avaliação da viabilidade embrionária na reprodução humana

Rita de Cássia Savio Figueira

AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE EMBRIONÁRIA

NA REPRODUÇÃO HUMANA ASSISTIDA: VALOR

PREDITIVO DE PARÂMETROS MORFOLÓGICOS

Tese apresentada ao curso de Pós-

Graduação da Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo para

obtenção do título de Doutora em Ciências

da Saúde.

São Paulo

2015

Rita de Cássia Savio Figueira

AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE EMBRIONÁRIA

NA REPRODUÇÃO HUMANA ASSISTIDA: VALOR

PREDITIVO DE PARÂMETROS MORFOLÓGICOS

Tese apresentada ao curso de Pós-

Graduação da Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo para

obtenção do título de Doutora em Ciências

da Saúde.

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: Ciências da Saúde

ORIENTADOR: Prof. Dr. Tsutomu Aoki

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Edson Borges Jr.

São Paulo

2015 Versão Corrigida

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central da

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

Figueira, Rita de Cássia Savio Avaliação da viabilidade embrionária na reprodução humana assistida: valor preditivo de parâmetros morfológicos./ Rita de Cássia Savio Figueira. São Paulo, 2015.

Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Tsutomu Aoki Co-Orientador: Edson Borges Júnior 1. Infertilidade 2. Fertilização in vitro 3. Desenvolvimento

embrionário 4. Transferência embrionária BC-FCMSCSP/12-15

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, eternos exemplos de dedicação.

Ao meu irmão e amigo para toda a vida, Cezar.

Ao Murilo, meu amor verdadeiro e companheiro.

Ninguém pode tirar de você...

... A disposição de tentar mais uma vez.

... A vontade de enfrentar desafios.

... A sensação de dever bem cumprido.

... A coragem de ser simplesmente você.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Tsutomu Aoki pela orientação e pelo exemplo de determinação.

Ao Dr. Edson Borges Jr., pela orientação e não só pelo incentivo, mas também pelo exemplo na

busca incansável por conhecimento. Obrigada por tudo.

Ao Dr. Edson Borges Jr. e ao Dr. Assumpto Iaconelli Jr., diretores clínicos do Fertility Medical

Group, pela oportunidade e por toda a confiança em mim depositada ao longo desses 10 anos de

trabalho árduo e de bons momentos compartilhados.

À Gloria Calderon, diretora da empresa EmbryoTools, por ser a principal responsável pela

minha paixão pela morfologia embrionária e pelo seu apoio sempre.

A todos os membros da equipe de embriologistas dos Laboratórios de Fertilização in vitro e

Andrologia do Centro de Fertilização Assistida - Fertility: Livia Vingris, Matheus Azevedo,

Renata Ferreira, Rodrigo Provenza e Thais Serzedello, pelo verdadeiro significado de EQUIPE

resultando em muitos bebês em casa e pelos inúmeros bons momentos compartilhados. Amigos,

obrigada pela dedicação e por todo o carinho.

Aos novos membros desse time: Caroline Brogliato e Jéssica Rocha pelo interesse notório em

serem realmente parte desta EQUIPE.

A todos os funcionários do Centro de Fertilização Assistida - Fertility e do Instituto Sapientiae

pelo convívio, em especial à Carla Mercante, à Margaret Meira, à Daniela Braga e à Amanda

Setti pelo profissionalismo associado a boas risadas.

Aos meus pais Jorge e Maria José e ao meu irmão Cezar pelo amor incondicional, pelo apoio,

pelo incentivo constante e por estarem ao meu lado em todos os momentos, independente da

distância. Obrigada por tudo.

À Elvira, ao Ivaldir e à Nola, minha segunda família, por todo apoio e carinho sempre presentes.

Ao meu esposo Murilo, pelo companheirismo, compreensão, admiração e pelo amor sempre tão

presente. Obrigada pelo alicerce intelectual e emocional na finalização deste trabalho e por tudo

que “construímos” neste período.

À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e À Irmandade da Santa Casa de

Misericórdia de São Paulo por proporcionarem a efetivação desta tese.

Ao Centro de Fertilização Assistida - Fertility e às pacientes submetidas ao tratamento pela

disponibilização dos dados utilizados para elaboração desta tese.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte

financeiro.

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

μL - Microlitro

UI - Unidades internacionais

ASRM - do inglês American Society for Reproductive Medicine (Sociedade Americana de

Medicina Reprodutiva)

CDC - do inglês Centers for Disease Control and Prevention (Centros de Controle e Prevenção

de Doenças)

CFM - Conselho Federal de Medicina

CNS - Conselho Nacional de Saúde

CGH - do inglês Comparative Genomic Hybridization (Hibridização Genômica Comparativa)

CO2 - Dióxido de carbono

CP - Corpúsculo polar

CPN - Corpos Precursores de Nucléolos

DNA - do inglês Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucléico)

DP - Desvio padrão

E2 - Estradiol

EC - Extracitoplasmático

EOC - Estímulo Ovariano Controlado

EPV - Espaço perivitelineo

ESHRE - do inglês European Society of Human Reproduction and Embryology (Sociedade

Européia de Reprodução Humana e Embriologia)

FISH - do inglês Fluorescent In Situ Hybridization (Hibridização in situ fluorescente)

FIV - Fertilização in vitro

FSH - do inglês Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante)

r-FSH - do inglês recombinant Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante

recombinante)

HP-u-FSH - do inglês Highly Purified urinary Follicle Stimulating Hormone (Hormônio

Folículo Estimulante urinário altamente purificado)

GnRH - do inglês Gonadotropin Releasing Hormone (Hormônio Liberador das Gonadotrofinas)

hCG - do inglês human Chorionicgonadotropin (Gonadotrofina Coriônica Humana)

r-hCG - do inglês recombinant human Chorionicgonadotropin (Gonadotrofina Coriônica

Humana recombinante)

β-hCG - do inglês human Chorionicgonadotropin beta subunit (subunidade beta da

Gonadotrofina Coriônica Humana)

HEPES - (N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfônico)

HSA - do inglês Human Serum Albumin (Albumina Sérica Humana)

IC - Intracitoplasmático

ICSI - do inglês Intracytoplasmic Sperm Injection (Injeção Intracitoplasmática de

Espermatozóides)

MCI - Massa Celular Interna

NSFG - do inglês National Survey of Family Growth (Pesquisa Nacional de Crescimento

Familiar)

OMS - Organização Mundial da Saúde

OMICS - Conjunto de ferramentas de análise genômica, transcriptômica e proteômica

OR - do inglês Odds ratio (Razão de Chance)

PN – Pronúcleo(s)

POP – Procedimento Operacional Padrão

PVP - Polivinilpirrolidona

RE - Retículo endoplasmático

REDLARA - Rede Latinoamericana de Reprodução Assistida

REL - Retículo endoplasmático liso

RHA - Reprodução Humana Assistida

RLA - Registro Latinoamericano

RNA - do inglês Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico)

mRNA - do inglês messenger Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico mensageiro)

rRNA - do inglês ribosomal Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico ribossomal)

RON - Regiões Organizadoras de Nucléolos

SART CORS - do inglês Society for Assisted Reproductive Technology Clinic Outcome

Reporting System (Sistema de Relato dos Resultados Clínicos da Sociedade Nacional Americana

para Tecnologia Reprodutiva Assistida)

SPTZ - Espermatozoides

TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TRF - Trofoectoderma

VAC - Vacúolo

ZP - Zona pelúcida

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Esquema didático para avaliação da simetria de blastômeros nos dias 2 e 3 do

desenvolvimento embrionário........................................................................................................26

FIGURA 2: Modelo de categorização das variáveis número de células / ritmo de clivagem e

simetria de blastômeros para os dias 2 e 3 do desenvolvimento utilizados para submissão dos

dados à análise estatística...............................................................................................................34

FIGURA 3: Curva ROC para o modelo taxa de formação de blastocistos...................................62

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Modelo de classificação da fragmentação embrionária humana segundo

Alikani, 1999..................................................................................................................................14

TABELA 2: Modelo de classificação de blastocistos humanos cultivados in vitro

segundo Gardner and Schoolcraft, 1999.........................................................................................17

TABELA 3: Intervalos de horas em relação ao horário de realização do procedimentode ICSI

utilizados para avaliação regular dos embriões quanto aos critérios morfológicos

de interesse.....................................................................................................................................31

TABELA 4: Descrição das características dos casais inseridos no presente estudo

e de seus ciclos de tratamento de RHA..........................................................................................39

TABELA 5: Descrição das características clínicas da população estudada e dos ciclos de

tratamento de RHA. ......................................................................................................................40

TABELA 6: Descrição das variáveis de resposta folicular das pacientes submetidas

ao EOC...........................................................................................................................................41

TABELA 7: Descrição dos parâmetros seminais pré-processamento das amostras submetidas

à ICSI..............................................................................................................................................42

TABELA 8: Perfil laboratorial das variáveis de sucesso após submissão dos oócitos à

ICSI.................................................................................................................................................42

TABELA 9: Taxas de sucesso do tratamento de RHA para as pacientes avaliadas no estudo.....43

TABELA 10: Descrição das características e do perfil de resposta clínica e laboratorial dos

casais submetidos ao tratamento de RHA de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do

desenvolvimento............................................................................................................................44

TABELA 11: Taxa de blastocistos obtidos no dia 5 do desenvolvimento de acordo com as

características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA..................................................45

TABELA 12: Descrição da incidência dos dismorfismos oocitários avaliados no dia 0 do

desenvolvimento.............................................................................................................................47

TABELA 13: Taxa de formação de blastocisto de acordo com o dismorfismo oocitário detectado

no oócito submetido à ICSI............................................................................................................48

TABELA 14: Descrição da incidência das alterações do padrão de morfologia pronuclear

avaliadas no presente estudo...........................................................................................................49

TABELA 15: Taxa de formação de blastocisto de acordo com a alteração do padrão de

morfologia pronuclear detectado nos zigotos obtidos após a ICSI................................................50

TABELA 16: Descrição das características dos embriões de acordo com os critérios de

morfologia embrionária avaliados para o dia 2 do desenvolvimento.............................................52

TABELA 17: Taxa de formação de blastocisto de acordo com os critérios morfológicos

avaliados nos embriões em dia 2 do desenvolvimento..................................................................53

TABELA 18: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia

embrionária do dia 2 do desenvolvimento, de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do

desenvolvimento............................................................................................................................55


morfologia embrionária avaliados para o dia 3 do desenvolvimento.............................................56


avaliados nos embriões em dia 3 do desenvolvimento...................................................................58




TABELA 22: Critérios selecionados pelo modelo de regressão logística binária múltipla como

preditores da obtenção de embriões em estágio de blastocisto quando cultivados até o dia 5 do


TABELA 23: Descrição das características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA de

acordo com a taxa de implantação dos embriões transferidos em estágio de blastocisto...............64

TABELA 24: Taxa de implantação dos blastocistos transferidos de acordo com as características

dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA.........................................................................65

TABELA 25: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com o

dismorfismo oocitário detectado no oócito submetido à ICSI.......................................................66

TABELA 26: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com a

alteração do padrão de morfologia pronuclear detectado nos zigotos obtidos após a ICSI...........68

TABELA 27: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com os

critérios morfológicos detectados nos embriões em dia 2 do desenvolvimento.............................70


embrionária do dia 2 do desenvolvimento, de acordo com a taxa de implantação dos embriões

transferidos em estágio de blastocisto............................................................................................71


critérios morfológicos detectados nos embriões em dia 3 do desenvolvimento.............................72



transferidos em estágio de blastocisto............................................................................................73


preditores do potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto após transferência

embrionária.....................................................................................................................................74

SUMÁRIO

1) INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

1.1) REPRODUÇÃO HUMANA ASSISTIDA (RHA) ........................................................... 1

1.2) MORFOLOGIA OOCITÁRIA......................................................................................... 3

1.2.1) Dismorfismos intracitoplasmáticos ............................................................................ 5

1.2.1.1) Granulação ............................................................................................................ 5

1.2.1.2) Inclusões ................................................................................................................. 5

1.2.2) Dismorfismos extracitoplasmáticos ........................................................................... 6

1.2.2.1) Zona pelúcida ......................................................................................................... 6

1.2.2.2) Espaço perivitelineo ............................................................................................... 6

1.2.2.3) Corpúsculo polar ................................................................................................... 7

1.2.2.4) Forma ..................................................................................................................... 7

1.3) MORFOLOGIA EMBRIONÁRIA .................................................................................. 8

1.3.1) Morfologia pronuclear .............................................................................................. 10

1.3.1.1) Pronúcleo ............................................................................................................. 10

1.3.1.2) Corpos Precursores de Nucléolos (CPN) ............................................................ 11

1.3.1.3) Halo Citoplasmático ............................................................................................ 12

1.3.2) Classificação embrionária nos dias 2 e 3 do desenvolvimento .............................. 12

1.3.2.1) Número de células e ritmo de clivagem ............................................................... 13

1.3.2.2) Simetria de blastômeros ....................................................................................... 13

1.3.2.3) Fragmentação citoplasmática .............................................................................. 14

1.3.2.4) Multinucleação ..................................................................................................... 16

1.3.3) Classificação embrionária nos dias 5 e 6 do desenvolvimento .............................. 17

1.4) JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA DO ESTUDO ..................................................... 19

2) OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 21

2.1) OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 21

3) CASUÍSTICA E MÉTODO .............................................................................. 22

3.1) REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 22

3.2) REVISÃO DOS PRONTUÁRIOS LABORATORIAIS ............................................... 26

3.3) TREINAMENTO DA EQUIPE E ELABORAÇÃO DE ESQUEMAS DIDÁTICOS 30

3.4) PACIENTES ..................................................................................................................... 22

3.5) ESTÍMULO OVARIANO CONTROLADO (EOC)..................................................... 23

3.6) RECUPERAÇÃO OOCITÁRIA .................................................................................... 23

3.7) OBTENÇÃO DE ESPERMATOZOIDES, ANÁLISE E PROCESSAMENTO

SEMINAL ................................................................................................................................ 24

3.8) INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI) ............. 25

3.9) AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E SELEÇÃO EMBRIONÁRIA ............................ 32

3.10) COLETA DE DADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS ........................................ 33

3.11) CATEGORIZAÇÃO DAS VARIÁVEIS DE ESTUDO ............................................. 34

3.12) SEGUIMENTO CLÍNICO ............................................................................................ 36

3.13) CONCEITOS E VARIÁVEIS ....................................................................................... 36

3.14) ANÁLISE E ESTATÍSTICA DOS DADOS ................................................................ 38

4) RESULTADOS .................................................................................................. 40

4.1) Dados descritivos – Perfil da população estudada .................................................... 40

4.2) Objetivo 1 – Valor preditivo de critérios morfológicos oocitários e embrionários

avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento na obtenção de embriões em estágio de

blastocisto. ............................................................................................................................ 44

4.2.1) Dados descritivos .................................................................................................... 44

4.2.2) Morfologia oocitária ............................................................................................... 47

4.2.3) Morfologia pronuclear ............................................................................................ 50

4.2.4) Morfologia do dia 2 do desenvolvimento embrionário ........................................... 52


4.2.6) Obtenção de um modelo de regressão logística binária ......................................... 60


avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento no potencial de implantação de embriões

em estágio de blastocisto. .................................................................................................... 64

4.3.1) Dados descritivos .................................................................................................... 64

4.3.2) Morfologia oocitária ............................................................................................... 67

4.3.3) Morfologia pronuclear ............................................................................................ 68



4.3.6) Obtenção de um modelo de regressão logística binária ......................................... 75

5) DISCUSSÃO ....................................................................................................... 77

Dados descritivos .............................................................................................................. 77

Idade .................................................................................................................................. 77

Estímulo ovariano controlado ........................................................................................... 79

Amostra seminal ................................................................................................................ 81

Morfologia oocitária ......................................................................................................... 82

Morfologia do dia 1 do desenvolvimento .......................................................................... 85

Morfologia dos dias 2 e 3 do desenvolvimento ................................................................. 89

Modelos preditivos ............................................................................................................ 97

6) CONCLUSÕES ................................................................................................ 100

7) ANEXO ............................................................................................................. 103

8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 131

FONTES CONSULTADAS ................................................................................. 145

RESUMO .............................................................................................................. 146

ABSTRACT .......................................................................................................... 147

LISTAS E APÊNDICE ........................................................................................ 148

1) INTRODUÇÃO

1.1) REPRODUÇÃO HUMANA ASSISTIDA (RHA)

A infertilidade conjugal é definida como a incapacidade de conceber após um ano de

relações sexuais regulares sem o uso de métodos contraceptivos (Schmidt 2006). Evidências

epidemiológicas sugerem que a infertilidade acomete por volta de 15% dos casais em idade

reprodutiva (Templeton 1995). Segundo o mais recente registro do Centro de Controle e

Prevenção de Doenças (CDC) dos EUA, a partir de dados compilados pela Pesquisa Nacional de

Crescimento Familiar (NSFG), dentre aproximadamente 62 milhões de mulheres com idade entre

15 e 44 anos em 2010, cerca de 7,4 milhões, ou 12%, receberam tratamento para infertilidade em

algum momento de suas vidas. Dentre as mulheres casadas de mesma faixa etária estima-se que

1,5 milhões sejam inférteis (CDC 2006-2010). Em registro publicado em 2014, referente às taxas

de sucesso obtidas por centros de fertilização assistida em 2012, o CDC divulgou a realização de

176.247 procedimentos de RHA por 456 clínicas, que seriam representativas de 98% dos

tratamentos realizados no país (CDC 2012). Segundo o último registro da Sociedade Européia de

Reprodução Humana e Embriologia (ESHRE), 550.296 procedimentos de RHA foram relatados

por 991 clínicas de 31 países em 2010. Estima-se que tenham sido realizados 1221 ciclos por

milhão de habitantes (Kupka et al. 2014). Considerando-se o contexto no qual o Brasil encontra-

se inserido, segundo o último Registro Latinoamericano (RLA), órgão da Rede Latinoamericana

de Reprodução Assistida (REDLARA), foram reportados 47.326 procedimentos de RHA

realizados em 2012 por 155 centros de 14 países. Os dados relatados representam um aumento de

12,9% no número de ciclos realizados quando comparado ao ano de 2011 (Zegers-Hochschild et

al. 2015).

Dentre as técnicas de RHA utilizadas para o tratamento de infertilidade, destacam-se a

Fertilização in vitro (FIV) clássica e a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóides (ICSI). A

ICSI foi introduzida em 1992 (Palermo et al. 1992), sendo utilizada exclusivamente em casos de

fator masculino de infertilidade, incluindo alterações de concentração, motilidade e morfologia

espermática. De fato, por meio da utilização desta técnica é possível obter taxas satisfatórias de

fertilização e gestação em casos que envolvem recuperação cirúrgica de espermatozoides

(Semião-Francisco et al. 2010). Relatos atuais indicam que atualmente a técnica representa

72,6% dos procedimentos realizados nos EUA, sendo de 36,4% o número obtido para o ano de

2

1996 (CDC, ART, 2012). O aumento do uso da técnica está associado a sua aplicação para o

tratamento de casais inférteis na ausência de fator masculino (Boulet et al. 2015). Segundo

registro da RLA, a ICSI representou 85% dos procedimentos de RHA realizados na América

Latina, proporção que permanece sem alteração desde 2008 (Zegers-Hochschild et al. 2015).

O sucesso da técnica de ICSI pode ser associado, dentre outros fatores, à quantidade e à

qualidade de gametas e embriões obtidos (Varghese, Goldberg, and Agarwal 2007). Para que um

número adequado de oócitos seja recuperado, as pacientes são submetidas a protocolos de

estímulo ovariano controlado (EOC). Tendo como objetivo o bloqueio hipofisário, na grande

maioria dos casos as pacientes são tratadas com agonistas ou antagonistas do hormônio liberador

das gonadotrofinas (GnRH). O estímulo ovariano envolve a administração de gonadotrofinas, o

hormônio folículo estimulante (FSH) recombinante na maioria dos casos, as quais induzem o

desenvolvimento folicular sendo a maturação final dos múltiplos folículos induzida pela

administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Lopes, Iaconelli Jr, and Iaconelli

2011). Ao final do EOC, os folículos ovarianos são aspirados por punção guiada por ultrassom e

os oócitos recuperados a partir do fluido folicular. Após serem submetidos às técnicas de RHA os

oócitos fertilizados são incubados na maioria das vezes por 3 a 5 dias até que os embriões em

desenvolvimento sejam transferidos para o útero materno (Setti, Braga, and Figueira 2011, Braga,

Figueira, and Setti 2011, Maldonado and Iaconelli Jr 2011).

No início da aplicação das técnicas de RHA, baixas taxas de sucesso foram obtidas por

embrião transferido. Naquele momento, o aumento do número de embriões transferidos foi uma

estratégia aplicada com o objetivo de se obter um aumento significativo no valor destas taxas

(Edwards and Steptoe 1983). Ao longo dos anos, maiores taxas de implantação embrionária

foram obtidas, porém, acompanhadas de taxas elevadas de gestação múltipla relatadas até os dias

de hoje (Kupka et al. 2014, Zegers-Hochschild et al. 2015, CDC 2012). Com o objetivo de

diminuição dos índices de multiparidade algumas políticas de redução do número de embriões a

serem transferidos foram sugeridas (CFM 2010). Desta forma, a seleção do embrião com maior

probabilidade de implantação tornou-se um dos principais objetivos da RHA e foco de numerosos

estudos que serão abordados posteriormente de acordo com o dia de desenvolvimento

embrionário.

3

1.2) MORFOLOGIA OOCITÁRIA

Na rotina da maioria dos laboratórios de FIV a avaliação morfológica oocitária inicia-se

com classificação do grau de expansão das células do complexo cumulus-corona em

estereomicroscópio. Em oócitos maduros, o complexo apresenta-se expandido formando uma

camada gelatinosa ao redor do oócito, resultado da secreção de ácido hialurônico compondo uma

matriz que se interpõe às células, separando-as e conferindo a aparência descrita. Considerando-

se a remoção destas células em oócitos que serão submetidos à ICSI, a avaliação mais acurada em

microscópio invertido fornece informações a respeito do grau de maturação nuclear, sendo o 1o

corpúsculo polar (CP) marcador de maturidade em oócitos MII (Rienzi et al. 2012).

Posteriormente, todos os oócitos MII são submetidos à ICSI sendo o potencial de

desenvolvimento embrionário estimado exclusivamente com base na morfologia embrionária,

independente da qualidade do oócito a partir do qual este foi derivado. No entanto, a qualidade

oocitária pode ser considerada um fator limitante da fertilidade feminina, refletindo o potencial

de desenvolvimento intrínseco de um oócito, além de apresentar um papel crucial não apenas na

fertilização, mas também no desenvolvimento subsequente (Gilchrist, Lane, and Thompson 2008,

Figueira et al. 2010).

Uma complexa cascata de eventos de maturação que ocorrem durante o desenvolvimento

folicular confere ao oócito a capacidade de fertilização e o subsequente desenvolvimento

embrionário (Gougeon 1996, Gandolfi and Gandolfi 2001). A maturação oocitária envolve não

apenas alterações relacionadas a eventos nucleares, mas também alterações citoplasmáticas que

ocorrem de maneira coordenada, sendo que a maturidade nuclear não pode ser considerada

sinônimo de competência oocitária por não refletir a maturidade citoplasmática (Ebner, Moser,

and Tews 2006). A maturação citoplasmática envolve inúmeros processos moleculares e

estruturais responsáveis pela preparação do oócito para os eventos ligados à fertilização. As

mudanças estruturais do citoplasma são caracterizadas por uma extensa reorganização de

organelas intracelulares, destacando a reorganização de mitocôndrias visando o fornecimento de

um suprimento local de energia, a migração de grânulos corticais para a periferia do oolema para

bloqueio da polispermia e a movimentação do retículo endoplasmático (RE) antecipando a

liberação de Ca2+

que ocorre durante a fertilização (Eppig 1996, Krisher 2004). Desta forma,

deficiências no processo de maturação citoplasmática podem comprometer todos os processos

que preparam o oócito para ativação, adequada fertilização e desenvolvimento embrionário. Além

4

das deficiências do processo, a assincronia nos eventos de maturação nuclear e citoplasmática foi

associada à ocorrência de dismorfismos oocitários (Van Blerkom and Henry 1992). Oócitos

considerados morfologicamente normais devem apresentar: forma esférica; citoplasma

transparente moderadamente granular e livre de inclusões; pequeno espaço perivitelineo (EPV),

livre de granulações, contendo um único CP redondo e intacto e uma zona pelúcida (ZP) clara e

de espessura apropriada (Swain and Pool 2008). Usualmente, os dismorfismos oocitários podem

ser divididos em intra (IC) e extracitoplasmáticos (EC). Os dismorfismos IC envolvem a presença

de granulações e/ou inclusões citoplasmáticas como corpos refráteis, vacúolos (VAC) e/ou

agregados do retículo endoplasmático liso (REL). Os dismorfismos EC envolvem anormalidades

na forma do oócito, anormalidades no EPV como a presença de grânulos corticais, anormalidades

na ZP incluindo espessura e coloração e/ou anormalidades no CP como alteração do seu tamanho

(Veeck 1988).

