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Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas Integradas Área de Concentração em Odontologia
HÉVELIN COUTO PIMENTA
POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE MEDICAÇÕES INTRACANAIS A BASE DE PRÓPOLIS MARROM SOBRE Enterococcus faecalis
Cuiabá, 2013
HÉVELIN COUTO PIMENTA
POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE MEDICAÇÕES INTRACANAIS A BASE DE PRÓPOLIS MARROM SOBRE Enterococcus faecalis
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas, Área de Concentração Odontologia. Orientadora: Profª. Drª. Andreza Maria Fabio Aranha.
Cuiabá, 2013
FICHA CATALOGRÁFICA Catalogação na Fonte
Bibliotecárias Patrícia Jaeger / CRB1-1736
Valéria Oliveira dos Anjos / CRB1-1713
P644p Pimenta, Hévelin Couto.
Potencial antimicrobiano de medicações intracanais a Base de Própolis Marrom sobre Enterococcus faecalis / Hévelin Couto Pimenta – Cuiabá: Universidade de Cuiabá - UNIC, 2013.
103 f. : il. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, para obtenção do título de Mestre em Ciências Ontológicas.
Orientadora: Profª Drª Andreza Maria Fábio Aranha. 1. Odontologia 2. Própolis. 3. Necrose – polpa dentária 4. Ação antimicrobiana. 5.
Tratamento Endodôntico. 6. Medicação intracanal 7. Enterococcus faecalis. 8. Título. II. Pimenta, Hévelin Couto III. UNIC.
CDU: 616.314-089.818.1
HÉVELIN COUTO PIMENTA
POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE MEDICAÇÕES INTRACANAIS A BASE DE PRÓPOLIS MARROM SOBRE Enterococcus faecalis
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá – UNIC como requisito para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas – Área de Concentração Odontologia. Orientadora Profª. Drª. Andreza Maria Fabio Aranha.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Orientadora: Profª. Drª. Andreza Maria Fabio Aranha
______________________________________ Membro Titular: Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges
__________________________________________ Membro Titular: Profª. Drª Ivana Maria Póvoa Violante
Cuiabá, 22 de Fevereiro de 2013.
Conceito Final: _____________
Dedico este trabalho primeiramente a Deus, por ter me dado o dom da vida e a oportunidade de ter chegado até aqui e a
todas as pessoas que realmente acreditaram na minha conquista, que
sempre me incentivaram e deram apoio para enfrentar e superar as dificuldades
encontradas.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Hermano e Neuza, e aos meus irmãos, Denisson, Leonardo e Graziela, pelo amor, carinho, pelos conselhos, educação e principalmente por estarem sempre ao meu lado, apoiando minhas escolhas. Amo vocês!
Ao meu noivo, Diego, pela amizade, carinho, amor e companheirismo, sempre me incentivando a nunca desistir. Amo você!
Agradeço de coração minha orientadora Prof ªDrª Andreza Maria Fabio Aranha pelo voto de confiança, orientação, paciência, amizade, dedicação em todos os momentos. Sinto-me privilegiada pela oportunidade de poder trabalhar com você, por tudo que você representa como pessoa e profissional. Sempre agradecida.
A Profª Drª Ivana Maria Póvoa Violante pela orientação, dedicação e profissionalismo e, sobretudo pela amizade e compreensão, bem como todo o pessoal do laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Cuiabá, Geraldo Neto, Eufrásia, Daniele e Dona Maria pelo auxílio e orientações.
Ao Prof. Dr. Carlo Ralph de Musis pela análise estatística do presente estudo, por sua atenção e disponibilidade.
Ao Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges, coordenador do curso de Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas pela organização e qualidade do Curso e a todos os professores do Programa por tudo o que nos ensinaram com tanto carinho e dedicação.
A todos os meus colegas de classe pelo intenso aprendizado e amizade nesses dois anos, em especial Maura Dorileo, Wissem Khalil e Carlos Antunes.
Às alunas da graduação da FOC-UNIC Priscila Vieira e Paula Gilioli pelo auxílio durante os experimentos.
Aos membros do Grupo de Pesquisa (GPQ), Coordenado pela Profª Drª Andreza Aranha, pelas discussões de trabalhos científicos e sugestões durante a execução de minha pesquisa.
Ao Sr. Catarino da Biomendes Cosméticos de Produtos Naturais pela coleta da própolis marrom no Apiário de Nossa Senhora do Livramento.
Ao Prof. Dr. Rogério Alexandre Rans, pela atenção e disponibilização de materiais necessários para o desenvolvimento da pesquisa.
Às funcionárias da seção de pós-graduação, Dora e Cátia, por resolverem toda a parte burocrática relacionada a relatórios, documentos, elaboração de Bancas Examinadoras, matrícula e pelo excelente trabalho.
Ao funcionário do laboratório de Odontologia, Nelson, pela disponibilidade e auxílio.
À funcionária da Microbiologia da UNIC, Nika, por todo auxílio durante a realização dos experimentos.
Aos funcionários do Laboratório de Bioquímica e Pesquisa da Faculdade de Medicina da UFMT pela disponibilização do Leitor de Elisa utilizado na fase experimental do estudo.
Às Faculdades de Odontologia e Farmácia Bioquímica, nas pessoas dos respectivos Diretores, Prof. Dr. Fábio Luís Miranda Pedro e Angela Marcia Selhorst e Silva Beserra onde foi desenvolvido este projeto.
Aos meus pacientes, que compreenderam minha ausência no consultório.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho.
MUITO OBRIGADA!
“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito
nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem
nem vitória, nem derrota.” (Theodore Roosevelt)
RESUMO
RESUMO PIMENTA, H. C. Potencial antimicrobiano de medicações intracanais a base de própolis marrom sobre Enterococcus faecalis. 2013. 103 f. Dissertação (Mestrado) – Pós-Graduação em Ciências Odontológicas Integradas, Universidade de Cuiabá-UNIC, Cuiabá, 2013. Clinicamente, o preparo biomecânico e agentes químicos auxiliares não são capazes de eliminar completamente os microrganismos presentes no sistema de canais radiculares. Portanto, a ação de uma medicação intracanal com atividade antimicrobiana eficaz contra patógenos resistentes, é necessária. A própolis é um produto natural produzido por abelhas, composta principalmente por cera e resinas, que apresenta propriedades terapêuticas como antinflamatória, antimicrobiana, anestésica, antioxidante, imuno-estimulatória, antitumoral e cicatrizante. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana de medicações intracanais a base de própolis marrom sobre Enterococcus faecalis por meio dos métodos da microdiluição em caldo e da infecção e desinfecção de dentina bovina. Trinta espécimes de dentes incisivos centrais bovinos recém-extraídos foram preparados e infectados in vitro por 21 dias com E.faecalis. Os espécimes foram divididos aleatoriamente em 6 grupos (n=5) de acordo com a medicação intracanal utilizada: G1: pasta de hidróxido de cálcio, G2: Polietilenoglicol (controle negativo), G3: extrato de própolis 20%, G4: extrato de própolis 40%, G5: extrato de própolis 20% + pasta de hidróxido de cálcio e G6: extrato de própolis 40% + pasta de hidróxido de cálcio. As medicações foram inseridas nos lumens dos canais radiculares e mantidas por 14 dias. Raspas de dentina foram coletadas com brocas esféricas em baixa rotação dos canais e colocadas em tubos de ensaio contendo meio BHI. O crescimento bacteriano foi avaliado por espectrofotometria após 15 dias. Todas as medicações experimentais reduziram significantemente o número de bactérias. As pastas G4 e G5 foram mais eficazes do que a G1 com inibição do crescimento bacteriano de 35,8%, 41% e 21,3%, respectivamente. Conclui-se que a própolis pode ser uma alternativa para tratamento de infecções endodônticas persistentes. Palavras-chave: Própolis. Necrose da polpa dentária. Produtos com ação antimicrobiana.
ABSTRACT
ABSTRACT
PIMENTA H.C. Antimicrobial potential of intracanal medications based on brown propolis against Enterococcus faecalis. 2013. 103 f. Dissertation (Master’s Program) - Postgraduate Dental Science Integrated, University of Cuiabá-UNIC, Cuiaba, 2013. Under clinical conditions, a biomechanical preparation and endodontic disinfectants do not completely eliminate the microorganisms present in the root canal system; therefore, the action of an intracanal medication with effective antimicrobial activity against resistant pathogens is necessary. Propolis is a honeybee product, composed mainly by wax and resins. The latter have a plant origin and contain substances with therapeutic properties, such as anti-inflammatory, antimicrobial, anesthetic, antioxidant, immune-stimulating, anti-tumor and healing. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of intracanal medications based on brown propolis against Enterococcus faecalis by broth microdilution and infection and disinfection of bovine dentin methods. Thirty dentine tubes prepared from intact freshly extracted bovine maxillary central incisors were infected in vitro for 21 days with E. faecalis. The specimens were divided into six groups, according to the intracanal medicament used, as follows: G1: calcium hydroxide in a viscous vehicle (Carbowax 400); G2: Carbowax 400 (control group); G3: 20% propolis extratct; G4: 40% propolis extract; G5: 20% propolis extract + calcium hydroxide paste; G6: 40% propolis extract + calcium hydroxide paste. The medicaments were placed into the canal lumen and left there for 14 days. Dentine chips were removed from the canals with sequential sterile round burs at low speed and collected in separate test tubes containing BHI broth. The microbial growth was analyzed by spectrophotometry after 15 days. All experimental agents significantly reduced the number of the cultivable bacteria. G4 and G5 pastes were more effective than G1 paste, showing 35.8%, 41% e 21.3% antibacterial action, respectively. It can be concluded that propolis may be an alternative for the treatment of resistant endodontic infections.
Keywords: Propolis. Necrosis of the dental pulp. Products with antimicrobial.
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Apresentação dos grupos experimentais, das medicações intracanais e suas respectivas proporções de manipulação. .................................... 64
Tabela 2 - Análise do pH das medicações intracanais testadas. ............................ 74
Tabela 3 - Análise descritiva dos dados referente ao crescimento bacteriano, considerando a variável medicação intracanal. ...................................... 75
Tabela 4 - Análise de variância para o crescimento bacteriano. ............................. 75
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Própolis marrom bruta triturada. ........................................................... 59
Figura 2 - (A-D) Preparo do extrato bruto etanólico da própolis marrom: (A) Extração da própolis bruta com 2L de álcool de cereais a 80%; (B) Homogeneização da solução com auxílio do ultrassom; (C) Concentração do extrato etanólico da própolis marrom em rotaevaporador. (D) Extrato bruto da própolis marrom. ........................ 60
Figura 3 - Extratos da própolis marrom em diferentes concentrações solubilizados em DMSO: 200mg/mL (1); 100 mg/mL (2); 50 mg/mL (3); 20 mg/mL (4).................................................................................. 61
Figura 4 - Representação esquemática da microplaca na determinação da CIM dos extratos da própolis marrom, utilizando a técnica da resazurina. .. 62
Figura 5 - Medicações intracanais preparadas para os testes microbiológicos: G1- Pasta de Hidróxido de Cálcio (Pasta base), G2- Polietilenoglicol 400, G3- Extrato de Própolis 20%, G4- Extrato de Própolis 40%, G5- Extrato de Própolis 20% + Pasta de Hidróxido de Cálcio e G6- Extrato de Própolis 40% + Pasta de Hidróxido de Cálcio. .................... 64
Figura 6 - Incisivo central bovino íntegro recém extraído. .................................... 65
Figura 7 - (A-B) Dimensões dos espécimes de dentina bovina. (A) Desenho esquemático do preparo dos espécimes; (B) Espécime de dentina bovina. .................................................................................................. 66
Figura 8 - (A-D) Preparo dos espécimes para avaliação da desinfecção dos espécimes de dentina contaminados pelas medicações intracanais estudadas: (A) Espécimes infectados com Enterococcus faecalis. (B) Posicionamento da cera descontaminada no interior da placa de cultura com 24 poços para posterior fixação dos espécimes; (C) e (D) Espécimes posicionados sobre a cera utilidade e espaço intracanal radicular preenchido por medicação experimental. ............. 69
Figura 9 - (A-B) Método de avaliação da desinfecção de dentina bovina. (A) Obtenção de raspas de dentina por meio de brocas esféricas em baixa rotação; (B) Aumento progressivo da largura do canal em função da troca das brocas. ................................................................. 70
Figura 10 - Tubos de ensaio contendo as brocas n° 6 e nº8 e espécime, respectivamente, após a remoção das raspas de dentina. .................. 70
Figura 11 - Representação esquemática da microplaca na determinação da taxa de crescimento bacteriano por espectrofotometria, utilizando resazurina como revelador. .................................................................. 71
Figura 12 - Representação gráfica dos intervalos de confiança de 95% para a taxa de inibição do crescimento bacteriano de acordo com as medicações intracanais testadas. ........................................................ 77
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC American type culture collection
BHI Brain heart infusion
Ca(OH)2 Hidróxido de Cálcio
CBM Concentração bactericida mínima
CIM Concentração inibitória mínima
CHX Clorexidina
CLFR Cromatografia líquida de fase reversa
DMSO Dimetil-sulfóxido
EEP Extrato etanólico de própolis
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
E. faecalis Enterococcus faecalis
g grama
GTF Glicosiltransferase
GS/MS Espectrofotometria de massa gasosa
LTA Ácido lipopoliteicóico
h hora
HC Hidróxido de cálcio
Hela Linhagem celular de adenocarcinoma
H-fr Fração hexânica
µg micrograma
mg miligrama
mL mililitro
mm milímetro
MH Muller-Hinton
MEV Microscopia eletrônica de varredura
n Amostra
NaOCl Hipoclorito de sódio
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
PAA Periodontite apical aguda
PAC Periodontite apical crônica
PAE Periodontite apical exacerbada
PCR Reação em cadeia da polimerase
PEG Polietilenoglicol
pH Potencial hidrogeniônico
PMCC Paramonoclorofenol canforado
RCM Ágar para clostrídeos
TSB Caldo peptona caseína e soja
TSBY Caldo tripticase soja suplementado com extrato de levedura
UFC Unidade formadora de colônia
UNIC Universidade de Cuiabá
UFMT Universidade Federal do Mato Grosso
SUMÁRIO
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 21
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 25
2.1 INFECÇÃO DA POLPA DENTÁRIA .................................................................... 25
2.1.1 Biofilme dos canais radiculares .................................................................... 26
2.1.2 Enterococcus faecalis.................................................................................... 30
2.1.3 Agentes antimicrobianos ............................................................................... 33
2.1.3.1 Agentes irrigantes.......................................................................................... 34
2.1.3.2 Medicações intracanais ................................................................................. 37
2.2 PRÓPOLIS .......................................................................................................... 42
2.2.1 Composição química ..................................................................................... 43
2.2.2 Atividade antimicrobiana ............................................................................... 45
2.2.3 Biocompatibilidade ........................................................................................ 54
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 57
3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 57
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 57
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 59
4.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO DA PRÓPOLIS MARROM ........................ 59
4.2 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE MEDICAÇÕES INTRACANAIS A BASE DA PRÓPOLIS MARROM .................................................. 60
4.2.1 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ............................. 60
4.2.1.1 Obtenção dos inóculos bacterianos .............................................................. 62
4.2.2 Preparo das medicações intracanais ........................................................... 63
4.2.3 Infecção e desinfecção de dentina bovina ................................................... 65
4.2.3.1 Preparo dos espécimes ................................................................................. 65
4.2.3.2 Tratamento da dentina para remoção de smear layer ................................... 66
4.2.3.3 Esterilização dos espécimes ......................................................................... 67
4.2.3.4 Preparo dos inóculos e contaminação bacteriana dos espécimes ................ 67
4.2.3.5 Avaliação da desinfecção dos espécimes de dentina contaminados pelos extratos ........................................................................................................... 68
4.3 TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS ......................................... 71
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 74
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 79
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 88
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 90
1 INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento da inflamação dos tecidos pulpar e periapicais é
decorrente, da presença de bactérias e de seus produtos (KAKEHASHI; STANLEY;
FITZGERALD, 1965; SUNDQIVIST, 1976) e, da resposta do hospedeiro a eles.
(NAIR, 1997). Os microrganismos podem atingir a câmara pulpar e os tecidos
periapicais através da exposição dos túbulos dentinários à microflora bucal por
lesões de cárie ou traumas dentários, presença de bolsa periodontal, anacorese e
infecção periapical de dentes adjacentes (ESTRELA, 2009). Mais de 500 espécies
de microrganismos são conhecidas por colonizar a cavidade bucal humana
(ESTRELA, 2004). Com a infecção do tecido pulpar, este pode tornar-se necrótico,
tornando o sistema de canais radiculares um ambiente propício para o
estabelecimento, no terço apical da raiz, de uma microflora bacteriana mista,
predominantemente anaeróbia, rica em Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella,
Eubacterium e Peptostreptococcus. (SHAH; COLLINS, 1990).
A sanificação do sistema de canais radiculares infectados tem sido uma
constante preocupação na Endodontia (ESTRELA et al., 2012), a qual é suportada
por estudos sobre a eficácia da instrumentação mecânica, a influência da utilização
de meios auxiliares, como os agentes irrigantes, medicações intracanais e
sistêmicas, na busca de alternativas de tratamento antimicrobiano para as patologias
pulpares (SOUZA FILHO et al., 2008; BHUVA et al., 2010; JAMB; NIKHIL; SINGH,
2010; RÔÇAS; SIQUEIRA, 2011; VAGHELA et al., 2011; POGGIO et al., 2012). O
preparo biomecânico do sistema de canais radiculares reduz significativamente os
microrganismos predominantes na microbiota endodôntica (BYSTROM;
SUNDQVIST, 1981; PETERS; WESSELINK; VAN WINKELHOFF, 2002), porém é
incapaz de promover a completa desinfecção de algumas áreas devido às
complexidades anatômicas, fazendo com que os microrganismos persistentes
sobrevivam se multipliquem e, reinfectem o espaço pulpar. (BYSTROM;
CLAESSON; SUNDQVIST, 1985; GOMES; DRUCKER; LILLEY, 1994; SIQUEIRA;
LOPES, 1999).
O Enterococcus faecalis é uma bactéria gram-positiva, anaeróbia
facultativa, frequentemente isolada em canais radiculares de dentes previamente
obturados, que apresentam infecções secundárias (SIQUEIRA; RÔÇAS, 2004;
22
SEDGLEY et al., 2006). É considerado um patógeno endodôntico persistente por
sua capacidade de tolerar baixos níveis de oxigênio e nutrientes, pH extremos,
promover formação de biofilme bacteriano, bem como oferecer resistência a
antibióticos (DOLAN; COSTERTON, 2002). O Enterococcus faecalis é responsável
por um terço das lesões periapicais (MOLANDER et al., 1998), tornando seu
controle e eliminação, um desafio para o sucesso do tratamento endodôntico.
