1

Cinthia Figueiredo

DISSERTAO DE MESTRADO

Avaliao das propriedades antitumoral e antimetasttica de frao proteoltica do ltex de Carica candamarcensis em modelo de melanoma

murino

Orientadora: Profa Dra Miriam Teresa Paz Lopes

Co-orientador: Prof. Dr. Carlos E. Salas Bravo

Belo Horizonte

2009

Livros Grtis

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Milhares de livros grtis para download.

2

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS BIOLGICAS

FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

Cinthia Figueiredo

Avaliao das propriedades antitumoral e antimetasttica de frao proteoltica do ltex de Carica candamarcensis em modelo de melanoma

murino

Dissertao de mestrado apresentada ao

Programa de Ps-graduao em Cincias

Biolgicas: Fisiologia e Farmacologia, com

nfase em Farmacologia do Instituto de

Cincias Biolgicas da Universidade Federal de

Minas Gerais, como requisito parcial para a

obteno do ttulo de Mestre.

rea de Concentrao: Farmacologia

Orientadora: Profa. Dra. Miriam Teresa Paz

Lopes

Co-orientador: Prof. Dr. Carlos E. Salas Bravo

Belo Horizonte

2009

3

Dedico este trabalho aos meus pais Ivan e Nadir e a minha irm Thays

4

Tenhas sempre presente que a pele se enruga, o cabelo embranquece

Os dias convertem-se em anos

Mas, o que importante no muda, a tua fora e convico no tem idade

O teu esprito como qualquer teia de aranha

Atrs de cada linha de chegada, h uma de partida

Atrs de cada conquista, vem um novo desafio

Enquanto estiveres viva, sente-te viva

Se sente saudades do que fazias, volte a faz-lo

No vivas de fotografias amarelecidas

Continua, quando todos esperarem que desistas

No deixes que enferruje o ferro que existe em ti

Faz com que em vez de pena, te tenham respeito

Quando no conseguires mais correr atravs dos anos, trota

Quando no consigas trotar, caminha

Quando no consigas caminhar, usa uma bengala

Mas, nunca te detenhas!

(Madre Tereza de Calcut)

5

Agradecimentos:

A Deus por abenoar a minha vida;

A minha famlia por me apoiar incondicionalmente e por ser tudo o que eu tenho de

mais valioso;

A Profa. Miriam e ao Prof. Salas pela oportunidade e pela pacincia;

Aos amigos inesquecveis do LSAT pelo carinho, pela amizade e pelo auxlio em

todos os momentos;

Aos alunos do Laboratrio de Biologia Molecular de Produtos Naturais pela ajuda em

alguns dos experimentos;

Aos professores colaboradores (Slvia, Valbert e Geovanni) e seus alunos pela boa

vontade;

A Profa Janetti e seus alunos pela presteza e por cederem o espao para grande

parte dos experimentos executados nesse trabalho;

Aos colegas de departamento, em especial ao Bruno, por ter me apresentado os

caminhos cientficos;

A Tatiane, minha secretria, por ter sido meu brao direito em todo o tempo de

execuo do mestrado;

A Celinha, aos funcionrios do Biotrio e demais funcionrios do ICB pelos servios

prestados;

Aos amigos e parentes pelo carinho;

A todos aqueles que, de alguma forma, colaboraram com a execuo deste trabalho.

6

COLABORADORES:

Prof Geovanni Dantas Cassali, Departamento de Patologia Geral, ICB-UFMG.

Profa Slvia Passos Andrade, Departamento de Fisiologia e Biofsica, ICB-

UFMG.

Prof. Valbert Nascimento Cardoso, Departamento de Anlises Clnicas,

Faculdade de Farmcia, UFMG.

7

SUMRIO

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS i

RESUMO ii

ABSTRACT iv

LISTA DE FIGURAS vi

1. INTRODUO 1

1.1 Fatores iniciadores e promotores do cncer 1

1.2 Desenvolvimento tumoral 2

1.3 Estratgias para o tratamento do cncer 6

1.3.1 Frao proteoltica derivada do ltex de C. candamarcensis- P1G10 10

2. OBJETIVOS 12

2.1 Geral 12

2.2 Especficos 12

3. MATERIAIS E MTODOS 13

3.1 Materiais 13

3.1.1 Biolgicos 13

3.1.2 Reagentes qumicos 13

3.1.3 Equipamentos 15

3.1.4 Materiais diversos 16

3.1.5 Frmacos utilizados 17

3.1.6 Solues 17

3.2 Metodologia 22

3.2.1 Obteno de P1G10 22

3.2.1.1 Inibio de P1G10 por iodoacetamida 22

3.2.1.2 Marcao de P1G10 com 99mTc 23

3.2.2 Avaliao da citotoxicidade de P1G10 23

3.2.2.1 Cultivo celular 23

8

3.2.2.2 Avaliao da viabilidade celular pelo teste do MTT 24

3.2.3 Avaliao da atividade antitumoral de P1G10 25

3.2.3.1 Avaliao da variao da massa tumoral 25

3.2.3.2 Avaliao do tempo de sobrevivncia 25

3.2.3.3 Avaliao da dependncia da atividade proteoltica de P1G10 em seu efeito antitumoral

26

3.2.3.4 Avaliao do efeito de P1G10 sobre a angiognese tumoral 27

3.2.3.4.1 Quantificao da angiognese atravs da dosagem de hemoglobina (Hb)

27

3.2.3.4.2 Dosagem da atividade de N-acetil-b-D-glicosaminidase (NAG) 27

3.2.3.4.3 Ensaio imunoenzimtico para dosagem de VEGF,TNF- e TGF- 28

3.2.3.5 Biodistribuio de P1G10 29

3.2.3.5.1 Imagens cintilogrficas 30

3.2.4 Avaliao da atividade antimetasttica de P1G10 30

3.2.4.1 Avaliao da ocorrncia e nmero de pontos de metstase 30

3.2.4.2 Avaliao do tempo de sobrevivncia 31

3.2.4.3 Biodistribuio de P1G10 31

3.2.4.3.1 Imagens cintilogrficas 32

4. RESULTADOS 33

4.1 Citotoxicidade de P1G10 sobre linhagens de clulas normais e tumorais 33

4.2 Atividade antitumoral em animais tratados com P1G10 36

4.2.1 Variao da massa tumoral 37

4.2.2 Tempo de sobrevida 38

4.2.3 Efeito de P1G10 sobre a angiognese tumoral 41

4.2.4 Avaliao da dependncia da atividade proteoltica de P1G10 em seu efeito antitumoral

45

4.2.5 Biodistribuio de P1G10 45

4.3 Atividade antimetasttica 48

9

4.3.1 Variao no percentual de ocorrncia e do nmero de pontos de metstase

48

4.3.2 Tempo de sobrevivncia 52

4.3.3 Biodistribuio de P1G10 56

5. DISCUSSO 59

5.1 Atividade antitumoral 60

5.2 Atividade antimetasttica 70

6. CONCLUSO 75

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 76

8. ANEXOS 85

10

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

5-FU - Fluoruracila

ANOVA Anlise de varincia

CEBIO- Centro de Bioterismo do ICB, UFMG

Cpm Contagem por minuto

D.O. - Densidade ptica

DMSO Dimetilsulfxido

DTT- ditiotreitol

ELISA- Enzima Linked Immunosorbent assay (ensaio imunoenzimtico)

H.E.- colorao hematoxililina- eosina

Hb- hemoglobina

HTAB- brometo de hexadeciltrimetilamnio

IAA- Iodoacetamida

IC50 - Concentrao inibitria para 50% da populao

Kp Coeficiente de partio

MTT- Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2ila]-2,5 difeniltetrazol

NAG - N- acetil--D-glicosaminidase

PBS- tampo fosfato de sdio

TGF - Transformig Growth Factor (Fator transformador de crescimento )

TNF - Tumor Necrosis Factor (Fator de Necrose Tumoral )

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor (Fator de Crescimento Endotelial

Vascular)

11

RESUMO

Estudos prvios demonstraram a utilizao de proteases como frmaco principal ou

adjuvante na Oncologia. Com base nesses achados, o objetivo deste trabalho, foi

avaliar as propriedades antitumoral e antimetasttica da frao proteoltica rica em

cisteino proteases advinda do ltex de Carica candamarcensis (P1G10), utilizando

modelos murinos de melanoma B16F1 (no metasttico) e B16F10 (metasttico).

Inicialmente, observamos uma reduo da massa tumoral de 88,6% (modelo B16F1)

para o grupo tratado com a dose de 5 mg/kg (0,26 0,62 g) em relao ao grupo

controle (2,28 1,01 g, *p

12

B16F10 de grupos tratados em relao ao controle. No encontramos tambm maior

seletividade, em ensaios in vitro, para as clulas tumorais B16F1 e B16F10. Em face

desses resultados, possvel sugerir que, diferena de outras proteases, a

atividade antitumoral de P1G10 no depende de sua atividade proteoltica e, to

pouco, de atividade citotxica, mas que h o envolvimento da ao antiangiognica.

Em relao atividade antimetasttica de P1G10, os resultados obtidos mostram

um efeito expressivo em dose menor que as utilizadas para outras proteases. Desta

forma, a continuidade do estudo sobre os mecanismos de ao pelos quais a frao

atua se faz necessria.

Palavras - chave: Antitumoral, Antimetasttica, Proteases, C. candamarcensis

13

ABTRACT

Pharmacological and pre-clinical studies have demonstrated that plant cysteine

proteases have therapeutical potential in Oncology. In this work, we evaluated the

antitumoral and antimetastatic properties of a proteolytic fraction from Carica

candamacensis latex, designated as P1G10 that has an elevated content of cysteine

proteases, using B16F1 (non metastatic) and B16F10 (metastatic) melanoma

models. Firstly, we observed a reduction of tumor mass (88,6%) in mice s.c. given

5mg/kg P1G10 (0,26 0,62 g) compared to control (2,28 1,01 g, *p

14

than described for other proteases. On this way, a next step is to investigate the

underlyning mechanisms.

Key-words: Antitumoral, Antimetastatic, Proteases, Carica candamarcensis.

