avaliacao de atividade toxica

PROGRAMA DE PS

Avaliao da Atividadecourbaril L.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOISINSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA

tividade Txica, Genotxica e AntigenotxicaL. em Camundongos e Drosophila melanogaster

CAMILA REGINA DO VALE

Goinia - GO

Maio de 2012

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS

GRADUAO EM BIOLOGIA

ntigenotxica de Hymenaea Drosophila melanogaster

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CAMILA REGINA DO VALE

Avaliao da Atividade Txica, Genotxica e Antigenotxica de Hymenaea courbaril L. em Camundongos e Drosophila melanogaster

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biologia, do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Gois, como requisito parcial para a obteno do ttulo de Mestre em Biologia.

Orientadora: Profa. Dra. Lee Chen Chen Co-orientao: Prof. Dr. Salvador de Carvalho

Goinia - GO

Maio de 2012

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AGRADECIMENTOS Este trabalho no teria sido possvel sem a colaborao de algumas pessoas que

contriburam de forma relevante para a execuo do mesmo, da que no poderia deixar de prestar um agradecimento sincero:

Agradeo a Deus por ter me dado a vida e todas as possibilidades para que pudesse concluir mais essa etapa em minha vida.

minha Orientadora Profa. Dra. Lee Chen Chen, por todo carinho, sabedoria e disposio em me orientar.

Ao Prof. Dr. Salvador de Carvalho que alm de co-orientar esse trabalho, sempre se mostrou amigo para todos os momentos.

Aos professores Dra. Knya Silva Cunha e Dr. Mario Antnio Span por gentilmente aceitar a participar da banca de minha defesa de mestrado.

Profa. Dra. Ceclia Maria Alves de Oliveira por ter fornecido as amostras aqui avaliadas.

minha querida amiga para todos os momentos, Dbora Cristina da Silva Lima pelo companheirismo, amizade e ajuda em todos os momentos.

s estagirias do laboratrio de Mutagnese com Drosophila Alinny Nayara Vidal e Silva e Ana Flvia dos Santos pela amizade e grande ajuda com o teste SMART/asa.

Aos amigos e companheiros do laboratrio de Radiobiologia e Mutagnese, Cristiene Costa Carneiro, Carolina Ribeiro e Silva e Flvio Borges por todos os momentos juntos, pelo apoio e pela colaborao que tornou o laboratrio mais alegre e produtivo.

Aos estagirios Priscila Zei, Lidyanne Silva, Jeferson Hollanda, Renata Agra e Brenda Raquel por toda colaborao nas atividades do laboratrio, pelo companheirismo e dedicao.

professora Wanderlene Blanco Nunes, pela colaborao na anlise estatstica do teste SMART/asa.

Elayne Silva Miguel e Leandro Prado Felcio pela amizade e colaborao no teste SMART/asa.

Ao meu querido namorado, Cleiber Caetano Martins pelo amor, pacincia, respeito e por tornar esse momento ainda mais feliz.

minha famlia, minhas tias Zlia Maria do Vale, Maria Madalena do Vale e a minha querida me Florentina Santos do Vale pelo incentivo e por todo carinho a mim dedicados.

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Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pelo auxlio financeiro.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPQ) pelo auxlio financeiro.

Universidade Federal de Gois (UFG) pelo auxlio financeiro.

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Mas os que esperam no Senhor renovaro suas foras, subiro com asas como guias, correro e no se cansaro, caminharo e no se fatigaro

Isaas 40:31

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SUMRIO

INTRODUO GERAL 1.1. Plantas Medicinais ............................................................................................................. 1

1.1.1. Uso de Plantas Medicinais no Brasil ............................................................................. 2 1.1.2. Componentes qumicos de Plantas Medicinais ............................................................ 3 1.1.3. Propriedades Txicas, Mutagnicas e Antimutagnicas de Plantas Medicinais ...... 4 1.2. Hymenaea courbaril L. ...................................................................................................... 6 1.2.1. Seiva de Hymenaea courbaril ....................................................................................... 10 1.2.2. Composio Qumica de Hymenaea courbaril ........................................................... 11 1.2.3. Atividades Biolgicas de Hymenaea courbaril ........................................................... 12 1.3. Mutagenicidade/ Genotoxicidade ................................................................................... 13 1.4. Antimutagenicidade/ Antigenotoxicidade ..................................................................... 16 1.5. Testes Para Avaliao dos Efeitos Mutagnicos e Antimutagnicos de Compostos . 17 1.5.1. Teste do Microncleo em Medula ssea de Camundongos ..................................... 18 1.5.2. Teste para Deteco de Mutao e Recombinao Somtica (Somatic Mutation and Recombination Test- SMART). ..................................................................................... 22 1.6. Compostos Usados em Testes Para Avaliao dos Efeitos Mutagnicos e Antimutagnicos de Substncias ........................................................................................... 27 1.6.1. Mitomicina C (MMC) .................................................................................................. 28 1.6.2. Doxorrubicina (DXR) ................................................................................................... 29 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 30 2.1. Geral ................................................................................................................................. 30 2.2. Especficos ........................................................................................................................ 30 3. REFERNCIAS ................................................................................................................. 31

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Captulo I Avaliao da Atividade Citotxica, Genotxica e Antigenotxica de Hymenaea

courbaril L. em Medula ssea de Camundongos

1. INTRODUO .................................................................................................................. 52 2. MATERIAL E MTODOS ............................................................................................... 53 2.1. Material Botnico ............................................................................................................ 53 2.2. Camundongos .................................................................................................................. 53 2.3. Reagentes Qumicos e Solues ...................................................................................... 54 2.3.1. Tampo Fosfato ............................................................................................................ 54 2.3.2. Corante .......................................................................................................................... 54 2.3.3. Fixador........................................................................................................................... 54 2.3.4. Homogeneizao das Clulas ....................................................................................... 54 2.3.5. Controles ....................................................................................................................... 55 2.4. Procedimento Experimental ........................................................................................... 55

2.5. Anlise Citogentica ........................................................................................................ 55 2.6. Anlise Estatstica ............................................................................................................ 56 3. RESULTADOS ................................................................................................................... 56 4. DISCUSSO ....................................................................................................................... 65 5. CONCLUSO..................................................................................................................... 67 6. REFERNCIAS ................................................................................................................. 68

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Captulo II Interferncia da Seiva de Hymenaea courbaril L. sobre a mutagenicidade e recombinogenicidade induzida pelo Cloridrato de Doxorrubicina em clulas somticas de Drosophila melanogaster.

1. INTRODUO .................................................................................................................. 75 2. MATERIAL e MTODOS ................................................................................................ 76 2.1. Material Botnico ............................................................................................................ 76 2.2. Linhagens de Drosophila melanogaster .......................................................................... 76 2.3. Agentes Qumicos ............................................................................................................ 77 2.3.1. Controles ....................................................................................................................... 77 2.4.Cruzamentos ..................................................................................................................... 77 2.5. Meios de Cultura e Condies de Cultivo ..................................................................... 77 2.6. Procedimento Experimental - Tratamento Crnico ................................................... 78 2.7. Preparao e Anlise das Lminas ................................................................................ 79 2.8. Anlise Estatstica ............................................................................................................ 79 3. RESULTADOS ................................................................................................................... 80 4. DISCUSSO ....................................................................................................................... 86 5. CONCLUSO..................................................................................................................... 88 7. REFERNCIAS ............................................................................................................... 889

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Captulo III Assessment of the toxic, genotoxic, antigenotoxic and recombinogenic, activities of the

Hymenaea courbaril L. (Fabaceae) in Drosophila melanogaster and mice

1. Introduction ........................................................................................................................ 95 2. Materials and methods ....................................................................................................... 96 2.1. Plant material................................................................................................................... 96 2.2. Mouse bone marrow micronucleus test ......................................................................... 96 2.2.1. Animals .......................................................................................................................... 96 2.2.2. Experimental procedure .............................................................................................. 97 2.2.3. Statistical analysis ......................................................................................................... 98 2.3. Somatic mutation and recombination test (SMART) .................................................. 98 2.3.1. Drosophila strains and crosses ..................................................................................... 98 2.3.2. Experimental procedure .............................................................................................. 99 2.3.3. Statistical analysis ....................................................................................................... 100 3. Results ................................................................................................................................ 100 3.1. Mouse bone marrow micronucleus test ....................................................................... 100 3.2. Somatic mutation and recombination test (SMART) ................................................ 103 4. Discussion .......................................................................................................................... 107 5. Conclusion ......................................................................................................................... 109 References ............................................................................................................................. 110 COSIDERAES FINAIS E PERSPECTIVAS .............................................................. 116

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LISTA DE ILUSTRAES

INTRODUO GERAL

Figura 1: A planta, Hymenaea courbaril .................................................................................. 8 Figura 2: Fruto de Hymenaea courbaril.................................................................................... 9 Figura 3: Flor e folhas de Hymenaea courbaril ........................................................................ 9 Figura 4: Tronco e madeira de Hymenaea courbaril .............................................................. 10 Figura 5: Seiva de Hmenaea courbaril ................................................................................... 11 Figura 6: Processo de maturao das clulas da linhagem eritrocitria .................................. 21 Figura 7: Formao de microncleos em eritrcitos da medula ssea .................................... 21 Figura 8: Fentipos dos pelos de D. melanogaster ................................................................. 24 Figura 9: Asas dos indivduos trans-heterozigotos e heterozigotos balanceados ................... 25 Figura 10. Fotomicrografia mostrando pelos mltiplos observados em microscpio ptico de luz... .............................................................................................................................. 26 Figura 11. Fotomicrografia mostrando pelos mutantes do tipo flare e pelos normais observados em microscpio ptico de luz ................................................................................ 26 Figura 12. Fotomicrografia mostrando mancha gmea contendo pelos mltiplos e pelos flare adjacentes observada em microscpio ptico de luz ................................................................ 27 Figura 13. Frmula estrutural do quimioterpico Mitomicina C ............................................ 28 Figura 14: Frmula estrutura do quimioterpico Doxorrubicina ............................................ 29