A medicação intracanal deve ser capaz de eliminar os microrganismos
que sobrevivem ao preparo biomecânico, controlar o exsudato inflamatório
persistente, ser biocompatível aos tecidos periapicais e possuir ação destrutiva dos
osteoclastos presentes na reabsorção radicular externa (ESTRELA et al., 1995),
bem como neutralizar os produtos tóxicos residuais do preparo biomecânico e
apresentar amplo espectro (LEONARDO, 1999). O hidróxido de cálcio tem sido a
medicação intracanal mais utilizada em função de suas propriedades antimicrobiana,
de promover o selamento físico provisório do canal radicular e potencial osteogênico
(BARRETO; LUISI; FACHIN, 2005), entretanto há evidências da resistência do
Enterococcus faecalis ao hidróxido de cálcio. (LOVE, 2001; EVANS et al., 2002).
Baseado nas evidências da dificuldade do controle do biofilme
endodôntico pela técnica convencional do preparo biomecânico, a busca por
substâncias biocompatíveis que sejam eficazes contra patógenos resistentes, como
o Enterococcus faecalis, é crescente. (ESTRELA; HOLLAND, 2003; WATAHA, 2005;
FERREIRA et al., 2007; GARCIA et al., 2011).
A própolis é um produto resinoso produzido pelas abelhas da espécie
Apis mellifera, cuja composição depende do clima da região, da flora e da época do
ano em que é coletada (GREENAWAY; SCAYSBROOK; WHATLEY, 1990;
BANKOVA et al., 1992; PARK et al., 1997). Existem diferentes tipos de própolis que
são caracterizadas e classificadas de acordo com a sua composição química (PARK
et al., 2000). Os principais componentes da própolis são os flavonóides, ácidos
fenólicos e graxos, esteróides, aminoácidos, entre outros (KUMAZAWA et al., 2003;
HU, 2005; HAYACIBARA, 2005). Os flavonóides e ácidos fenólicos são descritos
como responsáveis pelas propriedades biológicas terapêuticas da própolis. (VOLPI;
BERGOZINI, 2006).
Na odontologia, a própolis tem sido utilizada como agente anticárie
(HENO; IKENO; MIYAZAWA, 1991), meio de armazenamento de dentes
23
avulsionados (MARTIN; PILEGGI, 2004; GOPIKRISHNA et al., 2008), agente de
capeamento pulpar (SABIR et al., 2005) e como selante para hipersensibilidade
dentinária (ALMAS; MAHMOUD; DAHLAN, 2001), em função de suas propriedades
imunoestimulatória, antioxidante, antinflamatória e antimicrobiana (BANKOVA;
POPOV.; MAREKOV, 1982; HOFFMANN et al., 1998; OTA et al., 1998; PARK; KOO;
IKEGAKI, 1998; MANARA et al., 1999; GERALDINI; SALGADO; RODE, 2000;
SFORCIN et al., 2000; BANSKOTA; TEZUKA; KADOTA, 2001). Há evidências de
que a própolis seja biocompatível aos tecidos periapicais (AL SHAHEER et al., 2004;
GARCIA et al., 2011) e apresenta grande potencial contra microrganismos
resistentes. (AWAWDEH; BERTARM; HAMMAD, 2009; KANDASWAMY et al., 2010;
KAYAOGLU et al., 2011; MADHUBALA; SRINIVASAN; AHAMED, 2011).
Desta forma, foi de interesse, no presente estudo, investigar o potencial
antimicrobiano da própolis marrom como medicação intracanal no tratamento de
infecções endodônticas com Enterococcus faecalis.
2 REVISÃO DE LITERATURA
25
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 INFECÇÃO DA POLPA DENTÁRIA
A polpa dentária é formada por tecido conjuntivo indiferenciado, de origem
mesenquimatosa, vascularizado, inervado e rico em células imunologicamente
competentes (ESTRELA, 2004). As condições anatômicas da polpa dentária,
limitada por paredes inelásticas de dentina, esmalte e cemento, garantem o seu
isolamento do ambiente séptico da cavidade bucal e concomitantemente, permitem
que o tecido pulpar seja uma estrutura fragilizada frente aos agressores de natureza
biológica, física e/ou química. (ESTRELA, 2004).
Em 1894, Miller observou, pela primeira vez, a presença de bactérias no
interior do canal radicular e as associou às patologias pulpares e perirradiculares.
Esfregaços obtidos de canais radiculares com câmaras pulpares abertas e presença
de polpas necróticas foram analisados. Uma variedade ampla de formas bacterianas
(cocos, bacilos e espirilos) foi observada, bem como diferenças na localização dos
microrganismos, sendo que algumas espécies foram localizadas na câmara pulpar
enquanto que outras, no interior do canal radicular.
Kakehashi, Stanley e Fitzgerald (1965) ao utilizarem ratos como modelo
experimental, observaram o papel desempenhado pelas bactérias e seus produtos
na indução das infecções pulpares e perirradiculares. Polpas de molares de ratos
convencionais e germ free foram expostas ao meio bucal, sendo observado que nos
animais convencionais ocorreu o desenvolvimento de inflamação crônica seguida da
necrose do tecido pulpar e do desenvolvimento de lesões perirradiculares, enquanto
que nos animais germ free, a resposta pulpar foi caracterizada pela presença
mínima de inflamação e por deposição de dentina neoformada na área exposta,
demonstrando a importância da presença de microrganismos na instalação das
infecções endodônticas.
A polpa e os tecidos periapicais, ao contrário da cavidade bucal, são
áreas do hospedeiro que, em condições sadias, são estéreis sob o aspecto
microbiológico. Desta forma, a presença de microrganismos nestes tecidos é um
referencial sugestivo do desenvolvimento da doença. (FIGDOR; DAVIES;
26
SUNDQVIST, 2003).
Os microrganismos utilizam as seguintes vias de acesso para colonizarem
o sistema de canais radiculares: túbulos dentinários a partir da expansão da lesão
cariosa ou durante intervenções odontológicas; cavidade aberta pela exposição
pulpar direta de origem traumática ou iatrogênica; microrganismos do sulco gengival
podem atingir a câmara pulpar, utilizando um canal lateral ou o forame apical
(membrana periodontal) e corrente sanguínea, nos casos da ocorrência de
bacteremia e septicemia; Extensão,a partir de dentes adjacentes infectados. (NAIR,
2004).
Inicialmente, na polpa dentária, uma resposta inflamatória aguda de curta
duração ocorre na presença de bactérias com conseqüente reabsorção óssea na
região periapical imperceptível ao exame radiográfico (NAIR, 1997; 2004). Na
ausência do tratamento endodôntico e do controle bacteriano, mediadores
inflamatórios são liberados, intensificando a resposta imune e inflamatória local e a
reabsorção óssea (NAIR, 1997; 2004). Neste momento, a lesão periapical incipiente
pode evoluir para cura espontânea, intensificação do processo inflamatório e avanço
para o interior do osso, formação de abscesso primário, fistulação ou pode tornar-se
crônica. (NAIR, 2004).
2.1.1 Biofilme dos Canais Radiculares
Cerca de 500 espécies microbianas habitam a cavidade bucal humana
(ESTRELA, 2004), as quais buscam por um nicho e nutrição. A princípio, todas as
espécies bacterianas têm a possibilidade de penetrarem no sistema de canais
radiculares (SUNDQVIST, 1992). No entanto, a característica mais marcante da flora
endodôntica é o número relativamente pequeno de espécies que são isolados de
canais radiculares infectados. (NAIR, 2004).
Até a metade da década de 70, em função do desconhecimento das
técnicas de anaerobiose, as investigações mostravam que os microrganismos
isolados dos canais radiculares com polpas necrosadas eram predominantemente
bactérias anaeróbias facultativas do grupo dos estreptococos, enterococos,
micrococos, difteróides, estafilococos, lactobacilos, bactérias entéricas, Candida
27
spp., Neisseria spp. e Veillonella spp. (MORSE, 1987; GOMES; DRUKER; LILLEY,
1996).
Sundqvist (1976) avaliou a microbiota de 32 canais radiculares de dentes
permanentes humanos unirradiculares com polpas necrosadas decorrentes de
injúria traumática. O autor observou que 19 dentes estavam infectados e cerca de
90% dos microrganismos isolados eram bactérias anaeróbias estritas.
Posteriormente, os resultados de Sundqvist (1976) foram confirmados
por, Byström e Sundqvist (1983), Baumgartner e Falkler (1991), os quais observaram
a presença de bactérias anaeróbias estritas nos canais radiculares infectados,
inclusive nos 5 mm apicais. Os autores sugeriram que a disponibilidade de
nutrientes e a tensão de oxigênio na região apical comparadas à porção principal do
canal radicular eram os fatores determinantes da predominância de bactérias
anaeróbias de crescimento lento na porção apical.
Tronstad, Barnett e Cervone (1990) analisaram a causa do insucesso do
tratamento endodôntico convencional em dez pacientes portadores de lesão
periapical submetidos à cirurgia parendodôntica. Durante o procedimento cirúrgico,
removeu-se aproximadamente 2 a 3 mm do ápice radicular envolvido pela lesão
periapical e as amostras foram processadas e observadas em MEV. Os autores
observaram que o cemento das raízes estava coberto por uma camada lisa e
amorfa, contínua ao ápice radicular e adjacente ao forame apical. Em maior
ampliação, foi observada nesta camada uma variedade de formas bacterianas,
confirmando a existência de um biofilme bacteriano na região, com predominância
de cocos e bacilos, sugerindo a possível causa do insucesso da terapia endodôntica.
Segundo Nair (2004), a composição da microbiota endodôntica varia
consideravelmente. Utilizando como referencial, técnicas microscópicas e de
culturas microbianas, foi observado nas infecções endodônticas, a presença de
microrganismos dos gêneros Peptostreptococcus, Actinomyces, Eubacterium,
Veillonella, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Treponema, Streptococcus,
Enterococcus, Actinomyces, Candida, entre outros.
Pinheiro et al. (2003) identificaram espécies microbianas em dentes que
apresentaram insucesso no tratamento endodôntico. Foram selecionados 60 dentes
com lesões periapicais persistentes e durante o retratamento endodôntico, amostras
28
foram coletadas do canal radicular para identificação das espécies por meio de
isolamento e técnicas de anaerobiose. A associação dos achados microbiológicos
com características clínicas foi investigada. Das espécies microbianas isoladas,
57,4% eram anaeróbias facultativas e 83,3% gram-positivas. O Enterococcus
faecalis foi o microrganismo mais observado. Os anaeróbios obrigatórios
representaram 42,6% das espécies e o gênero mais frequente foi o
Peptostreptococcus, o qual foi associado a sintomas clínicos. Associações
significativas foram observadas entre: dor ou história de dor e infecções
polimicrobianas ou anaeróbias; sensibilidade à percussão e Prevotella
intermedia/Prevotella nigrescens; presença de fístula e Streptococcus spp. ou
Actinomyces spp; dentes sem selamento coronário e Streptoccus spp. ou Candida.
Os autores concluíram que a flora microbiana de dentes que apresentam insucesso
no tratamento endodôntico foram limitados a um pequeno número de espécies
microbianas gram-positivas. Os anaeróbios facultativos, especialmente o
Enterococcus faecalis, foram os microrganismos mais comumente isolados,
entretanto infecções polimicrobianas e anaeróbios obrigatórios foram encontrados
em canais obturados com sintomatologia dolorosa.
Foschi et al. (2005) avaliaram a presença de bactérias selecionadas
(Enterococcus faecalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella
forsythensis, Treponema denticola) em canais radiculares infectados por meio da
PCR. Foram avaliados associação bacteriana e sinais clínicos da infecção
endodôntica. Amostras microbiológicas foram obtidas de 62 dentes em 54 pacientes
com infecção endodôntica. Para cada dente, dados clínicos, incluindo os sintomas
do paciente, foram coletados. Os dentes foram classificados de acordo com o
diagnóstico em periodontite apical aguda (PAA), periodontite apical crônica (PAC) e
periodontite apical exacerbada (PAE), sendo 71% dos casos de infecção primária e
29% de infecção secundária. Os resultados revelaram que o E. faecalis foi
idenificado em 24% dos casos, P. gingivalis em 13%, P. intermedia em 8% e T.
forsysthensis em 7%. A bactéria T. denticola foi detectada em 56% dos pacientes
com PAE. O E. faecalis foi encontrado em 60% dos dentes com PAE e em 72% dos
dentes com infecção secundária. Os autores concluíram que a bactéria T. denticola
foi associada a infecção endodôntica sintomática na presença de reabsorção óssea
apical. O E. faecalis foi associado ao insucesso do tratamento endodôntico. Sugeriu-
29
se que estas espécies podem desempenhar papéis críticos nas patologias
endodônticas.
Chugal et al. (2011) investigaram quais espécies bacterianas residem na
região apical de dentes humanos com periodontite apical de infecções endodônticas
primárias e secundárias por meio de técnicas de PCR. Amostras foram coletadas da
região apical de 18 dentes com necrose pulpar e 8 dentes com tratamento
endodôntico realizado. Os resultados revelaram que as espécies bacterianas da
região apical nas infecções primárias foram significativamente mais diversificadas do
que nas infecções secundárias. Os dentes que apresentavam infecção secundária
exibiram baixa similaridade na composição bacteriana enquanto que nas infecções
primárias, a composição bacteriana foi praticamente idêntica. Foi observada alta
ocorrência de fusobactérias, Actinomyces sp. e oral, Anaeroglobus geminatus em
ambos os tipos de infecções. Os casos de infecção secundária apresentaram
Burkholderiales ou Pseudomonas sp., ambos patógenos ambientais oportunistas.
Concluiu-se que certos microrganismos apresentam prevalência semelhante nas
infecções primárias e secundárias, indicando que provavelmente são erradicados
durante o tratamento endodôntico. A presença de Burkholderiales ou Pseudomonas
sp., demosntra o problema com a contaminação do ambiente. Sugeriu-se que o
tratamento parece afetar os canais radiculares de diferentes formas, resultando em
alterações da microbiota local.
Wang et al. (2012) avaliaram a flora bacteriana primária e a localização do
biofilme extrarradicular em periodontites apicais persistentes. Amostras da porção
apical foram coletadas cirurgicamente de 23 dentes que apresentaram periodontite
apical e analisadas por meio de MEV, coloração de gram Brown e Bren modificada e
anáilse da PCR. Os resultados revelaram que o biofilme extrarradicular dos dentes
tratados constitui de material amorfo extracelular com diversas espécies bacterianas,
como Actinomyces sp. oral, Propionibacterium, Prevotella sp. oral, Strepstococcus,
Porphyromonas endodontalis e Burkholderia. Actinomyces sp. oral e
Propionibacterium foram as bactérias mais freqüentes com 84,6% e 61,5%,
respectivamente, no biofilme. Concluiu-se que na superfície externa de dentes
tratados endodonticamente com lesão periapical persistente, há presença de
biofilme e que Actinomyces sp. oral e Propionibacterium são os prováveis
30
responsáveis pela formação de biofilme extrarradicular e infecção periapical
persistente.
2.1.2 Enterococcus faecalis
O Enterococcus faecalis é uma bactéria anaeróbia facultativa, gram
positiva que faz parte da microflora intestinal e comumente presente nas infecções
do trato urinário e endocárdio (SANDOE et al., 2002; DENOTTI et al., 2009). O
Enterococcus faecalis compõe um grupo de bactérias que são associadas a
infecções endodônticas, no entanto, estas espécies correspondem a uma
porcentagem muito pequena da microbiota bacteriana inicial de dentes com polpas
necróticas sem tratamento (SUNDQVIST, 1992). Entretanto, é freqüentemente
encontrado em canais obturados com sinais de periodontite crônica apical (FIGDOR;
DAVIES; SUNDQVIST, 2003) e especialmente, em dentes com infecções pós-
tratamento endodôntico. (SEDGLEY et al., 2005).
Do ponto de vista microbiológico, os enterococos apresentam poucas
exigências para o seu crescimento, sendo capazes de crescer em temperatura entre
10 a 45 °C, pH 9,6 em solução salina 6,5% e de sobreviver a 60 °C por 30 minutos
(PARADELLA; KOGA-ITO; JORGE, 2007). O E. faecalis é capaz de se manter viável
in vitro em canais radiculares por um período de 12 meses sem nutrientes adicionais
e sob várias condições experimentais não-favoráveis, como quando exposto a sais
biliares, ácido, calor, falta de glucose, hipoclorito de sódio e em água de torneira
(LAPLACE et al., 1997; CAPIAUX et al., 2000; FIGDOR; DAVIES; SUNDQVIST,
2003). A habilidade do E. faecalis de sobreviver a períodos extensos em ambientes
nutricionais limitados representa uma importante característica da patogênese desta
espécie em processos patológicos de falhas no tratamento endodôntico. (FIGDOR;
DAVIES; SUNDQVIST, 2003).
A habilidade de formação de biofilme pelo gênero Enterococcus permite a
colonização de superfícies inertes e biológicas, protegendo contra agentes
antimicrobianos e ação de fagócitos, mediando adesão e invasão de células do
hospedeiro (BALDASSARI et al., 2005). Além da formação de biofilme, os fatores de
virulência do E. faecalis são a produção de substância de agregação, adesinas de
31
superfície, ácido lipopoliteicóico (LTA), produção extracelular de superóxido, enzima
lítica gelatinase e hialuronidase, os quais podem estar associados aos vários
estágios de infecções endodônticas, bem como à inflamação periapical
(KAYAOGLU, ORSTAVIK, 2004). O ácido lipopoliteicóico, encontrado na parede
celular do E. faecalis, auxilia em sua ligação às células eucarióticas, incluindo
linfócitos (BEACHEY et al., 1977; BEACHEY et al., 1979). O LTA também estimula a
reabsorção óssea e a secreção de mediadores inflamatórios por células
polimorfonucleares, contribuindo para o dano tecidual do local infectado.
(KAYAOGLU, ORSTAVIK, 2004).
Evidências da identificação do E. faecalis em infecções endodônticas
persistentes são descritos a seguir.