15

LISTA DE FIGURAS

Tabela 1. Determinao da IC50 de P1G10 sobre linhagens celulares normais e

tumorais..................................................................................................................34

Figura 1. Grficos representativos da determinao da IC50 de clulas normais e

tumorais P1G10...................................................................................................35

Figura 2. Determinao do crescimento de melanoma B16F1 em camundongos

C57Bl6 em funo do tempo.....................................................................................36

Figura 3. Avaliao da atividade antitumoral de P1G10 sobre modelo de melanoma

B16F1....................................................................................................37

Figura 4. Sobrevivncia de camundongos C57Bl6 tratados com P1G10................39

Figura 5. Massa tumoral de animais C57Bl6 mortos durante o ensaio de

sobrevivncia..........................................................................................................40

Figura 6. Quantificao da hemoglobina em melanoma B16F1 de camundongos

C57Bl6 tratados com P1G10....................................................................................41

Figura 7. Dosagem da atividade de NAG em melanoma B16F1 de camundongos

C57Bl6 tratados com P1G10....................................................................................42

Figura 8. Determinao dos nveis de citocinas em melanoma B16F1 de animais

tratados com P1G10...............................................................................................43

Figura 9. Determinao dos nveis de citocinas em soro de animais portadores de

melanomas B16F1 tratados com P1G10................................................................44

Figura 10. Avaliao da dependncia da atividade proteoltica da frao para sua

atividade antitumoral...............................................................................................45

Figura 11. Coeficiente de partio de P1G10 marcado com 99mTc em tumores

B16F1.....................................................................................................................46

Figura 12. Distribuio de P1G10 em modelo de melanoma B16F1.....................47

Figura 13. Percentual de ocorrncia de desenvolvimento de metstase para

camundongos C57Bl6 ao longo do tempo................................................................48

16

Figura 14. Avaliao da atividade antimetasttica de P1G10 em modelo

B16F1.....................................................................................................................49

Figura 15. Avaliao da atividade antimetasttica de P1G10 atravs do nmero de

pontos em animais acometidos por metstase para modelo B16F10....................50

Figura 16. Aspecto macroscpico dos focos metasttiticos pulmonares de animais

tratados com P1G10...............................................................................................50

Figura 17. Aspecto microscpico dos focos metasttiticos pulmonares de animais

tratados com P1G10...............................................................................................51

Figura 18. Sobrevivncia de animais C57Bl6 tratados com P1G10........................53

Figura 19. Percentual de ocorrncia de metstases em animais C57Bl6 mortos

durante o ensaio de sobrevivncia.........................................................................55

Figura 20. Coeficiente de partio de P1G10 marcado com 99mTc em pulmes de

animais sadios e portadores de melanoma B16F10...............................................57

Figura 21. Distribuio de P1G10 em modelo de melanoma B16F10...................58

17

1) INTRODUO:

O estudo do cncer de fundamental importncia na atualidade, visto que,

mundialmente, uma das principais causas de morte. Segundo a Organizao

Mundial de Sade, o nmero estimado de novos casos crescer de 10 milhes em

2000 para 15 milhes em 2020. No Brasil, as estimativas para o ano de 2008 e,

vlidas tambm para 2009, apontam que ocorrero 466.730 novos casos de cncer

(www.inca.gov.br/estimativa/2008/conteudo_view.asp?ID=2).

O aumento da incidncia relacionada ao cncer ocorreu devido industrializao,

que gerou mudanas e uma maior uniformidade das condies de vida, trabalho,

nutrio e consumo entre as diferentes classes scio-econmicas. Desta forma,

houve uma mudana no perfil de mortalidade, com diminuio das taxas desta para

doenas infecciosas e aumento para doenas crnico degenerativas como o cncer,

doena de Alzheimer e doenas cardiovasculares em funo do aumento da

expectativa de vida (Waters, 2001).

As altas taxas de morbidade se devem, especialmente em tumores com alta

capacidade de metastatizao, falta de terapias que sejam efetivas nos estgios

avanados da doena. Alm disto, o diagnstico nas fases iniciais da doena

difcil, visto que, o padro ouro para o diagnstico definitivo continua sendo em

muitos casos, a bipsia com anlise histolgica, que uma tcnica invasiva e

executada muitas vezes em fases tardias, aps a identificao da malignidade

(Gadeliya et al, 2009).

1.1) Fatores iniciadores e promotores do cncer:

Desde o incio do sculo XX, o aparecimento de casos de cncer em uma mesma

famlia propulsionou a busca por causas genticas responsveis por esta patologia.

Nas dcadas seguintes, os avanos na identificao molecular das alteraes

responsveis pelo processo da carcinognese foram determinantes para defini-la

como um processo aonde, inicialmente, as clulas acumulam alteraes genticas

distintas (Hanahan & Weinberg, 2000). Essas alteraes moleculares se constituem

de eventos como a inativao de genes supressores tumorais (p.e. p53 ou Rb) ou

ativao de proto-oncogenes (p.e. Ras ou Myc). Essas mutaes geram

instabilidade genmica, afetam mecanismos de controle da diviso celular e

18

permitem a formao do tumor primrio (Mazzone & Comoglio, 2006).

Microscopicamente, as clulas tumorais apresentam algumas caractersticas que as

distinguem das normais como: alta proporo do ncleo em relao ao citoplasma,

nuclolo proeminente, mitocndria com menor funcionalidade, alteraes no

citoesqueleto e poucas estruturas especializadas (Alonso et al, 2004).

Os fatores ambientais se traduzem em genticos, sendo que h uma ampla

variedade de substncias s quais estamos expostos e que apresentam

propriedades carcinognicas ou mutagnicas. Tabagismo (especialmente devido

nitrosamina), exposio ao sol, dieta, produtos do metabolismo da inflamao e

vrus, como o da hepatite B ou C, so alguns exemplos de fatores ambientais que

podem contribuir com o aumento do risco de desenvolver a doena (Wogan et al,

2004).

1.2) Desenvolvimento tumoral:

Conforme dito anteriormente, o cncer uma doena que se origina de alteraes

genticas que so transmitidas da clula alterada s suas clulas filhas. Apesar de

estarmos expostos diariamente a inmeros carcingenos ambientais, o

desenvolvimento de um clone celular tumoral um evento relativamente raro. Isto

ocorre por que a clula precisa transpor uma srie de barreiras fisiolgicas, que so

denominadas pontos de controle, para se tornar tumoral. A progresso pelo ciclo

celular regulada, em parte, por uma srie de protenas como as ciclinas e as

quinases dependentes de ciclinas, principalmente nas transies de fases, tanto de

G1 (fase de preparo para a sntese de DNA) para S (fase de sntese de DNA), onde,

caso haja alguma irregularidade, o gene p53 desencadeia o processo de apoptose;

quanto de G2 (intervalo entre a fase S e a mitose) para a mitose, onde os

mecanismos no esto bem elucidados (Nurse et al, 1998). Desta forma,

anormalidades nos genes da transcrio dessas protenas regulatrias desregulam o

ciclo e permitem que clulas alteradas escapem ao processo de apoptose;

(Guimares & Linden, 2004).

As clulas modificadas vo se multiplicando e formam uma massa tumoral. A idia

atual de que o tumor seja constitudo no s por clulas transformadas, mas

tambm por outras do hospedeiro como as clulas endoteliais, musculares lisas,

19

fibroblastos e as clulas do sistema imunolgico, que interagem entre si. Essa

formao denominada de microambiente tumoral determinante para o processo de

progresso tumor (Hanahan & Weinberg, 2000).

Com a expanso do tumor, ocorre o aumento da distncia de difuso do oxignio e

nutrientes para determinadas reas do tumor. A hipxia (diminuio de nveis de

oxignio nos tecidos) ativa o fator heterodimrico induzvel pela hipxia (HIF

Hipoxia Inducible Factors) que induz a transcrio de genes que, conjuntamente

com outras protenas como a angiopoetina-2, estimulam a formao de novos vasos

que migram para a massa tumoral. Este processo denominado angiognese e

garante o estabelecimento do oxignio e a homeostase nutricional do tumor (Brahimi

& Pouyssgur, 2006). Desta forma, a inibio da angiognese pode significar a

inibio da progresso e invasividade tumoral (Ferrara & Kerbel, 2005).

A angiognese tumoral apresenta caractersticas que a diferenciam da inflamatria.

Na inflamao, a maior fonte de fatores angiognicos so os leuccitos infiltrados e

as plaquetas, enquanto que para o tumor, as maiores produtoras so as clulas

tumorais com uma contribuio menor dos leuccitos. Os vasos presentes no tumor

apresentam arquitetura e funo anormal, so desorganizados, dilatados, tortuosos

e com dimetro aumentado, so mais fenestrados com membrana basal

descontnua ou ausente, sendo mais permeveis. As alteraes observadas na

angiognese e a permeabilidade vascular variam de acordo com o tipo de tumor e

do rgo do hospedeiro onde o tumor est se desenvolvendo, em parte pelas

diferenas entre os rgos que, apresentando diferentes clulas em seu estroma,

produziro diferentes propores de molculas pr e antiangiognica (Carmeliet &

Jain, 2000; Bian et al, 2004).

Dentre as molculas pr-angiognicas, se destacam as citocinas, que so

secretadas pelas clulas normais e tumorais. Estas molculas participam de vrios

eventos biolgicos como a imunidade inata, apresentao de antgeno,

diferenciao das clulas na medula ssea e expresso de molculas de adeso

(Mller, 2002). Dentre estas, o fator de crescimento do endotlio vascular (VEGF

Vascular Endothelial Growth Factor) tem papel importante por desempenhar

funes, tais como o aumento da permeabilidade vascular, estmulo da

diferenciao, proliferao, migrao e sobrevivncia celular (Stefanini et al, 2008).

20

O aumento de sua expresso parece ser uma caracterstica de patologias como o

cncer, a artrite e a doena cardiovascular (Harper & Bates, 2008). Os nveis de

VEGF so controlados no tumor, principalmente, pela hipxia e, alm disso, por

algumas citocinas e fatores de crescimento como o derivado de plaquetas (PDGF

Platelet Derived Growth Factor), o de necrose tumoral (TNF Tumor Necrosis

Factor), o transformador (TGF - Transforming Growth Factor) e o epidermal

(EGF Epidermal Growth Factor) que induzem a transcrio de VEGF (Akagi et al,

1999).

Outras citocinas tambm apresentam papel de destaque na angiognese, entre

estas, o TNF- e o TGF-. O TNF- um dos principais mediadores das reaes

imunolgicas, inflamatrias e patofisiolgicas. Sua atividade antitumoral advem de

efeitos diretos sobre as clulas tumorais, atravs da ativao da resposta imune

e/ou efeitos citotxicos diretos (Fiers, 1991). Esta citocina tem sido associada ao

desenvolvimento e progresso tumoral em modelos pr clnicos e sua secreo

pelas clulas do microambiente parece estar relacionada com a invaso e migrao

celular (Mocellini & Nitti, 2008). Experimentos in vivo e in vitro sugerem que o TGF-

pode promover o cncer de vrias formas, afetando o microambiente tumoral,

aumentando invasividade e inibindo o sistema imune (Pdua & Massagu, 2009).

Assim como estes fatores citados e outros, como o NOS (xido ntrico sintase) e a

COX2 (cicloxigenase 2), atuam como ativadores outros, atuam como inibidores

(p.e.: angiostatina e endostatina) e o desbalano entre esses pode resultar em

aumento da neoformao vascular (Zielo et al, 2007).

