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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ANA MILDA KARSTEN BAUMGART
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DAS ESPÉCIES
VEGETAIS Cipura paludosa E Chenopodium ambrosioides
Itajaí
2014
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ANA MILDA KARSTEN BAUMGART
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DA ESPÉCIES
VEGETAIS Cipura paludosa E Chenopodium ambrosioides
Dissertação de Mestrado submetido ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz
Itajaí, Agosto de 2014
FICHA CATALOGRÁFICA
B327a
Baumgart, Ana Milda Karsten, 1983- Avaliação do potencial antimicrobiano das espécies vegetais cipura paludosa e chenopodium ambrosioides / Ana Milda Karsten Baumgart, 2014. 79f. ; il., tab. ; fig. Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador : Prof . Dr. Alexandre Bella Cruz” Bibliografia : p. 68-79 1. Atividade antimicrobiana. 2. Chenopodium ambrosioides. 3. Iridaceae (cipura paludosa). 4. Extratos vegetais. 5. Química farmacêutica. 6. Produtos naturais. 7. Farmacologia. I.Título. CDU: 615.32
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a todos que estiveram ao meu lado ao longo dessa caminhada,
especialmente a minha família, meus pais, meu noivo e minhas amigas,
pelo apoio, amor e compreensão
nos momentos de ausência.
AGRADECIMENTOS
A elaboração deste trabalho não teria sido possível sem a colaboração,
estímulo e empenho de diversas pessoas. Agradeço a todos que contribuíram direta
ou indiretamente para que eu alcançasse essa meta.
A Deus, que em todos os momentos me deu forças para continuar em frente.
Obrigada Senhor, por estar sempre ao meu lado.
Ao Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz, pelo apoio, orientação, paciência,
confiança e dedicação. Muito obrigada pela grande oportunidade de entrar no
mundo fascinante da pesquisa.
À Prof. Msc. Rosana Cé Bella Cruz pela amizade e auxílio nos ensaios.
À Prof. Dra. Angela Malheiros pela produção dos extratos, frações, óleo
essencial e hidrolatos da Chenopodium ambrosioides.
Ao Prof. Dr. Valdir Cechinel-Filho pelo isolamento das substâncias da Cipura
paludosa.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,
pela excelências das aulas e auxílio nas atividades práticas.
Aos meus queridos familiares, pelo carinho, compreensão nas minhas
ausências e torcida constante pelo meu sucesso.
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DAS ESPÉCIES VEGETAIS
Cipura paludosa E Chenopodiumambrosioides
Ana Milda Karsten Baumgart
Agosto/2014
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 89
As doenças infecciosas são hoje uma das principais causas de morte em todo mundo. Devido o aumento da resistência dos micro-organismos aos fármacos ou seus efeitos colaterais, é de grande importância a busca de novas fontes de antimicrobianos.Métodos modernos utilizados para o desenvolvimento de novas moléculas têm apresentado, de maneira geral, pouco êxito no desenvolvimento de novos fármacos. Em contrapartida, os produtos naturais são fontes de quantidade e diversidade de moléculas químicas ainda pouco exploradas para obtenção de novos compostos biologicamente ativos. Este estudo avaliou a atividade antimicrobiana de Chenopodiumambrosioides(três extratos brutos, três frações, três frações de hidrolatos e o óleo essencial das folhas) e duas substâncias (isoeleuterina e eleuterina)isoladas de Cipura paludosa. Para a avaliação da atividade antimicrobiana foram utilizados os métodos de diluição em ágar e caldo, ebioautografia, bem como,ensaio preliminar para verificação do modo de ação sobre a membrana celular. O óleo essencial da C. ambrosioides apresentou melhor atividade antimicrobiana em relação aos seus extratos e frações. A atividade foi verificada contra 9 dos 15 fungos analisados, destacando-se atividade moderada paraC. glabrata, C. krusei, A. nigercom CIM de 390,62 ppm, epara M. gypseumcom CIM de 195 ppm.Com relação às substâncias de C. paludosa (isoeleuterina e eleuterina) apresentaram promissora atividade inibitória frente às bactérias Gram-positivas S. aureus e B. subtilis (CIM de 31,25 ppm), e àbactéria Gram-negativa S. typhimurium (CIM de 62,5 ppm). Também apresentaram moderada atividade antifúngicacontra as espécies de Candida testadas. O melhor resultado entre as leveduras foi contraC. neoformans com CIM de 31,25 ppm. Entre os fungos filamentosos a isoeleuterina apresentou CIM de 15,62 ppmcontraA. niger. No ensaio de verificação do modo de ação,foi observadoque o óleo essencial atua na função da membrana celular. Conclui-se que a C. ambrosioidese as substâncias isoeleuterina e eleuterinaapresentaram importante atividade antibacteriana e antifúngica contra patógenos humanos. Palavras-chave: Atividade antimicrobiana. Cipura paludosa. Chenopodium ambrosioides.
EVALUATION OF ANTIMICROBIAL POTENTIAL OF THE PLANT SPECIES
Cipura paludosa AND Chenopodium ambrosioides
Ana Milda Karsten Baumgart
August 2014
Supervisor: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz
Area of concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances
Number of Pages: 89
Infectious diseases are a leading cause of death worldwide. Because of the increasing resistance of micro-organisms to the drugs or their side effects, it is very important to search for new sources of antimicrobials. Modern methods for the development of new molecules have shown, in general, little success in developing new drugs. In contrast, natural products are potential sources of biologically active compounds that have been little explored, in terms of their quantity and diversity of chemical molecules. This study evaluates the antimicrobial activity of Chenopodium ambrosioides (three crude extracts, three fractions, three fractions of hydrosols and essential oil from the leaves) and two substances (iso-eleutherine and eleutherine) isolated from Cipura paludosa. For the evaluation of antimicrobial activity, the agar dilution and broth were used, as well as bioautography, and a preliminary assay to determine the mode of action on the cell membrane assay. The essential oil of C. ambrosioides showed better antimicrobial activity in relation to their extracts and fractions. The activity was checked against 9 of the 15 analyzed fungi, with a finding of especially moderate activity for C. glabrata, C. krusei, A. niger with MIC of 390.62 ppm, and M. gypseum with MIC of 195 ppm. In terms of substances of C. paludosa (iso-eleutherine and eleutherine), they showed promising inhibitory activity against Gram-positive S. aureus and B. subtilis (MIC of 31.25 ppm) bacteria, and Gram-negative bacteria S. typhimurium (MIC 62.5 ppm). They also showed moderate antifungal activity against the Candida species tested. The best result for the yeast was against C. neoformans, with MIC of 31.25 ppm. Among the filamentous fungi, iso-eleutherine presented an MIC of 15.62 ppm against A. niger. In the test to determine the mode of action, it was observed that the essential oil acts on cell membrane function. We conclude that C. ambrosioides and the substances iso-eleutherinepresented significant antibacterial and antifungal activity against human pathogens. Keywords: Antimicrobial activity. Cipura paludosa. Chenopodium ambrosioides.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Crescimento de uma cultura de bactérias..........................................18
Figura 2 – Diferenças estruturais entre bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas................................................................................................................21
Figura 3 – Fotografia da flor de Cipura paludosa................................................28
Figura 4 – Fotografia das folhas de Chenopodium ambrosioides.......................31
Figura 5 – Esquema para obtenção das substâncias isoladas de Cipura
paludosa.................................................................................................................37
Figura 6 – Esquema de obtenção dos extratos brutos e frações de Chenopodium
ambrosioides..........................................................................................................38
Figura 7 – Esquema de obtenção do óleo essencial, e frações do hidrolato de
Chenopodium ambrosioides..................................................................................39
Figura 8 – Representação esquemática do teste de macrodiluição em tubo, após
a incubação e inoculação.......................................................................................43
Figura 9 – Bioautograma do óleo essencial, extratos, frações e hidrolatos da C.
ambrodioides frente a S. aureus............................................................................62
Figura 10 – Condutividade elétrica do Óleo essencial de C. ambrosioides frente a
S. aureus................................................................................................................64
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Concentração inibitória mínima dos extratos e óleo essencial de
Chenopodium ambrosioides frente às bactérias Gram-positivas .......................... 49
Tabela 2 – Concentração inibitória mínima dos extratos e óleo essencial de
Chenopodium ambrosioides frente às bactérias Gram-negativas ......................... 49
Tabela 3 – Concentração inibitória mínima dos extratos e óleo essencial de
Chenopodium ambrosioides frente a fungos leveduriformes ................................ 51
Tabela 4 – Concentração inibitória mínima dos extratos e óleo essencial de
Chenopodium ambrosioides frente a fungos filamentosos .................................... 52
Tabela 5 – Concentração inibitória mínima da Isoeleuterina e Eleuterina frente às
bactérias Gram-positivas ....................................................................................... 57
Tabela 6 – Concentração inibitória mínima da Isoeleuterina e Eleuterina frente às
bactérias Gram-negativas ..................................................................................... 57
Tabela 7 – Concentração inibitória mínima da Isoeleuterina e Eleuterina frente a
fungos leveduriformes ........................................................................................... 59
Tabela 8 – Concentração inibitória mínima da Isoeleuterina e Eleuterina frente a
fungos filamentosos .............................................................................................. 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS – Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida
ATCC – American Type Culture Collection
CBM – Concentração Bactericida Mínima
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CFM – Concentração Fungicida Mínima
CG/EM – Cromatografia Gasosa/Espectroscopia em Massa
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical Laboratory Standards Institute
DCM – Diclorometano
DMSO - Dimetilsulfóxido
EBC – Extrato Bruto do Caule
EBF – Extrato Bruto da Folha
EBF EtOH – Extrato Bruto Etanólico da Folha
EBR – Extrato Bruto da Raiz
EtOH – Extrato Etanólico
FDA – Food and Drug Administration
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
OE – Óleo Essencial
P. BUT EtOH - Partição Butanol do Extrato Etanólico
P.AE EtOH – Partição Acetato de Etila do Extrato Etanólico
P.AE H - Partição Acetato de Etila do Hidrolato
P.BUT H - Partição Butanol do Hidrolato
P.DCM EtOH – Partição Diclorometano do Extrato Etanólico
P.DCM H - Partição Diclorometano do Hidrolato
TTC – Cloreto 2,3,5 trifenil tetrazólio
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 12
2 OBJETIVOS ....................................... ......................................................... 14
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 14
2.2 Objetivos Específicos ................................................................................ 14
3 REVISÃO DA LITERATURA ........................... ............................................ 16
3.1 Doenças infecciosas .................................................................................. 16
3.2 Agentes antimicrobianos .......................................................................... 16
3.1 Resistência antimicrobiana ....................................................................... 19
3.4 Bactérias ..................................................................................................... 19
3.5 Fungos ........................................................................................................ 21
3.6 Plantas medicinais e atividade antimicrobiana ....................................... 24
3.7 Óleos Essenciais e atividade antimicrobiana .......................................... 25
3.8 Cipura paludosa ......................................................................................... 27
3.9 Chenopodium ambrodioides .................................................................... 30
3.10 Ensaios microbiológicos ........................................................................... 32
4 MATERIAL E MÉTODOS .............................. .............................................. 36
4.1 Equipamentos ............................................................................................ 36
4.2 Reagentes ................................................................................................... 36
4.3 Material Vegetal .......................................................................................... 37
4.3.1 Cipura paludosa ......................................................................................... 37
4.3.2 Chenopodium ambrosioides ..................................................................... 38
4.4 Micro-organismos ...................................................................................... 39
4.5 Preparação dos inóculos .......................................................................... 40
4.5.1 Bactérias ................................... .................................................................. 40
4.5.2 Fungos leveduriformes ...................... ....................................................... 41
4.5.3 Fungos filamentosos ........................ ......................................................... 41
4.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ........................ 42
4.6.1 Método de diluição em ágar (macrodiluição) .. ........................................ 42
4.6.2 Método de diluição em caldo (microdiluição).. ........................................ 43
4.7 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) e
Concentração Fungicida Mínima (CFM) .............................................................44
4.8 Bioautografia ..............................................................................................44
4.9 Avaliação do Mecanismo da função de membrana ce lular ....................45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................... .........................................48
5.1 Atividade antimicrobiana ...........................................................................48
5.1.1 Chenopodium ambrosioides .....................................................................48
5.1.2 Cipura paludosa .........................................................................................56
5.2 Bioautografia ..............................................................................................61
5.3 Avaliação do Mecanismo da função de membrana ce lular ....................63
6 CONCLUSÕES ............................................................................................66
REFERÊNCIAS ............................................................................................68
12
1 INTRODUÇÃO
Entre as dez principais causas de morte no mundo encontramos as doenças
infecciosas. Segundo dados estatísticos da Organização Mundial da Saúde de 2008,
as infecções pulmonares inferiores foram responsáveis por 6,1% das mortes, as
doenças diarréicas por 4,3%, o HIV por 3,1% e a tuberculose por 2,4% (WHO,
2011). Apesar do sucesso da descoberta dos antibióticos no passado, nas duas
últimas décadas houve um aumento significativo das infecções causadas por micro-
organismos. Segundo Butler (2005), as doenças infecciosas estão em segundo lugar
como causa de morte em todo mundo. Infecções bacterianas causam 17 milhões de
mortes globais, sendo as crianças e os idosos os mais atingidos.
O número de pacientes suscetíveis aos mais variados tipos de infecções
cresce com o passar do tempo. Com o sistema imune deficiente, aumenta a
suscetibilidade a infecções oportunistas, podendo decorrer principalmente do
tratamento de neoplasias, transplante de órgãos, síndrome da imunodeficiência
adquirida (AIDS), lupus eritematoso sistêmico (LES) e diabetes.
A terapia para infecções bacterianas e fúngicas representa um desafio para
pesquisadores e clínicos. A resistência a agentes antimicrobianos é grave e
preocupante, os fármacos disponíveis tornaram-se ineficazes frente à resistência
que os micro-organismos adquirem devido ao uso irracional e pouco seguro dos
medicamentos. São necessárias pesquisas para o desenvolvimento de novas
substâncias antimicrobianas e o desenvolvimento de novas abordagens para o
tratamento. O custo financeiro de uma terapia fracassada por conta de micro-
organismos resistentes é muito grande, geram novas consultas, novos exames para
o diagnóstico, novas prescrições e talvez uma provável internação hospitalar.