Para avaliar o resultado do retratamento endodôntico conservador e
realizar a análise microbiológica de casos considerados insatisfatórios, Sundvisqt et
al. (1998) avaliaram 54 dentes tratados endodonticamente, de pacientes
assintomáticos, com evidência radiográfica de lesão periapical, cujo tratamento
endodôntico se encontrava bem obturado e realizado há 5 anos, foram selecionados
e indicacados para retratamento. Após a desobturação dos canais, amostras
bacteriológicas foram coletadas com pontas de papel esterilizadas, antes do preparo
químico-mecânico, 7 dias após o preparo biomecânico e 15 dias após medicação
intracanal de pasta à base de hidróxido de cálcio e inseridas em tubos de ensaio
com meio de cultura à base de tioglicolato e ágar para posterior análise
microbiológica. Os canais foram selados com pensos de algodão esterilizados e
cimento à base de óxido de zinco e eugenol. Decorridos sete dias, os pacientes
retornaram para nova coleta imediatamente após a remoção do selamento
temporário, e após o preparo químico-mecânico. Os canais radiculares foram
medicados com pasta à base de hidróxido de cálcio. Após 15 dias de medicação
intracanal, nova coleta foi realizada e os canais foram obturados e os dentes,
restaurados. A análise das amostras revelou que 24 (44%) dos canais radiculares
estavam contaminados por microrganismos durante a desobturação (S. intermedius,
L. catenaforme, Eubacterium alactolyticum, Propionibacterium acnes, P. micros,
Streptococcus mitis, F. nucleatum, Streptococcus anginosus, Eubacterium timidum,
Propionibacterium propionicum, Bacterioides gracilis e Enterococcus faecalis). Em
20 casos (37%), houve crescimento bacteriano das amostras coletadas na primeira
32
e segunda sessão de tratamento. 93% dos pacientes foram acompanhados
preservados anualmente por cinco anos, sendo que 37 (68%) apresentaram taxa de
sucesso de aproximadamente 74%. A taxa de sucesso nos dentes em que o E.
faecalis se fez presente foi relativamente menor (66%) que a média dos outros
casos, o que sugere que o microrganismo seria um importante agente causador do
insucesso endodôntico.
Molander et al. (1998) observaram a microbiota endodôntica em 100
dentes tratados endodonticamente com periodontite apical, após período de
aproximadamente quatro anos. Para tal finalidade, amostras foram removidas dos
canais radiculares infectados por meio de brocas Gattes-gliden e lima Hedstrom e
levadas para análise microbiológica. Cepas anaeróbias foram identificadas por
micromorfologia, morfologia da colônia, testes físicos e bioquímicos e por meio de
cromatografia líquida de fase gasosa. As cepas facultativas e aeróbias foram
identificadas por coloração de Gram, morfologia da colônia e meios seletivos. O
crescimento foi semiquantificado como muito espesso, espesso, moderado, escasso
e muito escasso sobre placas de ágar através da contagem de UFC/mL. Em 85% da
amostra, observaram a presença de microbiota intracanal com 117 cepas isoladas,
com predominância de anaeróbios facultativos gram-positivos (69%), sendo o E.
faecalis a espécie encontrada com maior freqüência na proporção de 47,05%.
Love (2001) avaliou um possível mecanismo para explicar a sobrevivência
e o crescimento do Enterococcus. faecalis dentro dos túbulos dentinários, bem como
sua capacidade de reinfectar o canal radicular obturado. Cepas de Streptococcus
gordoni, Streptococcus mutans e E. faecalis foram repicadas em placas de ágar
TSBY (Caldo tripticase soja suplementado com extrato de levedura), ajustadas a
aproximadamente 1,2 x 109 células/mL, contendo 10 a 90% de soro humano e
incubadas a 37ºC, por 56 dias. Decorrido este período, as culturas foram inoculadas
em dentes humanos unirradiculares hígidos, extraídos por motivos diversos e
preparados previamente. Os resultados revelaram que as 3 espécies bacterianas
avaliadas permaneceram viáveis dentro do período experimental. O E. faecalis
parece apresentar habilidade para invadir os túbulos dentinários e de se manter
viável, aderindo-se ao colágeno na presença de soro humano, mecanismo pelo qual
as células desta espécie bacteriana atuariam como patógeno nos casos de
insucesso endodôntico.
33
2.1.3 Agentes antimicrobianos
A eliminação completa dos microrganismos do interior dos canais
radiculares de dentes infectados com lesões periapicais tem sido um desafio na
Endodontia. Embora haja uma expressiva redução de microrganismos após o
preparo biomecânico dos canais radiculares, há evidências da necessidade de
agentes antimicrobianos auxiliares, como as soluções irrigadoras e as medicações
intracanais utilizadas entre as sessões do tratamento endodôntico, com o objetivo de
potencializar o processo de sanificação do sistema de canais radiculares.
(BYSTROM; SUNDQVIST, 1981; BYSTROM et al., 1987; SYDNEY; ESTRELA,
1996; ESTRELA et al., 2012).
A ação mecânica dos instrumentos endodônticos durante o preparo
biomecânico dos canais radiculares é incapaz de promover completa desinfecção de
algumas áreas devido às complexidades anatômicas da região. (BYSTRÖM et al.,
1987). Desta forma, se faz necessária a utilização de substâncias químicas
auxiliares com o intuito de promover controle ou eliminação completa dos depósitos
bacterianos nos canais radiculares, uma vez que os agentes irrigantes auxiliam na
lubrificação do canal radicular durante a ação de corte dos instrumentos, na
remoção da camada de smear layer, na desinfecção, dissolução do exsudato,
dissolução do tecido pulpar necrosado e pré-dentina (BYSTRÖM; SUNDQVIST,
1983). Inúmeras substâncias químicas têm sido utilizadas como agentes irrigantes,
dentre elas o hipoclorito de sódio (NaOCl) (AYHAN et al., 1999; GOMES et al., 2001;
ESTRELA et al., 2007; VIANNA; GOMES, 2009; BHUVA et al., 2010; RÔÇAS;
SIQUEIRA JR., 2011), a clorexidina (GOMES et al., 2001; ESTRELA et al., 2007;
VIANNA; GOMES, 2009) , o EDTA (BACA et al., 2011) e o ácido cítrico (POGGIO et
al., 2012) são os mais frequentes.
A medicação intracanal ideal para favorecer a reparação tecidual
apresenta como referenciais três parâmetros principais: potencial antimicrobiano,
biocompatibilidade e capacidade de estimulação dos tecidos do hospedeiro.
(ESTRELA, 2004). Para o tratamento efetivo das infecções endodônticas, deve-se
considerar: o conhecimento da microbiota endodôntica (infecção primária,
secundária ou persistente), o mecanismo de ação da medicação intracanal, a
efetividade antimicrobiana, o tempo de atuação da medicação intracanal, o alcance
34
na massa dentinária, a resistência microbiana e a compatibilidade biológica.
(ESTRELA, 2004). Desta, forma a utilização da medicação intracanal poderia
contribuir decisivamente para a máxima redução das bactérias que eventualmente
ficaram protegidas da ação letal das substâncias químicas irrigantes do canal
radicular. (BYSTRÖM et al., 1987; SJÖGREN et al., 1991).
2.1.3.1 Agentes irrigantes
Gomes et al. (2001) avaliaram a eficácia in vitro de várias concentrações
de NaOCl (0,5%, 1%, 2,5%, 4% e 5,25%) e de duas formas de Gluconato de
Clorexidina (gel e líquido) em três concentrações (0,2%, 1% e 2%) na eliminação do
E. faecalis. Para a microdiluição em caldo, colônias puras de E. faecalis foram
cultivadas em ágar BHI e suspensas em solução salina esterilizada. A suspensão foi
ajustada, por espectrofotometria, na escala de turbidez 0,5 de McFarland e,
ultrassonificada com os irrigantes experimentais por 10, 30 e 45 segundos ou,
1,3,5,10,20 e 30 minutos. Após 7 dias de incubação a 37ºC, foi observada a
turvação das soluções para determinar o crescimento bacteriano positivo. Os
autores concluíram que todos os irrigantes testados possuíram atividade
antimicrobiana, sendo que o tempo necessário para a eliminação do E. faecalis foi
dependente da concentração e do tipo de irrigante utilizado. A clorexidina na forma
líquida em todas as concentrações e o NaOCl a 5,25% foram os mais eficazes.
Dametto et al. (2005) avaliou e comparou a atividade antibacteriana in
vitro da clorexidina gel a 2%, clorexidina líquida 2% e hipoclorito de sódio 5,25%
(NaOCl) sobre o Enterococcus faecalis. Para tal objetivo, raízes de pré-molares
inferiores humanos foram preparadas por instrumentação seriada, autoclavadas e
contaminadas por um período de 7 dias com monoculturas de E. faecalis. Em
seguida, os dentes foram divididos em 5 grupos e submetidos ao preparo
biomecânico com variação apenas da substância química auxiliar. Para avaliar o
potencial antimicrobiano dos agentes irrigantes auxiliares, foram realizadas 3 coletas
bacteriológicas e posterior contagem das UFC/mL: pré-preparo químico-mecânico,
pós-preparo químico-mecânico e 7 dias após o preparo químico-mecânico. O
gluconato de clorexidina a 2%, na forma gel e líquida, promoveu uma redução
35
significante nas coletas imediata e 7 dias após o preparo biomecânico. Entretanto,
no grupo do hipoclorito de sódio a 5,25%, houve uma redução do número de UFC na
coleta imediatamente após o preparo biomecânico, mas foi observado crescimento
bacteriano na coleta final. Concluiu-se que dentre os meios químicos auxiliares
testados como irrigantes endodônticos, o gluconato de clorexidina 2%, gel e líquido,
foram mais efetivos do que o NaOCl 5,25% sobre o E. faecalis.
Pinheiro et al. (2004) avaliaram a susceptibilidade in vitro do E. faecalis a
diferentes antibióticos (benzilpenicilina, amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulânico,
eritromicina, azitromicina, vancomicina, cloranfenicol, tetraciclina, doxiciclina,
ciprofloxacina e moxifloxacina). Com este objetivo, 21 dentes com lesão periapical
foram selecionados. A concentração inibitória mínima foi determinada utilizando o
sistema E-test. As cepas do E. faecalis foram classificadas como sensíveis ou
resistentes de acordo com a NCCLS/2002 (Metodologia dos Testes de Sensibilidade
a Agentes Antimicrobianos por Diluição para Bactéria de Crescimento Aeróbico:
Norma Aprovada). Os resultados mostraram que as cepas de E. faecalis foram
completamente susceptíveis à amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulânico,
vancomicina e maxofloxacina. Algumas cepas foram sensíveis ao cloranfenicol,
tetraciclina, doxiciclina e ciprofloxacina, enquanto que a eritromicina e a azitromicina
foram as menos eficazes contra o E faecalis.
Berber et al. (2006) avaliou a atividade antimicrobiana de diferentes
protocolos para o preparo biomecânico de 270 raízes de pré-molares inferiores
infectadas com Enterococcus faecalis, divididas em 18 grupos, nos quais as técnicas
de instrumentação foram testadas variando-se o uso das substâncias químicas
auxiliares. Os agentes irrigantes estudados foram: clorexidina 2% (CHX) gel e
líquida, hipoclorito de sódio (NaOCl) 5,25%, 2,5% e 0,5% e, soro fisiológico. O
preparo biomecânico foi realizado pela técnica de instrumentação híbrida cérvico-
apical ou pela instrumentação rotatória. Amostras bacteriológicas do canal radicular
foram coletadas antes e imediatamente após o preparo químico-mecânico e as
UFC/mL, contadas. Adicionalmente, amostras de dentina foram removidas dos
terços apical, médio e cervical. Na luz do canal radicular, todas as substâncias,
inclusive o soro fisiológico quando associados à instrumentação mecânica,
promoveram uma redução de quase 100% nas coletas microbiológicas
imediatamente após o preparo químico-mecânico. Nas coletas resultantes das
36
raspas de dentina, independente do terço apical, técnica ou profundidade, o NaOCl
5,25% e a CHX gel 2% obtiveram os melhores resultados na redução bacteriana dos
túbulos dentinários seguidos do NaOCl 2,5%, CHX líquida 2% e NaOCl 0,5%. Os
autores concluíram que o NaOCl especialmente nas mais altas concentrações, e a
CHX 2% gel, independentemente da técnica de instrumentação utilizada, foram
capazes de eliminar o E. faecalis dos túbulos dentinários.
A eficácia das soluções de hipoclorito de sódio (NaOCl) e clorexidina
(CHX), em diferentes concentrações, associadas ou isoladas, contra o Enterococcus
faecalis, foi avaliada por Vianna e Gomes (2009). Os agentes irrigantes estudados
foram CHX a 2% gel, CHX a 2% líquida, NaOCl a 1%, NaOCl a 2,5% e NaOCl a
5,25%, em diferentes combinações e, em proporções iguais. Dois métodos foram
utilizados para avaliação do potencial antimicrobiano: teste de difusão em ágar e
teste de microdiluição em caldo. Os autores concluíram que a CHX a 2% gel
provocou maior zona inibição do crescimento bacteriano e as menores inibições
foram obtidas pelo NaOCl a 1% e NaOCl a 2,5%. A CHX a 2% gel, o NaOCl a 5,25%
e a combinação de CHX a 2% líquida e NaOCl a 5,25% precisaram de 1 minuto para
promover a eliminação do Enterococcus faecalis. A associação de NaOCl e CHX
não apresentou melhor eficácia na eliminação bacteriana comparada à CHX
utilizada sozinha.
Baca et al. (2011) avaliaram a atividade antimicrobiana residual e a
capacidade de erradicar o Enterococcus faecalis de diferentes soluções irrigadoras,
sozinhas ou em combinação, num teste volumétrico de dentina humana. As
soluções de hipoclorito de sódio a 2,5% (NaOCl), clorexidina 2% (CHX), cetrimida
0,2% (CTR), ácido etilenodiaminotetracético 17% (EDTA), ácido maleico 7% (MA), e
os regimes de associações do NaOCl 2,5%, seguido por 17% de EDTA ou MA 7%,
CTR 0,2% ou CHX 2%, foram selecionados. Para determinar a atividade residual
dos regimes de irrigação propostos, foi criado biofilme de E. faecalis sobre os blocos
de dentina após 24 horas de incubação a 37o.C. Os resultados da atividade residual
e antimicrobiana dos regimes-teste foram expressos como a taxa de inibição da
formação e eliminação do biofilme, respectivamente. A CHX 2% e a solução CTR
0,2% mostraram 100% de inibição do biofilme; NaOCl 2,5% apresentaram a menor
atividade residual (18,10%). A taxa de eliminação bacteriana do NaOCl 2,5% e CTR
0,2% foi de 100% seguido por MA 7% e CHX 2%, enquanto que o EDTA 17% foi o
37
menos eficaz (44%). As soluções de MA 7% ou EDTA 17% seguido por CTR 0,2%
ou CHX 2% mostraram 100% de atividade residual e antimicrobiana. Os resultados
mostraram que a solução CTR 0,2% sozinha e as combinações em que CTR 0,2%
ou CHX 2% foram as soluções finais de irrigação que promoveram atividade residual
e antimicrobiana máximas.
Poggio et al. (2012) compararam a atividade antimicrobiana in vitro do
Tetraclean (associação de doxiciclina, ácido cítrico e propilenoglicol), Niclor
(Hipoclorito de Sódio a 5,25%), Cloreximid (Clorexidina a 0,12%, Solução de
cetrimida 0,2%) e Peróxido de Hidrogênio volume 12, sobre o Enterococcus faecalis,
Streptococcus mutans e Staphylococcus aureus. O teste de difusão em ágar foi
utilizado para verificar a atividade antimicrobiana das soluções. Discos de papel
foram saturados com cada uma das soluções testadas (a temperatura ambiente e ao
pré-aquecimento a 50°C) e colocados em placas de cultura de ágar já infectadas e
incubadas a 37°C por 24h. Os resultados revelaram quem em temperatura ambiente
o Tetraclean mostrou inibição significativamente maior em relação às outras
soluções testadas. O pré-aquecimento em 50°C aumentou significativamente a
inibição do crescimento bacteriano para todos os grupos testados. A 50°C o
peróxido de hidrogênio volume 12 e o Tetraclean mostraram eficácia
significativamente maior em relação às outras soluções. Os autores concluíram que
o pré-aquecimento do peróxido de hidrogênio volume 12 e do Tetraclean favoreceu
a inibição do crescimento bacteriano.
2.1.3.2 Medicações intracanais
O hidróxido de cálcio é uma base forte (pH 12,6), pouco solúvel em água
(1,2 g/L), obtida a partir da calcinação (aquecimento) do carbonato de cálcio até sua
transformação em óxido de cálcio (cal viva), que quando hidratado forma o hidróxido
de cálcio (BUDVARI, 1996). As propriedades do hidróxido de cálcio derivam de sua
dissociação iônica em íons cálcio e íons hidroxila, sendo que, a ação destes íons,
sobre os tecidos e as bactérias, explica suas propriedades biológicas, pois ativa
enzimas teciduais, como a fosfatase alcalina, conduzindo ao efeito mineralizador e
antimicrobianas, inibindo enzimas bacterianas. (ESTRELA, 2004).
38
Acredita-se que os íons hidroxila do hidróxido de cálcio desenvolvem seu
mecanismo de ação em nível de membrana citoplasmática, pois é o local onde se
localiza os sítios enzimáticos, responsável por funções essenciais como o
metabolismo, crescimento e divisão celular (ESTRELA et al., 1994). O efeito do
elevado pH do hidróxido de cálcio, influenciado pela liberação de íons hidroxila, é
capaz de alterar a integridade da membrana citoplasmática por meio de agressões
químicas aos componentes orgânicos e transporte de nutrientes, ou por meio da
destruição de fosfolipídios ou ácidos graxos insaturados da membrana
citoplasmática, observado pelo processo de peroxidação lipídica, sendo esta na
realidade, uma reação de saponificação. (ESTRELA et al., 1995).
Orstavik e Haapasalo (1990) analisaram o efeito antibacteriano de
soluções irrigadoras e medicações intracanais em dentina bovina infectada com
Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Escherichia coli ou Pseudomonas
aeruginosa. Blocos cilíndricos de dentina bovina foram obtidos de incisivos bovinos
recém-extraídos, tendo os resíduos orgânicos e inorgânicos removidos por
tratamento ultra-sônico com EDTA e hipoclorito de sódio a 5.25%. Os espécimes de
dentina foram infectadas por períodos que variaram de 3 a 6 semanas. Os
medicamentos endodônticos utilizados na desinfecção de dentina foram: hidróxido
de cálcio (Calasept), Paramonoclorofenol canforado (PMCC), gluconato de
clorexidina (Hibitane), iodeto de potássio, hipoclorito de sódio e EDTA. Após a
aplicação dos medicamentos, os espécimes de dentina foram incubados a 37°C
durante 7 dias. A eficácia dos vários medicamentos teve uma grande variação, de
acordo com a espécie bacteriana estudada. Considerando que a capacidade de
infectar os túbulos dentinários variou de acordo com os microrganismos, os
resultados mostraram que o paramonoclorofenol canforado foi, de modo geral, mais
eficiente que o hidróxido de cálcio (Calasept). Dentre as soluções irrigadoras
testadas, o iodeto de potássio mostrou maior eficácia do que o hipoclorito de sódio e
a clorexidina. O EDTA praticamente não apresentou ação antibacteriana. A
presença de “smear layer” diminuiu, mas não eliminou a ação dos medicamentos
testados.