A presena do tumor gera uma resposta inflamatria, como uma tentativa do

organismo de controlar a doena (Talmadge et al, 1981). Por essa razo, o

microambiente tumoral rico em clulas inflamatrias, especialmente os

macrfagos, sendo que estas clulas podem afetar o desenvolvimento do tumor de

vrias formas. Lu e colaboradores (2006) afirmaram que macrfagos ativados so

recrutados para a eliminao das clulas transformadas. Contudo, a idia corrente

que, na presena do tumor, ocorre uma mudana de fentipo dos macrfagos que

passam a estimular a angiognese pela produo de fatores de crescimento e,

tambm, geram a ruptura da membrana extracelular, promovendo a progresso e

invaso tumoral (Schfer & Werner, 2008). Desta forma, a ao dos macrfagos em

21

relao ao desenvolvimento do tumor paradoxal. Ao mesmo tempo em que podem

atuar reduzindo a invaso e geram uma grande quantidade de antgenos, que

podem auxiliar no reconhecimento da clula tumoral pelo sistema imune, podem,

tambm, gerar o aumento da vascularizao, subverter a imunidade e aumentar a

produo de elementos facilitadores do crescimento tumoral (Bidard et al, 2008).

Simultaneamente aos eventos angiognicos, outros de degradao e de

remodelamento da matriz extracelular ocorrem para que o tumor e a rede vascular

continuem se desenvolvendo, eventos que resultam em invaso de tecidos

adjacentes. Esses processos ocorrem atravs da ao das proteases endgenas

que so produzidas pelas clulas do estroma e, principalmente, pelas tumorais. Nas

clulas normais, as enzimas proteolticas esto localizadas em lisossomas ou outros

compartimentos intracelulares, porm, nas tumorais, estas so translocadas dos

compartimentos intracelulares para a superfcie celular e ento, so secretadas.

Existe uma grande variedade dessas enzimas, so elas as metalo, asprtico,

cisteno e serino proteases (Deryugina et al, 2006, Minarowska et al, 2008). Essas

enzimas so ativadas em pH cido (entre 3,5 e 5,5) e, portanto, suas atividades

esto aumentadas em ambientes onde h hipxia, como o tumoral (Nagase &

Woesser, 1999). Cada tipo de tumor apresenta caractersticas prprias de

degradao proteoltica, como, por exemplo, a perda do colgeno tipo VII que ocorre

precocemente no melanoma (Kirkham et al, 1989), no cncer de mama (Wetzels et

al, 1991) e no cncer de prstata (Nagle et al, 1995), enquanto que para o tumor de

clon, a perda da laminina-5 a mais comum (Pyke et al, 1994).

Alm da degradao da matriz extracelular pelas proteases endgenas, outros

mecanismos mediados por molculas de adeso, como as caderinas, selectinas e

integrinas, esto envolvidos na migrao e invaso tumoral. As integrinas,

glicoprotenas de adeso, alm de promover a migrao da clula tumoral tambm

medeiam vias sinalizadoras de sobrevivncia celular, permitindo que a clula

consiga sobreviver longe do seu local de origem (Stupack, 2005; Frisch & Screaton,

2001; Jin & Varner,2004). Para a clula migrar, necessrio que ela passe por uma

transio denominada epitlio mesenquimal, na qual a clula tumoral, de origem

epitelial passa a expressar genes tipicamente expressos em clulas de tecido

22

conjuntivo. Neste processo, ocorrem mudanas de morfologia, arquitetura e adeso

aumentando a capacidade migratria da clula (Lee et al, 2006).

O pice da progresso neoplsica ocorre com a metstase que o processo no qual

as clulas migram do stio primrio e colonizam reas distncia. Assim, as clulas

tumorais penetram pelo sistema linftico ou corrente sangunea atravs de um

processo semelhante ao realizado por leuccitos na diapedese, ou atravs de

destruio da parede do vaso (Strell & Entschladen, 2008). O mecanismo pelo qual

ocorre a perda de adeso s clulas endoteliais ainda no est completamente

esclarecido (Chiarugi &Gianonni, 2008) e no existem estudos suficientes para

quantificar o percentual de clulas tumorais que sobrevivem e conseguem colonizar

reas secundrias (Eccles & Welch, 2007).

Ao atingir o stio secundrio, a clula metasttica pode ficar quiescente em seu novo

ambiente at o momento em que inicie a produo de fatores de crescimento e,

ocorra uma adequada angiognese no local. Nesta fase denominada fase de

dormncia, a metstase assintomtica e ainda no detectvel clinicamente.

Dados da literatura revelam que o tumor primrio exerce efeito supressor sobre o

crescimento das metstases nas reas secundrias e que, a remoo deste pode

reduzir os nveis de angiostatina e expandir as micrometstases pr existentes

(Holmgren et al, 1995; Zetter,1998; Da et al, 2006).

1.3) Tratamento do cncer:

Um dos maiores desafios para o tratamento do cncer a ocorrncia de metstase,

visto que o mecanismo pelo qual as clulas colonizam reas distantes elucidado,

constituindo a maior causa de morte e falhas do tratamento (Zetter,1998). As

modalidades de tratamento mais comuns atuam sobre o tumor primrio e, so estas:

a resseco cirrgica, quimioterapia, radioterapia e a imunoterapia.

A retirada cirrgica do tumor, j vem sendo executada por mais de cem anos e

continua sendo a pedra angular para o tratamento do cncer de tumores slidos. A

resseco do tumor primrio feita em duas etapas. Inicialmente, realizada a

bipsia para estabelecer o diagnstico, avaliar a espessura e caractersticas

histopatolgicas. Posteriormente, para leses confirmadas de neoplasias, o

23

processo cirrgico requer uma exciso o mais extensa possvel com amplas

margens de segurana (Wainstein & Belfort, 2004; Katz et al, 2005; Kitano et al,

2006). A disseco eletiva de linfonodos sentinelas controversa e a

metastasectomia (resseco cirrgica das metstases) de difcil execuo,

especialmente para estgios mais tardios do cncer (Esser, 2003).

Na radioterapia, se utiliza a radiao ionizante para destruir as clulas tumorais. A

morte celular induzida pela radiao gera injrias no material gentico, impedindo a

diviso celular. Porm, seus efeitos no so seletivos para as clulas tumorais,

advindo da, os efeitos colaterais deste tratamento. A radioterapia indicada como

terapia adjuvante ps-cirrgica, eliminando as clulas tumorais residuais (Formenti &

Demaria, 2008).

Quando combinada com outras abordagens teraputicas, a imunoterapia pode ser

uma ferramenta de tratamento efetiva. Vrias tcnicas vm sendo desenvolvidas

como a transferncia de linfcitos T citotxicos (CD8T) e pode ser usada para

reduzir clulas tumorais residuais e reduzir o risco de recorrncia e metstase

(Krger et al, 2007).

O tratamento quimioterpico constitui um grande desafio para a medicina moderna

visto que, geralmente, atua em nvel celular, sem especificidade, interferindo no

processo de crescimento e diviso, no destruindo seletiva ou exclusivamente

clulas tumorais. Os efeitos colaterais da quimioterapia esto relacionados

destruio de clulas saudveis que esto em mitose, e incluem: toxicidade

hematolgica, com depresso da medula ssea, que manifestada por leucopenia,

trombocitopenia e anemia; toxicidade gastrointestinal, manifestada atravs de

nuseas, vmitos, mucosite, anorexia, diarria e constipao; toxicidades cardaca,

heptica, pulmonar, neurolgica, vesical/renal; alteraes metablicas, como

hipomagnesemia, hiponatremia, hipercalcemia e hiperuricemia; toxicidade

dermatolgica, com alteraes nas unhas, alopecia, eritema, urticria,

hiperpigmentao e fotossensibilidade; reaes alrgicas e anafilaxia (Arajo et al,

2006).

Dentre os frmacos utilizados, temos os agentes citotxicos, hormnios e agentes

antiangiognicos. Os agentes citotxicos atuam de forma a interromper a diviso

24

celular e desencadear o processo de apoptose. Podem agir tambm ativando

cascatas apoptticas, como a via das caspases (Shalaija et al, 2004). Neste grupo,

esto presentes os agentes alquilantes, os antimetablitos, os antibiticos e os

inibidores mitticos. Os agentes alquilantes atuam formando ligaes covalentes

com componentes celulares nucleares e seus efeitos esto diretamente relacionados

com a alquilao do DNA, a cisplatina, representante desse grupo, um anlogo da

platina e atravessa a membrana atravs de seus canais transmembranares,

formando adutos com o DNA (Jamieson & Lippard, 1999). J os agentes

antimetablitos afetam a biossntese de componentes essenciais do DNA e do RNA;

a fluoruracila (5-FU) pertence a este grupo e foi desenvolvida como um anlogo da

base uracila contendo flor. Seu principal mecanismo de ao a inibio da

timidilato sintase e, consequentemente, a sntese do DNA (Thomas & Zalcberg,

1998). Os antibiticos formam uma classe com estrutura qumica variada e que no

atuam especificamente sobre uma fase do ciclo celular, neste grupo, destacamos a

mitomicina C que atua aumentando expresso de caspases 8 e 3,

consequentemente, gerando a apoptose. Outro grupo importante formado pelos

inibidores mitticos que paralisam a mitose atravs de sua ao sobre a tubulina

formadora dos fusos mitticos; a vincristina que um alcalide da vinca um dos

antineoplsicos deste grupo (Kuboyama et al, 2004). Existem, tambm, outros

agentes citotxicos que no pertencem a esses grupos, como o etoposdeo,

derivado semi-sinttico da podofilotoxina, que atua como inibidor da topoisomerase

II (Meresse et al, 2004).

Outros agentes podem atuar de forma no citotxica no tratamento das neplasias,

como a terapia hormonal que utilizada quando o tumor derivado de tecidos

sensveis a um determinado hormnio e dependem dele para seu crescimento e

sobrevivncia, como o tumor de mama ou de prstata. Dentre os frmacos

utilizados, podemos citar o tamoxifeno, que um inibidor competitivo da ligao do

estrgeno ao seu receptor ou a ciproterona, que um inibidor competitivo dos

receptores de andrognios. Este tratamento leva uma queda nos nveis ou

antagonizam a ao dos esterides sexuais (De La Taille, 2001; Schroth et al, 2007).