Tendo em vista que micro-organismos multirresistentes representam um
desafio no tratamento das infecções, é essencial a necessidade de encontrar novas
substâncias com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate a
esses micro-organismos. Uma das alternativas na busca de novos fármacos eficazes
na erradicação de processos infecciosos são os produtos naturais, principalmente os
de origem vegetal.
O interesse por plantas medicinais pode ser demonstrado através de uma
consulta ao PubMed selecionando publicações com informações sobre plantas
13
medicinais com ação antimicrobiana. A pesquisa foi realizada utilizando-se como
unitermos “plant” e “antimicrobial”, “plant” e “antibacterial” e, por último, não menos
importante, “plant” e “antifungal”. Foram listados 49.058 artigos para o unitermo
“plant” e “antimicrobial”, 13.308 para “plant” e “antibacterial” e 10.864 para “plant” e
“antifungal”.
As plantas medicinais são importantes fontes de substâncias capazes de inibir
o crescimento de bactérias e fungos, com seus extratos ou substâncias isoladas,
produzem ilimitadas oportunidades para novos fármacos devido a diversas
combinações químicas. A pesquisa por novos agentes antimicrobianos se faz
necessária devido ao surgimento de micro-organismos resistentes e de infecções
oportunistas fatais. Tais pesquisas podem contribuir significativamente na
descoberta de novos agentes.
Muitas plantas medicinais dos biomas brasileiros, tais como o cerrado, a
floresta amazônica e a mata atlântica têm sido utilizadas pelas populações locais no
tratamento de várias doenças tropicais, incluindo esquistosomose, leishmaniose,
malária e infecções fúngicas e bacterianas (ALVES et al., 2000).
Algumas espécies do gênero Chenopodium possuem aplicações tradicionais,
e algumas merecem maior atenção como a espécie Chenopodium ambrosioides.
Estudos preliminares realizados por Chekem et al. (2010) com o óleo essencial de
C. ambrosioides demonstraram atividade antifúngica contra fungos oportunistas, já
os estudos de Jardim et al. (2008) e Prasad et al. (2009) também com o óleo
essencial apresentaram atividade antifúngica contra fungos filamentosos e
dermatófitos respectivamente.
Há plantas que ainda não são encontrados estudos antimicrobianos como,
por exemplo a espécie Cipura paludosa. Lucena (2010) ao analisar a composição
química de C. paludosa demonstrou a presença de metabólitos secundários como
terpenos, esteroides, alcaloides, quinonas e compostos fenólicos, também foram
identificadas algumas naftoquinonas e naftopiranos nos bulbos de C. paludosa. É
conhecido que as naftoquinonas apresentam atividades antimicrobianas (ANDÚJAR
et al., 2013).
Diante do exposto e devido à escassez de estudos antimicrobianos das
espécies C. ambrosioides e C. paludosa é de interesse o estudo destas espécies e
seus compostos bioativos, visando sua utilização como fonte de recursos
terapêuticos.
14
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar a atividade antimicrobiana das substâncias isoladas do extrato bruto
de Cipura paludosa e extratos brutos, frações, óleo essencial e hidrolatos de
Chenopodium ambrosioides.
2.2 Objetivos Específicos:
Determinar a Concentração Inibitória Mínima das substâncias isoladas do
extrato bruto de Cipura paludosa e extratos brutos, frações, óleo essencial e
hidrolatos de Chenopodium ambrosioides, frente a bactérias Gram positivas e Gram
negativas.
Determinar a Concentração Inibitória Mínima das substâncias isoladas do
extrato bruto de Cipura paludosa e extratos brutos, frações, óleo essencial e
hidrolatos de Chenopodium ambrosioides, frente a fungos leveduriformes e
filamentosos.
Demonstrar atividade antimicrobiana dos extratos, frações, óleo essencial e
hidrolatos da Chenopodium ambrosioides através da bioautografia.
Avaliar o modo de ação em membrana celular dos extratos, frações, óleo
essencial, hidrolato ou substância isolada que apresentar atividade antibacteriana.
15
16
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Doenças infecciosas
A infecção é uma doença que envolve a presença de micro-organismos
(bactérias, fungos, vírus e protozoários) em um hospedeiro vivo. Uma infecção está
presente quando micro-organismos invasores estimulam uma resposta no
hospedeiro. Inicialmente ocorre a penetração do agente infeccioso no corpo do
hospedeiro seguido de sua multiplicação, com consequente apresentação de sinais
e sintomas. Um micro-organismo capaz de causar infecção é dito patogênico, e o
grau ou extensão da lesão que pode causar a um hospedeiro infectado, é dito
virulência (WINN et al., 2008).
As doenças infecciosas constituem um grande problema de saúde pública e
contribui substancialmente para a morbidade e mortalidade em todo mundo. Então,
a sociedade investe na investigação de doenças infecciosas, a fim de alcançar o
progresso científico e desenvolver novas opções terapêuticas (BLIZIOTIS et al.,
2005).
O aumento no número de infecções fúngicas e bacterianas se deve a vários
fatores como, por exemplo, a resistência dos micro-organismos aos fármacos, o
aparecimento de doenças como a AIDS, doença aguda do sistema respiratório e
doenças autoimunes, pacientes imunocomprometidos, tais como, pacientes com
câncer e transplantados, além disso, idosos e crianças são alvos para infecções
nosocomiais. Para agravar a situação, tratamentos prolongados com antifúngicos
e/ou antibacterianos, hemodiálise e procedimentos invasivos são fatores intrínsecos
para o surgimento de resistência dos micro-organismos (BUTLER, 2005).
3.2 Agentes antimicrobianos
Os fármacos conhecidos hoje e usados no tratamento de doenças infecciosas
são agentes antibióticos, análogos dos antibióticos ou quimioterápicos. O termo
antibiótico, derivado de antibioses, que são substâncias anti-infecciosas, de origem
natural, são produzidas metabolicamente por micro-organismos, enquanto que os
17
agentes “análogos dos antibióticos” são produzidos por vegetais ou animais e os
quimioterápicos são substâncias antimicrobianas sintéticas (SOUZA et al., 2003).
As substâncias antibióticas ou antimicrobianas representam talvez o maior
avanço da farmacoterapia nas últimas décadas, com progressos sem limites dentro
da terapêutica medicamentosa (LIMA, 2001), entretanto seu uso abusivo e
equivocado no âmbito hospitalar e ambulatorial é considerado o principal fator
associado ao surgimento de micro-organismos resistentes (BELLA CRUZ et al.,
2010).
Para obter sucesso no tratamento das doenças infecciosas, deve-se fazer a
opção pelo uso de antimicrobianos, e considerar aquele que for mais adequado para
eliminação ou controle do agente infeccioso. Para o combate das infecções,
especialmente frente aos micro-organismos resistentes, deve-se fazer o uso de
novas tecnologias para o desenvolvimento de antimicrobianos mais eficazes que
possibilitem a prospecção de novas classes de moléculas capazes de neutralizar o
patógeno, inibindo o desenvolvimento da resistência (BELLA CRUZ et al., 2010).
Muitas variáveis influenciam o tratamento de uma determinada infecção, por
exemplo, concentração do agente antimicrobiano, suas propriedades
farmacológicas, a patologia da lesão e seu ambiente bioquímico, bem como, o
comportamento metabólico do micro-organismo (SOUZA et al., 2003).
Quando os micro-organismos se encontram em um ambiente propício,
crescem e eventualmente se duplicam. O tempo que uma bactéria leva para dividir-
se é chamado tempo de geração ou tempo de duplicação. O crescimento continua
até que a população atinja determinada densidade celular e ocorra a exaustão dos
nutrientes do meio ou o acúmulo de metabólitos tóxicos. Até que isso aconteça, as
bactérias crescem livremente, essa condição é chamada de crescimento equilibrado,
pois todos os componentes da célula aumentarão proporcionalmente por um certo
período de tempo (SCHAECHTER et al., 2002).
Como podemos observar na figura 1, o crescimento microbiano é
frequentemente acompanhado com base na curva que representa o crescimento de
uma população de um determinado micro-organismo. A Fase inicial é chamada de
fase lag ou latência, onde as bactérias de um inóculo, algumas vezes, retomam
lentamente o crescimento. Depois disso entram em fase exponencial de
crescimento; quando ocorre a exaustão dos alimentos ou o acúmulo de material
tóxico, entram em fase estacionária; algumas vezes, durante a fase estacionária, as
18
culturas bacterianas perdem a viabilidade, verificada pela contagem de bactérias
viáveis, em geral sem perder a integridade celular (SCHAECHTER et al., 2002).
Figura 1 – Curva de crescimento típica de uma população bacteriana.
Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004.
As propriedades antimicrobianas dos extratos e substâncias são geralmente
estudadas através de ensaios in vitro, por exemplo o ensaio de susceptibilidade
(BELLA CRUZ et al., 2010). Com base em testes in vitro, os agentes antimicrobianos
são classificados em bactericidas ou bacteriostáticos, para bactérias, e fungicidas ou
fungiostáticos, para fungos (BARROS et al., 2008). Os agentes bactericidas e
fungicidas matam os micro-organismos e são mais eficazes durante a fase de
crescimento logarítmico, uma vez que o aumento da atividade metabólica
proporciona susceptibilidade máxima. Os agentes antimicrobianos bacteriostáticos e
fungiostáticos apenas inibem o crescimento microbiano (SOUZA et al., 2003).
O fármaco ideal para a cura de infecções antifúngicas ainda não foi
descoberto. Os fármacos utilizados nas infecções fúngicas podem ser tóxicos não
apenas para a célula fúngica, mas também para a célula do hospedeiro. Essa ação
tóxica é devido a semelhança entre a célula fúngica e a célula humana. Numerosos
agentes que inibem processos vitais da célula fúngica são conhecidos, mas devido a
sua toxicidade para o homem não podem ser empregados como medicamento
(POLAK, 1999).
19
3.3 Resistência antimicrobiana
O avanço da medicina nas diferentes áreas clínicas e cirúrgicas tem sido
acompanhado por um desenvolvimento tecnológico impressionante nos últimos
anos, o que tem contribuído para o favorecimento da longevidade dos pacientes em
muitos casos. As unidades de terapia intensiva se multiplicaram e sofisticaram,
recebendo e tratando pacientes em situações cada vez mais críticas. Um dos
grandes desafios tem sido o manejo adequado das intercorrências infecciosas
bacterianas e fúngicas que frequentemente acometem esses pacientes (ROSSI;
ANDREAZZI, 2005).
Um grave problema em relação às infecções bacterianas é o aparecimento de
cepas resistentes, nos quais a terapêutica torna-se bastante difícil. Isto ocorre
principalmente devido ao uso abusivo e irracional dos antimicrobianos disponíveis,
promovendo a seleção de cepas resistentes e que se sobressaem diante da
população bacteriana (HEMAISWARYA; KRUTHIVENTI; DOBLE, 2008).
Também tem sido observado aumento na incidência de infeções fúngicas nas
últimas décadas, assim como um aumento da resistência de diferentes funcigidas
usados na prática médica. Os fungos são os patógenos mais negligenciados. A
anfotericina B, por exemplo, foi descoberta em 1956 e ainda é utilizada como padrão
ouro para terapia antifúngica (ABAD; ANSUATEGUI; BERMEJO, 2007).
O uso indiscriminado de medicamentos antimicrobianos químicos sintéticos
pela população tem levado a um grande índice de micro-organismos que se
tornaram resistentes a esses compostos, intensificando-se assim, pesquisas de
novas substâncias de origem natural úteis para combater infecções (FRANCO et al.,
2005; HEMAISWARYA; KRUTHIVENTI; DOBLE, 2008).
3.4 Bactérias
As bactérias são organismos procariontes, não possuem núcleo típico, seu
material genético não está protegido por uma membrana, encontra-se em
cromossomos circulares, chamados de nucleóides. Não apresentam organelas
citoplasmáticas especializadas, sendo que algumas estruturas protéicas atuam na
adesão as células hospedeiras (fimbrias) ou são responsáveis pela locomoção
(flagelos). Estão envoltas pela parede celular, extremamente rígida, conferindo
20
morfologia caracerística à célula bacteriana e protegendo-a contra agentes externos
(MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2010).
A coloração de Gram é uma maneira simples de classificar as bactérias,
utiliza princípios morfo-tintoriais da parede celular e através dela podemos classificar
as bactérias em dois grandes grupos, Gram-positivas e Gram-negativas (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2008).
As bactérias Gram-positivas tem uma parede celular espessa em múltiplas
camadas, constituída principlamente de peptidoglicano envolvendo a membrana
citoplasmática (MIMS et al., 1999). O peptidoglicano é essencial para a estrutura,
duplicação e sobrevivência em condições normalmente hostis nas quais as bactérias
crescem. Podem conter ácido teicóico, lipoteicóico e polissacarídeo C. O ácido
teicóico é essencial para a viabilidade celular. Ele está covalentemente ligado ao
peptidoglicano; o ácido lipoteicóico contêm um ácido graxo e está ancorado na
membrana citoplasmática, juntos eles promovem a ligação a outras bactérias e a
receptores específicos em superfícies de células mamíferas (adesão), sendo
também importantes fatores de virulência (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,
2010).
Nas bactérias Gram-negativas a camada de peptidoglicano é delgada e
superposta por uma membrana externa, ancorada a moléculas de
lipopolissacarídeos e lipoproteínas no peptidoglicano (MIMS et al., 1999). São mais
complexas do que as Gram-positivas, tanto estruturalmente quanto quimicamente.
A parede celular da Gram-negativa contêm duas camadas externas à membrana
citoplasmática e não há ácidos teicóico ou lipoteicóico (MURRAY; ROSENTHAL;
PFALLER, 2010).
Na figura 2 podemos observar as diferenças citadas acima em relação as
bactérias Gram-negativas e Gram-positivas.
21
Figura 2 – Diferenças estruturais entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Fonte: MIMS et al., 2005.
As bactérias também podem ser classificadas em patógenos, patógenos
oportunistas e não-patógenos. As bactérias patogênicas caracterizam-se por sua
capacidade de transmissão, aderência e invasão de células e tecidos do hospedeiro,
toxigenicidade e capacidade de escapar do sistema imunológico do hospedeiro
(JAWETZ; MELNICK; ADELBERG, 2005).