Gomes et al. (2002) avaliaram a atividade antimicrobiana do hidróxido de
cálcio associado a diferentes veículos sobre microrganismos comumente isolados
dos canais radiculares infectados através de teste de difusão em ágar. Cilindros de
39
aço inoxidável foram colocados sobre as placas de ágar infectadas e os
medicamentos testados foram inseridos no interior dos cilindros e incubados a 37°C.
As zonas de inibição do crescimento bacteriano foram mensuradas e registradas
após incubação de cada placa por 24h. A atividade antimicrobiana dos
medicamentos foi observada, em ordem decrescente, em relação ao potencial
antimicrobiano: hidróxido de cálcio + PMCC glicerina, hidróxido de cálcio + PMCC,
hidróxido de cálcio + glicerina, hidróxido de cálcio + anestésico, hidróxido de cálcio +
soro fisiológico, hidróxido de cálcio + água, hidróxido de cálcio + polietilenoglicol. Os
autores concluíram que pastas com veículos oleosos apresentaram inibição
significativamente maior em comparação com veículos aquosos e viscosos e que a
atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio foi afetada pelo tipo de veículo
utilizado.
Gomes et al. (2003) avaliaram a atividade antimicrobiana de medicações
intracanais contra o Enterococcus faecalis por meio do método de infecção de
dentina. Foram preparados 180 incisivos centrais bovinos, que tiveram os 5mm
apicais e 2/3 da coroa cortados, obtendo-se discos de dentina bovina que foram
infectados por culturas de E. faecalis por 7 dias. Os espécimes foram divididos em 4
grupos: I- Clorexidina gel 2%, II- Hidróxido de cálcio + Polietilenoglicol 400, III-
Clorexidina gel 2% + Pasta de Hidróxido de Cálcio e IV- BHI (controle). Os
espécimes receberam a medicação e foram incubados a 37°C nos períodos de 2, 7,
15 e 30 dias. Os resultados revelaram que a Clorexidina gel 2% eliminou
completamente os microrganismos em todos os períodos. O hidróxido de cálcio
permitiu o crescimento bacteriano em todos os períodos. A associação da
clorexidina gel 2% e hidróxido de cálcio demonstrou 100% de efetividade nos 2
primeiros dias, sendo diminuída aos 7 e 15 dias. Os autores concluíram que a
clorexidina gel 2% foi a medicação mais eficaz contra o E. faecalis e que a atividade
antimicrobiana depende do tempo de permanência da medicação no canal radicular.
Vianna et al. (2005) avaliaram a atividade antimicrobiana do hidróxido de
cálcio em associação a diferentes veículos contra patógenos endodônticos pelo
teste de microdiluição em caldo. As pastas de hidróxido de cálcio foram preparadas
com os seguintes veículos: água destilada, glicerina, PMCC, PMCC + glicerina e
PMCC + polietilenoglicol. Foram necessárias de 6 a 24 horas para eliminação dos
microrganismos aeróbios e facultativos e de 30 segundos a 5 minutos, para os
40
anaeróbios estritos para todas as medicações testadas. A susceptibilidade
microbiana em ordem crescente foi: E. faecalis (patógeno mais resistente), Candida
albicans, Staphylococcus aureus, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas
endodontalis e Prevotella intermedia. Concluiu-se que as pastas de hidróxido de
cálcio necessitaram de maior tempo para eliminar os microrganismos facultativos do
que os aeróbios. Para os autores, os achados sugeriram que a propriedade
antimicrobiana está relacionada à formulação da pasta e à susceptibilidade
microbiana, pois pastas preparadas com glicerina e polietilenoglicol precisam de
mais tempo para eliminar os microrganismos que as outras pastas.
Gomes et al. (2006) avaliaram a atividade antimicrobiana da pasta de
hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), clorexidina gel 2% (CHX) e a associação de ambos
contra os seguinte microrganismos: Enterococcus faecalis, Candida albicans,
Staphylococcus aureus, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis e
Prevotella intermedia. Para avaliação microbiológica, foram utilizados dois métodos:
teste de difusão em ágar e teste de exposição direta. O (Ca(OH)2) + CHX
apresentou zonas de inibição variando de 2,84 a 6,5mm e foram necessários de 30s
a 6h para eliminar os microrganismos testados. A CHX produziu zonas de inibição
de 4,33 a 21,67mm, sendo necessário 1min ou menos para eliminar os
microrganismos testados. A pasta de (Ca(OH)2) + água esterilizada inibiu apenas os
microrganismos com os quais estavam em contato direto e foram necessários de
30s a 24h para eliminar os microrganismos testados. Os autores concluíram que a
associação do (Ca(OH)2) com a CHX apresentou maior eficácia contra os
microrganismos testados quando comparada a associação com a água estéril.
Souza Filho et al. (2008) avaliaram a atividade antimicrobiana da
clorexidina 2% gel (CHX), hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e associação de ambos
com iodofórmio e óxido de zinco como medicação intracanal contra os seguinte
microrganismos: E. faecalis, S. sanguis, S. sobrinus, S. mutans, P. gingivalis e P.
intermedia. O pH das medicações também foi determinado. A atividade
antimicrobiana foi avaliada pelo teste de difusão em ágar. A maior zona de inibição
foi produzida pela CHX 2% gel, seguida de CHX 2% gel + iodofórmio, Ca(OH)2 +
CHX 2% gel + óxido de zinco e Ca(OH)2 + água. A média de pH dos medicamentos
testados permaneceu superior a 12,0 durante todo o experimento, exceto para CHX
41
2% gel (pH = 7,0). Os autores concluíram que todos os medicamentos apresentaram
atividade antimicrobiana, sendo a CHX 2% gel, o mais eficaz.
Delgado et al. (2010) avaliaram a eficácia do hidróxido de cálcio e da
clorexidina 2% gel como medicação intracanal sobre o Enterococcus faecalis. Foram
utilizados 60 dentes humanos unirradiculares que foram infectados com o
microrganismo e, incubados a 37°C por 21 dias. Posteriormente, as seguintes
medicações intracanais foram inseridas nos canais radiculares: CHX 2% gel,
Ca(OH)2 + CHX 2% gel e solução salina como controle. Os espécimes foram
novamente incubados por 14 dias. Em seguida, raspas de dentina foram coletadas
através de brocas Gattes-gliden, na profundidade de 0-200 um. As raspas foram
inseridas em tubos de ensaio contendo BHI e incubadas por 48h. A contagem da
quantidade de unidades formadoras de colônias (UFC) e a viabilidade bacteriana
foram realizadas através de microscopia de fluorescência. Os autores concluíram
que houve redução significativa de número de UFC e a porcentagem de
Enterococcus faecalis quando a medicação utilizada foi hidróxido de cálcio + CHX
2% gel em comparação com o grupo controle. Além disto, a eficácia antimicrobiana
da CHX 2% gel foi significativamente maior em relação ao Ca(OH)2.
Vaghela et al. (2011) avaliaram a capacidade de desinfecção de túbulos
dentinários utilizando diferentes medicações intracanais contra Enterococcus
faecalis e Candida albicans. Foram utilizados 80 dentes humanos unirradiculares
que foram preparados e infectados com os microrganismos e incubados por 21 dias.
Posteriormente, os espécimes foram divididos em quatro grupos: Grupo I: solução
salina (controle negativo), Grupo II: hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) + propilenoglicol,
Grupo IV: hidróxido de Cálcio + iodofórmio + óleo de silicone e Grupo V: clorexidina
2% gel (CHX 2%). Cada grupo recebeu a medicação no interior do canal e foi
incubado por 7 dias. Em seguida, raspas de dentina foram coletadas através de
brocas Gattes-gliden na profundidade de 200µm e 400µm e foram inseridas em
tubos de ensaio contendo caldo esterilizado e, incubadas por 24h. A solução de
cada tubo foi avaliada por espectrofotometria. Os resultados revelaram que todas as
medicações estudadas exerceram atividade antimicrobiana. Os Grupos II e IV
exerceram atividade antibacteriana ligeiramente maior. Os grupos III e IV
apresentaram uma tendência de maior atividade antifúngica. A inibição do
crescimento microbiano a 200µm e 400 µm foi uniforme.
42
Farhad et al. (2012) compararam a atividade antibacteriana da associação
do hidróxido de cálcio com três veículos diferentes como medicação intracanal
contra o Enterococcus faecalis. Foram utilizados 61 dentes humanos unirradiculares
que obtiveram o canal radicular preparado e foram divididos em 3 grupos. G1:
hidróxido de cálcio + água destilada, G2: hidróxido de cálcio + hipoclorito de sódio
5,25%, G3: hidróxido de cálcio + clorexidina 0,2%. Os espécimes receberam a
medicação intracanal e foram colocados em um aparelho contendo duas câmaras,
onde a porção coronária foi contaminada pela bactéria e a porção radicular foi
submersa em caldo BHI esterilizado, durante 90 dias. A infiltração bacteriana foi
observada pela turbidez do caldo e a viabilidade do E. Faecalis, pela contaminação
do ágar e por microscopia de luz. O maior tempo de contaminação da porção
radicular foi para o G3 (66,76 dias) e o menor foi para o G1 (40,29 dias). Foi
observada diferença estatisticamente significante entre G3 e G1. Após o período de
90 dias de contaminação, 88,23% das amostras do G1, 70,58% do G2 e 64,70% do
G3 foram contaminadas. Os autores concluíram que a associação do hidróxido de
cálcio com a clorexidina apresentou atividade antibacteriana significativamente maior
que a associação do hidróxido de cálcio com água destilada.
2.2 PRÓPOLIS
A própolis é uma substância resinosa coletada pelas abelhas dos brotos,
exsudatos de árvores e outras partes do tecido vegetal, modificada na colméia por
adição de secreções salivares (MARCUCCI; DE CAMARGO; LOPES, 1996).
Apresenta textura que varia de dura e friável à maleável e pegajosa, enquanto que a
coloração pode ser amarela, verde ou castanho escuro e em geral, o sabor é
resinoso e o odor aromático (SALATINO et al., 2010). A própolis é utilizada pelas
abelhas para vários fins, como vedar as fendas e buracos na colméia, para
embalsamar corpos de animais intrusos que são mumificados sem putrefação e
contribuir para a manutenção da temperatura dentro da colméia, por volta de 35°C.
(GHISALBERTI, 1999; SIMONE-FINSTROM; SPIVAK, 2010).
Há evidências de propriedades terapêuticas da própolis como atividade
antibacteriana (TAKAISI-KIKUNI; SCHILCHER, 1994; MARCUCCI, 1995;
43
KUJUMGIEV et al., 1999; SCHELLER et al., 1999; KOO et al., 2000; ABD EL-HADI;
HEGAZI, 2002; KARTAL et al., 2003; AL-WAILI, 2005; BOYANOVA et al., 2005;
POPOVA et al., 2005), antinflamatória (BORRELLI et al., 2002), anticarcinogênica
(EL-KHAWAGA; SALEM; ELSHAL, 2003), antioxidante (RUSSO; LONGO;
VANELLA, 2002), neuroprotetora (NAKAJIMA et al., 2007), hepatoprotetora
(GONZALES et al., 1995) e antiviral. (DEBIAGGI et al., 1990; AMOROS et al., 1992,
1994; ITO et al., 2001; SCHNITZLER et al., 2010).
Algumas propriedades biológicas e químicas da própolis têm sido
estudadas, porém a sua utilização terapêutica na odontologia ainda é incipiente
(Bankova, 2005), o que pode ser explicado pela variabilidade de sua composição
química em função de sua origem geográfica, visto que em diferentes ecossistemas,
principalmente em regiões tropicais, as abelhas recorrem a distintas espécies
vegetais como fonte de matéria-prima empregada em sua elaboração. (BANKOVA;
CASTRO; MARCUCCI, 2000).
2.2.1 Composição química
Inúmeros componentes foram identificados em amostras de diferentes
origens da própolis, como, ácidos graxos e fenólicos, ésteres, ésteres fenólicos,
flavonóides (flavonas, flavononas, flavonóis, di-hidroflavonóis, etc), terpenos, b-
esteróides, aldeídos e álcoois aromáticos, sesquiterpenos e naftaleno.
(GREENAWAY; SCAYSBROOK; WHATLEY, 1990; MARCUCCI; CAMARGO,
LOPES, 1996).
Bankova et al. (1995) analisaram quatro amostras da própolis
provenientes de diferentes regiões do Brasil obtidas através da extração em etanol a
70% por meio da espectrofotometria gasosa de massa (GS/MS). Os resultados
revelaram a presença, em grande quantidade, dos seguintes componentes:
terpenóides, ácido cumarínico e sesquiterpenos.
Park et al. (1997) analisaram a própolis coletada de colméia de Apis
mellifera, proveniente de sete estados brasileiros: Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso
do Sul, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Por meio da
cromatografia líquida de fase reversa (CLFR), encontraram altas concentrações de
44
flavonóides, embora houvesse diferença deste valor dependendo do Estado de
origem. A concentração total de flavonóides da própolis de Mato Grosso do Sul foi
de aproximadamente 12,5mg/g e os derivados de flavonóides mais encontrados
foram a quercitina, apigenina, sacuranetina e crisina. Baseado nos resultados, os
autores sugeriram que a ecologia vegetal do meio ambiente influencia na
determinação dos componentes da própolis e devido a esta diversidade, é
necessário o estudo prévio dos componentes da própolis para determinar sua
aplicação terapêutica.
Kumazawa et al. (2003) analisaram a presença de polifenóis e flavonóides
em extratos etanólicos da própolis (EEP) oriunda da Argentina, Austrália, Brasil,
Bulgária, Chile, China, Hungria, Nova Zelândia, África do Sul, Tailândia, Ucrânia,
Uruguai, Estados Unidos e Uzbesquistão, por meio da cromatografia líquida de alta
precisão (HPLC). Os resultados revelaram que os menores valores de polifenóis e
flavonóides foram encontrados nas amostras da Tailândia (31,2mg/g), enquanto que
os valores de polifenóis da própolis brasileira (120mg/g) foram menores apenas em
relação à búlgara (220mg/g) e chinesa (299mg/g) e, foi a única própolis composta
pela artepelin-C (43,9mg/g) que apresenta atividade antitumoral. Os autores
sugerem que a diferença da concentração dos componentes analisados ocorre em
função da região da coleta, por conta da diversidade de sua flora ecológica.
Volpi e Bergonzini (2006) avaliaram por meio de HPLC, a separação
quantitativa e qualitativa e a determinação dos componentes polifenólicos de
extratos etanólicos da própolis de diferentes origens (Argentina, Itália, Espanha,
Azerbaijão, China, Etiópia e Quênia). Os resultados revelaram que os extratos de
própolis da Argentina, Itália e Espanha apresentaram grande quantidade de
pinocembrin (aproximadamente 49%, 48% e 39% do total de flavonóides
identificados, respectivamente) e porcentagens variáveis mais similares a outras
espécies. Ao contrário a própolis da China, Azerbaijão e Etiópia apresentaram
grande quantidade de pinocembrin (aproximadamente 63%, 46% e 62%,
respectivamente), mas na amostra da China não foi encontrado genisteína,
caempferol, apigenina e crisina, na amostra do Azerbaijão não foi encontrado
genisteína, caempferol, acacetin, e crisina e na amostra da Etiópia não foi
encontrado caempferol e acacetin. Na amostra do Quênia, não foi identificado
nenhum tipo de flavonóide. Os autores concluíram que as amostras da Argentina,
45
Itália e Espanha foram mais ricas em flavonóides em relação as outras amostras
estudadas.
Falcão et al. (2012) avaliaram a composição fenólica da própolis de
diferentes regiões e ilhas de Portugal. Por meio da técnica de cromatografia líquida,
quarenta extratos etanólicos foram analisados e setenta e seis polifenóis foram
identificados. Foram estabelecidos dois grupos: Própolis comum, que continha
compostos fenólicos típicos de álamo, tais como flavonóides e seus metilados/forma
estratificada, ácidos fenilpropanóides e ésteres e um tipo raro de própolis com
composição incomum como glicosídeos de quercetina e campferol. Os autores
concluíram que o método permitiu o estabelecimento do perfil fenólico da própolis de
Portugal a partir de diferentes localizações geográficas e a possibilidade de utilizar
alguns compostos fenólicos, como caempferol, como marcadores geográficos. Os
dados sugerem que outras espécies botânicas, além de árvores de álamo podem
ser importantes fontes de resinas para a própolis de Portugal.
2.2.2 Atividade antimicrobiana
Park et al. (1998) compararam amostras da própolis de vários estados
brasileiros em relação a sua capacidade antibacteriana e de inibir a enzima GTF que
é a responsável pela síntese de glucanos a partir da sacarose, substâncias
essenciais para o metabolismo das bactérias componentes do biofilme cariogênico.
Os microrganismos avaliados foram: Streptococcus mutans, Streptococcus
sanguinis, Streptococcus sp. isolados de saliva e Actinomyces naeslundii. As
amostras da própolis foram coletadas dos estados de Minas Gerais, São Paulo,
Goiás, Mato Grosso do Sul, Paraná e Rio Grande do Sul. Para realização do
experimento, os extratos etanólicos das amostras de própolis foram obtidos através
da associação de 2g de própolis em 25 mL de etanol 80%. Para avaliação da
atividade antimicrobiana, o teste de difusão em ágar foi realizado. A HPLC e
cromatografia líquida de fase reversa (HPTLC) foram realizadas para avaliar os
componentes das amostras da própolis. Todas as amostras testadas inibiram o
volume da produção de GTF por Streptococcus mutans, merecendo destaque as
amostras do Rio Grande do Sul (inibição=30,5%) e do Mato Grosso do Sul (inibição=
46
19,4%), cujos halos de inibição para Streptococcus mutans foram de 3,0 mm e 1,5
mm, respectivamente. A amostra da própolis do Rio Grande do Sul apresentou
maior concentração de pinocembrin e galangina.