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Figura 1. Frequncia de eritrcitos policromticos micronucleados (EPCMN) aps 24 horas de tratamento com a seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) e controles .................................. 58 Figura 2. Frequncia de eritrcitos policromticos micronucleados (EPCMN) aps 48 horas de tratamento com a seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) e controles .................................. 59 Figura 3. Razo de EPC/ENC aps 24 horas de tratamento com a seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) e controles .................................................................................................... 60 Figura 4. Razo de EPC/ENC aps 48 horas de tratamento com a seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) e controles .................................................................................................... 60 Figura 5. Frequncia de eritrcitos policromticos micronucleados (EPCMN) aps 24 horas de tratamento com a seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) concomitantemente com MMC e controles . 63 Figura 6. Frequncia de eritrcitos policromticos micronucleados (EPCMN) aps 48 horas de tratamento com a seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) concomitantemente com MMC e controles . 63 Figura 7. Razo de EPC/ENC aps 24 horas de tratamento com a seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) comcomitantemente com MMC e controles ................................................ 64 Figura 8. Razo de EPC/ENC aps 48 horas de tratamento com a seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) comcomitantemente com MMC e controles ................................................ 64

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Figura 1. Curva de sobrevivncia dos descendentes de Drosophila melanogaster provenientes dos cruzamentos padro (ST) e de alta bioativao (HB) tratadas com doses diferentes da seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) ................................................................. 81 Figura 2. Contribuio das frequncias de mutao e recombinao em relao frequncia total de manchas mwh por indivduo, do cruzamento ST, aps tratamento crnico com a seiva de Hymenaea courbaril associado Doxorrubicina................................................................. 85 Figura 3. Contribuio das frequncias de mutao e recombinao em relao frequncia total de manchas mwh por indivduo, do cruzamento HB, aps tratamento crnico com a seiva de Hymenaea courbaril associado Doxorrubicina................................................................. 85

Captulo III Assessment of toxic, genotoxic, antigenotoxic and recombinogenic, activities of


Figure 1. Survival curves of descendants of Drosophila melanogaster from standard (ST) and high bioactivation (HB) crosses fed with different doses of Hymenaea courbaril sap (Hycs); nc: negative control ................................................................................................................ 105

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LISTA DE TABELAS



Tabela 1. Frequncia de eritrcitos policromticos micronucleados (EPCMN) e relao de eritrcitos policromticos e eritrcitos normocromticos (EPC/ENC) em medula ssea de camundongos aps a administrao de diferentes doses da seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) ....................................................................................................................................... 58 Tabela 2. Frequncia de eritrcitos policromticos micronucleados (EPCMN) e relao de eritrcitos policromticos e eritrcitos normocromticos (EPC/ENC) em medula ssea de camundongos aps a administrao de diferentes doses da seiva de Hymenaea courbaril (SHyc) co-tratadas com Mitomicina C ..................................................................................... 62


Tabela 1. Frequncia de manchas mutantes observadas nos descendentes heterozigotos marcados (MH) e heterozigotos balanceados (BH) de Drosophila melanogaster, do cruzamento padro (ST) tratados com diferentes doses da seiva Hymenaea courbaril (SHyc) e co-tratados com Doxorrubicina ................................................................................................ 82 Tabela 2. Frequncia de manchas mutantes observadas nos descendentes heterozigotos marcados (MH) e heterozigotos balanceados (BH) de Drosophila melanogaster, do cruzamento de alta bioativao (HB) tratados com diferentes doses da seiva Hymenaea courbaril (SHyc) e co-tratados com Doxorrubicina ................................................................. 84

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Captulo III Assessment of toxic, genotoxic, antigenotoxic and recombinogenic activities of


Table 1: Frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes and polychromatic and normochromatic erythrocyte ratio observed in bone marrow of mice treated with Hymenaea courbaril sap and co-treated with Mitomycin C and their respective controls ...................... 102 Table 2:Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous trans-heterozygous (MH) and balancer-heterozygous (BH) descendants of Drosophila melanogaster from standard (ST) cross treated with Hymenaea courbaril sap (Hycs) co-treated with Doxorubicin ............................................................................................................................ 105 Table 3: Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous trans-heterozygous (MH) and balancer-heterozygous (BH) descendants of Drosophila melanogaster from high bioactivation (HB) cross treated with Hymenaea courbaril sap (Hycs) co-treated with Doxorubicin ............................................................................................................................ 106

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LISTA DE ABREVIATURAS C: graus celsius 40x: quarenta vezes BdS: beaded serrate BH: heterozigotos para o cromossomo balanceador TM3 cm: centmetro

DL: dose letal D. melanogaster: Drosophila melanogaster DNA: cido desoxirribonuclico DXR: doxorrubicina ENC: eritrcitos normocromticos EPC: eritrcitos policromticos EPCMN: eritrcitos policromticos micronucleados flr3: flare 3

g: grama

HB: high bioactivation i.p.: intraperitoneal

kg: quilogramas

mg: miligramas

MH: trans-heterozigotos

mL: mililitro

MMC: mitomicina C MN: microncleos mwh: multiple wing hairs

ORR: oregon resistence p.c.: peso corpreo

RNA: cido ribonuclico SMART: somatic mutation and recombination test ST: standard SHyc: seiva de Hymenaea courbaril TM3: third multiple 3

2: qui-quadrado

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RESUMO

Hymenaea courbaril L. (famlia Fabaceae), popularmente conhecida no Brasil como jatob, uma espcie tropical que ocorre na floresta semi-decdua da Amrica do Sul. A espcie tem sido utilizada no Brasil para fins culinrios e na medicina popular para tratar artrite, disfuno gstrica, inflamao e doenas respiratrias. Devido ao uso generalizado dessa planta como um recurso teraputico e alimentar, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos txicos, genotxicos, recombinognicos e antigenotxicos da seiva de Hymenaea courbaril (SHyc), usando o teste do microncleo em medula ssea de camundongo e o teste de recombinao e mutao somtica (SMART) em Drosophila melanogaster. Para avaliar a ao clastognica e aneugnica pelo ensaio do microncleo, os animais foram tratados com 3 concentraes de SHyc (5, 10 e 15 mL/kg de peso corporal). Para avaliar a atividade anticlastognica e antianeugnica , os animais foram tratados simultaneamente com SHyc e mitomicina C (4mg/kg de peso corporal). Para avaliar as atividades mutagnica e recombinagnica pelo teste SMART, larvas de terceiro estgio provenientes dos cruzamentos padro (ST) e alta bioativao (HB) foram tratadas com 3 doses de SHyc (0,3; 1,5 ou 3 mL), por aproximadamente 48 horas. Para avaliar a atividade antimutagnica e anti-recombinognica, larvas provenientes de ambos os cruzamentos foram co-tratadas com 3 doses de SHyc (0,3, 1,5 ou 3 mL) e doxorubicina (0,125 mg/mL). Nossos resultados para o teste do microncleo em medula ssea de camundongos mostraram que SHyc no apresentou efeitos citotxicos, clastognicos e/ou aneugnicos , mas apresentou atividade ancitotxica, anticlastognica e/ou antianeugnica em medula ssea de camundongos. Os resultados para o teste SMART/asa no demonstraram efeitos mutagnicos e recombinagnicos, mas a aco antimutagnica e anti-recombinognica foi evidenciado em clulas somticas de Drosophila melanogaster.

Palavras-chave: jatob, antianeugnese, anticlastognese, antimutagnese, anti-recombinognese.

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ABSTRACT

Hymenaea courbaril L. (Family Fabaceae), popularly known in Brazil as jatob, is a tropical species that occurs in semi-deciduous forest of the South America. The species has been used in Brazil for culinary purposes and in folk medicine to treat arthritis, gastric dysfunction, inflammation and respiratory diseases. Due to the spreading use of this plant as a therapeutic resource and food, the present study aimed to evaluate the toxic, genotoxic, recombinogenic and antigenotoxic effects of Hymenaea courbaril sap (Hycs) using the mouse bone marrow micronucleus test and somatic mutation and recombination test (SMART) in Drosophila melanogaster. To evaluate the clastogenic and aneugenic activities by micronucleos test the animals were treated with 3 concentrations of Hycs (5, 10 and 15 mL/kg body weight). To evaluate the anti-clastogenic and anti-aneugenic activities, the animals were simultaneously treated with Hycs and mitomycin C (4mg/kg body weight). To evaluate the mutagenic and recombinogenic activities by SMART, three-day-old larvae derived from standard (ST) and high bioactivation (HB) crosses were treated with 3 doses of Hycs (0.3, 1.5 or 3 mL) for approximately 48 hours. To evaluate the antimutagenic and antirecombinogenic activities, larvae derived from both crosses were cotreated with 3 doses of Hycs (0.3, 1.5 or 3 mL) and doxorubicin (0.125 mg/mL). Our results in the mouse bone marrow micronucleus test showed that SHyc exhibited no cytotoxic, clastogenic and/or aneugenic effects, but showed anticytotoxic, anti-clastogenic and /or anti-aneugenic activities in mouse bone marrow. The results for the SMART test showed no mutagenic and recombinagenic effects, but antimutagenic and anti-recombinogenic activities were found in both crosses in somatic cells of Drosophila melanogaster.

Key words: jatob, anti-aneugenic, anti-clastogenic, antimutagenic, anti-recombinogenic.

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1. INTRODUO GERAL

1.1. Plantas Medicinais

A utilizao de plantas para preveno, tratamento ou cura de doenas uma das prticas medicinais mais antigas da humanidade. As civilizaes remotas muito contriburam com o conhecimento das propriedades teraputicas dos vegetais (Almassy Jnior et al., 2005). Foi atravs da observao e da experimentao pelos povos primitivos que as propriedades teraputicas de plantas foram sendo descobertas e propagadas de gerao em gerao, fazendo parte da cultura popular (Elvin-Lewis, 2001).