Agentes antiangiognicos como o bevacizumab (que um anticorpo monoclonal

anti-VEGF) ou o sorafenid (inibidor de quinases que atua inibindo crescimento e

ativando apoptose de clulas endoteliais e alguns tipos de tumorais) tambm vm

25

sendo utilizados por aumentarem o tempo de sobrevivncia do paciente. Contudo,

seu uso muito recente e necessrio um maior tempo de monitoramento do

paciente e resoluo de problemas como a resistncia ao tratamento a longo prazo

(Sessa et al, 2008). Os anticorpos monoclonais podem ser gerados para reconhecer

e se ligar a antgenos especficos do tumor e so utilizados conjuntamente com

agentes citotxicos ou podem ser ligados a radioistopos para aumentar a sua

atividade (Ravi & Chari, 2007)

H algum tempo, estudos clnicos sobre a utilizao de proteases na Oncologia vm

sendo realizados e comprovando a sua importncia como frmaco principal ou

adjuvante. Misturas enzimticas contendo papana, tripsina e quimiotripsina

demonstraram ter eficcia clnica atuando como supressores tumorinognicos,

reduzindo disseminao metasttica e aumentando o tempo de sobrevida ou mesmo

aliviando os efeitos adversos gerados pelo tratamento convencional e melhorando a

qualidade de vida dos pacientes (Leipner & Saller, 2000). Foi demonstrado, tambm,

que a administrao oral de bromelina, enzima proteoltica advinda de Ananas

comosus, trouxe remisso de tumores malignos com poucos efeitos colaterais para

os pacientes (Gerard, 1974).

Apesar dos inmeros estudos sobre as formas de atuao das proteases no cncer,

os seus mecanismos de ao no esto completamente elucidados. Um possvel

mecanismo de ao a atuao sobre o balano entre proteases e antiproteases

(inibidores de proteases). Acredita-se que as proteases exgenas possam induzir a

sntese de inibidores de proteases, como as 2 macroglobulinas, que inativam

proteases endgenas que participam do processo de metstases (Sloane et al,

1990).

Outro possvel mecanismo de ao das proteases no cncer atravs da

modulao da expresso de vrias molculas de adeso. Estudos demonstraram

que a bromelina capaz de remover molculas de adeso como CD44, CD45RA

(uma isoforma de CD45), CD6, CD7, CD8 e Leu8/LAM1 por protelise. Desser e

colaboradores (2001) relatou a ao das misturas proteolticas combinadas com a

bromelina na reduo dos nveis da citocina TGF- em sangue humano. Este fator

26

est relacionado a proliferao, diferenciao celular e atividade

imunossupressora tumoral (Moses et al. 1994)

Dentre as proteases citadas anteriormente, a papana que advinda do ltex de

Carica papaya, foi a primeira a ser caracterizada e utilizada, tambm, na indstria

como amaciante de carnes, no curtimento de couros ou na clarificao da cerveja,

portanto se destaca pela sua importncia comercial (Castro, 1981). Proteases como

a papana ou como a bromelina, so endopeptidases denominadas cisteno

proteases ou tiol proteases. Elas possuem uma cistena no stio ativo e seu

mecanismo de catlise envolve a participao do grupo tilico. A famlia de cisteno

proteases C1 a mais numerosa famlia destas proteases e compreende as

enzimas semelhantes estruturalmente papana. Elas esto distribudas em

animais, vrus, bactrias e plantas, principalmente as que pertencem famlia

Caricaceae (Bromme et al., 2004).

1.3.1) Frao proteoltica derivada do ltex de C. candamarcensis - P1G10:

Fraes proteolticas do ltex de Carica candamarcensis vm sendo caracterizadas

bioqumica e farmacologicamente pelo Laboratrio de Substncias Antitumorais e

pelo Laboratrio de Biologia Molecular de Produtos Naturais, ambos do ICB, UFMG.

Essa uma planta tpica da costa oeste da Amrica do Sul caracterizada por seu

caule grosso, ramificado na poro apical. Possui cerca de 5 metros de altura e seu

fruto amarelo, elipside e comestvel aps o cozimento. O ltex de C.

candamarcensis coletado geralmente das camadas mais externas dos endocarpos

dos frutos verdes, onde os canais lactferos so numerosos (foto em anexo - ANEXO

1). Esse se apresenta rico em carboidratos, vitaminas, sais minerais e peptdeos de

baixo peso molecular, alm de enzimas da classe das cisteno proteases, ausentes

na Carica papaya (Baeza et al, 1990; Bravo et al,1994). Algumas dessas enzimas

apresentam caractersticas diferentes das descritas para papana, tais como pH

timo, ponto isoeltrico, atividade cataltica e reatividade imunolgica (Teixeira et al,

2008). Sabemos que pela separao cromatogrfica do ltex de C. candamarcensis

em Sephadex G10 se obtm fraes proteolticas que podem ser agrupadas em dois

picos denominados de P1 e P2G10, que so constitudos por protenas de massa

molecular de cerca de 23 kDa (grfico em anexo ANEXO 2). Pereira e

colaboradores (2001) relataram significativa similaridade entre a estrutura primria

27

da frao purificada proveniente do ltex de C. candamarcensis (CC23) e proteases

purificadas da C. papaya. A menor homologia foi obtida com a papana (59,5%),

seguida pela papaya protease IV (67,6%), papaya protease III (69,7%) e, finalmente,

com a chimopapana (74,3%).

Inicialmente, descrevemos a atividade mitognica, in vitro, de fraes de P1G10

obtidas por cromatografia de troca inica. Estudos in vivo demonstraram uma

interessante capacidade cicatrizante, dose dependente, de P1G10 em modelo

murino de dermoabrases. Esta atividade pode ser justificada pela angiognese e

atividade proteoltica, possivelmente, debridante observadas que, em conjunto,

participam do processo de cicatrizao (Gomes et al, 2005; Mello et al, 2006).

Estudos subseqentes evidenciaram as atividades protetora e cicatrizante gstrica

de P1G10 em modelos de leses ulcerosas agudas induzidas pela indometacina e

crnicas induzidas pelo cido actico (Mello et al, 2008; Silva et al, 2008). J foi

relatada, tambm, a ao antitumoral de P1G10 em relao ao modelo de

carcinoma de Ehrlich, com reduo de cerca de 41% da massa tumoral (Viana et al,

2008).

Devemos considerar que a fonte destas substncias so espcies edveis e, por

tanto, representam um risco minimizado para a sade humana. Trabalhos pr

clinicos de toxicologia aguda realizados pelo nosso grupo mostraram que, para as

vias intraperitoneais (i.p.) e subcutneas (s.c.) apenas altas doses (acima de 50

mg/kg) causaram morte em cerca de 30 minutos. Em estudos toxicolgicos

subcrnicos, utilizando administrao oral, s se observou o aparecimento de sinais

txicos para a dose de 300 mg/kg a partir do 45 dia. Esses resultados demonstram

a baixa toxicidade de P1G10 por via sistmica, permitindo a execuo de estudos

com segurana (Villalba et al, dados no publicados).

Considerando que os efeitos aqui descritos so concentrao/dose dependente e

que algumas outras proteases vm sendo estudadas como

antitumoral/antimetastticas, visamos com este trabalho avaliar esta capacidade

para P1G10.

28

2) OBJETIVOS:

2.1) Objetivo geral:

Avaliar as atividades antitumoral e antimetasttica da frao P1G10 do ltex

de Carica candamarcensis sobre os modelos in vivo de melanoma murino

metasttico (B16F10) e no metasttico (B16F1).

2.2) Objetivos especficos:

Determinar a citotoxicidade de P1G10 sobre linhagens normais e tumorais

atravs da medida de viabilidade celular pelo mtodo do MTT.

Estabelecer as condies tcnicas ideais para dois modelos de melanoma

(metasttico e no metasttico) em camundongos C57Bl6.

Determinar a dose mxima tolerada por via subcutnea, bem como a mais

eficaz de P1G10 para modelos de tumor metasttico e no metasttico sobre

a linhagem de camundongos C57Bl6.

Determinar o tempo de sobrevida de camundongos C57Bl6 portadores de

melanoma, metasttico ou no, tratados com P1G10.

Avaliar marcadores angiognicos tumorais, assim como inflamatrios em

camundongos tratados com P1G10, como:

concentrao de hemoglobina

dosagem da atividade de NAG

dosagem de VEGF, TNF- e TGF-

Avaliar se a biodistribuio de P1G10 alterada na presena do tumor para

os diferentes modelos.

Avaliar a participao da atividade proteoltica de P1G10 na atividade

antitumoral.

29

3) MATERIAIS E MTODOS:

3.1) MATERIAIS:

3.1.1) Biolgicos:

3.1.1.1) Animais:

Camundongos da linhagem C57Bl6 apresentando entre 6-8 semanas

fornecidos pelo Centro de Bioterismo da UFMG (CEBIO)

3.1.1.2) Linhagens celulares:

B16F1 (clulas de melanoma com baixo potencial de colonizao pulmonar),

gentilmente cedidas pelo Prof. Ricardo Brentani do Instituto Ludwig, So Paulo,

SP, Brasil.

B16F10 (clulas de melanoma com alto potencial de colonizao pulmonar),

gentilmente cedidas pelo Prof. Ricardo Brentani do Instituto Ludwig, So Paulo,

SP, Brasil.

CHO (clulas de ovrio de hamster chins), gentilmente cedidas pelo Prof.

Ricardo Brentani do Instituto Ludwig, So Paulo, SP, Brasil

BHK-21 (fibroblastos de rim de hmster), adquiridas atravs do Banco de

Clulas do Rio de Janeiro (cdigo CR007)

CIPs (endotlio de aorta de coelho), gentilmente cedido pela Dra. Helena Nader

do Departamento de Bioqumica da Universidade Federal de So Paulo

(UNESP), So Paulo, SP, Brasil

3.1.2) Reagentes qumicos:

Amershan Life Science, Buckingghamshire, Inglaterra - FBS (Soro Fetal

Bovino).

Bristol-Meyes-Squibb Indstria Farmacutica S/A, So Paulo, SP, Brasil -

Anfotericina B.

30

Calbiochem, St. Diego, EUA - BSA 0,1% e 1% (albumina de soro bovino tipo

V).

Gibco-BRL Corporate Headquarters, Gaithersburg, EUA - Pancreatina,

meio de cultura F12 Ham desidratado, meio de cultura RPMI - 1640

desidratado.

Instituto Adolpho Lutz, So Paulo, SP, Brasil - ATV (soluo aquosa de

tripsina) contendo: tripsina (0,20 g), versene (0,02 g) e gua deionizada q.s.p.

(100 mL).

Labsynth Produtos para Laboratrio Ltda, Diadema, SP, Brasil - H2O2

(perxido de hidrognio), KCl P.A. (cloreto de potssio), KH2PO4 P.A.

(dihidrogenofosfato de potssico), NaCl P.A. (cloreto de sdio), NaOH P.A.

(hidrxido de sdio), Twen 80 (polioxietilnsorbitano monolaurato).

Labtest Produtos para Anlises Clinicas Ltda, Lagoa Santa, Minas

Gerais, Brasil - Reagente de hemoglobina (KCN 500 mg/dL).

Laboratrios Wyeth-Whitehall, So Paulo, SP, Brasil - Ampicilina sdica.

Merck, Darmstadt, Alemanha - Bicarbonato de sdio P.A., DMSO (dimetil

sulfxido), EDTA P.A. (etileno-diamino-tetracetato dissdico dihidratado),

etanol absoluto, fosfato monobsico de potssio P.A., fosfato monobsico e

dibsico de sdio P. A., Triton X-100.

