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AVALIAÇÃO MORFOFUNCIONAL DO POTENCIAL DE

REVERSÃO ESPONTÂNEA DA CIRROSE HEPÁTICA INDUZIDA

EM MURINOS PELA ASSOCIAÇÃO DE TETRACLORETO DE

CARBONO E ETANOL

JULIANA VIEIRA DIAS

Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Clínica Médica, da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Setor de

Gastroenterologia, como parte dos pré-requisitos necessários à obtenção do

grau de mestre em Ciências da Saúde.

Rio de Janeiro

Dezembro, 2006

Livros Grátis

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EM MURINOS PELA ASSOCIAÇÃO DE TETRACLORETO DE

CARBONO E ETANOL

JULIANA VIEIRA DIAS





Este trabalho foi realizado no Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular do

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – IBCCF.

Orientadores: Prof. Henrique Sérgio Moraes Coelho Prof. Guilherme Ferreira d a Mota Rezende Co-orientadora: Regina Coeli dos Santos Goldenberg

Rio de Janeiro Dezembro,2006

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Aos meus queridos pais por terem me dedicado tanto amor e apoio. Á meu irmão por simplesmente fazer parte da minha vida.

vi

AGRADECIMENTOS

Quero agradecer a todos que fizeram parte desse trabalho e que no fim se

tornaram amigos:

Ao professor Guilherme por ter tornado tudo isso possível, apesar de ter quase

me desorientado!

À professora Regina Coeli por ser minha conselheira profissional e pessoal. Te

gosto muito Rê.

Ao professor Antônio Carlos por ter me apoiado quando quase desisti.

À professora Cristina Takyia por ter me ensinado tudo o que sei sobre

histologia.

À Dr (tia).Léa que me apresentou o hospital universitário e que sempre

acreditou no meu potencial.

À minha grande amiga Verônica pelo apoio incondicional desde os primórdios

da faculdade.

Ao meu querido amigo Nobrux por toda a ajuda profissional e por todos os

bons momentos passados juntos. Valeu garoto!

A todos os hepáticos: Luiz, Adriana, Leandro, Taís, Celinha, Andréia. Obrigada

por sermos um grupo tão unido. Amo vocês!

Aos meus amigos do laboratório de cardiologia: Débora, João, Nessa, Patrícia,

Ramon, Juliana, Carol e Esporcate. Apesar de gostarem de músculos e

corações, agradeço imensamente pela constante alegria que cerca nosso

laboratório. Somos uma grande equipe.

Á galera do laboratório de Fisiologia Renal e de Anatomia. Aprendi muito com

todos vocês.

A toda minha família amada que tanto torce por mim. Não existe no mundo

família melhor que a minha!

vii

FOLHA DE APROVAÇÃO



EM RATOS PELA ASSOCIAÇÃO DE TETRACLORETO DE

CARBONO E ETANOL

JULIANA VIEIRA DIAS

Orientadores: Prof. Henrique Sérgio Moraes Coelho Prof. Guilherme Ferreira d a Mota Rezende





Aprovada em _____de_______________de________.

Banca examinadora:

____________________________________________________ Profa Renata de Mello Perez

____________________________________________________ Prof. João Pedro Werneck de Castro

____________________________________________________ Prof. Carlos Alberto de Oliveira Basílio

Rio de Janeiro Dezembro,2006

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Dias, Juliana Vieira

Avaliação morfofuncional do potencial de reversão espontânea da cirrose hepática induzida em ratos pela associação de tetracloreto de carbono e etanol / Juliana Vieira Dias. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2006.

xiii, 102 f.: il. ; 31 cm

Orientadores: Henrique Sérgio Moraes Coelho e Guilherme Ferreira da Mota Rezende

Dissertação (mestrado) –UFRJ / Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Clínica Médica, 2006.

Referências bibliográficas: f. 63-78

1. Cirrose hepática experimental – induzido quimicamente. 2. Tetracloreto de carbono. 3. Etanol. 4. Colágeno. 5. Ratos Wistar. 6. Clínica Médica - Tese. I. Coelho, Henrique Sérgio Moraes. II. Rezende, Guilherme Ferreira da Mota. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Clínica Médica. IV. Título.

ix

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO................................................................................................ p.1

1.1. Panorama das Hepatopatias p. 1 1.2. Epidemiologia das Hepatopatias Crônicas p. 2 1.3. O Fígado 1.3.1. Anatomia, Função e Estrutura.............................................................. p. 3 1.3.2. Microambiente Hepático....................................................................... p.7 1.4. Regeneração Hepática............................................................................... p.10 1.5. Cirrose Hepática 1.5.1. Definição de Cirrose............................................................................. p.11 1.5.2. Aspectos Morfológicos.......................................................................... p.12 1.5.3. Aspectos Clínicos................................................................................. p.16 1.6. Modelos Experimentais de Cirrose Hepática.............................................. p.18 2. OBJETIVOS p.25 3. MATERIAIS E MÉTODOS............................. ................................................. p.26

3.1. Animais....................................................................................................... p.26 3.2. Confecção da Dieta Líquida Alcoólica e Não – Alcoólica........................... p.26 3.3. Grupos........................................................................................................ p.27 3.4. Protocolo Experimental............................................................................... p.28 3.5. Análise Histológica..................................................................................... p.30 3.5.1. Coloração por Hematoxilina & Eosina.................................................. p.31 3.5.2. Coloração por Picrosirius...................................................................... p.31 3.6. Análise Morfométrica.................................................................................. p.32 3.7. Ensaio de Hidroxiprolina............................................................................. p.32 3.8. Imunofluorescência Indireta........................................................................ p.33 3.8. Análise Bioquímica..................................................................................... p.34 3.9. Análise Estatística...................................................................................... p.35 4. RESULTADOS...................................... .......................................................... p.36

4.1. Peso dos Animais....................................................................................... p.36 4.2. Consumo de Dieta Líquida e Ingestão de Etanol....................................... p.39 4.3. Análise Histológica..................................................................................... p.41 4.4. Análise Morfométrica.................................................................................. p.45 4.5. Ensaio de Hidroxiprolina............................................................................. p.46 4.6. Imunofluorescência Indireta........................................................................ p.48 4.7. Análise Bioquímica..................................................................................... p.51 5. DISCUSSÃO................................................................................................... p.54

6. CONCLUSÃO....................................... .......................................................... p.62

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS p.63

8. ANEXOS p.79

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Representação esquemática da anatomia dos lobos hepáticos

(adaptado de SHERLOCK&DOOLEY, 2002)....................................................p.4

Figura 2 – Representação esquemática dos vasos sanguíneos hepáticos.

(adquirida no site: www.hepcentro.com.br)......................................................p.5

Figura 3 – Representação esquemática do lóbulo Hepático (bordas azuis), com

uma veia centro-lobular ao centro e delimitado por tratos portais na sua periferia

e do ácino hepático com suas zonas: a zona acinar 1 (bordas amarela), zona

acinar 2 (borda laranja) e zona acinar 3 (borda vermelha). (adaptado de 3B

Scientific microanatomy ™, 2002)...................................................................p.6

Figura 4 – Representação esquemática das modificações ocorridas no fígado

normal após a lesão hepática crônica (adaptado de FRIEDMAN,

2000)...............................................................................................................p.13

Figura 5 – Representação esquemática dos principais mecanismos envolvidos

na fibrogênese hepática induzida por etanol e por CCl4. (adaptado de ROJKIND

& GREENWEL, 2001).....................................................................................p.23

Figura 6 - Protocolo experimental de indução de cirrose hepática.................p.30

Figura 7 – Pesos médios dos animais por grupo experimental nos períodos de 0

semana (A), 4 semanas (B), 8 semanas (C) e 15 semanas (D) de protocolo

experimental..................................................................................................p.38

Figura 8 – Consumo médio de dieta líquida ao final de 15 semanas de

xi

experimento...................................................................................................p.39

Figura 9: Macro e microscopia dos animais experimentais...........................p.43

Figura 10: Microscopia dos grupos intoxicados com CCl4 isolado ou associado

ao etanol........................................................................................................p.44

Figura 11: Análise morfométrica....................................................................p.46

Figura 12: Ensaio de hidroxiprolina...............................................................p.47

Figura 13: Imunofluorescência......................................................................p.49

Figura 14: Qualificação (A-C) e quantificação (D) de tTG2...........................p.50

Figura 15: Análise bioquímica.......................................................................p.53

xii

Tabela 1 – Metabolismo dos hepatócitos relacionado à zona acinar (adaptado de SHERLOCK & DOOLEY, 2002).............................................................p.7

Tabela 2 – Principais Causas de Cirrose Hepática (SHERLOCK & DOOLEY, 2002)...........................................................................................................p.26

Tabela 3 – Composição da dieta líquida de Lieber-DeCarli modificada (adaptado de LIEBER & DeCARLI, 1989)..................................................p.27

Tabela 4 – Grupos experimentais de acordo com a dieta e injeção intraperitoneal (i.p.)....................................................................................p.27

Tabela 5 – Grupos da recuperação hepática espontânea.........................p.29

Tabela 6 – Peso dos animais.....................................................................p.36

Tabela 7 – Consumo médio de dieta líquida por grupo experimental ao longo de 15 semanas de experimento.................................................................p.40

Tabela 8 – Dose média de etanol por grupo ao longo das 15 semanas de experimento................................................................................................p.41

Tabela 9 – Valores da análise de morfometria dos grupos intoxicados com CCl4 e associado ao etanol........................................................................p.45

Tabela 10 – Valores do ensaio de hidroxiprolina dos grupos intoxicados com etanol e CCl4.............................................................................................p.47

Tabela 11 – Valores da quantificação de tTG pela morfometria dos grupos intoxicados com CCl4 e etanol..................................................................p.51

Tabela 12 – Valores dos parâmetros bioquímicos de ALT (A), AST (B), ALB (C) e BilT (D).............................................................................................p.52

LISTA DE TABELAS

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ALT - alanina aminotransferase

AST - aspartato aminotrasferase

ALB – albumina

AIH – alteração por internação hospitalar

BilT – bilirrubina total

CCl4 - tetracloreto de carbono

CTRL - dieta líquida controle

CTRL+Azeite - dieta líquida controle e injeções intraperitoneais de azeite

CTRL+CCl4 - dieta líquida controle e injeções intraperitoneais CCl4

CTRL+CCl4/8sR - Ração padrão e água por 8 semanas após a interrupção da

indução

CFCs - cloro-flúor-carbonos

CYP2E1 - citocromo P450 2E1

DNA - ácido desoxiribonucléico

EtOH - dieta líquida alcoólica

EtOH+Azeite - dieta líquida alcoólica e injeções intraperitoneais de azeite

EtOH+CCl4 dieta líquida alcoólica e injeções intraperitoneais CCl4

EGF – fator de crescimento epidérmico (do inglês epidermal growth factor)

EtOH+CCl4/8sR - Ração padrão e água por 8 semanas após interrupção da

indução

FITC – isotiocianato de fluoresceína (do inglês fluorescein isothiocyanate)

HGF – fator de crescimento de hepatócitos (do inglês hepatic growth factor)

CHC – hepatocarcinoma

HSCs – células estreladas hepáticas (do inglês hepatic stellate cells)

IL-6 – interleucina-6 (do inglês interleucine-6)

i.p. - intraperitoneal

IAM – infarto agudo do miocárdio

KCs – células de kuppfer (do inglês kuppfer cells)

MS - Ministério da Saúde

xiv

MEC - matriz extracelular

MMPs - metaloproteases da matrix extracelular.

MEOS – sistema oxidativo enzimático microssomal (do ingles microssomal

enzimatic oxidative sistem)

NIH – Instituto Nacional de Saúde (do inglês National Institute of Health)

OMS – Organização Mundial de Saúde

PA – para análise

PDGF – fator de crescimento derivado de plaquetas (do inglês platelet-derived

growth factor)

SUS – Sistema Único de Saúde

SVS - Sistema de Vigilância em Saúde

SECs – células endoteliais sinusoidais (do inglês sinusoidal endothelial cells)

TIMPs - tecido inibidor de metaloprotease

TNF-α – fator- α de necrose tumoral (do inglês tumor necrose factor-α)

TGF- α – fato transformador do crescimento (do inglês transformer growth

factor-α)

TGF- β – fato transformador do crescimento (do inglês transformer growth

factor-β

tTG – tissue transglutaminase

tTG2 - tissue transglutaminase 2

γ-GT - γ-glutamiltranspeptidase (do ingles γ-glutamyltranspeptidase)

HBV – vírus da hepatite B

HCV – vírus da hepatite C

xv

RESUMO Introdução: O desenvolvimento de um modelo animal adequado de cirrose hepática que reproduza um padrão histológico irreversível da doença humana é uma importante ferramenta para o estudo dos mecanismos morfofuncionais dessa doença e para a avaliação de potenciais terapias. Nosso estudo buscou estabelecer um modelo experimental através da associação de tetracloreto de carbono (CCl4) e etanol, e investigar o potencial de reversibilidade espontânea após a retirada das hepatotoxinas através das alterações histológicas e bioquímicas dos fígados cirróticos.

Métodos: Ratos Wistar fêmeas pesando entre 150-200g foram divididos de acordo com a dieta líquida de Lieber-DeCarli e a administração de injeções intraperitoneais (i.p.): NORMAL - ração padrão e água filtrada; CTRL - dieta líquida controle (sem adição álcool); CTRL+Azeite - dieta líquida controle e i.p. de azeite; CTRL+CCl4 – dieta líquida controle e i.p. de CCl4; EtOH – dieta líquida alcoólica; EtOH+Azeite - dieta líquida alcoólica e i.p. de azeite; EtOH+CCl4 – dieta líquida alcoólica e i.p. de CCl4. A dieta foi administrada ad libitum. O CCl4 foi injetado em uma solução a 20% (dose = 0,05ml/kg de peso corporal) diluído em veículo (azeite de oliva), três vezes por semana. Os animais foram sacrificados ao fim de 15 semanas de indução. Alguns animais dos grupos CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4 foram mantidos com ração padrão e água e sacrificados 8 semanas após o fim da interrupção da intoxicação. Cortes histológicos de 5µm corados com hematoxilina&eosina e picrosirius foram realizados para a análise morfológica da arquitetura e da fibrose hepática, respectivamente. A fibrose foi quantificada pela morfometria das lâminas de picrosirius e pelo ensaio de hidroxiprolina. A imunofluorescência indireta foi realizada para detectar colágenos I e III e a quantidade de tranglutaminase tecidual 2 (tTG2). O soro foi coletado para as avaliações funcionais das enzimas de lesão hepática - alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) e de função hepática – bilirrubina (BilT) e albumina (ALB).