Koo et al. (2000) investigaram e compararam a atividade antimicrobiana,
inibição da aderência de Streptococos mutans e inibição da formação de glucano
insolúvel em água, dos extratos etanólicos de própolis (EEP) 10% e Arnica montana
10% contra os seguinte microrganismos: Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis, Candida albicans, Streptococcus sanguinis, Streptococcus mutans,
Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Actinomyces naeslundii,
Actinomyces viscosus, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis e
Prevotela denticola, sendo os três últimos isolados clinicamente. A atividade
antimicrobiana foi determinada através do método de difusão em ágar. Para avaliar
a aderência celular a uma superfície de vidro, os microrganismos foram cultivados
durante 18 horas a 37° C, em tubos de ensaio em ângulo de 30°. Para ensaio de
formação de glucano insolúvel em água, uma mistura de sacarose bruta e de 0,125
mL de glicosiltransferase foi incubada durante 18h a 37° C, em tubos de ensaio em
ângulo de 30°. A arnica e o extrato da própolis foram adicionados aos tubos para
avaliar a concentração de inibição da adesão de células e a formação de glucano
insolúvel em água. Os resultados revelaram que o extrato de própolis inibiu
significativamente todos os microrganismos testados, mostrando a maior zona de
inibição para Actinomyces spp. O extrato de arnica não demonstrou atividade
antimicrobiana significativa. A aderência celular e a formação de glucano insolúvel
em água foram quase completamente inibidas pelo extrato de própolis, a uma
concentração final de 400 µg/mL e 500 µg/mL, respectivamente. O extrato de arnica
mostrou ligeira inibição da adesão das células em crescimento (19% para S. mutans
e 15% para S. sobrinus) e da formação de glucano insolúvel em água (29%), nas
mesmas concentrações. Os autores concluíram que o extrato de própolis mostrou
atividade antibacteriana in vitro, inibição da adesão celular, inibição insolúvel em
água a formação de glucano, enquanto que o extrato de Arnica foi apenas
ligeiramente ativo nestas condições.
Uzel et al. (2005) avaliaram a atividade antimicrobiana de quatro amostras
de própolis oriundas da região da Anatólia (Turquia) contra diferentes
microrganismos, incluindo patógenos bucais. Extratos etanólicos de própolis (EEP)
47
foram preparados a partir de cada amostra, os quais também foram analisados
quanto à composição química por meio de cromatografia gasosa de alta resolução e
espectrofotometria de massa. Para avaliação da atividade antimicrobiana, a
concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada por meio do teste de
macrodiluição. Os resultados revelaram que a própolis TB foi a mais eficaz, e a CIM
foi de 2µg/mL para S. sobrinus e E. faecalis, 4µg/ mL para M. luteus, C. albicans e C.
krusei, 8µg/mL para S. mutans, S. aureus, S. epidermidis e E. aerogenes, 16 µg/mL
para E. coli e C. tropicalis e 32µg/mL para S. typhimurium e P.a aeruginosa .Os
principais componentes das amostras foram flavonóides como pinocembrin,
pinostropin, isalpinin, pinobanksin, quercetina, naringenina, galangina e crisina. Os
autores concluíram quem apesar da própolis ter sido coletada de diferentes regiões,
todas obtiveram significativa atividade antimicrobiana contras bactérias gram-
positivas e leveduras e que a própolis pode ser utilizada na prevenção e no
tratamento de cárie dentária, já que demonstrou uma atividade antimicrobiana
significativa contra microrganismos envolvidos em doenças bucais.
Hayacibara (2005) avaliaram a influência de frações isoladas da própolis
brasileira tipo 3 (Região Sul) e tipo 12 (Região Sudeste) sobre a viabilidade do
Streptococcus mutans, atividade da glicosiltransferase (GTFS) e atividade e
desenvolvimento da cárie dentária em ratos. O extrato etanólico dos dois tipos da
própolis foi serialmente fracionado em hexano (H-fr), clorofórmio, acetato de etila e
etanol. A capacidade das quatro frações e do EEP de inibir o crescimento do S.
mutans e S. sobrinus e a aderência a uma superfície de vidro foram examinados. O
efeito das frações da própolis sobre a atividade GTF B e C, enzima responsável pela
síntese de glucanos a partir da sacarose, sendo essenciais para o metabolismo das
bactérias componentes do biofilme cariogênico, também foi avaliado. Para o estudo
da cárie, os canais radiculares de incisivos de 60 ratos Winstar foram infectados com
S. sobrinus e divididos em 5 grupos: G1: EEP tipo 3, G2: H-fr tipo 3, G3: EEP tipo
12, G4: H-fr tipo 12 e G5: etanol 80% (controle). Os agentes antimicrobianos foram
aplicados topicamente 2 vezes ao dia durante 5 semanas e em seguida os dentes
fora extraídos para análise microbiológica. A fração H-fr de ambos os tipos da
própolis foram igualmente eficazes na redução da cárie dentária em ratos. Os dados
sugerem que os compostos cariostáticos da própolis tipos 3 e 12 são, em sua
48
maioria, apolares e a fração hexânica deve ser a fração de escolha para
identificação de novos potenciais agentes anti-cárie.
Oncag et al. (2006) avaliaram a atividade antibacteriana da própolis,
hidróxido de cálcio, gel de clorexidina e Vitapex® (pasta de hidróxido de cálcio +
iodofórmio) em canais infectados com E. faecalis. Com este objetivo, 180 dentes
unirradiculares hígidos humanos extraídos foram preparados de acordo com o
protocolo de tratamento endodôntico convencional e os forames apicais foram
selados com resina epóxica. Após a esterilização, os dentes foram inoculados com
10μL da cepa de E. faecalis cultivada em caldo BHI e ajustada na escala 0,5 de
McFarland. Em seguida, a amostra foi dividida em seis grupos, os quais receberam
aproximadamente 0,1mL das seguintes substâncias como medicação intracanal:
Grupo 1 - pó de hidróxido de cálcio + glicerina; Grupo 2- gel de clorexidina 1%;
Grupo 3- Vitapex® + óleo de silicone; Grupo 4- extrato etanólico de própolis a 10%;
Grupo 5- etanol 96% e Grupo 6- apenas com a cultura de E. Faecalis (controle
negativo); grupo 7-. dentes não infectados, sem medicação. Todos os espécimes
foram selados com bolinha de algodão esterilizada e cimento temporário e em
seguida, incubados em condições de anaerobiose a 37°C, por 48 horas ou 10 dias.
Decorridas 48 horas, o selamento coronário foi removido de parte dos espécimes e
os canais radiculares receberam irrigação para remoção da medicação intracanal.
Posteriormente, cones de papel esterilizados foram levados aos canais e
transferidos para tubos de ensaio com meio de cultura para observação da
quantidade de unidades formadoras de colônia (UFC). Decorridos 10 dias, o restante
da amostra também passou pelo mesmo processo. Os resultados revelaram que
todos os medicamentos foram efetivos contra o E. faecalis no período de 48 horas,
com diferença significativa entre os grupos 1 ao 4 e grupos 5 e 6, não sendo
observada diferença significativa entre os medicamentos à base de hidróxido de
cálcio, Vitapex® ou própolis. Para o período de 10 dias, os medicamentos dos
grupos 1 ao 4 foram efetivos contra E. faecalis, com diferença significativa em
relação aos grupos 5 e 6. A própolis foi a medicação mais efetiva, porém, não foi
estatisticamente diferente do gel de clorexidina. A própolis e a clorexidina foram
mais eficazes que o hidróxido de cálcio e o Vitapex®. Os autores concluíram que a
própolis demonstrou boa atividade antibacteriana, podendo ser uma alternativa de
medicação intracanal.
49
Ferreira et al. (2007), avaliaram as concentrações inibitória mínima (CIM)
e bactericida (CBM) do extrato etanólico de própolis 10% (EEP), da solução
hidróxido de cálcio 10%, paramonoclorofenol canforado e formocresol por meio do
método de macrodiluição, utilizando meios de cultura RCM, Brucella e BHI. Os
agentes antimicrobianos foram testados contra as bactérias anaeróbias Prevotella
nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces israellis, Clostridium perfrigens
e Enterococcus faecalis com padronização de 5x105 UFC/mL. Todas as medicações
testadas exerceram efeito antimicrobiano sem diferença entre elas. A CIM foi de
6425,0 µg/mL e a CBM foi de 7640,4 µg/mL. A susceptibilidade microbiana às
medicações testadas foram variáveis, no entanto o E. faecalis foi o menos sensível,
mas sem diferença significante. A atividade antimicrobiana comprovada do EEP
contra os microrganismos identificados em infecções pulpares e periapicais sugerem
a própolis como uma alternativa efetiva de medicação intracanal.
Koru et al. (2007) avaliaram a composição química, a concentração
inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM), através do teste
de macrodiluição de cinco amostras diferentes de própolis coletadas em quatro
regiões da Turquia e uma do Brasil, bem como nove bactérias anaeróbias da
cavidade bucal. Todas as espécies foram susceptíveis e os valores da CIM variaram
de 4 a 512 mg/mL. A própolis de Kazan-Ankara (Turquia) foi a mais eficaz contra os
microrganismos estudados. Os valores da CBM das amostras do extrato etanólico
da própolis (EEP) de Kazan-Ankara variaram de 8 a 512 mg/mL. A eliminação
bacteriana foi observada no período de 4h de contato com a susbstância testada
para Peptostreptococcus anaerobius, Lactobacillus acidophilus e Actinomyces
naeslundii, 8h para Prevotella oralis, Prevotella melaninogenica e Porphyromonas
gingivalis, 12h para Fusobacterium nucleatum, 16h para Veillonella parvula. As
amostras da própolis testadas foram mais eficazes contra bactérias anaeróbias
Gram-positivas do que para as Gram-negativas. As composições químicas foram
determinadas por meio da HPLC associada a GS/MS. Os principais compostos dos
extratos etanólicos da própolis foram os flavonóides, tais como quercetina,
galangina, naringerina e crisina, e ácidos aromáticos, como ácido caféico. Os
autores concluíram que devido ao aumento da resistência bacteriana aos
antimicrobianos, a própolis pode ser uma alternativa no tratamento de doenças da
cavidade bucal.
50
Costa et al. (2008) avaliaram a ação antimicrobiana de substâncias
utilizadas em Endodontia contra o E. faecalis através da técnica de difusão em ágar
pela técnica do poço. Os materiais testados foram divididos em 11 grupos: Grupo1:
extrato de própolis verde 12% (Propomax®); Grupo 2: Pasta Guedes-Pinto
(Iodofórmio+PMCC+Rifocort®); Grupo 3: extrato de própolis verde 12% + Rifocort®
+ Iodofórmio; Grupo 4: Rifocort® + extrato de própolis verde12%; Grupo 5: Ca(OH)2)
+ extrato de própolis verde 12%; Grupo 6: Ca(OH)2 + soro fisiológico; Grupo 7:
Iodofórmio + extrato de própolis verde 12%; Grupo 8: Iodofórmio + soro fisiológico;
Grupo 9 - Rifocort®; Grupo 10: paramonoclorofenol canforado e Grupo 11: soro
fisiológico (controle negativo). Os resultados mostraram que houve diferença
significante entre as substâncias avaliadas, sendo que as pastas dos Grupos 2, 3 e
4 foram as mais eficazes contra o E. faecalis, com os maiores halos de inibição, 9,3
mm, 9,0 mm e 8,5 mm, respectivamente. Considerando as substâncias
isoladamente, o Rifocort® foi a que produziu o maior halo de inibição (10,5 mm) e os
Grupos 6 e 8 não apresentaram efetividade antimicrobiana contra o E. faecalis. Os
autores concluíram que a solução de extrato de própolis verde apresentou baixa
atividade antimicrobiana contra o E. faecalis e, dentre as substâncias testadas, o
Rifocort® apresentou maior ação antimicrobiana.
Rezende et al. (2008) avaliaram a atividade antimicrobiana de duas
pastas experimentais contendo a própolis associada ao hidróxido de cálcio, sobre
culturas polimicrobianas obtidas de 16 dentes molares decíduos com polpa
necrosada e com fístula, extraídos de crianças entre 4 e 6 anos de idade. Os
produtos utilizados para o preparo das pastas foram: extrato etanólico da própolis
brasileira (EEP) a 11%, extrato da própolis brasileira sem etanol (EP); Hidróxido de
cálcio p.a (HC) e propilenoglicol. Foram preparadas duas pastas na consistência de
creme dental: EEP + HC e EP + HC. A análise microbiológica foi realizada em
duplicata por meio da técnica de difusão em ágar. Ambas as pastas apresentaram
zonas de inibição maiores (EEP-HC/13,56 mm e EP-HC/14,88 mm) contra os
microrganismos coletados dos canais radiculares do que a pasta de hidróxido de
cálcio associada ao propilenoglicol (11,63 mm). A pasta EP + HC apresentou zonas
de inibição um pouco maiores que a EEP-HC. Os autores concluíram que a
associação entre a própolis e hidróxido de cálcio foi efetiva no controle das infecções
dentárias in vitro.
51
Maia-Filho et al. (2008) avaliaram a atividade antimicrobiana da própolis
produzida pelas abelhas Scaptotrigona sp. e de diferentes medicações utilizadas
durante o tratamento endodôntico contra o Enterococcus faecalis. As medicações
testadas foram: I- Hidróxido de Cálcio (HC), II- Clorexidina gel 2% (CHX), III-
Hipoclorito de Sódio 5% (HS) e IV- Extrato de própolis (EP). Foram preparados
extratos hidroalcóolicos (7:3) das amostras da própolis, sendo a concentração final
de 1g da própolis diluída em 100mL de álcool 70%. A atividade antimicrobiana das
medicações foi avaliada por meio do teste de difusão em ágar. Para tal finalidade,
placas de cultura com ágar MH foram inoculadas com a suspensão bacteriana na
concentração de 0,5 da escala de McFarland e em seguida, discos de papel filtro
sobre o ágar contaminado foram impregnados com as medicações avaliadas e
incubados a 37°C por 24h. A concentração inibitória mínima (CIM) também foi
determinada através das seguintes diluições do extrato de própolis: 1:10, 1:20, 1:40,
1:80 e 1:160. Os halos de inibição do crescimento bacteriano foram: 21,3 mm para a
CHX, 16,2 mm para o HC, 10,9 mm para o EP e 7,2 mm para o HS. O extrato da
própolis apresentou CIM de 1mg/mL. Os autores concluíram que o extrato da
própolis apresentou boa atividade antimicrobiana, sendo maior que o hipoclorito de
sódio 5%, entretanto a clorexidina gel 2% foi a mais efetiva contra o Enterococcus
faecalis.
Awawdeh, Al Beitawi e Hammad (2009) investigaram a atividade
antibacteriana da própolis e do hidróxido de cálcio quando utilizados como
medicação intracanal em espécimes de dentina infectados com E. faecalis. Foram
utilizados 50 dentes unirradiculares extraídos por indicação ortodôntica que foram
preparados, obtendo-se espécimes cilíndricos de dentina radicular. Cinco espécimes
foram selecionados aleatoriamente e mantidos como controle negativo. Os
espécimes restantes foram inoculados com E. faecalis e incubados a 37°C por 21
dias e a infecção confirmada por MEV. Em seguida, os espécimes foram divididos
aleatoriamente em três grupos e tiveram os canais radiculares preenchidos pela
solução de própolis 30% (n=20, Grupo I), pasta de hidróxido de cálcio (n=20, Grupo
II) ou solução salina (n=4; Grupo III- controle positivo). No grupo controle negativo
(n= 4), os espécimes foram imersos em meio de cultura esterilizada. Os espécimes
foram selados com cimento temporário e reincubados a 37°C por 24 e 48h. Após o
período de incubação os espécimes foram irrigados com solução salina para
52
remoção da medição intracanal. Para os testes microbiológicos, foram realizadas
coletas por meio de cones de papel esterilizados, os quais foram transferidos para
placas de ágar incubados a 37°C por 24h para observação de crescimento
bacteriano. Os resultados mostraram que para os espécimes tratados com a própolis
30%, não houve crescimento do microrganismo testado nos tempos experimentais,
enquanto que o hidróxido de cálcio mostrou-se ineficaz nos mesmos períodos.
Castro et al. (2009) avaliaram a atividade antimicrobiana dos principais
ácidos graxos do extrato etanólico e suas frações e identificaram a natureza química
dos compostos bioativos a partir do isolamento da própolis brasileira do tipo 6. O
extrato etanólico da própolis tipo 6 (EEP), a sua fração hexânica (H-Fr), os principais
ácidos graxos e sub-frações isoladas foram analisadas por meio de cromatografia
líquida de alta precisão (HPLC), cromatografia gasosa com detector de ionização de
chama (HRGC-FID) e cromatografia gasosa de massa e espectrofotometria (GC-
MS). Três sub-frações e ácidos graxos foram testados contra o Staphylococcus
aureus e Streptococcus mutans através da concentração inibitória mínima (CIM) e
concentração bactericida mínima (CBM). O EEP e H-Fr inibiram o crescimento dos
microrganismos testados, no entanto os principais ácidos graxos não exerceram
atividade antimicrobiana. As três sub-frações (1, 2 e 3) foram isoladas a partir de H-
Fr por HPLC e apenas a sub-fração 1 apresentou atividade antimicrobiana. Os
autores concluíram que os principais ácidos graxos testados (ácido oléico, palmítico,
linoléico e esteárico) não foram os responsáveis pela atividade antimicrobiana da
própolis tipo 6. A sub-fração 1, pertencente à classe da benzofenona, foi a
responsável pela atividade antimicrobiana observada neste estudo.
Kayaoglu et al. (2011) avaliaram a atividade antimicrobiana de duas
amostras de própolis (ART e TM), comparadas a medicações intracanais
estabelecidas como clorexidina (CHX), hidróxido de cálcio e etanol (controle), contra
o Enterococcus faecalis. Foram utilizados blocos de dentina obtidos a partir de
dentes humanos uniradiculares que foram infectados e incubados por 2 semanas.
Posteriormente, o canal radicular foi preenchido com as medicações no período de 1
a 7 dias. Em seguida, após a remoção das medicações intracanais, raspas de
dentina foram removidas por meio de brocas Gates-glidden nº 6 e transferidas para
tubos contendo solução salina para preparo da suspensão bacteriana. Alíquotas da
suspensão foram transferidas para placas de ágar TSA e incubados por 2 dias para
53
contagem de UFC/mL. Todas as medicações testadas foram eficazes contra E.
faecalis. No 1º dia, não houve diferença entre as amostras de própolis e o etanol,
porém no 7º dia houve redução bacteriana significativa para as amostras de própolis.
As duas amostras de própolis foram estatisticamente semelhantes entre si e ao
hidróxido de cálcio ao 7º dia. A amostra TM foi semelhante a CHX ao 7º dia. A CHX
foi a medicação mais eficaz para os dois períodos. A própolis exerceu atividade
antimicrobiana superior ao hidróxido de cálcio e inferior à CHX.