Apesar de identificadas as alterações que podem comprometer a competência oocitária,

pouco se sabe em relação às suas origens, a quando e como estas alterações podem afetar

processos do desenvolvimento normal e ao fato da possibilidade de seus efeitos envolverem a

alteração da expressão de vias de sinalização regulatórias (Embryology 2011).

As variações morfológicas oocitárias podem ser resultado de fatores intrínsecos como a

idade da paciente, e/ou de fatores extrínsecos associados, por exemplo, aos protocolos de EOC e

a resposta da paciente ao tratamento (Figueira et al. 2010). A maioria dos oócitos recuperados

após EOC apresentam uma ou mais variações dos critérios morfológicos (Balaban and Urman

2006, Ebner, Moser, and Tews 2006, Rienzi et al. 2008), sendo o mesmo observado para

pacientes férteis doadoras de oócitos (Ten et al. 2007).

Relatos do consenso de Istambul de avaliação embrionária (Embryology 2011) sugerem

que dismorfismos EC são variações fenotípicas na maioria das vezes relacionadas às condições

de cultivo ou à idade da paciente. Por outro lado, a presença de agregados de REL foi associada

ao comprometimento da competência oocitária e relacionada a perdas fetais e distúrbios de

imprinting (Otsuki et al. 2004, Ebner, Moser, et al. 2008). De modo geral, a presença dos

dismorfismos IC e EC e sua associação com a competência oocitária e com o comprometimento

do desenvolvimento embrionário é controversa, conforme apontado em estudos recentes de

revisão sistemática e metanálise (Rienzi, Vajta, and Ubaldi 2011, Setti et al. 2011).

5

1.2.1) Dismorfismos intracitoplasmáticos

1.2.1.1) Granulação

O aumento da granulação do citoplasma pode ocorrer de forma homogênea, afetando todo

o citoplasma do gameta, ou de localização centralizada, sendo esta última associada a um pior

prognóstico (Kahraman et al. 2000, Meriano et al. 2004). Além da granulação, alterações na

viscosidade e fluidez do citoplasma também foram descritas (Ebner et al. 2001). A fluidez do

citoplasma pode ser avaliada de acordo com a persistência do cone de injeção formado no

citoplasma do oócito decorrente entrada da micropipeta de ICSI no momento da injeção, reflexo

da deficiência na textura do citoplasmática.

1.2.1.2) Inclusões

Numerosos tipos de inclusões citoplasmáticas podem ser observados no citoplasma de

oócitos avaliados em microscopia de luz. Os corpos refráteis, assim chamados devido sua

aparência quando identificados em microscopia de luz, são estruturas de aproximadamente 10μm

de diâmetro, compostas de material lipídico e grânulos densos. Os vacúolos (VAC) são inclusões

citoplasmáticas rodeadas por membrana, podendo variar em número e tamanho. Acredita-se que

estes possam surgir espontaneamente ou por fusão de vesículas derivadas do REL e/ou do

complexo de Golgi (Van Blerkom 1990, El Shafie et al. 2000). Por outro lado, os mecanismos

associados com o surgimento dos agregados de REL são desconhecidos. A distinção entre estas

estruturas é dada pelo fato de que os agregados de REL são estruturas translúcidas não

delimitadas por membrana (Otsuki et al. 2004, Ebner, Moser, and Tews 2006, Rienzi et al. 2012).

Estudos sugerem que a presença de algumas inclusões citoplasmáticas, como os corpos

refráteis, não exerce impacto na qualidade do oócito. Por outro lado, a presença de VAC e

agregados do REL foram associados ao comprometimento da competência de oócitos humanos

(Balaban et al. 1998, Ebner et al. 2001, Ebner, Moser, and Tews 2006).

Ainda não foi elucidado de que modo as inclusões citoplasmáticas ou deficiências na

fluidez do citoplasma afetariam a viabilidade oocitária. Estudos sugerem que os efeitos estariam

relacionados à função do citoesqueleto e a estrutura do fuso meiótico (Van Blerkom 1990, Collas

6

and Poccia 1998, Ebner et al. 2001). Desta forma, defeitos no citoplasma oocitário afetariam a

formação e o posicionamento dos PN, dado que o citoesqueleto poderia não se organizar

perfeitamente, comprometendo o posicionamento correto do fuso meiótico durante a retomada da

meiose. Além disso, a cascata de eventos da fertilização envolve a liberação de cálcio e grânulos

corticais, síntese de proteína e alterações do citoesqueleto (Dozortsev et al. 1995). Assim,

considerando a importância dos fatores presentes no ooplasma neste processo, fica clara a

possibilidade de comprometimento da fertilização por anormalidades oocitárias citoplasmáticas.

Por outro lado, relatos sugerem que as perdas fetais e as desordens de imprinting associadas à

presença dos agregados de REL estão associadas aos altos níveis de cálcio observados durante a

ativação oocitária, além do fato de os níveis serem mantidos elevados por maior período de

tempo (Otsuki et al. 2004, Akarsu et al. 2009).

1.2.2) Dismorfismos extracitoplasmáticos

1.2.2.1) Zona pelúcida (ZP)

A ZP é uma matriz multi-laminar composta por glicoproteínas, polissacarídeos e proteínas

específicas, com aproxidamente 15-20 µm de espessura, que envolve o oócito e o embrião no

início do desenvolvimento (Pelletier, Keefe, and Trimarchi 2004). A estrutura da zona pelúcida é

formada durante a maturação folicular pelo oócito (Nikas et al. 1994) e, em parte, pelas células da

granulosa (Gook et al. 2004). A formação e organização das proteínas específicas da ZP durante a

maturação oocitária pode refletir a competência oocitária (Shen et al. 2005, Madaschi et al. 2009,

Montag et al. 2011). Segundo consenso, não há benefício na determinação da espessura da zona

pelúcida em microscopia de luz. Porém, considerando-se a possibilidade de efeitos paciente-

específico sugere-se o registro de alterações na espessura ou coloração dessa estrutura

(Embryology 2011).

1.2.2.2) Espaço perivitelineo (EPV)

O EPV é uma estrutura fluida que se encontra entre a membrana plasmática do oócito,

chamada oolema, e a ZP. O EPV pode variar em tamanho e conteúdo, sendo o tamanho do EPV

7

associado à fase de maturação oocitária. Nos oócitos maduros o EPV apresenta seu maior grau de

expansão quando comparado aos oócitos imaturos (Mikkelsen and Lindenberg 2001).

Duas hipóteses foram propostas para explicar a presença de grânulos no EPV. A primeira

hipótese é derivada de dados de microscopia eletrônica indicando a presença de uma matriz

extracelular formada por grânulos e filamentos no espaço entre o oolema e a ZP (Dandekar and

Talbot 1992). A segunda baseia-se na existência de processos das células da corona que

atravessam a ZP do oócito em PI. Acredita-se que após a remoção desses processos, alguns

resquícios permaneçam no EPV (Sathananthan 1997). A presença de grânulos parece estar

também associada à dose de gonadotrofina administrada durante o EOC (Hassan-Ali et al. 1998,

Farhi et al. 2002).

1.2.2.3) Corpúsculo polar (CP)

O 1o CP é uma célula filha, contendo 23 cromossomos e 46 cromátides, gerada após a

telófase da primeira divisão meiótica. Alguns critérios morfológicos do 1o CP, como a forma, o

tamanho e a integridade podem ser utilizados na predição da qualidade do oócito (Ebner, Moser,

and Tews 2006). Considerando-se a dependência do fator tempo, postula-se que a morfologia do

1o CP possa fornecer informações a respeito da idade pós-ovulatória do oócito. Apesar de alguns

CP permanecerem intactos por mais de 20h após a ovulação, em geral após este intervalo estas

estruturas apresentam sinais de fragmentação e degeneração (Ortiz, Lucero, and Croxatto 1983).

O aumento de tamanho do 1o CP pode ser considerado o mais importante dismorfismos

associados ao CP, estando relacionado ao aumento da incidência de aneuploidiais no oócitos

(Veeck 1988, Fancsovits et al. 2006).

1.2.2.4) Forma

Alterações na forma dos oócitos são acompanhadas de irregularidades na forma e

composição da ZP. Dois possíveis mecanismos foram sugeridos para a ocorrência de oócitos com

alteração de forma: o estresse mecânico durante o processo da punção folicular e/ou denudação

(Shen et al. 2005), deformando tanto o citoplasma quanto a ZP do oócito (com possível

recuperação de forma em 24h) e uma anomalia pré-existente gerada durante a maturação

8

intrafolicular (Ebner, Shebl, et al. 2008). A diminuição dos pontos de contato célula-célula em

embriões alongados, requisito essencial para o desenvolvimento embrionário e formação da

blastocele, justificaria o impacto negativo deste dismorfismo na competência oocitária (Suzuki et

al. 1995, Ebner, Moser, and Tews 2004).

1.3) MORFOLOGIA EMBRIONÁRIA

Apesar dos avanços tecnológicos significativos da medicina reprodutiva baseados no

advento da era do “OMICS” (conjunto de ferramentas de análise genômica, transcriptômica e

proteômica) e do estudo da cinética embrionária por meio da tecnologia de time-lapse, a maioria

dos laboratórios de Fertilização in vitro de todo o mundo selecionam para transferência embriões

humanos cultivados in vitro baseados em parâmetros morfológicos avaliados pontualmente em

microscopia de luz.

Registros de imagem em time-lapse foram rapidamente integrados a laboratórios de FIV

nos últimos cinco anos (Herrero and Meseguer 2013). Os sistemas de monitoramento time-lapse

registram imagens digitais dos embriões em cultivo em intervalos de tempo pré-determinados. Os

sistemas podem ser instalados em incubadoras convencionais de cultivo embrionário ou podem

ser adquiridos sistemas combinados de incubadoras time-lapse. As imagens obtidas são

compiladas por sistemas computacionais especializados que fornecem uma sequência em time-

lapse de todo o desenvolvimento embrionário, desta forma excluindo a necessidade de retirada do

embrião da incubadora pelo embriologista para avaliação de sua morfologia. A aquisição desta

tecnologia envolve investimento significativo sendo três as principais tecnologias

disponibilizadas no mercado: Embryoscope® (Fertilitech), Primo Vision (Vitrolife) e Eeva

(Auxogyn, Inc.) (Kovacs 2014). As vantagens propostas como, por exemplo, a possibilidade de

cultivo ininterrupto, a otimização da documentação dos procedimentos, o controle de qualidade e,

especialmente, a introdução de novos marcadores de qualidade embrionária, tem estimulado o

interesse pela tecnologia (Wong et al. 2013). Um grande número de publicações tem sugerido

que o intervalo de tempo no desenvolvimento difere entre embriões viáveis e não viáveis

(Herrero and Meseguer 2013), porém poucos relatos disponibilizam modelos aplicáveis de

seleção embrionária (Conaghan et al. 2013, Meseguer et al. 2011). Além disso, estudos

multicêntricos têm demonstrado as limitações destes modelos quando aplicados por diferentes

9

clínicas (Kirkegaard et al. 2014). Desta forma, evidências a respeito do aumento significativo das

taxas de nascidos vivos e da efetividade de custo da implementação desta tecnologia em

laboratórios de FIV tem sido questionada (Armstrong et al. 2015, Kirkegaard et al. 2015).

A metabolômica e a proteômica são, dentre as tecnologias “OMICS”, as plataformas mais

promissoras dado seu caráter não invasivo de avaliação da qualidade embrionária. Na

metabolômica é possível mensurar o consumo e a produção de múltiplos substratos pelo embrião

analisando o meio de cultivo ao qual o embrião foi exposto durante o cultivo in vitro (Tachibana

2014). O proteoma representa todas as proteínas responsáveis pelas funções celulares, traduzidas

a partir do transcriptoma das células, sendo diretamente influenciado pelo estado fisiológico da

célula em determinado momento (Dominguez, Lopes, and Torres 2007). A busca por marcadores

de viabilidade embrionária tem como foco o secretoma proteômico, definido pelas proteínas

produzidas pelo embrião e secretadas para o meio de cultivo (Katz-Jaffe et al. 2009). Desta

forma, a caracterização do metaboloma e do proteoma embrionário permite um maior

entendimento dos estágios iniciais da embriogênese, além da possibilidade de refletir a

competência embrionária resultando em aumento das taxas de sucesso de tratamentos de RHA

(Cortezzi et al. 2011, Cortezzi et al. 2013). No entanto, apesar dos resultados no campo da

pesquisa, a aplicação clínica e a disponibilização de técnicas rotineiramente aplicáveis ainda

estão sob investigação e requerem validação (Krisher, Schoolcraft, and Katz-Jaffe 2015).

Diversos aspectos morfológicos avaliados em microscopia de luz têm sido apontados

como preditivos do potencial de implantação embrionária incluindo aqueles relacionados às

etapas iniciais do desenvolvimento como, por exemplo, a morfologia pronuclear e as primeiras

clivagens embrionárias. De modo geral, independente do dia da transferência, tais critérios

parecem apresentar valor preditivo de viabilidade embrionária quando avaliados individualmente

ou coletivamente (Embryology 2011). Aspectos morfológicos avaliados no dia da transferência

embrionária têm sido priorizados, seja esta realizada em dia 3 ou 5 do desenvolvimento in vitro

(Racowsky et al. 2009, Racowsky et al. 2011, Van Royen et al. 2001, Vernon et al. 2009). A

seleção embrionária em dia 3 envolve basicamente a avaliação do número de células e ritmo de

clivagem, a avaliação quantitativa e qualitativa da fragmentação citoplasmática quando presente,

a avaliação da simetria entre os blastômeros resultantes das primeiras clivagens e a avaliação da

incidência de blastômeros multinucleados e anucleados. Por outro lado, os principais parâmetros

avaliados na seleção de embriões em estágio de blastocisto (dia 5 ou 6 do desenvolvimento)

10

incluem grau de expansão da blastocele e padrão de organização da massa celular interna (MCI) e

do trofoectoderma (TRF) (Embryology 2011).

1.3.1) Morfologia pronuclear

A morfologia pronuclear está diretamente relacionada à qualidade dos gametas, sendo a

etapa inicial na qual a normalidade destes pode ser avaliada fornecendo informações

complementares para a seleção embrionária nos estágios iniciais da clivagem. Um número

significativo de modelos tem sido proposto para classificação de embriões em estágio de

pronúcleo. Principalmente devido sua clareza e objetividade, os critérios de classificação

pronuclear descritos previamente por Tesarik & Greco (1999) e Scott et al. (2000) são os mais

utilizados até os dias de hoje. Os parâmetros morfológicos avaliados neste momento estão

relacionados às inúmeras transformações observadas durante a nucleogênese em humanos. A

avaliação da fertilização costuma ser direta, sendo um oócito considerado fertilizado aquele que

apresenta dois pronúcleos (PN) e dois corpúsculos polares (CP). No entanto, esta definição de

fertilização é um registro pontual de uma continuidade de eventos previamente ilustrados por

meio de time-lapse (Payne et al. 1997). Além disso, a definição de fertilização associada à

presença de dois corpúsculos polares é questionável dados que estes podem fragmentar e

desintegrar antes do intervalo de avaliação da fertilização (Embryology 2011).

1.3.1.1) Pronúcleo

O padrão normal para os PN feminino e masculino durante a avaliação do zigoto inclui

semelhança de tamanho, justaposição e posicionamento central em relação ao citoplasma (Payne

et al. 1997). O tamanho dos PN pode diferir, sendo o masculino o de maior diâmetro. Porém,

diferenças de 4 μm estão associadas ao comprometimento do desenvolvimento embrionário e a

maior incidência de aneuploidias (Munné & Cohen 1998, Sadowy et al. 1998, Gámiz et al. 2003).

A posição periférica dos PN ou a não justaposição pode indicar falha nos mecanismos do

processo de fertilização como, por exemplo, a formação do áster e dos microtúbulos (Simerly et

al. 1995, Gianaroli et al. 2003, Barroso et al. 2009).

11

1.3.1.2) Corpos Precursores de Nucléolos (CPN)

Presentes nos núcleos de todas as células em atividade mitótica, os nucléolos são sítios

nos quais os genes ribossomais são transcritos sendo, portanto, essenciais para síntese protéica. O

desenvolvimento dos nucléolos ocorre em áreas denominadas regiões organizadoras de nucléolos

(RON), localizadas em pontos específicos dos cromossomos nos quais estão localizados os genes

que codificam para os RNA ribossomais (rRNA). Os nucléolos são caracterizados por um

componente fibrilar denso, um centro fibrilar e um componente granular (Goessens 1984).

Oócitos de folículos antrais possuem nucléolos em atividade de síntese de rRNA e proteínas para

o crescimento oocitário. Durante a maturação oocitária, a síntese é interrompida e o nucléolo

desaparece. Desta forma, oócitos em Metafáse II (MII) e no estágio pronuclear estão

caraterizados apenas pela porção do centro fibrilar, sendo denominados corpos precursores de

nucléolos (CPN) (Tesarik & Kopecny 1989).

A nucleogênese inclui o crescimento, organização e fusão dos corpos precursores de

nucléolos (CPN), eventos dependentes da atividade transcricional pronuclear e da presença de

fatores do ooplasma relacionados à maturação oocitária. De modo geral, a fase inicial do

desenvolvimento pronuclear é caracterizada por um número elevado de corpos precursores de

nucléolos (CPN) de tamanho relativamente pequeno, distribuídos randomicamente em cada um

dos PN. Por outro lado, a fase mais tardia do desenvolvimento pronuclear é caracterizada por um

pequeno número de CPN de tamanho relativamente maior com distribuição polarizada sendo

observado acúmulo próximo ao local onde o PN faz contato com o outro. Tais considerações

apontam o desenvolvimento dos CPN um marcador potencial numa avaliação morfológica não

invasiva da qualidade do zigoto (Payne et al. 1997, Tesarik & Kopecny 1989, 1990).

Alterações do padrão dos CPN de embriões em estágio de PN resultam em efeitos

significativos no desenvolvimento embrionário dado que a falta de polarização, fusão e o

restabelecimento de um nucléolo funcional apresenta um efeito negativo na habilidade de

crescimento e função celular (Sadowy et al. 1998, Scott et al. 2000, Scott 2003, Zollner et al.

2002).

12

1.3.1.3) Halo Citoplasmático

Após a fertilização é possível observar um padrão diferencial de distribuição do

citoplasma no zigoto. A reorganização do citoplasma é dependente de processos da fertilização

que resultam em oscilações de cálcio caracterizadas por ondas coordenadas temporalmente e

espacialmente no citoplasma do oócito. A densa área observada próxima aos PN está associada

com a rotação e movimento do citoplasma bem como com a distribuição diferencial de organelas

e mitocôndrias, resultando na formação de um halo menos denso na periferia (Payne et al. 1997,

Bavister & Squirrell 2000). A distribuição diferencial das mitocôndrias por sua vez está

relacionada à concentração diferencial de cálcio no citoplasma afetando a produção de ATP e a

necessidade diferencial de energia pelo zigoto (Motta, Nottola, & Makabe 1997).

Anormalidades no processo de fertilização podem resultar na não formação do halo

citoplasmático com consequências para o desenvolvimento embrionário (Scott & Smith 1998,

Scott 2003). A localização das mitocôndrias em uma região diferente da periferia pronuclear

pode implicar na distribuição desigual destas para as células-filha de embriões em estágio de

clivagem, resultando em depleção da produção de ATP em alguns blastômeros. A ausência de

rotação do PN paterno, diretamente relacionada com a formação do halo citoplasmático, implica

no alinhamento anormal da cromatina e/ou no posicionamento inadequado dos centrossomos,

resultando em desenvolvimento embrionário anormal. Além disso, a ausência de rotação e o

resultado da não polarização do citoplasma podem implicar em distribuição incorreta de produtos

gênicos ao longo das sucessivas clivagens (Van Blerkom, Davis, & Alexander 2000).

1.3.2) Classificação embrionária nos dias 2 e 3 do desenvolvimento

Os critérios mais utilizados na seleção de embriões a serem transferidos estão baseados na

morfologia embrionária nos dias 2 e 3 do desenvolvimento. De modo geral, a avaliação inclui

número de células e ritmo de clivagem, simetria de blastômeros, fragmentação citoplasmática,

multinucleação e ausência de núcleo nos blastômeros.

13

1.3.2.1) Número de células e ritmo de clivagem

A ocorrência de divisão celular pode ser considerada o mais importante indicador de

viabilidade embrionária. Espera-se observar embriões com 4 células em dia 2 (44h+1) e com 8

células em dia 3 (68h+1), considerando-se o intervalo de tempo após a ICSI sugerido para

avaliação dos embriões (Embryology 2011).

Além da importância do número de células, relatos prévios demonstraram a existência de

ritmos de clivagem ideais. Diversos estudos concluíram que tanto o ritmo lento quanto o

acelerado de clivagem resultam em comprometimento significativo do desenvolvimento

(Giorgetti et al. 1995, Ziebe et al. 1997, Van Royen et al. 1999). Nestes estudos, quando

considerado como ritmo de clivagem ideal a ocorrência de embriões com 8 células no dia 3

provenientes de embriões com 4 células no dia 2, a transferência resultou em taxas de

implantação significativamente maiores. Segundo o consenso, embriões com ritmo de clivagem

lento ou rápido apresentam reduzido potencial de implantação (Embryology 2011).

A correlação entre o ritmo de clivagem e a constituição cromossômica do embrião foi

previamente investigada (Almeida & Bolton 1996, Magli et al. 2007). O ritmo lento bem como

acelerado de clivagem tem sido relacionado ao aumento da incidência de anormalidades

cromossômicas, incluindo aneuploidias, mosaicismo e poliploidias.

1.3.2.2) Simetria de blastômeros

Devemos destacar que para embriões em estágio de 2, 4 e 8 células a simetria de

blastômeros é representada pela observação de blastômeros de tamanho idêntico. Por outro lado,

para embriões em estágio de 3, 5, 6 e 7 células espera-se observar diferentes tamanhos celulares

como indicativo de clivagem normal. Por exemplo, um embrião de 7 células de clivagem normal

deve apresentar 1 célula de maior tamanho e 6 menores, sendo que apenas após a divisão da

célula de maior tamanho devem ser observados 8 blastômeros de tamanho semelhante. Neste

caso, a diferença de tamanho entre os blastômeros é apenas indicativa de assincronia no processo

de clivagem das células (a célula maior de um embrião de 7 células encontra-se em ritmo de

clivagem mais lento que as demais) (Puissant et al. 1987).

14

Apesar de subestimada, a ocorrência de irregularidades na clivagem celular é considerada

indicador clássico de qualidade embrionária e capacidade de desenvolvimento, afetando

negativamente o potencial de implantação embrionário (Ziebe et al. 1997, Hardarson et al. 2001).

Além da possível distribuição desigual de proteínas, mRNA, mitocôndrias e outras organelas

celulares entre as duas células-filha a clivagem desigual pode também estar relacionada à

distribuição desigual de material genético (Antczak & Van Blerkom 1999). Um aumento

significativo na incidência de anomalias cromossômicas foi observado em embriões que

apresentaram blastômeros assimétricos quando comparado a embriões de blastômeros simétricos

ou semelhantes (Hardarson et al. 2001).

