TESTES DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS Antonia Maria de Oliveira Machado Instituto Paulista de Doenas Infecciosas e Parasitrias Laboratrios Setor de Microbiologia do Laboratrio Central - HSP - UNIFESP O que testar? Como interpretar? Reproduo da descoberta de Fleming Reproduo da placa de Fleming para a prova de sensibilidade aos antibiticos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos A avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos representa uma das tarefas mais importantes do laboratrio de microbiologia. O constante aparecimento de novos mecanismos bacterianos de resistncia e novos antimicrobianos tornam os testes cada vez mais complexos necessrio uma atualizao constante dos protocolos e a freqente implementao de novos testes e metodologias. Microbiologistas, patologistas clnicos mdicos assistentes so obrigados a uma atualizao constante Evoluo Clnica Microrganismo Antimicrobiano Paciente Teste de sensibilidade Imunidade Farmacologia Helio Sader - LEMC TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS METODOLOGIAS Avaliao QUALITATIVA - DISCO DIFUSO EM GAR Avaliao QUANTITATIVA - DILUIO EM CALDO Macrodiluio Microdiluio - DILUIO EM AGAR - AUTOMATIZADOS - E TEST MACRODILUIO MBC g/mL MIC 100 50 25 12.5 6.25 3.12 16 8 4 controle MICRODILUIO DILUIO EM GAR gar com 6 g/mL de Vancomicina Enterococcus spp. S s 4 g/mL I 8-16 g/mL R > 32 g/mL Princpio do mtodo E test Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Curva de regresso 100 50 25 12 6.25 3.12 1.6 0.8 0.4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Dimetro de zona de inibio (mm) MICs (g/mL) EtestDifuso NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS NCCLS Organizao internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilizao de normas e procedimentos laboratoriais padronizados. A subcomisso do NCCLS composta de representantes de profisses, do governo e indstria, incluindo laboratrios de microbiologia, educadores, farmacuticos, etc. Recomendaes na escolha dos antimicrobianos Padronizao das tcnicas Critrios para a interpretao dos resultados Parmetros para o controle qualidade do teste. NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS NCCLS Laboratrio de Microbiologia Clnica Infectologistas Comisso de Infeco Hospitalar Comisso de Controle de Utilizao Antibiticos Farmcia NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS NCCLS Seleo dos agentes antimicrobianos Isolado requer terapia antimicrobiana Isolado cuja susceptibilidade no preditiva Isolado capaz de exibir resistncia Orientao teraputica Permite individualizar padres de resistncia. Quando e porque realizar o antibiograma? NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS NCCLS Avaliao da Sensibilidade Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp. - Agar Mueller-Hinton - Inculo mtodo do crescimento ou suspenso direta - Incubao 35oC em atm. ambiente - Leitura 16 a 18h - Controle de qualidade P.aeruginosa ATTC* 27853 E.coli ATTC* 35218 NCCLS.M100 -S11, 2002 Pacientes com fibrose cstica 24h Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp. AMICACINA 2 TOBRAMICINA 2 GENTAMICINA 1 CEFEPIMA 2 CEFTAZIDIMA 1 CIPROFLOXACINA 2 IMIPENEM 2 MEROPENEM 2 PIPERACILINA/Tazo 1 TICARC / c.clav. 1 POLIMIXINA AMICACINA 2 GENTAMICINA 1 AMPICILINA/Subac. CEFEPIMA 2 CEFTAZIDIMA 1 CEFTRIAXONA 3 