Resultados: Ao final de 15 semanas de indução os animais dos grupos CTRL, CTRL+Azeite, EtOH, EtOH+Azeite apresentaram padrões histológicos normais quando comparados ao grupo NORMAL. Já os animais dos grupos CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4 demonstraram padrão de cirrose hepática, apresentando septos fibrosos e nódulos de regeneração, que permaneceu alterado até 8 semanas após a interrupção da agressão. O aumento no conteúdo de colágeno analisado pela morfometria foi observado em ambos os grupos agredidos com CCl4 no final de 15 semanas (NORMAL - 2,25±1,21; CTRL+CCl4 – 9,83±3,85; EtOH+CCl4 - 12,68±2,64), porém, quando analisados 8 semanas após a interrrupção, os animais associados com CCl4 e etanol (10,38±1,36) permaneceram com um grau de fibrose maior que o grupo CTRL+CCl4 (6,99±0,88). Este resultado nos encorajou a focalizar as investigações no grupo que associou CCl4 e etanol. O aumento da detecção do colágeno no grupo EtOH+CCl4 se manteve 8 semanas após a suspensão da indução como evidenciado pelo ensaio de hidroxiprolina (NORMAL - 1,2±0,17; EtOH+CCl4 - 1,9±0,03; EtOH+CCl4/8sR - 1,6±0,18) e pela imunofluorescência. A imunofluorescência realizada para a tTG2 também demonstrou um aumento na detecção e na quantidade dessa enzima que permaneceu elevado após 8

xvi

semanas da retirada das hepatotoxinas (NORMAL - 7,90±0,83; EtOH+CCl4 - 66,43±8,00; ETOH+CCl4/8sR - 56,82±21,10). Os valores de AST (NORMAL – 62,20±14,15; EtOH+CCl4 (582,4±297,2), ALT (NORMAL – 12,0±2,9; EtOH+CCl4 – 102,0±83,47), BilT (NORMAL – 0,02±0,04; EtOH+CCl4 - 0,15±0,18) e ALB (NORMAL – 4,32±0,22; EtOH+CCl4 – 2,96±0,32) estavam alterados na 15a semana de indução, porém retornaram aos níveis normais 8 semanas após interrupção da intoxicação.

Conclusão: A associação de CCl4 e etanol induziu cirrose hepática em ratos representativa dos aspectos fisiopatológicos e clínicos da doença humana e foi capaz de sustentar as alterações histopatológicas por um longo tempo após a retirada dos agentes agressores, embora os parâmetros funcionais tenham sido normalizados.

xvii

ABSTRACT Introduction: The development of an adequate animal model of hepatic cirrhosis that reproduces an irreversible histological standard of human is an extremely important tool for the study of the morphofunctional mechanisms of this illness and for evaluation of potential therapies. Our study searched to establish an associated CCl4–ethanol-induced cirrhosis model and investigate the spontaneous recovery potential after the withdrawal of the aggressive agents through histological and biochemistry alterations of cirrhotic livers.

Methods: Female Wistar rats weighting between 150–200g were divided in accordance with the Lieber-DeCarli liquid diet and the intraperitonial injections (i.p.): NORMAL - standard rat chow and filtered water; CTRL - control (non-alcohol) Liber-DeCarli liquid diet; CTRL+Oil - control Liber-DeCarli liquid diet and i.p. of oil; CTRL+CCl4 - control Liber-DeCarli liquid diet and i.p. of CCl4; EtOH – alcoholic Liber-DeCarli liquid diet; EtOH+Oil - alcoholic Liber-DeCarli liquid diet and i.p. of oil; EtOH+CCl4 - alcoholic Liber-DeCarli liquid diet and i.p. of CCl4. The diet was administrated ad libitum. The CCl4 was injected in a 20% solution (dose = 0.05mL/kg body weight) diluted in vehicle (olive oil), three times weekly throughout 15 weeks. Some animals of groups CTRL+CCl4 and EtOH+CCl4 were fed with standard chow and water and were sacrificed 8 weeks after interruption of insult. Hepatic architecture and fibrous septa were analyzed in liver slices of 5µm stained with Hematoxilin&Eosin and Sirius Red, respectively. Fibrosis quantification was measured by morphometry and hydroxyproline assay. Indirect immunofluorescence was performed to detect collagens type I and III and the amount of tissue transglutaminase 2 (tTG2). The serum was collected for hepatic injury enzymes evaluations - alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), and hepatic function - total bilirubin (BilT) and albumin (ALB).

Results: At the end of 15 weeks of chronic hepatic injury, animals from groups CTRL, CTRL+OIL, EtOH, EtOH+OIL presented a normal liver pattern when compared to NORMAL group. In contrast, rats in groups CTRL+CCl4 and EtOH+CCl4 showed a cirrhosis pattern, with fibrous septa and regenerative nodules in that were sustained by 8 weeks after interruption of injury. The increase in the content of collagen analyzed by morphometry was observed in both the groups intoxicated with CCl4 in the end of 15 weeks (NORMAL – 2.25±1.21; CTRL+CCl4 – 9.83±3.85; EtOH+CCl4 – 12.68±2.64), however, fibrosis quantification at 8th week after interruption of intoxication remained higher in EtOH+CCl4/8wR (10.38±1.36) group when compared with CTRL+CCl4/8wR group (6.99±0.88). This result encouraged us to focus investigation on CCl4 and ethanol intoxicated animals. The EtOH+CCl4 group presented an increase in collagen content remained until 8 weeks after inteerruption of intoxication as evidenced by assay of hydroxyproline (NORMAL - 1,2±0.17; EtOH+CCl4 - 1,9±0.03; EtOH+CCl4/8sR – 1.6±0.18) and by immunofluorescence. The immunofluorescence performed by tTG2 also demonstrated an increase in detection and the amount of this enzyme that remained high after the interruption of the hepatotoxins (NORMAL – 7.90±0.83; EtOH+CCl4 – 66.43±8.00; EtOH+CCl4/8wR – 56.82±21.10). Values of AST (NORMAL – 62.20±14.15; EtOH+CCl4 (582.4±297.2), ALT (NORMAL – 12.0±2.9; EtOH+CCl4 – 102.0±83.47), BilT (NORMAL – 0.02±0.04; EtOH+CCl4 -

xviii

0.15±0.18) and ALB (NORMAL - 4.32±0.22; EtOH+CCl4 – 2.96±0.32) were altered at 15a week of induction but returned to normal levels 8 weeks after interruption of intoxication.

Conclusion: Carbon tetrachloride-ethanol association induced hepatic cirrhosis in rats representative of physiopathologic and clinic aspects of human disease and sustained cirrhosis morphology over a wider period of time, although functional parameters may normalize.

xix

1. INTRODUÇÃO

1.1. PANORAMA GERAL DAS HEPATOPATIAS CRÔNICAS

A doença hepática crônica é uma enfermidade que acomete grande

parcela da população mundial, atingindo cerca de 1,5 milhões de pessoas

por ano, segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2004).

Dentre as diversas etiologias que podem levar às hepatopatias

crônicas as hepatites virais e o álcool são as mais prevalentes. A OMS

relatou que mais de 2 bilhões de pessoas foram infectadas pelo vírus da

hepatite B (HBV), desses aproximadamente 15% poderiam desenvolver

hepatite crônica ou cirrose hepática. Apesar da infecção pelo vírus da

hepatite C (HCV) ser menos freqüente, estima-se que 180 milhões de

pessoas no mundo estão infectadas, sendo que cerca de 72%

desenvolvem hepatopatias crônicas evoluindo na maioria das vezes para

a cirrose (OMS, 2000).

Em se tratando do etanol, estima-se que de dois bilhões de

pessoas que consomem bebidas alcoólicas, cerca de 76 milhões têm

diagnóstico de desordem de consumo de álcool (OMS, 2004). O

alcoolismo foi responsável por cerca de 30% dos casos de cirrose

hepática no ano de 2005 de acordo com a OMS (ROOM e cols., 2005).

O hepatocarcinoma (CHC) causa 1 milhão de mortes anualmente

no mundo (WU e cols., 2006). Dos pacientes infectados pelo HBV, cerca

de 10% evoluem para o CHC em populações de baixo risco e em regiões

xx

de grande incidência do vírus cerca de 56% da população é acometida

pelo câncer (BOSCH e cols., 2004).

No Brasil o panorama também é preocupante. No ano de 2002 o

SUS apontou 9.731 (12%) óbitos em 76.628 internações devido a

doenças do fígado. Dentre esses óbitos, 21,1% foram atribuídos a

doenças relacionadas ao consumo excessivo de álcool. Para

compreender a relevância desses dados, basta analisar que as mortes

ocasionadas por infarto do miocárdio (IM), a maior causa de óbitos no

país, representaram cerca de 15,6% das internações ocorridas. Além

disso, os gastos com o pagamento de autorizações de internação

hospitalar (AIH) para as doenças hepáticas não são muito menores do

que os gastos com as mesmas AIH para o infarto agudo do miocárdio

(IAM). Enquanto o IAM custou ao SUS 55 milhões de reais em 2002, as

doenças hepáticas consumiram quase 53 milhões de reais

(DATASUS/MS, 2002).

1.2. EPIDEMIOLOGIA DA CIRROSE HEPÁTICA

A cirrose é uma doença grave, pois pode comprometer a função

hepática e levar à falência do órgão. Segundo dados do ano de 2001 da

Organização Mundial de Saúde, estima-se que a cirrose hepática foi

responsável pela morte de aproximadamente 796.000 pessoas em todo o

mundo, sendo classificada como a décima quinta causa de mortalidade no

mundo [OMS, 2003].

xxi

No Brasil, os dados de mortalidade provenientes do Sistema de

Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde do governo brasileiro (SVS)

indicam as doenças do aparelho digestivo como a oitava maior causa de

mortalidade, sendo que aproximadamente 30% dos óbitos que se

enquadram nessa categoria têm como causa a cirrose hepática [SVS/MS,

2004].

Os indicadores de mortalidade do Departamento de Informação e

Informática do Sistema Único de Saúde (DATASUS/MS) referentes ao período

de 2002 demonstram que a taxa de mortalidade específica por cirrose hepática

é de 7,79 óbitos para cada 100.000 habitantes e que o número de óbitos por

essa doença tende a crescer em proporção ao aumento da população do país

[DATASUS/MS, 2002].

Diversas tentativas de tratamento têm sido realizadas para mudar esse

quadro, porém ainda esbarramos no transplante hepático como única

alternativa, cuja viabilidade está sujeita à presença de uma política sistemática

e eficiente de doação de órgãos no país.

1.3. O FÍGADO 1.3.1. Anatomia, Função e Estrutura

O fígado é o maior órgão do corpo humano, representando cerca de 2%

a 5% do peso corporal total no adulto (DESMET, 2001). Está localizado na

parte superior da cavidade abdominal abaixo do diafragma. Anatomicamente o

fígado é dividido em dois lobos principais, o direito e o esquerdo separados

xxii

pelo ligamento falciforme, ambos os lobos com quatro segmentos cada. (Figura

1) (SHERLOCK&DOOLEY, 2002).

Figura 1 – Representação esquemática da anatomia do s lobos hepáticos

(adaptado de SHERLOCK&DOOLEY, 2002)

O aporte sanguíneo é realizado por duas vias: a artéria hepática e a veia

porta (SHERLOCK&DOOLEY, 2002). A artéria hepática possui a função de

manter o suprimento sanguíneo rico em oxigênio e nutrientes vindos da aorta.

A veia porta transporta cerca de 80% do sangue vindo do tubo digestivo, baço

e pâncreas, sendo responsável pela regulação do microambiente metabólico

do hepatócito. A drenagem venosa é realizada pela veia central que passa o

sangue pela veia cava inferior levando-o de volta ao coração. A bile secretada

pelos hepatócitos é excretada através dos ductos biliares. (Figura 2) (ARIAS,

2001).

Lobo Direito Diafragma

Lobo Esquerdo

Ligamento Falciforme

Vesícula Biliar

xxiii

Figura 2 – Representação esquemática dos vasos sang uíneos hepáticos.

(adquirida no site: www.hepcentro.com.br).

Além de sintetizar e secretar o produto biliar, o fígado desenvolve

diversas funções tais como: absorção e armazenamento de substâncias da

dieta (carboidratos, proteínas, lipídeos, minerais e vitaminas), transporte e

regulação de volume sanguíneo e depuração de toxinas. O fígado também

participa dos mecanismos de fagocitose, hematopoiese e coagulação

(DESMET, 2001).

A divisão clássica da unidade hepática, o lóbulo, é baseada na visão

estrutural de veias hepáticas tributárias localizadas na posição central (veias

centrais) e, na periferia encontram-se os tratos portais. Esses vasos são

xxiv

delineados por hepatócitos e sinusóides desenhando uma estrutura hexagonal

(Figura 3) (DESMET, 2001).

Porém, em 1976, RAPPAPORT descreveu o fígado de uma maneira

mais complexa considerando a parte estrutural e funcional, criando assim o

ácino hepático. Esse conceito se baseia na divisão do parênquima hepático em

três zonas, de acordo com a proximidade dos hepatócitos e fluxos sanguíneos

originários de espaços-porta (ramos terminais da veia porta, artéria hepática e

ducto biliar) e veias centro lobular (Figura 3) (SHERLOCK&DOOLEY, 2002)

Figura 3 – Representação esquemática do lóbulo Hepá tico (bordas azuis),

com uma veia centro-lobular ao centro e delimitado por tratos portais na

sua periferia e do ácino hepático com suas zonas: a zona acinar 1 (bordas

amarela), zona acinar 2 (borda laranja) e zona acinar 3 (borda vermelha).

(adaptado de 3B Scientific microanatomy ™ , 2002).

Lóbulo Hepático Trato Portal

Ácino Hepático

Veia Centrolobular

Zona Acinar 1

Zona Acinar 2

Zona Acinar 3

Sinusóides

xxv

A zona 1 (peri-portal) é a primeira a receber o sangue com alto

conteúdo de oxigênio e nutrientes, sendo considerada a região mais ativa e

resistente. É o local com grandes concentrações de enzimas pertencentes ao

ciclo de Krebs. A zona 2 (medio-lobular) recebe o sangue com conteúdo

intermediário de oxigênio. A zona 3 (peri-venular) é a última a ser irrigada,

recebendo assim, o sangue mais pobre em oxigênio e substratos. É uma região

responsável pela detoxicação, possuindo grandes quantidades da enzima

microssomal citocromo P450. Cada zona possui características funcionais

distintas que caracterizam a heterogeneidade do parênquima hepático

(TABELA 1) (SHERLOCK & DOOLEY, 2002)

Tabela 1 – Metabolismo dos hepatócitos relacionado à zona acinar

(adaptado de SHERLOCK & DOOLEY, 2002).