1.3.2.3) Fragmentação citoplasmática

A fragmentação pode ser definida como uma estrutura extracelular, anuclear, de conteúdo

citoplasmático delimitado por membrana (Alikani et al. 1999). A incidência da fragmentação é

difícil de ser avaliada dado que é necessário inicialmente diferenciar os fragmentos das células, e

então estimar a proporção relativa do embrião ocupada por estes fragmentos (Embryology 2011).

Johansson, Hardarson, & Lundin 2003 definiram os fragmentos como sendo <45 μm em diâmetro

para embriões em dia 2, e <40 μm em diâmetro para embriões em dia 3. Apesar das causas exatas

da fragmentação não estarem estabelecidas, alguns processos celulares parecem estar envolvidos

como apoptose, deficiência de ATP no embrião, perda de blastômero por apoptose devido

alteração cromossômica, ou meramente fragmentos anucleados resultantes da clivagem que serão

posteriormente reabsorvidos (Hardy 1999, Chavez et al. 2012, Stensen et al. 2015).

A classificação quantitativa da porcentagem do volume do embrião que é ocupada por

fragmentos citoplasmáticos anucleados pode ser associada a uma classificação qualitativa dos

fragmentos em cinco grupos (I a V) de acordo com seu tamanho e distribuição (Tab. 1) (Alikani

et al. 1999).

15

TABELA 1: Modelo de classificação da fragmentação embrionária humana segundo Alikani,

1999.

Tipo I Volume mínimo, fragmentos associados a um blastômero

Tipo IIFragmentos localizados e predominantemente no espaço

perivitelínico

Tipo IIIFragmentos pequenos dispersos entre os blastômeros, no

espaço perivitelínico ou em ambos

Tipo IVFragmentos grandes semelhantes a blastômeros, distribuídos

randomicamente, associados a blastômeros desiguais

Tipo VFragmentos necróticos, granulosidade e contração

citoplasmática característica

Considerando embriões com baixa porcentagem de fragmentação, a avaliação do tamanho

e organização dos fragmentos passa a ser um parâmetro crítico a ser considerado. No entanto, o

padrão de fragmentação não pode ser considerado de fácil avaliação dado a natureza não estática

de tais estruturas, além da possibilidade de serem reabsorvidas ou sofrerem lise durante o

desenvolvimento embrionário (Embryology 2011).

Independente do mecanismo ou da causa, a fragmentação embrionária parece estar

diretamente relacionada com o comprometimento da viabilidade embrionária sendo que a

fragmentação tipo IV apresenta um efeito negativo mesmo quando compromete um volume

restrito do embrião (Alikani et al. 1999). Atualmente, o valor da porcentagem do volume do

embrião comprometido pela fragmentação a partir do qual se observa uma importância clínica

varia entre os estudos (10-20%) (Alikani et al. 2000, Van Royen et al. 2001). A relação positiva

da ocorrência de fragmentação com a incidência de mosaicismo foi previamente observada

(Munné & Cohen 1998, Ziebe et al. 2003, Munné 2006, Magli et al. 2007), sugerindo que os

fragmentos possam conter pedaços cromossômicos resultados de erros no funcionamento dos

fusos.

16

1.3.2.4) Multinucleação

Um blastômero contendo mais de um único núcleo em interfase é definido como

multinucleado (Embryology 2011). Os relatos da incidência da multinucleação variam

consideravelmente. Estudos relatam que a multinucleação incide em cerca de 30% dos embriões

produzidos in vitro, sendo que 17% a 87% dos ciclos apresentam pelo menos um embrião

multinucleado (Balakier & Cadesky 1997, Jackson et al. 1998, Van Royen et al. 2003, Rienzi et

al. 2005). Apesar de a literatura que descreve a multinucleação em embriões ser bastante extensa,

a razão da sua ocorrência ainda não foi esclarecida. Os possíveis mecanismos descritos para a

ocorrência de multinucleação incluem a cariocinese na ausência da citocinese, a fragmentação

parcial do núcleo ou a migração anormal dos cromossomos durante a anáfase da mitose

(Pickering et al. 1995, Staessen & Van Steirteghem 1998, Munné & Cohen 1993).

Especula-se ainda que a multinucleação possa ser induzida pelo protocolo de estimulação

ovariana controlada e por condições adversas de cultivo embrionário. A utilização de altas doses

de gonadotrofina implica em rápido crescimento folicular na ausência de vascularização

adequada resultando em hipóxia, ou seja, suprimento inadequado de oxigênio para o oócito em

processo de maturação (Van Blerkom, Antczak, & Schrader 1997). Além disso, esse tipo de

protocolo de estímulo está associado ao recrutamento de uma população heterogênea de folículos

aumentando a possibilidade da recuperação de oócitos de competência comprometida (Jackson et

al. 1998, Figueira et al. 2010). Estudos em humanos demonstraram que os fusos meióticos e

mitóticos são estruturas sensíveis a oscilações de temperatura sendo que os microtúbulos sofrem

despolimerização quando em situação de estresse provocada por baixas temperaturas, podendo

resultar em embriões cromossomicamente anormais (Pickering et al. 1990). Considerando-se a

fragilidade das estruturas essenciais para a correta divisão celular, sugere-se que as causas da

multinucleação possam estar associadas a oscilações de temperatura e pH durante o cultivo de

gametas e embriões (Pickering et al. 1990, Pickering et al. 1995, Munné & Cohen 1993).

O potencial negativo da ocorrência de multinucleação no desenvolvimento embrionário

pode ser relacionado a erros na replicação e segregação cromossômica, resultando em redução

significativa das taxas de sucesso após transferência de embriões multinucleados (Jackson et al.

1998, Pelinck et al. 1998, Van Royen et al. 2003). Considerando os núcleos de um blastômero

multinucleado como entidades separadas, espera-se que a replicação e o condensamento da

17

cromatina ocorram de forma independente, resultando em duas estruturas cromossômicas em um

único fuso mitótico e na distribuição cromossômica anormal nas células-filha (Hardarson et al.

2001, Meriano et al. 2004).

1.3.3) Classificação embrionária nos dias 5 e 6 do desenvolvimento

A significância da avaliação de embriões no estágio pós-compactação relaciona-se ao fato

de ser realizada após ativação do genoma embrionário. Neste estágio, o alto grau de diferenciação

celular e a ativação do genoma embrionário podem fornecer informações importantes referentes à

viabilidade embrionária (Embryology 2011). As variações morfológicas observadas em cultivos

prolongados envolvem estágios de compactação e blastulação, sendo considerado como padrão

de normalidade a compactação completa no dia 4 de desenvolvimento e a blastulação,

rompimento da zona pelúcida e a eclosão do blastocisto entre os dias 5 e 6. Após 120h (+3) do

momento do procedimento de ICSI, o blastocisto deve apresentar uma blastocele definida

ocupando pelo menos metade do volume do embrião, uma distinta massa celular interna (MCI)

destacando-se como uma saliência na cavidade e um anel formado por células do trofoectoderme

(TRF) de tamanho similar distribuídas uniformemente de modo a formar um epitélio coesivo

(Gardner DK 1999, Gardner & Schoolcraft 1999).

A relação entre a morfologia do blastocisto e o subseqüente potencial de implantação tem

sido investigada de acordo com critérios variados. Dois principais sistemas de classificação

morfológica de blastocistos considerando expansão da blastocele e características da MCI e do

TRF foram desenvolvidos com o objetivo de predizer o potencial de implantação (Gardner &

Schoolcraft 1999, Dokras, Sargent, & Barlow 1993). O sistema de classificação de blastocisto

descrito por Gardner é o mais utilizado até os dias de hoje (Tab. 2).

18

TABELA 2: Modelo de classificação de blastocistos humanos cultivados in vitro segundo

Gardner & Schoolcraft, 1999.

Grau 1Blastocsito jovem, blastocele ocupa menos de 50% do volume

do embrião

Grau 2 Blastocele ocupa metade ou mais do volume do embrião

Grau 3Blastocisto completo, blastocele ocupa todo o volume do

embrião

Grau 4 Blastocisto expandido, zona pelúcida de espessura fina

Grau 5Blastocisto com parte do trofoectoderme eclodindo da zona

pelúcida

Grau 6 Blastocisto com eclosão completa da zona pelúcida

Grau A Muitas células fortemente agrupadas

Grau B Algumas células dispersas

Grau C Células escassas

Grau A Muitas células formando um epitélio coesivo

Grau B Poucas células formando um frouxo epitélio

Grau C Células escassas e grandes

CLASSIFICAÇÃO DO BLASTOCISTO

CLASSIFICAÇÃO DA MASSA CELULAR INTERNA

(para embriões de grau 3-6)

CLASSIFICAÇÃO DO TROFOECTODERME

(para embriões de grau 3-6)

CLASSIFICAÇÃO DO BLASTOCISTO

Grau de expansão da blastocele

CLASSIFICAÇÃO DA MASSA CELULAR INTERNA (MCI)

Para blastocistos de GRAU 3-6

CLASSIFICAÇÃO DO TROFOECTODERMA (TRF)

Para blastocistos de GRAU 3-6

Blastocisto

19

1.4) JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA DO ESTUDO

A subjetividade da avaliação morfológica, bem como a ampla diversidade de sistemas de

classificação embrionária aplicados por diferentes clínicas, implica em resultados contraditórios

tornando extremamente difícil a implementação de um consenso do valor preditivo dos diferentes

parâmetros morfológicos avaliados (Rienzi et al. 2005, Racowsky et al. 2010, Racowsky et al.

2011). A otimização dos critérios morfológicos a serem avaliados, bem como a determinação do

valor preditivo de cada um destes critérios, representa um grande potencial de aumento

significativo das taxas de sucesso do tratamento além de possibilitar a redução da incidência de

gestações múltiplas por assegurar que as taxas de gestação não estariam comprometidas pela

transferência de um menor número de embriões.

A importância da necessidade de padronização da avaliação morfológica embrionária é

atualmente foco da comunidade internacional. O recente encontro de membros da associação

internacional de embriologistas ALPHA e do grupo de embriologia da ESHRE teve como

objetivo o estabelecimentos de critérios e terminologias a serem utilizados na classificação de

oócitos, zigotos e embriões que pudessem ser facilmente aplicados na rotina (Embryology 2011).

No entanto, a implementação dos pontos abordados neste consenso por laboratórios de FIV em

todo o mundo ainda é opcional, não sendo abrangida nos relatos de dados anuais da sociedade na

qual o laboratório está inserido. Em 2007, dados de morfologia embrionária foram inseridos nos

bancos de dados do Sistema de Relato dos Resultados Clínicos da Sociedade Nacional Americana

para Tecnologia Reprodutiva Assistida (SART CORS) após estabelecimento de um sistema de

avaliação embrionária. Os dados foram coletados por laboratórios de forma voluntária e avaliados

de forma retrospectiva para validação do sistema com resultados promissores (Racowsky et al.

2011). Porém, dados de morfologia embrionária ainda não fazem parte dos bancos de dados do

SART. No Brasil, centros de fertilização assistida acreditados pela REDLARA relatam

anualmente dados de todos os procedimentos realizados, porém nenhum dado de morfologia

embrionária é incluído ou abordado pelo RLA.

Com relação ao estabelecimento do valor preditivo dos critérios, muitos têm sido

correlacionados com o desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto e com o

potencial de implantação dos blastocisto obtidos, conforme abordado no tópico Introdução. O

cultivo embrionário até o estágio de blastocisto ofereceria algumas destas vantagens quando

comparado à transferência de embriões em estágio de clivagem incluindo: (i) maiores taxas de

20

implantação, (ii) oportunidade de melhor seleção de embriões viáveis para transferência, (iii)

redução potencial do número de embriões transferidos, (iv) melhor sincronização temporal entre

o embrião e o endométrio no momento da transferência embrionária (Alper et al. 2001, Gardner,

Lane, & Schoolcraft 2000, Gardner & Balaban 2006, Technology 2013). Porém, o desafio atual

seria determinar de forma prospectiva, para cada paciente, se este tipo de estratégia implicaria em

uma maior chance de gestação em comparação com a transferência de embriões em estágio de

clivagem. Tal desafio torna-se complicado ao considerarmos nossa inabilidade em predizer se (ou

quais) embriões em estágio de clivagem irão formar blastocistos viáveis. Na tentativa de

estabelecimento dos valores preditivos dos critérios de morfologia embrionária poucos estudos

tiveram como foco determinar a interdependência dos parâmetros avaliados ou determinar o peso

relativo destes parâmetros em predizer o potencial de desenvolvimento ou implantação

(Embryology 2011). Do mesmo modo, modelos preditivos previamente estabelecidos com o

objetivo de classificar os embriões de acordo com seu potencial de implantação foram baseados

em um número limitado de critérios avaliados e de dados disponíveis, sendo ainda necessários

estudos de validação (Giorgetti et al. 1995, Holte et al. 2007, Racowsky et al. 2009, Racowsky et

al. 2011, Steer et al. 1992, Van Royen et al. 1999, Ziebe et al. 1997).

Desta forma, a determinação de quais critérios morfológicos avaliados no início do

desenvolvimento embrionário seriam capazes de predizer qual a probabilidade de embriões em

estágio de clivagem formarem blastocistos viáveis e, ainda, a determinação de quais destes

critérios seriam capazes de auxiliar na seleção do blastocisto a ser transferido seriam ferramentas

importantes a serem aplicadas com o objetivo de definir quais os ciclos se beneficiariam do

cultivo prolongado com a obtenção de maiores chances de implantação.

21

2) OBJETIVO GERAL

Avaliar o valor preditivo de parâmetros morfológicos oocitários e embrionários na

determinação da viabilidade de embriões humanos cultivados in vitro provenientes de casais

inférteis submetidos a tratamentos de RHA.

2.1) OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar o valor preditivo de parâmetros morfológicos oocitários e embrionários,

avaliados nos dias 0, 1, 2 e 3 do desenvolvimento, na obtenção de embriões em estágio de

blastocisto quando cultivados até o dia 5 do desenvolvimento.

Determinar o valor preditivo de parâmetros morfológicos oocitários e embrionários,

avaliados nos dias 0, 1, 2 e 3 do desenvolvimento, no potencial de implantação de

embriões em estágio de blastocisto após transferência embrionária.

22

3) CASUÍSTICA E MÉTODO

3.1) PACIENTES

O estudo transversal incluiu dados de ciclos 1521 pacientes submetidas a procedimentos

de RHA no Centro de Fertilização Assistida – Fertility no período de Julho/2011 a Junho/2014.

Critérios de inclusão

Foram incluídos no estudo ciclos de pacientes que iniciaram o tratamento neste período e

que apresentaram os seguintes critérios:

Todos os embriões foram mantidos em cultivo até o dia 5 do desenvolvimento;

A transferência embrionária foi realizada no ciclo no qual a paciente foi submetida ao

EOC;

Os embriões foram transferidos em dia 5 do desenvolvimento.

Critérios de exclusão

Os seguintes critérios foram considerados para a exclusão dos ciclos do estudo:

Utilização de oócitos descongelados e/ou aquecidos;

Utilização de oócitos doados;

Utilização de espermatozoides provenientes de recuperação cirúrgica;

Utilização de espermatozoides com ausência de motilidade progressiva;

Transferência de embriões descongelados e/ou aquecidos;

Transferência de embriões doados;

Realização do diagnóstico genético pré-implantacional dos embriões obtidos.

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE):

Todas as pacientes submetidas a tratamento no Centro de Fertilização Assistida - Fertility

assinam, previamente ao início do tratamento proposto, o TCLE concordando com os

procedimentos a serem realizados, conforme estabelecido pelas normas éticas para utilização das

técnicas de reprodução assistida (CFM 1992, CNS 1996).

23

3.2) ESTÍMULO OVARIANO CONTROLADO (EOC)

As pacientes foram submetidas ao bloqueio hipofisário realizado por meio da

administração do análogo agonista do Hormônio Liberador de Gonadotrofinas (Gonadotrophin

Releasing Hormone agonist – GnRH, Lupron Kit™, Abbott S.A Societé Française des

Laboratoires, Paris, França) ou antagonista (Gonadotrophin Releasing Hormone antagonist –

Cetrotide©, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha ou Orgalutran®, Merck Sharp & Dohme

(MSD) and Schering-Plough, New Jersey, EUA) seguido por EOC, com administração do

Hormônio Folículo Estimulante recombinante (Recombinant Follicular Stimulating Hormone –

r-FSH, Gonal-F®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) ou altamente purificado (Highly

purified Follicular Stimulating Hormone – HP-u-FSH, Menopur® ou Bravelle®, Ferring, New

Jersey, EUA). A estimulação ovariana foi acompanhada por dosagens séricas de estradiol (E2,

pg/mL) e ultrassonografias pélvicas por via endovaginal seriadas, sendo os dados obtidos

utilizados para definir o dia de administração da Gonadotrofina Coriônica humana recombinante

(Recombinant Human Corionic Gonadotrophin – r-hCG, Ovidrel®, Merck KGaA, Darmstadt,

Alemanha), utilizada para induzir a maturação folicular final e a luteinização, após a estimulação

do desenvolvimento folicular.

3.3) RECUPERAÇÃO OOCITÁRIA

A recuperação oocitária foi realizada 34 a 36 horas após a administração do r-hCG por

meio de aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassom, sendo a paciente submetida à

sedação. Após a recuperação, os oócitos foram incubados em meio de cultura (Global® for

Fertilization, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) suplementado em 10% (Protein supplement,

LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) e coberto por óleo mineral (Parafin Oil, LifeGlobal

Group, Connecticut, EUA) por 4 horas em atmosfera controlada a 37 ºC e 7,5% de CO2. As

células do complexo cúmulus-corona foram removidas por exposição durante 30 seg ao meio

tamponado com HEPES contendo 80 UI/mL da enzima hialuronidase (Hyaluronidase, Irvine

Scientific, California, EUA). Posteriormente, as células restantes foram cuidadosamente

removidas por denudação mecânica usando pipetas Pasteur de vidro manualmente afiladas. Os

oócitos denudados foram então avaliados em estereomicroscópio quanto ao seu grau de

24

maturação nuclear. Oócitos que apresentaram a extrusão do primeiro corpúsculo polar foram

classificados em Metáfase II (MII) e submetidos à ICSI.

3.4) OBTENÇÃO DE ESPERMATOZOIDES, ANÁLISE E PROCESSAMENTO

SEMINAL

As amostras de sêmen ejaculado foram obtidas por masturbação, após dois a cinco dias de

abstinência ejaculatória, coletadas em frasco plástico e estéril e enviadas para análise e

processamento seminal. Primeiramente as amostras foram submetidas à análise seminal, de

acordo com protocolos estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS 2010). Foram

obtidas, então, a concentração de espermatozoides, a porcentagem de espermatozoides móveis

progressivos, não progressivos e imóveis e a morfologia seminal segundo critério de Kruger

(Kruger et al. 1986). Após análise seminal, foi realizado protocolo de processamento seminal

pelas técnicas de gradiente descontínuo de densidade ou migração ascendente de

espermatozoides, conforme indicações estabelecidas no II Consenso de Infertilidade Masculina

(Rhoden 2003) para recuperação de espermatozoides com motilidade progressiva a serem

utilizados na técnica de ICSI.

Gradiente descontínuo de densidade

Para a realização do gradiente descontínuo de densidade, foram utilizadas duas camadas

de Isolate (Irvine Scientific, California, EUA) nas densidades de 90% e 50%. Utilizando uma

pipeta estéril, 1 mL da camada inferior (90%, Isolate) foi transferida para um tubo cônico, sendo

1 mL da camada superior (50%, Isolate) depositada gentilmente sobre a camada inferior. Foi

adicionado 1 mL da amostra seminal liquefeita sobre as camadas de Isolate seguido de

centrifugação por 10 min a 300g. As camadas do reagente Isolate foram cuidadosamente retiradas

por aspiração e o precipitado contendo os espermatozoides foi ressuspendido em 1 mL de meio

de cultura tamponado com HEPES ((N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfônico),

Global® w/HEPES, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) seguido de centrifugação por 8 min a

300g para lavagem. O sobrenadante foi, então, removido e o precipitado final ressuspendido em

0,5 mL de meio de cultivo com HEPES (Global® w/HEPES, LifeGlobal Group, Connecticut,

25

EUA). A amostra recuperada foi analisada com relação aos parâmetros descritos acima e

encaminhada ao laboratório de FIV para utilização na técnica de ICSI.

Migração ascendente de espermatozoides

Para a técnica de migração ascendente de espermatozoides, 0,5 mL da amostra seminal

após liquefação foi depositada em um tubo cônico, sendo 1 mL de meio de cultura com HEPES

(Global® w/HEPES, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) cuidadosamente adicionado, de

forma a obtermos uma camada de meio de cultivo sobre a amostra seminal. Após um período de

incubação de uma hora a 37 ºC, mantendo-se o tubo inclinado a 45o, parte do sobrenadante foi

aspirado e transferido para outro tubo cônico. A amostra recuperada foi analisada com relação

aos parâmetros descritos acima e encaminhada ao laboratório de FIV para utilização na técnica de

ICSI.

3.5) INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)

A técnica de fertilização in vitro utilizada para todos os casos incluídos neste estudo foi a

injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), realizada de acordo com a técnica-padrão

descrita por Palermo et al. (1992). Para a ICSI, os oócitos foram dispostos individualmente em

gotas de 4 µL de meio tamponado (Global® w/HEPES, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA), e

a amostra seminal adequadamente processada foi adicionada em gotas centrais de solução de

10% polivinilpirrolidona (PVP) em meio tamponado com HEPES contendo albumina sérica

humana (HSA) (Polyvinylpyrrolidone (PVP) Solution with HSA, Irvine Scientific, California,

EUA), cobertas com óleo mineral (Parafin Oil, LifeGlobal, Connecticut, EUA). Após a injeção,

os oócitos foram cultivados individualmente em microgotas de 50 µL de meio de cultivo

embrionário (Global®, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) suplementado em 10% (Protein

supplement, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) e coberto por óleo mineral (Parafin Oil,

LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) em atmosfera controlada a 37 ºC e 7,5% de CO2 até o dia 3

do desenvolvimento embrionário. Neste dia, após avaliação da morfologia embrionária, o meio

de cultivo foi renovado e os embriões foram mantidos atmosfera controlada a 37 ºC, 7,5% de

26

CO2 e 7% de O2 até o momento da transferência embrionária, realizada no dia 5 do

desenvolvimento.

3.6) REVISÃO DE LITERATURA

A seleção dos parâmetros morfológicos embrionários que seriam avaliados para cada dia

do desenvolvimento foi baseada em levantamento bibliográfico em base de dados MEDLINE. O

levantamento incluiu manuscritos disponíveis escritos em inglês e publicados em ou após Janeiro

de 1992. Para a busca utilizamos uma adequada combinação dos seguintes termos: fertilização in

vitro (in vitro fertilization), embrião humano (human embryo), morfologia embrionária (embryo

morphology), valor preditivo (predictive value), viabilidade embrionária (embryo viability), taxa

de blastocisto (blastocyst rate), potencial de implantação (implantation potential), morfologia

oocitária (oocyte morphology), morfologia pronuclear (pronuclear morphology), número de

células em dia 2 (day 2 cell number), número de células em dia 3 (day 3 cell number), simetria de

blastômeros (blastomere symmetry), fragmentação de blastômeros (blastomere fragmentation),

multinucleação (multinucleation), morfologia embrionária de dia 3 (day 3 embryo morphology),

morfologia embrionária de dia 5 (day 5 embryo morphology), classificação de blastocisto

(blastocyst grading).

Os manuscritos obtidos foram então submetidos a processos de seleção a partir da análise

do título, resumo e do manuscrito completo, obrigatoriamente nesta ordem. Foram incluídos na

revisão manuscritos nos quais parâmetros morfológicos de avaliação oocitária e embrionária para

os dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento haviam apresentado uma correlação significativa com o

potencial de formação de blastocisto e/ou com o potencial de implantação do blastocisto.