CIPROFLOXACINA 2 IMIPENEM 2 MEROPENEM 2 PIPERACILINA/Tazo 1 TICARC / c.clav. 1 POLIMIXINA Cefotaxima Pode ser reportado quando a cepa for resistente Os outros no fermentadores devem ser testadas pelo mtodo de diluio. NCCLS 2002 - M100-S11 Tabela 2B Avaliao da Sensibilidade Estafilococos - Agar Mueller-Hinton - Inculo suspenso direta - Incubao 35oC em atm. ambiente - Leitura 16 a 18 mas 24h Oxacilina e Vancomicina - Controle de qualidade S.aureus ATTC* 25923 E.coli ATTC* 35218 NCCLS 2002 - M100-S11 Tabela 2C CIPROFLOXACINA 3 CLINDAMICINA 2 ERITROMICINA 2 GENTAMICINA 3 OXACILINA 1g 1 PENICILINA 1 SULFA/TRIMET 2 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 Quinupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA 3 Staphylococcus aureus Staphylococcus no aureus Azitromicina Claritromicina Rotineiramente no so reportado em urina MRSA CIPROFLOXACINA 3 CLINDAMICINA 2 ERITROMICINA 2 GENTAMICINA 3 OXACILINA 1g 1 PENICILINA 1 SULFA/TRIMET 2 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 Quinupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA 3 MRS As penicilinas, cefens e outros | lactmicos como amoxi/c.clav., ampi/sulb., ticarcilina/c.clav. e imipenem Oxa R PR Oxa s e PS S Oxa S e PR Resitentes penicilina lbeis s | lactamases 4 g Encaminhar a Laboratrio de Referncia Staphylococcus spp. Deteco de resistncia oxacilina Staphylococcus aureus (MRSA) gar Screening - MHA com 6 g de oxacilina + 4% de NaCl Microdiluio - CAMHB + 2% NaCl gar diluio - MHA + 2% NaCl Disco-difuso - MHA (1g de oxacilina) Inculo: suspenso direta (0,5 Mc Farland) Temperatura: 35C Tempo de incubao: 24 horas completas de incubao NCCLS 2002 - M100-S11 Tabela 2C Deteco Laboratorial GISA - Screening BHI gar com 6g/mL de vancomicina. Incubao por 24h Uma ou mais colnias - resultado positivo Controle de qualidade S. aureus ATCC 25923 - controle negativo Enterococcus faecalis ATCC 51299 - controle positivo Staphylococcus saprophyticus S. saprophyticus isolado de urina no precisa ser submetido ao teste de sensibilidade, pois a infeco responde s concentraes dos antibiticos rotineiramente utilizados para o tratamento em infeces no complicadas. (ex. nitrofurantoina, trimetoprim/sulfametoxazol, ou fluoroquinolona) A oxacilina no recomendada, pois cepas mecA negativa freqentemente so resistentes pelos critrios de interpretao dos estafilococos coagulase negativos. URINA ACIDO NALIDIXICO C. PIPEMDICO AMICACINA AMPICILINA CEFALOTINA CEFTRIAXONA CIPROFLOXACINA GENTAMICINA NORFLOXACINA NITROFURANTOINA SULFA/TRIMET AMICACINA CEFEPIMA CEFTAZIDIMA CEFTRIAXONA CIPROFLOXACINA GENTAMICINA IMIPENEM MEROPENEM NORFLOXACINA Pacientes internados P.aeruginosa, Enterobacter spp., E.coli e Klebsiella spp. Pacientes ambulatoriais Avaliao da Sensibilidade Enterococos - Agar Mueller-Hinton - Inculo mtodo de crescimento e suspenso direta - Incubao 35oC em atm. ambiente - Leitura 16 a 18h, mas 24h para Vancomicina - Controle de qualidade S.aureus ATTC* 25923 MIC NCCLS.M100 -S11, Tabela 2D, 2002 Avaliao da Sensibilidade Enterococos - Escolha dos discos - Tabela 2D gentamicina 120 g estreptomicina 300 g - Deteco de | lactamase teste de nitrocefin MIC s 6 = Resistente 7-9 = inconclusivo > 10 mm = Sensvel Penicilina NCCLS.M100 -S11, Tabela 2D, 2002 Enterococcus spp. AMPICILINA 1 CIPROFLOXACINA U CLORANFENICOL 3 GENTAMICINA 120 g 3 STREPTOMICINA 300 g 