Algumas espécies bacterianas são sempre consideradas patogênicas, sendo
sua presença anormal. Outras espécies fazem parte comumente da microbiota dos
seres humanos, mas também podem causar doenças. Por exemplo, a Escherichia
coli pertence à microbiota intestinal dos seres humanos normais, mas também
representa uma causa comum de infecções do trato urinário, diarréia dos viajantes e
outras doenças. Outras bactérias provocam doenças em indivíduos
imunodeprimidos ou debilitados, constituindo patógenos oportunistas (JAWETZ;
MELNICK; ADELBERG, 2005).
3.5 Fungos
Em contraste com as bactérias, a estrutura celular dos fungos é mais
complexa. Tratam-se de seres aclorofilados, sem capacidade de produzir energia ou
22
material plástico por meio da energia da luz e do gás carbônico (CO2), são
desprovidos da capacidade da fotossíntese, pois não possuem cloroplasto. São
seres heterotróficos quimiotróficos, dependendo de substâncias orgânicas
previamente formadas. São eucariotas, podendo ser haplóides, diplóides ou
poliplóides; têm parede rígida quitinosa constituída de polímeros de amino-açúcares,
sem reserva de amido, em alguns casos com presença de glicogênio (MINANI,
2003). Sua estrutura celular possui parede celular, mitocôndrias, aparelho de Golgi,
ribossomos ligados ao retículo endoplasmático, e um citoesqueleto constituído por
microtúbulos, microfilamentos e filamentos intermediários (SCHAECHTER et al.,
2002). Alimentam-se por absorção, pois não são capazes de ingerir ou fagocitar
alimentos. Reproduzem e multiplicam de forma vegetativa, assexual, sexual ou
parassexual. A dispersão é feita por meio de esporos e formas vegetativas (MINANI,
2003). Essa descrição demonstra que os fungos são tão semelhantes às células
hospedeiras que dificulta a elaboração de estratégias terapêuticas específicas,
dirigida contra o agente infeccioso, e ao mesmo tempo atóxicas para o hospedeiro
(SCHAECHTER et al., 2002).
Os fungos são organismos ubíquos, ou seja, apresentam ampla distribuição
geográfica, sendo encontrados no solo, ar, água, alimentos, material orgânico em
decomposição, plantas, animais e homem. Quanto à sua capacidade de produzir
doença, os fungos são classificados em patógenos primários e patógenos
oportunistas (ZAITZ; RUIZ; SOUZA, 2004).
Os fungos podem ser divididos estruturalmente em leveduras e filamentosos.
As leveduras são seres unicelulares, que apresentam formato esférico ou oval e se
reproduzem por divisão binária ou brotamento. Já os fungos filamentosos
apresentam várias células em disposição contínua na forma tubular. O
desenvolvimento desses fungos ocorre a partir de estruturas de frutificação que dão
origem ao túbulo germinativo, formando as hifas (TORTORA; FUNKE; CASE, 2002).
Os fungos patogênicos que colonizam os humanos e causam doenças
possuem características que permitem a sua classificação em grupos de acordo com
os tecidos primários que colonizam: agentes fúngicos que causam infecções
superficiais, cutâneas, subcutâneas e sistêmicas. Os fungos que causam infecções
superficiais colonizam as camadas queratinizadas da pele, dos pêlos e das unhas,
induzem pouca ou nenhuma resposta imune ao hospedeiro, em geral, são de
interesse estético e fáceis de diagnosticar. Os fungos capazes de produzir lesões
23
subcutâneas são introduzidos de maneira traumática através da pele e têm
tendência a envolver as camadas mais profundas da derme, tecido subcutâneo e
osso. Podem causar lesões superficiais, mas dificilmente se disseminam para
órgãos distantes e apresentam um baixo grau de infectividade. As infecções
sistêmicas afetam as vias respiratórias, e os agentes apresentam características
morfológicas peculiares, que contribuem para sua capacidade de sobreviver no
hospedeiro (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2010).
Entre as infecções fúngicas mais comuns, encontramos as micoses cutâneas
sendo principalmente causadas por dermatófitos, que utilizam a queratina como
nutriente durante a infecção de pele, cabelos e unhas, e estão classificados em três
gêneros: Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton (WHITE et al., 2008).
A transmissão das dermatofitoses ou tinhas, ocorre pelo contato direto com
animais e humanos infectados ou indireto por fômites contaminados, e as formas
clínicas variam de acordo com o agente etiológico (espécie) e o sítio anatômico
acometido (DEGREEF, 2008).
Embora as infecções causadas por dermatófitos sejam geralmente restritas as
regiões superficiais da epiderme, esses fungos podem comportar-se de maneira
invasiva, ocasionando infecção profunda e disseminada em pacientes
imunocomprometidos, até mesmo com surgimento de granulomas dermatofíticos
(RODWELL et al., 2008).
Diversos fungos, presentes no meio ambiente ou integrantes da flora normal,
podem em determinadas situações passarem de saprófitos a patogênicos,
provocando quadros clínicos variáveis, desde processos febris benignos, a
septicemias algumas vezes fatais (LACAZ et al., 2002).
Dentre as principais patologias fúngicas oportunísticas podemos citar a
candidíase, aspergilose, criptococose e fusariose. Candidíase ou candidoses são
infecções provocadas por leveduras de gênero Candida, principalmente Candida
albicans. A maior parte dessas infecções são de origem endógena, ou seja, são
causadas por micro-organismos que fazem parte da microbiota normal do ser
humano. A transmissão exógena ocorre principalmente em pacientes debilitados
pelo tratamento com antibióticos e drogas imunossupressoras, e no decurso de
doenças crônicas (LACAZ et al., 1998; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008; FISHER;
COOK, 2001).
24
3.6 Plantas medicinais e atividade antimicrobiana
Os povos antigos tinham uma ampla coleção de produtos naturais que
usavam com objetivos medicinais. Esses produtos, obtidos a partir de fontes
vegetais, às vezes eram muito eficazes, possuíam uma qualidade consistente e
alguns destes compostos isolados provaram ser satisfatórios como agentes
terapêuticos. Por exemplo, o Timol, princípio ativo isolado da Thymus vulgaris L.,
mais popularmente conhecido como Tomilho, utilizado como antimicrobiano (SILVA,
2002; THOMAS, 2003).
A partir de 1950 foram isolados os primeiros compostos de espécies vegetais
com atividade antimicrobiana: o diterpeno biflorinina, e o triterpeno maitenina
(ZACCHINO, 2001). Outros metabólitos secundários com ação antimicrobiana foram
isolados, como a mirecetina, kaempferol, quercetina (XU; LEE, 2001).
Apesar das plantas medicinais serem utilizadas pela medicina popular desde
os tempos mais remotos, suas potencialidades encontram-se longe de estar
esgotadas, afirmação endossada pelos novos paradigmas de desenvolvimento
social e econômico, baseados nos recursos renováveis. Novos conhecimentos e
novas necessidades certamente encontrarão, no reino vegetal, soluções, por meio
da descoberta e do desenvolvimento de novas moléculas com atividade terapêutica
ou com aplicações tanto na tecnologia farmacêutica quanto no desenvolvimento de
fitoterápicos com maior eficácia (SCHENKEL; GOSMANN; PETROVICK, 2010).
O mecanismo de interação das plantas e de seus fitopatógenos envolve um
sistema de ataque e defesa, essa interação faz com que seja ativada na planta-
hospedeira a produção de metabólitos especializados, como as fitoalexinas, estas
são produtos naturais, ausentes na planta sadia, podem apresentar atividade
inibidora sobre bactérias, fungos, nematóides, efeito tóxico para animais e para as
próprias plantas (LEITE, 2009).
É reconhecida a importância dos produtos naturais, incluindo aqueles
derivados de plantas, no desenvolvimento de modernos fármacos terapêuticos
(CALIXTO, 1997). Além disso, o interesse populacional pelas terapias naturais tem
aumentado significativamente nos países industrializados e acha-se em expansão o
uso de plantas medicinais e fitoterápicos (WHO, 2003). Segundo dados da
Organização Mundial da Saúde (OMS) 80% da população dos países em
desenvolvimento utiliza práticas tradicionais na atenção primária, e desse total, 85%
25
usa plantas medicinais ou preparações destas (apud MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2001).
Até 2006 havia 98 antibacterianos no mercado empregados na clínica para o
tratamento de infecções. Destes, 10 são provenientes de produtos naturais, 64 são
derivados de produtos naturais com algumas modificações, 23 são totalmente
sintéticos e 1 foi sintetizado a partir de produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2007).
De 2006 a 2010 foram aprovados 6 novos antibacterianos, sendo 3 derivados de
produtos naturais com modificações e 3 totalmente sintéticos (NEWMAN; CRAGG,
2012). Em relação aos antifúngicos em 2006 havia 29 fármacos, 1 de origem
biológica, 3 derivados de produtos naturais com modificações, 22 totalmente
sintéticos e 3 foram sintetizados a partir de produtos naturais (NEWMAN; CRAGG,
2007). Entre 2006 e 2010 apenas um antifúngico foi aprovado, um derivado da
equinocandina (NEWMAN; CRAGG, 2012).
Com relação aos antifúngicos, pesquisam-se fármacos com alvos específicos,
para diminuir a toxicidade, já que as células fúngicas e humanas são semelhantes e
compartilham de muitas vias metabólicas intermediárias, onde há enzimas similares.
As pesquisas, em relação aos antifúngicos, buscam inibidores da biossíntese do
ergosterol, inibição das topoisomerases ou ainda da parede celular fúngica
(ZACCHINO, 2001).
A tradicional antibioticoterapia está caminhando para uma crise de ineficácia,
devido à resistência dos micro-organismos aos agentes antimicrobianos, o que
aumenta consideravelmente a procura por novas e eficazes substâncias com esta
atividade. A investigação química de extratos de plantas e produtos naturais para
atividade antimicrobiana tem demonstrado que plantas superiores representam uma
potencial fonte de novos agentes antinfecciosos (HEEMANN et al., 2006).
3.7 Óleos Essenciais e atividade antimicrobiana
Óleos essenciais de plantas há muito tempo têm servido de base para
diversas aplicações na medicina popular, tal realidade serviu de base para diversas
investigações científicas, com vista na confirmação da atividade antimicrobiana dos
óleos essenciais. Isto mostra claramente que estes metabólitos secundários têm
potencial na área médica, na aplicação em cosméticos, alimentos e na indústria
26
farmacêutica (DORMAN; DEANS, 2000; ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al.,
2006; NUNES et al., 2006; BENKEBLIA, 2004).
Para tanto, tem se desenvolvido métodos de investigação in vitro que
produzam resultados confiáveis e possam ser reproduzidos e validados. Há dois
ensaios utilizados para avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais, o
método de difusão em ágar e a diluição em ágar (KALEMBA; KUNICKA, 2003).
A atividade antimicrobiana vem sendo estudada nas últimas décadas por
muitos pesquisadores. A maior parte destes trabalhos é realizada com os óleos
essenciais sem fracionamento e em muitos casos sem a identificação dos
componentes químicos. Em outros casos, a ação é atribuída a algum dos
componentes do óleo, baseada em estudos realizados com substâncias isoladas. O
mecanismo de ação dos óleos essenciais é complexo e ainda não foi totalmente
explicado (KNOBLOCH et al., 1989; YUNES; CECCHINEL-FILHO, 2007). Mas sabe-
se que é importante para a ação antimicrobiana dos constituintes dos óleos
essenciais o caráter lipofílico de seu esqueleto hidrocarboneto e do caráter
hidrofílico dos seus grupos funcionais (KALEMBA; KUNICKA, 2003).
O modo de ação dos agentes antimicrobianos depende do tipo de micro-
organismos que está relacionado, principalmente a estrutura da sua parede celular e
o arranjo da sua membrana externa. As bactérias Gram-negativas (P. aeruginosa)
exibem uma resistência intrínseca a uma grande variedade de óleo essencial, isto
está relacionado com a superfície hidrofílica da sua membrana externa, rica em
moléculas de lipopolissacarídeo. Forma uma barreira contra agentes tóxicos,
pequenas moléculas hidrofílicas não são impedidas de passar através da membrana
externa devido a presença abundante da ação de proteínas do tipo porina. No
entanto, macromoléculas hidrofóbicas, como os óleos essenciais, são constituintes
incapazes de penetrar a barreira (KALEMBA; KUNICKA, 2003).
A ação dos óleos essenciais contra bactérias Gram-positivas e fungos parece
ser similar. Os constituintes dos óleos destroem a parede celular das bactérias e
fungos e a membrana citoplasmática, interrompendo a força motriz de prótons, o
fluxo de elétrons, o transporte ativo e a coagulação do conteúdo das células
(KALEMBA; KUNICKA, 2003; BURT, 2004).
Considerando a variabilidade de constituintes químicos presentes nos óleos
essenciais, é provável que sua atividade antimicrobiana não é atribuível a um
mecanismo específico, mas há vários alvos na célula. Há evidências que os
27
constituintes minoritários têm papel crucial no desempenho da atividade
antimicrobiana, possivelmente pela produção de sinergismo entre os outros
componentes (BURT, 2004).
Alguns componentes dos óleos essenciais de natureza fenólica, por exemplo,
o carvacrol e o timol, podem causar uma interrupção no exterior da camada de
lipopolissacarídeo seguida de desintegração parcial da membrana externa
(HELANDER et al., 1998). O Timol possui estrutura similar ao carvacrol, eles diferem
pela localidade do grupo hidroxila sobre o anel fenólico, as duas substâncias
parecem tornar a membrana permeável (LAMBERT et al., 2001). Ambas as
estruturas desintegram a membrana externa de bactérias Gram-negativas liberando
os lipopolissacarideos (LPS), aumentando a permeabilidade da membrana
citoplasmática ao ATP. Precursor do carvacrol, o p-cimeno é hidrofóbico e provoca
maior inchaço da membrana citoplasmática do que o carvacrol (ULTEE; BENNIK;
MOEZELAAR, 2002). O cinamaldeído é conhecido por ter ação inibitória sobre E.
coli e Salmonella typhimurium em concentrações parecidas com as do carvacrol e
timol, mas não desintegra a membrana externa e nem inibe o ATP (Adenosina
Trifosfato) intracelular (HELANDER et al., 1998).
3.8 Cipura paludosa
Entre as espécies mais comuns da família Iridaceae está a Cipura paludosa,
uma pequena erva de flores azul-celeste, que ocorre em áreas mais abertas e
alagáveis de cerrado e também em pastos e terrenos baldios (SOUZA; LORENZI,
2005). É uma espécie herbácea conhecida popularmente como “alho do mato”, “alho
da campina”, “alho do campo”, “cebolinha do campo”, “coqueirinho”, “coquinho” e
“vareta” (CORRÊA; PENNA, 1926-1978).