3.7) REVISÃO DOS PRONTUÁRIOS LABORATORIAIS

Todos os parâmetros abordados como preditivos de viabilidade embrionária, segundo

manuscritos selecionados durante a revisão bibliográfica, foram listados e incluídos nos

prontuários laboratoriais de acordo com o dia de desenvolvimento embrionário para o qual este

seria devidamente avaliado. Os prontuários laboratoriais foram então revisados e adequados à

rotina laboratorial.

27

Os critérios incluídos, bem como seu respectivo dia de análise com relação ao

desenvolvimento embrionário, estão listados abaixo. O termo descrito entre parênteses representa

a forma abreviada utilizada nos prontuários laboratoriais. Os itens descrevem as alterações

possíveis de serem detectadas. Com a finalidade de otimizar a coleta de dados os parâmetros

aferidos foram inseridos de forma a serem facilmente localizados e registrados no prontuário.

Caso a alteração estivesse presente, a identificação foi registrada por meio da marcação de um

(X) na coluna correspondente, evitando a exposição prolongada do embrião ao microscópio

óptico durante a avaliação. Cabe ressaltar que os critérios de normalidade foram enumerados no

manual de Procedimento Operacional Padrão (POP) do Centro de Fertilização Assistida -

Fertility, atualizado segundo levantamento do presente estudo (Anexo 1).

Dia 0, Morfologia oocitária:

Parâmetros intracitoplasmáticos:

Granulosidade citoplasmática excessiva (CG);

Granulosidade citoplasmática em cluster (CL);

Citoplasma enegrecido (CE);

Presença de vacúolos (PV);

Retículo endoplasmático liso agregado (RE);

Presença de inclusões citoplasmáticas (IN);

Parâmetros extracitoplasmáticos:

1º corpúsculo polar fragmentado (CF);

Granulações no espaço perivitelineo (DP);

Espaço perivitelineo aumentado (EP);

Alteração de forma e/ou espessura e/ou coloração da zona pelúcida (ZP);

Alteração de forma do oócito (AF);

Membrana plasmática oocitária resistente no momento da ICSI (MR);

Membrana plasmática oocitária sem resistência no momento da ICSI (MSR).

28

Dia 1, Morfologia pronuclear:

Número de pronúcleos (No PN);

Número de corpúsculos polares (No CP);

PN - Alteração de tamanho (Tamanho);

PN – Posição não central em relação ao citoplasma (Periféricos);

PN – Não justapostos (Afastados);

Nucléolo – Número de nucléolos em pelo menos um dos PN menor do que 3

(número (0, 1 e 2));

Nucléolo – Tamanho não correspondente ao estágio da nucleogênese (Tamanho);

Nucléolo – Assincronismo da organização dos nucléolos durante a nucleogênese

(Polarização);

Ausência ou irregularidade na formação do halo citoplasmático (Halo);

Detecção de vacúolos no citoplasma (Vac);

Granulosidade excessiva no citoplasma (CG);

Detecção de irregularidade da membrana plasmática (Memb. Irreg.).

Dia 2:

Embrião - No de células (Algarismos decimais);

Embrião - Simetria de blastômeros (Simétrico (Si), Semelhante (Se) ou

Assimétrico (As));

Embrião - Fragmentação em % (Porcentagem do volume do embrião ocupado por

fragmentos anucleados);

Embrião - Tipo de fragmentação (Posição dos fragmentos de acordo coma

classificação de Alikani, 1999);

Presença de fragmentos grandes (Frag gdes, número decimal);


Detecção de vacúolos no citoplasma de pelo menos um dos blastômeros (Vac);

Alteração de forma do embrião (Forma);

Alteração na zona pelúcida do embrião (ZP);

29

Presença de blastômeros sem núcleo (BL s/ N, número decimal);

Presença de blastômeros multinucleados (Multinucleação, número de blastômeros

comprometidos e número de núcleos detectados).

Dia 3:

Embrião - No de células (Algarismos decimais) e/ou grau de compactação;

Embrião - Simetria de blastômeros (Simétrico (Si), Semelhante (Se) ou

Assimétrico (As));

Embrião - Fragmentação em % (Porcentagem do volume do embrião ocupado por

fragmentos anucleados);

Embrião - Tipo de fragmentação (Posição dos fragmentos de acordo coma

classificação de Alikani, 1999);

Presença de fragmentos grandes (Frag gdes, número decimal);


Detecção de vacúolos no citoplasma de pelo menos um dos blastômeros (Vac);

Alteração de forma do embrião (Forma);

Alteração na zona pelúcida do embrião (ZP);

Presença de blastômeros sem núcleo (BL s/ N, número decimal);

Presença de blastômeros multinucleados (Multinucleação, número de blastômeros

comprometidos e número de núcleos detectados);

Presença de blastômero apresentando diferença de tamanho maior ou igual a 50%

em relação ao menor blastômero do embrião - Blastômero dominante (BD).

30

Dias 5 e 6:

MCI (massa celular interna):

MCI - Ausente, caso não detectada durante avaliação;

MCI - Não compacta, caso não detectada formação de protuberância na blastocele;

MCI - Granulosidade excessiva no citoplasma das células que compõem a MCI

(CG);

MCI - Detecção de células degeneradas na MCI (Cel Deg);

TRF (trofoectoderma):

TRF – Detecção de formação de TRF irregular, não observação da formação de

epitélio coesivo (Irreg);

TRF – Presença de poucas células na formação do TRF (Poucas cel);

TRF – Granulosidade excessiva no citoplasma das células que compõem o TRF

(CG);

TRF – Detecção de células degeneradas no TRF (Cel Deg);

Os prontuários revisados para os dias 1, 2, 3 e 5 do desenvolvimento embrionário e que

foram utilizados na rotina laboratorial encontram-se anexos (Anexo 2).

3.8) TREINAMENTO DA EQUIPE E ELABORAÇÃO DE ESQUEMAS DIDÁTICOS

Com o objetivo de reduzir variações intra e interobservador a equipe de embriologistas do

Centro de Fertilização Assistida - Fertility recebeu treinamento para avaliação da morfologia

embrionária incluindo todos os parâmetros apontados no presente estudo. Ainda com o objetivo

de tornar essa avaliação menos subjetiva, esquemas didáticos foram desenvolvidos e

incorporados aos POPs do laboratório. Abaixo um exemplo de esquema didático desenvolvido

para abordagem do parâmetro simetria de blastômero para os dias 2 e 3 do desenvolvimento (Fig.

1). Os esquemas foram utilizados neste caso para uma clara diferenciação entre a assimetria do

tamanho dos blastômeros e a assincronia de clivagem, conforme detalhado previamente no tópico

Introdução.

31

Fig. 1a

No de células

4 células

3 células

5 células

6 células

7 células

8 células

Blastômeros de mesmo tamanho Blastômeros de tamanho diferente

Fig. 1b

CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - SIMETRIA

No DE CÉLULAS SIMETRIA ESPERADA

1 CEL GDE

2 CEL MENORES =

3 CEL GDE

2 CEL MENORES =

2 CEL GDE

4 CEL MENORES =

1 CEL GDE

6 CEL MENORES =

3

2

8

4

7

6

5

2 CEL =

8 CEL =

4 CEL =

NO DE CÉLULAS

FIGURA 1: Esquema didático para avaliação da simetria de blastômeros nos dias 2 e 3 do

desenvolvimento embrionário. Embriões apresentando a simetria esperada para cada dia do

desenvolvimento estão destacados na Fig. 1a e demonstrados na Fig. 1b.

32

3.9) AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E SELEÇÃO EMBRIONÁRIA

A avaliação dos critérios de morfologia oocitária foi realizada no momento da ICSI. O

oócito classificado na linha de número “1” foi identificado como embrião “1” da placa de cultivo

de forma que as características oocitárias de cada um dos embriões resultantes estivessem

disponíveis para utilização como parâmetro de seleção para transferência. Os embriões foram

avaliados em intervalos regulares quanto aos critérios morfológicos de interesse, sendo o

intervalo de tempo correspondente ao número de horas após a realização da ICSI: dia 1 ou

checagem da fertilização (17h+1), classificação do dia 2 do desenvolvimento (44h+1), dia 3

(68h+1) e dia 5 (116h+2) (Tab. 3).

TABELA 3: Intervalos de horas em relação ao horário de realização do procedimento de ICSI

utilizados para avaliação regular dos embriões quanto aos critérios morfológicos de interesse.

OBSERVAÇÃO INTERVALO (horas) PADRÃO ESPERADO

Fertilização (±1) 17 Estágio pronuclear

Dia 2 (±1) 44 Estágio de 4-cel

Dia 3 (±1) 68 Estágio de 8-cel

Dia 5 (±2) 116 Blastocisto

A seleção dos embriões a serem transferidos foi baseada em critérios discutidos

recentemente pelas Sociedades Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) e Européia de

Reprodução Humana e Embriologia (ESHRE) (Racowsky et al. 2011, Embryology 2011). Cabe

ressaltar que a idade da mulher não foi considerada critério de exclusão para o estudo, sendo até 4

embriões transferidos em alguns ciclos cujas pacientes apresentavam idade igual ou superior a 40

anos, conforme sugerido pelo Conselho Federal de Medicina (CFM 2010).

33

3.10) COLETA DE DADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS

Os prontuários das pacientes inseridas neste estudo foram arquivados no Centro de

Fertilização Assistida – Fertility, além de estarem disponíveis para consulta em formato

digitalizado. Todos os dados clínico-laboratoriais referentes a cada um dos procedimentos

realizados foram inseridos em banco de dados eletrônico formato Access.

Para cada ciclo a partir do qual foram incluídos embriões para este estudo foram também

coletadas as seguintes informações listadas abaixo, além de todos os critérios de morfologia

oocitária e embrionária descritos previamente:

Dados pessoais do casal (Nome, idade);

Data da punção folicular;

Fator de infertilidade;

Protocolo de indução (Unidades e tipo de gonadotrofina / Bloqueio hipofisário);

Dosagem de estradiol no dia do hCG (E2);

Tipo de coleta da amostra seminal (Ejaculado / Punção aspirativa epididimária ou

testicular);

Parâmetros seminais pré e pós-processamento, sendo os critérios de normalidade

definidos de acordo com a OMS (2010);

Motilidade dos espermatozoides utilizados para ICSI (Motilidade progressiva, não

progressiva, imóvel);

No de folículos puncionados;

No de oócitos obtidos;

Grau de maturação nuclear dos oócitos após denudação (PI, MII ou MII)

No de oócitos injetados e grau de maturação nuclear;

Morfologia oocitária (Dia 0, para cada um dos oócitos injetados);

Morfologia embrionária (Dias 1, 2, 3 e 5, parâmetros descritos previamente – para cada

um dos embriões obtidos);

No de embriões obtidos;

No de embriões transferidos;

No de embriões criopreservados;

34

Dia de desenvolvimento embrionário na transferência;

Espessura endometrial (mm) no dia da administração do hCG;

Resultado de gestação (Dosagem sérica de β-hCG);

No de sacos gestacionais com batimento cardíaco.

A disponibilidade destas informações torna-se relevante dado que devemos considerar a

possível influência de outros fatores, além dos critérios morfológicos oocitários e embrionários

focos deste estudo, na chance de sucesso do tratamento como, por exemplo, o fator idade

materna.

3.11) CATEGORIZAÇÃO DAS VARIÁVEIS DE ESTUDO

Após tabulação, tornou-se necessária a organização dos dados para possibilitar a

submissão dos mesmos para as análises estatísticas, incluindo o modelo de regressão logística.

Alguns exemplos do agrupamento das variáveis em categorias para avaliação dos parâmetros

número de células, ritmo de clivagem e simetria de blastômeros para os dias 2 e 3 do

desenvolvimento estão na Figura abaixo (Fig. 2).

Foram considerados para este estudo embriões com ritmo de clivagem normal aqueles que

apresentaram de 3 a 5 células em dia 2 e 7 ou 8 células em dia 3 do desenvolvimento. Embriões

com 2 células em dia 2 ou com um número menor ou igual a 6 células em dia 3 foram

classificados como ritmo lento de clivagem. Por outro lado, embriões apresentando 6 ou mais

células em dia 2 ou 9 ou mais células em dia 3 foram considerados como ritmo de clivagem

rápido. Quanto ao ritmo de clivagem avaliamos ainda para o dia 2 do desenvolvimento a não

ocorrência de clivagem ou a compactação precoce. Para o dia 3 do desenvolvimento os embriões

foram classificados como parada de clivagem ou clivagem anormal quando não houve ocorrência

de clivagem no intervalo entre a avaliação do dia 2 e do dia 3 ou quando foi detectada clivagem

de apenas uma célula neste intervalo, respectivamente. Além disso, realizou-se o agrupamento de

algumas destas categoriais para análise dos dados como a inserção dos ritmos lento e rápido de

clivagem em uma mesma categoria, ou ainda a inserção de todas as categoriais que representam

uma variação do ritmo de clivagem normal na categoria “anormal”. Com relação ao parâmetro

35

simetria de blastômeros, embriões classificados como simétricos (Si) ou semelhantes (Se) foram

agrupados em uma mesma categoria e assimétricos (As) inseridos em outra categoria.

No DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM

ESTATÍSTICA 1 DIA 2 ESTATÍSTICA 1 DIA 3

Ritmo de clivagem No células GRUPOS Ritmo de clivagem No células GRUPOS

LENTA 2 1 LENTA <6 1

NORMAL 3 a 4 2 NORMAL 7 a 8 2

RÁPIDA >5 3 RÁPIDA >9 3

PARADO NC 4 PARADO 4

COMPACTAÇÃO PRECOCE 5 CLIVAGEM 1CEL 5

ESTATÍSTICA 2 DIA 2 ESTATÍSTICA 2 DIA 3

Ritmo de clivagem GRUPOS Ritmo de clivagem GRUPOS

LENTA/RÁPIDA 1 LENTA/RÁPIDA 1

NORMAL 0 NORMAL 0

PARADO 2 PARADO 2

CLIVAGEM 1CEL 3

ESTATÍSTICA 3

Ritmo de clivagem GRUPOS

ANORMAL 1

NORMAL 0

SIMETRIA DE BLASTÔMEROS Dia 2 e 3

Si ou Se 0

As 1

3 a 5

>6

Não clivado

Categorias Categorias

Categorias Categorias

Categorias

Categorias

DIAS 2 E 3

DIAS 2 E 3

FIGURA 2: Modelo de categorização das variáveis número de células / ritmo de clivagem e

simetria de blastômeros para os dias 2 e 3 do desenvolvimento utilizados para submissão dos

dados à análise estatística.

Si= Simétrico, Se= Semelhante, As= Assimétrico

36

Outros parâmetros não exemplificados acima foram categorizados para análise como a

presença de fragmentos anucleados, de blastômeros multinucleados e de blastômeros anucleados.

O parâmetro fragmentação embrionária foi categorizado de acordo com o tipo (II, III ou IV) e

grau (ausente, comprometendo até 10 ou 20% do volume do embrião), além da combinação de

ambos os critérios. A presença ou ausência de blastômeros multinucleados e de blastômeros

anucleados foi registrada, bem como a porcentagem de blastômeros comprometidos (> ou <

25%). Ainda para o parâmetro multinucleação, o maior número de núcleos visualizados em pelo

menos um dos blastômeros comprometidos foi considerado (> ou < 2 núcleos), de forma

independente do número de blastômeros comprometidos.

3.12) SEGUIMENTO CLÍNICO

No intervalo de 10 dias após a transferência embrionária foi realizada a dosagem

quantitativa dos níveis séricos da subunidade beta da gonadotrofina coriônica humana (β-hCG),

indicativo de gestação positiva. A gestação clínica foi definida por meio da detecção de saco

gestacional e de batimento cardíaco fetal em ultrassonografia pélvica transvaginal realizada de 3

a 4 semanas após a transferência embrionária.

3.13) CONCEITOS E VARIÁVEIS

Oócito PI

Oócito em grau de maturação nuclear Prófase I da Meiose I, caracterizado pela presença

de vesícula germinativa.

Oócito MI

Oócito em grau de maturação nuclear Metáfase I da Meiose I, caracterizado pela ausência

de vesícula germinativa e de corpúsculo polar.

Oócito MII

Oócito em grau de maturação nuclear Metáfase II da Meiose II, caracterizado pela

presença do 1o corpúsculo polar.

37

Taxa de oócitos recuperados

A taxa de oócitos recuperados foi definida pelo número de oócitos recuperados após

punção folicular dividido pelo número de folículos puncionados.

Taxa de oócitos MII

A taxa de oócitos MII foi definida pelo número de oócitos classificados como MII quanto

ao grau de maturação nuclear dividido pelo número de oócitos recuperados após punção folicular.

Taxa de oócitos injetados

A taxa de oócitos injetados foi definida pelo número de oócitos submetidos à ICSI

dividido pelo número de oócitos recuperados após punção folicular.

Taxa de 2PN

A taxa de 2PN foi definida pelo número de zigotos com fertilização normal (2PN) obtidos

dividido pelo número de oócitos submetidos à ICSI.

Taxa de blastocistos

A taxa de blastocistos foi definida como o número de embriões que atingiram o estágio de

blastocisto, independente do grau de expansão da blastocele, dividido pelo número de embriões

que foram mantidos em cultivo até o dia 5 do desenvolvimento.

Viabilidade embrionária

No presente estudo optamos por definir a viabilidade embrionária como sendo o potencial

de o embrião atingir o estágio de blastocisto quando cultivado até o dia 5 do desenvolvimento e,

ainda, o potencial de implantação deste embrião quando selecionado para a transferência.

Taxa de gestação clínica

A taxa de gestação clínica foi definida pelo número de pacientes que apresentaram

dosagem positiva de β-hCG, detecção de saco gestacional e de batimento cardíaco fetal dividido

pelo número de pacientes que realizaram transferência embrionária.

Taxa de implantação

38

A taxa de implantação foi definida pelo número de sacos gestacionais que apresentaram

batimento cardíaco dividido pelo número de embriões transferidos.

Taxa de aborto

A taxa de aborto foi definida pelo número de pacientes que apresentaram perda

gestacional dividido pelo número de pacientes com gestação clínica detectada.

3.14) ANÁLISE E ESTATÍSTICA DOS DADOS

Os dados de morfologia obtidos para todos os dias do desenvolvimento (desde o dia 0 –

morfologia oocitária até o dia 3 – 68h após a fertilização) dos embriões obtidos foram associados

aos dados obtidos para o dia 5 do desenvolvimento, ou seja, o sucesso na obtenção do embrião

em estágio de blastocisto (Blastocisto (S)) ou a falha na formação do blastocisto (Blastocisto

(N)), com o objetivo de identificarmos possíveis parâmetros preditivos de formação de

blastocistos. Da mesma forma, os dados de ocorrência (Implantação 100%) ou não (Implantação

0%) de implantação embrionária foram avaliados juntamente com os dados de morfologia

obtidos para todos os dias do desenvolvimento, com o objetivo de identificação de possíveis

parâmetros preditivos do sucesso da implantação embrionária. Cabe ressaltar que para alcançar

tal objetivo foram utilizados apenas dados de embriões provenientes dos ciclos que apresentaram

0% ou 100% de implantação, de forma que pudéssemos afirmar o sucesso ou a falha de

implantação do embrião estudado. O fato de não podermos afirmar qual foi o embrião implantado

em um ciclo cuja taxa de implantação foi de, por exemplo, 50% implicou na não inclusão destes

dados.

A associação entre a normalidade/anormalidade dos critérios morfológicos e a viabilidade

embrionária foram avaliadas com o auxílio dos programas computacionais Minitab 17,

GraphPad Prism 5.0 e SPSS 20.0. Inicialmente, foi realizada a análise bivariada centrada nos

testes de associação entre as variáveis independentes e a variável resposta (Blastocisto e/ou

Implantação) para a identificação das principais variáveis associadas à viabilidade embrionária.

Para variáveis quantitativas os valores foram expressos em média + desvio padrão. Para avaliação

de duas populações de dados as variáveis quantitativas foram submetidas ao teste paramétrico t

de Student ou ao teste não-paramétrico de Mann-Whitney, de acordo com o resultado obtido após

39

submissão destas variáveis ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Nas análises de

associação de variáveis qualitativas foram aplicados os testes Qui-Quadrado ou o Teste Exato de

Fisher, conforme apropriado. Finalmente, foi construído um modelo de regressão, através do

programa SPSS, visando a ajustar as variáveis preditoras da variável resposta. Sendo a variável

resposta de ambos os objetivos deste estudo uma variável dicotômica, análises de regressão

logística binária foram aplicadas e os resultados foram expressos como Odds ratio (OR) ou

Razão de Chance (calculado em relação ao critério de normalidade para cada um dos

parâmetros), Intervalo de Confiança a 95% (IC) e valor de P. O método Foward foi utilizado,

deste modo as variáveis preditivas foram adicionadas ao modelo de acordo com a força da

associação. Foram incluídas na determinação do modelo todas as variáveis que apresentaram um

nível descritivo de significância menor ou igual a 0,20 na análise bivariada. Os resultados foram

considerados ao nível crítico de 5% de significância (P<0,05).

40

4) RESULTADOS

4.1) Dados descritivos – Perfil da população estudada

Considerando o período proposto para este estudo foram realizados 2155 ciclos de

aspiração folicular e fertilização in vitro com injeção intracitoplasmática de espermatozoides

(ICSI), resultado do tratamento de 1521 pacientes.

Considerando-se os critérios de inclusão do presente estudo como inicialmente o fato de

que houvesse transferência embrionária (80,0% dos ciclos iniciados) e de que a transferência

fosse realizada em dia 5 do desenvolvimento em estágio de blastocisto (53,7% dos ciclos

transferidos) poderíamos incluir 926 ciclos de 699 pacientes submetidas ao tratamento. Após

considerarmos todos os critérios de exclusão do estudo conforme descrito em Método, foram

incluídos no presente estudo os dados de morfologia oocitária e embrionária de 743 ciclos de 583

pacientes submetidas ao tratamento.

Os dados descritos na tabela abaixo (Tab. 4) representam o perfil clínico dos casais e dos

ciclos de tratamento inseridos no presente estudo, incluindo dados relacionados ao EOC.

TABELA 4: Descrição das características dos casais inseridos no presente estudo e de seus

ciclos de tratamento de RHA.

Variáveis do EOC N Média Intervalo Desvio padrão

Pacientes 583 - - -

Punções foliculares 743 - - -

Idade Mulher (anos) - 34,3 21-45 4,1

Idade Homem (anos) - 37,2 25-63 5,6

Unidades de FSH (UI) administrada - 2279 600-4950 605

Dosagem do E2 no dia da administração do hCG (pg/mL) - 2124 125-10000 1538

Espessura endometrial (mm) no dia de administração do hCG - 10,8 5,0-18,6 2,1

A média de idade das pacientes submetidas ao tratamento, cujos embriões foram

avaliados no presente estudo, foi de 34,3 anos sendo a idade mínima e a máxima observada de 21

e de 45 anos, respectivamente. A média de idade foi de 37,2 anos para os respectivos parceiros,

41

com mínima de 25 e máxima de 63 anos. Em média, foram aplicadas 2279 UI de FSH para EOC,

sendo de 2124 pg/mL o valor médio de E2 no dia da administração do hCG. A espessura

endometrial obtida para o mesmo dia de avaliação foi em média 10,8 mm.

Buscando uma melhor caracterização da população estudada, bem como o estudo de todos

os possíveis fatores clínicos que pudessem interferir nas variáveis de resposta objetivo deste

estudo, as variáveis cujas incidências estão descritas na tabela abaixo (Tab. 5) foram levantadas e

analisadas para as pacientes incluídas no estudo.

TABELA 5: Descrição das características clínicas da população estudada e dos ciclos de

tratamento de RHA.