Fragmentos de papiros mdicos contendo instrues e receitas de como preparar medicamentos a partir de plantas medicinais datam de cerca de 2600 a.C. (Almassy Jnior et al., 2005). Na Mesopotmia, cerca de 2400 a.C., escritos antigos relatavam o uso de plantas para fins teraputicos. Entre essas estavam Cedrus sp., Culressus sempervirens, Glycyrrhia glabra, Commiphora sp. e Papaver sommiferum (Andrade, 2007).

Civilizaes chinesas, indianas, rabes, egpcias e incas conheciam a ao de vrias plantas sobre o organismo humano e deixaram evidncias escritas do uso de plantas para o tratamento de uma grande variedade de enfermidades. Os egpcios documentaram em papiros o uso de aproximadamente 700 produtos extrados de plantas. Na ndia (1000 a.C.), foram documentadas mais de 1000 ervas medicinais (Phillipson, 2001).

Na Grcia, Hipcrates (460-361 a.C.), considerado pai da medicina em seu tratado Corpus hipocratum reuniu a sntese de conhecimentos sobre o uso de plantas para terapia (Silva, 2005) e Teofrasto (Grcia-372 a 285 a.C.) catalogou cerca de 500 espcies vegetais. Posteriormente, Crateus, que viveu no sculo I a.C., publicou o livro Rhizotomikon, a primeira obra que se tem conhecimento sobre plantas medicinais da Grcia. J no sculo I d.C., Dioscrides publicou, tambm na Grcia, um livro com uma lista de 600 plantas medicinais. Nesse mesmo perodo, Galeno pai da farmacutica estudou preparaes de plantas com solventes (Balbach, 1980).

Na idade mdia, monastrios europeus faziam uso rotineiro de plantas que j eram descritas pela literatura. Existem relatos que os povos rabes, em suas migraes, difundiram diversas plantas medicinais no Mediterrneo. Aps esse perodo, j no sculo XVII, Samuel Hahnemann lanou as bases da homeopatia na Alemanha e Maximiliam Oskar Bircher-Brener, mdico sueco, demonstrou a importncia dos alimentos crus e naturais para a manuteno e combate a doenas (Silva, 2005).

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Atualmente, os fitoterpicos so amplamente utilizados em diversos pases. Por volta de 1970, a Organizao Mundial de Sade reconheceu os benefcios da medicina baseada em extratos de plantas, onde comearam a surgir pesquisas e desenvolvimento de medicamentos obtidos de fontes naturais (Sixel e Pecinalli, 2002, Newman et al., 2003). Na frica, 80% da populao dependem do uso de produtos naturais para alvio de enfermidades, os quais representam alternativos frente ao alto custo dos frmacos sintticos (Aschwanden, 2001).

1.1.1. Uso de Plantas Medicinais no Brasil

No Brasil, o conhecimento do uso das plantas medicinais o resultado de uma miscigenao cultural envolvendo africanos, europeus e indgenas, com introduo de espcies exticas pelos colonizadores e escravos (Engelke, 2003). Na poca do descobrimento, os ndios j faziam uso de plantas medicinais. Os negros africanos trouxeram informaes sobre o uso de fitoterpicos e os imigrantes de diversas partes do mundo contriburam na ampliao dos conhecimentos sobre as plantas medicinais (Costa e Nepomuceno, 2003; Silva, 2005).

A utilizao de plantas para fins teraputicos no Brasil se deve principalmente diversidade de espcies consideradas medicinais, alta prevalncia e variedade de doenas infecciosas e parasitrias encontradas na maioria das regies (Martins et al., 2000; Brando et al., 2008). O alto custo dos medicamentos tambm incita a populao a procurar o apoio na medicina alternativa, onde o uso de remdios preparados com plantas medicinais de fcil acesso e mais econmicos (Almassy Jnior et al., 2005; Junior et al., 2005).

A expanso da fitoterapia no Brasil pode ser atribuda a diversos fatores, tais como os efeitos adversos de frmacos sintticos, a preferncia dos consumidores por tratamentos naturais, a validao cientfica das propriedades farmacolgicas de espcies vegetais, o desenvolvimento de novas formas de preparaes e administraes de produtos fitoterpicos e um melhor conhecimento qumico, farmacolgico e clnico das drogas vegetais e seus derivados (Junior et al., 2005; Melo et al., 2007).

As plantas medicinais brasileiras ainda so comercializadas em feiras livres, mercados populares e so encontradas em quintais residenciais em todas as regies do pas (Dourado et al., 2005; Morais et al., 2005). As razes, caules, folhas e frutos de planta so em algumas comunidades, as nicas fontes disponveis de recursos teraputicos (Luna et al., 2005; Ruiz et al., 2005). As plantas so utilizadas na forma de infuso, macerado, unguentos, pomadas, xaropes, cpsulas e tambm in natura (Schimitz et al., 2005). As observaes

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populares sobre o uso e a eficcia de plantas medicinais contribuem de forma relevante para a divulgao das atividades teraputicas dos vegetais, mantendo, dessa maneira, o hbito do consumo dessas preparaes naturais.

1.1.2. Componentes Qumicos de Plantas Medicinais

As plantas produzem, a partir de seu metabolismo, diferentes tipos de substncias, aparentemente para sua defesa contra vrus, bactrias, fungos e animais predadores (Rodrigues e Lopes, 2001). Tais substncias vm sendo estudadas e caracterizadas, pois esto intimamente relacionadas com os efeitos biolgicos desencadeados pelas plantas (Junior et al., 2005; Cavalcanti et al., 2006).

Compostos qumicos presentes em plantas podem ser resultantes do metabolismo primrio e secundrio. O primeiro grupo de compostos engloba as substncias indispensveis a sua sobrevivncia e que se formam graas ao processo fotossinttico. O segundo grupo, oriundo do metabolismo secundrio, aparentemente sem atividades essenciais, so denominados princpios ativos ou metablitos secundrios (Di Stasi, 1996).

Os metablitos secundrios embora no sejam produtos essenciais para o organismo e no participem da sua rota bioqumica primria, apresentam funes ecolgicas importantes, tais como atrao de polinizadores, proteo contra predadores, microrganismos e competidores, evitam a perda de gua e aumento de temperatura, atuam como inibidores da germinao, regulam o crescimento, a fertilizao e o ambiente da rizosfera garantindo vantagens para a sobrevivncia e para a perpetuao da espcie em seu ecossistema (Santos, 2004; Molyneux et al., 2007).

Dentre os metablitos secundrios de plantas esto os compostos fenlicos (flavonides e taninos), alcalides, terpenos, leos essenciais e resinas (Cowan 1999, Duarte, 2006). Os compostos fenlicos, alcalides e os terpenos so ativos contra vrus, bactrias e fungos. Os terpenos, divididos em diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, hemiterpenos e sesquiterpenos so utilizados contra fungos por romper a membrana lipdica do microrganismo (Cowan, 1999). Esses compostos so sintetizados e depositados em rgos especficos ou em todas as partes da planta (Harbone, 1990).

Metablitos secundrios so os principais responsveis pelas propriedades teraputicas das plantas medicinais. Dessa forma, metablitos presentes em plantas podem ser teis para o desenvolvimento de novos agentes farmacuticos (Souza, 2008).

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Atualmente, busca-se isolar esses princpios ativos, evitando assim os possveis efeitos colaterais de uma mistura heterognea de compostos presente nas plantas. Assim, nos

ltimos anos temse verificado um grande avano cientfico envolvendo estudos qumicos e

farmacolgicos de plantas medicinais, visando a obteno de novos compostos com propriedades teraputicas (Silva, 2008).

No inicio do sculo XX foram isolados os primeiros princpios ativos de produtos vegetais como a morfina, estricnina e quinina (Hamburger e Hostettmann, 1991; Phillipson, 2001). Existe uma grande variedade de princpios ativos extrados de plantas utilizados para o tratamento de diversas doenas, dentre elas, o cncer (Almeida et al., 2005). Dentre esses esto os alcalides vegetais derivados da Vinca (Vimblastina e Vincristina), o ster alcalide derivado do teixo ocidental (Taxus brevifolia) e do teixo europeu (Taxus baccata) (Taxol) (Oliveira, 2002), Podofilotoxinas (ou epipodofilotoxinas), tendose como principais exemplos a Etoposida (VP16) e Teniposida (VM26), bem como derivados semisintticos da Podofilotoxina, provenientes da raiz do podfilo (Podophyllum peltatum) (Salmonm, 1998; Chabner e Calabresi, 1995).

1.1.3. Propriedades Txicas, Mutagnicas e Antimutagnicas de Plantas Medicinais

O uso de plantas como forma medicinal vem atingindo um pblico cada vez maior (Zan, 2008). Apesar da ampla utilizao, pouca informao encontra-se disponvel sobre seus constituintes, bem como sobre os riscos que podem oferecer a sade humana (Pavan-Fruehauf, 2000). Tal fato torna-se preocupante devido ao uso indiscriminado e sem qualquer conhecimento fitoqumico, farmacolgico e toxicolgico das espcies (Alice et al., 1995; Fonseca et al., 2004).

De modo geral, a populao acredita que os fitoterpicos no possuem efeitos colaterais por serem obtidos de fontes naturais. No entanto, os metablitos secundrios presentes em plantas podem apresentar tanto efeitos benficos como tambm efeitos indesejveis ou txicos (Simes et al., 2004; Turolla et al., 2006).

Muitas plantas contm constituintes txicos, tais como os alcalides pirrolizidnicos, cido ercico, cido ntrico, cido oxlico, digitlicos, flavonides, furocumarinas, hidrazinas e as quinonas (Pereira, 1992; Chitturi e Farrel, 2000). Algumas plantas tambm apresentam agentes genotxicos que provocam leses no DNA e assim aceleram ou aumentam o

aparecimento de mutaes que podem estar associadas ao desenvolvimento de neoplasias (Marques et al., 2002; Junior et al., 2005; Sousa, 2008).