R & D Systems, Mineapolis, EUA - Kits de imunoensaio DuoSet VEGF,

TNF TGF anti-mouse.

Sigma Chemical Co, St. Louis, EUA - cido ctrico monohidratado; brometo

de 3 (4,5-dimetiltiazol-2-ila)-2,5-difeniltetrazlio ou sal de tetrazlio (MTT);

EBSS (Earles balanced salt solution); estreptomicina, HCl P.A (cido

clordrico); hepes (N-[2-hydroxyetyl]-piperazine-N-2 ethaneusulphonic acid);

H2SO4 (cido sulfrico); HTAB (Brometo de hexa 1,6 - bis-

deciltrimetilamnio); IAA (iodoacetamida); OPD ( -fenilenodiamina); TMB

(3,3,5,5- tetrametilbenzidina).

White Martins do Brasil S/A, Contagem, MG, Brasil - Nitrognio lquido.

31

P1G10 produzida no Laboratrio de Biologia Molecular de Produtos Naturais

do Departamento de Bioqumica e Imunologia da Universidade Federal de

Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

3.1.3) Equipamentos:

Abbott Laboratories, Chicago, EUA - Contador gama ANSR.

Consul - Multibrs Eletrodomsticos S/A, So Bernardo do Campo, SP,

Brasil - Refrigerador ajustado temperatura de +4C; freezer temperatura de

20C.

Fanem, So Paulo, SP, Brasil Banho-maria calibrado a 37C, centrfuga

Excelsa 2 modelo 205 N.

Fisher Scientific, California, EUA - Ultra-sonicador modelo FS-28H.

Fizatron Equipamentos Eltricos para Laboratrio, So Paulo, SP, Brasil -

Agitador magntico modelo 252.

Janke & Kunkel IKA, Labortenik, Alemanha - Homogeneizador Ultra- turrax.

Metter Micronal Instrumentos S/A, So Paulo, SP, Brasil - Balana eletrnica

analtica modelo MT-200.

Milipore Corporation, Bedford, EUA - Deionizador de gua por meio de

osmose reversa.

Nevoni Equipamentos Mdicos e Odontolgicos, So Paulo, SP, Brasil -

Bomba aspirante modelo H.

Novatcnica Equipamentos para Laboratrios, Piracicaba, SP, Brasil -

Medidor de pH modelo NT-PH2 - equipado com eletrodo modelo V-620 C -

Analion Aparelhos & Sensores Ind. & Com., Ribeiro Preto, SP, Brasil

Nuaire Equipaments, Pymouth, Minneapolis, EUA. Estufa incubadora 36,5 C,

atmosfera controlada e contendo 2,5% CO2 (v/v).

Olympus Corporation, New York, EUA. Microscpio tico linha CB, microscpio

tico invertido modelo CK2.

32

Shimadzu Corporation, Kyoto, Japo. Espectrofotmetro de duplo feixe para

faixas UV (ultravioleta) e visvel modelo UV-150-02.

Spectramax Plus, Molecular Devices, CA, EUA - Leitor de microplacas de

ELISA.

Thermolyne, Dubuque, Ioha, EUA - Shaker Roto Mix modelo 48200.

Veco do Brasil Indstria & Companhia de Equipamentos, Campinas, SP,

Brasil - Capela com fluxo laminar de ar ultrafiltrado.

3.1.4) Materiais diversos:

Biodinmica, Ibipor, PR, Brasil - Fio de sutura Suturim 1x10 m.

Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EUA - Tubos tipo eppendorf

com capacidade para 0,5 e 1,5 mL.

Fenin-Optik, Blakenburg, Alemanha - Cmaras de Neubauer.

Fizatron, Equipamentos Eletrnicos para Laboratrios, So Paulo, SP,

Brasil - Barras magnticas.

Gilson Sas, Frana - Pipetadores automticos com capacidade mxima de 2,

20, 200 e 1000 l, acompanhados de ponteiras de polipropileno.

Millipore Corporation, Bedford, EUA - Membranas filtrantes de nitrato de

celulose, com 0,45 m e 0,22 m de dimetro de poro.

Nunc Inter Med A/S, Roskilde, Dinamarca - Garrafas de poliestireno de 50

ml para cultura, placas de poliestireno multicavitadas de 96 cavidades.

Quimex Corning Incorporated, New York, New York, EUA - Pipetas

graduadas de vidro, tubos de polipropileno com fundo cnico de 15 e 50 ml de

capacidade e dotados de tampa rosquevel.

Sigma Chemical Co, St. Louis, MD, EUA - Saco de dilise com poro 10 kDa

de dimetro.

S.S White, Rio de Janeiro, RJ, Brasil - Material cirrgico.

33

Sytat Software Inc., Richmond, California, EUA - Software Sigma Plot

verso 5.0 e Prisma verso 3.0 para anlise de resultados em forma grfica e

testes estatsticos.

Vidrolabor-Thermex Astra Brasil Ind. Vidros, F. Vasconcelos, SP, Brasil -

Vidraria (kitazato de 1000 ml, bquer 1000 ml e tubos de ensaio com 14 X 1

cm de dimenses).

3.1.5) Frmacos utilizados:

Cespo industria e Comrcio Ltda, Jacare, So Paulo Quetamina

(Dopalen ).

Laboratrios Calier S.A., Barcelona, Espanha Xilasina (Dopaser ).

Valeant Farmacutica do Brasil Ltda, So Paulo, SP, Brasil 5-

Fluorouracila (Fluoro- Uracil ) soluo injetvel 250 mg/10 mL.

3.1.6) Solues:

Fosfato de sdio a 0,1 M :

Na2HPO4...................................................................................................7,09 g

gua destilada q.s.p............................................................................ 500,00 mL

Glicina a 0,8 M :

Glicina......................................................................................................15,01 g

gua destilada q.s.p.............................................................................250,00 mL

H2O2 a 1,2 mM em tampo fosfato de sdio:

H2O2..........................................................................................................1,60 L

Tampo fosfato de sdio 80 mM............................................................25,00 mL

H2SO4 a 4 M :

H2SO4....................................................................................................115,00 mL

34

gua destilada q.s.p.............................................................................500,00 mL

Meio F12 HAM (NaHCO3 31 mM, Hepes 10 mM, Ampicilina 0,27 mM,

Estreptomicina 0,06 mM) :

Meio F12 Ham desidratado (comercial).....................................................10,60 g

Bicarbonato de sdio ..................................................................................2,67 g

Hepes.....................................................2,38 g

Ampicilina sdica ........................................................................................0,10 g

Estreptomicina ............................................................................................0,10 g

gua deionizada q.s.p. ...............................................................................1,00 L

Aps ajustado o pH, 0,005 g de Anfotericina B foi adicionado e esterilizado por

filtrao em membrana Millipore com porosidade absoluta de 0,22 m.

Meio RPMI-1640 pH 7,4 (NaHCO3 14 mM, Hepes 4 mM, Ampicilina 0,27 mM,

Estreptomicina 0,06 mM) :

Meio RPMI-1640 desidratado (comercial) ................................................10,43 g

Bicarbonato de sdio .................................................................................1,20 g

Hepes ........................................2,38 g

Ampicilina sdica.........................................................................................0,10 g

Estreptomicina ............................................................................................0,10 g

gua deionizada q.s.p. ...............................................................................1,00 L

Aps ajustado o pH, 0,005 g de Anfotericina B foi adicionado e esterilizado por

filtrao em membrana Millipore com porosidade absoluta de 0,22 m

NaCl a 0,8 M :

NaCl...........................................................................................................11,70 g

gua destilada q.s.p.............................................................................250,00 mL

NaOH a 0,8 M :

NaOH...........................................................................................................8,00 g

gua destilada q.s.p.............................................................................250,00 mL

p-nitrofenil-N-acetil-b-D-glicosamina a 2,24 mM :

35

p-nitrofenil-N-acetil-b-D-glicosamina.........................................................0,77 mg

Tampo citrato/fosfato..............................................................................1,00 mL

PBS pH 7,2 - 7,4 :

NaCl ............................................................................................................8,00 g

KCl...............................................................................................................0,20 g

Na2HPO4.....................................................................................................1,15 g

KH2PO4........................................................................................................0,21 g

gua deionizada q.s.p.................................................................................1,00 L

Reagente diluente (utilizado nos ensaios imunoenzimticos) :

PBS estril..............................................................................................40,00 mL

BSA 0,1%.....................................................................................................0,04 g

Soluo de cido ctrico a 0,1 M :

cido ctrico monohidratado......................................................................10,51 g

gua destilada q.s.p.............................................................................500,00 mL

Soluo de cido sulfrico a 4M :

H2SO4 (18M).........................................................................................115,00 mL

gua destilada q.s.p.............................................................................500,00 mL

Soluo anestsica Ketapun (quetamina 10% e xilasina 2%) :

Quetamina 10%.........................................................................................10,00 mL

Xilasina 2%...............................................................................................7,50 mL

Soluo de Drabkin :

Reagente de hemoglobina (KCN 500 mg/dL).........................................10,00 mL

gua destilada..................................................................................... 990,00 mL

Soluo de HTAB (brometo de hexa 1,6 - bis- deciltrimetilamnio) a 5% :

36

HTAB...........................................................................................................0,10 g

Tampo fosfato de sdio (80 mM, pH 5,4).............................................20,00 mL

Soluo NaCl 0,9% :

NaCl.............................................................................................................0,90 g

gua destilada q.s.p.............................................................................100,00 mL

Soluo de pancreatina 0,2 % v/v em tampo EBSS pH 7,4 :

Pancreatina..1,00 mL

EBSS q.s.p..........................................................................................10,00 mL

Soluo para paralisao da reao (VEGF) :

H2SO4 4M...............................................................................................30,00 mL

gua destilada q.s.p.............................................................................. 10,00 mL

Soluo Triton X-100 :

Triton X- 100.............................................................................................1,00 mL

Soluo salina a 0,9% q.s.p.........................................................................1,00 L

Tampo de bloqueio (ensaios imunoenzimticos) :

PBS estril............................................................................................. 40,00 mL

BSA 1%........................................................................................................0,40 g

Tampo citrato/fosfato (pH 5) :

Soluo A:

cido ctrico 0,1 M.......................................................................................9,60 g

gua deionizada q.s.p..........................................................................500,00 mL

Soluo B:

Fosfato de sdio dibsico..........................................................................35,82 g

37

gua deionizada q.s.p..........................................................................500,00 mL

Tampo citrato/ fosfato:

Soluo A................................................................................................24,30 mL

Soluo B................................................................................................25,70 mL

gua deionizada q.s.p..........................................................................100,00 mL

Tampo glicina a 0,2 M :

Glicina a 0,8 M......................................................................................100,00 mL

NaCl a 0,8 M.........................................................................................100,00 mL

NaOH a 0,8 M.......................................................................................100,00 mL

Tampo de lavagem (ensaios imunoenzimticos) :

Polioxietilnsorbitano monolaurato 20 (Tween 20)..................................650,00 L

PBS..............................................................................................................1,30 L

TMB (3,3,5,5- tetrametilbenzidina).a 6,4 mM em DMSO :

TMB..........................................................................................................1,54 mg

DMSO.......................................................................................................1,00 mL

Polioxietilnsorbitano monolaurato 20 (Tween 20) :

Polioxietilnsorbitano monolaurato 20 (Tween 20).....................................1,00 mL

gua deionizada estril.............................................................................3,00 mL

38

3.2) METODOLOGIA:

3.2.1) Obteno de P1G10:

A frao proteoltica foi obtida e fornecida pelo Prof. Carlos Edmundo Salas Bravo

do Laboratrio de Biologia Molecular de Produtos Naturais do Departamento de

Bioqumica e Imunologia do ICB, UFMG.