Kandaswamy et al. (2010) avaliaram a atividade antimicrobiana de
diferentes medicações intracanais contra o Enterococcus faecalis. As medicações
testadas foram: clorexidina 2% (CHX), própolis (PP), suco de Citrofolia morinda
(SCM), iodo povidine 2% (I-POV) e hidróxido de cálcio (HC). Dentes humanos recém
extraídos foram infectados e incubados por 21 dias a 37°C. Os dentes foram
divididos em 6 grupos: I- Salina (controle negativo); II- PP; III- SCM; IV: I-POV; V-
CHX; VI- HC. Os espécimes receberam as medicações e foram incubados por 3
períodos: 1, 3 e 5 dias. Posteriormente, após a remoção das medicações testadas,
raspas de dentina foram coletadas nas profundidades de 200 e 400 µm por meio de
brocas Gates-glidden nº 4 e 5 e, transferidas para tubos de ensaio contendo caldo
TS esterilizado. Após 24h de incubação a 37°C, alíquotas foram transferidas para
placas de ágar TS e as colônias foram tabuladas. O grupo da CHX produziu o
melhor efeito antimicrobiano (100%), seguido de I-POV (87%), PP (71%), SCM
(69%) e HC (55%). Não houve diferença significativa entre a própolis e o suco de
citrofolia morinda, sendo eficazes contra o E. faecalis.
Madhubala, Srinivasan e Ahamed (2011) avaliaram e compararam a
atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio, associação triantibiótica e extrato
etanólico da própolis contra o Enterococcus faecalis. Foram utilizados dentes
incisivos humanos que tiveram suas coroas removidas e o canal radicular
preparado. Os espécimes foram infectados e incubados por 21 dias. Após o período
de incubação as unidades formadoras de colônia (UFC), foram contadas antes da
inserção das medicações intracanais. Posteriormente, os espécimes foram divididos
em 5 grupos: I- Hidróxido de cálcio; II- Associação triantibiótica (ciprofloxacina,
minociclina e metronidazol); III- Própolis; IV: etanol; V- Solução salina. As
medicações intracanais foram inseridas nos canais radiculares e incubados por 3
períodos diferentes: 1, 2 e 7 dias. O efeito antimicrobiano das medicações foi
54
determinado através da porcentagem de redução do número de UFC (%RCC). A
maior % RCC foi para própolis (100%) no 2º dia, seguida da associação triantibiótica
(82,5 %-1º dia; 92,2%-2º dia e 98,4%-3º dia). O hidróxido de cálcio mostrou aumento
gradual da atividade antimicrobiana atingindo o máximo de 59,4% no 7º dia. Os
autores concluíram que a própolis foi mais eficaz contra o E. faecalis quando
comparada à associação triantibiótica no período de 2 dias, porém ambas foram
semelhantes ao 7º dia.
Jahromi, Toubayani e Rezaei (2012) avaliaram o efeito antimicrobiano da
própolis comparada ao hidróxido de cálcio por meio da contagem de unidades
formadoras de colônia (UFC) e concentração inibitória mínima (CIM). Foram
utilizados dentes humanos uniradiculares extraídos por finalidade ortodôntica, que
foram preparados, infectados com E. faecalis na escala 0.5 de McFarland e
incubados a 37°C por 21 dias. Após o período de incubação, os espécimes foram
divididos em 5 grupos: I- Hidróxido de cálcio; II- Própolis; III- Etanol; IV- Sem
medicação (controle positivo); V- Meio de cultura esterilizado (controle negativo). As
medicações intracanais foram inseridas nos canais radiculares e incubados por 1
semana. Em seguida, raspas de dentina do interior dos canais radiculares foram
coletadas e inseridas em tubos contendo caldo BHI. Após incubação a 37°C por 1
semana, alíquotas foram transferidas para placas de ágar Muller-Hinton e incubadas
por 48 h. O teste de concentração inibitória mínima (CIM Própolis: 340µg/mL e CIM
Hidróxido de cálcio: 2.500340µg/mL) e a quantidade de UFC (Própolis: 5.80 e
Hidróxido de cálcio: 183.55) demonstraram superioridade da própolis em relação ao
hidróxido de cálcio. Os autores concluíram que a própolis foi um agente eficaz contra
o E. faecalis como medicação intracanal.
2.2.3 Biocompatibilidade
Al Shaher et al. (2004) avaliaram a tolerância de fibroblastos da polpa
dentária e do ligamento periodontal de terceiros molares humanos recém
erupcionados e extraídos à várias concentrações da própolis(0-20 mg/mL) e do
hidróxido de cálcio (0-250mg/mL). A viabilidade celular após o tratamento com os
agentes antimicrobianos estudados foi analisada pela coloração violeta cristal
55
seguida por análise de espectrofotometria por meio do Leitor Elisa. Os resultados
revelaram que a própolis nas concentrações igual ou menor que 4 mg/mL não foram
tóxicas para os fibroblastos do ligamento periodontal, tampouco para as células da
polpa dentária, como viabilidade celular superior a 75%. Entretanto, o hidróxido de
cálcio, na concentração de 0.4 mg/mL foi citotóxica e menos de 25% das células
foram consideradas viáveis. Os autores sugeriram que a própolis possa ser utilizada
como medicação intracanal devido à sua baixa toxicidade.
Barbaric et al. (2011) avaliaram vinte amostras de própolis que foram
coletadas de 17 localidades da Croácia (I-XVII), 2 da Bósnia (XVIII-XIX) e 1 da
Macedônia (XX). A HPLC foi utilizada para determinar a composição química dos
polifenóis. Experimentos biológicos in vitro foram realizados sobre células de
adenocarcinoma cervical (HeLa). Foram determinados ácidos fenólicos (ácido
ferúlico, ácido p-cumárico e ácido caféico) e flavonóides (tectocrisina, galangina,
pinocembrin, pinocembrin-7-metiléter, crisina, apigenina, caempferol e quercitina).
Todas as amostras possuíam tectocrisina em intervalos de 0,1988 mg/g (XVIII) a
1,2004 mg/g (III), enquanto que o ácido caféico e quercitina não foram encontrados.
O flavonóide mais abundante foi a galangina em intervalos de 0,3706mg/g (XVII) a
47,487mg/g (IX). As amostras de própolis I, VI e X aplicadas no intervalo de
concentração manifestaram redução significativa do crescimento celular. GI(50) que
foi utilizado como indicador de citotoxicidade entre amostras de própolis, revelou que
a própolis VII foi a mais eficaz (GI(50)= 70ug/mL), seguida de XV, XVIII e I. Os
autores concluíram quem o efeito antiproliferativo e citotóxico da própolis sobre as
células HeLa não se correlaciona com a concentração dos componentes
individualmente, mas sim com o sinergismo entre ácidos fenólicos e flavonóides. As
diferenças na composição química conduzem a diversidade da atividade biológica
das amostras de própolis.
3 OBJETIVOS
57
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito antimicrobiano de
medicações intracanais a base de própolis marrom sobre Enterococcus faecalis.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Avaliar a concentração inibitória mínima do extrato bruto da própolis
marrom sobre Enterococcus faecalis;
b) Comparar a atividade antimicrobiana de medicações intracanais a base
de própolis marrom em diferentes concentrações contra Enterococcus faecalis;
c) Comparar a atividade antimicrobiana entre medicações intracanais a
base de própolis marrom e a pasta de hidróxido de cálcio contra Enterococcus
faecalis;
d) Avaliar o potencial antimicrobiano dos extratos brutos da própolis
marrom associadas à pasta de hidróxido de cálcio sobre Enterococcus faecalis;
e) Comparar o pH das medicações intracanais estudadas.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
59
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO DA PRÓPOLIS MARROM
O extrato bruto da própolis marrom foi preparado de acordo com método
proposto por Cabral et al. (2009). Para tal finalidade, 495,81g da própolis marrom
bruta da espécie Apis mellifera, foram coletadas no apiário de Nossa Senhora do
Livramento, fazenda Pirizal, no interior do Cerrado Matogrossense, que apresenta
pastagem com várias árvores adultas, a maioria delas sucupira (Pterodon
emarginatus) e guanandi (Calophyllum brasiliense). A amostra obtida foi
acondicionada em saco plástico hermeticamente fechado à temperatura ambiente e
posteriormente, foi triturada manualmente, homogeneizada e mantida em
refrigerador a -18°C até o momento da extração (Figura 1).
Figura 1 - Própolis marrom bruta triturada.
Em seguida, a amostra foi submetida à extração utilizando-se 2L de álcool
de cereais a 80%, à temperatura de 60ºC, com auxílio do ultrassom (Ultrasonic
Cleaner 1440 USC, Unique, Santo Amaro, SP, Brasil) durante 15 minutos, sob
agitação constante. Finalmente, o extrato bruto foi obtido por concentração em
rotaevaporador (Evaporador rotativo 802, Fisatom, São Paulo, SP, Brasil) (Figura 2),
obtendo-se uma massa de 174,73g de extrato bruto da própolis marrom para a
execução das atividades propostas.
60
Figura 2 - (A-D) Preparo do extrato bruto etanólico da própolis marrom: (A) Extração da própolis bruta com 2L de álcool de cereais a 80%; (B) Homogeneização da solução com auxílio do ultrassom; (C) Concentração do extrato etanólico da própolis marrom em rotaevaporador. (D) Extrato bruto da própolis marrom.
4.2 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE MEDICAÇÕES INTRACANAIS A BASE DA PRÓPOLIS MARROM
4.2.1 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
O extrato bruto da própolis marrom foi solubilizado, serialmente, em
dimetilsulfóxido (DMSO) (SZLISZKA et al., 2011) nas concentrações de 20mg/mL,
50mg/mL, 100mg/mL e 200mg/mL (Figura 3).
61
Figura 3 - Extratos da própolis marrom em diferentes concentrações solubilizados em DMSO: 200mg/mL (1); 100 mg/mL (2); 50 mg/mL (3); 20 mg/mL (4).
Para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da própolis
marrom foi utilizado o método da microdiluição em caldo e cepa de Enterococcus
faecalis (ATCC 29212), disponível no Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade
de Farmácia e Bioquímica da Universidade de Cuiabá. A CIM é definida como a
menor concentração do agente antimicrobiano capaz de inibir o crescimento do
microrganismo nos poços de microdiluição em placa com 96 poços (Costa - Corning,
New York, NY, USA).
O meio de cultura utilizado foi o caldo Muller-Hinton (MH; Difco
Laboratories, Detroit, MI, USA); 64 mg/mL de Cloranfenicol (Sigma Chemical,
Badlapur, India), como controle positivo (substância padrão) e, o caldo Muller-Hinton
(MH) esterilizado, como controle negativo. O desenho esquemático da organização
da placa de 96 poços para o teste de microdiluicão em caldo está apresentado na
Figura 4.
Para a leitura visual, a técnica da resazurina foi utilizada. (AHMED;
GOGAL; WALSH, 1994; MONTEIRO et al., 2012). Após 24 horas de incubação da
placa em estufa a 37o C, 30 μL da solução aquosa de resazurina a 0,01%
(OLIVEIRA et al., 2006; ALVES, 2008) foram adicionados em cada poço e então, a
placa foi novamente incubada em estufa a 37o C durante 4h. A manutenção da cor
62
azul nos poços foi interpretada como ausência de crescimento bacteriano e o
desenvolvimento da cor rosa, como presença do crescimento bacteriano. A
resazurina é um corante (sal C12H6NNaO4), indicador da reação de
oxidação/redução, que permite analisar o crescimento microbiano pela alteração da
forma azul oxidada não fluorescente para a forma rosa fluorescente e reduzida por
enzimas citoplasmáticas e mitocondriais. (AHMED; GOGAL; WALSH, 1994).
Cada concentração do extrato foi testada em duplicata e o teste foi
repetido três vezes.
Figura 4 - Representação esquemática da microplaca na determinação da CIM dos extratos da
própolis marrom, utilizando a técnica da resazurina.
4.2.1.1 Obtenção dos inóculos bacterianos
Os inóculos bacterianos foram preparados e padronizados de acordo com
a metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição
63
para Bactéria de Crescimento Aeróbio: Norma Aprovada – Sexta Edição (Normas do
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute) (NCCLS, 2003), com algumas
modificações. (MITSCHER; BEAL; BATHALA, 1972). Colônias puras de E. faecalis
foram cultivadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion, Difco Laboratories, Detroit, MI,
USA), suplementado com sangue de carneiro desfibrinado 5% por 24 horas. Para o
isolamento de colônias jovens, alíquotas foram transferidas para uma placa de Petri
com ágar Müller Hinton (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) e incubadas a 35ºC,
por aproximadamente 24 horas. Após o período de incubação, foram selecionadas
de 4 a 5 colônias e transferidas para um tubo contendo 5 mL de solução salina
esterilizada. A suspensão celular foi ajustada para aproximadamente 1,5 x 108
unidades formadoras de colônias/mL, equivalente a turbidez 6 da escala padrão de
McFarland 0,5. Para verificação da pureza das cepas, foram utilizados meios
seletivos específicos para o crescimento e avaliação microscópica.
4.2.2 Preparo das medicações intracanais
O preparo das medicações intracanais foi realizado no Laboratório de
Pesquisa de Produtos Naturais da Faculdade de Farmácia-Bioquímica da
Universidade de Cuiabá - UNIC. Os componentes utilizados foram: hidróxido de
cálcio p.a. (Hidroxil, Inodon, Porto Alegre, RS, Brasil), polietilenoglicol (Carbowax
400, Henrifarma, São Paulo, SP, Brasil), extrato bruto de própolis marrom a 20% e
extrato bruto de própolis marrom a 40%.
As concentrações de própolis marrom 20% e 40% foram selecionadas
para o desenvolvimento do presente estudo. As medicações intracanais, as
proporções de manipulação e os grupos que as representam estão descritos na
Tabela 1.
64
Tabela 1 - Apresentação dos grupos experimentais, das medicações intracanais e suas respectivas proporções de manipulação.
GRUPO EXPERIMENTAL
MEDICAÇÃO INTRACANAL PROPORÇÃO DE MANIPULAÇÃO
G1 Pasta de Hidróxido de Cálcio
(Hidróxido de cálcio p.a. + Carbowax 400)-Pasta Base 4g :4,5mL
G2 Carbowax 400 (controle negativo) -
G3 Extrato bruto de própolis 20% + Carbowax 400 0,2g :1mL
G4 Extrato bruto de própolis 40% + Carbowax 400 0,4g :1mL
G5 Extrato bruto de própolis 20% + Pasta de Hidróxido de
Cálcio 1:1
G6 Extrato bruto de própolis 40% + Pasta de Hidróxido de
Cálcio 1:1
Os componentes foram pesados em balança analítica de alta precisão
(Q500L210C, Quimis, Diadema, SP, Brasil) e as pastas foram preparadas com
auxílio de placa de vidro (Jon, São Paulo, SP, Brasil) e espátula 24 (Duflex, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil).
Inicialmente, a pasta base (Pasta de Hidróxido de cálcio; G1) foi
manipulada até atingir a consistência ideal para uso em Endodontia, ou seja,
semelhante ao creme dental. (ESTRELA et al., 1999). Finalmente, após o preparo
das medicações experimentais, as mesmas foram armazenadas em seringas
plásticas descartáveis de 3 mL (Injex, Ourinhos, SP, Brasil) para facilitar a utilização
durante o experimento (Figura 5).
Figura 5 - Medicações intracanais preparadas para os testes microbiológicos: G1- Pasta de Hidróxido
de Cálcio (Pasta base), G2- Polietilenoglicol 400, G3- Extrato bruto de Própolis 20%, G4- Extrato bruto de Própolis 40%, G5- Extrato bruto de Própolis 20% + Pasta de Hidróxido de Cálcio e G6- Extrato bruto de Própolis 40% + Pasta de Hidróxido de Cálcio.
65
O pH das pastas testadas foi avaliado, em triplicata, através da utilização
de um pHmetro digital (Bel PH 966 Plus, Biovera, Ramos, RJ, Brasil).
4.2.3 Infecção e desinfecção de dentina bovina
Para a avaliação da atividade antimicrobiana de medicações intracanais a
base da própolis marrom, o método proposto por Gomes et al. (2003) de infecção e
desinfecção da dentina bovina, foi empregado. Para tal finalidade, 30 dentes
incisivos centrais bovinos íntegros, recém extraídos, com completa formação
radicular (Figura 6), foram obtidos na Faculdade de Odontologia de Bauru-USP
(Anexo 1). Após a extração, os dentes foram mantidos em solução de hipoclorito de
sódio 0,5% durante 24 horas e então, raspados com curetas para remoção dos
remanescentes de tecidos periodontais e ósseo. Em seguida, foram armazenados,
sob refrigeração, em solução de timol 0,1% para desinfecção superficial e
conservação até o momento da obtenção dos espécimes. (LANA et al., 2009; BACA
et al., 2011).
Figura 6 - Incisivo central bovino íntegro recém extraído.
4.2.3.1 Preparo dos espécimes
Para a obtenção dos espécimes, os dentes foram fixados com godiva de
baixa fusão (Godiva Exata, DFL, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) em uma base de acrílico
que foi acoplada a um mini-torno de bancada giratório (WT70G, Worker, Curitiba,
66
PR, Brasil) e os segmentos dentários foram obtidos por meio de disco diamantado
flexível dupla-face de 22 mm (7020, KG Sorensen, Cotia, SP, Brasil), sob
refrigeração, acoplado à peça reta em baixa rotação (Kavo, Joinville, SC, Brasil).
Inicialmente, dois terços da coroa dentária e 5 mm da porção apical da
raiz foram descartados, mantendo a estrutura remanescente com espaço pulpar
central. Em seguida, três cilindros de aproximadamente 4 mm de comprimento foram
obtidos de cada estrutura remanescente. O cemento dos espécimes foi removido
com broca diamantada cilíndrica em baixa rotação (ref. 3101, KG Sorensen, Cotia,
SP, Brasil), sob refrigeração, deixando o diâmetro dos cilindros de dentina com
aproximadamente 6 mm. Para a padronização do diâmetro do canal radicular, este
foi ampliado a aproximadamente 2,3 mm, utilizando-se uma broca esférica carbide
nº 04 (Maillefer, Dentsply, Matão, São Paulo, Brasil) (Figura 7 - A e B). Todos os
procedimentos de preparo dos cilindros foram realizados sob refrigeração e os
espécimes, mantidos em água corrente para evitar desidratação. As medidas
obtidas para a confecção dos espécimes foram confirmadas por meio de um
paquímetro eletrônico digital (Starrett Indústria e Comércio Ltda, São Paulo, SP
Brasil). Os espécimes foram mantidos em solução salina tamponada (pH.74) até o
momento do experimento.
Figura 7 - (A-B) Dimensões dos espécimes de dentina bovina. (A) Desenho esquemático do preparo dos espécimes; (B) Espécime de dentina bovina.