O gênero Cipura estende-se do sul do Paraguai e parte meridional do Brasil
até a parte central do México e Cuba, fazendo parte de uma das riquezas da floresta
Amazônica (GOLDBLATT; HENRICH, 1987). No Brasil encontramos nos estados do
Rio de Janeiro, Minas Gerais, Goiás e Mato Grosso (CORRÊA; PENNA, 1926-1978).
O gênero possui nove espécies, mas a C. paludosa é a espécie mais amplamente
distribuída, enquanto as outras são de localização restrita (GOLDBLATT; HENRICH,
1987).
28
Dias (2010) descreveu a C. paludosa como uma erva ereta, com 10 a 32 cm
de altura; com o bulbo medindo 1,0-2,0 x 0,7-1,7cm. Possui uma a quatro folhas por
planta, medindo 5,0-32,0 x 0,2-2,0 cm, sendo licadas, ensiformes, glabras, com
tricomas nas margens e (em algumas) nervuras. Há uma inflorescência por planta, a
bráctea tectriz mede 7,0-21,0 x 0,3-0,6 cm, é lanceolada, com escapo floral de 2,0-
13,0 x 0,1 cm. Cada planta apresenta um a quatro ripídios e cinco a nove brácteas,
que medem 1,0-4,5 x 0,4-1,0 cm e as mais externas são estéreis. As flores são
lilases ou azuis, com tépalas (folha floral não diferenciada em pétala ou sépala)
externas de 1,0-2,5 x 0,4-1,0 cm, são obovais ou lineares, com base aguda, ápice
arredondado, patentes ou eretas, tépalas internas de 0,8-1,0 x 0,4-0,6 cm, sendo
eretas, revolutas, com mancha branca no terço inferior e uma listra vertical amarela
na região mediana e superior, composta por nectários, podendo ou não apresentar
estrias roxas na margem dessa listra, estames adpressos aos estiletes, filetes de 0,3
cm de comprimento filiforme, anteras brancas com 0,3 cm oblongas, estiletes com
0,7 cm de comprimento, unidos, com três estigmas, cada um com um lobo e um
lacínio. O ovário mede 0,8-1,0 x 0,1-0,2 cm, com vários óvulos por lóculo, pedicelo
com 0,8 cm de comprimento. As cápsulas elípticas medem 2,0-2,5 x 0,8 cm, as
sementes possuem 0,13 x 0,1 cm. A flor da C. paludosa pode ser observada na
figura 3.
Figura 3 – Foto da flor de Cipura paludosa.
Fonte: MERCADANTE, M. Cipura paludosa, 2009.
29
Usada na medicina tradicional na forma de chá para tratar diversas desordens
como infecções, inflamações, processos dolorosos, no combate às doenças renais e
diarréia (LUCENA, 2010).
Estudos realizados sobre a C. paludosa demonstraram a presença de
metabólitos secundários como terpenos, esteroides, alcaloides, quinonas e
compostos fenólicos. Algumas naftoquinonas e naftopiranos têm sido identificados
nos bulbos da C. paludosa que podem ser responsáveis em parte por suas
propriedades antinociceptivas e antiinflamatórias (LUCENA, 2010). Quatro
naftoquinonas foram isolados dos bulbos dessa planta e são conhecidos como
eleuterina, isoeleuterina, hongkonin e 11-hidroxi-eleuterina (TESSELE et al., 2011).
As naftoquinonas são derivadas das quinonas e de particular interesse em
virtude de sua ampla ocorrência em produtos naturais e como produtos químicos do
ambiente (FERREIRA et al., 2010). As naftoquinonas são bem conhecidas por
apresentar atividades antibacterianas, antifúngicas e antitumoral, e tem sido
amplamente testada em vários estudos farmacológicos. Entre as várias quinonas
com atividades farmacológicos, as do grupo lapachol são compostos privilegiados,
com diversas atividades. Foram atribuídas ao lapachol e seus derivados semi-
sintéticos, atividades biológicas tais como: atividade cercaricida (prevenção da
penetração de cercarias Schistosoma mansoni na pele); ação moluscida (atividade
contra caramujos Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário do Schistosoma
mansoni); leishmanicida (ação intracelular nas formas amastigotas de Leishmania
braziliensis); tripanossomicida (atividade contra Trypanosoma cruzi, agente
causador da doença de Chagas em sua fase tripomastigota); antimalárico (atividade
contra eritrócitos parasitados por Plasmodium falciparum); uso contra enteroviroses;
antiinflamatória e antiulcerantes (DA SILVA; FERREIRA; DE SOUZA, 2003;
GAFNER et al., 1996; KUMAGAI et al., 2011).
Estudos científicos sobre as propriedades farmacológicas de C. paludosa são
escassos. Um grupo de pesquisa demonstrou efeitos centrais do extrato etanólico da
C. paludosa com significativa atividade antinociceptiva e antiinflamatória quando
analisada em diferentes modelos de nocicepção química, térmica e mecânica em
camundongos e ratos (LUCENA et al., 2007a). Posteriormente foi verificado in vivo,
a ação neuroprotetora do extrato etanólico dos bulbos da planta contra a toxicidade
induzida pelo metilmercúrio em camundongos, o tratamento com o extrato etanólico
30
da C. paludosa também aumentou os níveis de glutationa redutase nos cerebelos
desses animais (LUCENA et al., 2007b).
3.9 Chenopodium ambrosioides
Pertence a família Chenopodiaceae que tem como sinonímia Amarantaceae.
O gênero Chenopodium L. compreende cerca de 100 espécies, a maioria destas são
cosmopolitas e estão distribuídas principalmente nas regiões subtropicais e
temperadas (KOKANOVA-NEDIALKOVA et al., 2011).
A Chenopodium ambrosioides é conhecida popularmente como “erva de
Santa Maria”, “mastruço”, “ambrosina”, “mastruz”, “erva-de-bicho”, “mentruz” ou
“erva-do-formigueiro”, sendo muito empregada na medicina popular na região
centro-oeste, sul e sudeste do Brasil (LORENZI; MATOS, 2002).
A Relação Nacional de Plantas Medicinais de interesse ao SUS (RENISUS),
implementado pelo governo brasileiro, seleciona essa erva como uma das 71
espécies ou gêneros, tradicionalmente utilizados no Brasil e recomendáveis para
possível uso como fitoterápicos ou medicamentos populares a serem prescritos pelo
Sistema Único de Saúde (SUS), para medicina humana (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2009). É encontrada na Farmacopeia Brasileira 1ª e 2ª edição com percentual de
ascaridol que varia de 60 a 80% (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1926, 1959). A
concentração de ascaridol (42,77%) encontrada no óleo essencial do presente
estudo é inferior ao informado na Farmacopeia, essa concentração pode variar de
acordo com fatores climáticos e geográficos que alteram a produção dos compostos
ativos nas plantas (GOBBO-NETTO; LOPES, 2007).
É uma planta originária da América Central e do Sul e espontânea no sul e
sudeste do Brasil. Ocorre em todos os países temperados e tropicais de forma
silvestre ou cultivados e é considerada uma planta invasora (LORENZI; MATOS,
2002)
Lorenzi e Matos (2002) descreveram a C. ambrosioides como uma planta
perene ou anual, muito ramificada, podendo atingir até um metro de altura. Possui
folhas simples, alternadas, pecioladas, de tamanho diferente, sendo menores e mais
finas nas extremidades superiores. As flores são pequenas, verdes, dispostas em
espigas axilares densas. Os frutos são muito pequenos e do tipo aquênio, esféricos,
31
pretos, ricos em óleo e muito numerosos, geralmente confundidos com sementes.
Toda a planta tem um odor forte e característico. As folhas da C. ambrosioides
podem ser observadas. Na figura 4 podemos observar as folhas da C. ambrosioides.
Figura 4 – Foto das folhas de Chenopodium ambrosioides.
Fonte: KRESS, H. Chenopodium ambrosioides, 2013.
Investigações fitoquímicas sobre as espécies do gênero Chenopodium
revelaram grande variedade de compostos orgânicos sendo eles: terpenos,
esteroides, saponinas triterpênicas, flavonoides e alcaloides (KOKANOVA-
NEDIALKOVA; NEDIALKOV; NIKOLOV, 2009). Algumas espécies desse gênero
possuem várias aplicações tradicionais, mas algumas merecem maior atenção e têm
sido testadas em diferentes atividades biológicas, como antimicrobiana, anti-
inflamatória (YADAV et al., 2007) e antihelmíntica (DUKE, 1985; WEISS, 2001;
YADAV et al., 2007).
Um estudo realizado na Universidade de Dschang (África Central) com o óleo
essencial das partes aéreas (folhas, flores e caule) de C. ambrosioides obtido por
hidrodestilação, sua composição química analisada por Cromatografia Gasosa (GC)
e Cromatografia Gasosa com Espectro de Massa (GC/MS) permitiu a identificação
de 14 componentes, que representa 98,8% do total de óleo. Os componentes
principais foram: α-terpineno (51,3%), p-cimeno (23,4%) e p-menta-1,8-dieno
(15,3%). As propriedades antifúngicas do óleo essencial foram investigadas in vitro
32
pelo método de microdiluição. A atividade antifúngica in vitro foi dose dependente e
os valores de concentração inibitória mínima variaram de 0,25 a 2 mg/mL. A
atividade antifúngica in vivo foi avaliada em modelo de rato induzida a candidíase
vaginal. A atividade in vivo do óleo em candidíase vaginal em ratos não foi dose
dependente. Com efeito, todas as três doses testadas, 0,1%, 1% e 10%, conduziram
à recuperação da infecção dos ratos induzida após 12 dias de tratamento. Este óleo
tem um efeito dose dependente relativamente importante no perfil de ácidos graxos
de C. albicans (CHEKEM et al., 2010).
A extração de Chenopodium ambrosioides L. brasileiro revelou um baixo
rendimento (0,3%) do óleo essencial, com uma boa atividade contra oito fungos
importantes, Aspergillus flavus, A. glaucus, A. niger, A. ochraceous, Colletotrichum
gloesporioides, C. musae, Fusarium oxysporum, e F. semitectum (JARDIM et al.,
2008). Visando melhorar a extração dos compostos antifúngicos, em um segundo
estudo o extrato hexano foi avaliado, este melhorou o rendimento (1,1%) dos
antifúngicos com uma atividade comparável ao óleo essencial (JARDIM et al., 2010).
A composição química de extratos e óleo essencial de C. ambrosioides tem
sido alvo de muitos estudos. Muhayimana et al. (1998), idenficaram σ-terpineno e
ascaridol no óleo essencial de C. ambrosioides. Onocha et al. (1999), analisaram o
óleo essecial de C. ambrosioides coletado na Nigéria, identificando 91,2% da sua
constituição, as substâncias encontradas foram: σ-terpineno (15,7%) e p-cimeno
(15,5%). Gupta et al. (2002), examinaram a composição do óleo essencial de C.
ambrosioides da Índia, identificando as substâncias: σ-terpineno (64%), p-cimeno
(19%) e ascaridol (7%). Pino et al. (2003), avaliaram a constituição do óleo essencial
de C. ambrosioides de Cuba, encontrando acetato de σ-terpenilla (73,9%) e p-
cimeno (4,3%). Cavalli et al. (2004,) analisaram o óleo essencial de C. ambrosioides
de Madagascar, identificando as substâncias: ascaridol (41,8%), isoascaridol
(18,1%) e p-cimeno (16,2%). Jardim et al., (2008) avaliaram o óleo essencial de C.
ambrosioides do Brasil e identificaram: Z-ascaridol (44,4%), E-ascaridol (30,2%) e p-
cimeno (25,4%).
3.10 Ensaios Microbiológicos
A micologia médica tem passado por muitas mudanças. A profilaxia
antifúngica e a terapia empírica tem contribuído para alterações epidemiológicas,
33
com a aparição de cepas com resistência secundária aos antifúngicos e a
substituição de algumas espécies sensíveis por outras com resistência intrínseca
(ROBERTS; TAYLOR; BOYLE, 2003; ESTRELLA; TUDELA, 2002).
Nesse contexto, os testes de sensibilidade em micologia tem apresentado
grande importância, apesar de a correlação entre os testes in vitro e a resposta
terapêutica in vivo ainda não estar totalmente definida, uma vez que o tratamento
depende de variáveis ligadas a clínica do hospedeiro (ESTRELLA; TUDELA, 2002;
REX et al., 2001).
Os testes in vitro para avaliar a susceptibilidade antimicrobiana são
fundamentais para uma adequada antibioticoterapia. Eles contribuem na escolha da
melhor alternativa de tratamento, reduzindo a possibilidade de falha terapêutica
(TORRES, 2005; ELEWSKI, 1998; ESTEBAN; ABARCA; CABANES, 2005;
GHANNOUM et al., 2004).
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada através da
determinação de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o
crescimento do micro-organismo teste. Esse valor é conhecido como Concentração
Inibitória Mínima (CIM). Um aspecto bastante relevante na determinação da CIM de
extratos vegetais é a preocupação em relação aos aspectos toxicológicos,
microbiológicos e legais pertinentes aos compostos naturais ou suas combinações
(PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana e
antifúngica dos extratos vegetais. Os mais conhecidos incluem método de difusão
em ágar, método de macrodiluição e microdiluição. Para determinar a CIM ou a
Concentração Bactericida Mínima (CBM) de extratos ativos de plantas, tem-se
utilizado um método sensível de microdiluição desenvolvido por Eloff (1998).
As variações referentes à determinação da CIM de extratos de plantas podem
ser atribuídas a vários fatores. Dentre eles podemos citar a técnica aplicada, o
microrganismo e a cepa utilizada no teste, a origem da planta, a época da coleta, se
os extratos foram preparados a partir de plantas frescas ou secas e a quantidade de
extrato testada. Assim, não existe método padronizado para expressar os resultados
de testes antimicrobianos de produtos naturais (FENNEL et al., 2004).
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um
método físico, no qual um micro-organismo é testado contra uma substância
biologicamente ativa em meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de
34
inibição de crescimento do micro-organismo testado com a concentração da
substância ensaiada (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
A aplicação do método de difusão se limita a micro-organismos de
crescimento rápido, sendo eles aeróbios ou aeróbios facultativos. A avaliação é
comparativa frente a um padrão biológico de referência (controle positivo) e a zona
ou o halo de inibição de crescimento é medida partindo-se da circunferência do
disco ou poço, até a margem onde há crescimento de micro-organismos (BARRY;
THORNSBERRY, 1991).