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Por essa razo existe a necessidade de melhores polticas de regulamentao, bem como normas de comercializao e uso de produtos derivados de plantas. Neste sentido, as pesquisas relacionadas aos efeitos de plantas medicinais e seus constituintes devem ser estimuladas e intensificadas. Testes para avaliar o potencial mutagnico e/ou citotxico de plantas, utilizadas na medicina popular, tambm devem ser realizados. Somente a partir destas anlises torna-se possvel mensurar os reais riscos da aplicao das plantas medicinais. Dessa maneira podem-se estabelecer nveis de segurana e eficincia em relao sua utilizao (Cavalcanti et al., 2006; Sousa, 2008).

Por outro lado, as plantas medicinais tambm possuem vrias classes de fitoqumicos que apresentam propriedades anticarcinognicas, antimutagnicas, antioxidantes e imunomoduladoras (Punturee et al., 2007).

Diversos compostos obtidos de plantas podem atuar como agentes protetores em relao carcinognese humana. Tais compostos agem inibindo estgios de iniciao, promoo ou progresso tumoral, bem como atuam bloqueando e destruindo mutgenos fora das clulas, evitando que estes agentes causem possveis leses no DNA e/ou o desencadeamento de processos tumorais (Edenharder et al., 1993).

Estudos recentes, in vitro e in vivo, tm mostrado que alguns constituintes naturais de plantas exercem atividade moduladora de agentes mutagnicos (Melo et al., 2001; Ohe et al., 2001; Ren et al., 2001). Yuan e colaboradores (2003) reportaram os efeitos protetores do ginseng (P. ginseng) contra vrios tipos de tumores. Kim e colaboradores (2002) identificaram as propriedades quimiopreventivas de extratos de rom (Punica granatum). Muitos flavonides isolados de plantas tm demonstrado potencial farmacolgico, exibindo atividade antitumoral (Frederich et al., 1999). A atividade antimutagnica tambm tem sido atribuda aos taninos, compostos fenlicos largamente distribudos em plantas (Imanishi et al., 1991; Tanaka et al., 1998).

Produtos naturais, de origem vegetal, apresentam atividade antioxidante relacionada com o sequestro de radicais livres, principalmente de espcies reativas de oxignio (EROS), implicadas na ocorrncia de patologias, tais como o envelhecimento precoce, inflamao crnica, doenas neurodegenerativas, Diabetes mellitus, arteriosclerose, doenas auto-imune, carcinognese e mutagnese (Andrade et al., 2007). Diante disso, torna-se evidente a importncia de identificao e caracterizao dos compostos vegetais, bem como a avaliao de seu potencial antimutagnico e/ou anticarcinognico. Essas medidas podem conduzir estratgias para reduzir o risco da ocorrncia de diversas doenas em humanos (Dearfield et al., 2002; Verschaeve et al., 2004).

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1.2. Hymenaea courbaril L.

Dentre as espcies amplamente utilizadas pela populao est a Hymenaea courbaril, conhecida popularmente como jatob, farinheira, fava doce, jata, jata vermelho, jatob-da-caatinga, jatob-do-cerrado, jatob-mido, jeta, juta, dentre outros. Pertence famlia Fabaceae, subfamlia Caesalpinoideae. nativa da mata semidecdua da bacia do Paran, Centro Oeste, floresta tropical Amaznica e Mxico (Lorenzi, 1998; Silva et al., 2001; Lorenzi e Matos, 2002).

A famlia Fabaceae compreende aproximadamente 650 gneros e 18000 espcies, das quais encontram subdivididas nas subfamlias Caesalpinoideae, Faboideae e Mimosideae (Oliveira, 2001). A subfamlia Caesalpinoideae compreende 150 gneros e 2700 espcies, com ampla distribuio (Biondo et al., 2005). Dentre eles esto os gneros: Caesalpina, Dimorphandra, Peltophorum, Cassia, Senna, Copaifera e Hymenaea (Coneglian e Oliveira, 2006).

O gnero Hymenaea compreende 14 espcies, das quais nove so encontradas no Brasil, ocorrendo em quase todas as regies, com distribuio uniforme na Amaznia, onde encontrado nas matas de terra firme de solo argiloso, e algumas vezes em vrzeas altas. A maioria das espcies do gnero possui algum valor econmico, fornecendo madeira, resina e fruto comestvel, alm de possuir variados usos na medicina popular (Melo et al., 2004).

H. courbaril uma espcie arbrea de 15 a 20 metros de altura, apresentando copas amplas, densas e troncos grossos (Figura 1). Suas folhas so alternas, compostas bifolioladas e pecioladas. Os frutos so do tipo vagem, cor marrom-escura e sementes duras envoltas por polpa farincea (Figura 2). Flores grandes com ptalas excedentes ao clice (Figura 3) (Carvalho, 2007). A casca externa do tronco tem cor cinza-clara com pequenos sulcos e espessura de at 10 mm e a casca interna rosada apresentando uma resina cor de vinho (Figura 4) (Lorenzi 1992, Shanley e Medina, 2005).

Essa espcie desenvolve-se em mata de terra firme, sob solo argiloso e tambm nas proximidades de rios e lagos (Campos e Uchida, 2002). Floresce no perodo entre dezembro e maro e fornece frutos de julho a novembro (Silva et al., 2001).

As principais formas de uso de H. courbaril so a obteno de madeira, preparo de incensos, vernizes, elaborao de produtos cosmticos e como forma alimentcia (Lorenzi e Matos, 2002). Os seus frutos possuem sementes envolvidas por uma polpa amarelo-plida, farincea, adocicada, comestvel, de sabor e aroma caractersticos. A polpa bastante

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apreciada na culinria regional, podendo ser consumida in natura ou como farinha para a elaborao de bolos, pes, biscoitos, mingaus, entre outras iguarias (Almeida e Silva, 1994; Silva et al., 2001). Por sua beleza tem sido largamente utilizada na arborizao de cidades (Almeida 2001). A resina da madeira utilizada na indstria e na rea farmacutica (Almeida et al., 1998), sendo normalmente encontrada na base da rvore e um excelente impermeabilizador natural (Shanley e Medina, 2005).

Na medicina popular todas as partes de H. courbaril so utilizadas (casca, polpa dos frutos, razes, resina e seiva), conferindo diferentes propriedades e usos (Corra, 1984; Vieira, 1991). A casca usada para o tratamento de enfermidades estomacais, intestinais, inflamatrias, como antifngico, para queimaduras e tosse (Barros, 1982). A seiva usada para doenas respiratrias e suas folhas para problemas de prstata e cistite crnica (Aguiar, 2009; Guarim-Neto e Morais, 2003; Lorenzi e Matos, 2002).

A polpa do fruto utilizada como laxante e a resina tida como afrodisaca, apresentando ainda propriedades tnicas (Brando, 1991). Outros estudos revelam seu uso em distrbios cardio-pulmonares, como sedativa, adstringente, para hematria, diarria, dispepsia, disenteria, fadiga, clica intestinal e artrites (Martins et al., 2000; Nogueira et al., 2001; Miyake et al., 2008).

Outras espcies do gnero Hymenaea tambm so utilizadas na medicina popular no tratamento de hemoptises, infeces pulmonares, problemas estomacais, asma, laringites, hematria, diarria e para fraquezas em geral (Verpoorte, 1987; Vila Verde et al., 2003; Gazzaneo et al., 2005; Shanley e Medina, 2005; Agra et al., 2007).

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Figura 1: A planta, Hymenaea courbaril (Tamayo, 2008)

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Figura 2: Fruto de Hymenaea courbaril (Andra, 2011).

Figura 3: Flor e folhas de Hymenaea courbaril (Andra, 2011).

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Figura 4: Tronco e madeira de Hymenaea courbaril (Andra, 2011).

1.2.1. Seiva de Hymenaea courbaril

O tronco de H. courbaril libera uma substncia aquosa denominada de seiva ou vinho. Essa possui cores variadas, indo de laranja at marrom bem escuro (Figura 5). A seiva (lquido) transforma-se em resina (slido) quando entra em contato com o ar (Andra, 2011).

A produo de seiva pela H. courbaril muito varivel, apresentando de 15 a 52 litros por rvore. Em mdia a rvore precisa de um intervalo de seis meses entre coletas. No final do perodo chuvoso a produo maior que no perodo seco. A comercializao da seiva de jatob realizada em pequenas quantidades pelos extrativistas diretamente aos consumidores finais. Nos centros urbanos a seiva adquirida em lojas especializadas em produtos fitoterpicos (Andra, 2011).

Anlises fsico-qumicas dessa seiva demonstraram que o seu pH cido em torno de 4,2 e que essa no apresenta carboidratos, fibras, lipdeos ou protenas (Andra, 2011). Estudos fitoqumicos detectaram a presena de flavonides, taninos e terpenos (Martins et al., 2000; Nogueira et al., 2001; Aguiar, 2009).

A seiva de H. courbaril vem sendo extrada e utilizada pela populao para diversos fins, tais como para produo de combustvel, verniz vegetal e impermeabilizador de superfcies. Como forma medicinal utilizada pela populao como tnico, para problemas respiratrios e urinrios, como fortificante, energtico natural, fortalecedor do sistema imunolgico, estimulante e muito utilizada pelos indgenas para melhorar o desempenho sexual (Lima et al., 2007; Andra, 2011).

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Figura 5: Seiva de Hymenaea courbaril (Andra, 2011).

1.2.2. Composio Qumica de Hymenaea courbaril

Estudos fitoqumicos da espcie H. courbaril detectaram a presena de compostos fenlicos (flavonides, procianidinas e taninos), leos essenciais e terpenos em extratos da casca, folhas, frutos, resina e seiva (Martins et al., 2000; Nogueira et al., 2001; Miyake et al., 2008; Aguiar, 2009). A semente possui alto teor de fibras (85,31%), de protenas (9,05%) e de lipdios (5,30%). A frao lipdica apresenta 75% de cidos graxos insaturados, sendo o cido linoleico dominante (46,9%).