3 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 QUINUPRISTIN/DALFOPRISTIN 2 Penicilina Sinergismo positivo Sinergismo negativo Ampicilina, amoxacilina, amoxi/c.clav., ampi/sulb., piperacilina e piperacilina /c.clav. Para cepas no produtoras de | lactamases Deteco de | lactamases + R Penicilina S 15-16 mm MIC NCCLS.M100 -S11, Tabela 2D, 2002 7-9 mm MIC Avaliao da Sensibilidade Enterobactrias - Agar Mueller-Hinton - Inculo mtodo de crescimento e suspenso direta - Incubao 35oC em atm. ambiente - Leitura 16 a 18h - Controle de qualidade E.coli ATTC* 25922 E.coli ATTC* 35218 NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002 Enterobactrias AMICACINA 2 AMPICILINA 1 AMPICILINA/Sulbactan 2 AZTREONAM 3 CEFALOTINA 1 CEFEPIMA 2 CEFTAZIDIME 3 CEFOXITINA 2 CEFTRIAXONA 2 CIPROFLOXACINA 2 GENTAMICINA 1 IMIPENEM 2 PIPERACILINA/Tazobactan 2 SULFA/TRIMET 2 TICARCILINA/c.clavulnico2 Cefotaxima Meropenem Levofloxacina Amoxacilina Amoxacilina/c.clavulnico NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) - 2001 Deteco de ESBL em bacilos Gram-negativos Klebsiella spp. e Escherichia coli Teste de triagem: disco difuso ou determinao da MIC Antimicrobianos Ceftriaxona Ceftazidima Cefpodoxima Aztreonam Cefotaxima DD (mm) s 25 s 22 s 17 s 27 s 27 NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002 Teste confirmatrio da produo de ESBL Klebsiella spp. e Escherichia coli Teste de cefotaxima e ceftazidima, sozinhos e associados cido clavulnico Adio de 10L de uma soluo de cido clavulnico de 1000g/mL a discos contendo 30g dos antimicrobianos Aumento >5mm indica produo de ESBL NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002 Avaliao da Sensibilidade e Especificidade de Diferentes Testes para Deteco de Cepas Produtoras de ESBL Teste Sens. Espec. Disco difuso (bkpts ESBL-NCCLS) 89 62 Dupla Difuso 41 100 ESBL Etest 89 98 Disco difuso (CTX + AZT - NCCLS) 88 83 Adio de clavulanato 97 47 MICs para 5 substratos (Etest) 100 100 Reis et al., J Bras Patol Clin, 2000. [in press] ESBL Como reportar amostras produtoras de ESBL? O NCCLS sugere que todas as amostras produtoras de ESBL sejam reportadas como resistentes s penicilinas, cefalosporinas, e aztreonam. NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002 Salmonella spp. e Shigella spp. Ampicilina, uma quinolona e trimetoprim-sulfametoxazol. Em isolados extra-intestinais de Salmonella spp. cloranfenicol e uma cefalosporina de terceira gerao devem ser includos. Cefalosporinas de primeira e segunda geraes e aminoglicosdeos podem aparecer sensveis in vitro mas no so efetivas clinicamente. Nunca reportar como sensvel. O que testar? NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002 Avaliao da Sensibilidade Haemophilus spp - Agar Haemophilus Test Medium (HTM) - Inculo suspenso direta - Incubao 35oC em atm. 5% CO2 - Leitura 16 a 18h - Controle de qualidade H.influenzae ATTC* 49247 H.influenzae ATTC* 49766 E.coli ATTC* 39218 NCCLS, M100-S11 Tabela 2E, 2002 Avaliao da Sensibilidade Haemophilus spp + O teste Positivo preditivo de resistncia ampicilina e amoxacilina NCCLS, M100-S11 Tabela 2E, 2002 Ampicilina Cefalosporina de 3a gerao Cloranfenicol Haemophilus spp. meio HTM AMPICILINA 1 AZITROMICINA 3 CEFTRIAXONA 2 CEFUROXIMA 2 CIPROFLOXACINA 3 CLORANFENICOL 2 SULFA/TRIMET 1 MEROPENEM 2 Cefotaxima Ceftazidima Gatifloxacina Levofloxacina