4.2.3.2 Tratamento da dentina para remoção de smear layer
Para remoção da camada de smear layer, os espécimes foram
acondicionados em tubos de ensaio, contendo 3 mL da solução de hipoclorito de
67
sódio 5,25% e transferidos para banho ultrassônico por 10 minutos (Ultrasonic
Cleaner 1440 USC, Unique, Santo Amaro, SP, Brasil). Em seguida, os espécimes
foram lavados em água corrente por uma hora para remoção dos resíduos da
solução de hipoclorito de sódio (PEREZ et al., 1993) e então, imersos em EDTA a
17% (pH.7.2) e ultrassonificados por mais 10 minutos. Novamente, os espécimes
foram lavados em água corrente por 1 hora.
4.2.3.3 Esterilização dos espécimes
Os espécimes foram autoclavados, individualmente, no interior de tubos
de ensaio contendo 3 mL de caldo BHI por 15 minutos a 120oC. A eficácia da
esterilização foi confirmada pela incubação dos espécimes a 37oC por 24 horas.
Para facilitar a penetração do meio de cultura, os tubos de ensaio contendo os
espécimes foram levados ao tratamento ultrassônico por 10 minutos. (HAAPASALO;
ORSTAVIK, 1987).
4.2.3.4 Preparo dos inóculos e contaminação bacteriana dos espécimes
Para a contaminação dos espécimes, inóculos bacterianos foram
preparados como descrito anteriormente (Item 4.2.1.1).
Em capela de fluxo laminar (Q216-F20M, Quimis, Diadema, SP, Brasil),
após o período de incubação para confirmação da esterilização dos espécimes, 2
mL de BHI dos tubos contendo os espécimes foram substituídos por 2 mL dos
inóculos do E. faecalis e novamente, incubados por 21 dias a 37oC (SALEH et al.,
2004; DELGADO et al., 2010; KANDASWAMY et al., 2010; BACA et al., 2011;
MADHUBALA; SRINIVASAN; AHAMED, 2011; MATOS NETO et al., 2012; LIMA et
al., 2012). A cada dois dias, 1 mL do BHI contaminado foi substituído por 1 mL de
BHI esterilizado, recém-preparado, para evitar a saturação do meio. A turbidez do
meio durante os períodos de incubação indicaram o crescimento bacteriano.
68
4.2.3.5 Avaliação da desinfecção dos espécimes de dentina contaminados pelos extratos
Após a infecção dos espécimes de dentina, cada espécime foi removido
dos tubos de ensaio, sob condições assépticas, e o canal radicular foi irrigado com 5
mL de solução salina fisiológica e seco com cones de papel esterilizados (Tanari,
Manacapuru, AM, Brasil). As superfícies externas foram cobertas por esmalte incolor
(Colorama, São Paulo, SP, Brasil) para prevenir contaminação interna (HELING et
al., 1992). Os espécimes foram fixados no fundo dos poços de microplacas de 24
poços (Corning, New York, NY, USA,) com cera utilidade descontaminada (Clássico,
São Paulo, SP, Brasil) em luz ultravioleta, a qual também obliterou a superfície
inferior do canal radicular. Os poços foram então preenchidos com Ágar a 46°C
(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) até atingir a superfície superior dos espécimes
de dentina. Finalmente, os medicamentos intracanais foram aplicados no lúmen dos
canais radiculares com auxílio de seringa plástica de 3 mL até o preenchimento total
(Figura 8. A-D). Os espécimes foram divididos, aleatoriamente, em 6 grupos de
acordo com os medicamentos intracanais (N=5/Grupo). Após o preenchimento de
todos os canais radiculares, os espécimes foram incubados a 37°C por 14 dias.
Ao término dos 14 dias, os espécimes foram removidos das placas de
cultura e irrigados com 5mL de solução salina fisiológica para remoção de todo o
medicamento e foram secos com cones de papel absorventes esterilizados. Cada
espécime foi mantido em posição em uma bandeja plástica esterilizada (Indusbello,
Londrina, PR, Brasil) com o auxílio de uma pinça clínica esterilizada (Duflex, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil) durante a obtenção das raspas de dentina.
69
Figura 8 - (A-D) Preparo dos espécimes para avaliação da desinfecção dos espécimes de dentina contaminados pelas medicações intracanais estudadas: (A) Espécimes infectados com Enterococcus faecalis. (B) Posicionamento da cera descontaminada no interior da placa de cultura com 24 poços para posterior fixação dos espécimes; (C) e (D) Espécimes posicionados sobre a cera utilidade e espaço intracanal radicular preenchido por medicação experimental.
As raspas dentinárias foram obtidas, sequencialmente, com profundidade
de aproximadamente 400 m, por meio da utilização de brocas esféricas
esterilizadas acopladas em micromotor em baixa rotação (Kavo, Joinville, SC, Brasil)
com diâmetros progressivos, nº 6 e n° 8 (Maillefer, Dentisply, Matão, SP, Brasil). As
brocas penetraram no canal e removeram, concentricamente, uma camada de
dentina da superfície interna do canal de aproximadamente 100 m (ASSOULINE et
al., 2001) (Figura 9-A e B), permitindo avaliar a difusão das medicações no interior
da dentina.
Para padronização do volume das raspas de dentina obtido, estas foram
pesadas em balança analítica de precisão (Q500L210C, Quimis, Diadema, SP,
Brasil). As raspas de dentina contidas em cada broca e o remanescente dos
espécimes foram, imediatamente, inseridos em tubos do tipo de ensaio contendo 3
mL de caldo BHI (Figura 10) e então, incubados a 37oC por 15 dias (HAAPASALO;
ORSTAVIK, 1987). Os tubos foram avaliados diariamente para a verificação da
turvação do caldo e indicativo de crescimento bacteriano.
70
Figura 9 - (A-B) Método de avaliação da desinfecção de dentina bovina. (A) Obtenção de raspas de
dentina por meio de brocas esféricas em baixa rotação; (B) Aumento progressivo da largura do canal em função da troca das brocas.
Fonte: (GOMES et al., 2003).
Figura 10 - Tubos de ensaio contendo as brocas n° 6 e nº8 e espécime, respectivamente, após a
remoção das raspas de dentina.
71
Após 15 dias de incubação, o crescimento bacteriano foi analisado por
espectrofotometria (Leitor de ELISA, SpectraMax 190 Absorbance Microplate
Reader, Sunnyvale, CA, USA), com comprimento de onda de 570 nm (redução) e
630nm (oxidação) (ZRIMSEK et al., 2004) na Universidade Federal do Mato Grosso-
UFMT (Laboratório de Bioquímica e Pesquisa, Faculdade de Medicina, Cuiabá, Mato
Grosso). Para tal finalidade, 100µL do conteúdo de cada tubo foram transferidos, em
triplicata, para microplacas de 96 poços adicionados de 30 µL de solução aquosa de
resazurina 0,01% e incubadas em estufa a 37o.C por 4h (Figura 11).
Figura 11 - Representação esquemática da microplaca na determinação da taxa de crescimento bacteriano por espectrofotometria, utilizando resazurina como revelador.
4.3 TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS
No presente estudo, a medicação intracanal e a difusão dos materiais no
interior da dentina foram consideradas variáveis independentes, influenciando ou
72
não, a taxa de crescimento bacteriano, considerado como variável dependente.
A variável independente material apresentou seis níveis: Pasta de
Hidróxido de Cálcio (G1), Polietilenoglicol 400 (G2), Pasta de Própolis 20% (G3),
Pasta de Própolis 40% (G4), Pasta de Própolis 20% + Pasta de Hidróxido de Cálcio
(G5) e Pasta de Própolis 40% + Pasta de Hidróxido de Cálcio (G6). A variável
difusão dos materiais no interior da dentina apresentou 2 níveis: diâmetro da broca
no.6 (d1) e diâmetro da broca no. (d2). Assim, de acordo com a proposição deste
trabalho, as hipóteses testadas foram:
1. Quanto a medicação intracanal
H0: a medicação intracanal não exerce influência na taxa de crescimento
bacteriano;
H1: a medicação intracanal exerce influência na taxa de crescimento
bacteriano;
2. Quanto a difusão dos materiais no interior da dentina
H0: a difusão dos materiais no interior da dentina não exerce influência na
taxa de crescimento bacteriano;
H1: a difusão dos materiais no interior da dentina exerce influência na
taxa de crescimento bacteriano;
3. Quanto à interação medicação intracanal/difusão dos materiais no
interior da dentina
H0: a interação medicação intracanal/difusão dos materiais no interior da
dentina não exerce influência na taxa de crescimento bacteriano;
H1: a interação medicação intracanal/difusão dos materiais no interior da
dentina exerce influência na taxa de crescimento bacteriano.
5 RESULTADOS
74
5 RESULTADOS
O extrato de própolis marrom apresentou atividade antimicrobiana contra
Enterococcus faecalis, sendo observada a concentração inibitória mínima (CIM) de
100mg/mL por meio do teste de microdiluição em caldo.
O pH das medicações intracanais testadas em triplicata dos grupos G1 a
G6 estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 - Análise do pH das medicações intracanais testadas.
LEITURA DO pH GRUPOS EXPERIMENTAIS
G1 G2 G3 G4 G5 G6
1 11,74 9,28 7,25 6,0 11,36 12,48
2 13,51 9,58 6,79 5,74 12,0 12,62
3 14,12 9,79 6,45 5,67 12,3 12,74
VALOR MÉDIO DO pH 13,12 9,55 6,83 5,80 11,88 12,61
A taxa de crescimento bacteriano foi calculada de acordo com a seguinte
fórmula (SZLISKA et al., 2011):
% proliferação bacteriana = ALW – (AHW x R0) x 100
ALW - valor da absorbância a 570 nm
AHW - valor da absorbância a 630nm
R0=AOLW/AOHW
AOLW – Valor da absorbância do meio de cultura + resazurina – Valor da
absorbância do meio de cultura isolado a 570nm
AOHW - Valor da absorbância do meio de cultura + resazurina – Valor da
absorbância do meio de cultura isolado a 630nm
Os dados obtidos por espectrofotometria na técnica da resazurina estão
apresentados na Tabela 3.
75
Tabela 3 - Análise descritiva dos dados referente ao crescimento bacteriano, considerando a variável medicação intracanal.
* G1-Pasta-base; G2- Carbowax 400; G3- Pasta de própolis 20%; G3- Pasta de própolis 40%; G5- Pasta de Própolis 20% + Pasta-base; G6- Pasta de própolis 40% + pasta-base.
O teste de correlação de Pearson foi aplicado para avaliar a correlação
entre o pH e a taxa de crescimento bacteriano (p= 0,758).
Aplicou-se um modelo de análise de variância (ANOVA) para a análise
das variáveis independentes, medicação intracanal, difusão dos materiais e
associação de ambas. Testou-se a aderência dos resíduos a distribuição Normal e à
homocedasticidade pelos testes de Kolmogorov-Smirnov e Levene,
respectivamente, ao nível de significância de 5% (α = 0,05). Detectou-se uma
diferença significativa quanto a homogeneidade de variâncias, a qual foi contornada
com o uso de um teste post hoc robusto quanto a heterocedasticidade.
A ANOVA identificou diferença estatística entre os grupos apenas para a
variável independente medicação intracanal (Tabela 4).
Tabela 4 - Análise de variância para o crescimento bacteriano.
* Valor estatisticamente significante (p < 0,05)
MEDICAÇÃO INTRACANAL*
NÚMERO DE ESPÉCIMES
ABSORBÂNCIA MÍNIMA MÉDIA
(570 nm)
ABSORBÂNCIA MÁXIMA MÉDIA
(630 nm)
TAXA DE CRESCIMENTO BACTERIANO
MÉDIO (%)
G1 24 0,61 0,28 -21,35
G2 30 0,45 0,15 -3,66
G3 29 0,61 0,30 -34,59
G4 24 0,67 0,30 -35,82
G5 30 0,71 0,35 -41,05
G6 30 0,50 0,23 -29,83
VARIÁVEIS INDEPENDENTES
SOMA DOS QUADRADOS
GRAU DE LIBERDADE
(df)
MÉDIA DOS QUADRADOS
f NÌVEL DE
SIGNIFICÂNCIA
Medicação Intracanal
26807,034 5 5361,407 18,340 0,000*
Difusão dos materiais
545,185 1 545,185 1,865 0,174
Medicação intracanal/Difusão
dos materiais 867,973 5 173,595 0,594 0,705
76
Por esta razão, o teste post hoc de Tamhane foi selecionado para
localização das diferenças considerando os grupos dois a dois. Os resultados estão
apresentados na Tabela 5.
Tabela 5 - Teste de Tamhane para as comparações múltiplas, segundo a variável medicação intracanal.
* Valor estatisticamente significante (p < 0,05)
MEDICAÇÃO INTRACANAL
( A)
MEDICAÇÃO
INTRACANAL (B)
DIFERENÇA MÉDIA (A-B)
ERRO PADRÃO
GRAU DE SIGNIFIÂCANCIA
INTERVALO DE CONFIANÇA 95%
MENOR VALOR
MAIOR VALOR
G1 (N=24)
G2 G3 G4 G5 G6
-17,6863% 13,2360% 14,4707% 19,7042% 8,4794%
4,68330% 4,71813% 4,93567% 4,68239% 4,68239%
0,003* 0,062 0,044* 0,001* 0,462
-31,1983% -0,3791% 0,2278% 6,1922% -5,0326%
-4,1744% 26,8511% 28,7135% 33,2161% 21,9913%
G2 (N=30)
G1 G3 G4 G5 G6
17,6863% 30,9223% 32,1570% 37,3905% 26,1657%
4,68239% 4,45249% 4,68239% 4,41460% 4,41460%
0,003* 0,000* 0,000* 0,000* 0,000*
4,1744% 18,0738% 18,6451% 24,6513% 13,4265%
31,1983% 43,7709% 45,6690% 50,1297% 38,9049%
G3 (N=29)
G1 G2 G4 G5 G6
-13,2360% -30,9223% 1,2347% 6,4682% -4,7566%
4,71813% 4,45249% 4,71813% 4,45249% 4,45249%
0,062 0,000* 1,000 0,695 0,893
-26,8511% -43,7709% -12,3804% -6,3804% -17,6052%
0,3791%-18,0738% 14,8498% 19,3167% 8,0919%
G4 (N=24)
G1 G2 G3 G5 G6
-14,4707% -32,1570% -1,2347% 5,2335% -5,9913%
4,93567% 4,68239% 4,71813% 4,68239% 4,68239%
0,044* 0,000* 1,000 0,873 0,796
-28,7135% -45,6690% -14,8498% -8,2785% -19,5033%
-0,2278% -18,0738% 12,3804% 18,7455% 7,5206%
G5 (N=30)
G1 G2 G3 G4 G6
-19,7042% -37,3905% -6,4682% -5,2335% -11,2248%
4,68239% 4,41460% 4,45249% 4,68239% 4,41460%
0,001* 0,000* 0,695 0,873 0,118
-33,2161% -50,1297% -19,3167% -18,7455% -23,9640%
-6,1922% -24,6513%
6,3804% 8,2785% 1,5144%
G6 (N=30)
G1 G2 G3 G4 G5
-8,4794% -26,1657% 4,7566%
5,9913%% 11,2248%
4,68239% 4,41460% 4,45249% 4,68239% 4,4460%
0,462 0,000* 0,893 0,796 0,118
-21,9913% -38,9040% -8,0949% -7,5206% -1,5144%
5,0326% -13,4265% 17,6052% 19,5033% 23,9640%
77
A Figura 12 representa a taxa de inibição do crescimento bacteriano de
acordo com as medicações intracanais testadas.
Figura 12 - Representação gráfica dos intervalos de confiança de 95% para a taxa de inibição do
crescimento bacteriano de acordo com as medicações intracanais testadas. * Letras iguais representam valores estatisticamente iguais.
6 DISCUSSÃO
79
6 DISCUSSÃO
Vários métodos têm sido propostos para avaliação do potencial
antimicrobiano de medicações intracanais para o tratamento de infecções
endodônticas, como o teste de difusão em ágar (PARK et al., 1998; MOLANDER et
al., 1998; KOO et al., 2000; GOMES et al., 2002; GOMES et al., 2006; BALLAL et
al., 2007; SOUZA-FILHO et al., 2008; MAIA-FILHO et al., 2008; POGGIO et al.,
2012), teste de microdiluição em caldo (AL-SHAHER et al., 2004; VIANNA et al.,
2005; FERREIRA et al., 2007; KORU et al., 2007; AWADEH; AL BEITAWI;
HAMMAD, 2008; MAIA-FILHO et al., 2008; CASTRO et al., 2009; JAHROMI;
TOUBAYANI; REZAEI, 2012) e o teste de infecção e desinfecção de dentina
(ORSTAVIK; HAAPASALO, 1990; SIQUEIRA; DE UZEDA, 1996; LOVE, 2001;
DAMETTO et al., 2005; GOMES et al., 2003; VIVACQUA-GOMES et al., 2005;
ONCAG et al., 2006; REZENDE et al., 2008; VIANNA; GOMES, 2009; AWAWDEH;
AL BEITAWI; HAMMAD, 2009; DELGADO et al., 2010; ROSSI-FEDELE et al., 2010;
KANDASWAMY et al., 2010; KAYAOGLU et al., 2011; MADHUBALA; SRINIVASAN;
AHAMED, 2011; BACA et al., 2011; VAGHELA et al., 2011; FARHAD et al., 2012;
JAHROMI; TOUBAYANI; REZAEI, 2012), entre outros. Há evidências de que no
método da difusão em ágar, as zonas de inibição estão mais relacionadas à
solubilidade e difusão do material testado, do que de sua própria eficácia contra os
microrganismos, dependendo do número e espécies bacterianas inoculadas,
características do ágar e tempo de incubação. (GOMES et al., 2006).
No presente estudo, a microdiluição em caldo foi realizada para se
determinar a concentração inibitória mínima (CIM) da própolis marrom contra o E.
faecalis, a qual foi de 100 mg/mL. Diferentemente, foram observados valores
inferiores da CIM de outros tipos de própolis contra o E. faecalis, como de 4 g/mL
da própolis TB da Turquia (UZEL et al., 2005), 6425 g/mL da própolis brasileira da
região sul (FERREIRA et al., 2007) e 340 g/mL da própolis do Irã (JAHROMI;
TOUBAYANI; REZAEI, 2012). Koru et al. (2007) avaliaram a CIM da própolis verde
brasileira contra diversos microrganismos, P. anaerobius (20.8 g/mL), P. gingivalis
(294.4 g/mL), F. nucleatum (256 g/mL), P. melaninogenica (204.8 g/mL).
Entretanto, há evidências de que a diferença da atividade antimicrobiana é
80
dependente da composição dos extratos da própolis, bem como das cepas
bacterianas envolvidas. (BARBARIC et al., 2011).