De acordo com a dimensão do halo os micro-organismos podem ser
classificados como: sensíveis, quando o diâmetro da zona de inibição é maior ou
não mais do que 3 mm menos que o controle positivo; moderadamente sensíveis,
halo maior que 2 mm, mas menor que o controle positivo de mais de 3 mm; e
resistentes, diâmetro igual ou menor que 2 mm. Como controle positivo, emprega-se
um quimioterápico padrão, e como controle negativo o solvente utilizado para a
dissolução dos extratos (KARAMAN et al., 2003; SPRINGFIELD et al., 2003).
As técnicas de aplicação da substância antimicrobiana no método de difusão
são por meio de disco, cilindros de aço inoxidável ou vidro e perfuração em ágar
(PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
O teste de difusão em disco é aceito pelo FDA (Food and Drug
Administration) e estabelecido como padrão pelo CLSI (BARRY; THORNSBERRY,
1991). O teste de difusão em disco sugerido por Rabanal et al. (2002) e por
Karaman et al. (2003) consiste na aplicação de 10 µL da solução de agente
antimicrobiano em discos de papel de filtro de 6 mm de diâmetro, nas diferentes
concentrações a serem testadas variando de 31,25 a 500 µg/mL.
A metodologia consiste em colocar os discos sobre o meio de cultura sólido
previamente inoculado em placas de Petri, a disposição dos discos deve ser tal que
sua distância até a lateral da placa seja maior que 15 mm e de modo a não sobrepor
as zonas de inibição. O pH do meio de cultura deve estar entre 7,2 e 7,4 e a
profundidade recomendada é de aproximadamente 4 mm (BARRY;
THORNSBERRY, 1991).
O método de diluição em caldo considera a relação entre a proporção de
crescimento do micro-organismo testado no meio líquido e a concentração da
substância ensaiada. A avaliação é comparada frente a um padrão biológico de
35
referência. Entende-se por proporção a densidade da turbidez provocada pelo
crescimento microbiano (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
O método fornece resultados quantitativos e não é influenciado pela
velocidade de crescimento dos micro-organismos. Sua desvantagem é a dificuldade
na detecção de contaminação no caso de teste de materiais clínicos. Como controle
positivo, utiliza-se o caldo com o quimioterápico padrão com a suspensão
padronizada de micro-organismo em teste, e como controle negativo o meio de
cultura com o solvente usado para dissolução da amostra e a suspensão microbiana
(SAHM; WASHINGTON II, 1991). Duas metodologias podem ser empregadas:
macro e microdiluição.
A macrodiluição envolve testes em tubos de ensaio, com volume de meio de
cultura variando de 1 e 10 mL. Por ser laborioso, consumir muito tempo, requerer
muito espaço no laboratório e gerar grande quantidade de resíduos é usado
pequeno número de réplicas (SAHM; WASHINGTON II, 1991; ZGODA, PORTER,
2001).
A microdiluição utiliza microplacas com 96 poços, com volume de meio de
cultura entre 0,1 e 0,2 mL. Eloff (1998) utilizou a técnica de diluição em microplacas
para verifcar a atividade antimicrobiana em extratos vegetais e observou
inconvenientes na técnica, tais como compostos presentes em alguns extratos
precipitavam, e a coloração verde da clorofila em concentração muito alta interferia
na análise. Todavia, concluiu que o método de microplacas é barato, tem
reprodutibilidade, é 30 vezes mais sensível que outros métodos usados na literatura,
requerem pequena quantidade de amostra, pode ser usado para grande número de
amostras e deixa um registro permanente.
36
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Equipamentos
Agitador de tubos (Phoenix, Agitador de Tubos AP56)
Agitador Magnético com Aquecimento (Dist)
Autoclave Vertical (Phoenix)
Balança de precisão (Bel Engineering)
Capela de Fluxo Laminar (Pachane)
Centrífuga (Fanem, Centrífuga Excelsa Baby I)
Condutivímetro (Digimed DM-32)
Espectrofotômetro (Micronal, Colorímetro fotoelétrico B340 UV 660 nm)
Estufa de Incubação Microbiológica (Quimis)
Incubadora com agitação vertical (Dist)
Micro-ondas (LG)
Placas de Cromatografia de Camada Delgada de Sílica-Gel
Placas de Microtitulação com 96 poços, fundo com formato de V e U
4.2 Reagentes
Acetato de Etila (Merck)
Ágar Mueller-Hinton (Acumedia)
Ágar Sabouraud Dextrosado (Acumedia)
Água
Caldo Mueller-Hinton (Merck)
Caldo Sabouraud Dextrosado 2% (Isofar)
Cloreto 2,3,5 trifenil tetrazólio (Vetec)
Cloreto de Sódio (Vetec)
Dimetilsulfóxido (Merck)
Glicose (Lafan)
Hexano (Nuclear)
37
4.3 Material Vegetal
4.3.1 Cipura paludosa
C. paludosa foi coletada no município de Porto Velho, estado de Rondônia,
Brasil, em agosto de 2009. Um exemplar foi submetido à análise botânica e
identificado pelo Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) por Maria de
Fátima Figueiredo Melo. Uma excicata de número 1782 encontra-se depositada no
Herbário Dr. Ary Tupinambá Penna Pinheiro, em Porto Velho, Brasil.
Os procedimentos para a obtenção dos extratos brutos e substâncias isoladas
foram realizados no Laboratório da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI pela
acadêmica Priscila Batista Tessele, orientada pelo Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
(TESSELE, 2011) conforme a figura 5.
Figura 5 – Esquema para obtenção das substâncias isoladas de Cipura paludosa.
Bulbos frescos de C. paludosa foram macerados com metanol à temperatura
ambiente durante cerca de sete dias. Após filtração, o solvente foi removido por
38
evaporação sob pressão reduzida e o resíduo foi particionado sucessivamente com
diclorometano (DCM) e acetato de etila (AE).
Parte da fração DCM foi fracionada em sílica gel por cromatografia em coluna,
eluindo com um gradiente de n-hexano:acetato de etila com polaridade crescente
rendendo várias frações, onde as frações 58-65 referente a isoeleuterina renderam
17% a partir de DCM e as frações 77-83 que correspondem a eleuterina
apresentaram rendimento de 6,5% também a partir da DCM.
4.3.2 Chenopodium ambrosioides
C. ambrosioides foi coletada no munícipio de Cáceres, estado do Mato
Grosso, Brasil, em março 2010. Um exemplar foi submetido à análise botânica, para
identificação segura da espécie. Uma excicata de número HBR 52802 encontra-se
depositada no Herbário Barbosa Rodrigues, Itajaí, SC.
Os procedimentos para a obtenção dos extratos brutos, frações, óleo
essencial e hidrolatos foram realizados no Laboratório de Análises Fitoquímicas da
Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI pelas acadêmicas Ruth Tomasoni
Degenhardt e Liliane Trivellato Grassi, orientada pela Professora Dra. Angela
Malheiros (GRASSI, 2011; DEGENHARDT, 2013). Nas figuras 6 e 7 estão
apresentados, os esquemas dos procedimentos realizados.
Figura 6 – Esquema de obtenção dos extratos brutos e frações de Chenopodium
ambrosioides.
39
Figura 7 – Esquema de obtenção do óleo essencial, e frações do hidrolato de
Chenopodium ambrosioides.
O material botânico foi seco e separado em folhas, caules e raiz, estas foram
trituradas e submetidas separadamente ao processo de maceração com etanol,
somente as folhas foram submetidas ao processo de partição líquido- líquido com
solventes imiscíveis entre si e em ordem crescente de polaridade (diclorometano,
acetato de etila e butanol). O processo de extração do óleo essencial das folhas de
C. ambrosioides foi realizado pelo método de arraste a vapor com aparato de
Clevenger. O hidrolato obtido foi submetido à partição líquido-líquido repetindo o
mesmo procedimento realizado para o extrato bruto das folhas. O óleo essencial
obtido foi denominado CAOE com rendimento de 1,15%, apresentou duas
substâncias majoritárias, que foram identificadas como: 1-isopropil-4-metil-benzeno
(p-cimeno) (42,32%) e 1-isopropil-4-metil-2,3-dioxabiciclo[2.2.2]oct-5-eno
(ascaridol) (49,77%), respectivamente, totalizando 92,09% do óleo essencial
analisado.
4.4 Micro-organismos
As cepas microbianas foram adquiridas da coleção americana American Type
Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, U.S.A.) ou cepas isoladas do Centro de
Referência em Micologia (C) (CEREMIC, Facultad de Ciencias Bioquímicas y
Farmacéuticas, Suipacha 531, (2000) Rosario, Argentina).
40
Os micro-organismos utilizados como cepas padrões para a realização dos
ensaios de atividade antimicrobiana foram as bactérias Gram-positivas:
Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), S. saprophyticus (ATCC 35552), S.
epidermidis (ATCC 12228), Bacillus subtilis (ATCC 2385), Enterococcus faecalis
(ATCC 29212) e Gram-negativas: Klebsiela pneumoniae (ATCC 13883), Escherichia
coli (ATCC 11775), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella typhimurium (ATCC 14028).
Para os ensaios com fungos foram utilizadas as seguintes cepas de fungos
leveduriformes: Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763), Cryptococcus neoformans
(ATCC 32264), Candida albicans (ATCC 10231), C. tropicalis (ATCC 7349), C.
parapsilosis (ATCC 22019), C. krusei (ATCC 6258), C. glabrata (ATCC 90030) e
fungos filamentosos: Aspergillus flavus (ATCC 9170), A. niger (ATCC 9092), A.
fumigatus (ATCC 26934), Rhizopus sp (C135), M. gypseum (C115), Trichophyton
mentagrophytes (ATCC 9972), T. rubrum (C137) e Epidermophyton flocosum
(C114).
4.5 Preparação dos inóculos
4.5.1 Bactérias
Cada bactéria foi transferida do meio de manutenção para o meio ágar
Mueller-Hinton e incubada a 35 ºC por 18 a 24 h, para ativação da respectiva cultura.
Para o preparo do inóculo foram selecionadas 3 a 4 colônias da bactéria
ativada em ágar Mueller-Hinton, e transferidas para um tubo de ensaio com 5 mL de
salina 0,86% estéril, e homogeinizadas em agitador de tubos por 15 segundos.
A densidade do inóculo foi ajustada em espectrofotômetro, lendo-se em
comprimento de onda de 520 nm para a obtenção de 75% de transmitância por
comparação com a escala McFarland. A solução salina estéril foi empregada como
branco (CLSI, 2003).
O inóculo final foi obtido pela diluição da suspensão das respectivas culturas
bacterianas, obtendo-se a concentração de aproximadamente 1,5 x 106 células/mL.
Para o método de diluição em ágar, inoculou-se em cada frasco contendo o meio
uma alça calibrada de 1 µL (1-5 x 105 células) (CLSI, 2003).
41
4.5.2 Fungos leveduriformes
Cada fungo foi transferido do meio de manutenção para o meio ágar
Sabouraud Dextrosado e incubado a 30 ºC por 24 a 48 horas, para ativação da
respectiva cultura.
Para o preparo do inóculo foram selecionadas 3 a 4 colônias do fungo ativado
em ágar Sabouraud Dextrosado, e transferidas para um tubo de ensaio com 5 mL
de salina 0,86% estéril, e homogeinizadas em agitador de tubos por 15 segundos.
A densidade do inóculo foi ajustada em espectrofotômetro, lendo-se em
comprimento de onda de 520 nm para a obtenção de 85% de transmitância. A
solução salina estéril foi empregada como branco. O inóculo final foi obtido pela
diluição da suspensão das respectivas culturas fúngicas, obtendo-se a concentração
de aproximadamente 1,5 x 106 células/mL. Para o método de diluição em ágar,
inoculou-se em cada frasco contendo o meio uma alça calibrada de 1 µL (1-5 x 105
células) (ESPINEL-INGROFF; PFALLER, 1995).
4.5.3 Fungos filamentosos
Os fungos foram mantidos em ágar Sabouraud Dextrosado à temperatura
ambiente por 7 a 10 dias para a obtenção das culturas jovens. Os respectivos
inóculos foram preparados, removendo-se os esporos de cada fungo a partir da sua
colônia jovem, com auxílio de uma alça, transferidos para um tubo com água estéril
(10 mL), e homogeneizado vigorosamente em agitador de tubos. A suspensão
conidial foi filtrada com uma gaze para a remoção das hifas. A suspensão resultante
foi novamente homogeneizada e ajustada para 1,5 x 106 conídios/mL pela adição de
água estéril, utilizando um hemocitômetro para a determinação da contagem de
células. Foi inoculado em cada frasco contendo o meio uma alça calibrada de 10 µL
correspondendo a 1-5 x 104 células, para cada micro-organismo (LLOP et al., 2000).
42
4.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
4.6.1 Método da Diluição em Ágar (Macrodiluição)
Os valores da CIM foram determinados através do método da diluição em
ágar dos extratos de C. ambrosioides através da metodologia descrita pelo CLSI
(CLSI, 2002a, 2002b, 2003), com adaptações.
Os extratos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO), atingindo uma
concentração de 40 mg/mL, e preparada uma série de diluições em 10 tubos com
concentrações variando de 2000 a 3,9 ppm, o óleo essencial não foi dissolvido em
DMSO e as concentrações variaram de 12.500 a 97,65 ppm. Foram adicionados
1.000 µL de ágar Mueller-Hinton para as bactérias e 1.000 µL de ágar Sabouraud
Dextrosado para os fungos leveduriformes e filamentosos. O frasco foi
imediatamente agitado manualmente para total homogeneização da mistura. Os
frascos foram inclinados e após a solidificação dos meios de cultura, os micro-
organismos previamente ativados foram inoculados nas séries correspondentes.
Posteriormente, foram incubados em estufa a 35 ºC por 18 a 24 horas para o
crescimento das bactérias, a 30 ºC por 24 a 48 horas para os fungos leveduriformes,
e a temperatura ambiente (25 ºC) por 5 a 15 dias para os fungos filamentosos
(Figura 8).
Após o período de incubação, foram realizadas leituras da CIM através da
verificação visual do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados foi
considerada CIM a inibição total do crescimento microbiano.
Durante os testes foram utilizados frascos controle, contendo apenas o meio
de cultura e frascos contendo DMSO. Os testes foram considerados válidos apenas
quando houve crescimento bacteriano nestes frascos.