Lomefloxacina Moxifloxacina Ofloxacina Sparfloxacina Amoxilina S Deteco de | lactamases + R Ampicilina Amoxicilina Resistncia s fluoroquinolonas rara. - Avaliao da Sensibilidade Moraxella catarrhalis + O teste Positivo preditivo de resistncia ampicilina e amoxacilina 90% + (Livermore,Clin.Microbiol.rev.8: 557, 1996) Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis Perfil de sensibilidade de amostras isoladas no Brasil Programa SENTRY 1997 a 1999 Amostras de So Paulo (UNIFESP); Rio de Janeiro (Lab. Lmina), Florianpolis (Lab. Sta Luzia) e Porto Alegre (Hosp. de Clnicas). Antibitico Amoxicilina Amoxicilina/Clav. Cefaclor Cefuroxima Cefepima Azitromicina Cloranfenicol STX/TMP (Bactrim) Levofloxacina Gatifloxacina H. influenzae (n = 187) 8 0,5 8 2 0,12 2 s 2 8 s 0,5 s 0,03 MIC90 88,8 100,0 96,5 97,9 100,0 99,4 96,6 52,4 100,0 100,0 % sens. M. catarrhalis (n =109) 4 0,25 2 2 2 s 0,12 s 2 1 0,06 0,06 MIC90 6,4 99,1 100,0 100,0 100,0 100,0 99,1 85,3 100,0 100,0 % sens. Avaliao da Sensibilidade S.pneumoniae - Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro - Inculo suspenso direta - Incubao 35oC em atm. 5% CO2 - Leitura 20 a 24h - Controle de qualidade S.pneumoniae ATTC* 49619 NCCLS, M100-S11 Tabela 2G, 2002 Avaliao da Sensibilidade Streptococcus pneumoniae NCCLS.M100 - S11, Tabela 2G, 2002 - Escolha dos discos Tabela A Oxacilina Penicilina no recomendado para outros estreptococos - Dimetros de inibio especficos (Tabela 2G) - Interpretao Oxacilina > 20 mm Sensvel s 19 mm penicilina, meropenem e ceftriaxona ou cefotaxima MIC Streptococcus pneumoniae CLORANFENICOL 2 ERITROMICINA 1 OFLOXACINA OXACILINA 1g PENICILINA 1 RIFAMPICINA GATIFLOXACINA 3 SULFA/TRIMET VANCOMICINA 2 Ampicilina, Amoxacilina, amoxacilina/c.clav. ampicilina/sulb., cefaclor, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona, cefuroxima, imipenem e meropenem Pencilina Meropenem Ceftriaxona > 20mm S s19 mm MIC < 17 mm Levofloxacina Moxifloxacina NCCLS.M100 - S11, Tabela 2G, 2002 21% 16,5% 18% 14,5% 13,6% 16,7% 24,7% S = 79% S = 92% RI =19,2% AR= 1,8% RI =7% AR=1% < 6 anos Resistncia de Pneumococo Penicilina < 6 anos R: 21% * > 6 anos R: 8% * * P 2,0 ug/ml 1-2anos: R: 31,7% RI =27,4% AR= 4,3% N.cepas invasivas=4.000 PAHO Projeto SIREVA Instituto Adolfo Lutz Streptococcus pneumoniae 123 cepas do Hospital So Paulo - Perfil de Resistncia Oxacilina S = 90 Penicilina S = 90 (79,67%) Oxacilina R = 33 Penicilina S = 8 Penicilina I = 22 (17,89%) Penicilina R = 3 (2,44%) Ceftriaxona S = 30 Ceftriaxona I = 2 Ceftriaxona R = 1 822530210%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Penicilina Cef triaxonaTESTE DE INDUO PARA DETECO DO FENTIPO MLS Staphylococcus spp. e S.pneumoniae Antibitico Amox-clav Cefuroxima Cefotaxima Claritromicina Azitromicina TMP/SMX Levofloxacina Gatifloxacina Susceptibilidade do S.pneumoniae aos antimicrobianos Programa SENTRY - Amrica Latina 1997- 1999 991 isolados - S: 67,0% I:21,6% R:11,4% Peni S (664) MIC 90 %S 2 100 0.12 99.6 0.03 99.4 s 0.25 94.4 s 0.12 95.3 4 74.4 1 99.8 0.5 99.7 Peni I (214) MIC 90 %S 2 99.5 2 80.6 0.5 93.2 > 32 78.5 > 16 81.7 8 43.0 2 100.0 0.5 100.0 Peni R (214) MIC 90 %S 4 0.0 8 2.3 2 21.6 4 70.5 8 77.3 8 7.1 2 100.0 0.5 100.0 Isolados da Argentina, Brasil, Chile, Colmbia, Mxico, Uruguai e Venezuela 1997 a 1999 - Pneumonia comunitria. S. pneumoniae - Programa