Na preparao, 3,0 g de ltex liofilizado de C. candamarcensis foi suspendido em 20

mL de tampo acetato de sdio 1 M (pH 5,0); contendo cistena, 25 mM; EDTA, 10

mM; e DTT, 5 mM. Aps 30 minutos de agitao lenta temperatura ambiente, o

material foi centrifugado durante 10 minutos a 9000 x G a 4oC. O sobrenadante foi

filtrado em membrana de 0,45 m de porosidade e constituiu o ltex ativado, usado

posteriormente na purificao.

A resina Sephadex G-10 (50 g) foi equilibrada durante 48 horas com 200 mL de

tampo acetato de sdio 1 M (pH 5,0). Em seguida, o sobrenadante obtido

anteriormente foi aplicado sobre a resina, utilizando acetato de sdio 1 M (pH 5,0)

com um fluxo constante de 0,25 mL/minuto temperatura ambiente e coletando

fraes de 5 mL, as quais posteriormente foram triadas mediante a determinao da

densidade tica em 280 e 405 nm (concentrao de protena e atividade amidsica,

respectivamente) (Gomes et al, 2005).

3.2.1.1.) Inibio de P1G10 por iodoacetamida:

Para a inibio enzimtica de P1G10, se utilizou com o inibidor irreversvel

iodoacetamida (IAA). Inicialmente, foi preparada uma soluo aquosa (35 mL) de

P1G10 na concentrao de 2 mg/mL, qual foram adicionados 4,9 g de DTT. A

soluo resultante foi incubada 4 C, sob agitao constante, por 30 min. Aps

este perodo, a soluo foi incubada com 2,94 mg de IAA por 100 minutos. As

amostras ento foram dialisadas com leve agitao contra 2500 mL de gua milii-Q

a 4C durante 48 h (trocando a gua a cada 12 h), para eliminar o excesso de

inibidor. Aps este procedimento, as amostras foram esterilizadas e estavam prontas

para os ensaios biolgicos (Gomes et al, 2005).

39

3.2.1.2) Marcao de P1G10 com 99mTc:

As amostras de P1G10 foram marcadas radioativamente e fornecidas pelo

Laboratrio de Radioistopos da Faculdade de Farmcia da UFMG sob

coordenao do Prof. Valbert Cardoso. Alquotas de 100 L das solues de P1G10

foram incubadas temperatura ambiente durante 20 minutos com SnCl2 e 2 L de

borohidreto de sdio. O pH foi ajustado para 7,0 e adicionado mistura 100 L das

solues de pertecnetato de sdio, aguardando por 20 minutos para posterior

determinao do rendimento de marcao e separao das impurezas

radioqumicas executadas conforme j padronizado anteriormente no laboratrio

citado.

Avaliao in vitro:

3.2.2) Avaliao da citotoxicidade de P1G10:

3.2.2.1) Cultivo celular:

O teste utilizado para avaliao da citotoxicidade foi o teste do MTT. As clulas

B16F10, B16F1, CHO e BHK-21 foram cultivadas em meio RPMI 1640 a 5% (v/v) de

FBS, enquanto que para as clulas CIPs, o meio utilizado foi o F12-Ham

suplementado com 10% FBS. Todas as linhagens foram mantidas em estufa a 5%

de CO2 e 37o C com atmosfera mida. Ao atingirem aproximadamente 90% de

confluncia, subcultivos das linhagens foram realizados para ampliao da cultura e

posterior congelamento. As clulas B16F10, B16F1, CHO e BHK-21 foram

inicialmente lavadas com PBS/EDTA pH 7,4 e em seguida adicionou-se tripsina a

0,2% (v/v) para a retirada das clulas aderidas superfcie do frasco de cultivo.

Quando as clulas apresentavam-se completamente desprendidas, foi adicionado

meio RPMI com 5% FBS para inativar a tripsina. J nas clulas CIPs o mesmo

procedimento foi executado, no entanto a enzima utilizada foi a pancreatina 0,2%

(v/v) em tampo EBSS e para a inativao da mesma foi utilizado o meio F12 Ham

10% de FBS. O congelamento para a manuteno das clulas viveis em estoque

foi efetuado a partir da preparao de criotubos contendo alquotas de 650 L das

40

linhagens celulares (em 30% FBS e 10% DMSO). As alquotas foram inicialmente

congeladas a 20 C por duas horas e depois estocados em nitrognio lquido.

3.2.2.2) Avaliao da viabilidade celular pelo mtodo do MTT:

A suspenso celular obtida foi semeada em placas de poliestireno de 96 cavidades

nas densidades de 0,8 x 103 clulas/cavidade (B16F10 e B16F1); 1,0 x 103

clulas/cavidade (CHO e BHK-21) ou 2,5 x 103 clulas/cavidade (CIPs), suspensas

em 100 L de meio RPMI mais 5% (v/v) de FBS ou F12 Ham com 10% de FBS para

CIPs. As culturas foram incubadas em estufa a 36,5oC com atmosfera mida e 5%

(v/v) de CO2. Aps adeso dessas clulas na superfcie das cavidades, essas foram

expostas a concentraes diferenciadas da frao P1G10 (variando entre 10-8 e 10-4

g/mL), sendo que os controles receberam apenas meio/soro.

Os testes foram realizados em hexaplicatas. Houve exposio das clulas frao

proteoltica por 120 horas. Anteriormente leitura, foi realizada a adio de 10 L de

uma soluo de sal de tetrazlio (5 mg/mL) em cada cavidade (resultando na

concentrao final de 0,05 mg/10 L) e, 4 horas aps, os cristais de sal de tetrazlio

(formazan) foram diludos em 100 L de DMSO. Ento, realizou-se a leitura

espectrofotomtrica (540 nm). Para o clculo da concentrao inibitria para 50% da

populao, as mdias aritmticas das densidades ticas obtidas para os controles

foram consideradas como 100% de viabilidade celular. A porcentagem de clulas

viveis foi calculada, ento, pela frmula: B/A X 100, onde A= mdia aritmtica da

densidade ptica do controle e B = mdia aritmtica da densidade ptica na

presena da amostra (Heo et al, 1990).

Anlise estatstica:

O teste estatstico dos dados obtidos foi feito utilizando a anlise de varincia, one-

way ANOVA ps teste Dunnett (GhaphPad Prism 5), os valores foram considerados

significativos quando p

41

Avaliao In vivo:

3.2.3) Avaliao da atividade antitumoral de P1G10:

Clulas B16F1 (clulas de melanoma com baixo potencial metasttico) foram

cultivadas e obtidas conforme descrito no item 3.2.2.1. Aps a obteno da

suspenso celular, esta foi centrifugada e suspensa em RPMI 1640 (veculo utilizado

na administrao) e, ento, foram inoculadas subcutneamente (s.c.) no volume de

100 L, contendo 5 x 105 clulas, na regio do flanco direito de camundongos C57Bl6.

(Zuberek et al, 2003).

3.2.3.1) Avaliao da variao da massa tumoral:

O tratamento foi iniciado quatro dias aps o inculo de clulas por via s.c e feito

diariamente por 15 dias. Os animais foram separados em trs grupos: o controle que

recebeu somente veculo (soluo salina a 0,9%) e os grupos testes que receberam

a substncia na dose de 1 e 5 mg/kg. Os animais foram pesados em dias alternados

para ajuste da dose.

Ao trmino do tratamento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e

os tumores tiveram suas massas mensuradas.

Anlise estatstica:

Os resultados obtidos das massas dos tumores foram expressos como mdia erro

padro da mdia e comparados com os controles atravs da anlise de varincia,

one-way ANOVA ps teste Bonferroni (GhaphPad Prism 5). Os valores foram

considerados significativos quando p

42

et al, 2007). O tratamento teve a durao de 15 dias para todos os grupos, porm

para o grupo tratado com o 5-FU foi realizado em ciclos de 5 dias. Aps o trmino do

tratamento, foi feito o acompanhamento dirio dos animais e foram contabilizados os

bitos/dia. Os animais mortos tiveram seus tumores removidos e suas massas foram

medidas. Os resultados obtidos foram expressos em percentual de mortalidade nos

tempos de 1 a 8, 9 a 12 e 13 a 15 dias aps o trmino do tratamento (Ashour et al,

2007).

Anlise estatstica:

Os dados obtidos foram expressos graficamente pela curva de sobrevivncia de

Kaplan Meier e os resultados comparados entre si pelo teste de Logrank. Os

valores das massas tumorais apresentados pelos grupos foram comparados entre si

pelo Teste t de Student. Os resultados foram considerados significativos quando

p

43

3.2.3.4) Avaliao do efeito de P1G10 sobre a angiognese tumoral:

Neste ensaio, foram utilizados os tumores e o sangue coletados durante o

experimento de avaliao da dependncia da atividade proteoltica na atividade

antitumoral de P1G10. Os tumores relativos aos grupos controle e tratado com a

dose mais eficaz de P1G10 foram homogeneizados, fracionados e separados em

criotubos. O sangue foi centrifugado por 10 minutos a 12.000 r.p.m para obteno do

soro. Os tecidos e o soro foram mantidos a -20o C. Os parmetros utilizados para a

avaliao da atividade angiognica da frao foram as dosagens: de hemoglobina

(Hb), da atividade da N-acetil-b-D glicosaminidase (NAG) e a determinao dos

nveis das citocinas VEGF, TNF- e TGF- (Teixeira et al, 2006).