Alm desses compostos foram detectados na espcie a presena de cido catvico, cido coplico, cido eperico, cido labdanlico (Nakano e Djerassi, 1961), epicatequina (Artavia et al., 1995, Miyake et al.,2008) e de polissacardeos como galactose, xilose, glicose e arabinose (Omaira et al., 2007).

A partir do epicarpo de H. courbaril foram isolados o ster(-)-zanzibarato de metila (Imamura et al., 2004), e a resina presente nesse epicarpo composta predominantemente por diterpenos cidos como o zoico acompanhados de alguns sesquiterpenos em menor quantidade (Caramori et al. 2004).

A anlise fitoqumica dos seus frutos tambm mostrou a presena de sesquiterpenos, tais como o espatulenol, germacreno-D, -copaeno e -cariofileno (Aguiar, 2009). Alm desses, outros grupos de terpenos foram isolados dos frutos de H. courbaril, como o cido labdanlico e a crotomaclina (Jayaprakasam et al., 2007).

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Dentre as substncias qumicas isoladas de outras espcies do gnero Hymenaea pode-se destacar: atibilina, engelitina e eucrifina de H. martiana (Carneiro et al., 1993), cido gamico de H. oblongifolia (Cunningham et al., 1973), luteolina e tirosina de H. palustris (Aguiar, 2009), cido linolnico e cido olico de H. satignocarpa ( Matuda et al., 2005) e cido zanzibrico da espcie H. verrucosa (Cunningham et al., 1973).

1.2.3. Atividades Biolgicas de Hymenaea courbaril

Diante do amplo uso de H. courbaril como alternativa medicinal, diversos trabalhos relacionados com sua caracterizao bioqumica, farmacolgica e biolgica esto sendo realizados e muitos desses j revelaram atividades antifngica, antimicrobiana, antioxidante, larvicida e moluscicida (Buckeridge et al., 1997; Abdel-Kader et al., 2002; Takagi et al., 2002; Imai et al., 2008; Suzuki et al., 2007; Aguiar, 2009).

Rosrio e colaboradores (2008) avaliaram os efeitos de polissacardeos das sementes de H. courbaril em macrfagos peritoneais de camundongos e demonstraram que esses provocam aumento na produo de citosinas, quimiocinas e espcies reativas de oxignio.

Em estudos avaliando a viabilidade e capacidade de proliferao celular de macrfagos da linhagem RAW 264.7 pelo mtodo colorimtrico do MTT e pelo mtodo fotomtrico com corante cristal violeta, foi demonstrado que o tratamento com polissacardeos da semente de H. courbaril levou a diminuio da viabilidade e da proliferao celular, apresentando assim atividade citotxica para essa clula (Silveira, 2010).

Aguiar (2009) realizou estudos avaliando a atividade do leo essencial das cascas de frutos de H. courbaril sobre larvas de Aedes aegypti e foi demonstrado que esse leo apresentou atividade larvicida (Aguiar, 2009). Nesse mesmo estudo, tambm foi avaliada a atividade aloptica do extrato de H. courbaril sobre a espcie Lactuca sativa L. e os resultados mostraram inibio do crescimento de hipoctilos, indicando a presena de agentes aleloqumicos na espcie (Aguiar, 2009).

A capacidade antioxidante da casca de H. courbaril tambm foi avaliada pelo mtodo DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) e foi observado que a espcie eficiente em capturar radicais livres, apresentando-se assim como um agente antioxidante (Aguiar, 2009).

Em estudos avaliando a ao do extrato etanlico de H. courbaril contra artrite induzida por colgeno em camundongos, foi observado que esse extrato exerceu um efeito inibitrio sobre o desenvolvimento de artrite reumatide induzida (Miyake et al., 2008).

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Ao avaliar uma procianidina presente em H. courbaril, Miyake e colaboradores (2008) demonstraram que esse componente capaz de inibir a produo de IFN- e a ativao de macrfagos, alm de ter a capacidade de inibir a progresso da encefalomielite auto-imune.

Em estudos avaliando o potencial antifngico de outra espcie do gnero Hymenaea Souza e colaboradores (2008) observaram que extratos das pores areas de H. martiana foram capazes de inibir o crescimento dos fungos C. neoformans e T. rubrum que so importantes parasitas em humanos, sendo que em algumas concentraes a inibio chegou a 90%. Os autores atriburam esse efeito antifngico a presena de grandes quantidades de triterpenides nessa espcie. A atividade antifngica do extrato etanlico de H. courbaril tambm foi demonstrada contra o patgeno vegetal Pestalo tiasubculturalis (Mahabir, 1995).

Atividade antibacteriana e antifngica da resina de H. courbaril foi observada contra Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus (Mahabir, 1995). J em ensaios realizados por Agripino e colaboradores (2004), o extrato de folhas de H. courbaril no apresentou atividade antibacteriana e/ou antifngica contra Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus aureus.

Apesar da grande quantidade de estudos relacionados a atividade biolgica de H. courbaril, no existem at o momento, dados na literatura sobre seu potencial mutagnico e antimutagnico, revelando dessa maneira, a importncia do presente estudo.

1.3. Mutagenicidade/ Genotoxicidade

A informao gentica de todos os organismos vivos est armazenada nos cidos nuclicos (DNA e RNA), sendo codificada pelas sequncias de bases nitrogenadas. Essa informao conservada e transmitida para cada clula por sucessivas geraes atravs de um processo de replicao altamente fiel e preciso (Snustad e Simmons, 2001). No entanto essa transmisso pode no ser um fenmeno esttico. Durante a replicao as clulas mostram-se mais vulnerveis e podem ocasionalmente fixar alteraes presentes no DNA, passando a propag-las como mutaes (Bartek e Lukas, 2001; Kai e Wang, 2003; Liu et al., 2003).

Mutaes so alteraes que podem ser hereditrias no material gentico de um organismo. Tais alteraes podem ser decorrentes de processos celulares normais (mutaes espontneas) ou podem ser induzidas pela exposio a agentes fsicos (radiao ultravioleta ou ionizante), qumicos (aflatoxinas B e alcalides) ou biolgicos (vrus, bactrias e parasitas) (Lewin, 2001). Outro fator que tambm pode levar a mutaes o estresse oxidativo

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(Marnett, 2000; Olinsk et al., 2002). O potencial mutagnico diretamente proporcional ao nmero de leses oxidativas no DNA que escapam do mecanismo de reparo (Valko et al., 2004).

A maioria das mutaes adquirida, ou seja, induzida por agentes mutagnicos. Todos os organismos vivos esto permanentemente expostos a substncias mutagnicas endgenas ou exgenas (ambientais) (Moustacchi, 2000). Os agentes responsveis pelas diversas alteraes genticas podem ser basicamente classificados em autobiticos ou xenobiticos. Os autobiticos so mutgenos endgenos, a exemplo das espcies reativas de oxignio (EROs) produzidas in vivo. Os xenobiticos so mutgenos existentes no ambiente externo, sendo, portanto, estranhos ao sistema biolgico, tais como contaminantes (poluentes do ar e da gua), alimentares (aminas heterocclicas, aditivos e conservantes) e os relacionados com o estilo de vida (nitrosaminas, tabaco e lcool) (Sugimura, 1998).

Os organismos vivos esto frequentemente expostos a diversas substncias mutagnicas que podem causar danos celulares. Os danos podem afetar processos vitais como a duplicao e a transcrio gnica, bem como alterar os cromossomos, levando a processos neoplsicos e morte celular. Pelo fato de causarem leses no material gentico, essas substncias so conhecidas como substncias genotxicas (Costa e Menk, 2000). No entanto, para ser mutagnico no basta ser capaz de interagir e lesionar o DNA. Um composto dito mutagnico quando consegue aumentar a taxa de mutao em um organismo alm da taxa espontnea (Gatehouse et al., 1990).

Existem dois nveis de mutaes: as mutaes cromossmicas e as mutaes gnicas. As alteraes cromossmicas podem estar relacionadas estrutura cromossmica em consequncia de delees, duplicaes, inverses e translocaes ou ao nmero de cromossomos em decorrncia de falhas na citocinese, por no disjuno mittica. As mutaes gnicas so ocasionadas por substituio de bases (transies e transverses), inseres, delees e translocaes (Gatehouse et al., 1990; Suzuki et al., 1992).

Um nico agente mutagnico capaz de produzir diferentes eventos mutacionais em organismos com constituio gentica distintas. Contudo, a maior parte desses agentes exibe um espectro de mutaes caracterstico, que depende de vrios fatores, incluindo a natureza das alteraes primrias no DNA (modificaes de base, de resduos do carboidrato e fosfato ou quebras nos filamentos), e os subsequentes efeitos secundrios causados pela resposta do organismo a estas modificaes. Estes efeitos secundrios podem incluir a ao de vrias formas de reparo do material gentico e a duplicao de cromossomos sobre moldes modificados (Preston et al., 1987; Zaha, 1996).

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As manifestaes das mutaes dependem do material gentico atingido, se o germinativo ou o somtico. Recentemente foi proposto que as mutaes nas clulas

germinativas so responsveis por produzir mudanas na hereditariedade, acarretando o desenvolvimento de efeitos teratognicos e de desordens hereditrias mltiplas (Varanda, 2006). As mutaes em clulas somticas podem estar envolvidas na patognese de algumas doenas crnico-degenerativas, tais como as cardiovasculares (arteriosclerose) e neurodegenerativas (Alzheimer). Alm disso, as mutaes somticas esto intrinsecamente relacionadas com o processo de carcinognese (De Flora et al., 1996; Andreassi et al., 2000; Kirsch-Volders et al., 2002; Aruoma, 2003; Ross e Margolis, 2005; Scholzov et al., 2006).

bem documentado que mutaes atuam em etapas do processo de carcinognese e que ensaios que detectam componentes genotxicos permitem identificar substncias com risco potencial para desenvolvimento de neoplasias nos seres humanos (Butterworth, 2006). A mutao pode ser o primeiro estgio no processo inicial da formao do tumor e a literatura tem mostrado que mutaes em vrios genes crticos tm sido encontradas em neoplasias (Hard, 1998; Bishop, 1991; Hansen, 1990; Bridges et al., 1990).