Durante o processo de injúria as zonas 1 e 2 possuem maior capacidade

de regeneração que a zona 3 que, devido às suas características, é mais

propensa a morte celular (SHERLOCK&DOOLEY, 2002).

Zona 1 Zona 3

Carboidratos Gliconeogênese Glicólise

Proteínas Albumina Fibrinogênio

Albumina Fibrinogênio

Citocromo P450 Após fenobarbital + +

++ ++++++++

Suprimento de oxigênio +++ +

Formação de bile

dependente de sais biliares não dependente de sais biliares

++ -

- ++

Sinusóides Estreito e anastomótico Direto e radial

xxvi

1.3.2. Microambiente Hepático

Os hepatócitos (células hepáticas) constituem cerca de 60% da

população do fígado. Apresentam uma membrana plasmática com três

superfícies: uma sinusoidal conectando o espaço de Disse e indiretamente o

sangue, a segunda intercelular ligando hepatócitos vizinhos e a terceira

canalicular biliar (SCHACHTER, 2001).

As diferentes conexões dos hepatócitos com o meio externo permitem o

desenvolvimento de variadas funções tais como secreção de proteínas

plasmáticas para o sangue (SCHACHTER, 2001), sinalização intercelular e

controle de crescimento celular (KOJIMA e cols., 2003) e secreção da bile para

os canalículos biliares (SCHACHTER, 2001).

Os hepatócitos são organizados em cordões separados entre si por

sinusóides - unidades microvasculares. Os sinusóides são delineados por

células endoteliais sinusoidais (do inglês sinusoidal endothelial cells - SECs),

que formam uma barreira porosa com suas fenestras, permitindo a troca de

materiais entre o sangue e o epitélio (FRIEDMAN, 2000).

Além do endotélio propriamente dito existem outros tipos celulares que

junto dos hepatócitos formam a unidade funcional e histológica do fígado. As

células de Kupffer (do inglês kuppfer cells - KCs) e células estreladas hepáticas

(do inglês hepatic stellate cells - HSCs) são células não parênquimatosas que

participam ativamente da regulação da matriz extracelular (MEC)

(SHERLOCK&DOOLEY, 2002).

As KCs estão acopladas aos sinusóides sendo localizadas

particularmente na região peri-portal. Essas células participam da resposta

xxvii

imunológica realizando endocitose. (SHERLOCK&DOOLEY, 2002). Atualmente

tem sido descrito que esses macrófagos participam da ativação de células

estreladas, visto que a produção de fibrose requer um ambiente com células

inflamatórias. (FRIEDMAN, 2005)

As HSCs, também denominadas lipócitos, células de Ito, células fat-

storing ou células perissinusoidais, estão presentes no espaço de Disse, região

localizada entre os hepatócitos e o endotélio sinusoidal. São as principais

reguladoras da MEC do fígado normal e possuem um papel fundamental na

resposta à injúria (SATO e cols., 2003; GEERTS, 2001; MABUCHI e cols.,

2004). Essas células produzem grande variedade de componentes da MEC

incluindo colágenos tipo I, III, IV e V; glicoproteínas e proteoglicanos. Em

estado fisiológico, as HSCs se encontram quiescentes e são responsáveis pelo

estoque e transporte de retinóide (vitamina A) (LI e FRIEDMAN, 2001). Em

resposta à lesão hepática, essas células se ativam, perdem retinóide e seu

fenótipo se torna de uma célula contrátil semelhante a um miofibroblasto

(WANG e cols., 2004; MABUCHI e cols., 2004). A partir desse momento as

HSCs aumentam a produção de componentes da MEC e alteram a sua

composição, gerando principalmente colágenos fibrilares do tipo I e III (LI e

FRIEDMAN, 2001; WANG e cols., 2004). Além disso, as HSCs são fonte de

enzimas proteolíticas, as metaloproteases da matriz extracelular (MMPs). As

MMPs também conhecidas como colagenases e gelatinases dependendo do

substrato, são responsáveis pela degradação do colágeno basal e intersticial. A

maioria é sintetizada e secretada pelas HSCs sendo que durante a lesão

ocorre aumento da secreção dessas enzimas, principalmente MMP-1 e -2 e de

xxviii

seus inibidores (tecido inibidor de metaloprotease - TIMPs), TIMP-1 e -2 (LI e

FRIEDMAN, 2001).

A MEC que compõe o espaço de Disse é de grande importância para a

manutenção da homeostasia hepática, pois é fonte de diversas moléculas e

substâncias, dentre elas: colágenos fibrilares (tipo I, III e V) e não-fibrilares (tipo

VI), colágenos de membrana basal (tipo IV e XVIII), glicoproteínas estruturais

(laminina, fibronectina), proteoglicanos (decorina, tenascina-C, entactina,

heparan sulfato, condroitinas e outros) além de citocinas e fatores de

crescimento (SATO e cols., 2003).

1.4. REGENERAÇÃO HEPÁTICA

Desde os tempos da Grécia antiga é sabido que o fígado possui uma

extraordinária capacidade de regeneração espontânea, realizando hiperplasia e

hipertrofia compensatória para restauração da massa e da função hepática. O

modelo experimental de hepatectomia parcial (retirada de 70% do fígado) em

ratos é um dos estudos pioneiros e mais bem sucedidos de regeneração

hepática, descrito em 1931 por Higgins e Anderson (citado por

MICHALOPOULOS & DeFRANCES, 1997).

Tanto na hepatectomia quanto na injúria tóxica, os hepatócitos são as

primeiras células que proliferam para substituir o tecido lesado, saindo do

estado quiescente, estimuladas por fatores de crescimento e citocinas (JESUS

e cols., 2000; HIRONOBU e cols., 2006).

O fator de necrose tumoral tipo-α (do inglês tumor necrose factor-α -

TNF-α) e a interleucina-6 (do inglês interleucine - IL-6) são citocinas que atuam,

xxix

de maneira parácrina, como “gatilhos” iniciais na cascata de regeneração

estimulando a entrada dos hepatócitos no ciclo celular (G0 G1). (YANG e

cols., 1998; PAHLAVAN e cols., 2006).

O fator de crescimento do hepatócito (do inglês hepatic growth factor -

HGF) produzido pelas KCs, HSCs e SECs e o fator transformador do

crescimento-α (do inglês transformer growth factor-α – TGF- α) sintetizado

pelos hepatócitos, são os principais agentes envolvidos no direcionamento

dessas células para a síntese de DNA (G1 S) (HIRONOBU e cols., 2006). A

replicação inicia de uma maneira quase sincronizada atingindo o pico de

síntese de DNA após 24 horas, quando cerca de 35% dos hepatócitos estão

envolvidos ativamente na divisão celular. O pico de mitose ocorre 6-8 h após a

injúria (FAUSTO, 2001; JESUS e cols., 2000).

O processo de término da proliferação é vagamente conhecido, porém

sabe-se que o fator de crescimento transformador tipo β (do inglês transformer

growth factor-β - TGF- β) secretado por KCs, SECs e HSCs, inibe tanto a ação

do HGF quanto do TGF- α, fatores pró-mitóticos, e interrompe a proliferação

modulando assim a resposta tardia. (YANG e cols., 2006). O TGF- β inibe a

síntese de DNA do hepatócito, tanto em cultura como in vivo, podendo estar

atuando na regulação da regeneração e da fibrogênese hepática

(WOLLENBERG e cols., 1987; RUSSELL e cols., 1988). GREESNER e cols

(2002) demonstraram que o TGF- β participa da transdiferenciação das HSCs

em miofibroblastos, evidenciando sua ação anti - mitótica durante a lesão

hepática.

O reparo hepático basicamente envolve hepatócitos adultos,

principalmente células tetraplóides (FAUSTO, 2001). No entanto, numa

Excluído: <sp>

xxx

situação em que o dano impede a capacidade proliferativa do hepatócito,

ocorre a replicação de células ovais consideradas células tronco do fígado.

Essa população endotelial foi descoberta nos canais de Hering e é capaz de se

diferenciar em células hepáticas e células de ducto biliar (PAHLAVAN e cols.,

2006).

O transplante de fragmentos de fígado e o transplante de doador vivo

têm sido utilizados clinicamente e podem resultar na completa recuperação do

órgão em ambos, doador e receptor. Desde que o primeiro transplante de

fígado humano foi realizado por Starzl em 1963 (citado em FERREIRA e cols.,

2000), projetos experimentais têm evoluído com o objetivo de descobrir uma

terapia efetiva no tratamento das doenças hepáticas crônicas.

1.5. CIRROSE HEPÁTICA 1.5.1. Definição de Cirrose

A cirrose hepática é definida como um processo crônico caracterizado

histologicamente pela presença de fibrose e nódulos de regeneração e

funcionalmente pela ocorrência de hipertensão porta. Esses fatores integrados

levam à falência do órgão. (SHERLOCK&DOOLEY, 2002).

É uma doença de caráter irreversível que reduz a qualidade de vida do

paciente que possui, na maioria das vezes, como única alternativa o

transplante do fígado e dependendo do grau da complicação, pode levar ao

óbito.

1.5.2. Aspectos Morfológicos

xxxi

O surgimento da cirrose hepática ocorre por mecanismos de fibrose

desenvolvidos por um complexo processo no qual envolve principalmente

HSCs, citocinas, MMPs e TIMPs.

Após a lesão hepática aguda hepatócitos sobreviventes são capazes de

regenerar o órgão. Porém, lesões crônicas causadas por diversos agentes

como HBV, HCV, abuso de álcool e drogas resultam em quebra da

homeostasia com posterior deposição de componentes da MEC

(principalmente colágeno), desenvolvendo a fibrose hepática (BATALLER e

BRENNER, 2005).

A fibrose hepática pode ser considerada um processo reversível quando

o agente causador é interrompido (OKAZAKI e cols., 2001). No entanto,

quando a agressão é mantida, o colágeno se deposita continuamente formando

septos fibrosos que evoluem para nódulos de regeneração, estabelecendo o

quadro de cirrose hepática. Esse quadro é irreversível e cursa com a distorção

da arquitetura hepática, perda de função hepatocelular e de fenestras

sinusoidais (FRIEDMAN, 1999; ROJKIND, 2001).

Na fibrogênese, as HSCs modificam seu fenótipo para células tipo

miofibroblastos e tornam-se as principais produtoras de MEC, principalmente

de colágeno. As etapas envolvidas nesse processo em que as células perdem

a capacidade de estocar vitamina A e se tornam ativadas são reguladas por

diferentes células, fatores de crescimento e citocinas. (Figura 4) (FRIEDMAN,

2000; BATALLER e BRENNER, 2005).

xxxii

Figura 4 – Representação esquemática das modificaçõ es ocorridas no

fígado normal após a lesão hepática crônica (adapta do de FRIEDMAN,

2000).

A ativação das HSCs pode ser conceituada em duas etapas: iniciação e

perpetuação. A primeira é regulada por mecanismos parácrinos que

desencadeiam mudanças genotípicas e fenotípicas do início da cascata

fibrogênica. A segunda é regulada por mecanismos autócrinos e parácrinos

que permitem o estado ativado estável de produção de fibrose. (LI e

FRIEDMAN, 2001). O TGFβ 1 produzido por KCs, SECs e HSCs parece ser um

importante regulador da cascata fibrogênica e participa de ambas as etapas de

ativação. Ele atua sobre as KCs induzindo a expressão de TGFβ 1 e sobre as

HSCs estimulando a síntese e inibindo a degradação da MEC. (FRIEDMAN,

1999; BATALLER e BRENNER 2005). Além disso, ele induz acúmulo de H2O2

Espaço de Disse com matriz extracelular de baixa densidade, célula estrelada hepática em estado quiescente e com acúmulo de retinóides, hepatócitos com microvilos e células endoteliais sinusoidais com poros.

Matriz extracelular com depósito de fibras de colágeno, células estreladas hepáticas ativadas em proliferação e fibrogênicas, perda dos microvilos dos hepatócitos, perda dos poros das células endoteliais sinusoidais.

xxxiii

em varias células, causando estresse oxidativo que estimula a ativação das

HSCs. (DOMINGUEZ-ROSALEZ e cols., 1997). O fator de crescimento

derivado de plaquetas (PDGF) e o fator de crescimento epidérmico (EGF)

ambos produzidos por plaquetas, são descritos como importantes mitogénos

das HSCs (SHERLOCK&DOOLEY, 2002).

O acúmulo de MEC produzido pela ativação das HSCs seguindo a injúria

crônica gera um aumento de até 6 vezes no conteúdo de componentes

protéicos, sendo que os colágenos nas formas fibrilares (I e III) apresentam um

aumento de até 7 vezes (BATALLER e BRENNER, 2005). Dois fatores

importantes para a persistência do colágeno depositado podem ser

estabelecidos: o primeiro é a redução da atividade de proteases (MMPs) e o

segundo é a capacidade do colágeno resistir à degradação dessas proteases.

Um dos fatores que determinam o completo desequilíbrio na síntese e

na degradação dos colágenos é a atividade reduzida das MMPs devido

principalmente a superexpressão de seus inibidores - TIMPs (BATALLER e

BRENNER, 2005). A expressão de MMP-1 e MMP-13 são aumentadas na fase

inicial da injúria, porém são rapidamente reduzidas pelo aumento da expressão

de TIMP-1, TIMP-2 que mantém os colágeno tipo I e tipo III depositados em

grande quantidade. Já as MMP-2, MMP-3, MMP-9 e MMP-10 têm a expressão

aumentada gradualmente durante a fibrogênese, resultando no aumento da

degradação de componentes da membrana basal, incluindo colágeno tipo IV

(ROJKIND e GREENWEL, 2001).

O segundo ponto importante é a resistência do colágeno a degradação

pelas MMPs. A ligação cruzada covalente entre as proteínas de colágeno

(cross-linking) é realizada pelas transglutaminases teciduais (tTG), uma grande

xxxiv

família de enzimas que catalisam reações dependentes de Ca2+. Essas

enzimas são localizadas no sangue e em espaços intra - e extracelulares além

de atuarem em diversos processos bioquímicos, tais como, coagulação,

remodelamento tecidual, estabilização da matriz e morte celular (GRIFIN e

cols., 2002).