43
Figura 8 – Representação esquemática do teste de macrodiluição em tubo, após a inoculação e incubação.
Fonte: MACHADO, GALES, 2008. 4.6.2 Método da Diluição em Caldo (Microdiluição)
Para as substâncias isoladas da C. paludosa, os valores da CIM foram
determinados através do método da diluição em caldo (microdiluição) através da
metodologia descrita pelo CLSI para bactérias (CLSI, 2003), fungos leveduriformes
(CLSI, 2002b) e fungos filamentosos (CLSI, 2002a).
Para a preparação do inóculo da microdiluição de bactérias e fungos
leveduriformes, foram transferidos 133 µL dos inóculos descritos no item 4.5.1 e
4.5.2, para um tubo estéril, no qual foram adicionados 9,9 mL de caldo Mueller-
Hinton para bactérias e ou caldo Sabouraud para fungos leveduriformes,
homogeneizou-se e foi transferido para canaleta para utilização da pipeta multicanal
(CLSI, 2002a, 2002b, 2003).
Para a preparação do inóculo da microdiluição de fungos filamentosos, foram
transferidos 80 µL do inóculo descrito no item 4.3.3. para um tubo estéril, no qual
foram adicionados 4 mL de caldo Sabouraud, homogeneizou-se e após transferido
para canaleta para utilização da micropipeta multicanal (CLSI, 2002a).
As substâncias isoladas da C. paludosa, a isoeleuterina e eleuterina foram
dissolvidas em DMSO, atingindo uma concentração de 40 mg/mL. Neste ensaio foi
utilizada uma placa de microtitulação com 96 poços em forma de V para bactérias e
fungos leveduriformes e em forma de U para fungos filamentosos. Foi preparada
uma série de diluição, adicionando-se 95 µL de caldo Mueller-Hinton no primeiro
poço e 50 µL nos outros 11 poços. No primeiro poço da série foram adicionados 5 µL
44
da amostra, homogeneizou-se e foram transferidos 50 µL do primeiro poço para o
segundo poço, e assim por diante até o décimo poço. Os dois últimos poços
serviram como controles positivo e negativo, por último foram adicionados 50 µL de
meio de cultura (caldo) com o inóculo em cada poço, exceto no último. A placa foi
selada com filme de PVC e posteriormente incubadas em estufa a 35 ºC por 18 a 24
horas para o crescimento das bactérias, a 30 ºC por 24 a 48 horas para os fungos
leveduriformes, e a temperatura ambiente (25 ºC) por 5 a 15 dias para os fungos
filamentosos.
Após o período de incubação, foram realizadas leituras da CIM através da
verificação visual do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados,
foi considerada CIM a inibição total do crescimento microbiano.
4.7 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Fungicida
Mínima (CFM)
Para determinar a concentração bactericida mínima ou fungicida mínima
foram selecionadas as culturas que apresentaram inibição do desenvolvimento
bacteriano ou fúngico no ensaio de CIM. Para tanto, foram realizadas subculturas
em meio ágar Mueller-Hinton para bactérias, incubadas a 35 ºC por 18 a 24 horas e
em ágar Sabouraud Dextrosado para fungos leveduriformes e filamentosos,
incubados a 30 ºC por 24 a 48 horas, e a temperatura ambiente (25 ºC) por 5 a 15
dias, respectivamente. Após a incubação as culturas foram inspecionadas para a
verificação visual do crescimento microbiano.
Para a interpretação dos resultados, foi considerado que a inibição no ensaio
da CIM e crescimento de micro-organismo na cultura (CBM ou CFM) significa ação
bacteriostática ou fungistática e a ausência do crescimento na subcultura significa
ação bactericida ou fungicida (BARON; FINEGOLD, 1990).
4.8 Bioautografia
Para o direcionamento da pesquisa quanto à identificação dos compostos
com potencial antimicrobiano da planta, foi realizado o ensaio da bioautografia
(HAMBURGER; CORDELL, 1987; RAHALISON et al., 1994).
45
As amostras testes foram dissolvidas em acetona e aplicadas em placas de
cromatografia em camada delgada de sílica-gel (CCD). Em seguida, as placas foram
submetidas à eluição nos sistemas de solventes hexano e acetato de etila (9:1),
hexano e acetato de etila (6:4). Após a eluição e eliminação dos resíduos de
solventes, foi distribuída uma fina camada do meio de cultura contendo o inóculo de
micro-organismo susceptível (106 células/mL) sobre as placas de CCD e em seguida
incubada conforme a característica do micro-organismo.
Após o período de incubação foi borrifado nas placas, uma solução aquosa de
cloreto 2,3,5 trifenil tetrazólio (TTC) foi aspergida sobre a placa que foi novamente
incubada por mais 4 horas.
O critério empregado para a interpretação dos resultados de bioautografia foi
o aparecimento de zonas claras em torno dos compostos eluídos na CCD, indicando
a respectiva atividade antimicrobiana (HAMBURGER; CORDELL, 1987;
RAHALISON et al., 1994).
4.9 Avaliação do mecanismo de membrana celular
O óleo essencial de C. ambrosioides foi avaliado para verificação da atividade
em inibir a função da membrana celular através do método de Ye e colaboradores
(2005).
O inóculo microbiano foi preparado após ativação do S. aureus em ágar
Mueller-Hinton (37 ºC por 24 horas). Aproximadamente 4 colônias isoladas foram
transferidas para um tubo de ensaio contendo caldo Muller-Hinton e a concentração
de células foi ajustada na escala McFarland 0,5 através do espectrofotômetro.
Posteriormente foi incubado em estufa a 37 ºC por 6 horas. Após o período de
incubação, o tubo foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado foi suspendido em uma solução de glicose 5%. O
procedimento foi repetido até que a sua condutividade elétrica fosse próxima à
condutividade da solução de glicose 5%, tornando a solução isotônica.
O óleo essencial foi acrescentado a solução de glicose 5% em diferentes
concentrações (12.500; 6.250; 3.125; 1.562; 781; 390 ppm) sendo utilizada como
controle positivo a Polimixina B a qual foi testada na concentração de 100 µg/mL,
sendo realizada a leitura da condutividade elétrica (L1). Posteriormente, a estas
mesmas concentrações foi adicionado 100 µL da solução bacteriana previamente
46
preparada. Depois de homogeneizadas, as amostras foram incubadas sob agitação
a 37 ºC durante 40 minutos e então a condutividade foi verificada novamente (L2).
A diferença da condutividade elétrica das amostras com e sem a solução
bacteriana foi representada pela fórmula ∆L = L2 – L1, e a condutividade da bactéria
inativada aquecida em glicose 5% foi usada como controle negativo (Lo). A razão
∆L/∆Lo indicou a condutividade elétrica relativa das amostras analisadas.
47
48
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Atividade antimicrobiana
5.1.1 Chenopodium ambrosioides
As plantas contém milhares de componentes e são uma excelente fonte para
pesquisa de compostos com atividade antimicrobiana. A escolha certa dos
solventes, processos de extração e dos métodos de avaliação da atividade
antimicrobiana são essenciais para o isolamento e identificação dos compostos com
atividade biológica (DAS; TIWARI; SHRIVASTAVA, 2010; OSTROSKY et al., 2008).
A atividade antimicrobiana in vitro pode ser classificada de acordo com os
seguintes valores de CIM: para CIM abaixo de 100 ppm, a atividade antimicrobiana é
considerada boa, para CIM entre 100 e 500 ppm é considerada moderada, para CIM
entre 500 e 1000 ppm é considerada fraca e acima de 1.000 ppm é considerada
inativa (SANTOS et al., 2008; HOLETZ et al., 2002). Salienta-se que estes valores
de CIM são utilizados como referência para fármacos antimicrobianos de uso clínico,
porém os extratos com CIM superior a 1.000 ppm ainda possuem ação
antimicrobiana, que poderiam ser empregados como conservantes de cosméticos e
alimentos agregando valor, pois as concentrações de extratos nestes produtos são
bem maiores quando comparados aos fármacos.
Segundo Rocha (1994) produtos cosméticos podem conter até 1% (10.000
ppm) de flavonóide contribuindo para a ação antimicrobiana, além de serem
hidrossolúveis e miscíveis em cosméticos e não causarem irritação cutânea como
acontece com outros conservantes.
A avaliação da atividade antibacteriana dos extratos brutos, frações, óleo
essencial e hidrolatos da espécie C. ambrosioides frente a bactérias Gram-positivas
e Gram-negativas encontram-se nas tabela 1 e 2 respectivamente.
49
Tabela 1 – Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) dos extratos e óleo essencial de Chenopodium ambrosioides frente às bactérias Gram-positivas. Material testado Concentração Inibitória Mínima (ppm)
S. aur S. sap E. fae B. sub CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM
OE 6.250 / 6.250 6.250 / 12.500 12.500 / 12.500 3.125 / 3.125 EBF EtOH >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 EBR >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 EBC >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 P. DCM EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. DCM H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. AE EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. AE H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. BUT EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. BUT H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 Legenda: OE- Óleo essencial; EBF EtOH – Extrato bruto da folha etanólico; EBR – Extrato bruto da raiz; EBC – Extrato bruto do caule; P. DCM EtOH– Partição Diclorometano do extrato etanólico da folha; P. DCM H. - Partição Diclorometano do hidrolato do óleo essencial; P. AE EtOH - Partição Acetato de Etila do extrato etanólico da folha; P. AE H. - Partição Acetato de Etila do hidrolato do óleo essencial; P. BUT EtOH – Partição Butanol do extrato etanólico da folha; P. BUT H. – Partição Butanol do hidrolado do óleo essencial; S. aur – Staphylococcus aureus; S. sap – Staphylococcus saprophyticus; E. fae – Enterococcus faecalis; B. sub – Bacillus subtilis.
Tabela 2 – Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) dos extratos e óleo essencial de Chenopodium ambrosioides frente às bactérias Gram-negativas. Material testado Concentração Inibitória Mínima (ppm)
E. coli K. pneu S. typ P. aer CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM
OE 6.250 / 12.500 6.250 / 6.250 12.500 / 12.500 12.500 / 12.500 EBF EtOH >2.000 >1.000 >2.000 >2.000 EBR >2.000 >1.000 >2.000 >2.000 EBC >2.000 >1.000 >2.000 >2.000 P. DCM EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. DCM H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. AE EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. AE H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. BUT EtOH >1.000 >1.000 1.000 / >1.000 >1.000 P. BUT H. >1.000 >1.000 1.000 / >1.000 >1.000 Legenda: OE- Óleo essencial; EBF EtOH – Extrato bruto da folha etanólico; EBR – Extrato bruto da raiz; EBC – Extrato bruto do caule; P. DCM EtOH– Partição Diclorometano do extrato etanólico da folha; P. DCM H. - Partição Diclorometano do hidrolato do óleo essencial; P. AE EtOH - Partição Acetato de Etila do extrato etanólico da folha; P. AE H. - Partição Acetato de Etila do hidrolato do óleo essencial; P. BUT EtOH – Partição Butanol do extrato etanólico da folha; P. BUT H. – Partição Butanol do hidrolado do óleo essencial; E. coli – Escherichia coli; K. pneu – Klebsiela pneumoniae, S. typ – Salmonella typhimurium e P. aer – Pseudomonas aeruginosa.
50
Os extratos brutos, frações, óleo essencial e as frações dos hidrolatos de C.
ambrosioides apresentaram atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas com CIM superiores a 1.000 ppm, sendo considerados inativos contra
estas bactérias, com exceção para a fração butanol e a fração butanol do hidrolato
que foram consideradas com fraca atividade antimicrobiana pois apresentam CIM de
1.000 ppm para a bactéria Gram-negativa S. typhimurium.
Podemos observar um perfil de seletividade em relação às bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas encontrado nos testes de atividade antimicrobiana.
Este fato pode ser explicado devido a estrutura da célula bacteriana. A
resistência intrínseca das bactérias Gram-negativas aos agentes antimicrobianos
tem sido associada a presença de uma membrana externa existente nesses micro-
organismos. Com isso, o agente antimicrobiano encontra grande dificuldade de
penetrar na célula, ou quando consegue, a concentração não é alta o suficiente para
apresentar o resultado esperado (SCHAECHTER et al., 2002).
Os compostos hidrofóbicos apresentam dificuldade de atravessar a
membrana celular bacteriana externa, devido à sua porção polar estar situada na
face externa. Por outro lado, o interior hidrofóbico da membrana dificulta a
passagem de compostos hidrofílicos. (TAVARES, 1996; SCHAECHTER et al., 2002).
Além disso, as bactérias Gram-negativas possuem o espaço periplasmático, onde
podem ser encontradas as enzimas degradantes que inativam alguns antibióticos,
como por exemplo, os beta-lactâmicos, nucleases, proteases, entre outras
(TAVARES, 1996; SCHAECHTER et al., 2002).
Também tem sido demonstrado que as bactérias, sobretudo as Gram-
negativas, possuem mecanismos de bombas de efluxo especializados em expulsar
substâncias estranhas. Esses mecanismos atuam limitando o acesso do agente
antimicrobiano ao alvo, que lança a molécula de antibiótico, para fora da célula.
Esse sistema previne o acúmulo de antibiótico no interior da célula, evitando assim
que o agente antimicrobiano atinja a quantidade necessária para tornar o ambiente
letal à célula, não exercendo o seu efeito (NIKAIDO, 1989, 1994; GHANNOUM;
RICE, 1999; BAMBEKE; MICHOT; TULKENS, 2003).
A avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos, frações, óleo
essencial e hidrolatos da espécie C. ambrosioides frente a espécies de fungos
leveduriformes e filamentosos encontram-se nas tabelas 3 e 4 respectivamente
51
Tabela 3 – Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração fungicida mínima (CFM) dos extratos e óleo essencial de Chenopodium ambrosioides frente a fungos leveduriformes. Material testado Concentração Inibitória Mínima (ppm)
C. alb C. tro C. gla C. par C. kru C. neo S. cer CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM
OE 781,25 / 781,25 781,25 / 3.125 390,62 / 781,25 1.562 / 3.125 390,62 / 781,25 781,25 / 6250 781,25 / 1.562 EBF EtOH >2.000 >2.000 >2.000 2.000 / 2.000 >2.000 500 / 2.000 250 / 500 EBR 2.000 / 2.000 >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 2.000 / 2.000 1.000 EBC >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 P. DCM EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 1.000 / 1.000 >1.000 P. DCM H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 500 / 1.000 >1.000 P. AE EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. AE H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. BUT EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. BUT H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 Legenda: OE- Óleo essencial; EBF EtOH – Extrato bruto da folha etanólico; EBR – Extrato bruto da raiz; EBC – Extrato bruto do caule; P. DCM EtOH– Partição Diclorometano do extrato etanólico da folha; P. DCM H. - Partição Diclorometano do hidrolato do óleo essencial; P. AE EtOH - Partição Acetato de Etila do extrato etanólico da folha; P. AE H. - Partição Acetato de Etila do hidrolato do óleo essencial; P. BUT EtOH – Partição Butanol do extrato etanólico da folha; P. BUT H. – Partição Butanol do hidrolado do óleo essencial; C. alb – Candida albicans; C. tro – Candida tropicalis; C. gla – Candida glabrata; C. par – Candida parapsilosis; C. kru – Candida krusei; C. neo – Cryptococcus neoformans e S. cer – Saccharomices cerevisiae
52
Tabela 4 – Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração fungicida mínima (CFM) dos extratos e óleo essencial de Chenopodium ambrosioides frente a fungos filamentosos. Material testado
Concentração Inibitória Mínima (ppm) A. fla A. nig A. fum Rhi M. gyp E. flo T. rub T. men
CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM OE 1.562 / 6.250 390,62 / 781,25 3.125 / 6.250 1.562 / 3.125 195 / 1.562 1.562 / 3.125 1.562 / 3.125 781,25 / 781,25 EBF EtOH >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 1.000 / 2.000 >2.000 1.000 2.000 / 2.000 EBR >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 1.000 / 1.000 >2.000 2.000 2.000 / 2.000 EBC >2.000 >2.000 >2.000 >2.000 1.000 / 2.000 >2.000 2.000 2.000 / 2.000 P.DCM EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 500 / 1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. DCM H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 1.000 / 1.000 >1.000 1.000 500 / 1.000 P.AE EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 1.000 / 1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. AE H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 1.000 / 1.000 >1.000 500 500 P.BUT EtOH >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 P. BUT H. >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 1.000 / 1.000 Legenda: OE- Óleo essencial; EBF EtOH – Extrato bruto da folha etanólico; EBR – Extrato bruto da raiz; EBC – Extrato bruto do caule; P. DCM EtOH– Partição Diclorometano do extrato etanólico da folha; P. DCM H. - Partição Diclorometano do hidrolato do óleo essencial; P. AE EtOH - Partição Acetato de Etila do extrato etanólico da folha; P. AE H. - Partição Acetato de Etila do hidrolato do óleo essencial; P. BUT EtOH – Partição Butanol do extrato etanólico da folha; P. BUT H. – Partição Butanol do hidrolado do óleo essencial; A. fla – Aspergillus flavus; A. nig – Aspergillus niger; A fum – Aspergillus fumigatus; Rhi – Rhizopus sp; M. gyp – Microsporum gypseum; E. flo – Epidermophyton floccosum; T rub – Trichophyton rubrum e T. men – Trichophyton mentagrophytes.
53
Os extratos brutos, frações e as frações dos hidrolatos de C. ambrosioides
apresentaram CIM superiores a 1.000 ppm para C. albicans, C. tropicalis, C.
glabrata, C. parapsilosis e C. krusei, sendo considerados inativos contra essas
leveduras.
O óleo essencial de C. ambrosioides apresentou atividade contra 9 dos 15
fungos analisados, os fungos susceptíveis ao óleo foram: C. albicans, C. tropicalis,
C. glabrata, C. krusei, C. neoformans, S. cerevisiae, A. niger, M. gypseum e T.
mentagrophytes. Tais fungos são de importância clínica, pois tratam-se de fungos
oportunistas e dermatófitos.
O óleo essencial apresentou moderada atividade antifúngica para C. krusei e
C. glabrata com CIM de 390,62 ppm, para C. albicans e C. tropicalis foi considerado
com fraca atividade antifúngica com CIM de 781,25 ppm e considerado inativo para
C. parapsilosis.
Estudos preliminares realizados por Chekem et al. (2010) na Universidade de
Dschang (África Central) sobre a atividade antifúngica do óleo essencial das partes
aéreas (folhas, flores e galhos) de C. ambrosioides demonstraram resultados
inferiores quando comparado ao presente estudo. A técnica utilizada por Chekem et
al. (2010) foi a de microdiluição em caldo, para 3 cepas padrão de C. albicans a CIM
variou de 1,0 a 2,0 mg/mL (equivalente a 1.000 e 2.000 ppm), para C. krusei, C.
lusitaneae e C. tropicalis a CIM foi de 1,0 mg/mL, para C. parapsilosis a CIM foi de
0,5 mg/mL (equivalente a 500 ppm) e para a C. glabrata e C. guilliermondii a CIM foi
de 0,25 mg/mL (equivalente a 250 ppm). Entretanto, em relação a C. albicans, C.
tropicalis e C. krusei os valores obtidos de CIM do presente estudo foram inferiores
ao de Chekem et al. (2010), obtivemos CIM de 781,25 ppm para C. albicans e C.
tropicalis e CIM de 390,62 ppm para C. krusei. A composição química do óleo
essencial analisado por Chekem et al. (2010) apresentou apenas 0,7% de ascaridol
e 23,4% de p-cimeno, que difere bastante do presente estudo pois apresentou
49,77% de ascaridol e 42,32% de p-cimeno.
Em relação a S. cerevisiae o extrato bruto das folhas apresentou CIM de 250
ppm, sendo considerado com moderada atividade antifúngica, o óleo essencial e o
extrato bruto da raiz apresentaram fraca atividade com CIM respectivamente de
781,25 e 1.000 ppm, os demais extratos e frações de hidrolatos foram considerados
inativos para este micro-organismo.
54
Analisando os resultados da CIM do C. neoformans foi considerado o óleo
essencial, o extrato bruto das folhas, a fração diclorometano e a fração
diclorometano do hidrolato com fraca atividade antifúngica. Os demais extratos e
frações foram considerados inativos.
Os resultados obtidos nos fungos filamentosos indicam moderada atividade
antifúngica para o óleo essencial frente ao A. niger e M. gypseum com CIM
respectivamente de 390,62 e 195 ppm. Com exceção da fração butanol e fração
butanol do hidrolato, os demais extratos e frações foram considerados possuidores
de fraca atividade antifúngica frente ao M. gypseum. Os extratos, frações, óleo
essencial e frações dos hidrolatos foram inativos para os micro-organismos A. flavus,
A. fumigatus, Rhizopus sp e E. flocosum.
Um estudo realizado em Viçosa (MG) por Jardim et al. (2008) com óleo
essencial das folhas da C. ambrosioides revelou que o ascaridol (Z e E) é a
substância em maior quantidade (80%), porém a concentração de p-cimeno é muito
pequena (2,0%). O óleo essencial de C. ambrosioides foi testado frente a cepas de
A. flavus, A. niger, A. glaucus, A. ochraceus, Fusarium oxysporum, F. semitectum e
Colletotricum gloeosporioides através do método “poison food” nas concentrações
de 0,3%, 0,1%, 0,05% e 0,03% que equivalem respectivamente a 3.000 ppm, 1.000
ppm, 500 ppm e 300 ppm. O óleo essencial inibiu completamente o crescimento
micelial dos fungos testados na concentração de 0,3% (JARDIM et al., 2008). Ao
comparar esses resultados com avaliados no presente estudo observamos que em
relação ao A. flavus a CIM foi 48% inferior, com valor de 1.562 ppm e ao
compararmos com o A. niger a CIM foi 87% inferior, com valor de 390,62 ppm.
Prasad et al. (2009) também avaliou a atividade antifúngica do óleo essencial
das folhas de C. ambrosioides através da técnica de “poison food” frente a fungos
filamentosos. As folhas da C. ambrosioides foram coletadas nas margens do rio
Ganga (Samne Ghat, Varanasi) e revelaram um perfil fitoquímico diferente do
avaliado no presente estudo, onde há presença de m-cimeno (43,90%) e mirtenol
(13,33%) como constituintes majoritários, há presença de p-cimeno (0,9%) mas em
pequena quantidade e não foi encontrado ascaridol na sua constituição. O óleo
essencial inibiu completamente o crescimento de A. fumigatus, Microsporum
audouni, M. nanum, Trichophyton mentagrophytes, T. verrucosm e T. violaceum e
inibiu parcialmente o crescimento de A. flavus e A. niger na concentração de 800
ppm. No presente estudo foi encontrado resultados semelhantes para o T.
55
mentagrophytes, pois foi inibido completamente o crescimento micelial na
concentração de 781,25 ppm e em relação ao A. niger foi inibido completamente o
crescimento micelial com apenas 390,62 ppm, valor este inferior ao estudo de
Prasad et al. (2009).
Estudos realizados por Kumar et al. (2007) sobre a atividade antifúngica do
óleo essencial de C. ambrosioides frente a A. flavus, através da metodologia de
“poison food” verificaram 100% de inibição do crescimento micelial na concentração
de 500 ppm, e que em concentrações mais baixas, a partir de 10 ppm já há
alterações no metabolismo do fungo, como por exemplo, a inibição da produção de
aflatoxina B1.
As diferenças de CIM observadas podem ser atribuídas à composição
química dos antimicrobianos vegetais testados, e isto têm justificativa sob vários
aspectos edafo-climáticos (época de colheita, horário, localidade, entre outros
fatores) que alteram a produção dos compostos ativos nas plantas. Esta afirmação
encontra suporte em estudo de Gobbo-Netto e Lopes (2007), que relatam a
influência dos fatores ambientais na produção dos compostos secundários das
plantas, resultando em produtos vegetais com diferentes composições químicas e
com isto capacidades distintas para inibição de crescimento microbiano.
Na literatura sugere-se que a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais
está relacionada principalmente ao seu composto majoritário, embora, alguns
autores mencionem a sinergia com os compostos minoritários (BURT et al., 2004;
BAKKALI et al., 2008).
A maioria das pesquisas é realizada com os óleos essenciais sem
fracionamento e em muitos casos sem a identificação dos componentes químicos.
Em outros casos, a ação é atribuída a algum dos componentes do óleo, baseada em
estudos realizados com substâncias isoladas (YUNES; CECCHINEL-FILHO, 2007).
O efeito de associação entre os diversos compostos presentes em uma determinada
planta pode ser aditivo ou sinérgico, sendo observado em alguns casos e também
devendo ser levado em consideração (HEMAISWAYRA; KRUTHIVENTI; DOBLE,
2008). Isto poderia explicar a razão de que algumas substâncias apresentaram
menor atividade antimicrobiana do que o óleo essencial do qual foi extraído, como
foi verificado com as substâncias ascaridol e isoascaridol em relação ao óleo
essencial da C. ambrosioides.
56
Ao ser avaliado isoladamente o ascaridol e o isoascaridol extraídos do óleo de
C. ambrosioides frente as cepas de S. aureus e C. albicans, foi verificado que a CIM
obtida para S. aureus foi de 12.500 ppm e para C. albicans foi de 6.250 ppm para
ambas substâncias, mas quando analisamos o óleo essencial na sua totalidade
frente a S. aureus e a C. albicans a CIM encontrada foi de 6.250 ppm e 781,25 ppm,
respectivamente para ambas as substâncias, e podemos sugerir que estas
substâncias não são as responsáveis pela atividade antifúngica do óleo essencial da
C. ambrosioides. Da mesma forma torna-se necessário isolar os compostos ativos e
repetir os testes, para que possa ser demonstrada quais substâncias são
efetivamente ativas
O óleo essencial de C. ambrosioides apresentou atividade antimicrobiana
principalmente contra fungos leveduriformes e filamentosos. A ação dessas
substâncias destrói a parede fúngica e a membrana citoplasmática que resulta em
escoamento do citoplasma e sua coagulação. Sinais visíveis da ação dos óleos
essenciais nos fungos podem ser vistas através modificações morfológicas, como a
diminuição do micélio (KNOBLOCH, 1989; ADAMS; KUNZ; WEIDENBÖRNER,
1996; BOURREL et al., 1995; BILLERBECK et al., 2001).
Nas concentrações fungicidas mínimas (CFM), o perfil da atividade
antimicrobiano foi similar aos valores encontrados para a concentração inibitória
mínima (CIM).
Deve-se ressaltar que a diferença entre os valores de CIM e CFM para alguns
microorganismos foram pequenas, indicando que a planta possui atividade fungicida
próxima do ponto de inibição do respectivo fungo, o que é considerado uma
característica desejável para os agentes antimicrobianos frente a pacientes
imunocomprometidos, uma vez que os agentes antimicrobianos fungistáticos apenas
inibem o crescimento fúngico, tornando-os clinicamente menos desejáveis que os
fungicidas.
5.1.2 Cipura paludosa
Este é o primeiro ensaio de atividade antimicrobiana da espécie C. paludosa,
Não há relatos na literatura sobre a atividade antimicrobiana da espécie C. paludosa,
ou do gênero Cipura, e das substâncias isoladas isoeleuterina e eleuterina.
57
A isoeleuterina e eleuterina são naftoquinonas, elas são conhecidas por
apresentar atividades antibacterianas e antifúngicas, e tem sido amplamente
testadas em vários estudos farmacológicos (DA SILVA; FERREIRA; DE SOUZA,
2003; GAFNER et al., 1996; KUMAGAI et al., 2011).
Algumas naftoquinonas foram investigadas contra vários fungos patogênicos,
como é o caso das naftoquinonas shikonina, deoxishiconina, acetilshicocina e β-
hidroxiisovalerilshiconina que possuem ação antifúngica contra algumas leveduras
do gênero Candida e contra o fungo filamentoso Trichosporon cutaneum (SASAKI;
ABE; YOSHIZAK, 2002).
A avaliação da atividade antibacteriana das substâncias isoeleuterina e
eleuterina frente as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas testadas encontram-
se nas tabelas 5 e 6 respectivamente.