Estudos epidemiolgicos mostram que h relao entre o desenvolvimento de neoplasias e hbitos alimentares, pois a dieta uma das principais vias de exposio do organismo a diferentes componentes mutagnicos e/ou carcinognicos (Bagatini et al., 2007). Acredita-se que um tero de todos os cnceres humanos possa estar relacionado ao hbito alimentar (Ames, 1983). Trabalhos recentes tm identificado uma ampla variedade de compostos mutagnicos e/ou carcinognicos provenientes de plantas usadas na alimentao (De Marini, 1998; Gold et al., 2004).

Diante deste cenrio, vrias pesquisas cientficas ressaltam a necessidade de mudanas nos hbitos alimentares da populao na tentativa de minimizar os riscos de desenvolvimento de cncer. Para tanto, observa-se uma tendncia geral de se investigar o efeito genotxico, carcinognico, embriotxico e/ou teratognico de substncias qumicas, especialmente as presentes em alimentos (Hussain et al., 2001).

Atualmente, observa-se ainda grandes esforos da comunidade cientfica para realizar testes de genotoxicidade com plantas medicinais usadas empiricamente pela populao. Busca-se com isso identificar os reais riscos mutagnicos e/ou carcinognicos que tais substncias vegetais podem oferecer a sade humana (Maluf e Erdtman, 2003).

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1.4. Antimutagenicidade/ Antigenotoxicidade

Fatores da dieta tm grande importncia na metabolizao e detoxificao de compostos qumicos genotxicos, podendo diminuir assim a taxa de danos acumulados no DNA e ser utilizados na preveno de doenas (Brta et al., 2006). O consumo de componentes da dieta que podem diminuir danos no DNA constitui uma estratgia efetiva para modular e inibir processos mutagnicos, sendo esses compostos denominados agentes moduladores ou antimutagnicos (Rigo, 2009).

O termo antimutagnico foi usado originalmente em 1952 para descrever os agentes que reduzem a frequncia de mutaes espontneas ou induzidas, independente do mecanismo envolvido (Von Borstel et al., 1996). Os estudos com agentes antimutagnicos se iniciaram no ano de 1950, porm somente a partir da dcada de 1990 que o interesse se concentrou na identificao de agentes antimutagnicos, principalmente os de origem natural (Wargovich, 1997).

A antimutagnese caracteriza-se como um processo gentico normal, cuja funo manter a estabilidade da estrutura hereditria. Este fenmeno, considerado uma variedade do processo mutagnico, atua na reduo da frequncia de leses genticas atravs de um sistema multicompetente de antimutgenos endgenos que so ativados em nvel molecular, celular ou fisiolgico (Gancharova, 1993). Portanto, assim como a caracterizao de mutgenos uma tarefa essencial, a deteco e identificao de antimutgenos algo igualmente importante, uma vez que estas substncias podem oferecer grandes benefcios para a medicina e sade pblica, atuando na preveno de mutaes e das doenas a elas relacionadas (Barrai et al., 1992; Karekar et al., 2000).

Antimutgenos tm sido descritos, principalmente, em frutas e legumes (Block, 1992). Diversos metablitos presentes em muitas plantas impedem ou atenuam a ocorrncia de processos mutagnicos e/ou carcinognicos. Dentre esses esto o cido ascrbico (vitamina C), cidos graxos, cidos linolicos conjugados, o cido p-aminobenzico (PABA), as clorofilas e seus derivados, cumarinas, flavonides, fibras dietticas, fitoestrgenos, as glutationas, os isotiocianetos aromticos, a N-acetil-I-cistena, taninos, tocoferis (vitaminas E) e outros (Ames, 1983; Ames, 1986; Odin, 1997; Lohman et al., 2001; Rampazo et al., 2002; Nawrot et al., 2003; Erickson, 2003).

Alm desses compostos, destacam-se os polifenis, selnio e carotenides (Haslam, 1996; Valko et al., 2004). Esses so antioxidantes naturais contidos em plantas que podem ser usados na preveno dos consequentes danos oxidativos ao DNA e, portanto, so

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considerados agentes antimutagnicos (Kittis, 1994; Verhagen et al., 1997; kris-etherton et al., 2002).

Numerosos estudos epidemiolgicos tm mostrado uma relao inversa entre a ingesto de frutos e vegetais e o risco de cncer e doenas do corao (Dias, 2008). Dessa forma, a identificao de agentes antimutagnicos e/ou anticarcinognicos em alimentos indispensvel e extremamente importante na busca de estratgias para a preveno dessas doenas por meio de modificaes do hbito alimentar (Wargovich, 1997).

A quimioproteo, atravs dos componentes da dieta, requer no apenas uma avaliao da segurana e eficcia dos possveis agentes quimiopreventivos em modelos animais e em humanos, mas tambm um maior conhecimento dos seus mecanismos de ao (De Flora e Ferguson, 2005). Para isso, diversos sistemas testes in vitro e in vivo esto disponveis permitindo aos pesquisadores identificar estes agentes protetores (De Flora, 1998).

1.5. Testes Para Avaliao dos Efeitos Mutagnicos e Antimutagnicos de Compostos

Para avaliar os efeitos mutagnicos e antimutagnicos de compostos naturais ou sintticos, um grande nmero de testes de curta-durao esto disponveis. Esses ensaios detectam compostos genotxicos com potencial risco sade humana (Umbunzeiro e Vargas, 2003). Tais modelos so frequentemente estruturados pelos indicadores biolgicos que avaliam, ou seja, detectam mutaes gnicas, danos cromossmicos ou leses no DNA. A associao ntima desses indicadores biolgicos, bem caracterizados e facilmente quantificados, tem fortalecido a importncia dos testes de genotoxicidade (Ribeiro e Marques, 2003).

A funo primria dos testes de genotoxicidade investigar, usando clulas ou organismos, o potencial de agentes qumicos induzirem mutaes nas clulas somticas ou germinativas (Da Silva et al., 2003). O impacto de materiais txicos na integridade e no funcionamento do DNA da clula pode ser estudado em muitos organismos sob diferentes condies (McCarthy e Shugart, 1990). Durante as ltimas dcadas tem sido demonstrado que nenhum teste utilizado na rea de gentica toxicolgica capaz de detectar todos os tipos de efeitos genotxicos. Portanto, importante realizar uma bateria de testes in vivo e in vitro, a fim de melhor avaliar a genotoxicidade de compostos (Witte et al., 2007).

Muitos dos testes de deteco de atividades genotxicas tm sido propostos para identificao de possveis agentes carcingenos (Zeiger, 1998), visto que os testes de

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mutagenicidade so referenciais para carcinogenicidade. Pois, o cncer tipicamente uma doena de organismos multicelulares e os fatores que determinam mutagenicidade nestes organismos quase sempre tambm induzem neoplasias (Erdtmann, 2003).

Alm disso, o conhecimento de substncias capazes de modular os efeitos genotxicos de agentes qumicos e fsicos tambm de grande importncia, porque podem auxiliar no entendimento dos mecanismos de ao desses agentes genotxicos e contribuir para a diminuio das alteraes gnicas que possivelmente resultam no aparecimento de doenas (Takahashi et al., 2001).

Dentre os diversos testes de curta-durao existentes, destaca-se o teste do Microncleo em Medula ssea de Roedores e o teste de Mutao e Recombinao em Clulas Somticas de Drosophila melanogaster (SMART), ambos selecionados para o presente trabalho.

1.5.1. Teste do Microncleo em Medula ssea de Camundongos

O Teste do Microncleo foi proposto inicialmente por Heddle (1973) como uma alternativa simples para avaliar danos cromossmicos. um teste amplamente utilizado para deteco de agentes clastognicos, que promovem quebras cromossmicas e de agentes aneugnicos, que provocam a segregao cromossmica anormal, induzindo aneuploidias (Macgregor et al., 1987; Hayashi et al., 1994; Krishna e Hayashi, 2000; Ribeiro, 2003).

Este ensaio internacionalmente aceito como parte da bateria de testes recomendada na avaliao do potencial mutagnico para o registro de novos produtos qumicos que entram no mercado mundial e como um mtodo de triagem no desenvolvimento de novos frmacos (Hayashi et al., 2000; Ribeiro, 2003). A alta confiabilidade e o baixo custo da tcnica contribuem para o sucesso mundial e adoo desse biomarcador para estudos de danos genticos in vivo (Bonassi et al., 2007).

A frequncia de microncleos (MN) em clulas humanas ou de roedores tem se tornado um dos parmetros citogenticos empregados na rotina dos testes de gentica toxicolgica para avaliao de agentes qumicos e fsicos. Os MN podem ser analisados em eritrcitos, clulas da mucosa oral e/ou linfcitos para a estimativa de danos genticos induzidos in vivo (Hayashi et al., 1983).

Este teste pode ser executado praticamente em qualquer populao de clulas que estejam constantemente em diviso, sendo a medula ssea de mamferos uma das regies mais adequadas, visto que suas clulas levam de 22 a 24 horas para completar um ciclo de

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diviso (Heddle, 1973). Segundo Ribeiro (2003), os eritroblastos da medula ssea sofrem duplicao e se diferenciam em eritrcitos policromticos (Figura 7 e 8).