A transglutaminase tecidual 2 (tTG2 ou TG2) é a enzima mais conhecida

no envolvimento da fibrogênese. Ela catalisa a reação entre grupamentos γ-

carboxiamida e polipeptídeos ligados a um resíduo de lisina para formar um

isopeptídeo Nε (γ glutamil) lisina (LORAND e GRAHAM, 2003). Essa reação

química estabiliza as fibras de colágeno, aumentando a resistência à

degradação por enzimas proteolíticas. Com a agressão crônica, essas fibras se

tornam espessas e formam septos que irão circundar nódulos de regeneração,

caracterizando a cirrose hepática (WU e ZERN, 2004).

1.5.3. Aspectos Clínicos

A cirrose possui diferentes etiologias (Tabela 2) com características

peculiares, porém resultando em um quadro clínico comum: insuficiência

hepatocelular e hipertensão porta.

Etiologia da Cirrose Hepática

Hepatite Viral (B, C e D)

Etanol

Metabólica

Colestática

Bloqueio de Fluxo Venoso Hepático

Hepatite Auto-Imune

Toxinas e drogas

Criptogênica

xxxv

Tabela 2 – Principais Causas de Cirrose Hepática (S HERLOCK & DOOLEY,

2002).

As complicações mais graves são: desnutrição, ascite, peritonite

bacteriana, varizes e sangramento no esôfago, insuficiência hepatorenal,

síndrome hepatopulmonar e carcinoma hepatocelular (SHERLOCK &

DOOLEY, 2002).

O diagnóstico padrão de cirrose hepática ainda é histológico (biópsia

hepática). Outra forma de avaliação da doença se faz através de análises

bioquímicas na qual se avalia a presença de disfunção hepatocelular.

As aminotranferases são enzimas que catalisam reações de

transaminação. O aumento dessas enzimas indica lesão hepatocelular

(necrose). A alanina aminotransferase (ALT) é mitocôndrial, encontrada

exclusivamente nos hepatócitos. Já a aspartato aminotransferase (AST) é

citosólica, encontrada em vários órgãos: coração, músculo, rins, pâncreas e

fígado.A fosfatase alcalina, γ-glutamiltranspeptidase (γ-GT) e 5`nucleotidase

são importantes na detecção de colestase. (KAPLAN, 1993)

Outras substâncias são úteis na avaliação da função hepática. A

bilirrubina indireta ou não conjugada é um produto do metabolismo do heme

(eritrócitos), posteriormente conjugada em bilirrubina direta no fígado. A

elevação da concentração de bilirrubina direta no sangue representa disfunção

hepática ou obstrução dos ductos biliares. O aumento da bilirrubina indireta ou

não conjugada no sangue pode estar associado ao aumento da oferta de heme

(hemólise), à diminuição da captação hepática ou à diminuição da conjugação

hepática (deficiência da enzima glicuroniltransferase). A albumina é uma

xxxvi

proteína plasmática sintetizada exclusivamente pelas células hepáticas e a

diminuição nos níveis séricos dessa substância indicam baixa síntese e

concomitante secreção pelos hepatócitos (DAVERN, 2002).

Pacientes capazes de remover o agente causador da agressão hepática

vivem com a cirrose sem grandes complicações. Essa característica de cirrose

compensada é um estado clinico em que permanecem os padrões

histopatológicos, mas a função hepática melhora. A cirrose descompensada

poderá levar o paciente ao óbito. Quando o paciente atinge o estágio de

cirrose descompensada, a única terapia definitiva ainda é o transplante

hepático (DAVIS e cols., 2003; D’AMICO e cols., 2006). Embora muitos

esforços tenham sido feitos para aumentar a doação, a disponibilidade de

órgãos é muito pequena. Assim, é necessária a busca de novas terapias

capazes de aumentar a taxa de sobrevivência desses pacientes, para garantir

que estejam aptos para aguardar um transplante.

1.6. MODELO EXPERIMENTAL DE CIRROSE HEPÁTICA

Diversas abordagens metodológicas têm sido propostas para o

desenvolvimento experimental de fibrose e cirrose em ratos. Os principais

estudos o fazem através da obstrução do ducto biliar ou por administração de

substâncias hepatotóxicas como dimetilnitrosamina, tioacetamida e tetracloreto

de carbono (CCl4).

A obstrução do ducto biliar é um procedimento cirúrgico traumático

realizado em modelos animais por um período considerado curto (algumas

horas ou até 30 dias de oclusão) para o desenvolvimento de cirrose, sendo

xxxvii

portanto utilizado no estudo dos mecanismos de fibrogênese hepática

(modulação de MMps, TIMPs e citocinas) ocorridos na MEC (BISSELL e cols.,

1995; IREDALE e cols., 1996; KOSSAKOWSKA e cols., 1998)). KAMATH e

cols (1999) realizaram um estudo de hipertensão porta relatando alta

mortalidade e um percentual pouco significante ou ausente de fibrose após a

oclusão biliar de oito semanas.

MADDDEN e cols relataram em 1970 que a dimetilnitrosamina é fatal ao

homem mesmo em pequenas quantidades, necessitando muito cuidado na sua

manipulação. Haney e cols (1972) administraram dimetilnitrosamina em ratos

por gavagem levando a cirrose hepática em 4 semanas. No entanto esse

mesmo estudo demonstrou regeneração espontânea e mortalidade de 25% dos

animais. Jezequel e cols (1989) em um modelo de lesão hepática crônica

descreveram a produção de cirrose micronodular num período de 3 semanas.

Em ambos os trabalhos o período de indução de cirrose hepática foi muito

curto para reproduzir no animal as características representativas da doença

em humanos, a irreversibilidade.

Em um estudo de Li e cols (2002) a tioacetamida foi administrada

oralmente (diluída em água) por 12 semanas, desenvolvendo cirrose hepática.

Porém nesse mesmo trabalho foi relatado que para a reprodução da lesão

hepática crônica em 100% dos animais, deve haver um ajuste de dose de

acordo com a variação de peso do animal.

O CCl4 tem sido utilizado por décadas no estudo das lesões hepáticas

crônicas em diversos modelos experimentais. O primeiro relato de

desenvolvimento de cirrose hepática induzida por CCl4 foi proposto por

CAMERON E KARUNARATNE em 1936 (citado por McLEAN, e cols., 1969)

xxxviii

que estabeleceram a morfologia e os padrões de condições experimentais

dessa hepatotoxina. Esse estudo foi criticado por haver lento processo de

indução, alta taxa de mortalidade devido às altas doses administradas e um

padrão heterogêneo de lesão, visto que uma proporção dos ratos

sobreviventes não desenvolvia cirrose (McLEAN et al. 1969, PEREZ-TAMAYO,

1983).

Para reduzir tais problemas, foi proposta por McLean em 1969 a

administração simultânea de fenobarbital e CCl4 em que se observou a

redução da mortalidade e do tempo de agressão necessário para a indução de

cirrose e um aumento da proporção de animais cirróticos.

O fenobarbital foi associado ao CCl4 no desenvolvimento de cirrose

hepática por sua capacidade de aumentar a síntese do sistema oxidativo

enzimático microssomal (MEOS) ou sistema enzimático do citocromo P450,

enzima pela qual o CCl4 é metabolizado, potencializando sua hepatoxicidade

(McLEAN e cols., 1969; CASTILLO e cols., 1992). No entanto, é descrito que

após a suspensão da indução ocorre regeneração hepática e reparo tecidual

(KODAVANTI e cols., 1992; HASHIMOTO e cols., 1999).

Sabe-se que a cirrose hepática em humanos é uma doença irreversível.

Portanto a escolha de um modelo que demonstre esse padrão de lesão é

essencial para o estudo de seu mecanismo fisiopatológico. Tamayo (1983), em

seu estudo de revisão, critica a cirrose hepática produzida pelo CCl4,

baseando-se em achados anteriores que mostraram reversibilidade da lesão

hepática produzida em um mês de indução, quando a toxina foi suspensa. O

autor sugere que, para obter uma cirrose estável, a agressão deveria ser

xxxix

prolongada por um período maior de tempo, porém, podendo acarretar alta

mortalidade.

O CCl4 é um líquido incolor e hidrofóbico, produzido a partir de outros

hidrocarbonetos, que libera vapor de odor etéreo. Hoje em dia, é utilizado

apenas como solvente industrial, mas foi utilizado largamente na produção de

cloro-flúor-carbonos (CFCs) para fluído refrigerante e propelente de aerossóis,

como pesticida e como solvente de limpeza doméstica. Sua produção e

utilização foram reduzidas após a constatação de seus efeitos deletérios tanto

à saúde humana bem como ao meio ambiente (ATSDR, 2005).

O fígado é um órgão especialmente vulnerável a essa hepatotoxina

devido à abundância da isoenzima do MEOS mais envolvida nesse processo, a

citocromo P450 2E1 (CYP2E1), presente no retículo endoplasmático liso de

hepatócitos (RECKANEL e cols., 1989).

A metabolização do CCl4 pela CYP2E1 causa a quebra da ligação C-Cl

gerando o radical livre triclorometil (●CCl3). Esse radical livre reage

rapidamente ao oxigênio, formando um radical ainda mais reativo, o

triclorometilperoxi (CCl3O2●) (LAI e cols. 1978). Esses intermediários tóxicos

reativos causam lesão hepatocelular através da peroxidação lipídica e reações

autocatalíticas que resultam na perda da integridade da membrana. Além

disso, geram acúmulo de lipídios devido a incapacidade dos hepatócitos de

sintetizar apoproteína, proteína que se liga aos triglicerídedeos e facilita a

exportação de lipoproteínas. Essa alteração gordurosa caracteriza a esteatose

hepática (ROBBINS, 2001).

A ingestão de etanol foi utilizada em modelos experimentais de lesão

hepática aguda por ser um método simples de administração através da

xl

diluição na água do animal. No entanto para o desenvolvimento de um estudo

de lesão crônica existem alguns obstáculos quanto a essa forma de ingestão

tais como: aversão do animal ao álcool, desnutrição devido a ingestão de

nutrientes não balanceados e baixos níveis de etanol no sangue (PONNAPA e

RUBIN, 2000; HALL e cols., 2001). Devido a essas limitações foi desenvolvida

uma dieta líquida alcoólica que garantia todos os nutrientes necessários e um

considerável consumo de etanol (HALL e cols., 2001). Tsukamoto e cols

administraram por via gástrica etanol em dieta líquida em ratos e observaram a

presença de esteatose e fibrose, mas não relataram o desenvolvimento de

cirrose hepática. (Tsukamoto e cols (1985) – citado em Hall 2001). Enomoto e

cols (1999 – citado em PONNAPA e RUBIN, 2000) relataram um outro modelo

em que o etanol foi administrado pela mesma via diariamente por 4 semanas,

porém causando os mesmos danos hepáticos relatados no estudo descrito

acima.

O etanol tem sido associado ao CCl4 em alguns modelos de lesão

hepática crônica devido a sua capacidade de potencializar a hepatotoxicidade

do CCl4. Além de ser um agente hepatotóxico direto, principalmente quando

administrado em grandes doses (HALL e cols., 2001), a detoxicação do etanol

ativa a mesma via que metaboliza o CCl4, a citocromo P450, podendo

exarcebar a a ação da CYP2E1 em até seis vezes. (LIEBER 1988 – citado em

HALL 2001). O aumento da bioativação de radicais livres do CCl4 causa

estresse oxidativo e peroxidação de lipídios de membrana culminando na lesão

hepatocelular (HASUMURA e cols., 1974; CASTILLO e cols., 1992; LIEBER,

1997). Outra via de detoxicação do etanol é através das enzimas álcool

desidrogenase e aldeído desidrogenase que produzem respectivamente,

xli

acetaldeído e acetato. Essas duas reações também geram moléculas reativas

de oxigênio aumentando o dano causado ao hepatócito (PONNAPPA e

RUBIN, 2000). Finalmente, o estímulo patogênico mediado pela associação de

ambas hepatotoxinas irá disparar uma cascata de eventos que culminarão na

deposição de colágeno, levando ao desenvolvimento de fibrose e cirrose

hepática. (Figura 5)

●CCl3

xlii

Figura 5 – Representação esquemática dos principais mecanismos

envolvidos na fibrogênese hepática induzida por etan ol e por CCl 4.

(adaptado de ROJKIND & GREENWEL, 2001).

●CCl3

+

HEPATÓCITO

Etanol

Álcool Desidrogenase

CCl4

CYP2E1

Estresse

H2O2 Acetaldeído

Lesão membrana hepatócito

Depósito colágeno

HSC

Síntese colágeno

Espaço de Disse

KCs

TGF-β

Sinusóide

FIBROSE HEPÁTICA

xliii

Hall e cols (1991) comprovaram esse mecanismo através da produção

de um modelo de fibrose e cirrose após administração crônica de vapor de

CCl4 em baixas doses e etanol em dieta líquida durante 10 semanas. Plummer

e cols (1994) relataram que a associação dessas toxinas contribuiu para a

lesão hepática de maneira dose-relacionada. A dose mínima de etanol

(2,29g/Kg/dia) associada a uma dose elevada de CCl4 (240 ppm/hora)

desenvolveu cirrose hepática em um tempo longo (20 semanas) e com uma

incidência reduzida enquanto que a dose elevada de CCl4 combinada a maior

dose de etanol (8,16g/Kg/dia) produziu a lesão em um período menor (10

semanas).

De acordo com os relatos demonstrados na literatura ainda não se tem

um modelo estabelecido de cirrose hepática capaz de reproduzir os aspectos

clínicos e fisiopatológicos da doença, sendo essencial o desenvolvimento de

modelos mais eficazes. Além disso, é muito importante a avaliação do potencial

de regeneração do parênquima hepático para o estudo de novas abordagens

terapêuticas.

xliv

2. OBJETIVOS

GERAL:

Desenvolver um modelo de cirrose hepática em ratos com baixo

potencial de reversibilidade espontânea, através da administração simultânea

de etanol e de baixas doses de CCl4.

ESPECÍFICOS:

Avaliar as alterações histológicas hepáticas relacionadas à exposição

crônica ao etanol e ao CCl4, isolados e em associação.

Comparar o potencial de reversão espontânea da cirrose hepática

induzida por CCl4 e pela associação de etanol com CCl4.

Avaliar as características funcionais da cirrose hepática induzida pela

associação de etanol com CCl4.

xlv

3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. ANIMAIS

Os animais utilizados no estudo foram ratos fêmeas Wistar adultos

pesando entre 150g e 250g adquiridos no biotério do Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho (IBCCF) – UFRJ/RJ. Foram mantidos em caixas de

polipropileno, forradas com lascas de madeira esterilizadas, em ambiente com

temperatura controlada (entre 22ºC e 24ºC) e com ciclos claro/escuro natural

(12:12). Foram respeitados os preceitos do “Guia para o Uso e Cuidado de

Animais de Laboratório” (Publicação do NIH no 85-23, revisada em 1985, USA).

A pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética da instituição (protocolo no. 021).

3.2. CONFECÇÃO DA DIETA LÍQUIDA ALCOÓLICA E NÃO-ALC OÓLICA

A dieta líquida foi realizada baseada na dieta de LIEBER-DeCARLI

descrita previamente (HALL, 2001), porém com algumas modificações no

preparo e em sua composição final. Seus ingredientes garantem aos animais

uma alimentação balanceada permitindo a substituição da ração padrão, sem

acarretar danos nutricionais. Alguns ingredientes foram pesados

separadamente, outros foram comprados prontos (Tabela 3).

A dieta líquida sem etanol foi realizada com a diluição de todos os

ingredientes em água filtrada e conseqüente homogeneização no liquidificador.

A dieta líquida alcoólica foi realizada com bebida alcoólica destilada

comercial – aguardente (Companhia Muller de Bebidas) - cuja composição

essencial é de água e etanol a 42% GL. A aguardente era adicionada durante a

preparação da dieta e a concentração final do etanol era de 5,5% (m/v).

xlvi

Tabela 3 – Composição da dieta líquida de Lieber-De Carli modificada

(adaptado de LIEBER & DeCARLI, 1989).

3.3. GRUPOS EXPERIMENTAIS

Diversos grupos controles experimentais foram utilizados com o objetivo

de garantir que nenhum componente (azeite ou etanol) causaria lesão hepática

na ausência do CCl4. (Tabela 4).

Tabela 4 – Grupos experimentais de acordo com a die ta e injeção

intraperitoneal (i.p.)

Concentração para preparação de 1 Litro de dieta líquida

Albumina - 41,4 g Maltose Dextran - 115,2 g Vitamina A – 6000 UI Ácido Nicotínico – 7,5 mg

Cisteína – 0,5 g Colina – 5,68 g Vitamina B1 – 1,5 mg Pantetonato de Cálcio – 4 mg

Metionina - 0,3 g Carbonato de Cálcio – 2,7 g Vitamina B6 – 1,75 mg Inositol – 25 mg

Goma Xantina - 3g Cloreto de Sódio – 0,81 g Vitamina B12 – 25 µg Riboflavina - 1,5 mg

Celulose – 10g Fosfato de Sódio – 0,92 g Vitamina D - 400 UI Biotina – 50 µg

Azeite de Oliva – 28,4 g Fosfato de Potássio – 3,5 g Vitamina E – 30 UI Menadiona - 125 µg

Óleo de Milho - 8,5 g Sulfato Ferroso - 0,044g Ácido Fólico - 0,5 mg

Óleo de Girassol – 2,7 g Sulfato de Magnésio - 2,56g Ácido Parabenzóico – 12,5 mg Aguardente comercial – 160mL

NORMAL Dieta de ração padrão e água filtrada; n = 7

CTRL Dieta líquida sem etanol; n = 4

CTRL+Azeite Dieta líquida sem etanol + injeção i.p. de azeite de oliva; n = 4

CTRL+CCl4 Dieta líquida sem etanol + injeção i.p. de CCl4; n = 9

EtOH Dieta líquida alcoólica; n = 5

EtOH+Azeite Dieta líquida alcoólica + injeção i.p. de azeite de oliva; n = 11

EtOH+CCl 4 Dieta líquida alcoólica + injeção i.p. de CCl4; n= 7

* adicionado para constituir a dieta líquida alcoólica a 5,5%

xlvii

3.4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

O experimento foi dividido em 3 etapas: Adaptação – substituição da

ração pela dieta líquida; Indução da cirrose – substituição da dieta controle

pela dieta líquida alcoólica e injeção de CCl4; Interrupção da indução –

suspensão da dieta alcoólica e do CCl4. Na 1ª semana, etapa de adaptação,

todos os grupos receberam a dieta líquida sem etanol (dieta controle) com

exceção do grupo NORMAL que recebeu apenas ração padrão e água durante

todo o protocolo. Os grupos CTRL, CTRL+Azeite e CTRL+CCl4 permaneceram

com essa alimentação até o fim do protocolo. Na 2ª semana os grupos EtOH,

EtOH+Azeite e EtOH+CCl4 passaram a receber dieta alcoólica para se

adaptarem à presença do etanol. Na 3ª semana, etapa de indução da cirrose,

os grupos CTRL+Azeite e EtOH +Azeite iniciaram as injeções i.p. de 50µL de

azeite de oliva puro e os grupos CTRL+ CCl4 e EtOH+CCl4 iniciaram as

injeções i.p. de 0,05 mL/kg de CCl4 a 20% diluído em azeite de oliva. As

injeções foram administradas três vezes por semana em dias alternados

durante 15 semanas.

Ao final da 15ª semana de experimento, todos os animais dos grupos

controles (NORMAL, CTRL, CTRL+Azeite, EtOH, EtOH+Azeite) e alguns

animais dos grupos CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4 foram anestesiados com éter e

sacrificados por deslocamento cervical.

A partir desse momento iniciou-se a etapa de interrupção da indução

para avaliar as mudanças espontâneas morfológicas e funcionais ocorridas no

fígado dos animais. Para tal, a dieta alcoólica e as injeções i.p. foram

interrompidas nos animais remanescentes dos grupos CTRL+CCl4 e

EtOH+CCl4 que passaram a se alimentar de ração padrão e água. Ambos os

xlviii

grupos foram sacrificados com 8 semanas após a interrupção da indução

(Tabela 5).

Tabela 5 – Grupos da recuperação hepática espontâne a

No presente estudo a pesagem foi importante para avaliar se a

substituição da ração pela dieta líquida acarretaria danos nutricionais aos

animais. Para tanto, os animais foram pesados antes do inicio da indução, 4

semanas de indução, 8 semanas de indução, 15 semanas de indução.

Com o objetivo de comparar o consumo da dieta-controle e da dieta-

alcoólica, mensuramos (mL) o consumo médio diário por caixa experimental,

cada uma contendo cinco animais. As aferições foram realizadas na 4a, 8a e

15a semana de indução.

A dose média de etanol ingerida pelos animais dos grupos EtOH,

EtOH+Azeite e EtOH+CCl4 foi estimada com base na concentração de etanol

(5,5% m/v) na dieta-alcoólica e nos valores do consumo médio de dieta líquida

alcoólica, em relação ao peso médio dos animais de cada grupo experimental.

A média do consumo de etanol foi aferida na 4a, 8a e 15a semana de indução.

As análises histológicas foram realizadas antes do início da indução, na

4a, 8a e 15a semana de indução e na 8a semana após a interrupção da indução.

As análises bioquímicas foram realizadas antes do início da indução, na 15a

CTRL+CCl4/8sR Ração padrão e água por 8 semanas após a interrupção da

indução; n=4

EtOH+CCl 4/8sR Ração padrão e água por 8 semanas após interrupção da

indução; n = 6

xlix

semana de indução e na 8a semana após a interrupção da indução. O

protocolo experimental está ilustrado na figura 6.

Figura 6 - Protocolo experimental de indução de cir rose hepática

3.5. ANÁLISE HISTOLÓGICA

A histologia foi realizada em todos os grupos experimentais. A análise

nos períodos de 4 e 8 semanas de indução são oriundas de resultados de

trabalhos anteriores que geraram uma tese de mestrado intitulada “Modelo

Dieta controle + CCl4

(CTRL+CCl4 - n=9)

Dieta alcoólica + CCl4

(EtOH + CCl4 - n=11)

2 semanas de adaptação à dieta líquida

15 semanas de indução

8 semanas de interrupção da intoxicação com CCl4 e etanol

Bioquímica

Sacrifício

4s 8s 15s

8s

2s

2s

2s

Injeções de azeite e/ou CCl4 3x por semana em dias alternados

Grupos controles (n=25)

4s 8s 15s

4s 8s 15s

l

Experimental para Lesão Hepática Crônica Induzida por Tetracloreto de

Carbono e Álcool: avaliação de parâmetros para diagnóstico indireto de

cirrose”.

Retirada, lavagem, fixação e inclusão: As peças hepáticas foram

lavadas em salina tamponada 1X (PBS) para remoção do excesso de sangue.

Em seguida foram fatiadas e fixadas em solução Bouin por 4h e logo após em

solução de formaldeído 10% por 24h. Em seguida foram desidratadas em

quantidades graduais de etanol (70%, e 2 vezes em 100%), clarificados em

xilol por 2 vezes, e impregnados em parafina 2 vezes para a inclusão; cada

etapa durou 30 minutos. Corte : Os blocos incluídos em parafina foram

seccionados no micrótomo obtendo-se cortes de 5µm de espessura.

Colorações: As colorações realizadas foram de hematoxilina&eosina para

avaliação da arquitetura hepática e Picrosirius para avaliação do conteúdo de

colágeno.

3.5.1 - Coloração por Hematoxilina e Eosina

Para promover a desparafinização dos cortes, as lâminas foram

incubadas em estufa a 60ºC por 20 minutos. Em seguida, foram feitos três

banhos sucessivos de xilol PA por 3 minutos. Os cortes foram hidratados em

banhos de concentrações decrescentes de álcool (álcool 100%, 95%, e 90%)

por 3 minutos e, em seguida, foram lavados em água destilada por 3 minutos.

As lâminas foram incubadas em solução de Hematoxilina de Harris por 10

minutos e lavados em água corrente por 10 minutos. A diferenciação foi

realizada com solução de álcool clorídrico. Realizamos a lavagem das lâminas

li

em água corrente por 5 minutos e água destilada por 3 minutos. Em seguida,

as lâminas foram incubadas em solução de eosina por 10 minutos e, logo após,

foram lavadas rapidamente em água corrente. Os cortes foram então

desidratados em soluções crescentes de álcool (álcool 95%, 95%, 100% e

100%) por 3 minutos em cada solução. Fizemos a clarificação dos cortes em 3

banhos de xilol durante 5 minutos cada. As lâminas foram montadas com

Entellan e observadas em microscópio óptico Axioplan 100 (Zeiss) com

objetivas de 10X e 40X.

3.5.2 - Coloração por Picrosírius

As lâminas emblocadas em parafina foram colocadas na estufa a 60ºC

durante 20 minutos para facilitar a retirada da parafina. Os cortes histológicos

foram submetidos a três banhos de xilol PA por 5 minutos. O material foi

hidratado através de banhos de 5 minutos em soluções decrescentes de álcool

(100%, 95%, 90% e 70%) e depois lavados em água destilada por 10 minutos.

As lâminas foram incubadas em solução de ácido fosfomolíbdico 0,2% por 1

minuto e em seguida incubadas em solução de picrosírius por 90 minutos.

Após a incubação, as lâminas foram lavadas em ácido clorídrico 0,01N por 2

minutos e em álcool 70% durante 45 segundos. O material foi desidratado com

duas lavagens sucessivas de 5 minutos em álcool 95% e 100%. Os cortes

foram clarificados através de duas lavagens com xilol por 5 minutos. As

lâminas foram montadas com Entellan e observadas em microscópio óptico

Axioplan 100 (Zeiss) com objetivas de 10X e 40X.

lii

3.6. ANÁLISE MORFOMÉTRICA

A morfometria é uma técnica vastamente utilizada para quantificação do

grau de fibrose hepática em lâminas teciduais coradas com picrosirius. Foram

analisados por esse método o grupo NORMAL e os grupos intoxicados por

CCl4 durante 15 semanas (CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4) e após 8 semanas de

interrupção da agressão (CTRL+CCl4/8sR e EtOH+CCl4/8sR).

Esta análise utiliza a coloração de picrosirius calculando a área de tecido

fibroso em secções hepáticas de 5µm, coradas em vermelho, como

porcentagem da área total. Dez campos foram fotografados randomicamente

num aumento de 100x e foram analisados no programa Image-Pro Plus 5.0

(MediaCybernetics, USA).

3.7. ENSAIO DE HIDROXIPROLINA

A análise de hidroxiprolina foi realizada em animais do grupo NORMAL e

intoxicados com CCl4 e etanol durante 15 semanas (EtOH+CCl4) e após 8

semanas de interrupção da agressão (EtOH+CCl4/8sR).

É um método bioquímico que permite a análise direta do conteúdo de

fibrose através da quantificação desse aminoácido em tecido hepático total.

Para quantificá-lo, aproximadamente 2g de tecido hepático fresco (de

cada animal), foram desidratados em acetona por 48hrs. Depois, foram

colocados em estufa a 60ºC por 24hrs, macerados, pesados e estocados a 4ºC.

Cerca de 10 mg foram então hidrolisados com HCl 6M por 18 horas, à 107C. O

ácido foi removido por evaporação e o material hidrolisado foi ressuspendido

em 200µL de tampão de reação (5% de ácido cítrico monoidratado, 1,2% de

liii

ácido acético, 12% de acetato de sódio 3H2O, 3,4% de hidróxido de sódio, pH

6.0), diluído 1:10, no momento do uso. A solução foi então incubada com 1mL

de solução cloramina-T (60mM in 50% n-propanol, pH 6.0) por 20 minutos, à

temperatura ambiente. Ao produto da reação foi adicionado 1mL da solução

aldeído/ácido perclórico (1M 4-(Dimethylamino)-benzaldehyde in 16% ácido

perclórico and 60% n-propanol), permanecendo por 20 minutos à 60oC. A

densidade óptica foi lida a λ=595nm usando um espectrofotômetro (GE

Healthcare do Brasil, Brasil). A concentração foi determinada pela equação

linear tendo como base uma curva de calibração padrão de 4-hidroxiprolina

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

3.8. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Foram realizados ensaios de imunofluorescência dos grupos NORMAL e

que associaram CCl4 e etanol intoxicados durante 15 semanas (EtOH+CCl4) e

após 8 semanas de interrupção da agressão (EtOH+CCl4/8sR).

A detecção foi realizada para qualificar o padrão de distribuição dos

isotipos de colágenos I e III, componentes mais elevados durante a fase de

lesão hepática, e o isopeptideo ε (γ-glutamil) lysine, produto da tTG2, uma

enzima que atua na reação cruzada (cross-linking) de fibras colágenas. A

detecção do cross-linking de fibras de colágeno depositadas na matriz

caracteriza uma resistência maior à degradação por colagenases teciduais.

