. É importante fazermos o diagnóstico o quanto antes, e com boa margem de segurança, determinando assim o melhor tratamento. A análise da resposta imune poliespecífica intratecal (MRZ) vem sendo estudada em outros países como um marcador muito importante para o diagnóstico de Esclerose Múltipla. Não existem trabalhos realizados no Brasil com esse método, e por esse motivo iniciamos esse projeto de pesquisa, com o objetivo de estudar essa reação no sangue e no líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com EM que aceitarem participar. Os resultados podem ajudar na criação futura de novos métodos diagnósticos e tratamentos. Os pacientes serão estudados durante o acompanhamento normal que já realiza no ambulatório de EM. Procedimentos: Pacientes em investigação de Esclerose Múltipla no Ambulatório de Neurologia da UNICAMP / HC, para quem foi indicado coleta de sangue e LCR para propósito de diagnóstico e seguimento da doença terão sua autorização solicitada para o uso de material biológico nessa pesquisa. Serão necessários 10ml do líquor (obtida pela punção lombar) e 10ml do sangue para os estudos. Não é necessário estar em jejum e nem interromper medicações utilizadas. Risco e Desconforto: A coleta do líquor será realizada nas costas (região lombar). A dor que acompanha a punção lombar é semelhante aquela da coleta de sangue. O desconforto será mínimo, pois será realizada com anestesia local por profissional treinado e devidamente habilitado para a realização de punção lombar. Após submeter-se a punção lombar, o paciente deverá permanecer em repouso em casa, por 24 horas, e aumentar a ingestão de líquidos. Este repouso é importante para evitar dor de cabeça após a punção. Se houver dor, mesmo com o repouso, o paciente deverá permanecer por mais alguns dias sem atividades e procurar avaliação médica. Este tipo de dor de cabeça habitualmente não traz qualquer prejuízo ao paciente, mas necessita de repouso para desaparecer. A coleta do líquor, por utilizar agulha, apresenta os riscos inerentes ao procedimento. São descritas, raramente, intercorrências da punção, como dormências transitórias, dor local e infecção. A incidência destas complicações, no entanto, é baixa . O material é descartável e as agulhas atuais (modelo 22Gx 3.5 = 70x7) são mais finas e associadas a menor risco de complicações. Caso ocorra qualquer desconforto após o procedimento, o paciente deverá contatar a equipe de atendimento do HC - UNICAMP e a equipe de pesquisa, que orientarão as medidas a serem tomadas para aliviar os sintomas, sem nenhum custo.
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Benefícios: Não existe benefício imediato para o paciente. Os resultados dessa pesquisa podem auxiliar na melhor compreensão de mecanismos de doença e métodos diagnósticos para EM. Esclarecimento: Todas as dúvidas e perguntas do paciente quanto aos assuntos relacionados com a pesquisa e o tratamento serão esclarecidas pelos pesquisadores. Recusa ou descontinuação da participação: Durante o decorrer do estudo informaremos ao paciente o andamento da pesquisa, podendo este deixar de participar da pesquisa a qualquer momento, sem prejuízo no atendimento que recebe pelo HC – UNICAMP. Sigilo: As informações recebidas durante e depois do estudo e a privacidade dos pacientes serão mantidas em sigilo. Os resultados serão sempre analisados em grupo, estatisticamente, não sendo possível identificar de forma individual qualquer paciente. Gastos adicionais: Se houverem gastos adicionais (seringas, agulhas descartáveis, material de curativo...) estes serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.