Variáveis de perfil clínico Incidência (%)

Pacientes (mulher) com idade ≥ a 38 anos 21,9

Pacientes (homem) com idade ≥ a 38 anos 43,0

Ciclos com uso de FSH recombinante 94,8

Ciclos com bloqueio hipofisário por antagonista 92,2

Ciclos com fator masculino de infertilidade 47,4

Ciclos com fator feminino de infertilidade 61,4

Ciclos com fator masculino e feminino de infertilidade associados 19,2

Ciclos com indicação de endometriose 15,7

Ciclos com concentração seminal normal pré-processamento 68,9

Ciclos com motilidade total normal pré-processamento 81,3

Ciclos com motilidade progressiva normal pré-processamento 70,5

Mais de 20% das pacientes submetidas ao tratamento apresentaram idade igual ou

superior a 38 anos, sendo esta proporção ainda maior (43%) considerando-se a idade do homem.

O bloqueio hipofisário foi obtido em 92,2% dos casos com o uso de antagonista do GnRH e o

EOC foi induzido em 94,8% dos casos pelo uso de r-FSH. O fator masculino de infertilidade

isolado ou associado a outros fatores de infertilidade estava presente em cerca de 50% dos casos

sendo esta proporção maior para o fator feminino de infertilidade, 61,4% dos casos. A presença

de ambos foi relatada para 19,2% dos casos. Cerca de 15% das pacientes incluídas no estudo

42

apresentavam diagnóstico clínico de endometriose. Os parâmetros seminais pré-processamento

incluindo Concentração, Motilidade total e Motilidade progressiva estavam dentro do critério de

normalidade para a maioria dos ciclos de tratamento, sendo de 68,9%, 81,3% e de 70,5% a

incidência de normalidade para estes critérios, respectivamente.

As variáveis de resposta folicular após submissão ao EOC estão resumidas na Tab. 6 para

as pacientes incluídas no estudo.

TABELA 6: Descrição das variáveis de resposta folicular das pacientes submetidas ao EOC.

Variáveis de resposta folicular N Média Intervalo Desvio padrão

No de folículos puncionados 14905 20,1 2,0-64 10,6

No de oócitos recuperados 10868 14,6 1,0-50 8,1

Taxa média de oócitos recuperados (%) - 73,7 12-100 18,0

No de oócitos em grau de maturação nuclear MII 8072 10,9 1,0-41 6,0

Taxa média de MII (%) - 77,0 12-100 15,8

No de oócitos injetados 7609 10,2 1,0-36 5,0

Taxa média de oócitos injetados (%) - 75,3 12-100 18,6

Os valores médios obtidos para as pacientes submetidas ao EOC foram de 20,1 folículos

puncionados; 14,6 oócitos recuperados com taxa média de recuperação oocitária de 73,7%; 10,9

oócitos em MII com taxa média de MII de 77,0%; 10,2 oócitos injetados com taxa média de

oócitos injetados de 75,3%.

Os dados de parâmetros seminais macroscópicos e microscópicos avaliados pré-

processamento, para todas as amostras utilizadas nos ciclos estudados, encontram-se resumidos

na tabela abaixo (Tab. 7).

43

TABELA 7: Descrição dos parâmetros seminais pré-processamento das amostras submetidas à

ICSI.

Características seminais Média Intervalo Desvio padrão

Volume seminal (mL) 3,1 0,2-11,5 1,6

Concentração de sptz na amostra pré-processamento (x106/mL) 37,8 0,0002-207,5 34,9

Motilidade total (%) 54,8 6,0-95,0 17,5

Motilidade progressiva (%) 40,3 3,0-85,0 16,7

SPTZ= Espermatozoide

Em média, as amostras submetidas ao processamento seminal para ICSI apresentaram na

avaliação pré-processamento um volume ejaculado de 3,1mL, Concentração de 37,8x106/mL,

Motilidade total de 54,8% e Motilidade progressiva de 40,3%.

Algumas variáveis de sucesso laboratorial, após submissão dos oócitos à ICSI, estão

descritas na tabela abaixo (Tab.8). Dentre estas podemos destacar a taxa de oócitos que

apresentaram fertilização normal após serem submetidos à ICSI (Taxa média de 2PN, 82,0%) e a

taxa de blastocistos formados após cultivo dos embriões obtidos até o dia 5 do desenvolvimento

(Taxa de blastocistos, 53,8%). O número médio de embriões transferidos foi de 2,2 com um

intervalo de 1 a 4 embriões transferidos, sendo que em 40,4% dos ciclos houve criopreservação

dos embriões excedentes.

TABELA 8: Perfil laboratorial das variáveis de sucesso após submissão dos oócitos à ICSI.

Variáveis de sucesso laboratorial N Média Intervalo Desvio padrão

No de oócitos com fertilização normal (2PN) 5850 7,9 1,0-28 4,1

Taxa média de 2PN (%) - 82,0 11-100 14,9

No de embriões transferidos 1639 2,2 1,0-4,0 0,6

No de embriões congelados 1295 4,3 1,0-14 2,2

Taxa de blastocistos (%) 3147 53,8 - -

% de ciclos com criopreservação de embrião 300 40,4 - -

Os resultados clínicos obtidos após transferência embrionária estão descritas na Tab. 9.

44

TABELA 9: Taxas de sucesso do tratamento de RHA para as pacientes avaliadas no estudo.

Variáveis de sucesso clínico (%)

Taxa de gestação clínica 41,5 (308/743)

Taxa de aborto 15,6 (48/308)

Taxa de implantação 24,8 (407/1639)

Dos 743 ciclos de ICSI iniciados e nos quais houve transferência embrionária, obtivemos

308 ocorrências de gestação clínica positiva, resultando em 41,5% de taxa de gestação. A taxa de

implantação embrionária foi de 24,8% sendo resultado de um total de 1639 embriões transferidos

e da obtenção de 407 sacos gestacionais com batimento cardíaco detectado. Foram relatadas 48

ocorrências de aborto, resultando em uma taxa de 15,6% de abortamento.


avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento na obtenção de embriões em estágio de

blastocisto.

4.2.1) Dados descritivos

Variáveis quantitativas (Tab. 10) e qualitativas (Tab. 11) correspondentes ao perfil das

pacientes submetidas ao tratamento e ao perfil de resposta clínica e laboratorial foram avaliadas

quanto ao possível valor preditivo na taxa de obtenção de blastocistos.

Dentre as diferenças significativas observadas para as variáveis quantitativas, os seguintes

parâmetros apresentaram um valor médio menor para o grupo de embriões que atingiram o

estágio de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento: média de idade da mulher (33,6+4,0 vs

34,2+3,9; p<0,001); número médio de UI de FSH administradas (2205+632 vs 2274+605;

p<0,001); número médio de oócitos recuperados após punção folicular (17,1+8,3 vs 17,7+8,6;

p=0,015), taxa média de oócitos recuperados (74,3%+16,9 vs 76,9%+16,1; p<0,001) e motilidade

seminal total (54,2%+17,3 vs 55,1%+17,6, p=0,023). Por outro lados as variáveis taxa média de

MII (78,6%+14,3 vs 76,9%+14,7; p<0,001), taxa média de oócitos injetados (75,6%+18,1 vs

45

74,8%+17,3; p=0,022) e taxa média de 2PN (81,4%+14,1 vs 80,4%+14,3; p=0,011) apresentaram

um valor médio maior para o grupo de embriões que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5

do desenvolvimento. Não houve associação estatística significativa para as seguintes variáveis

quantitativas na taxa de formação de blastocistos: idade do homem, nível de E2, concentração e

motilidade progressiva da amostra seminal, número de folículos puncionados, número de oócitos

MII, número de oócitos submetidos à ICSI e número de oócitos com fertilização normal.

TABELA 10: Descrição das características e do perfil de resposta clínica e laboratorial dos

casais submetidos ao tratamento de RHA de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do

desenvolvimento.

Variáveis quantitativas - Perfil geral dos ciclos

de ICSI

Grupo A

Blastocisto (N)

Grupo B

Blastocisto (S)Valor de P

Idade mulher 34,2 (3,9) 33,6 (4,0) <0,001

Idade homem 37,0 (5,5) 36,9 (5,5) 0,561

FSH (UI) 2274 (605) 2205 (632) <0,001

E2 (pg/mL) 2429 (1708) 2443 (1719) 0,823

Concentração seminal (106/mL) 37,1 (34,5) 36,6 (33,9) 0,646

Motilidade total (%) 55,1 (17,6) 54,2 (17,3) 0,023

Motilidade progressiva (%) 40,4 (16,7) 40,0 (16,7) 0,272

No de folículos puncionados 23,4 (10,8) 23,7 (11,7) 0,891

No de oócitos recuperados 17,7 (8,6) 17,1 (8,3) 0,015

Taxa média de oócitos recuperados (%) 76,9 (16,1) 74,3 (16,9) <0,001

No de oócitos em grau de maturação nuclear MII 13,3 (6,5) 13,1 (6,4) 0,486

Taxa média de MII (%) 76,9 (14,7) 78,6 (14,3) <0,001

No de oócitos injetados 12,5 (5,6) 12,2 (5,3) 0,058

Taxa média de oócitos injetados (%) 74,8 (17,3) 75,6 (18,1) 0,022

No de oócitos com fertilização normal (2PN) 9,9 (4,6) 9,8 (4,4) 0,482

Taxa média de 2PN (%) 80,4 (14,3) 81,4 (14,1) 0,011

Média (+DP)

Nota: Teste estatístico aplicado – Mann-Whitney.

46

TABELA 11: Taxa de blastocistos obtidos no dia 5 do desenvolvimento de acordo com as

características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA.

Variáveis qualitativas - Perfil geral dos ciclos

de ICSI

Taxa de blastocistos

obtidos (%)Valor de P

Idade da mulher

<37a 39,2

>38a 34,1

Idade do homem

<37a 38,5

>38a 38,5

Bloqueio hipofisário

GnRH agonista 41,7

GnRH antagonista 38,2

Estímulo ovariano controlado

FSH urinário 42,0

FSH recombinante 38,3

Fator de infertilidade

Endometriose (N) 38,7

Endometriose (S) 36,5

Perfil seminal

Concentração inicial

>15 (106/mL) 37,8

<15 (106/mL) 40,6

Motilidade total

>40% 38,2

<40% 41,2

Motilidade progressiva

>32% 37,9

<32% 40,9

0,982

0,059

0,236

0,002

0,147

0,230

0,044

0,084

Nota: Teste estatístico aplicado – Qui-quadrado.

47

Utilizando a classificação de variáveis qualitativas que caracterizam a população do

estudo, a variável idade da mulher aparece novamente como possível interferente do potencial de

formação de blastocistos. Pacientes com idade menor ou igual a 37 anos apresentaram uma taxa

de formação de blastocistos de 39,2%, significativamente maior do que a observada para

pacientes com idade igual ou superior a 38 anos, que foi de 34,1% (p=0,002). Para a variável

motilidade seminal, a taxa de blastocistos formados foi maior para o grupo que apresentou

motilidade progressiva de padrão anormal, ou seja, <32% (37,9% vs 40,9%; p=0,044). As

seguintes variáveis avaliadas de forma qualitativa: idade do homem, estratégia de bloqueio

hipofisário, tipo de gonadotrofina aplicada para EOC, diagnóstico clínico de endometriose,

concentração e motilidade seminal total não apresentaram associação estatística significativa com

a taxa de formação de blastocistos.

4.2.2) Morfologia oocitária

Parâmetros de morfologia oocitária avaliados no dia 0 do desenvolvimento, previamente

ao procedimento de ICSI, foram avaliados e registrados para todos os 7609 oócitos submetidos à

injeção. A incidência dos dismorfismos intracitoplasmáticos e extracitoplasmáticos foi descrita

para os 5850 oócitos que resultaram em embriões após a ICSI e que foram incluídos no estudo

para avaliação do possível valor preditivo destes parâmetros na taxa de formação de blastocistos

(Tab. 12).

A granulação citoplasmática em padrões superiores ao considerado normal foi relatada

para 96,4% dos oócitos avaliados. Por outro lado, alterações nos outros parâmetros

intracitoplasmáticos de morfologia oocitária foram observadas em menos de 10% dos oócitos,

com destaque para o acúmulo de REL cuja incidência foi de 2,2%. Apesar de nenhum dos

dismorfismos extracitoplasmáticos apresentarem incidência maior que 50%, a ocorrência de

alteração de pelo menos um destes parâmetros foi detectada em 65,5% dos oócitos estudados. De

modo geral, 98,3% dos oócitos apresentaram ao menos a presença de um dismorfismo intra ou

extracitoplasmático.

48

TABELA 12: Descrição da incidência dos dismorfismos oocitários avaliados no dia 0 do

desenvolvimento.

Dismorfismos oocitários intracitoplasmáticos Incidência (%)

CG - Granulação citoplasmática 96,4

CL - Granulação citoplasmática centralizada 7,1

REL - Acúmulo de Retículo endoplasmático liso 2,2

VAC - Presença de vacúolos 4,8

Alteração de pelo menos um parâmetro intracitoplasmático 96,6

Dismorfismos oocitários extracitoplasmáticos

DB - Presença de debris no espaço perivitelíneo 42,9

ZP - Alteração de zona pelúcida 4,3

EP - Espaço perivitelíneo aumentado 15,2

CP frag - Corpúsculo polar fragmentado 33,8

FORMA - Alteração de forma 1,9

Alteração de pelo menos um parâmetro extracitoplasmático 65,5

Dismorfismos oocitários intra ou extracitoplasmáticos

Alteração de pelo menos um parâmetro intra ou extracitoplasmático 98,3

Os dados de detecção ou a ausência dos dismorfismos oocitários avaliados foram

submetidos à análise estatística para estudo do possível valor preditivo destes parâmetros na taxa

de obtenção de blastocistos. Os resultados obtidos foram resumidos na Tab. 13. As taxas de

formação de blastocisto descritas correspondem àquelas observadas para oócitos nos quais as

alterações foram detectadas. Nos casos em que houve uma diferença significativa (p<0,05) para a

taxa de formação de blastocisto entre embriões provenientes de oócitos nos quais as alterações

estavam ou não presentes foram relatadas também as taxas de formação de blastocisto para

oócitos nos quais as alterações não foram detectadas.

49

TABELA 13: Taxa de formação de blastocisto de acordo com o dismorfismo oocitário detectado

no oócito submetido à ICSI.

Variáveis qualitativas - Dismorfismos oocitáriosTaxa de blastocistos


CG - Granulação citoplasmática 38,4 0,996

CL - Granulação citoplasmática centralizada 38,1 0,891

RE - Acúmulo de Retículo endoplasmático liso 48,8 0,017

alteração ausente 38,2

VAC - Presença de vacúolos 33,5 0,083

Alteração de pelo menos um parâmetro intracitoplasmático 38,4 0,830

DB - Presença de debris no espaço perivitelíneo 40,5 0,005


ZP - Alteração de zona pelúcida 38,1 0,915

EP - Espaço perivitelíneo aumentado 33,5 0,001


CP frag - Corpúsculo polar fragmentado 40,5 0,019


FORMA - Alteração de forma 33,6 0,296

Alteração de pelo menos um parâmetro extracitoplasmático 39,7 0,006


Alteração de pelo menos um parâmetro intra ou extracitoplasmático 38,5 0,747


Foram observadas taxas de formação de blastocistos significativamente maiores para

embriões provenientes de oócitos cujas seguintes alterações de morfologia oocitária estavam

presentes: acúmulo de REL (48,8% vs 38,2%, p=0,017), presença de debris no EPV (40,5% vs

36,9%, p=0,005), fragmentação do 1o CP (40,5% vs 37,4%, p=0,019) e detecção de alteração de

pelo menos um dos parâmetros extracitoplasmáticos (39,7% vs 36,0%, p=0,006). Por outro lado,

para o parâmetro extracitoplasmático aumento do EPV uma menor taxa de blastocistos foi

observada para oócitos cuja alteração estava presente (33,5% vs 39,3%, p=0,001). Não houve

associação estatística significativa entre a presença dos seguintes dismorfismos e a taxa de

formação de blastocistos: granulação citoplasmática, granulação citoplasmática centralizada,

50

presença de VAC, alteração de ZP, alteração de forma, presença de pelo menos um parâmetro

intracitoplasmático ou presença de pelo menos um parâmetro intra ou extracitoplasmático.


Parâmetros de morfologia pronuclear avaliados no dia 1 do desenvolvimento foram

avaliados e registrados para todos os 5850 zigotos obtidos após a ICSI. As incidências das

possíveis alterações do padrão normal de morfologia pronuclear foram descritas na tabela abaixo

(Tab. 14).

TABELA 14: Descrição da incidência das alterações do padrão de morfologia pronuclear

avaliadas no presente estudo.

Morfologia pronuclear Incidência (%)

Alteração de tamanho de PN 7,6

Ocorrência de PN periféricos 5,2

Ocorrência de PN afastados 4,3

Ocorrência de alteração de número de CPN 3,9

Ocorrência de alteração de polarização de CPN 22,5

Alteração na formação do halo citoplasmático 20,4

Detecção de vacúolos em estágio de 2PN 16,4

Padrão anormal de morfologia pronuclear 37,4

PN= Pronúcleo(s), CPN= Corpos precursores de nucléolos

Alterações do padrão de morfologia do PN propriamente dito, incluindo a alteração no

tamanho ou na disposição (periféricos ou afastados) dessa organela não apresentaram incidência

superior a 10% dos zigotos obtidos. Por outro lado, alterações na organização dos CPN durante a

nucleogênese foram observadas em 22,5% dos embriões em estágio de 2PN. Cabe ressaltar que a

detecção de alteração no padrão normal de morfologia pronuclear estava presente em 37,4% dos

embriões avaliados.

51

Os dados de presença ou ausência de alterações no padrão normal de morfologia

pronuclear foram submetidos à análise estatística para estudo do possível valor preditivo destes

parâmetros na taxa de obtenção de blastocistos. Os resultados obtidos foram resumidos na Tab.

15. As taxas de formação de blastocisto descritas correspondem àquelas observadas para zigotos

nos quais as alterações foram detectadas. Nos casos em que houve uma diferença significativa

(p<0,05) para a taxa de formação de blastocisto ou ainda para aqueles casos em que o valor de p

foi não significante, porém <0,2, foram apresentadas também as taxas de formação de blastocisto

para zigotos nos quais as alterações não foram detectadas.

TABELA 15: Taxa de formação de blastocisto de acordo com a alteração do padrão de

morfologia pronuclear detectado nos zigotos obtidos após a ICSI.

Variáveis qualitativas - Morfologia pronuclearTaxa de blastocistos


Alteração de tamanho de PN 31,8 0,003


Ocorrência de PN periféricos 31,9 0,017


Ocorrência de PN afastados 33,3 0,092


Ocorrência de alteração de número de CPN 27,9 0,154


Ocorrência de alteração de polarização de CPN 39,5 0,368

Alteração na formação do halo citoplasmático 42,5 0,002


Incidência de vacúolos em estágio de 2PN 38,5 0,943

Incidência do padrão anormal de morfologia pronuclear 36,8 0,050




52

Dentre as diferenças significativas observadas, os seguintes parâmetros apresentaram uma

menor taxa de blastocistos obtidos quando detectados nos zigotos avaliados: alteração de

tamanho de PN (31,8% vs 39,0%, p=0,003); detecção de PN periféricos no momento da avaliação

(31,9% vs 38,8%, p=0,017) e detecção de padrão pronuclear anormal (36,8% vs 39,4%, p=0,050).

A alteração do parâmetro formação do halo citoplasmático resultou na obtenção de uma maior

taxa de blastocistos formados (39,4% vs 36,8%, p=0,002).

A detecção de PN afastados (33,3% vs 38,7%, p=0,092) e de alteração no número de CPN

(27,9% vs 38,5%, p=0,154) também resultaram em menor taxa de formação de blastocisto, porém

não houve diferença significativa. As variáveis alteração da polarização dos CPN e presença de

vacúolos também não demonstraram associação estatística significativa com a taxa de formação

de blastocistos.

4.2.4) Morfologia do dia 2 do desenvolvimento embrionário

Parâmetros de morfologia embrionária avaliados no dia 2 do desenvolvimento foram

avaliados e registrados para todos os 5850 embriões obtidos após a ICSI. O perfil dos embriões

obtidos, de acordo com os parâmetros avaliados, pode ser observado na tabela abaixo (Tab. 16).

Os dados correspondem à incidência de embriões observados para os diferentes padrões descritos

para os critérios: ritmo de clivagem; simetria de tamanho de blastômeros, fragmentação

citoplasmática; multinucleação e ausência de núcleo.

53


morfologia embrionária avaliados para o dia 2 do desenvolvimento.

Morfologia embrionária - Parâmetros dia 2 Incidência (%)

Ritmo de clivagem

Ritmo normal de clivagem 71,2

Ritmo lento de clivagem 15,3

Ritmo rápido de clivagem 13,5

Ausência de clivagem 1,1

Compactação precoce 0,1

Simetria de tamanho de blastômeros

Blastômeros simétricos ou semelhantes 46,6

Fragmentação citoplasmática

Ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 95,3

Multinucleação / Ausência de núcleo

Multinucleação presente 22,9

Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião 61,8

Ausência de núcleo 22,7

Núcleo ausente em mais de 25% dos blastômeros do embrião 70,5

Ritmo normal de clivagem, presença de blastômeros simétricos ou semelhantes e detecção

de fragmentos anucleados comprometendo até 10% do volume do embrião foram observados em,

respectivamente, 71,2%, 46,6% e 95,3% dos embriões. Considerando-se os critérios discutidos

podemos afirmar que, de modo geral, mais de 50% dos embriões obtidos poderiam ser

classificados como embriões de boa qualidade para o dia 2 do desenvolvimento.

A detecção de blastômeros multinucleados ou de blastômeros com ausência de núcleo no

momento da observação correspondeu a 22,9% e 22,7% dos embriões avaliados. Por outro lado,

dentre os embriões que apresentaram a alterações destes critérios, a multinucleação e a ausência

de núcleo foi detectada em mais de 25% dos blastômeros do embrião em 61,8% e em 70,5% dos

casos, respectivamente.

Variáveis qualitativas (Tab. 17) e quantitativas (Tab. 18) correspondentes aos padrões de

morfologia embrionária do dia 2 do desenvolvimento foram avaliadas quanto ao possível valor

preditivo na taxa de obtenção de blastocistos.

54


avaliados nos embriões em dia 2 do desenvolvimento.

Variáveis qualitativas - Morfologia do dia 2 do desenvolvimentoTaxa de blastocistos


Ritmo de clivagem




Ritmo lento ou rápido de clivagem 18,7



Blastômeros assimétricos 30,8



Ausência de fragmentação 43,2

Ocorrência de fragmentação de tipo II 37,0

Ocorrência de fragmentação de tipo III 36,2

Ocorrência de fragmentação de tipo IV 5,4

Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião (≠ de

tipo IV)40,5

Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo de 10% a 35% do volume do

embrião (≠ de tipo IV)16,2


Multinucleação

Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião 22,1

Multinucleação ausente 43,9

Multinucleação presente, porém mais de 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 15,0

Multinucleação presente, porém até 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 28,8


Multinucleação comprometendo até 25% dos blastômeros do embrião 35,5

Ausência de núcleo

Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião 28,6

Núcleo presente em todos os blastômeros do embrião 41,3


Núcleo ausente em até de 25% dos blastômeros do embrião 36,1

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001


55

Podemos observar que para todos os critérios avaliados no dia 2 do desenvolvimento

embrionário houve uma diferença significativa (p<0,001) entre a taxa de formação de blastocistos

quando detectados padrões de normalidade ou anormalidade para as categorias previamente

definidas. Em todos os casos observamos uma queda significativa na formação de blastocistos

para embriões de dia 2 nos quais os padrões observados foram de anormalidade do critério

avaliado como: ritmo anormal de clivagem; assimetria de blastômeros; detecção de fragmentos

anucleados; presença de multinucleação e presença de blastômeros anucleados. Além disso, o

agravamento do padrão de anormalidade como, por exemplo, um maior comprometimento do

volume embrionário pela presença de fragmentos anucleados, uma maior incidência de

blastômeros multinucleados e/ou anucleados foram determinantes para uma queda significativa

da taxa de obtenção de blastocistos dentre os embriões nos quais tais alterações estavam

presentes.