Para tanto, peças hepáticas foram embebidas em um criopreservador

(TISSUE-TEK OCT) e congeladas a - 70°C. Cortes de 6µm foram realizadas no

criostato a -20ºC e em seguida fixados em acetona. Os anticorpos primários

foram: transglutaminase tecidual (tTG2 - Stratech Scientific) - 1:40 e colágenos

liv

tipo I e III (CHEMICON International, Temecula, CA) - 1:30. Os anticorpos

secundários foram: FITC goat anti-mouse IgG (H+L) conjugate (ZYMED) 1:50

for tTG2 e FITC goat anti-rabbit IgG (H+L) conjugate (ZYMED) 1:50 para

colágenos tipo I e III (ISSA e cols., 2004; GRENARD e cols., 2001).

Após a revelação do cross-linking de colágeno mediado por tTG2,

realizamos a quantificação dessa enzima pela análise morfométrica, calculando

a área marcada com FITC. Dez campos de cada lâmina foram fotografados e

analisados usando o programa Image-Pro Plus 5.0 (MediaCybernetics, USA).

3.9. ANÁLISE BIOQUÍMICA

A avaliação dos parâmetros bioquímicos foi realizada nos grupos

NORMAL, EtOH+CCl4 e EtOH+CCl4/8sR. Os animais foram anestesiados e 1

mL de sangue foi retirado da veia caudal. As amostras foram centrifugadas a

3584 x g por 10 minutos. O soro foi separado da fração celular e congelado a

−70°C. As amostras foram analisadas pelo Analyst Vet 16 (Hemagen),

aparelho de uso veterinário que contém um sistema de padronização

bioquímico interno. Em nosso estudo foram analisados marcadores séricos de

lesão hepática - alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase

(AST) - e marcadores séricos de função hepática - bilirrubina total (BilT) e

albumina (ALB).

3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA

lv

Todas as variáveis analisadas eram numéricas. A comparação entre os

grupos foi realizada usando ANOVA com o teste de Tukey`s para múltiplas

comparações e teste “t” de student quando comparamos dois grupos. P<0,05

foi considerado estatisticamente significativo. Os dados foram apresentados

como média ± DP.

A análise de regressão foi realizada para avaliar a diferença no grau de

reversibilidade espontânea entre os dois modelos de indução com CCl4.

lvi

4 – RESULTADOS 4.1 Peso dos animais

Os resultados demonstraram que não houve diferença significativa entre

os pesos médios dos grupos CTRL, CTRL+Azeite, CTRL+CCl4, EtOH,

EtOH+Azeite e EtOH+CCl4 nas semanas 0 (Figura 7A) e 4 (Figura 7B) quando

comparados ao grupo NORMAL. É importante notar que em ambos os

períodos, os grupos que receberam dieta líquida apresentaram valores de peso

médio relativamente próximos, na faixa dos 180 a 190g. (Tabela 6).

Tabela 6 – Peso dos animais

semanas de experimento Grupos

0 4 8 15

NORMAL 192,2 ±4,3 (n= 7) 194,4 ±8,6 (n= 5) 199,5 ±3,3 (n= 5) 200,4 ±3,5 (n= 5)

CTRL 182,3 ±11,8 (n= 4) 184,8 ±9,3 (n= 4) 190,1 ±10,6 (n= 4) 194,8 ±8,2 (n= 4)

CTRL+ Azeite 184,5 ±2,1 (n= 4) 185,1 ±5,8 (n= 4) 193,6 ±9,3 (n= 4) 196,2 ±2,3 (n= 4)

CTRL+ CCl4 187,4 ±6,5 (n= 5) 186,3 ±3,0 (n= 5) 175,4 ±7,0 a (n= 5) 166,6 ±2,7 a (n= 4)

EtOH 187,5 ±8,3 (n= 5) 188,6 ±7,6 (n= 5) 185,1 ±5,3 (n= 5) 185,5 ±10,8 (n= 5)

EtOH+Azeite 188,1 ±9,9 (n= 5) 185,9 ±4,5 (n= 5) 185,5 ±12,4 (n= 5) 183,2 ±8,9 (n= 5)

EtOH +CCl4 190,7 ±5,8 (n=49) 189,6 ±6,8 (n=42) 162,8 ±13,5 b (n=29) 154,4 ±23,8 b (n=17)

Valores expressos como média ± desvio padrão em gramas (g)

Após 8 semanas (Tabela 6 e Figura 7C) observamos que os grupos

CTRL, CTRL+Azeite, EtOH e EtOH+Azeite continuaram sem alteração do

peso. Porém, o grupo CTRL+CCl4 apresentou queda significativa de peso

a p<0,05 vs grupo NORMAL b p<0,001 vs grupo NORMAL

lvii

médio (p<0,05) em relação ao grupo NORMAL. Já o grupo EtOH+CCl4

apresentou queda significativa dos pesos médios em relação aos grupos

NORMAL e CTRL+Azeite (p<0,001), CTRL, EtOH e EtOH+Azeite (p<0,01).

Não foi observada diferença significativa entre o peso médio dos grupos

CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4 indicando que somente a adição de CCl4 foi

responsável pela perda de peso.

Após 15 semanas de experimento (Tabela 6 e Figura 7D), os grupos

CTRL, CTRL+Azeite, EtOH e EtOH+Azeite ainda se mantiveram sem variação

nos pesos médios. E novamente observamos uma queda significativa dos

pesos médios dos grupos CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4. O grupo CTRL+CCl4

apresentou queda significativa (p<0,05) de peso médio em relação ao grupo

NORMAL. O grupo EtOH+CCl4 apresentou queda significativa dos pesos

médios em relação aos grupos NORMAL, CTRL e CTRL+Azeite (p<0,001),

EtOH (p<0,01) e EtOH+Azeite (p<0,05).

Esses dados demonstraram, que dentre os períodos analisados, só foi

possível observar os efeitos da toxicidade do CCl4 sobre o peso médio dos

animais após 8 semanas de intoxicação.

lviii

Figura 7 – Pesos médios dos animais por grupo exper imental nos

períodos de 0 semana (A), 4 semanas (B), 8 semanas (C) e 15 semanas (D)

de protocolo experimental. Em (A) e (B), não houve diferença significativa

nos pesos médios dos animais em todos os grupos ana lisados. Em (C) e

(D), houve uma queda significativa do peso médio no s grupos CTRL+CCl 4

e EtOH+CCl 4. Os grupos CTRL, CTRL+Azeite, EtOH e EtOH+Azeite

mantiveram seus pesos médios sem alterações ao long o do experimento.

Peso médio (0 semanas)

NORMAL

CTRL

CTRL+Azeite 4

CTRL+CCl

EtOH

EtOH+Azeite 4

EtOH+CCl

100

120

140

160

180

200

220

Grupos

Agr

amas


NORMAL

CTRL

CTRL+Azeite 4

CTRL+CCl

EtOH

EtOH+Azeite 4

EtOH+CCl

100

120

140

160

180

200

220

Grupos

B

gram

as


NORMAL

CTRL

CTRL+Azeite 4

CTRL+CCl

EtOH

EtOH+Azeite 4

EtOH+CCl

100

120

140

160

180

200

220

# **/***

Grupos

C

gram

as


NORMAL

CTRL

CTRL+Azeite 4

CTRL+CCL

EtOH

EtOH+Azeite 4

EtOH+CCl

100

120

140

160

180

200

220

# */**/***

Grupos

D

gram

as

# p<0,05 vs grupo NORMAL

** p<0,01 vs grupo CTRL, grupo EtOH e grupo

EtOH+Azeite

*** p<0,001 vs grupo NORMAL e grupo CTRL+Azeite

# p<0,05 vs grupo NORMAL

* p<0,05 vs grupo EtOH

** p<0,01 vs grupo EtOH+Azeite

*** p<0,001 vs grupo NORMAL, grupo CTRL, e grupo

CTRL+Azeite

lix

4.2 – Consumo de dieta líquida e ingestão de etanol

Os resultados demonstraram que a diferença entre o consumo médio

diário das dietas líquidas foi menor (p<0,01) nos grupos que receberam dieta -

alcoólica (62,1±25,9; grupos EtOH, EtOH+Azeite, e EtOH+CCl4) que nos

grupos que receberam dieta-controle (82,9±26,9; grupos CTRL, CTRL+Azeite e

CTRL+CCl4), no decorrer das 15 semanas de experimento (Figura 8).

Figura 8 – Consumo médio de dieta líquida ao final de 15 semanas de

experimento. O consumo médio de dieta líquida alcoó lica foi

significativamente menor (p<0,01) que o consumo méd io de dieta líquida

controle.

Ao analisarmos o consumo médio de dieta líquida por grupo (Tabela 7),

verificamos que o consumo médio das dietas líquidas foi semelhante entre os

grupos CTRL (67,4±21,2mL), CTRL+Azeite (68,7±17,4mL) e CTRL+CCl4

(67,8±22,9mL) após 4 semanas de experimento. Após 8 semanas, o grupo

CTRL (97,8±33,9mL), grupo CTRL+Azeite (101,6±32,3mL) e grupo CTRL+CCl4

(103,3±31,1mL) apresentaram aumento significativo de consumo médio

(p<0,001) em relação ao período anterior. Após 15 semanas, o consumo médio

dos grupos CTRL (80,7±23,4mL), CTRL+Azeite (81,7±15,5mL) e CTRL+CCl4

(84,1±15,7mL) apresentou uma queda significativa (p<0,05) em relação ao

Consumo médio

Controle Alcoólica0

20

40

60

80

100

120

** p<0,01

Dieta Líquida

mL

n=17

n=23

lx

período de 8 semanas. Esses resultados sugerem que a suplementação de

etanol na dieta pode ter contribuído significativamente para a diminuição do

consumo da dieta liquida.

Tabela 7 – Consumo médio de dieta líquida por grupo experimental ao

longo de 15 semanas de experimento.

A tabela abaixo (tabela 8) demonstra os resultados obtidos do consumo

de etanol. Observamos que a dose média de etanol ingerida pelos animais dos

grupos EtOH, EtOH+Azeite e EtOH+CCl4 se manteve entre 16,4±7,4g/Kg/dia e

22,2±7,8g/Kg/dia, sem apresentar diferenças significativas entre os grupos e

entre os períodos analisados.

Tabela 8 – Dose média de etanol por grupo ao longo das 15 semanas de

experimento.


4 8 15


4 8 15

CTRL 67,4±21,2 97,8±33,9 a 80,7±23,4b

CTRL+Azeite 68,7±17,4 101,6±32,3 a 81,7±15,5 b

CTRL+CCl4 67,8±22,9 103,3±31,1 a 84,1±15,7 b

EtOH 67,8±30,1 64,6±28,3 55,3±17,9

EtOH+Azeite 62,8±26,5 58,8±27,9 62,4±24,2

EtOH+CCl4 60,5±24,2 65,8±23,2 52,6±25,8

valores expressos como média ± desvio padrão em mililitros (mL)

a p<0,001 vs 4 semanas

b p<0,05 vs 8 semanas

Excluído: <sp>

lxi

EtOH 19,8 ±8,6 18,8 ±10,3 16,4 ±7,4

EtOH+Azeite 18,6 ±7,6 17,4 ±8,0 18,7 ±7,1

EtOH+CCl4 17,6 ±7,0 22,2 ±7,8 18,7 ±9,2

valores expressos como média ± desvio padrão em gramas por quilograma ao dia (g/kg/dia)

4.3 – Análise Histológica

Os animais do grupo NORMAL (n=5) sacrificados no final da 15ª semana

de experimento apresentaram na macroscopia uma superfície lisa, cor marrom

avermelhada, ausência de septos e consistência friável, características também

observadas em fígados de ratos saudáveis sacrificados antes do início do

experimento (Figura 9A). Na microscopia, observamos placas hepatocitárias

arranjadas radialmente em relação a veia centrolobular e aos sinusóides.

(Figura 9B). A coloração de picrosirius somente aparece ao redor dos espaços

porta e de veias centrolobulares (Figura 9C). Os fígados dos ratos dos grupos

CTRL (n=4), CTRL+Azeite (n=4), EtOH (n=5) e EtOH+Azeite (n=5),

sacrificados no mesmo período, apresentaram os mesmos padrões

morfológicos do grupo NORMAL.

Os fígados dos ratos sacrificados do grupo CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4

após 4 semanas de indução de cirrose apresentaram na macroscopia

alterações na superfície hepática que se tornou irregular e friável. Notamos

também um aspecto adiposo e coloração leitosa, características relacionadas

ao padrão de esteatose hepática em humanos (Figura 9D). Na microscopia

observamos a desorganização das placas hepáticas devido à tumefação de

hepatócitos e acúmulo de vacúolos lipídicos (esteatose) (Figura 9E). Os

espaços porta se tornaram alargados formando septos fibrosos finos e

lxii

incompletos alguns deles iniciando a formação de pontes entre espaços porta

(Figura 9F).

Ao final da 8ª semana, macroscopicamente a superfície hepática se

tornou mais irregular com a presença de alguns nódulos. Apresentaram

consistência mais rugosa e coloração rósea (Figura 9G). Observamos

microscopicamente que a desestruturação do parênquima hepático se tornou

mais evidente apresentando esteatose nos hepatócitos. Nos espaços porta,

notamos a presença de proliferação de ductos biliares e infiltrados inflamatório

(Figura 9H). Há formação de septos fibrosos com espessura fina e delimitados

por nódulos de regeneração, a principal característica da cirrose (Figura 9I).

Já com 15 semanas de intoxicação, os fígados apresentaram uma clara

evidência de cirrose hepática macronodular. O tamanho do órgão foi reduzido

(atrofia) e a superfície se tornou irregular com múltiplos nódulos. Apresentaram

também consistência rígida e coloração avermelhada, características padrões

da cirrose hepática em humanos (Figura 9J). A análise histológica também

comprovou a indução da cirrose, caracterizada pela perda total da arquitetura

do parênquima, redução do acúmulo de lipídeos, infiltrado inflamatório

moderado de proliferação de ductos biliares (Figura 9K). Observamos também

a presença de nódulos de regeneração formados por septos fibróticos

espessos e uma intensa deposição de colágeno na região peri-portal (Figura

9L).