3.2.3.4.1) Quantificao da angiognese atravs da dosagem de hemoglobina (Hb):

A avaliao da angiognese foi realizada atravs do mtodo colorimtrico de

Drabkin & Austin (1935) adaptado por Plunkett (1990). Para este experimento, aos

fragmentos tumorais (cujas massas tinham valores de aproximadamente 100 mg)

foram adicionados 2 mL de reagente de Drabkin e homogeneizados com o auxlio do

aparelho homogeneizador ultra-turrax. Esse homogenato foi centrifugado por 40

minutos a 10.000 r.p.m e filtrado em filtro Milipore de 0,22 m. As amostras em

duplicatas (100 L por cavidade), assim como o padro foram distribudos em placas

de 96 poos. A concentrao de Hb foi determinada atravs de leitura

espectrofotomtrica a 540 nm em leitor de ELISA e os valores obtidos foram

divididos pelos valores de suas respectivas massas e comparados s de uma curva

padro de Hb previamente estabelecida.

3.2.3.4.2) Dosagem da atividade da N-acetil--D-glicosaminidase (NAG):

Esse ensaio foi feito utilizando parte do sedimento obtido na dosagem de Hb ao qual

foi adicionada soluo de NaCl a 0,9% contendo 0,1 % (v/v) de Triton-X-100. Houve

a homogeneizao por 30 segundos e a centrifugao por 10 minutos a 3.000 r.p.m

a 4oC. O sobrenadante (100 L) foi utilizado para a realizao do ensaio. Foram

adicionados placa de 96 poos 100 L das amostras, 100 L do substrato p-

nitrofenil-N- acetil- -D- glicosamina e 2,24 mM em tampo citrato/fosfato de sdio

44

0,1 M pH 4,5. Aps uma incubao a 37o C durante 10 minutos, foram adicionados

100 L de tampo glicina 0,2 M pH 10,6 para paralisar a reao. A absorbncia foi

medida por leitura espectrofotomtrica a 405 nm e os resultados obtidos foram

expressos em densidade tica (Teixeira et al, 2006).

3.2.3.4.3) Ensaio imunoenzimtico para dosagem de VEGF, TNF- e TGF-:

As amostras dos tumores (100 L do sobrenadante da dosagem de Hb) e do soro

(150 L) foram homogeneizadas em 500 l de PBS pH 7,4 contendo 0,05% de

Tween 20, centrifugadas a 12.000g/4o C por 30 minutos e o sobrenadante foi

reservado. As citocinas foram dosadas em 150 L do sobrenadante usando kits de

imunoensaio da R & D Systems, seguindo seus protocolos. A placa de microtitulao

foi sensibilizada com 100 L/ cavidade de anticorpo primrio (anti-camundongo)

especfico para a citocina a ser avaliada e incubada a 4o C overnight. A placa foi

lavada por 6 vezes com 400 L de PBS pH 7,4 contendo 0,05% de Tween 20

(tampo de lavagem). Foram, ento, adicionados placa 200 mL/ poo de PBS pH

7,4 com 1% BSA (Albumina de Soro Bovino), seguido de incubao por 1 hora para

bloquear os stios de ligaes inespecficas. A placa foi novamente lavada com

tampo de lavagem. Os padres e as amostras diludas em PBS pH 7,4 com 0,1%

BSA e 0,05% Tween 20 (100 L por poo) foram adicionadas placa e incubados a

4oC overnight. A placa foi lavada com o tampo de lavagem e foram adicionados 100

L/cavidade do apropriado anticorpo de deteco biotinilado e incubado por 2 horas.

A placa foi lavada com o tampo de lavagem novamente e foram adicionados 100

L/ poo do conjugado estreptavidina-peroxidase e incubada durante 30 minutos

temperatura ambiente. Aps nova lavagem da placa, 100 L/ poo de OPD foi

diludo em tampo citrato a 0,03% pH 5,0 contendo 0,02% de H2O2 30 v/v foram

adicionados. A placa foi incubada abrigada de luz durante 30 minutos. A reao foi

interrompida por adio de 50 L/cavidade de H2SO4 1M. A leitura das placas foi

feita em espectrofotmetro a 492 nm. Todas as amostras foram ensaiadas em

duplicata e as incubaes (exceto overnight) foram temperatura ambiente. Os

resultados foram expressos em g/mg de tecido ou g/ml. Uma curva-padro, com

sete pontos, foi construda usando, diluies seriadas a partir de 1000 g/ml

(Ferreira et al, 2007).

45

Anlise estatstica:

Os resultados obtidos nos ensaios anteriores (em g/mg de tumor para dosagem de

Hb, OD/mg tumor para dosagem de NAG, g/mg de tumor para dosagem de

citocinas no tumor ou mg/150 L de soro para dosagem de citocinas no soro) foram

expressos como mdia erro padro da mdia e comparados com os controles

atravs do Teste t de Student (GhaphPad Prism 5). Os valores foram considerados

significativos quando p

46

Para obteno das imagens cintilogrficas, os animais tratados com P1G10 5 mg/kg

marcada com 99mTc. foram anestesiados e, em seguida, posicionados em decbito

ventral. Atravs das imagens, possvel avaliar a biodistribuio de P1G10 no

organismo do animal. As imagens foram obtidas pela gama cmara no tempo de 1

hora aps a administrao e o detector foi posicionado de forma a ficar sobre a

regio posterior do animal.

3.2.4) Avaliao da atividade antimetasttica de P1G10 :

Clulas B16F10 (clulas de melanoma com alto potencial de colonizao pulmonar)

foram cultivadas e obtidas conforme descrito no item 3.2.2.1 e, ento, foram

centrifugadas e suspensas em RPMI 1640 (veculo usado na administrao). Foram

inoculados 100 l da suspenso celular contendo 5 x 104 clulas, por via s.c., na

orelha direita dos camundongos C57Bl6. Quinze dias aps o inculo inicial, os

animais foram anestesiados com xilasina e quetamina na proporo de 7,5 : 10 (0,1

mL/ 100 g de peso do animal via i.m.) para realizao da cirurgia de remoo das

orelhas, de forma a extirpar completamente o tumor (Fidler et al, 1978) .

3.2.4.1) Avaliao da ocorrncia e nmero de pontos de metstase:

Os animais foram divididos em 4 grupos: o controle (tratado com soluo salina a

0,9%) e outros trs que receberam a frao nas doses de 1; 5 e 10 mg/kg por 21

dias diariamente por via s.c. Os animais foram pesados em dias alternados para

ajuste da dose. O tratamento iniciou-se no dia da cirurgia e, aps o seu trmino, os

camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical, tiveram seus pulmes

removidos e analisados quanto ao percentual de ocorrncia e nmero de pontos de

metstases. Esses foram classificados em relao ao tamanho com o auxlio de uma

lupa (puntuais ou menores de 1 mm, at 3 mm e acima de 3 mm).

Anlise estatstica:

Os resultados obtidos foram expressos em percentual de ocorrncia e nmero de

pontos metastticos. Esse ltimo foi expresso como mdia erro padro da mdia e

comparados com os controles atravs da anlise de varincia, one-way ANOVA ps

47

teste Dunnet (GhaphPad Prism 5). As diferenas foram consideradas significativas

quando p

48

Camundongos C57Bl6 foram subdivididos em 2 grupos: um grupo sadio (que no

recebeu o inculo celular) e o grupo portador de melanoma B16F10 (que recebeu

inculo celular na densidade de 5 x 104 clulas em 100 L e sofreu cirurgia). O

tratamento com P1G10 5 mg/kg foi iniciado imediatamente aps a remoo cirrgica

das orelhas por via s.c., por 21 dias diariamente. Os animais foram sacrificados em

tempos diferenciados ao longo do tratamento (2, 9 e 16o) e, apenas no dia do

sacrifcio, foram tratados com P1G10 marcada com 99mTc.

A distribuio tecidual foi determinada 1 hora aps a administrao da frao, nos

animais previamente anestesiados com mistura de xilasina e quetamina na

proporo de 7,5:10 (0,1 mL/ 100 g de peso do animal via intramuscular) para coleta

de sangue. Os animais foram sacrificados para a remoo, pesagem e determinao

da radioatividade dos pulmes, atravs da leitura em contador gama ANSR. As

porcentagens em relao dose injetada presente em cada pulmo e as

porcentagens em relao dose injetada por grama de pulmo foram calculadas

para determinao da taxa de captao (Nunan et al, 2002; Lemos et al, 2008).

3.2.4.3.1) Imagens cintilogrficas:

Para obteno das imagens cintilogrficas, os animais tratados com P1G10 5 mg/kg

marcada com 99mTc foram anestesiados por via i.p. e, em seguida, posicionados em

decbito ventral. As imagens mostram a biodistribuio de P1G10 no organismo do

animal e foram obtidas pela gama cmara no tempo de 1 hora aps a administrao,

sendo o detector posicionado de forma a ficar sobre a regio posterior do animal.

Anlise estatstica:

Os resultados obtidos para a captao pulmonar de P1G10 foram expressos como

mdia erro padro da mdia e comparados com os controles para cada tempo (2,

9 e 16 dias) atravs do Teste t de Student (GhaphPad Prism 5), sendo os valores

considerados significativos quando p

49

4) RESULTADOS :

Com o intuito de avaliar a atividade antitumoral e antimetasttica de P1G10,

estudamos in vivo, sua ao em modelos de melanoma no metasttico - B16F1 e

metasttico B16F10, bem como iniciamos ensaios para delinear o mecanismo de

ao da frao, considerando como possveis atividades envolvidas a citotxica e a

antiangiognica. Os resultados obtidos, atravs desses experimentos, esto

descritos abaixo.

Avaliao in vitro:

4.1) Citotoxicidade de P1G10 sobre linhagens de clulas normais e tumorais:

A citotoxicidade em linhagens celulares foi avaliada aps o plaqueamento de

linhagens normais e tumorais e exposio das mesmas por 120 horas a

concentraes de P1G10 variando entre 10-8 a 10-4 g/mL e posterior anlise da

viabilidade celular pelo mtodo colorimtrico do MTT. O percentual de clulas

viveis foi calculado e, a partir da curva de regresso linear, foram determinadas as

concentraes inibitrias para 50% da populao (IC50). O tratamento com a frao

mostrou efeitos citotxicos concentrao dependente, tanto para as clulas normais

(CHO, BHK-21 e CIPs) quanto para as clulas tumorais (B16F1 e B16F10).

Podemos observar na Tabela 1 que as doses inibitrias apresentam valores de IC50

semelhantes para todas as linhagens estudadas. Estes valores variaram entre 10-6 e

10-5, sendo a IC50 mais baixa (1,74 x 10-6 g/mL) encontrada para a linhagem normal

CHO.

50

Tabela 1. Determinao da IC50 de P1G10 sobre linhagens celulares normais e tumorais.