Na presena de um agente clastognico, podem ocorrer quebras cromossmicas, gerando fragmentos acntricos que se atrasam em relao aos elementos com centrmero, ou causar distrbios no aparato mittico, de modo que algumas cromtides podem tambm se atrasar em relao s demais. Assim, um cromossomo inteiro ou fragmentos acntricos no conseguem migrar para os plos da clula durante a anfase e podem no ser includos nos ncleos das clulas filhas aps a diviso celular, formando assim os chamados MN, observados no citoplasma de clulas policromticas (Figura 8) (Ribeiro, 2003). Quando os eritroblastos expelem seu ncleo, ao se transformarem em eritrcitos, os MN permanecem no

citoplasma onde so facilmente reconhecveis (Figura 8) (RabeloGay, 1991). Esses MN podem ser analisados em eritrcitos policromticos (EPC, eritrcitos

imaturos) de medula ssea de camundongos ou ratos (Ribeiro, 2003). Durante um perodo de 10 e 24 horas, os eritrcitos imaturos so policromticos (RNApositivos), pois apresentam grande quantidade de RNA ribossmico. Estes EPC so facilmente corados, devido a quantidade de RNA e diferenciam-se dos eritrcitos maduros ou normocromticos (ENC) que no contm RNA ribossmico (Krishna e Hayashi, 2000).

Os EPC so clulas que ainda esto em estgio imaturo e quando sofrem maturao se transformam em ENC, os quais so lanados na corrente sangunea. O teste do MN se caracteriza pela observao do efeito do agente testado em EPC anucleados, que tm vida curta e qualquer microncleo encontrado representa dano cromossmico recente (Salvadori et al., 2003). Se contarmos os MN apenas em EPC, saberemos que eles se formaram na mitose anterior, na presena do agente mutagnico.

Como o perodo entre a ltima diviso e a formao do EPC de 8 a 12 horas, s se encontram MN induzidos pelo agente cerca de 10 horas aps o tratamento. Alm disso, o intervalo mnimo dentro do qual os MN podem ser detectados corresponde durao do estgio de policromtico, entre 10 a 24 horas (RabeloGay, 1991).

Na tcnica do MN em medula ssea de roedores a avaliao do nmero de clulas micronucleadas obtida atravs da contagem de 2000 EPC. Tambm feita a avaliao da relao EPC/ENC em total de 1000 EPC registrando simultaneamente a frequncia de ENC, para avaliar a citotoxicidade de um composto (Heddle e Salamone, 1981). Uma diminuio na proporo de EPC reflete em uma diminuio na relao EPC/ENC, dessa forma essa relao um parmetro de citotoxicidade ou depresso celular (Shahrim et al., 2006).

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Os eventos que levam formao do MN podem ser induzidos pelo estresse oxidativo, exposio a agentes clastognicos ou aneugnicos, defeitos genticos nos pontos de controle do ciclo celular e/ou nos genes de reparo do DNA e tambm pela deficincia de nutrientes requeridos como co-fatores no metabolismo do DNA e na maquinaria da segregao cromossmica (MacGregor, 2005; Umegaki e Fenech, 2000; Kimura et al., 2004; Rajagopalan et al., 2004; Fenech et al., 2005; Bonassi et al., 2007).

Os compostos aneugnicos e clastognicos tm diferentes mecanismos de ao. A aneuploidia induzida pela interao com tubulina e inibio do processo de polimerizao necessrio para a formao do fuso mittico, o que leva a perda de cromossomos inteiros. J os compostos clastognicos causam quebras, resultando na perda de fragmentos cromossmicos. Acredita-se que o tamanho do MN seja um parmetro para distinguir danos causados por compostos aneugnicos (MN grandes) de compostos clastognicos (MN pequenos) (Cammerer et al., 2007).

O aumento da frequncia de MN nas clulas indicativo da elevao das taxas de mutaes por quebras e/ou perdas cromossmicas e o teste do MN in vivo em clula de medula ssea de roedores fornece fortes evidncias da genotoxicidade sistmica do composto qumico avaliado sob condies experimentais apropriadas (Carvalho et al., 2002; Salvadori, et al., 2003). importante tambm ressaltar que o potencial de muitos compostos naturais de modular os efeitos genotxicos de xenobiticos tem sido identificado utilizando-se o teste do MN como parmetro de anlise (Azevedo et al., 2003).

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Figura 6: Processo de maturao das clulas da linhagem eritrocitria (Ribeiro, 2003).

Figura 7: Formao de microncleos em eritrcitos da medula ssea (Ribeiro, 2003).

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1.5.2. Teste para Deteco de Mutao e Recombinao Somtica (Somatic Mutation and Recombination Test- SMART).

O teste SMART com Drosophila melanogaster foi primeiramente descrito por Graf e colaboradores em 1984. caracterizado por ser rpido, barato, produzir resultados confiveis e facilmente reproduzveis (Graf et al., 1984). O SMART vem sendo amplamente utilizado na deteco de efeitos citotxicos, genotxicos e antigenotxicos de agentes qumicos e misturas complexas (Kaya et al., 2002).

A D. melanogaster, um organismo eucarioto conhecida popularmente como mosca da fruta, utilizada h mais de 100 anos em pesquisa gentica, em diversos testes para o monitoramento de agentes genotxicos (Vogel et al., 1999). Oferece diversas vantagens que facilitam seu uso em diferentes protocolos, tais como: pequeno tamanho, fcil cultivo, tempo de gerao curto (aproximadamente 10 dias a 25C), elevado nmero de prognie, pequena quantidade de cromossomos e capacidade de metabolizar compostos (Graf e Singer, 1992; Graf et al., 1996). Segundo Akmoutsou e colaboradores (2011) o extensivo conhecimento acerca do genoma da D. melanogaster tem feito deste organismo um modelo para estudos genticos em eucariontes, bem como na avaliao dos efeitos txicos, genotxicos e antigenotxicos.

A comparao do genoma humano com o da Drosophila aponta para a alta conservao evolutiva, no apenas em nvel da sequncia do DNA, mas principalmente em relao s funes gnicas. So tambm relevantes os dados obtidos a partir de anlise protemicas, uma vez que 60 % dos 289 genes relacionados a doenas humanas apresentam homlogos em Drosophila, dos quais, 75% portam sequncias proticas similares nestes dois organismos (Tickoo e Russel, 2002). Com o trmino do projeto de sequenciamento do genoma da Drosophila, estudos de comparao mostraram que dois teros dos genes implicados em cnceres humanos tm equivalncia na mosca, incluindo o supressor de tumor, TP53, pois compartilham domnios similares (Sutcliffe e Brehm, 2004).

O teste SMART/asa foi desenvolvido para detectar a perda de heterozigose de genes marcadores especficos que determinam a expresso de fentipos detectveis nas asas da mosca adulta. Esse teste baseia-se na identificao de pelos ou tricomas com fentipos mutantes que representam a expresso fenotpica da ocorrncia de leses em nvel de DNA (Graf et al., 1984; Dias, 2008).

As leses so primordialmente induzidas nas clulas dos discos imaginais que, por diversas divises mitticas, daro origem a estruturas do corpo da mosca adulta, como as asas.

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Caso ocorra alguma alterao gentica em uma das clulas do disco imaginal, tal alterao estar presente em todas as clulas descendentes, formando um clone de clulas mutantes detectadas como uma mancha de pelos diferentes na asa da mosca adulta. Essas manchas, com fentipos caractersticos indicam a ocorrncia de eventos genticos relacionados com mutaes pontuais, aberraes cromossmicas e rearranjos estruturais devidos recombinao mittica (Graf et al., 1984; 1989; 1996). Diversos trabalhos apontam que a Recombinao Homloga (RH) um dos mecanismos responsveis pela perda de heterozigose de genes que esto envolvidos na regulao do ciclo celular. A RH tambm pode induzir eventos como a converso gnica, deleo de segmentos cromossmicos e translocaes e considerada como um dos principais processos de alteraes genticas envolvidos na gnese e progresso de processos carcinognicos (Bishop e Schiestl, 2001; Lehmann, 2003). Este bioensaio permite a deteco simultnea de recombinao mittica e mutaes gnicas e cromossmicas atravs da anlise dos gentipos trans-heterozigoto para os genes marcadores mwh e flr3 (mwh/flr3) e heterozigotos para o cromossomo balanceador TM3 (mwh/TM3) (Rigo, 2009). Os fentipos flr3 e mwh manifestam-se devido a perda da heterozigose induzida por diferentes eventos genotxicos.

O teste fornece resultados de eventos mutacionais ocorridos, como mutaes gnicas e cromossmicas e recombinaes somticas, quantifica a contribuio da recombinao e mutao induzida por compostos em estudo e detecta compostos genotxicos e antigenotxicos de ao direta ou indireta, de acordo com o nvel basal e alto de enzimas de metabolizao do tipo citocromo P450 (Sousa, 2008). Para a realizao do teste SMART so utilizadas 3 linhagens mutantes de D. melanogaster:

1) Linhagem multiple wing hairs (mwh): os indivduos dessa linhagem possuem um gene marcador no brao esquerdo do cromossomo 3 e caracterizado por expressar trs ou mais pelos por clula (pelos mltiplos) (Figura 8c), diferentemente da linhagem selvagem onde h a expresso de apenas um pelo por clula (Figura 8a) (Dias, 2008);

2) Linhagem flare3 (flr3): os indivduos dessa linhagem possuem o gene marcador flr3 localizado tambm no brao esquerdo do cromossomo 3, em uma regio mais proximal do centrmero, e caracterizado por expressar um pelo modificado na clula, com a base alargada e semelhante a uma chama de vela (Figura 8b). Esse gene marcador letal em homozigose recessiva e as moscas no se desenvolvem at a fase adulta (Graf et al., 1984; Guzmn-Rincon e Graf, 1995). Em funo desta letalidade foi desenvolvido um cromossomo

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balanceador TM3, BdS (Third Multiple 3, beaded-serrate), que mantm a heterozigose da linhagem. O balanceador impede eventos de recombinao (Lindsley e Zimm, 1992);

3) Linhagem Oregon R, flare3 (ORR): essa linhagem caracterizada por ser capaz de ativar promutgenos, de forma mais eficiente, que dependem da ativao metablica por enzimas citocromo P450, tambm conhecidas como CYP6A2. A linhagem ORR apresenta o marcador flr3 e carrega os cromossomos 1 e 2 de uma linhagem chamada de Oregon R (ORR), resistente ao DDT, diferindo-se assim da linhagem flr3 (Dapkus e Merell, 1977). Essa linhagem possui, assim, alta capacidade de bioativao, devido altos nveis de expresso de enzimas citocromo P450 (Hallstrom e Blanck, 1985).