SENTRY Brasil - 1997 a 2000 387 amostras - S: 78,3% -- I: 23,1 % -- R: 4,6% Antibitico Peni - S (303) Peni - I (70) Peni - R (14)MIC90 %S MIC90 %S MIC90 %SAmoxic-clavul 0,25 100,0 0,5 100,0 4 78,6Cefaclor 2 88,0 4 63,3 >32 0,0Cefuroxima 0,12 99,2 1 92,5 8 9,1Cefotaxima 0,03 99,1 0,5 95,2 2 12,5Cefepima 0,12 98,6 0,25 95,7 2 35,7Claritromicina < 0,25 93,0 2 79,1 4 54,5Azitromicina < 0,12 94,2 8 83,6 2 81,8Tetraciclina >16 65,7 >16 75,7 >16 71,4Sulfa / Trimet 4 57,9 8 30,0 >8 7,1Levofloxacina 1 100,0 2 100,0 1 100,0Gatifloxacina 0,5 100,0 0,5 100,0 0,5 100,0# Inclui amostras de So Paulo, Rio de Janeiro, Florianpolis e Porto Alegre. Helio Sader - UNIFESP Streptococcus spp, no S.pneumoniae Streptococcus viridans Penicilina MIC Streptococcus pyogenes Streptococcus agalatie Critrios de interpretao para disco-difuso devem ser usados somente para Streptococcus |-hemolticos penicilina, ampicilina, ofloxacina e quinupristin-dalfopristin Penicilina < 24 mm S Ampicilina, amoxicilina, amoxi/ c.clav., amoxi/sulb., ceflacor, ceftriaxona, cefalotina, imipenem e meropenem NCCLS.M100 - S11, Tabela 2H, 2002 Neisseria gonorrhoeae Suspeita de falncia teraputica Vigilncia Estudos para orientar terapia emprica NCCLS, M100-S11 Tabela 2F, 2002 Avaliao da Sensibilidade Neisseria gonorrhoeae - GC agar com 1% de suplemento - Inculo suspenso direta - Incubao 35oC em atm. 5% CO2 - Leitura 20 a 24h - Controle de qualidade n.gonorrhoeae ATTC* 49226 NCCLS, M100-S11 Tabela 2F, 2002 Neisseria gonorrhoeae Teste |-lactamase: POSITIVA : R amoxicilina, ampicilina e penicilina (PPNG) : no garante sensibilidade (CRMNG - PBPs) Todos os isolados? Detecta PPNG e no CRMNGs Obs.:raros casos de resistncia por |-lactamase alterao de PBPs NCCLS, M100-S11 Tabela 2F, 2002 NEGATIVA Neisseria gonorrhoeae Resultados intermedirios Confirmar Gonococo com halos s19mm para penicilina (10U) indica provvel produo de |-lactamase Gonococo com halos s19mm para tetraciclina (30g) indica resistncia mediada por plasmideo (TRNG) MIC R s 26 mm R s 30 mm NCCLS, M100-S11 Tabela 2F, 2002 Stenotrophomonas maltophilia Resistncia intrnseca a carbapenens Resultados de sensibilidade obtidos por disco-difuso e automatizados podem no apresentar correlao com resultados obtidos por MIC convencional Determinao da MIC (microdiluio ou gar diluio) Antimicrobianos a serem testados (MIC): sulfametoxazol/trimetoprim, ticarcilina/cido clavulnico tetraciclina e cloranfenicol RESISTNCIA BACTERIANA RESISTNCIA INTRNSICA CEFALOTINA Enterobacteriaceae -Cedecea spp -Citrobacter freundii -Enterobacter spp -Providncia spp -M.morganii -P.vulgaris -P.penneri -Serratia spp -Yersinia enterocoltica RESISTNCIA INTRNSICA CEFOXITINA Enterobacteriaceae -Citrobacter freundii -Enterobacter spp -Serratia spp RESISTNCIA INTRNSICA Amp/.clavulnico e Amp/Sulbactam Enterobacteriaceae -Citrobacter freundii -Enterobacter spp -Serratia spp RESISTNCIA BACTERIANA FENTIPOS RAROS DE RESISTNCIA Enterobacteriaceae Imipenem S.aureus Vanco, Teico S.coag.negativa Vancomicina E.faecalis Ampicilina Strep.|hem:A, B, C, F, G Peni, Ampi, cefal. de 3 e 4 gerao Streptococcus spp Vancomicina H.influenzae Cefal. de 3 e 4 gerao e fluoroquinolonas N.gonorrhoeae Cefal. de 3 e 4 gerao Quinolonas e aminoglicosdeos | Lactmicos RESISTNCIA BACTERIANA A qualidade dos resultados do teste MUITO OBRIGADA amachado-labc@dhsp.epm.br