Linhagens celulares

IC50 (g/mL)

Tumorais

B16F1 3,23 x10-5

B16F10 3,32 x10-5

Normais

CHO 1,74 x 10-6

CIPs 1,66 x 10-5

BHK-21 6,31 x 10-5

Clulas foram expostas por 120 horas a concentraes crescentes da frao, sendo a viabilidade celular determinada pela metabolizao do MTT. As IC50 foram determinadas aps a regresso linear dos dados experimentais. (B16F1 = clulas de melanoma com baixo potencial de colonizao pulmonar, CHO = clulas de ovrio de hmster chins, CIPS= clulas de endotlio de aorta de coelho, BHK-21 = fibroblastos de rim de hmster baby)

Na Figura 1A, esto apresentados os valores das densidades ticas obtidas para as

diferentes concentraes de P1G10 utilizadas sobre a linhagem celular BHK-21. A

Figura 1B mostra um grfico representativo do perfil da atividade citotxica da frao

observada na figura anterior, considerando que os perfis e valores de IC50 foram

semelhantes para todas as linhagens estudadas.

51

Figura 1. Grficos representativos da determinao da IC50 de clulas normais e tumorais P1G10. Clulas BHK-21 (fibroblastos de rim de hmster baby) foram expostas a concentraes crescentes de P1G10 por 120 horas e a viabilidade celular avaliada ao final do perodo pelo teste do MTT. (A) Valores das densidades ticas (D.O.) obtidas para cada concentrao, sendo o controle considerado como 100% de viabilidade celular (*p

52

6 10

15

0

1

2

3

4

*

n=10

n=9

n=9

**##

Tempo de sacrifcio (dias)

Massa t

um

ora

l (g

)

Avaliaes in vivo :

4.2) Atividade antitumoral em animais tratados com P1G10:

Para a determinao do crescimento dos tumores em funo do tempo,

camundongos C57Bl6 receberam inculo celular (B16F1), via subcutnea (s.c.) na

densidade celular de 5 x 105 clulas em 100 L. Os animais foram sacrificados em

intervalos de tempo de 6, 10 e 15 dias, aps o inculo. Observou-se o perfil do

crescimento da massa tumoral, sendo que os valores foram de 0,03 0,13 g para

tumores removidos em 6 dias; 0,41 0,32 g para os removidos em 10 dias (*p

53

Con

trol

e 1 5 0

1

2

3

*

P1G10 (mg/kg)

n=6

n=6

n=8

Massa t

um

ora

l (g

)

4.2.1) Variao da massa tumoral:

A atividade antitumoral foi avaliada aps 15 dias de tratamento com P1G10 via s.c.,

o qual foi iniciado 4 dias aps o inculo celular. Trs grupos foram formados:

controle, P1G10 nas doses de 1 e de 5 mg/kg, sendo os animais pesados em dias

alternados para ajuste da dose. Ao trmino do tratamento os animais foram

sacrificados e tiveram suas massas tumorais medidas. Foi observada uma reduo

de 88,6% da massa tumoral do grupo tratado com a dose de 5 mg/kg (0,26 0,62 g)

em relao ao grupo controle (2,28 1,01 g, *p

54

4.2.2) Tempo de sobrevivncia:

Para avaliar o tempo de sobrevida gerado por P1G10 em animais portadores de

melanoma B16F1, foram formados 3 grupos: o controle negativo (soluo salina;

n=35), o grupo tratado com a dose eficaz de P1G10 (5 mg/kg; n=35), via s.c.,

diariamente por 15 dias e o grupo tratado com fluoruracila (5-FU) 20 mg/kg (n=24),

via intraperitoneal (i.p.), em ciclos de 5 dias por 15 dias, como controle positivo.

Conforme mostrado na Figura 4A, observamos que entre o 1 e o 8 dia aps o

trmino do tratamento ocorreu apenas um bito para o grupo tratado com P1G10

(2,9%), nmero significativamente inferior aos obtidos nos grupos 5-FU (7 animais

mortos ou 29,2%) e controle negativo (9 mortes ou 25,7%). Porm, se observou que

o percentual de mortalidade se diferenciou entre os grupos ao longo do tempo. Do 9

ao 12 dia aps o trmino do tratamento, o tratamento com 5-FU gerou uma reduo

maior no nmero de mortes (2 bitos, totalizando 9 ou 37,5%) em relao aos

grupos P1G10 (9 mortes, totalizando 10 ou 28,6%) e controle negativo (12 bitos,

totalizando 21 ou 60%). Nos ltimos dias de ensaio (13 ao 15 dia aps o trmino

do tratamento), foram contabilizadas 9 mortes para o grupo P1G10 (totalizando 19

ou 54,3%), nmero superior ao grupo controle que apresentou 6 bitos (totalizando

27 ou 77,1%) e apenas uma morte para o grupo 5-FU (totalizando 10 ou 41,7%). Na

Figura 4B, observamos que, pelo teste de Logrank, existem diferenas estatsticas

entre todos os grupos tratados em relao ao controle negativo, sendo 5-FU e

P1G10 semelhantes entre si.

55

Figura 4. Sobrevivncia de camundongos C57Bl6 tratados com P1G10. Os animais receberam

inculos (B16F1- 5x105 clulas em 100 L) e foram tratados com P1G10 5mg/kg ou salina (ambas por

via s.c. e por 15 dias) ou 5-FU via i.p. por 15 dias em ciclos de 5 dias. Ao final, foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12/12 horas, com rao e gua ad libitum e os bitos foram contabilizados diariamente. (A) Atravs da curva de Kaplan- Meier possvel observar diferenas entre os grupos P1G10 e 5-FU em relao ao grupo controle. (B) Teste de Logrank, demonstrando as diferenas estatsticas entre os grupos (1= controle, 2= P1G10 5 mg/kg, 3= 5-FU 20 mg/kg). Os valores de p destacados em vermelho se referem aos significativos.

A ocorrncia de tumor nesse ensaio foi de 100% nos animais mortos durante o

experimento e esses tiveram seus tumores removidos e as massas determinadas.

No perodo entre o 1 e 8 dia aps o trmino do tratamento, no foi possvel

analisar estatisticamente a variao de massa tumoral entre os trs grupos, pois o

grupo tratado com P1G10 apresentou apenas um bito (a massa tumoral foi de 0,10

Grupos comparados Estatstica do teste Valor de p

Controle x P1G10 x 5-FU 8,7000 0,0131

Controle x P1G10 6,5000 0,0107

Controle x 5-FU 5,6000 0,0179

P1G10 x 5-FU 0,2000 0,6730

A

B

56

g). O grupo tratado com 5-FU apresentou massas tumorais diferentes

estatisticamente (0,05 0,04 g, *p

57

Con

trol

e

P1G

10

0

2

4

6

8

10

*

n=7

n=10

Hb

(g

/mg

tu

mo

r)

4.2.3) Efeito de P1G10 sobre a angiognese tumoral:

Para avaliar a atividade angiognica, foram coletados fragmentos de tumor e

amostras de sangue por puno da artria braquial. Iniciou-se com o processamento

dos tumores e coleta do sobrenadante para quantificao da hemoglobina (Hb),

conforme descrito na seo Materiais e Mtodos item 3.2.3.4.1. Na Figura 6,

possvel verificar a reduo da quantidade de Hb, em g/mg de tumor, do grupo

tratado com P1G10 5 mg/kg (2,15 1,19) em relao ao grupo controle (7,90 2,04,

*p

58

Con

trol

e

P1G

10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

n=6

*

n=8A

tivid

ad

e d

e N

AG

(O

D/m

g t

um

or)

Figura 7. O grupo tratado, portanto, obteve um aumento da atividade de NAG de

46,8% em relao ao controle.

Figura 7. Dosagem da atividade de NAG em melanoma B16F1 de camundongos C57Bl6 tratados

com P1G10. Os animais receberam inculos celulares (B16F1- 5x105 clulas em 100 L) e foram

tratados com P1G10 5 mg/kg ou salina, ambas por 15 dias via s.c. Os tumores foram processados como preconizado por Plunkett e colaboradores (1990) e o pellet obtido foi utilizado para dosagem da atividade de NAG. (* p

59

Figura 8. Determinao dos nveis de citocinas em melanoma B16F1 de animais tratados com

P1G10. Camundongos C57Bl6 receberam inculos (B16F1- 5x105 cl em 100 L) e foram tratados com

P1G10 5 mg/kg ou salina, ambas por 15 dias e via s.c. Os tumores foram processados como preconizado por Teixeira e colaboradores (2006) e o sobrenadante obtido foi utilizado para dosagens de citocinas. (A) Determinao dos nveis de VEGF (*p

60

A determinao dos nveis de VEGF e TNF- (Figura 9 A e B, respectivamente)

tambm foi executada no soro dos animais, porm no houve diferena estatstica

entre os grupos tratados (0,52 0,35 e 0,06 0,01, para VEGF e TNF- ,

respectivamente) e controle (0,32 0,28 e 0,08 0,01, para VEGF e TNF- ,

respectivamente). No foi realizada a dosagem de TGF- em soro por falta de

amostras.

Figura 9. Determinao dos nveis de citocinas em soro de animais portadores de melanomas B16F1 tratados com P1G10. Camundongos C57Bl6 receberam inculos (B16F1- 5x10

5 clulas em

100 L) e foram tratados com P1G10 ou salina. Esses camundongos tiveram seu sangue coletado e o soro utilizado para dosagem de citocinas. (A) Determinao de VEGF, (B) Determinao de TNF-.

Con

trol

e

P1G

10

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

n=4

n=4

VE

GF

(g

/150

l so

ro)

Con

trol

e

P1G

10

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10 n=4

n=4

TN

F-

(g

/150

l so

ro)

A

B

61

4.2.4) Avaliao da dependncia da atividade proteoltica de P1G10 em seu efeito antitumoral:

Camundongos C57Bl6 foram tratados com P1G10 5 mg/kg ou soluo salina

(controle) ou P1G10 5 mg/kg com sua atividade proteoltica inibida pela

iodoacetamida (IAA) para verificar se a atividade antitumoral observada

dependente da atividade proteoltica da frao. Observou-se, conforme apresentado

na Figura 10 A, que o grupo tratado com a frao inibida apresentou reduo da

massa tumoral (1,23 1,21 g) semelhante do grupo tratado com P1G10 (1,05

0,92 g). Porm apenas o ltimo grupo foi estatisticamente diferente em relao ao

controle (2,36 1,57g, *p

62

5 10 16

0.0

0.5

1.0

1.5

Dias

*

n=5

n=5n=4

*

Kp

(%

cp

mtu

mo

r/%

cp

ms

an

gu

e)

sendo ao final do tratamento administrado P1G10 na mesma dose, porm, marcada

com 99mTc. O esquema teraputico variou em relao ao nmero de dias de

tratamento (5, 10 e 16 dias).

As taxas de captao de radioatividade obtidas em cada tumor foram corrigidas pela

taxa correspondente ao total administrado e pelas massas tumorais. Esses

resultados foram ento utilizados para o clculo do coeficiente de partio

tumor/sangue (Kp), ou seja, a relao entre a quantidade de frao distribuda no

tumor e a presente na corrente sangunea.

Verifica-se uma reduo do Kp ao longo do tempo, sendo maior no 5o dia