Corroborando os dados obtidos na avaliação qualitativa dos critérios divididos em

categorias, a avaliação de variáveis quantitativas demonstrou uma diferença significativa para o

número de células do embrião em dia 2, o número de blastômeros multinucleados e a

porcentagem de blastômeros comprometidos pela multinucleação. O grupo de embriões que

atingiu a classificação de blastocisto quando cultivado até o dia 5 do desenvolvimento apresentou

no dia 2 do seu desenvolvimento em sua maioria 4 células em média, um menor número de

blastômeros multinucleados e uma menor porcentagem de blastômeros comprometidos pela

multinucleação quando presente (Tab. 18). A avaliação quantitativa dos critérios número e

porcentagem de blastômeros anucleados não apresentou diferença significativa entre os grupos

Blastocisto (N) ou (S), sendo este último menor para o grupo de embriões que atingiram o estágio

de blastocisto (49,6% vs 50,3%, p=0,1036).

56



desenvolvimento.

Variáveis quantitativas - Morfologia do dia 2

do desenvolvimento

Grupo A

Blastocisto (N)

Grupo B


No de células 4,1 (1,7) 4,1 (0,9) 0,0053

No de blastômeros multinucleados 1,4 (0,6) 1,3 (0,6) 0,0017

% de blastômeros multinucleados 47,5 (26,5) 37,5 (23,5) <0,001

No de blastômeros sem núcleo 1,7 (0,8) 1,7 (0,8) 0,7553

% de blastômeros sem núcleo 50,3 (27,3) 49,6 (30,2) 0,1063

Média (+DP)



Parâmetros de morfologia embrionária avaliados no dia 3 do desenvolvimento foram

avaliados e registrados para todos os 5850 embriões obtidos após a ICSI. O perfil dos embriões

obtidos, de acordo com os parâmetros avaliados, pode ser observado na tabela abaixo (Tab. 19).

Os dados correspondem à incidência de embriões observados para os diferentes padrões descritos

para os critérios: ritmo de clivagem; simetria de tamanho de blastômeros, fragmentação

citoplasmática; multinucleação e ausência de núcleo.

57


morfologia embrionária avaliados para o dia 3 do desenvolvimento.

Morfologia embrionária - Parâmetros dia 3 Incidência (%)

Ritmo de clivagem




Parada de clivagem ou Clivagem de 1 célula em 24 horas 6,2

Embrião compacto 1,0




Ocorrência de fragmentação até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 92,9

Multinucleação / Ausência de núcleo

Multinucleação presente 11,2


Ausência de núcleo 16,8

Núcleo ausente mais de 25% dos blastômeros do embrião 34,6

Ritmo normal de clivagem, presença de blastômeros simétricos ou semelhantes e detecção

de fragmentos anucleados comprometendo até 10% do volume do embrião foram observados em,

respectivamente, 57,4%, 30,7% e 92,9% dos embriões. Considerando-se os critérios discutidos

podemos afirmar que, de modo geral, menos de 50% dos embriões obtidos poderiam ser

classificados como embriões de boa qualidade para o dia 3 do desenvolvimento, diferente do

previamente observado para o dia 2 do desenvolvimento.

A detecção de blastômeros multinucleados ou de blastômeros com ausência de núcleo no

momento da observação correspondeu a 11,2% e 16,8% dos embriões avaliados. Por outro lado,

dentre os embriões que apresentaram a alterações destes critérios, a multinucleação e a ausência

de núcleo foi detectada em mais de 25% dos blastômeros do embrião em 23,5% e em 34,6% dos

casos, respectivamente.

58

Variávies qualitativas (Tab. 20) e quantitativas (Tab. 21) correspondentes aos padrões de


preditivo na taxa de obtenção de blastocistos.

Da mesma forma que o observado anteriormente para a classificação do dia 2, houve uma

diferença significativa (p<0,001) entre a taxa de formação de blastocistos para todos os critérios

avaliados no dia 3 do desenvolvimento embrionário (Tab. 20). Em todos os casos observamos

uma queda significativa na formação de blastocistos para embriões de dia 3 nos quais os padrões

observados foram de anormalidade do critério avaliado como: ritmo anormal de clivagem;

assimetria de blastômeros; detecção de fragmentos anucleados; presença de multinucleação e

presença de blastômeros anucleados. Além disso, mais uma vez o agravamento do padrão de

anormalidade como, por exemplo, um maior comprometimento do volume embrionário pela

presença de fragmentos anucleados, uma maior incidência de blastômeros multinucleados e/ou

anucleados foram determinantes para uma queda significativa da taxa de obtenção de blastocistos

dentre os embriões nos quais tais alterações estavam presentes.

59


avaliados nos embriões em dia 3 do desenvolvimento.

Variáveis qualitativas - Morfologia do dia 3 do desenvolvimentoTaxa de blastocistos


Ritmo de clivagem



















tipo IV)40,3

Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo de 10% a 35% do volume do

embrião (≠ de tipo IV)18,2


Multinucleação












<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001


60

Corroborando os dados obtidos na avaliação qualitativa dos critérios divididos em

categorias, a avaliação de variáveis quantitativas demonstrou uma diferença significativa para o

número de células do embrião em dia 3, o número de blastômeros multinucleados e a

porcentagem de blastômeros comprometidos pela multinucleação. O grupo de embriões que

atingiu a classificação de blastocisto quando cultivado até o dia 5 do desenvolvimento apresentou

no dia 3 do seu desenvolvimento em sua maioria 8 células em média, um menor número de

blastômeros multinucleados e uma menor porcentagem de blastômeros comprometidos pela

multinucleação quando presente, bem como um menor número de blastômeros anucleados e uma

menor porcentagem de blastômeros com ausência de núcleo (Tab. 21).



desenvolvimento.


do desenvolvimento

Grupo A

Blastocisto (N)

Grupo B


No de células 7,2 (2,2) 8,1 (1,5) <0,001


% de blastômeros multinucleados 25,5 (18,1) 17,4 (7,7) <0,001


% de blastômeros sem núcleo 27,8 (15,8) 21,6 (13,1) <0,001

Média (+DP)


4.2.6) Obtenção de um modelo de regressão logística binária

Com o objetivo de determinar a influência dos parâmetros morfológicos na determinação

da viabilidade embrionária, avaliada neste caso como a formação de blastocisto no dia 5 do

desenvolvimento, análises de regressão logística binária múltipla foram realizadas.

Considerando-se os resultados obtidos na análise bivariada, 43 possíveis fatores preditivos foram

inseridos na determinação do modelo.

61

Encontram-se na Tab. 22 as 14 variáveis definidas como preditoras da formação de

blastocisto com o uso da regressão logística binária múltipla.


preditores da obtenção de embriões em estágio de blastocisto quando cultivados até o dia 5 do

desenvolvimento.

Ordem de entrada da

variável no modeloVariáveis selecionadas pelo modelo

Coeficiente da

variável na

equação

Razão de chance

(OR)

Intervalo de confiança

(IC 95%) Valor de P

8 Idade da mulher -0.042 0,959 0,943-0,975 <0,001

11 Taxa média de oócitos recuperados (%) -0.006 0,994 0,990-0,998 0,003

10 EP - Espaço perivitelíneo aumentado -0.403 0,668 0,556-0,804 <0,001

Ritmo lento de clivagem (dia 2) -0.497 0,608 0,474-0,780 <0,001

Ritmo rápido de clivagem (dia 2) -1.048 0,351 0,271-0,453 <0,001

3 Blastômeros assimétricos (dia 2) -0.412 0,663 0,568-0,773 <0,001

14Multinucleação presente, porém mais de 2 núcleos detectados em um mesmo

blastômero (dia 2)-0.415 0,660 0,464-0,939 0,021

4 Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião (dia 2) -0.579 0,560 0,392-0,801 0,001

5 Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião (dia 2) -0.479 0,619 0,525-0,730 <0,001

6 No de células (dia 3) 0.218 1,244 1,145-1,351 <0,001

Ritmo lento de clivagem (dia 3) -0.765 0,465 0,351-0,616 <0,001

Ritmo rápido de clivagem (dia 3) -0.685 0,504 0,370-0,687 <0,001

7 Blastômeros assimétricos (dia 3) -0.392 0,676 0,575-0,795 <0,001

Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do

embrião (≠ de tipo IV) (dia 3) -0.844 0,430 0,261-0,709 0,001

Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 20% do volume do

embrião (≠ de tipo IV) (dia 3) -1.264 0,283 0,155-0,514 <0,001

12 No de blastômeros multinucleados (dia 3) -0.24 0,786 0,663-0,933 0,006

13 No de blastômeros sem núcleo (dia 3) -0.116 0,891 0,815-0,973 0,010

2

1

9

62

A razão de chance ou probabilidade de formação de blastocistos encontra-se listada na

tabela acima para cada variável definida como preditora independente. Além disso, estão listados

acima os coeficientes de cada uma destas variáveis na equação matemática definida pelo modelo,

a qual permite que para cada embrião seja obtida uma probabilidade de formação de blastocisto

com base na soma de valores obtida para os critérios avaliados:

= 0,882 (Constante) + (-0,042 x Idade da mulher) + (-0,006 x Taxa média de oócitos

recuperados) + (-0,403 x Espaço Perivitelineo aumentado (Sim=1 e Não=0)) + (-0,497 x Ritmo

lento de clivagem em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-1,048 x Ritmo rápido de

clivagem em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,412 x Blastômeros assimétricos

em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,415 x Multinucleação presente, porém

mais de 2 núcleos detectados em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 2 do

desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,579 x Multinucleação presente, comprometendo mais

de 25% dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,479 x

Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento

(Sim=1 e Não=0)) + (0,218 x Número de células em dia 3 do desenvolvimento) + (-0,765 x

Ritmo lento de clivagem em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0.685 x Ritmo

rápido de clivagem em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,392 x Blastômeros

assimétricos em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,844 x Ausência ou Presença

de Fragmentos anucleados comprometendo até 10% do volume do embrião em dia 3 (Sim=1 e

Não=0)) + (-1,264 x Ausência ou Presença de Fragmentos anucleados comprometendo até 20%

do volume do embrião em dia 3 (Sim=1 e Não=0)) + (-0,240 x Multinucleação presente em pelo

menos um dos blastômeros do embrião em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-

0,116 x Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 3 do

desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)).

A predição do modelo obteve uma taxa de acerto de 71,7%. Além disso, considerando-se

um ponto de corte de 50% na chance de formação ou não do blastocisto o modelo obteve uma

sensibilidade de 63,8% e especificidade de 76,9% (Fig. 3).

63

Figura 3: Curva ROC para o modelo taxa de formação de blastocistos. A área sob a curva foi

0,780.

64


avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento no potencial de implantação de embriões em

estágio de blastocisto.

Dentre os 1639 embriões transferidos foram incluídos nesta análise 767 embriões sendo

618 embriões provenientes de ciclos com 0% de implantação e 149 embriões provenientes de

ciclos com 100% de implantação.

4.3.1) Dados descritivos

Variáveis quantitativas (Tab. 23) e qualitativas (Tab. 24) correspondentes ao perfil das

pacientes submetidas ao tratamento e ao perfil de resposta clínica e laboratorial foram avaliadas

quanto ao possível valor preditivo no potencial de implantação de embriões em estágio de

blastocisto.

Dentre as diferenças significativas observadas, os seguintes parâmetros apresentaram um

valor médio menor para o grupo de embriões que implantaram após transferência: média de idade

da mulher (32,3+4,1 vs 34,4+3,9; p<0,001); média de idade do homem (35,3+5,4 vs 37,3+5,4;

p<0,001) e número médio de UI de FSH administradas (2179+614 vs 2279+642; p=0,031) (Tab.

23). Para nenhuma outra variável quantitativa descrita na Tabela houve associação estatística

significativa com a ocorrência ou não de implantação embrionária

65

TABELA 23: Descrição das características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA de

acordo com a taxa de implantação dos embriões transferidos em estágio de blastocisto.

Variáveis quantitativas - Perfil geral dos ciclos

de ICSI

Grupo A

Implantação 0%

Grupo B

Implantação 100%Valor de P

Idade mulher 34,4 (3,9) 32,3 (4,1) <0,001

Idade homem 37,3 (5,4) 35,3 (5,4) <0,001

FSH (UI) 2279 (642) 2179 (614) 0,031

E2 (pg/mL) 2319 (1593) 2717 (1942) 0,108

Concentração seminal (106/mL) 40,8 (37,8) 33,3 (27,3) 0,252

Motilidade total (%) 55,5 (17,7) 53,6 (17,5) 0,090

Motilidade progressiva (%) 41,8 (17,2) 39,3 (15,9) 0,114

No de folículos puncionados 22,1 (11,3) 21,6 (9,8) 0,809

No de oócitos recuperados 15,8 (8,1) 15,9 (7,5) 0,591

Taxa média de oócitos recuperados (%) 73,4 (17,4) 75,5 (17,7) 0,151

No de oócitos em grau de maturação nuclear MII 11,9 (6,1) 12,0 (6,0) 0,758

Taxa média de MII (%) 77,1 (15,7) 76,3 (13,8) 0,474

No de oócitos injetados 11,2 (5,2) 10,9 (4,8) 0,730

Taxa média de oócitos injetados (%) 75,1 (18,4) 72,4 (18,9) 0,146

No de oócitos com fertilização normal (2PN) 8,8 (4,3) 8,6 (4,1) 0,845

Taxa média de 2PN (%) 79,6 (15,6) 79,9 (17,8) 0,318

Média (+DP)


Utilizando a classificação de variáveis qualitativas que caracterizam a população do

estudo, as variáveis idade da mulher e idade do homem destacam-se novamente como possíveis

interferentes do potencial de implantação de blastocistos. Mulheres com idade menor ou igual a

37 anos apresentaram uma taxa de implantação dos blastocistos transferidos de 22,5%,

significativamente maior do que a observada para pacientes com idade igual ou superior a 38

anos, que foi de 9,1% (p<0,001), para os homens as taxas obtidas foram de 22,4% e 15,6%,

respectivamente, com p=0,023 (Tab. 24). A estratégia de bloqueio hipofisário, o tipo de

gonadotrofina aplicada para EOC, o diagnóstico clínico de endometriose, a concentração e

66

motilidade seminal total não apresentaram associação estatística significativa com a taxa de

implantação embrionária.

TABELA 24: Taxa de implantação dos blastocistos transferidos de acordo com as características

dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA.

Variáveis qualitativas - Perfil geral dos ciclos

de ICSI

Taxa de implantação

embrionária (%)Valor de P

Idade da mulher

<37a 22,5

>38a 9,1

Idade do homem

<37a 22,4

>38a 15,6

Bloqueio hipofisário

GnRH agonista 16,9

GnRH antagonista 19,7


FSH urinário 16,0

FSH recombinante 19,8

Fator de infertilidade

Endometriose (N) 19,4

Endometriose (S) 19,4

Perfil seminal

Concentração inicial

>15 (106/mL) 19,6

<15 (106/mL) 18,7

Motilidade total

>40% 18,5

<40% 22,5

Motilidade progressiva

>32% 19,6

<32% 18,0

<0,001

0,023

0,587

0,515

0,998

0,783

0,309

0,638


67

4.3.2) Morfologia oocitária

Os dados de presença ou a ausência dos dismorfismos oocitários avaliados foram

submetidos à análise estatística para estudo do possível valor preditivo destes parâmetros no

potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. Os resultados obtidos foram

resumidos na Tab. 25. As taxas de implantação embrionária descritas correspondem àquelas

observadas para embriões provenientes de oócitos nos quais as alterações foram detectadas. Nos

casos em que houve uma diferença significativa (p<0,05) para a taxa de implantação entre oócitos

nos quais as alterações estavam ou não presentes foram relatadas também as taxas de implantação

obtidas na ausência das alterações.

TABELA 25: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com o

dismorfismo oocitário detectado no oócito submetido à ICSI.

Variáveis qualitativas - Dismorfismos oocitáriosTaxa de implantação


CG - Granulação citoplasmática 19,0 0,204*

CL - Granulação citoplasmática centralizada 25,4 0,226*

RE - Acúmulo de Retículo endoplasmático liso 0,0 0,012 +


VAC - Presença de vacúolos 19,2 0,326*

Alteração de pelo menos um parâmetro intracitoplasmático 19,0 0,168*

DB - Presença de debris no espaço perivitelíneo 20,5 0,448*

ZP - Alteração de zona pelúcida 7,4 0,108*


EP - Espaço perivitelíneo aumentado 18,1 0,711*

CP frag - Corpúsculo polar fragmentado 18,1 0,469*

FORMA - Alteração de forma 22,2 0,689+

Alteração de pelo menos um parâmetro extracitoplasmático 19,5 0,963*

Alteração de pelo menos um parâmetro intra ou extracitoplasmático 19,5 1,0+

Nota: Teste estatístico aplicado – *Qui-quadrado ou +Exato de Fisher.

A transferência de embriões em estágio de blastocisto provenientes de oócitos nos quais

foi detectada a presença de agregados de REL resultou em falha total de implantação (taxa de

68

implantação de 0%), sendo de 20% a taxa de implantação obtida na ausência de detecção desta

alteração no dia 0 do desenvolvimento embrionário (p=0,012). A detecção de nenhum outro

dismorfismo oocitário apresentou associação estatística significativa com a taxa de implantação

embrionária. Apesar da reduzida taxa de implantação de blastocistos provenientes de oócitos com

alteração de zona pelúcida (7,4%), não houve diferença significativa quando comparada a taxa de

implantação (19,9%) obtida na ausência desta alteração oocitária (p=0,108).


Os dados de detecção ou ausência de alterações no padrão normal de morfologia

pronuclear foram submetidos à análise estatística para estudo do possível valor preditivo destes

parâmetros no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. Os resultados

obtidos foram resumidos na Tab. 26. As taxas de implantação embrionária descritas

correspondem àquelas observadas para zigotos nos quais as alterações foram detectadas. Nos

casos em que o valor de p foi não significante, porém a diferença entre as taxas foi considerada

relevante, foram apresentadas também as taxas de implantação para blastocistos provenientes de

zigotos nos quais as alterações não foram detectadas.

69

TABELA 26: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com a

alteração do padrão de morfologia pronuclear detectado nos zigotos obtidos após a ICSI.

Variáveis qualitativas - Morfologia pronuclearTaxa de implantação


Alteração de tamanho de PN 10,0 0,183*


Ocorrência de PN periféricos 14,3 0,484*


Ocorrência de PN afastados 15,4 0,596*


Ocorrência de alteração de número de CPN 0,0 1,0+


Ocorrência de alteração de polarização de CPN 16,9 0,107*

Alteração na formação do halo citoplasmático 16,5 0,232*


Incidência de vacúolos em estágio de 2PN 20,0 0,863*

Incidência do padrão anormal de morfologia pronuclear 21,8 0,272*



Nenhuma das variáveis apresentou diferença significativa para a taxa de implantação de

blastocistos provenientes de zigotos nos quais alterações nos parâmetros de morfologia

pronuclear haviam ou não sido detectados, apesar de terem sido observadas diferenças relevantes

nos valores obtidos. Cabe destacar a queda da taxa de implantação de blastocistos provenientes

de zigotos nos quais havia sido detectada alteração de tamanho de PN (10,0% vs 19,8%,

p=0,183). Dada à relevância desta informação, bem como o fato de o nível de significância ser

<0,2, o valor preditivo da variável poderá ser avaliado no ajuste do modelo de regressão logística.

70




preditivo no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto.

Podemos observar que houve uma diferença significativa para a taxa de implantação de

blastocistos quando detectados padrões de normalidade ou anormalidade, segundo as categorias

previamente definidas, para os seguintes critérios do dia 2 do desenvolvimento embrionário:

ritmo de clivagem, detecção de fragmentos anucleados; presença de multinucleação e presença de

blastômeros anucleados. Apesar da redução observada para implantação de blastocistos que

apresentaram blastômeros assimétricos em dia 2 (16,1% vs 21,2%, p=0,084), não houve diferença

estatística significativa (Tab. 27). No entanto, dada a relevância desta informação, bem como o

fato de o nível de significância ser <0,2, o valor preditivo da variável poderá ser avaliado no

ajuste do modelo de regressão logística.

O agravamento do padrão de anormalidade com relação ao número de núcleos detectados

e a incidência de blastômeros multinucleados não foi determinante de uma queda significativa na

taxa de implantação de blastocistos para os quais a multinucleação havia sido detectada. No

entanto, as diferenças observadas podem ser consideradas relevantes sendo de 8,5% a taxa de

implantação para embriões multinucleados nos quais foram detectados até 2 núcleos em um

mesmo blastômero e de 0% para os quais houve detecção de mais de 2 núcleos (p=0,291).

Observamos ainda uma taxa de implantação de 7,0% para embriões multinucleados nos quais até

25% dos blastômeros estavam comprometidos e de 3,4% para os quais houve comprometimento

de mais de 25% dos blastômeros (p=0,644).

71


critérios morfológicos detectados nos embriões em dia 2 do desenvolvimento.

Variáveis qualitativas - Morfologia do dia 2 do desenvolvimentoTaxa de implantação


Ritmo de clivagem













Ocorrência de fragmentação de tipo IV -



tipo IV)15,5


tipo IV)15,7

Multinucleação












0,022*

0,021 *

0,006 *

0,084*

0,064*

0,002*

0,291+

0,644+

0,029*

0,528+


72

Não houve diferença significativa para as variáveis quantitativas de classificação dos

embriões no dia 2 do desenvolvimento entre o grupo de embriões que implantaram com relação

àqueles que não implantaram (Tab.28).



transferidos em estágio de blastocisto.


do desenvolvimento

Grupo A

Implantação 0%

Grupo B


No de células 4,0 (0,8) 4,0 (0,5) 0,9242


% de blastômeros multinucleados 39,5 (24,8) 35,4 (20,8) 0,8634



Média (+DP)





preditivo no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto.

73


critérios morfológicos detectados nos embriões em dia 3 do desenvolvimento.

Variáveis qualitativas - Morfologia do dia 3 do desenvolvimentoTaxa de implantação


Ritmo de clivagem













Ocorrência de fragmentação de tipo IV -


Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião

(≠ de tipo IV)16,8

Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 20% do volume do embrião

(≠ de tipo IV)16,7

Multinucleação












0,075*

0,096*

0,031 *

0,015 *

0,204*

0,081*

1,0+

0,168*

0,198+

1,0+


74

Podemos observar que houve uma diferença significativa para a taxa de implantação de

blastocistos quando detectados padrões de normalidade ou anormalidade, segundo as categorias

previamente definidas, para os seguintes critérios do dia 3 do desenvolvimento embrionário:

ritmo de clivagem e simetria de blastômeros.

Apesar da redução observada para implantação de blastocistos que apresentaram em dia 3

presença de fragmentos anucleados, presença de multinucleação e presença de blastômeros

anucleados, não houve diferença estatística significativa (Tab. 29). No entanto, dada a relevância

destas informações, bem como o fato de o nível de significância ser <0,2, o valor preditivo das

variáveis poderá ser avaliado no ajuste do modelo de regressão logística.

O agravamento do padrão de anormalidade com relação à incidência de blastômeros

multinucleados e/ou anucleados não foi determinante para uma queda significativa na taxa de

implantação de blastocistos para os quais havia sido detectada a presença destas alterações.

Não houve diferença significativa para as variáveis quantitativas de classificação dos

embriões no dia 3 do desenvolvimento entre o grupo de embriões que implantaram com relação

àqueles que não implantaram.



transferidos em estágio de blastocisto.


do desenvolvimento

Grupo A

Implantação 0%

Grupo B


No de células 8,0 (1,3) 7,9 (0,9) 0,9380


% de blastômeros multinucleados 16,1 (5,3) 12,9 (0,9) 0,2711



Média (+DP)


75

4.3.6) Obtenção de um modelo de regressão logística binária

Com o objetivo de determinar a influência dos parâmetros morfológicos na determinação

da viabilidade embrionária, avaliada neste caso como o potencial de implantação de blastocistos

transferidos no dia 5 do desenvolvimento, análises de regressão logística binária múltipla foram

realizadas. Considerando-se os resultados obtidos na análise bivariada, 20 possíveis fatores

preditivos foram inseridos na determinação do modelo.

Encontram-se na Tab. 31 as 4 variáveis definidas como preditoras do potencial de

implantação dos blastocistos transferidos com o uso da regressão logística binária múltipla.


preditores do potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto após transferência

embrionária.