O teste de infecção e desinfecção de dentina bovina foi realizado para
avaliação do potencial antimicrobiano da própolis marrom, utilizando Enterococcus
faecalis, método que tem sido utilizado em vários estudos. (LOVE, 2001; DAMETTO
et al,. 2005; GOMES et al., 2003; VIVACQUA-GOMES et al., 2005; ONCAG et al.,
2006; REZENDE et al., 2008; VIANNA; GOMES, 2009; AWAWDEH; AL BEITAWI;
HAMMAD, 2009; DELGADO et al., 2010; ROSSI-FEDELE et al., 2010;
KANDASWAMY et al., 2010; KAYAOGLU et al., 2011; MADHUBALA; SRINIVASAN;
AHAMED, 2011; BACA et al., 2011; FARHAD et al., 2012; JAHROMI; TOUBAYANI;
REZAEI, 2012).
O E. faecalis é uma espécie bacteriana gram-positiva, anaeróbia
facultativa, comumente isolada de canais radiculares com infecções persistentes
(MOLANDER et al., 1998; SUNDQVIST et al., 1998; SUNDE et al., 2002; GOMES et
al., 2003; PINHEIRO et al., 2003; SEDGLEY et al., 2005; CHIVATXARANUKUL;
DASHPER; MESSER, 2008, KANDASWAMY et al., 2010). Há evidências de que a
presença do E. faecalis em dentes com canais obturados e sinais de periodontite
crônica apical (FIGDOR; DAVIES; SUNDQVIST, 2003) e com infecções pós-
tratamento endodôntico (SEDGLEY et al., 2005) é decorrente da alta resistência a
antimicrobianos (LOVE, 2001; FERREIRA et al., 2007), sobrevivência por períodos
extensos em ambientes com privação de nutrientes e oxigênio (FIGDOR; DAVIES;
SUNDQVIST, 2003; PARADELLA; KOGA-ITO; JORGE, 2007) e, alta virulência pela
produção de substância de agregação, adesinas de superfície, LTA, produção
extracelular de superóxido, enzima lítica gelatinase e hialuronidase (KAYAOGLU;
ORSTAVIK, 2004). Cepas de E. faecalis, ATCC 29212, como no presente estudo,
tem sido utilizado em testes de avaliação antimicrobiana de medicações intracanais
(GOMES et al., 2001; VIVACQUA-GOMES et al. 2005; FERREIRA et al., 2007;
ATHANASSIADIS et al., 2010; KANDASWAMY et al., 2010; BACA et al., 2011;
KAYAOGLU et al., 2011; MADHUBALA; SRINIVASAN; AHAMED, 2011). No
presente estudo, o período de contaminação da dentina bovina foi de 21 dias,
confirmada por Awawdeh, Al Beitawi e Hammad (2009) por microscopia eletrônica
de varredura, podendo atingir uma infecção densa nas paredes laterais dos canais
radiculares de 300-400 m. (HAAPASALO; ORSTAVIK, 1987).
81
Dentes bovinos foram utilizados, na presente investigação, pela facilidade
de sua obtenção e de manuseio (ORSTAVIK; HAAPASALO, 1990; GOMES et al.,
2003). Adicionalmente, a estrutura da dentina bovina se assemelha à dentina
humana em relação à quantidade, tamanho, forma, diâmetro e densidade dos
túbulos dentinários (ORSTAVIK; HAAPASALO, 1990), o que viabiliza seu uso em
métodos de avaliação de antimicrobianos. (ORSTAVIK; HAAPASALO, 1990;
GOMES et al, 2003; ROSSI-FEDELE et al., 2010).
No presente estudo, foi utilizado o método de redução da resazurina para
avaliar a taxa de crescimento bacteriano após desinfecção de dentina contaminada
por E. faecalis (AHMED; GOGAL; WALSH, 1994). Entretanto, optou-se pela leitura
por espectrofotometria, a qual representa um método quantitativo e objetivo
(ZRIMSEK et al., 2004), ao contrário da avaliação visual que é considerada subjetiva
e variável de acordo com os examinadores. (WANG et al., 1998).
Para superar a dificuldade do controle do biofilme endodôntico pela
técnica convencional do preparo biomecânico do sistema de canais radiculares, a
escolha de agentes irrigantes e medicações intracanais adequadas deve considerar
a biocompatibilidade aos tecidos periapicais e eficácia contra patógenos resistentes.
Dentre os produtos naturais, destaca-se a própolis devido suas
propriedades terapêuticas como atividade antimicrobiana (TAKAISI-KIKUNI;
SCHILCHER, 1994; MARCUCCI, 1995; KUJUMGIEV et al., 1999; SCHELLER et al.,
1999; KOO et al., 2000; ABD EL-HADI; HEGAZI, 2002; KARTAL et al., 2003; AL-
WAILI, 2005; BOYANOVA et al., 2005; POPOVA et al., 2005), antinflamatória
(BORRELLI et al., 2002), anticarcinogênica (EL-KHAWAGA; SALEM; ELSHAL,
2003), antioxidante (RUSSO; LONGO; VANELLA, 2002), neuroprotetora (NAKAJIMA
et al., 2007), hepatoprotetora (GONZALES et al., 1995) e antiviral. (DEBIAGGI et al.,
1990; AMOROS et al., 1992, 1994; ITO et al., 2001; SCHNITZLER et al., 2010).
Embora não existam evidências na literatura da toxicidade da própolis
marrom utilizada no presente estudo, Szliszka et al. (2011) observaram que extratos
etanólicos da própolis (EEP) verde (50ug/mL) e seus componentes (artepillin C,
quercetina, caempferol e ácido cumárico) aumentaram a apoptose e a toxicidade a
células de câncer de próstata. Contrariamente, Al Shaeer et al. (2004) observaram
que, em concentração igual ou inferior a 4mg/mL, a própolis apresentou baixa
toxicidade aos fibroblastos de polpa dentária e de ligamento periodontal, sendo 10
82
vezes menos potente do que o hidróxido de cálcio. A diferença das atividades
biológicas dos diversos tipos de própolis parece ser resultado da diversidade na
composição química (BARBARIC et al., 2011), o que sugere a necessidade de mais
investigações a respeito da citotoxicidade e biocompatibilidade deste produto.
O potencial antimicrobiamo de medicações intracanais a base de própolis
sobre patógenos endodônticos tem sido estudado (KOO et al., 2000; ONCAG et al.,
2006; FERREIRA et al., 2007; AWADEH; AL BEITAWI; HAMMAD, 2009; MAIA-
FILHO et al., 2008; KANDASWAMY et al., 2010; KAYAOGLU et al., 2011;
MADHUBALA; SRINIVASAN; AHAMED, 2011; JAHROMI; TOUBAYANI; REZAEI,
2012). Há evidências de que a atividade antimicrobiana, assim como as outras
propriedades terapêuticas, estão relacionadas à qualidade e quantidade de
componentes identificados na própolis de diferentes regiões (PARK et al., 2002,
KUMAZAWA et al., 2003, SALATINO et al., 2005), especialmente pela presença de
fenóis e polifenóis, substâncias aromáticas das quais derivam as flavonas,
flavonóides e flavonóis, que têm ação sobre a parede celular bacteriana.
(GREENAWAY; SCAYSBROOK; WHATLEY, 1990; MARCUCCI; DE CAMARGO;
LOPES, 1996; KOO et al., 2000; BANKOVA; CASTRO; MARCUCCI, 2000). Desta
forma, se faz necessária a identificação dos componentes e padronização das
amostras da própolis para a sua efetiva utilização (STEPANOVIC et al., 2003;
KOSALEC et al., 2005), o que é de interesse do presente grupo de pesquisa em
relação à própolis marrom.
Os processos bioquímicos para extração da própolis possibilitaram a
identificação de mais de 200 componentes presentes em amostras de própolis de
diversas regiões, destacando-se ácidos graxos e fenólicos, flavonóides, alcalóides,
naftaleno, entre outros (GREENAWAY; SCAYSBROOK; WHATLEY, 1990;
BANKOVA et al., 1995, SALATINO et al., 2005). A literatura é consensual em afirmar
que a composição da própolis depende da sua origem vegetal, portanto da sua
origem geográfica, bem como à sua fenologia hospedeira (BANKOVA et al., 1995;
MARCUCCI; DE CAMARGO; LOPES,1996; PARK et al., 1997). A própolis brasileira
possui uma concentração muito baixa de flavonóides e ésteres de ácidos fenólicos,
que são compostos antimicrobianos típicos de regiões temperadas, mas em
contrapartida, possui alta concentração de ácido di-hidrocinâmico, acetofenonas e
terpenóides específicos, todos compostos que também exercem atividade
83
antimicrobiana (BANKOVA et al., 1995). Embora não existam evidências dos
componentes da própolis marrom do cerrado mato-grossensse, Monzote et al.
(2012) observaram em amostras da própolis marrom de Cuba, país subtropical com
variação anual de temperatura de 20-35oC, por meio de técnicas de HPLC e
espectrometria de massa, a presença de nemorosone, propolone A, B, C e D,
garcinieliptone e hiperibone B, componentes resinosos com atividade
antimicrobiana. Adicionalmente, é interessante pontuar que o sinergismo entre os
componentes da própolis, além dos efeitos dos componentes individualmente, ainda
não está bem esclarecido na literatura e acredita-se ser um fator de fundamental
importância na determinação do potencial antimicrobiano da própolis. (KAYAOGLU
et al., 2011).
Na presente investigação, o crescimento bacteriano do E. faecalis foi
inibido por todas as pastas intracanais experimentais. Entretanto, o extrato de
própolis marrom 40% e o extrato de própolis marrom 20% associada à pasta de
hidróxido de cálcio foram mais eficazes do que a pasta de hidróxido de cálcio, com
inibição do crescimento bacteriano de 35,8%, 41% e 21,3%, respectivamente.
Embora não tenham sido encontrados estudos de avaliação da atividade
antibacteriana da própolis marrom, a maior efetividade da própolis sobre o hidróxido
de cálcio também foi observada em estudos anteriores (ONCAG et al., 2006;
REZENDE et al., 2008; MAIA-FILHO et al., 2008; AWAWDEH; AL BEITAWI;
HAMMAD, 2009; KANDASWAMY et al., 2010; KAYAOGLU et al., 2011;
MADHUBALA; SRINIVASAN; AHAMED, 2011; JAHROMI; TOUBAYANI; REZAEI,
2012). Segundo Sjogren et al. (1991), para atuar como agente antimicrobiano, o
hidróxido de cálcio necessita ser aplicado no canal radicular por pelo menos 7 dias.
No presente estudo, as medicações experimentais foram aplicadas por 14 dias de
acordo com investigações anteriores. (LANA et al., 2009; DELGADO et al., 2010;
LIMA et al., 2012).
O hidróxido de cálcio apresenta boas propriedades biológicas e
antimicrobianas in vitro (ESTRELA et al., 1995; GOMES et al., 2002; VIANNA et al.,
2005; GOMES et al., 2006; SOUZA-FILHO et al., 2008; DELGADO et al., 2010;
VAGHELA et al., 2011; FARHAD et al., 2012) e in vivo (BYSTROM; CLAESSON;
SUNDQVIST, 1985; SJOGREN et al., 1991) em função de seu pH altamente alcalino
(ESTRELA et al., 1999; SIQUEIRA JR., 2001), sendo considerado medicação
84
intracanal padrão-ouro no tratamento de infecções endodônticas. Entretanto, o
hidróxido de cálcio apresenta desvantagens como o baixo potencial contra o E.
faecalis (MOLANDER, 1998; DISTEL; HATTON; GILLESPIE, 2002; BRANDLE et al.,
2008). Adicionalmente, o E. faecalis pode sobreviver nos túbulos dentinários mesmo
na presença de hidróxido de cálcio por longos períodos (LOVE, 2001; ERCAN;
DALLI; DÜLGERGIL, 2006). Por outro lado, no presente estudo, todas as
medicações intracanais a base da própolis marrom testadas apresentaram atividade
antimicrobiana contra o E. faecalis, concordando com outras investigações (KOO et
al., 2000; ONCAG et al., 2006; FERREIRA et al., 2007; KANDASWAMY et al., 2010;
KAYAOGLU et al., 2011; MADHUBALA; SRINIVASAN; AHAMED, 2011; JAHROMI;
TOUBAYANI; REZAEI, 2012) e com o fato de que a própolis apresenta atividade
antimicrobiana significante contra as espécies mais resistentes, gram-positivas
anaeróbias facultativas e estritas. (KOO et al., 2000; FERREIRA et al., 2007).
Na presente investigação, o pH médio dos extratos de própolis 20% e
40% foi de 6.8 e 5.8, respectivamente, diferindo de Dias, Pereira e Estevinho (2012)
que observaram valores de pH inferiores da própolis coletada de quatro regiões de
Portugal, variando de 4.7 a 5.3. Entretanto, os mesmos autores sugerem que a
própolis de regiões mais quentes apresentam pH com valores superiores. A própolis
marrom foi coletada de um município da região centro-sul mato-grossensse com
temperatura média anual de 24ºC, o que poderia explicar os valores superiores do
pH.
A maioria das bactérias do sistema radicular apresenta crescimento,
preferencialmente, entre pH 6.5 e 7.5 e, apenas poucos microrganismos se
desenvolvem em pH com valores superiores (GOMES et al., 2003), como o E.
faecalis que é capaz de crescer em ambientes com pH alcalino superior a 11.5.
(BYSTROM; CLAESSON; SUNDQVIST, 1985). Em concordância com estudo prévio
(MONTERO, 2012), a associação das pastas da própolis 20% e 40% ao hidróxido de
cálcio resultou em elevação do pH de 6.8 e 5.8 para 11.8 e 12.6, respectivamente.
Entretanto, no presente estudo, o pH não influenciou a atividade antimicrobiana das
medicações intracanais estudadas.
No presente estudo, o extrato bruto de própolis 20% associado à pasta
de hidróxido de cálcio apresentou atividade antimicrobiana semelhante à pasta de
própolis 40% associada à pasta do hidróxido de cálcio, mas superior à pasta de
85
hidróxido de cálcio isolada. Como não existem outros estudos de associação da
pasta de hidróxido de cálcio com pastas da própolis em diferentes concentrações,
este resultado indica a necessidade de novas investigações para o isolamento e a
identificação da própolis marrom, bem como para explicar as reações sinérgicas
entre os componentes do hidróxido de cálcio e da própolis.
O sucesso da utilização da pasta de hidróxido de cálcio como uma
medicação antimicrobiana intracanal está relacionada a sua dissociação em íons
cálcio e íons hidroxila, o que é responsável pela alcalinização do ambiente
(SIQUEIRA JR., 2001), promovendo danos na membrana citoplasmática,
desnaturação protéica e danos ao DNA bacteriano (SIQUEIRA; LOPES, 1999). A
velocidade de dissociação iônica, a penetração dos íons hidroxila no interior dos
túbulos dentinários e o poder antimicrobiano da medicação são influenciados pela
diferença da viscosidade dos veículos empregados, sua solubilidade e pela
proporção pó-líquido das pastas. (ESTRELA et al., 1994; ZMENER; PAMEIJER;
BANEGAS, 2007; MOHAMMADI; DUMMER, 2011).
No presente estudo, o polietilenoglicol (PEG, Carbowax 400) foi utilizado
como veículo para a manipulação das pastas testadas, o qual representa um dos
veículos mais utilizados em medicações intracanais (GOMES et al., 2002; GOMES
et al., 2003; VIANNA et al., 2005; VIANNA et al., 2009; LANA et al., 2009; GONDIM
et al., 2012), com baixa toxicidade, alta solubilidade em soluções aquosas, bem
como baixa imunogenicidade e antigenicidade (ATHANASSIADIS; ABBOTT;
WALSH, 2007). O hidróxido de cálcio associado a veículos aquosos, como a água
destilada e o soro fisiológico, atingem valores altos de pH mais rapidamente,
enquanto que quando associado aos viscosos (polietilenoglicol, propilenoglicol),
provocam a dissociação iônica mais lentamente, mas mantém o pH estável por um
período de tempo maior (GOMES et al., 2002), o que é de interesse para o
tratamento endodôntico. Desta forma, para a manipulação das pastas a base da
própolis, na presente investigação, foi utilizada o PEG.
Como a própolis é uma substância resinosa, insolúvel em água, na
presente investigação, as pastas experimentais da própolis foram obtidas a partir do
extrato etanólico da própolis marrom (EEP), que apresenta evidências anteriores de
atividade antimicrobiana (KOO et al., 2000; ONCAG et al., 2006; FERREIRA et al.,
2007; REZENDE et al., 2008; KANDASWAMY et al., 2010; KAYAOGLU et al., 2011;
86
MADHUBALA; SRINIVASAN; AHAMED, 2011; JAHROMI; TOUBAYANI; REZAEI,
2012). Vários são os solventes polares utilizados para diluição e liberação dos
componentes fenólicos e polifenóicos de medicações a base da própolis, como o
etanol (KOO et al. 2000; STEPANOVIC et al. 2003; SAWAYA et al. 2004; KOSALEC
et al. 2005; FERREIRA et al., 2007; CABRAL et al. 2009), o DMSO (KOO et al.,
2000) e o álcool de cereais (PARMA-NETO, 2008). No presente estudo, o álcool de
cereais foi utilizado para a extração da própolis marrom, uma vez que representa um
produto de alta qualidade indicado na fabricação de produtos homeopáticos, extrato
de própolis, perfumes aromatizadores e bebidas finas. (NBR 5992, 2009).
A presente investigação mostrou que embora apresente limitações por ser
um estudo in vitro, medicações intracanais a base da própolis marrom, associadas
ou não ao hidróxido de cálcio, são eficazes contra o E.faecalis, podendo ser
considerados como alternativas para o tratamento de patologias periapicais.
Entretanto, por ser um estudo pioneiro, mais investigações clínicas e laboratoriais
são necessárias para avaliar a biocompatibilidade aos tecidos periapicais, isolar e
identificar os componentes da própolis marrom, bem como analisar o sinergismo
entre os componentes da própolis e do hidróxido de cálcio.
7 CONCLUSÕES
88
7 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos, foi observado que:
7.1. A concentração inibitória mínima da própolis marrom sobre o E.
faecalis foi de 100 mg/mL
7.2. Todas as medicações intracanais a base da própolis foram eficazes
contra o E. faecalis;
7.3. A pasta da própolis 40% e a pasta da própolis 20% associada à pasta
de hidróxido de cálcio foram mais eficazes contra o E. faecalis do que a
pasta de hidróxido de cálcio.
7.4. A pasta da própolis 20% e a pasta da própolis 40% associada à pasta
de hidróxido de cálcio apresentaram atividade antibacteriana
semelhante à pasta de hidróxido de cálcio.
7.5. A associação do hidróxido de cálcio às pastas da própolis 20% e 40%
elevaram os valores do pH de 6.8 e 5.8 para 11 e 12.1,
respectivamente.
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