Tabela 5 – Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) da Isoeleuterina e Eleuterina frente às bactérias Gram-positivas. Material testado Concentração Inibitória Mínima (ppm)
S. aur S. sap E. fae B. sub CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM
Isoeleuterina 31,25 / 1.000 125 / 1.000 500 / 1.000 31,25 / 31,25 Eleuterina 31,25 / 1.000 125 / 1.000 500 / 1.000 31,25 / 62,50 Legenda: S. aur – S Staphylococcus aureus; S. sap – S Staphylococcus saprophyticus; E. fae – Eenterococcus faecalis; B. sub – Bacillus subtilis. Tabela 6 – Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) da Isoeleuterina e Eleuterina frente às bactérias Gram-negativas. Material testado Concentração Inibitória Mínima (ppm)
E. coli S. typ P. aer CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM
Isoeleuterina >1.000 / >1.000 62,50 / 1.000 >1.000 / >1.000 Eleuterina >1.000 / >1.000 125 / 1.000 >1.000 / >1.000 Legenda: E. coli – Escherichia coli; S. typ – Salmonella typhimurium; P. aer – Pseudomonas aeruginosa.
A isoeleuterina foi considerada possuidora de boa atividade antibacteriana
frente a S. aureus, B. subtilis e S. typhimurium, já a eleuterina obteve boa atividade
para S. aureus e B. subtilis. Para E. faecalis as duas substâncias foram
58
consideradas com moderada atividade antibacteriana e para as demais bactérias
testadas as duas substâncias foram consideradas inativas.
Em relação a concentração bactericida mínima, destaca-se o resultado obtido
contra B. subtilis, a CIM e a CBM obtiveram o mesmo valor de 31,25 ppm para a
isoeleuterina.
Um agente bactericida é preferível a um agente bacteriostático, os
organismos que permanecem vivos na presença do fármaco ainda podem causar
dano ao hospedeiro, seja por continuarem a produzir toxina, seja por se tornarem
resistentes ao medicamento e, eventualmente, retomarem o crescimento. Foi
demonstrado que as substâncias bactericidas são as que atuam melhor quando as
defesas do organismo são insuficientes para eliminar os agentes invasores
(SCHLESSINGER; EISENSTEIN, 2002).
A avaliação da atividade antifúngica das substâncias isoeleuterina e
eleuterina frente aos fungos leveduriformes e filamentosos testados encontram-se
nas tabelas 7 e 8 respectivamente.
59
Tabela 7 – Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração fungicida mínima (CFM) da Isoeleuterina e Eleuterina frente a fungos leveduriformes. Material testado Concentração Inibitória Mínima (ppm)
C. alb C. tro C. gla C. par C. kru C. neo S. cer CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM
Isoeleuterina 250 / 1.000 250 / 1.000 250 / 1.000 500 / 1.000 125 / 250 31,25 / 31,25 125 / 500 Eleuterina 250 / 500 125 / 1.000 250 / 1.000 250 / 1.000 125 / 250 31,25 / 125 125 / 1000 Legenda: C. alb – Candida albicans; C. tro – Candida tropicalis; C. gla – Candida glabrata; C. par – Candida parapsilosis; C. kru – Candida krusei; C. neo – Cryptococcus neoformans e S. cer – Saccharomices cerevisiae. Tabela 8 – Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração fungicida mínima (CFM) da Isoeleuterina e Eleuterina frente a fungos filamentosos. Material testado Concentração Inibitória Mínima (ppm)
A. fla A. nig A. fum Rhi M. gyp E. flo T. rub T. men CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM CIM / CFM
Isoeleuterina 250 / 500 15,62 / 500 62,5 / 500 125 / 500 31,25 / 125 125 / 500 >1000 >1000 Eleuterina 250 / 500 62,5 / 500 125 / 125 500 / 1000 62,50 / 62,50 125 / 250 >1000 >1000 Legenda: A. fla – Aspergillus flavus; A. nig – Aspergillus niger; A. fum – Aspergillus fumigatus; Rhi – Rhizopus sp; M. gyp – Microsporum gypseum; E. flo – Epidermophyton floccosum; T rub –Trichophyton rubrum e T. men – Trichophyton mentagrophyte
60
Em relação as leveduras, a isoeleteurina e eleuterina foram consideradas com
moderada atividade antifúngica para todas as espécies de Candida avaliadas e
também para a espécie S. cerevisiae. Apresentou boa atividade apenas frente a C.
neoformans com CIM de 31,25 ppm. As leveduras do gênero Candida e o
Cryptococcus neoformans são considerados entre os principais causadores de
patologias fúngicas oportunistas.
Frente ao ensaio de CFM desta-se a eleuterina contra A. fumigatus com CFM
de 125 ppm e M. gypseum com CFM de 62,5 ppm, estes resultados foram
equivalentes ao ensaio de CIM. A diferença entre os valores de CIM e CFM para os
outros microorganismos foram pequenas, indicando que a planta possui atividade
fungicida próxima do ponto de inibição do respectivo fungo.
As leveduras do gênero Candida são responsáveis por até 78% dos casos de
infecções nosocomiais por fungos (MAROL; YUCESOY, 2007). Segundo alguns
autores as várias espécies de Candida são a quarta ou terceira principal causa de
septicemia na América (EDMOND et al., 1999; NG et al., 2000; FRIDKIN et al., 2006;
WENZEL; GENNINGS, 2005; CATARINO et al., 2013).
A criptococose trata-se de uma micose extremamente grave que ocorre com
grande frequência em pacientes imunodeprimidos, geralmente acometendo os
pulmões e o sistema nervoso central. O fungo atinge o organismo através do trato
respiratório, podendo causar lesões tegumentares, viscerais ou meningoencefálicas
(LACAZ et al., 2002; SCHAECHTER et al., 2002). Os tratamentos que existem hoje
são agressivos e estão apresentando um aumento de cepas resistentes. Foram
estudadas alternativas como uma tentativa para a bioprospecção do fármaco
antifúngico, desde o aparecimento de casos de resistência. Portanto, existe
necessidade de procurar novas alternativas para agentes antifúngicos. A utilização
de imunoterapia, terapia fotodinâmica e a busca por novas moléculas está ocorrendo
a partir de peptídeos de plantas (GULLO et al., 2013).
Frente aos fungos filamentosos, as substâncias isoeleuterina e eleuterina
tiveram boa atividade contra M. gypseum e moderada atividade contra E. flocosum.
Estes micro-organismos são dermatófitos e quando acomete seres humanos
provoca lesões inflamatórias e impetiginosas (FISHER; COOK, 2001).
A isoeleuterina teve boa atividade antifúngica frente ao A. niger e A.
fumigatus, já a eleuterina apresentou moderada atividade antifúngica e ambas
apresentaram moderada atividade frente ao A. flavus. A aspergilose inclui um
61
amplo espectro de doenças provocadas por fungos do gênero Aspergillus, com
manifestações clínicas que variam de colonização (por exemplo, aspergiloma), a
aspergilose broncopulmonar alérgica e outras formas disseminadas de infecção.
Apesar do progresso significativo alcançado na gestão desta infecção grave,
permanecem extremamente difíceis a sua prevenção, diagnóstico e terapia,
tornando-a uma das principais causas de morte entre os pacientes
imunocomprometidos (CUNHA et al., 2013).
5.2 Bioautografia
Como a bioautografia é um método útil para a localização de substâncias com
ação antimicrobiana em um cromatograma de extratos e ou frações de produtos
naturais somente foi avaliada a C. ambrosioides. A bioautografia contribui para a
localização e isolamento de substâncias ativas. Esta técnica é útil para substâncias
solúveis em meio aquoso, pois durante a incubação da placa as substâncias
deverão ultrapassar o meio de cultura por difusão, formando zonas de inibição de
crescimento microbiano (SOUZA et al., 2003).
O ensaio de bioautografia foi realizado com a bactéria S. aureus e a levedura
C. albicans, que mostraram boa sensibilidade aos componentes da C. ambrosioides.
O critério empregado para interpretação dos resultados da bioautografia foi o
aparecimento de zonas ou halos de inibição em torno das substâncias isoladas na
CCD, indicando a respectiva atividade antimicrobiana (RAHALISON et al., 1994).
Ensaios preliminares de atividade antimicrobiana de C. ambrosioides
demonstraram a atividade biológica somente do óleo essencial. Os demais extratos
brutos etanólicos de folhas, raiz e caule, suas frações diclorometano, acetato de etila
e butanol do extrato etanólico das folhas e do hidrolato foram considerados inativos.
Com a finalidade de facilitar a identificação de substâncias ativas com
atividade antimicrobiana foi realizada a bioautografia do óleo essencial, extratos,
frações e hidrolatos da C. ambrosioides. Os ensaios bioautográficos apesar de
qualitativos são uma ferramenta importante no auxílio para o isolamento e
identificação de substâncias ativas.
No ensaio bioautográfico foram testados diversos sistemas de solventes para
a obtenção dos cromatogramas com resolução suficiente para observação de
substâncias isoladas. Os sistemas de solventes que apresentaram as melhores
62
resoluções dos cromatogramas foram: hexano e acetato de etila (9:1) para a placa A
e hexano e acetato de etila (6:4) para a placa B.
Este trabalho revelou que o óleo essencial de C. ambrosioides exibe atividade
antimicrobiana como podemos observar na figura 9, com aparecimento de halos de
inibição. Previamente no ensaio de CIM foi verificado que o óleo essencial é ativo
contra a levedura C. albicans, e através do bioautograma foi observado um halo de
inibição com Rf (índice de retenção) de uma substância ainda desconhecida.
No bioautograma o ascaridol utilizado como referência não apresentou halos
de inibição para C. albicans, portanto inativo frente à esta levedura.
Devido ao alto teor de p-cimeno (42,32%) e ascaridol (49,77%) encontrado no
óleo essencial de C. ambrosioides, e sabendo que o ascaridol não apresentou
atividade frente a C. albicans e sabendo-se que o p-cimeno tem sido relatado como
agente que possui atividade antimicrobiana (ULTEE; BENNIK; MOEZELAAR, 2002),
sugere-se que a atividade do óleo essencial da C. ambrosioides provavelmente se
deve ao seu conteúdo em p-cimeno. Para confirmar tal suspeita é necessário
identificar quimicamente a(s) substância(s) responsál(eis) pelo halo de inibição.
Figura 9 - Bioautograma do óleo essencial, extratos, frações e hidrolatos da C. ambrodioides frente a S. aureus.
Legenda: Placa A: 1- Extrato das folhas EtOH; 2 – Óleo essencial; 3 – CAA38 (Ascaridol) Placa B: 4 – Extrato das folhas EtOH; 5 - P. DCM EtOH; 6 - P. DCM H.; 7 - P. BUT EtOH; 8 - P. BUT H.; 9 - P. AE EtOH e 10 - P. AE H.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Placa A Placa B
63
5.3 Avaliação do mecanismo de membrana celular
Considerando os resultados obtidos do óleo essencial de C. ambrosioides
frente aos micro-organismos foi realizado um estudo preliminar para verificar seu
mecanismo de ação.
De modo geral, os agentes antimicrobianos podem manifestar sua atividade
por vários mecanismos, os quais podem ser descritos como: inibidores de síntese de
parede celular, inibição da síntese de proteínas, inibição da síntese de ácidos
nucléicos, inibidores do ácido fólico e inibidores de membrana celular (FONSECA,
1999; SCHAECHTER et al., 2002; SOUZA et al., 2003).
Para avaliação da inibição da função da membrana celular, foi empregada a
cepa da bactéria Gram–positiva S. aureus, e o antimicrobiano Polimixina B (100
µg/mL) como controle positivo, e verificada a condutividade elétrica das amostras
através do método de Ye e colaboradores (2005). Segundo Xing e colaboradores
(2008) quando a integridade da membrana citoplasmática é rompida, pequenos íons
como K + e PO4-3 evadem-se seguidos por macromoléculas como DNA e RNA, além
de outros materiais, ocorrendo a lesão ou morte celular. A liberação destes
compostos intracelulares pode ser verificada através do aumento da condutividade
elétrica indicando com isso um dano na membrana celular. As polimixinas são
exemplos desse mecanismo, na inibição da membrana celular.
Foi verificado um aumento gradativo na condutividade da Polimixina B quando
a solução bacteriana foi adicionada. Por se tratar de um antimicrobiano inibidor da
função da membrana celular, devido a sua atividade detergente, é capaz de diminuir
a integridade da membrana, levando a perda de componentes essenciais
citoplasmáticos e conseqüente morte bacteriana (PLORDE, 1994; ROSSI;
ANDREAZZI, 2005).
Observamos que nas concentrações mais baixas do óleo essencial de C.
ambrosioides não houve dano celular, pois não ocorreu condutividade elétrica. À
medida que aumentamos a concentração do óleo essencial a diferença nas
condutividades elétricas também aumentaram, esta diferença comprova que quando
há um aumento na condutividade elétrica da suspensão celular a membrana
citoplasmática é rompida causando dano celular e ainda observamos um
comportamento dose dependente a partir de 6.250 ppm até 12.500 ppm, que é
explicado através do valor de 6.250 ppm na CIM. Assim, os resultados demonstram
64
que o óleo essencial de C. ambrosioides tem ação na membrana bacteriana.
Podemos observar os resultados na figura 11.
Figura 11 – Condutividade elétrica do Óleo essencial de C. ambrosioides frente a S. aureus.
65
66
CONCLUSÕES
• Os extratos brutos, frações, óleo essencial e hidrolatos de Chenopodium
ambrosioides apresentaram atividade antibacteriana e antifúngica.
• Os menores valores de CIM encontrados na planta C. ambrosioides foram
encontrados no óleo essencial, com CIM de 3.125 ppm contra a bactéria
Bacillus subtilis, CIM de 390,62 ppm contra a levedura Candida albicans e
CIM de 390,62 ppm contra o fungo filamentoso Aspergillus niger.
• No ensaio bioautográfico foi encontrada uma zona de inibição com Rf de uma
substância desconhecida frente à levedura C. albicans, esta substância ainda
não foi identificada.
• Através do modelo de permeabilidade de membrana, foi verificado que
provavelmente o óleo essencial de C. ambrosioides atua na função de
membrana celular.
• As substâncias isoladas da espécie Cipura paludosa, a isoeleuterina e
eleuterina apresentaram promissora atividade inibitória frente as bactérias
Gram-positivas Staphylococcus aureus e B. subtilis (CIM de 31,25 ppm), e
também frente a bactéria Gram-negativa Salmonella typhimurium (CIM de
62,5 ppm). O melhor resultado entre as leveduras foi frente ao Cryptococcus
neoformans com CIM de 31,25 ppm. Apresentaram moderada atividade
antifúngica frente a todas as espécies de Candida testadas. Entre os fungos
filamentosos damos destaque para a isoeleuterina que apresentou CIM de
15,62 ppm frente ao A. niger.
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