Variáveis selecionadas pelo modeloCoeficiente da variável na

equação

Razão de chance

(OR)

Intervalo de confiança

(IC 95%) Valor de P

Idade da mulher -0.131 0,878 0,833-0,925 <0,001

Blastômeros assimétricos (dia 2) -0.471 0,624 0,393-0,992 0,046

Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião (dia 2) -1.369 0,254 0,088-0,732 0,011

Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião (dia 2) -0.796 0,451 0,221-0,923 0,029

76

A razão de chance ou probabilidade de implantação dos blastocistos transferidos encontra-

se listada na tabela acima para cada variável definida como preditora independente. Além disso,

estão listados acima os coeficientes de cada uma destas variáveis na equação matemática definida

pelo modelo, a qual permite que para cada embrião seja obtida uma probabilidade de implantação

com base na soma de valores obtida para os critérios avaliados:

= 3,34 (Constante) + (-0,131 x Idade da mulher) + (-0,471 x Blastômeros assimétricos em dia 2

do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-1,369 x Multinucleação presente em pelo menos um

dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,796 x

Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento

(Sim=1 e Não=0)).

A predição do modelo obteve uma taxa de acerto de 80,1%. Além disso, considerando-se

um ponto de corte de 50% na chance de implantação ou não do blastocisto o modelo obteve uma

sensibilidade de 3,2% e especificidade de 99,4%.

77

5) DISCUSSÃO

Dados descritivos

A qualidade de oócitos e embriões pode ser afetada de modo negativo por fatores

diversos, incluindo idade materna (de Bruin et al. 2004, te Velde & Pearson 2002, Keefe,

Marquard, & Liu 2006), idade paterna (Simon et al. 2014, Robertshaw et al. 2014, Ferreira et al.

2010), dose de FSH e resposta ao EOC (Figueira et al. 2010, Figueira et al. 2011, Greb, Behre, &

Simoni 2005), dentre outros.

No presente estudo, pudemos observar um amplo intervalo para a variável idade dos

casais submetidos ao tratamento cujos dados laboratoriais foram avaliados, sendo de 21 a 45 anos

para as mulheres e de 25 a 63 anos para os homens. O mesmo foi observado para as variáveis (i)

dose total de FSH administrada durante EOC que variou de 600 a 4950 UI e (ii) nível sérico de E2

com resultados de 125 a 10000 pg/mL, sendo este último associado aos intervalos observados

para o número de folículos puncionados (de 2 a 64 folículos) e para o número de oócitos

recuperados (de 1 a 50 oócitos). Cabe ressaltar que nenhum critério de exclusão foi aplicado para

as variáveis em questão dado que estas foram avaliadas quanto ao possível valor preditivo frente

à taxa de formação de blastocistos e a taxa de implantação embrionária, variáveis de resposta

deste estudo.

Idade

A queda da fertilidade, definida como a capacidade biológica de reprodução, com o

aumento da idade da mulher tem sido foco de estudos epidemiológicos e demográficos há

décadas, os quais consistentemente demonstram que o início da queda ocorre por volta dos 35

anos (Menken, Trussell, & Larsen 1986, te Velde & Pearson 2002, Leridon 2004, Weinstein,

Wood, & Greenfield 1993). O estudo de Piette et al. (1990) sugere 37 anos como valor de corte

na idade da mulher para uma redução significativa das chances de gravidez. As bases biológicas

para o declínio da fecundidade com o aumento da idade parecem estar relacionadas com o

declínio da quantidade e qualidade dos oócitos da coorte folicular. A qualidade oocitária diminui

em paralelo à diminuição progressiva do número de folículos (Faddy et al. 1992, te Velde &

Pearson 2002). A incidência de aneuploidia parece ser a maior causa de declínio da qualidade

78

oocitária, sendo o principal mecanismo relacionado a este fato a ocorrência da não-disjunção

cromossômica durante a meiose destes oócitos (Battaglia et al. 1996, Jones 2008). De fato,

embriões provenientes de mulheres com idade superior a 37 anos submetidas à FIV apresentam,

em sua maioria, anormalidades cromossômicas incluindo inúmeras combinações de monossomias

e trissomias (Munné et al. 1995, Gianaroli et al. 1999, Wells & Delhanty 2000, Munné 2006).

Segundo Wells e Delhanty (2000) a ocorrência da não-disjunção cromossômica nos eventos de

mitose durante o desenvolvimento embrionário também estaria associado ao comprometimento

oocitário com o avanço da idade.

No presente estudo, a variável idade da mulher apresentou um valor médio menor para o

grupo de embriões que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento. Além

disso, pacientes com idade igual ou superior a 38 anos apresentaram uma taxa de formação de

blastocistos significativamente menor do que a observada para pacientes com idade inferior a 37

anos. Resultados similares foram obtidos por outros estudos, demonstrando uma associação da

queda de desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto com a idade da paciente

(Janny & Menezo 1996, Shapiro et al. 2002, Braga et al. 2012). O estágio de blastocisto não pode

ser considerado indicador de normalidade cromossômica embrionária. Porém, embriões

aneuplóides apresentam maior taxa de parada de desenvolvimento entre o dia 3 e os dias 5-6 do

desenvolvimento, quando comparados àqueles diagnosticados como euplóides (Magli et al.

2000). Desta forma, podemos sugerir que a maior incidência de embriões cromossomicamente

anormais justifica a menor taxa de formação de blastocistos para pacientes de maior faixa etária.

Além disso, postula-se que os embriões obtidos de pacientes com idade avançada apresentam

uma capacidade diminuída de implantação (Navot et al. 1991, Shapiro et al. 2002). Os dados

obtidos no presente estudo corroboram estas observações dado que a média de idade da mulher

apresentou-se como fator interferente da capacidade de implantação dos blastocistos formados,

sendo esta menor para o grupo de embriões implantados após transferência. Além disso, mulheres

com idade menor ou igual a 37 anos apresentaram uma taxa de implantação dos blastocistos

transferidos significativamente maior do que a observada para pacientes com idade igual ou

superior a 38 anos.

Da mesma forma, observamos um menor potencial de implantação para blastocistos

provenientes de oócitos injetados com espermatozoides de pacientes com idade igual ou superior

a 38 anos. Blastocistos com maior taxa de implantação foram observados para homens com

79

menor média de idade. Diferente do observado para a idade materna, os efeitos do avanço da

idade paterna nos resultados dos tratamentos de RHA são controversos. Alguns autores

associaram o declínio das taxas de gestação com o avanço da idade paterna (Ford et al. 2000,

Klonoff-Cohen & Natarajan 2004, Ferreira et al. 2010). Outros estudos sugerem que não há

associação da idade paterna com a qualidade embrionária e com as taxas de sucesso do

tratamento (Braga et al. 2012, Spandorfer et al. 1998).

A função reprodutiva masculina não sofre uma mudança abrupta com a idade, porém

alguns fatores importantes podem ser afetados com o avanço da idade. O declínio dos parâmetros

seminais como volume, concentração, motilidade e morfologia foram observados com o aumento

da idade do homem (Aboulghar et al. 2007, Plas et al. 2000, Kühnert & Nieschlag 2004). Além

disso, a fragmentação de DNA do espermatozoide, fator que pode ser um importante preditor das

taxas de sucesso, foi previamente associado com a idade paterna (Larson-Cook et al. 2003). Uma

maior porcentagem de fragmentação foi observada em pacientes de idade avançada (Moskovtsev,

Willis, & Mullen 2006). Tesarik, Greco, & Mendoza (2004) sugerem que a fragmentação de

DNA do espermatozoide apresenta um efeito adverso tardio no desenvolvimento embrionário,

sem efeito negativo aparente na morfologia dos embriões transferidos. O presente estudo

corrobora com tais informações uma vez que apesar de nenhum efeito ter sido observado para a

taxa de blastocistos formados, foi observado um efeito negativo da idade paterna no potencial de

implantação dos blastocistos obtidos. Além disso, um estudo do nosso grupo já havia

demonstrado a ausência de influência da idade paterna na qualidade morfológica dos blastocistos

obtidos (Braga et al. 2012). A idade paterna também foi associada a uma maior frequência de

alterações cromossômicas (Martin 2008). Assim, alterações genéticas podem também ser

associadas com o prejuízo da implantação dos embriões obtidos.


De modo geral pudemos observar que um EOC que resulte não apenas em menor resposta

folicular (uso de menor quantidade de FSH e obtenção de um menor número de oócitos), mas que

também resulte em um melhor aproveitamento dos oócitos obtidos (maiores taxas de oócitos em

MII, aptos para ICSI, e de melhor qualidade que resultem em maior taxa de 2PN) implicaria em

maior chance de obtenção de embriões em estágio de blastocisto no dia 5. Estudos anteriores

80

demonstraram que de fato o aproveitamento do ciclo de tratamento pode ser menor para aqueles

nos quais o EOC resulta em um grande número de oócitos recuperados. A fertilização, primeiro

evento de possível perda oocitária durante um ciclo de FIV parace não ser afetada pelo número

de oócitos recuperados (Figueira et al. 2011, De Sutter et al. 1996). Por outro lado, a porcentagem

de embriões de boa qualidade decresce significativamente de acordo com a taxa de recuperação

oocitária (Figueira et al. 2011, Klinkert et al. 2005). Protocolos agressivos de estimulação podem

ser responsáveis pela baixa taxa de embriões de boa qualidade (Baart et al. 2007) e, portanto,

pelas taxas significativamente menores de formação de blastocistos observadas no presente

estudo para pacientes que apresentaram valores médios maiores para o número de unidades de

FSH administradas, o número médio de oócitos recuperados após punção folicular e para a taxa

média de oócitos recuperados. Além disso, taxas significativamente menores de implantação

foram obtidas após transferência de blastocistos provenientes de ciclos nos quais uma maior dose

de FSH havia sido utilizada.

Em um ciclo natural, geralmente apenas um folículo antral torna-se dominante enquanto o

restante dos folículos em desenvolvimento será destinado à atresia. Por outro lado, durante um

EOC estes folículos serão resgatados e os oócitos obtidos poderão estar intrinsicamente

comprometidos (Kovalevsky & Patrizio 2005, Patrizio et al. 2007). Desta forma, oócitos de

diferentes qualidades são recuperados após punção folicular de pacientes submetidas ao EOC,

principalmente resultado da falta de sincronização dos eventos de maturação citoplasmática e

nuclear na maturação oocitária (Ebner, Moser, & Tews 2006). Além disso, a habilidade de

retomada da meiose e a competência para o desenvolvimento pré-implantacional é

progressivamente determinada durante a fase antral (Bukovsky et al. 2005). Tais modificações

envolvem ambos os compartimentos nuclear e citoplasmático e eventos intracelulares que podem

ser afetados por uma hiperestimulação ovariana. Estudos de Plachot & Crozet (1992), Haaf et al.

(2009) sugerem que o desenvolvimento de uma menor coorte oocitária pode representar uma

resposta mais apropriada à estimulacão ovariana, permitindo apenas que os mais competentes

folículos e oócitos se desenvolvam, aumentando a qualidade e maturidade oocitária. De fato,

pacientes que apresentaram um melhor aproveitamento oocitário com valores maiores de taxa

média de oóciots MII, taxa média de oócitos injetados e taxa média de oócitos com fertilização

normal apresentaram uma maior taxa de blastocistos formados.

81

Protocolos de estimulação mínima devem ser considerados como alternativa válida

expondo a paciente a menores níveis hormonais, mantendo um ambiente hormonal melhor

balanceado para o endométrio e limitando o risco de hiperestimulação ovariana (Hurst, Tucker, &

Schlaff 2002, Edwards 2007, Nygren 2007). Além disso, estudos prévios demonstraram que uma

estimulação ovariana leve, levando a uma menor recuperação oocitária, está associada a uma

menor proporção de embriões aneuplóides (Baart, Macklon, & Fauser 2009).

Amostra seminal

No presente estudo, observamos um valor médio menor da variável motilidade seminal

total para o grupo de embriões que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5 do

desenvolvimento. Além disso, observamos uma taxa de blastocistos formados maior para o grupo

que apresentou motilidade progressiva de padrão anormal sendo segundo a OMS (OMS 2010).

Apesar de as taxas de sucesso da ICSI terem sido previamente consideradas não dependentes de

parâmetros seminais básicos (Nagy et al. 1995), relatos mais recentes sugerem que falhas

repetidas após ICSI podem ser relacionadas a fatores derivados do espermatozoide e seu papel no

desenvolvimento embrionário pré-implantacional (Tesarik 2005, Barroso et al. 2009, Tesarik,

Mendoza-Tesarik, & Mendoza 2006). Apesar da correlação negativa observada entre a qualidade

seminal e o desenvolvimento embrionário (Verza & Esteves 2008), o parâmetro motilidade não

foi associado ao comprometimento do potencial de implantação de blastocistos (Braga, Setti,

Vingris, et al. 2013). O uso da técnica de ICSI e a seleção artificial do espermatozoide a ser

injetado pelo embriologista podem implicar na perda do possível papel preditivo da variável

motilidade. O potencial da variável em questão talvez pudesse ser melhor avaliado em ciclos de

FIV convencional no qual ocorre a seleção natural do espermatozoide capaz de atingir e fecundar

o óvulo ou em caso de ausência total de espermatozoides movéis disponíveis para ICSI (Liu et al.

1995, Tesarik 2005).

82

Morfologia oocitária

A qualidade oocitária pode ser considerada um fator chave na fertilidade feminina sendo

previamente reportado que o desenvolvimento de anomalias intra e extracitoplasmáticas durante

o processo de maturação podem resultar em falha de fertilização (Rienzi et al. 2008, Ebner et al.

2005), aneuploidia cromossômica (Van Blerkom & Henry 1992) e alteração do desenvolvimento

embrionário (Ebner, Moser, & Tews 2006).

Espaço perivitelineo aumentado

No presente estudo observamos um efeito negativo da presença de EP aumentado na taxa

de formação de blastocistos provenientes de oócitos nos quais este dismorfismo havia sido

detectado no momento da ICSI.

Estudos anteriores demonstraram uma menor probabilidade de fertilização em oócitos que

apresentaram EP aumentado (Figueira et al. 2010, Rienzi, Vajta, & Ubaldi 2011, Setti et al.

2011). Segundo revisão sistemática (Rienzi, Vajta, & Ubaldi 2011), a alteração de tamanho do

EP foi previamente avaliada de modo individual em 8 publicações, além de ser incluído em

sistemas de avaliação da morfologia oocitária em outros 3 relatos. Balaban et al. (1998), Rienzi

et al. (2008), De Sutter et al. (1996), Balaban et al. (2008) não observaram uma correlação

significativa entre a presença deste dismorfismo e o desenvolvimento embrionário. No entanto,

os resultados deste estudo corroboram com os dados de Ten et al. (2007) e Chamayou et al.

(2006), os quais encontraram uma correlação entre o tamanho do EP e a qualidade embrionária.

Além disso, a influência negativa da presença de EP aumentado na qualidade dos blastocistos

obtidos, incluindo grau de expansão e qualidade da MCI e do TE foi previamente descrita (Braga,

Setti, Figueira, Machado, et al. 2013).

A falta de consenso pode ser associada a diversos fatores. Segundo Balaban & Urman

(2006), defeitos EC devem ser considerados variações fenotípicas resultante da heterogeneidade

dos oócitos recuperados, sem implicação clínica. Além disso, segundo conclusão do consenso, a

alteração do tamanho do EP deve ser registrada apenas nos casos nos quais o mesmo apresentar-

se excepcionalmente aumentado (Embryology 2011).

83

Não houve associação com os índices de gestação e implantação e a presença de EP

aumentado em nenhum dos relatos anteriores. Da mesma forma, não houve associação da

presença deste dismorfismo com o potencial de implantação dos blastocistos transferidos no

presente estudo.

Retículo endoplasmático liso

Os resultados do presente estudo demonstraram uma influência negativa da presença de

agregados de REL no potencial de implantação de blastocistos provenientes de oócitos nos quais

este dismorfismo estava presente. A frequência relativamente baixa de ocorrência deste

dismorfismo pode ser apontada como motivo do efeito deste critério não ter sido avaliado

individualmente. Assim, a maioria dos estudos não avalia a ocorrência de vacúolos e agregados

de REL como critérios individuais (Xia 1997, Ebner et al. 2001, De Sutter et al. 1996, Wilding et

al. 2007, Serhal et al. 1997, Loutradis et al. 1999), sendo estes classificados como inclusões

citoplasmáticas. De acordo com estes estudos, inclusões citoplasmáticas não apresentam

correlação com fertilização, qualidade embrionária e taxas de implantação (Balaban et al. 1998,

De Sutter et al. 1996). Por outro lado, alguns estudos associaram a presença do aglomerado de

REL com reduzidas taxas de fertilização e comprometimento da qualidade embrionária (Xia

1997, Otsuki et al. 2004). Ebner, Moser, et al. (2008) demonstraram não haver limitação do

desenvolvimento embrionário até os dia 3 e 4 uma vez fertilizado com sucesso o oócito no qual a

alteração estava presente. No entanto, um número significativamente menor de blastocistos foi

observado para embriões derivados destes oócitos. Otsuki et al. (2004) relataram uma taxa de

apenas 18,2% de gametas afetados que atingem o estágio de blastocisto no dia 5 do

desenvolvimento. Além disso, Braga, Setti, Figueira, Machado, et al. (2013) demonstraram que a

presença deste dismorfismo influencia de modo negativo o grau de expansão e a qualidade da

MCI dos blastocistos obtidos. Em outros dois estudos prévios nos quais a presença de agregados

de REL foi individualmente registrada, resultados controversos foram relatados sendo observadas

menores chances de sucesso de fertilização e gestação (Sá et al. 2011) ou a ausência de influência

deste dismosfirmo nas taxas de sucesso (Rienzi et al. 2008).

De acordo com Otsuki et al. (2004), a presença deste dismorfismo está associada com

uma menor chance de gestação, até mesmo para oócitos não portadores desta alteração, porém

84

provenientes de uma coorte oocitária na qual o agregado de REL foi detectado. Ciclos nos quais

oócitos portadores de aglomerados de REL foram identificados apresentaram taxas

significativamente maiores de gestação bioquímica (22,2% vs 3,5%) e reduzidas taxas de

gestação clínica (28,2% vs 5,6%). Apenas uma gestação positiva foi relatada neste estudo, sendo

o bebê nascido diagnosticado com a Síndrome Beckwith-Wiedemann. No presente estudo, a

transferência de embriões em estágio de blastocisto provenientes de oócitos nos quais foi

detectada a presença de agregados de REL resultou em falha total de implantação. Além das

chances reduzidas de sucesso, a presença de agregados de REL foi associada com anomalias

fetais (Akarsu et al. 2009). Apesar de a presença deste dismorfismo estar associada com uma

maior taxa de aneuploidia oocitária (18-37%), a organização do fuso meiótico não foi afetada

pela presença mesmo de grandes aglomerados de REL (Chamayou et al. 2006).

Dados os riscos do desenvolvimento de embriões derivados de gametas alterados sugere-

se que gametas portadores deste dismorfismo não sejam inseminados (Embryology 2011). No

entanto, em publicações recentes Mateizel et al. (2013), Ebner, Shebl, & Oppelt (2013)

demonstraram que bebês saudáveis poderiam ser obtidos a partir destes gametas. Em um estudo

de revisão sistemática, Shaw-Jackson et al. (2014) relataram o nascimento de 183 bebês

provenientes de oócitos portadores de agregados de REL, sendo 171 bebês saudáveis, 8 nascidos

portadores de malformação, 3 mortes neonatais, 1 natimorto e 4 abortamentos. Os resultados

sugerem uma revisão da opinião do consenso, bem como a necessidade de um maior número de

estudos de forma que possamos melhor compreender a origem deste dismorfismo e evitar sua

ocorrência.

Assim, uma análise da literatura demonstra que o efeito de alterações da morfologia

oocitária nas taxas de sucesso após ICSI permanece controverso, fazendo com que exista uma

tendência de não se considerar a morfologia oocitária no processo de decisão durante a seleção de

embriões ou blastocistos para transferência. No presente estudo resultados diferente do esperado

foram observados para muitos dos dismorfismos sendo que o acúmulo de REL, a presença de

debris no espaço perivitelineo, o espaço perivitelineo aumentado, a fragmentação do 1o

corpúsculo polar e a detecção de alteração de pelo menos um dos parâmetros

extracitoplasmáticos foram fatores de influência positiva na taxa de obtenção de blastocistos.

Considerando-se que muitos dismorfirmos oocitários são avaliados em conjunto, e não

85

individualmente, ou não são avaliados em muitos destes estudos, o papel negativo das alterações

de morfologia oocitária na competência embrionária ainda não foi elucidado. Além disso, o

impacto da qualidade oocitária no desenvolvimento embrionário pré-implantacional parece estar

relacionado ao número e grau de extensão dos dismorfismos, dificultando a realização de estudos

comparativos (Embryology 2011). Em contraste com os processos in vivo, nos quais a maturação

ocorre como resultado de um longo e meticuloso processo de seleção natural (Van Soom et al.

2007), procedimentos de estimulação ovariana suprimem este mecanismo de seleção permitindo

a maturação de oócitos de qualidade comprometida de forma inerente, destinados à falha de

fertilização e desenvolvimento embrionário comprometido (Swain & Pool 2008). A qualidade

oocitária é determinada não apenas pelo genoma nuclear e mitocondrial, mas também pelo

microambiente do ovário e do folículo pré-ovulatório capaz de modificar a transcrição gênica e a

tradução de proteínas. Avaliando este complexo cenário, torna-se difícil acreditar que um simples

fator, característica ou mecanismo possa de forma adequada indicar a competência oocitária.

Uma análise complexa baseada em sistemas de pontuação parece ser uma estratégia promissora,

porém resultados contraditórios também foram observados nestes estudos dadas variações nos

sistemas de pontuação (Rienzi et al. 2008, La Sala et al. 2009).

Morfologia do dia 1 do desenvolvimento

O valor preditivo da morfologia pronuclear tem sido foco de estudos nos últimos anos. O

efeito prognóstico foi abordado (Scott & Smith 1998, Tesarik & Greco 1999, Scott et al. 2000,

Scott 2003, Braga, Setti, Figueira, Iaconelli, et al. 2013, Balaban et al. 2001, Tesarik et al. 2000,

Nagy et al. 2003), bem como a correlação com aneuploidia (Sadowy et al. 1998, Gianaroli et al.

2003). Por outro lado, alguns autores não observaram o valor preditivo deste critério (Salumets et

al. 2001, James et al. 2006, Weitzman et al. 2010). As alterações mais frequentes observadas em

zigotos incluem o tamanho e posição dos PN, o número e distribuição dos CPN e o halo

citoplasmático. Conforme sugestão do consenso, alterações de tamanho ou localização nuclear

devem sem registradas, bem como alterações do número de CPN. PN apresentando nenhum ou

apenas um CPN devem ser associados ao desenvolvimento anormal (Embryology 2011).

86

Morfologia pronuclear

Scott et al. (2000) demonstraram a ocorrência de uma forte correlação entre a

classificação da morfologia pronuclear com a morfologia dos embriões no dia 3 do

desenvolvimento e com a capacidade de formação de blastocisto no dia 5. Braga, Setti, Figueira,

Iaconelli, et al. (2013) e Balaban et al. (2001) demonstraram que o padrão pronuclear do zigoto

está diretamente correlacionado com a formação e a qualidade dos blastocistos. De modo geral,

segundo estudos prévios a normalidade do padrão nuclear em zigotos está associada a melhor

classificação morfológica em estágio de clivagem, a maior taxa de formação de blastocistos e a

obtenção de blastocistos de melhor qualidade. De fato, no presente estudo observamos uma taxa

significativamente menor de formação de blastocistos para zigotos que apresentaram alteração de

tamanho de PN, localização pronuclear periférica ou padrão geral de morfologia pronuclear

alterado, sendo o maior impacto observado para a observação de alteração do tamanho dos PN. A

alteração do tamanho dos PN foi previamente sugerida como o principal critério avaliado no dia 1

do desenvolvimento capaz de comprometer o desenvolvimento embrionário nos estágios de

clivagem e na formação de blastocistos (Gámiz et al. 2003, Scott 2003). Além disso, a detecção

de PN afastados e a alteração do número de CPN também resultaram em menor taxa de formação

de blastocistos, porém não foi observada diferença estatística significativa. Sendo estas as

alterações detectadas com menor incidência, houve provavelmente uma limitação do número de

eventos no grupo “alteração presente” não permitindo que fosse observada uma diferença

significativa. Cabe ressaltar que muitos estudos baseiam-se apenas na distribuição dos CPN para

classificação da morfologia pronuclear (Balaban et al. 2001, Fisch et al. 2001). Além disso, o

afastamento dos PN foi previamente associado com pior qualidade embrionária e reduzido

potencial de desenvolvimento (Scott et al. 2000, Scott 2003, Zollner et al. 2002).