Esses dados revelam que a intoxicação com o CCl4 e etanol e com CCl4

isoladamente induziu cirrose hepática com características comparáveis a lesão

em humanos.

lxiii

Figura 9: Macro e microscopia dos animais experimentais . A-C: A - Macroscopia do fígado normal demonstrando superfície lisa e coloração marrom-avermelhada. B - Microscopia do fígado normal (H&E 200x) mostrando um parênquima homogêneo, com hepatócitos arranjados radialmente ao redor dos sinusóides (setas). C - Coloração de Picrosirius mostrando colágeno em vermelho. A deposição ocorre somente nos vasos (tríade portal – seta; veia central – cabeças de seta, 40x). Após 4 semanas de indução: D - Macroscopia apresentando superfície hepática rugosa e coloração pálida, características típicas de esteatose. E - Microscopia mostrando múltiplas vesículas lipídicas confirmando a presença de esteatose (setas; H&E 200x). F - Em vermelho é possível visualizar o início da formação do septo fibroso (Picrosirius 100x, setas). Após 8 semanas de indução: G- Fígado com superfície irregular apresentando alguns nódulos de regeneração (setas). H - Microscopia mostrando a desorganização do parênquima, esteatose (setas pretas) e proliferação de ducto biliar (setas vermelhas) (H&E 200x). I - A deposição de colágeno (em vermelho) é mais intensa e os septos são finos estão começando a formar nódulos de regeneração (Picrosirius 100x). Após 15 semanas de indução: J - Macroscopia mostrando cirrose hepática: superfície irregular e múltiplos nódulos (setas). K - Microscopia demonstrando a modificação da estrutura hepática normal, com infiltrado inflamatório (cabeças de seta) e necrose tecidual (seta; H&E 200x). L - Coloração de Picrosirius mostrando deposição de colágeno em septos espessos, formando nódulos de regeneração completos. (100x).

A B C

D E F

G H I

K L J

NO

RM

AL

4 se

man

as d

e in

duçã

o

8

sem

anas

de

indu

ção

15

sem

anas

de

indu

ção

lxiv

Animais de ambos os grupos CTRL+CCl4/8sR e EtOH+CCl4/8sR

apresentaram o mesmo padrão histopatológico daquele encontrado após 15

semanas de indução, indicando a permanência da cirrose (Figura 10).

Figura 10: Microscopia dos grupos in toxicados com CCl 4 isolado ou

associado ao etanol. Microscopia dos animais intoxicados somente com CCl4

(A) ou associado ao etanol (C) apresentando nódulos completos e septos

espessos na 15a semana de indução que se mantiveram após 8 semanas de

interrupção da agressão tanto no grupo intoxicado com CCl4 isolado (B) ou

associado com ambos agentes (D). Picrosirius 100x.

A B

C D

lxv

4.4 - Análise morfométrica

Os dados de morfometria mostraram que houve aumento do conteúdo

de colágeno hepático em todos os animais analisados: CTRL+CCl4

(9,83±3,85), CTRL+CCl4/8sR (6,99±0,88), EtOH+CCl4 (12,68±2,64) e

EtOH+CCl4/8sR (10,38±1,36) quando comparados ao grupo NORMAL

(2,25±1,21). Embora a comparação da morfometria entre os grupos de animais

com 15 semanas de agressão (CTRL+CCl4 vs EtOH+CCl4) não tenha mostrado

diferença, observou-se, na 8ª semana após a interrupção da indução, maior

quantidade de fibrose no grupo que associou CCl4 e etanol em relação ao

grupo que foi induzido com CCl4 puro, (CTRL+CCl4/8sR vs EtOH+CCl4/8sR, p<

0,001). Contudo, não se observou diferença na variação do grau de fibrose

entre a 15ª semana de indução e a 8a semana após a interrupção da agressão

(Figura 11) entre os dois protocolos de indução.

Portanto seguimos nosso estudo focando no grupo que administrou

simultaneamente CCl4 e etanol. Os dados da análise morfométrica dos grupos

experimentais estão disponíveis na tabela 9.

Tabela 9 – Valores da análise de morfometria dos gr upos

intoxicados com CCl4 e associado ao etanol

GRUPOS NORMAL CTRL+CCl4 CTRL+CCl4/8sR EtOH+CCl4 EtOH+CCl4/8sR

VALORES

(%)

1,60

4,80

1,00

1,90

2,40

2,28

13,90

5,50

12,58

11,19

6,00

6,97

7,67

7,78

5,57

13,16

14,34

14,59

8,07

13,04

8,10

10,30

10,00

11,40

12,10

10,40

lxvi

4.5 – Ensaio de Hidroxiprolina

Os resultados dessa análise demonstraram que houve um aumento da

concentração de hidroxiprolina nos grupos EtOH+CCl4 (1,9±0,035) e

EtOH+CCl4/8sR (1,6±0,18) quando comparados ao grupo NORMAL (1,2±0,17).

Esses dados demonstram que o conteúdo de fibrose se manteve aumentado

no final da indução e após a retirada dos agentes tóxicos. Nenhuma diferença

foi encontrada entre esses grupos (Figura 12). Os valores do ensaio de

hidroxiprolina estão disponíveis na tabela 10.

Figura 11: Análise morfométrica: A indução crônica por 15 semanas com CCl4 puro

ou associado ao etanol levou a um aumento na quantidade de fibrose quando

comparado aos animais normais. O conteúdo de fibrose foi mantido por 8 semanas

após a interrupção da intoxicação por CCl4 puro ou associado ao etanol. Entretanto no

grupo que associou ambos hepatotóxicos observamos uma quantidade maior de

colágeno quando comparado ao grupo que administrou CCl4 puro.

NORMAL 4

CTRL+CCl

/8sR

4

CTRL+

CCl

4

EtOH+C

Cl/8s

R4

EtOH+C

Cl

0

5

10

15

% fibrose vs área nos grupos com 15 semanas de indu ção e com8 semanas de reversão espontânea

Grupos

***a= p<0,001 em relação ao demais grupos;***b= p<0,001 em relação ao grupo CTRL+CCl4/8sR

***a

***bNORMAL (n=7)

CTRL+CCl4 (n=5)

CTRL+CCl4/8sR (n=4)

EtOH+CCl4 (n-5)

EtOH+CCl48sR (n=6)

lxvii

Tabela 10 – Valores do ensaio de hidroxiprolina dos grupos intoxicados

com etanol e CCl 4

GRUPOS NORMAL EtOH+CCl4 EtOH+CCl4/8sR

VALORES (%) 1,389

1,412

1,171

0,999

1,051

1,213

2,197

1,399

1,688

2,088

2,160

1,722

1,878

1,416

1,519

1,687

1,467

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5***a

*b

Hidroxiprolina

***a p<0,001 e *b p<0,05 quando comparadoao grupo normal

HO

-Pro

(µg)

/Pes

o se

co (

mg)

NORMAL (n=6)

EtOH+CCl4 (n=5)

EtOH+CCl4/8sR (n=6)

Figura 12: Ensaio de hidroxiprolina . A indução crônica por 15 semanas

com CCl4 e etanol levou ao aumento do conteúdo de fibrose em tecido

hepático total pela análise bioquímica. Após 8 semanas de interrupção da

intoxicação os valores se mantiveram aumentados.

lxviii

4.6 – Imunofluorescência Indireta

No grupo NORMAL, ambos os colágenos foram detectados nos

espaços-porta e como finas fibrilas no lóbulo hepático (Figura 13A e 13B) Nos

grupos ETOH+CCl4 (Figuras 13C e 13D), ETOH+CCl4/8sR (Figuras 13E e 13F)

foi observada uma forte reatividade para ambos isotipos nos septos fibróticos,

indicando o acúmulo dessas proteínas durante a fase de intoxicação e de

interrupção do etanol e CCl4.

Na figura 14A observamos o fígado normal com deposição de ε (γ-

glutamil) lysine somente nas regiões perivasculares. No grupo EtOH+CCl4 (15

semanas de indução) observamos intensa deposição ε (γ-glutamil) lysine,

indicando forte ligação de fibras colágenas nos septos fibrosos (Figura 14B).

No grupo ETOH+CCl4/8sR este padrão permaneceu, demonstrando que a

deposição de colágeno se manteve 8 semanas após a retirada do etanol e CCl4

(Figura 14C).

A fim de confirmar os achados imunohistológicos de reação cruzada do

colágeno realizamos a quantificação da tTG2 através da técnica morfométrica.

O resultado demonstrou um aumento do cross-linking de colágeno no grupo

EtOH+CCl4 (66,43±8,00) quando comparado ao grupo NORMAL (7,90±0,83).

Além disso, também observamos um aumento no grupo ETOH+CCl4/8sR

(56,82±21,10) quando comparado ao grupo NORMAL, revelando que após a

interrupção da intoxicação as fibras colágenas resistiram a degradação. Não

obseravmos diferença entre os grupos EtOH+CCl4 e ETOH+CCl4/8sR (Figura

14D). Os valores na quantificação morfométrica da tTG2 estão disponíveis na

tabela 11.

lxix

Figura 1 3: Imunofluorescência . A, C e E: Colágeno tipo I; B, D e F: Colágeno tipo

III. A - B: Detecção de colágeno no parênquima hepático de rato normal. C - D:

Grupo intoxicado com etanol e CCl4 por 15 semanas (EtOH+CCl4). E - F: Grupo

intoxicado com etanol e CCl4 por 15 semanas e interrupção da indução por 8

semanas (EtOH+CCl4/8wR). Ambos os grupos intoxicados apresentaram deposição

de colágenos tipo I e III formando nódulos hepáticos. Aumento de 100x.

Colágeno tipo I Colágeno tipo III

NO

RM

AL

EtO

H +

CC

l 4

EtO

H +

CC

l 4/8

sR

E

F

C

D

A

B

lxx

A B C

NORMAL EtOH + CCl4 EtOH + CCl4/8sR

Transglutaminase tecidual (tTG)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

** P<0,01 compared to grupo NORMAL

** **

Transglutaminase tecidual (tTG)DNORMAL (n=3)

EtOH+CCl4(n=4)

EtOH+CCl4/8sR(n=5)

%tT

G v

s ár

ea

Figura 14 : Qualificação (A -C) e quantificação (D) de tTG2. Imunoensaio mostrando

cross-linking de colágeno. A – Cross-linking de colágeno somente ao redor de vasos

no grupo NORMAL. B – Septos formando nódulos completos apresentando aumento

do cross-linking no grupo com 15 semanas de indução. C – Nódulo hepático

mostrando ainda o aumento de crosslinking no grupo analisado após 8 semanas de

interrupção da indução, indicando que o colágeno não foi degradado. D: A análise

morfométrica mostrou que houve aumento de cross-linking de colágeno em ambos os

grupos intoxicados com CCl4 e etanol quando comparado ao grupo NORMAL.

lxxi

Tabela 11 – Valores da quantificação de tTG pela morfometria dos grupos

intoxicados com CCl 4 e etanol.


VALORES (%)

7,54

8,86

7,32

61,87

57,93

75,60

70,30

56,32

27,09

86,75

56,31

57,62

4.7 – Análise bioquímica

No grupo EtOH+CCl4 (15 semanas de indução) os valores de ALT

(Figura 15A) e AST (Figura 15B) se elevaram. Além disso, observamos

redução de albumina (Figura 15C) e aumento de bilirrubina (Figura 15D). Esses

dados indicam alterações funcionais características de cirrose hepática. No

entanto, após 8 semanas de interrupção dos agentes hepatotóxicos, todos os

parâmetros voltaram aos níveis basais. O nível de bilirrubina não foi

representado no grupo ETOH+CCl4/8sR devido ao fato que os valores

detectados estavam abaixo da sensibilidade do método. Os valores

bioquímicos estão disponíveis nas tabelas a seguir:

lxxii

Tabela 12 – Valores dos parâmetros bioquímicos de A LT (A), AST

(B), ALB (C) e BilT (D).


VALORES

ALT (U/L)

8

14

13

10

15

63

43

39

237

128

19

21

54

48

24

69


VALORES

AST (U/L)

38

63

70

74

66

794

231

935

614

338

124

95

153

183

100

201


VALORES

ALB

(g/dL)

4,3

4,7

4,3

4,1

4,2

3,0

3,0

3,2

3,2

2,4

4,3

4,8

4,3

3,5

4,2

4,9

GRUPOS NORMAL EtOH+CCl4

VALORES

BilT

(mg/dL)

0,0

0,0

0,0

0,0

0,1

0,5

0,1

0,1

0,1

0,1

0,0

C

A

D

B

lxxiii

0

50

100

150

200

P<0.05 comparado ao grupo NORMAL

*

*

Alanina Aminotransferase (ALT)A

U/L

Aspartato Aminotransferase (AST)

0

250

500

750

1000***

*** P<0.001 comparado ao grupo NORMAL

**

** P<0.01 comparado ao grupo ETOH+CCl4

BNORMAL (n=5)

EtOH+CCl4 (n=5)

EtOH+CCl4 /8sR (n=6)

U/L

ALB

0

1

2

3

4

5

6

***a P<0.001 comparado ao grupo NORMAL

***a

***b

***b P<0.001 comparado ao grupo ETOH+CCl4

C

g/dL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

*

BilT

* P<0.05

D

#

mg/

dl

Figura 15 . Análise bioquímica. O grupo EtOH+CCl4 (15 semanas de indução)

apresentou aumento nos valores de AST (A), ALT (B) e BilT (D) e diminuição nos

níveis de ALB (C) quando comparado ao grupo NORMAL. Porém no grupo

EtOH+CCl4/8sR (8 semanas após a interrupção de etanol e CCl4) todos os

parâmetros retornaram aos valores normais.

lxxiv

DISCUSSÃO

Não há descrição na literatura de modelos animais que reproduzam a

principal característica clínica da cirrose hepática encontrada em humanos: a

irreversibilidade histológica da lesão. Esse fator no levou ao desenvolvimento

de um modelo experimental adequado que investigasse o potencial de

reversibilidade do fígado após a suspensão da indução crônica.

É bem descrita na literatura a capacidade do CCl4 de produzir cirrose

hepática, porém este modelo de cirrose é criticado devido a variabilidade nas

características histopatológicas e relatos de regeneração hepática espontânea

após a sua suspensão (TAMAYO, 1983). McLEAN e cols (1969) propuseram a

associação do CCl4 com fenobarbital buscando a potencialização da toxicidade

do primeiro pela ativação da via microssomal da citocromo P450. HASHIMOTO

e cols (1999) demonstraram que a cirrose induzida pela associação de CCl4 e

fenobarbital por 10 semanas reverteu após a retirada das toxinas.

Buscando solucionar essas questões, nosso grupo decidiu associar

etanol e CCl4, visto que o primeiro é um potente inibidor da proliferação de

hepatócitos (WU e cols., 2000), capaz de exacerbar a hepatotoxicidade do CCl4

ativando a via microssomal da citocromo P450 (HALL e cols., 1991).