A partir dessas trs linhagens so realizados dois tipos de cruzamentos para o teste SMART/asa:

a) Cruzamento padro (ST) - fmeas virgens flr3 so cruzadas com machos mwh (Graf et al., 1989);

b) Cruzamento de alta bioativao metablica (HB) fmeas virgens ORR so cruzadas com machos mwh (Graf e Van Schaik, 1992). De ambos os cruzamentos possvel a obteno de dois tipos de descendentes: trans-heterozigotos para os marcados recessivos mwh e flr3 (MH- mwh+/+flr3) que possuem asas arredondadas e os heterozigotos para o cromossomo balanceador TM3 (BH- mwh+/TM3BdS) que possuem asas serrilhadas (Figura 9) (Dias, 2008). Nos descendentes MH possvel detectar a ocorrncia de diferentes eventos genticos, tais como mutaes de ponto, aberraes cromossmicas e recombinao mittica. J nos descendentes BH podem-se detectar apenas mutaes de ponto e aberraes cromossmicas. Isso se deve ao fato que o balanceador TM3 contm mltiplas inverses que impedem eventos de recombinao (Guzmn-Rincon e Graf, 1995).

Figura 8: Fentipos dos pelos de D. melanogaster (microscopia eletrnica): A) pelos normais; B) pelos flr3 e C) pelos mwh.

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Figura 9: Asas dos indivduos trans-hetereozigotos (A) e heterozigotos balanceados (B).

Os pelos mutantes so classificados em manchas: simples quando expressam apenas um dos marcadores mwh (Figura 10) ou flr3 (Figura 11) originadas por mutao, deleo, no-disjuno ou recombinao distal; e gmeas quando expressam os dois marcadores mwh e flr3 (Figura 12) na mesma mancha e so originadas exclusivamente por eventos recombinacionais (Graf et al., 1984).

Conforme o momento de induo do dano gentico e do tempo de ao da genotoxina durante a embriognese pode-se encontrar variaes no nmero de clulas mutantes presentes nas manchas. Quanto ao tamanho, as manchas se classificam em simples pequenas, quando possuem um ou dois pelos mutantes, caracterizadas por se formarem durante o ltimo e penltimo ciclo de diviso mittica, que ocorrem na fase de pupa. Ou manchas simples grandes, se houver trs ou mais pelos mutantes, so alteraes produzidas mais cedo, ou seja, so formadas durante o desenvolvimento larval no incio das divises mitticas (Graf et al., 1998). Como clulas monossmicas ou portadoras de grandes delees dividem-se raramente, aumentos restritos ao nmero de manchas simples pequenas podem ser indicativos de clastognese ou aneugnese (Graf et al., 1995).

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Figura 10. Fotomicrografia mostrando pelos mltiplos (seta) observados em microscpio ptico de luz (aumento de 40x).

Figura 11. Fotomicrografia mostrando pelos mutantes do tipo flare (seta A) e pelos normais (seta B) observados em microscpio ptico de luz (aumento de 40x).

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Figura 12. Fotomicrografia mostrando mancha gmea [contendo pelos mltiplos (seta A) e pelos flare (seta B) adjacentes] observada em microscpio ptico de luz (aumento de 40x).

1.6. Compostos Usados em Testes para Avaliao dos Efeitos Mutagnicos e Antimutagnicos de Substncias

O potencial antigenotxico de uma determinada substncia avaliado utilizando reconhecidos indutores de danos no DNA, como agentes agressores associados s substncias testes. Nessas avaliaes, mutgenos tm sido utilizados em associao com substncias com potencial antigenotxico (Brockman et al., 1992; De Flora et al., 1992; Gebhart, 1992; Kuroda et al., 1992; Mitscher et al., 1992). Alm disso, compostos mutagnicos tm sido utilizados em testes de genotoxicidade como controle positivo (Ribeiro et al., 2003).

Para o presente estudo foram utilizados a Mitomicina C como controle positivo (agente indutor de leses) para o teste do microncleo em medula ssea de camundongos e a Doxorrubicina como controle positivo (agente indutor de leses) para o teste SMART.

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1.6.1. Mitomicina C (MMC) A Mitomicina C (MMC) um antibitico isolado da espcie Streptomyces

caespitosus. Apresenta-se sob a forma de cristais azul-violeta. Sua molcula possui trs grupos reconhecidamente carcinostticos: um anel de aziridina, o grupo quinona e o grupo octano (Figura 13) (Ribeiro et al., 2003).

comumente usada como quimioterpico em aplicaes endovenosas, para tratamento de corioepitelioma, sarcoma de clulas reticulares, seminoma, tumores epiteliais, tumores da cavidade bucal, pulmes, intestino, pncreas e estmago (Crooke e Bradner, 1976; Bruijn et al., 1992; Bradner, 2001).

A ao de MMC pode ocorrer por mecanismos distintos: alquilao do DNA e gerao de radicais livres como o superxido e radicais hidroxil, que induzem quebras na fita de DNA (Kumar et al., 1992; McGuinness et al., 1991). Os radicais livres gerados pela MMC tm influncia na citotoxicidade devido extenso do dano que causam ao DNA e a inabilidade da clula em reparar a leso (Doroshow, 1986; Satorelli et al., 1989).

Segundo Rigo (2009) a MMC um agente que realiza ligao cruzada com o DNA. Drogas que formam ligaes cruzadas com o DNA inibem a replicao, bloqueando a diviso celular e impedindo a transcrio e a sntese protica, o que consequentemente acarreta a morte celular (Balis, 1968; Kraut e Drnovsek-Olup, 1996; Stream e Vanlleuwen, 2000).

Vrios trabalhos na literatura demonstram sua eficcia como inibidor do crescimento tumoral, por sua ao direta sobre o DNA (Hu et al., 2000). A MMC atua bloqueando a replicao de DNA e RNA e inibindo a sntese protica, sem ao especfica no ciclo celular. Clulas em rpida atividade proliferativa so mais suscetveis ao da droga (Calabresi e Chabner, 1990).

Figura 13. Frmula estrutural do quimioterpico Mitomicina C (Ribeiro et al., 2003).

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1.6.2. Doxorrubicina (DXR)

A Doxorrubicina (DXR) um antibitico extrado de um fungo conhecido como Streptomyces peuceltius, amplamente utilizada como antineoplsico, principalmente contra cncer de mama, ovrio, leucemia, pulmo e testculo (Figura 14). A DXR uma das drogas anti cncer mais utilizadas em fase clnica. Essa droga rapidamente metabolizada no fgado, produzindo um metabolito alcolico, o adriamicinol (Chiuchetta e Castro-Prado, 2002).

Este frmaco usado no tratamento de vrios tipos de tumores: leucemia linfoblstica, leucemia mieloblstica aguda, tumor de Wilms, neuroblastoma, sarcoma de pele leve, sarcoma de medula, cncer de mama, ovrios, bexiga, tireide, gstrico, linfoma de Hodgkins e cncer de pulmo de pequenas clulas (Micromedex, 2005).

A citotoxicidade da DXR contra as clulas cancerosas e seus efeitos txicos a vrios organismos esto relacionados a diferentes mecanismos de ao (Tallaj et al., 2005). Dentre esses esto a propriedade de intercalar seus anis entre os pares de bases dos nucleotdeos de DNA e de se ligar membrana celular lipdica (Dias, 2008). A DXR um agente que interage com a topoisomerase II, podendo induzir quebras simples e duplas na molcula de DNA, e tambm gerar radicais livres de oxignio (Rezende et al., 2011).

Alm disso, outros mecanismos tambm so sugeridos: (I) ligao ao DNA e alquilao; (II) pontes inter e intra-cadeias de DNA; (III) interferncia no processo de separao da dupla fita de DNA e na atividade da helicase (Minotti, 2004). Visto que algumas destas atividades independem da duplicao celular para induzirem leses no material gentico, existe a possibilidade deste composto tambm gerar danos em clulas no-proliferativas.

Figura 14: Frmula estrutural do quimioterpico Doxorrubicina (Merck, 1996)

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2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Tendo em vista as atividades biolgicas apresentadas da espcie Hymenaea courbaril, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade txica, genotxica e antigenotxica da seiva de H. courbaril pelo teste do microncleo em clulas da medula ssea de camundongos e pelo teste SMART/asa em clulas somticas de D. melanogaster.

2.2. Especficos

- Avaliar os possveis efeitos citotxicos da seiva de H. courbaril pelo teste do microncleo em clulas da medula ssea de camundongos;

- Avaliar os possveis efeitos clastognicos e/ou aneugnicos da seiva de H. courbaril pelo teste do microncleo em clulas da medula ssea de camundongos;

- Avaliar os possveis efeitos anticitotxicos, anticlastognicos e/ou antianeugnicos da seiva de H. courbaril pelo teste do microncleo em clulas da medula ssea de camundongos;

- Avaliar os possveis efeitos txicos da seiva de H. courbaril em larvas de D. melanogaster;

- Avaliar os possveis efeitos mutagnicos e/ou recombinognicos da seiva de H. courbaril pelo teste SMART/asa em clulas da asa D. melanogaster;

- Avaliar os possveis efeitos antimutagnicos e/ou anti-recombinognicos da seiva de H. courbaril pelo teste SMART/asa em clulas da asa D. melanogaster.

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3. REFERNCIAS

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