Nosso modelo de indução de lesão hepática crônica em ratos revelou

que a administração i.p. de CCl4 associada à ingestão de etanol em dieta

líquida desenvolveu cirrose hepática com características histopatológicas

semelhante àquelas da doença humana, as quais se mantiveram mesmo após

a retirada das toxinas. O modelo escolhido se baseou no trabalho de HALL e

cols (1991) que desenvolveram fibrose e cirrose hepática através da inalação

lxxv

de baixas doses de vapor de CCl4 associada à ingestão de dieta líquida

alcoólica.

A administração i.p. de CCl4 foi utilizada por ser um método

relativamente simples e de risco controlável comparado à via inalatória, já que

o vapor de CCl4 requer maiores cuidados com a biossegurança. A dose de

CCl4 administrada foi então calculada baseada nas concentrações do modelo

descrito por HALL e cols. (1991) que demonstrou que animais tratados

somente com uma dose média diária de vapor de CCl4 de 480ppm/h

apresentaram alterações histopatológicas como esteatose, necrose

hepatocelular e apoptose, porém sem desenvolver fibrose. SANZGIRI e cols.

(1997) demonstraram que a exposição dos animais a 1000ppm de CCl4 por 2

horas equivale a uma absorção total de 179mg ou 1,1mL de CCl4/kg de peso

corporal. Neste mesmo estudo, também demonstraram que a concentração

máxima de CCl4 é 3 vezes maior no fígado após a administração oral em bolus

quando comparada à inalação, ou seja, uma quantidade maior de CCl4 é

absorvida pelo sistema gastrointestinal, permitindo maior ação do CCl4 e

resultando em uma lesão hepática maior.

Em nossos ensaios preliminares, utilizamos a dose de 1,0mL de CCl4/kg

de peso corporal associada à ingestão de etanol, e observamos a mortalidade

de aproximadamente 80% dos animais. Sendo assim, decidimos reduzir a dose

administrada, baseados também nos achados de RAO e cols. (1997), que

demonstraram que a administração de dose única de 0,1mL/kg resultou em

mínimas alterações no tecido hepático.

lxxvi

No entanto, utilizamos uma dose 20 a 40 vezes menor (0,05mL/kg) que

as descritas em modelos de fibrose hepática (IREDALE e cols., 1998; ZHOU e

cols., 2004) e atingimos o grau de cirrose em 15 semanas em todos os animas

dos grupos CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4, com 100% de sobrevivência.

A ingestão do etanol em dieta líquida é uma técnica descrita há décadas

por LIEBER-DeCARLI (citado em HALL, 2001), criada pela necessidade de

desenvolver um modelo animal adequado de doença hepática alcoólica, em

que o consumo de etanol fosse mais eficiente que a administração em água,

garantindo as necessidades nutricionais aos animais. Em nosso estudo,

substituímos alguns dos ingredientes da fórmula estabelecida por LIEBER &

DeCARLI (1989) por componentes equivalentes (ex. caseína por albumina).

HALL e cols. (1991) demonstraram que o consumo de dieta líquida

controle permite o crescimento normal dos animais enquanto a dieta líquida

alcoólica reduz o ganho de peso dos animais. Em nossos achados observamos

que os grupos EtOH e EtOH+Azeite mantiveram seus pesos, sem apresentar

alterações nutricionais. A redução do peso foi somente observada nos grupos

CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4 a partir da oitava semana de experimento. Esse dado

demonstra que a dieta líquida mesmo modificada permitiu a substituição da

ração sem danos nutricionais, ocasionando alteração no peso somente em

animais intoxicados com CCl4.

Para que a administração de etanol fosse suficiente para potencializar o

efeito do CCl4 e induzir lesão hepática crônica foi necessário garantir que a

ingestão diária de etanol fosse acima de 8g/kg de peso corporal por dia

(PLUMMER e cols., 1994). Em nosso estudo, embora o consumo de dieta

líquida alcoólica (62,1±25,9) tenha sido menor que o consumo de dieta líquida

lxxvii

controle (82,9±26,9) (Figura 8), a ingestão média diária de etanol foi acima dos

valores estabelecidos por LIEBER & DeCARLI (1989), HALL e cols., (1991) e

PLUMMER e cols., (1994) em todos os grupos, indicando que a ingestão diária

de etanol de nossos animais foi adequada. (Tabela 7).

A análise histológica é o critério diagnóstico padrão da confirmação de

cirrose hepática. Nossos resultados demonstraram que após 15 semanas de

indução, os grupos CTRL+CCl4 e EtOH+CCl4 apresentaram características

morfológicas comparáveis na análise histopatológica corada com Picrosirius

(Figuras 10A e 10C). Após 8 semanas de interrupção da indução todos os

animais se mantiveram com o padrão histológico de cirrose. Tal achado

poderia nos fazer concluir que não há qualquer benefício na associação de

etanol ao CCl4.

Contudo a análise detalhada do grau de fibrose proporcionada pela

morfometria nos forneceu dados que parecem necessitar de interpretação mais

criteriosa. Se, por um lado, não se mostrou diferenças entre os grupos na

morfometria com 15 semanas (ANOVA p>0,05) e na variação do grau de

fibrose após interrupção da indução (análise por regressão), por outro lado, foi

identificada diferença na 8ª semana após interrupção da agressão, com os

animais que receberam etanol (EtOH+CCl4/8sR) apresentando maior conteúdo

de fibrose (Figura 11). Este dado sugere haver uma maior consistência da

fibrose no grupo que associou ambas as hepatotoxinas.

Podemos argumentar que a incapacidade de identificar diferenças na

intensidade da fibrose na 15ª semana assim como na variação do grau de

fibrose, após interrupção da indução, entre os dois modelos de agressão

crônica a diferentes causas:

lxxviii

1) o número de animais em cada grupo foi insuficiente para

demonstrar todas as diferenças existentes entre os grupos

2) embora o teste ANOVA e a análise por regressão não tenham

demonstrado, respectivamente, diferenças entre os grupos na

15ª semana de indução e na variação da fibrose após

interrupção da indução, o Box Plot sugere que os animais que

receberam etanol apresentaram maior quantidade de colágeno

e menor variação da fibrose no período de repouso. Um maior

grau de fibrose com 15 semanas e uma menor capacidade de

reversão da mesma neste grupo, não perceptíveis pelos testes

estatísticos convencionais, combinaram-se, tornando evidente

o efeito da adição de etanol ao CCl4 somente ao final de 8

semanas (ANOVA p<0,05).

3) o consumo de etanol não foi quantificado por animal, mas por

caixas de 5 animais. Caso a variação de consumo entre os

animais de uma mesma caixa tenha sido grande, alguns

animais poderiam ter sido expostos a quantidades demasiado

pequenas de etanol, insuficientes para potencializar os efeitos

tóxicos do CCl4, aproximando os resultados de ambos os

protocolos

ISSA e cols (2004) mostraram reversibilidade espontânea da cirrose

hepática induzida com injeções i.p. de CCl4, isoladamente, durante 12

semanas. Após 4 semanas de interrupção da agressão os animais

apresentaram redução na quantificação dos níveis de fibrose evidenciado pela

morfometria. Em outro estudo recente, VINICIUS e cols (2005) relataram

lxxix

características histológicas de cirrose septal incompleta (diminuição dos

septos) após quatro semanas de suspensão da indução em animais

intoxicados com CCl4 puro por 16 semanas.

Um dos principais mecanismo envolvidos no equilíbrio de síntese e

degradação de componentes da fibrose hepática é a ativação das HSCs.

Greenweel e cols (1999) demonstraram que o acetaldeído, primeiro produto do

metabolismo do etanol, é envolvido na ativação de HSCs in vitro (CHEN, 2002)

aumentando assim a deposição de colágeno na matriz, com aumento da

fibrose hepática. Considerando essas observações, enfatizamos que o etanol

parece ter um importante papel na fibrogenêse hepática durante o período de

intoxicação, potencializando o efeito do CCl4 permitindo assim que a fibrose se

mantenha após a interrupção da indução hepática crônica.

Pelas evidências morfométricas de um maior conteúdo de fibrose no

grupo EtOH+CCl4/8sR comparado ao grupo CTRL+CCl4/8sR e pelo relato da

literatura de que a intoxicação com CCl4 puro permite a reversão espontânea,

fomos encorajados a enfocar nossas investigações nos animais intoxicados

com CCl4 e etanol.

A quantificação de colágeno pelo ensaio de hidroxiprolina mostrou

elevado conteúdo desse aminoácido no grupo EtOH+CCl4 e se manteve após 8

semanas de interrupção. Mais uma vez nossos dados diferem dos modelos que

avaliaram a reversibilidade espontânea da cirrose induzida com CCl4 puro, os

quais demostraram a diminuição nos níveis de hidroxiprolina após a retirada da

hepatotoxina (IREDALE e cols., 1998; ISSA e cols., 2004; VINICIUS e cols.,

2005).

lxxx

Colágenos tipo I e III apresentam um aumento de 3 a 8 vezes na injuria

hepática (SHERLOCK&DOOLEY 2002). Kato e cols (2003) descreveram que o

etanol induz a expressão de TGF- β que estimula a ativação das HSCs levando

ao aumento da síntese de colágeno fibrilar tipo I, principal componente da

fibrose. Corroborando esses estudos, nossos achados mostraram um aumento

significativo de ambos os colágenos após 15 semanas de indução (Figuras 13C

e 13D) e 8 semanas após a interrupção da intoxicação, ambos localizados no

septo fibroso envolvendo nódulos (Figuras 13E e 13F).

WU e cols (2000) demonstraram que a administração de etanol aumenta

a expressão de tTG em células estreladas hepáticas e exacerba a atividade da

tTG2 em níveis que inibem a proliferação dos hepatócitos in vitro. Em 2004 WU

e cols descreveram que um dos principais mecanismos pela qual a tTG2 é

envolvida na inibição da síntese e proliferação celular de hepatócitos está

relacionado ao fato do cross-linking de colágeno estimular a secreção de TGF-

β, um importante inibidor de replicação do hepatócito, por componentes da

MEC em ratos. A tTG2 contribui para a formação de cross-linking de colágeno,

garantindo resistência à degradação por colagenases (Wu e cols., 2000). Em

nossos resultados observamos que a tTG2 estava localizada nos septos

fibrosos da mesma forma que o colágeno após 15 semanas de indução (Figure

14B) e este padrão foi sustentado após 8 semanas de interrupção da agressão

(Figure 14C). Com a finalidade de confirmar esses dados, foi realizada a

quantificação da tTG2 por morfometria, o que não demonstrou diferença entre

ambos os grupos (Figure 14D). Isto indica que a expressão de tTG2 continuou

após a interrupção da intoxicação, contribuindo para a resistência do septo

lxxxi

fibroso e mantendo a quantidade de fibrose, como observado pela análise

histopatológica.

O parâmetro funcional de nosso estudo foi a análise bioquímica utilizada

rotineiramente para a avaliação da função hepática em humanos.

Estabelecemos os valores normais dos parâmetros bioquímicos analisados e

observamos que os valores obtidos se encontraram semelhantes aos relatados

em outros estudos (FIGUERAS e cols., 1996; DIAZ-GIL e cols., 1999; KUS e

cols., 2004; LUO e cols., 2004).

Nossos resultados demonstraram que, em 15 semanas de indução, os

níveis séricos de AST, ALT e BilT aumentaram, e houve diminuição dos níveis

séricos de ALB. Porém esses valores retornaram aos níveis basais oito

semanas após a retirada dos agentes tóxicos (Figura 15).

Podemos explicar o retorno dos parâmetros bioquímicos à normalidade

baseando-nos nos estudos de lesão hepática cronica em pacientes cirróticos. A

albumina e bilirrubina séricas são componentes do escore Child-Pugh (PUGH,

1973), um sistema para avaliação de função hepática bastante utilizado em

pacientes cirróticos (CHOLONGITAS, 2006). O aumento da bilirrubina total e a

diminuição dos níveis de albumina são características típicas de cirrose

hepática descompensada. Pacientes com cirrose hepática compensada

geralmente apresentam testes funcionais normais visto que a capacidade de

síntese esta preservada (D'AMICO, 2006).

A elevação dos níveis de aminostransferases (AST/ALT) revela necrose

hepatocelular, típica das hepatites agudas (DAVERN, 2002) e fracamente

correlacionadas com o estágio da fibrose (AFDHAl, 2004). Em nosso modelo

lxxxii

experimental, os marcadores bioquímicos de função e lesão hepatocelular se

alteraram logo no início do período de indução, mas retornaram aos níveis

normais após 8 semanas de interrupção do insulto (Figura 1). Similarmente,

pacientes com cirrose hepática alcoólica geralmente apresentam níveis de

aminotransferases normais após a suspensão da ingestão alcoólica, razão pela

qual essas enzimas possuem baixa sensibilidade em detectar hepatopatias

crônicas em pacientes alcoólatras que não estejam consumindo álcool

(THABUT, 2006) Quando encaminhados ao programa de transplante hepático,

a maioria desses pacientes apresenta progressiva melhora da função hepática

enquanto abstinentes, e alguns deles podem ser retirados da lista devido à

melhora significativa (VELDT, 2002).

Portanto, podemos inferir que o comportamento dos marcadores

bioquímicos do nosso experimento assemelha-se àquele dos pacientes

alcoólatras com doença avançada, sugerindo que esse é um modelo animal de

cirrose hepática adequado.

lxxxiii

CONCLUSÕES:

Diante dos resultados obtidos em nossos estudos, podemos concluir que:

• A administração de CCl4 na dose de 0,05mL/kg de peso corporal,

associada ou não à ingestão crônica de etanol, induz lesões hepáticas

crônicas que progridem para cirrose hepática ao fim de 15 semanas;

• Os animais analisados após a suspensão do CCl4 isolado e do CCl4

associado ao etanol mantiveram os padrões histopatológicos de cirrose

hepática;

• Em comparação ao modelo pré-estabelecido de indução de cirrose por

CCl4 isolado, nosso modelo demonstrou ser menos suscetível a reversão

espontânea por manter o grau de fibrose maior no período da retirada das

toxinas.

• Os animais tratados com CCl4 associado ao etanol apresentaram

alterações significativas nos parâmetros bioquímicos (AST, ALT, BilT e Alb)

relacionados aos achados histopatológicos.

• Os parâmetros bioquímicos retornaram ao níveis basais após 8 semanas

de interrupção da agressão.

• Estabelecemos um modelo animal de cirrose hepática reprodutível dos

aspectos fisiopatológicos e clínicos da cirrose hepática que foi capaz de

sustentar as alterações histopatológicas por um período de 8 semanas

após a retirada dos agentes agressores.

lxxxiv

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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