O estabelecimento dos critérios preditivos de seleção embrionária em dia 1 do

desenvolvimento torna-se relevante em alguns países cuja legislação exige que a seleção

embrionária seja realizada no estágio de zigoto, eliminando ainda neste estágio embriões com

potencial de implantação comprometido (Montag, van der Ven, & Group 2001). Por outro lado,

considerando-se o cultivo prolongado de embriões, a avaliação embrionária nos dias 2 e 3 seria

capaz de fornecer informações indiretas a respeito da qualidade dos gametas, dado que gametas

anormais não produziriam embriões de desenvolvimento normal, além de um maior número de

87

informações referentes a qualidade embrionária. Além disso, o desenvolvimento embrionário

tardio (dia 5) reflete a expressão gênica e diferenciação embrionária, tendo um importante papel

na determinação do potencial de implantação dos embriões avaliados. Assim, o valor preditivo da

morfologia pronuclear torna-se questionável em casos nos quais a transferência será realizada em

dia 5 do desenvolvimento. No entanto, o potencial de implantação de blastocistos foi avaliado de

acordo com o padrão de morfologia pronuclear dos zigotos dos quais estes haviam sido

derivados, ressaltando a importância dos critérios avaliados ainda no dia 1 do desenvolvimento

(Braga, Setti, Figueira, Iaconelli, et al. 2013, Balaban et al. 2001). Blastocistos de boa qualidade

derivados de zigotos de morfologia pronuclear normal apresentam maiores taxas de implantação.

No entanto, blastocistos de boa qualidade derivados de zigotos de morfologia pronuclear anormal

ainda apresentam potencial de implantação, porém com taxas abaixo daquelas esperadas

considerando-se apenas a qualidade dos blastocistos obtidos. Scott et al. (2000) utilizando o

sistema de classificação pronuclear sugerido pelo próprio autor observaram que embriões em

estágio de clivagem selecionados inicialmente pela morfologia pronuclear e secundariamente

pela morfologia do dia 3 do desenvolvimento apresentaram taxas significativamente maiores de

implantação. Além disso, transferências realizadas em dia 5 do desenvolvimento embrionário

para embriões que haviam sido classificados quanto à morfologia pronuclear apresentaram

maiores taxas de implantação quando comparados a blastocistos selecionados para transferência

para os quais os critérios de morfologia do zigoto não haviam sido considerados. No presente

estudo, nenhuma das variáveis apresentou diferença significativa para a taxa de implantação de

blastocistos provenientes de zigotos nos quais alterações nos parâmetros de morfologia

pronuclear haviam ou não sido detectados. Uma queda da taxa de implantação de blastocistos

provenientes de zigotos nos quais havia sido detectada alteração de tamanho de PN foi observada,

porém sem significância estatística. O reduzido número de blastocistos selecionados para

transferência provenientes de zigotos portadores de alterações da morfologia pronuclear pode ter

sido limitante para a significância estatística.

Cabe ressaltar que estudos recentes derivados de observação de embriões em sistema

time-lapse demonstraram que a morfologia pronuclear sofre alterações significativas em curto

intervalo de tempo, sugerindo que uma simples observação pontual em microscopia de luz seria

deficiente (Azzarello, Hoest, & Mikkelsen 2012). Além disso, dentre os estudos que avaliaram o

comportamento dos PN em time-lapse (Chamayou et al. 2013, Kirkegaard et al. 2013) apenas um

88

demonstrou seu potencial como preditor de implantação (Azzarello, Hoest, & Mikkelsen 2012).

Além disso, Azzarello, Hoest, & Mikkelsen (2012) demonstraram que apenas o intervalo de

tempo de desaparecimento dos PN foi associado com o potencial de implantação dos embriões

obtidos, sendo os critérios morfológicos avaliados, incluindo o padrão de normalidade descrito

por Scott et al. (2000), o número e distribuição dos CPN não preditivos do potencial de

implantação destes embriões.

Halo citoplasmático

Diferente do esperado, a alteração do parâmetro formação do halo citoplasmático resultou

na obtenção de uma maior taxa de blastocistos formados. A ausência ou a detecção de um padrão

não homogêneo de formação do halo citoplasmático têm sido associadas a alterações na

localização de organelas, parâmetro importante para o correto desenvolvimento embrionário e

implantação. Muitos estudos confirmaram a importância do halo citoplasmático demonstrando

um aumento nas taxas de implantação de embriões para os quais o halo estava presente em

estágio de zigoto (Zollner et al. 2002, Salumets et al. 2002, Henkel et al. 2004). Por outro lado, o

efeito deste parâmetro no desenvolvimento embrionário não foi elucidado por outros autores

(Balaban et al. 2001, Demirel et al. 2001). Além disso, não existem evidências suficientes que

suportam o valor preditivo da observação do halo citoplasmático (Embryology 2011). No

presente estudo, a ausência ou o padrão anormal de formação do halo foram agrupados,

considerando-se como alteração presente quaisquer dos dois parâmetros. Uma melhor avaliação

deste parâmetro poderia resultar na ausência de correlação deste parâmetro com a taxa de

formação de blastocistos, conforme previamente relatada (Braga, Setti, Figueira, Iaconelli, et al.

2013).

89

Morfologia dos dias 2 e 3 do desenvolvimento

Número de células

No presente estudo, o ritmo de clivagem normal caracterizado pela presença de 3 a 5

células no dia 2 do desenvolvimento e 7 a 8 células no dia 3 do desenvolvimento foi

significativamente associado à taxa de formação de blastocistos e ao potencial de implantação

destes após transferência embrionária. Além disso, segundo análise quantitativa do número de

células, embriões com maior potencial de formação de blastocistos apresentam, em média, 4

células no dia 2 do desenvolvimento e 8 células nos dia 3 do desenvolvimento. Segundo

consenso, são estes os números de células que devem ser observados seguindo-se o intervalo de

tempo sugerido para avaliação após ICSI (Embryology 2011).

O comprometimento dos resultados clínicos derivado da transferência de embriões de

ritmos de clivagem lento ou rápido foi previamente reportado por diversos autores. De acordo

com Alikani et al. (2000), apenas 13,8% dos embriões com número de células menor do que 7 no

dia 3, 41,9% dos embriões com 7 a 9 células, e 27,5% dos embriões com número de células

maior do que 9 apresentam potencial para formação de blastocistos quando submetidos ao cultivo

prolongado. Avaliando retrospectivamente os resultados de transferências realizadas em dia 3 ou

5 do desenvolvimento embrionário, Racowsky et al. (2000) demonstraram que a presença de

embriões com 8 células em dia 3 é um forte critério preditivo das taxas de sucesso. Nenhum dos

embriões que apresentaram número de células menor que 8 em dia 3 implantaram quando

transferidos em dia 5 do desenvolvimento. Considerando apenas número de células, outro estudo

de Racowsky et al. (2003) demonstraram que embriões de 8 células em dia 3 apresentam maior

potencial de implantação (25%) quando comparados a outros embriões. Em ordem decrescente de

viabilidade foram classificados os embriões de mais de 8 células (18,1%), seguidos de embriões

com 7 células (10,2%) e embriões com menos de 7 células (3,0%).

O comprometimento do desenvolvimento embrionário de acordo com seu ritmo de

clivagem tem sido associado a maior ocorrência de anormalidades cromossômicas em embriões

que apresentam alteração em seu ritmo de clivagem (Magli et al. 2007, Kroener et al. 2014).

Magli et al. (2007) avaliaram o status cromossômico dos estágios de clivagem observados no dia

3 do desenvolvimento embrionário. A incidência de anormalidades cromossômicas foi

90

significativamente menor para o estágio de 7-8 células (50%) quando comparado a todos os

outros estágios. Os índices mais elevados de anomalias cromossômicas foram observados para

embriões que apresentaram 2 ou 3 células na manhã do dia 3 (94%) e para aqueles de 4 células

que apresentaram divisão de apenas um blastômero em relação ao dia 2 (85%). Proporções

similares de anormalidades cromossômicas foram observadas para embriões de clivagem lenta (4

células que apresentaram 2 células no dia 2), embriões moderadamente lentos (5 ou 6 células) e

embriões de clivagem rápida (≥9 células): 74%, 73% e 78%, respectivamente. Além disso, os

resultados demonstraram uma taxa de anormalidade de 97% para embriões que apresentam

parada de clivagem do dia 2 para o dia 3 e de 91% para embriões que apresentam clivagem de

apenas 1 blastômero do dia 2 para o dia 3. Este e outros estudos prévios que demonstraram uma

associação entre a incidência de aneuploidia e o número de células de embriões em ritmo de

clivagem determinaram o status cromossômico por meio da técnica de hibridização in situ por

fluorescência (FISH), técnica com falhas descrita na identificação de 20 a 50% de embriões

anormais quando comparado à técnica de hibridização genômica comparativa (CGH) (Fragouli et

al. 2010). Um estudo recente de Kroener et al. (2014) é apontado com o primeiro estudo que teve

como objetivo correlacionar parâmetros embrionários e o status cromossômico de embriões

determinado pela técnica de CGH. O índice de aneuploidia foi avaliado em função do número de

células em dia 3, demonstrando maior chance de aneuploidia para embriões com mais de 9

células (OD= 1.39; p=0,0294). A taxa de formação de blastocistos também foi avaliada neste

estudo em função do número de células e da constituição cromossômica embrionária. Embriões

com ritmo de clivagem acelerado (>9 células) apresentaram maior chance de formação de

blastocistos, independente da constituição cromossômica. No entanto, dentre os embriões que

atingiram o estágio de blastocisto, aqueles com ritmo de clivagem normal (6 a 9 células)

apresentaram uma menor incidência de aneuploidia (54% vs 62%, p=0,096). Desta forma, o

estudo aponta a seleção de blastocistos provenientes de embriões de 6 a 9 células em dia 3 como

relacionada a melhores taxas de sucesso quando comparada a seleção de blastocistos

provenientes de embriões com >9 células em dia 3. No entanto, apesar da maior sensibilidade e

da menor incidência de erros da técnica de CGH em relação ao FISH, o estudo foi baseado na

biópsia embrionária em dia 3 do desenvolvimento. A alta incidência de mosaicismo observada

em embriões de dia 3 (Taylor et al. 2014), bem como a possibilidade de comprometimento do

desenvolvimento embrionário decorrente da biópsia quando realizada neste dia do

91

desenvolvimento embrionário (Scott et al. 2013), sugerem ainda a necessidade de novos estudos a

fim de que se estabeleça a associação entre o ritmo de clivagem a e incidência de aneuploidias.

Além da maior chance de alteração cromossômica, o ritmo rápido de clivagem foi recentemente

correlacionado com perturbações no padrão de imprinting e no metabolismo em modelo de

embriões de camundongo (Market Velker, Denomme, & Mann 2012).

Simetria de blastômeros

A presença de blastômeros assimétricos foi significativamente associada à menor taxa de

formação de blastocistos quando presente nos dias 2 e/ou 3 do desenvolvimento. Além disso, a

assimetria de blastômeros em dia 3 do desenvolvimento teve efeito negativo significante na taxa

de implantação dos blastocistos transferidos. Apesar da redução do potencial de implantação, a

assimetria em dia 2 do desenvolvimento não apresentou efeito significante. A possibilidade da

distribuição irregular de material celular e/ou genético resultando em efeito negativo na

viabilidade embrionária tem sido pouco estudada. A maioria dos estudos considera o número de

células e a presença de fragmentação como sendo os principais critérios a serem abordados.

Porém, alguns autores demonstraram previamente o impacto negativo da assimetria de

blastômeros nos resultados obtidos (Giorgetti et al. 1995, Ziebe et al. 1997, Hardarson et al.

2001). Giorgetti et al. (1995) verificaram uma associação entre a assimetria e menores taxas de

implantação, porém não diferindo entre irregularidades da forma e do tamanho dos blastômeros.

Ziebe et al. (1997) e Hardarson et al. (2001) observaram uma queda significativa do potencial de

implantação dos embriões de acordo com alterações do padrão de simetria de blastômeros,

considerando-se o tamanho esperado a cada ciclo de divisão celular.

O comprometimento do desenvolvimento embrionário de embriões assimétricos estaria

relacionado à ocorrência de alterações na distribuição de material genético, sendo blastômeros

originados de embriões assimétricos mais afetados por alterações cromossômicas numéricas

(29,4%) quando comparados a blastômeros derivados de embriões simétricos (8,5%) (Hardarson

et al. 2001). Além disso, Hardarson et al. (2001) demonstraram que não apenas um maior número

de blastômeros destes embriões eram aneuplóides, mas também que a gravidade da aneuploidia

era maior. Além disso, especula-se que a divisão desigual de um blastômero resulte na

distribuição inadequada de proteínas, mRNA e organelas para as células-filha. Considerando a

92

ocorrência de polarização de algumas proteínas e produtos gênicos no embrião, o efeito negativo

de uma divisão celular desigual seria ainda amplificado.

Fragmentos anucleados

Alikani et al. (1999) demonstraram pela primeira vez que o grau e o padrão de

fragmentação do embrião estavam associados com as taxas de implantação embrionária.

Baseados na classificação embrionária do dia 3 de desenvolvimento, os autores relataram que as

taxas de implantação para os tipos I e IV de fragmentação diferem de 37.9% para 18.2%. A

fragmentação tipo IV apresentou um efeito negativo mesmo quando comprometido um volume

restrito do embrião, como demonstrado pelo autor em transferências nas quais apenas embriões

apresentando esse tipo de fragmentação foram transferidos. Em outro estudo do mesmo grupo, os

autores avaliaram a correlação entre as anormalidades morfológicas de embriões em estágio de

clivagem e a habilidade de formação de blastocistos (Alikani et al. 2000). A fragmentação

excessiva (>15%) apresentou um impacto negativo na chance de formação de blastocistos. O

presente estudo demonstrou o efeito negativo do tipo e do grau de fragmentação de embriões em

dia 2 e 3 do desenvolvimento na taxa de formação de blastocistos. Do mesmo modo que o

sugerido por estudos anteriores, o maior impacto negativo da ocorrência de fragmentação foi

observado para embriões apresentando fragmentação tipo IV ou >10% do volume do embrião

comprometido pela fragmentação. A ocorrência de fragmentação em dia 2 do desenvolvimento

apresentou um efeito negativo no potencial de implantação de blastocistos derivados destes

embriões. Apesar do menor potencial de implantação observado para blastocistos que

apresentaram fragmentação em dia 3 do desenvolvimento, não houve significância estatística. A

associação da ocorrência de fragmentação com outros critérios de classificação embrionária em

dia 3 do desenvolvimento poderia demonstrar o valor preditivo deste critério.

Ainda que associação entre fragmentação e a incidência de aneuploidia não tenha sido

verificada, sua relação positiva com a ocorrência de mosaicismo foi previamente observada

(Munné & Cohen 1998) sugerindo que os fragmentos pudessem conter pedaços cromossômicos

resultados de erros no funcionamento dos fusos. Estudos recentes demonstraram que a ocorrência

de fragmentação nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário correlaciona com a

93

ocorrência de erros mitóticos (Chavez et al. 2012, Wong et al. 2010, Stensen et al. 2015). Estas

observações justificariam o impacto deste critério no potencial de desenvolvimento embrionário.

Magli et al. (2007) avaliaram a incidência de anormalidades cromossômicas de acordo com a

porcentagem e o tipo de fragmentação, considerando o número de células do embrião no dia 3.

Os resultados demonstraram que para embriões sem fragmentação ou para aqueles apresentando

fragmentação localizada, a incidência de anomalias cromossômicas varia de acordo com o

número de células, independente do volume do embrião comprometido pela fragmentação. De

modo contrário, na presença de fragmentos não localizados, a incidência de anormalidades

cromossômicas é significativamente maior para embriões de 7-8 células comparados aqueles de

mesmo estágio celular que apresentam fragmentação localizada. Para embriões de clivagem lenta

(4 a 6 células em dia 3) não foi observada correlação entre fragmentação e anormalidade

cromossômica. Possivelmente, nestes casos, o atraso no ritmo de clivagem é o principal fator

relacionado às desordens cromossômicas, conforme previamente discutido. Desta forma, o estudo

sugere que a transferência de embriões de 8 células no dia 3 deve ser priorizada, mesmo na

presença de fragmentação e especialmente se esta estiver localizada e não distribuída por todo o

espaço perivitelínico. Estes resultados corroboram com os dados do presente estudo, sendo os

embriões de 8 células com ausência de fragmentação, ou fragmentação de tipo II ocupando

menos de 10% do volume embrionário os de maior chance de formação de blastocisto e

implantação.

Multinucleação e ausência de núcleos

A detecção de blastômeros multinucleados no momento da observação correspondeu a

22,9% e 11,2% dos embriões avaliados em dia 2 e 3 do desenvolvimento, respectivamente.

Apesar da variação considerável dentre os relatos da literatura, a incidência de blastômeros

multinucleados parece estar em cerca de 30% dos embriões obtidos. A avaliação deste parâmetro

é mais facilmente realizada no dia 2 do desenvolvimento devido à maior dimensão das células e a

melhor acessibilidade destas devido ao seu número reduzido. Segundo o consenso, a ocorrência

de multinucleação deve ser registrada para o dia 2 do desenvolvimento, dado o caráter mais

informativo deste critério para o dia 2 quando comparado ao dia 3 do desenvolvimento

94

(Embryology 2011). As variações na incidência de embriões multinucleados podem estar

relacionadas não apenas ao dia de desenvolvimento avaliado, mas também ao momento da

observação dado que apenas blastômeros em interfase apresentam núcleo visível subestimando as

taxas de multinucleação. A ocorrência de multinucleação apresentou efeito negativo significante

na taxa de formação de blastocistos quando detectada em embriões de dia 2 ou 3 do

desenvolvimento. O efeito negativo deste parâmetro no potencial de implantação dos blastocistos

transferidos foi verificado apenas quando detectado em embriões de dia 2 do desenvolvimento.

Apesar da redução significativa da taxa de implantação para blastocistos provenientes de

embriões multinucleados em dia 3 (10,8% vs 20,0%, p=0,168) não houve diferença estatística,

possivelmente devido ao número reduzido de embriões multinucleados em dia 3 serem

selecionados para transferência em dia 5, até mesmo pelo fato de um número reduzido atingir o

estágio de blastocisto (22,6% vs 40,6%, p<0,001). De fato, parece existir uma correlação entre a

multinucleação e o padrão de clivagem de embriões. Van Royen et al. (2001) demonstraram que

embriões com padrão de clivagem normal, caracterizado por 4 células em dia 2 e 8 células em dia

3 apresentam os menores índices de multinucleação quando comparados a embriões com ritmo

lento ou rápido de clivagem para estes dias do desenvolvimento. Os embriões portadores de

multinucleação, associado ao padrão alterado de clivagem, apresentariam menores chances de

formação de blastocisto conforme já discutido. O impacto da multinucleção no potencial de

implantação foi demonstrado previamente (Pickering et al. 1995, Van Royen et al. 2001, Van

Royen et al. 2003, Moriwaki et al. 2004). Van Royen et al. (2003) observaram uma queda de 4,3

vezes no potencial de implantação de embriões portadores de multinucleação, quando

comparados ao potencial de implantação de embriões mononucleados sugerindo o alto valor

preditivo deste critério.

O significativo potencial negativo da ocorrência de multinucleação no desenvolvimento

embrionário pode ser explicado pelo estudo genético desses embriões, dado que a multinucleação

parece estar relacionada a erros na replicação e segregação cromossômica. De fato, embriões

multinucleados quando avaliados apresentaram aumento da incidência de aneuploidia,

anormalidades cromossômicas e defeitos na síntese de DNA conforme relatado inicialmente por

Kligman et al. (1996) e mais recentemente por Hardarson et al. (2001). A análise da constituição

cromossômica de embriões portadores de blastômeros multinucleados demonstrou que 85%

destes apresentavam anormalidades cromossômicas em mais de 50% dos seus blastômeros. O

95

número de blastômeros cromossomicamente anormais excedia em ambos os estudos o número de

blastômeros comprometidos pela multinucleação, indicando comprometimento genético de todo

o embrião. Por outro lado, alguns estudos demonstraram que nem todos os embriões

multinucleados apresentam comprometimento de sua constituição cromossômica (Staessen &

Van Steirteghem 1998). A ocorrência de blastômeros binucleados apresenta um menor impacto

no comprometimento do desenvolvimento embrionário dado que uma maior porcentagem destes

embriões é caracterizada como euplóide quando comparado com embriões apresentando 3 ou

mais núcleos em um dos blastômeros (Meriano et al. 2004). O estudo de Meriano et al. (2004)

considerou para avaliação do impacto da multinucleação na competência embrionária dois

fenótipos mais comumente encontrados: blastômeros binucleados e multinucleados. Os

resultados obtidos demonstraram que embriões mononucleados provenientes de uma coorte

comprometida por embriões binucleados não apresentam potencial de desenvolvimento

comprometido, diferente do observado para embriões mononucleados provenientes de uma coorte

comprometida pela multinucleação. O estudo sugere que a ocorrência de blastômeros

binucleados deve ser considerada uma variável independente restrita ao embrião no qual é

detectada. Por outro lado, a multinucleação deve ser indicativa de comprometimento da

competência de toda a coorte. Além disso, análise de FISH para 5 cromossomos demonstrou que

embriões binucleados apresentam maior incidência de blastômeros normais para os cromossomos

testados quando comparados com embriões multinucleados. Dentre os embriões binucleados

avaliados 32% foram considerados normais e dentre os multinucleados apenas 3,7%. De fato, no

presente estudo observamos que o agravamento do padrão de anormalidade com relação ao

número de núcleos detectados e a incidência de blastômeros multinucleados em embriões de dia

2 e 3 foi determinante em uma queda significativa na taxa de formação de blastocistos para

embriões nos quais a multinucleação havia sido detectada. O mesmo efeito não foi observado

para o potencial de implantação dos embriões, porém as diferenças observadas podem ser

consideradas relevantes sendo de 8,5% a taxa de implantação para embriões de dia 2

multinucleados nos quais foram detectados até 2 núcleos em um mesmo blastômero e de 0% para

os quais houve detecção de mais de 2 núcleos (p=0,291). Observamos ainda uma taxa de

implantação de 7,0% para embriões multinucleados em dia 2 nos quais até 25% dos blastômeros

estavam comprometidos e de 3,4% para os quais houve comprometimento de mais de 25% dos

96

blastômeros (p=0,644). Novamente, o número amostral reduzido de embriões portadores destas

alterações e que foram selecionados para transferência pode ser apontado como fator limitante.

O impacto da observação de blastômeros sem núcleo nos dias 2 e 3 do desenvolvimento

foi significante para o potencial de formação de blastocistos, sendo este significante também para

o potencial de implantação dos blastocistos transferidos quando observado em blastômeros de

embriões em dia 2 do desenvolvimento. O estudo de Moriwaki et al. (2004) havia relatado uma

menor chance de implantação para embriões com blastômeros sem núcleo visível no momento da

observação. Porém, a significância clínica de blastômeros anucleados ainda não foi elucidada.

Segundo Palmstierna et al. (1998), considerando o fato de que o desenvolvimento do núcleo de

blastômeros envolve fases distintas nas quais este torna-se mais ou menos visível e considerando-

se a observação deste critério em intervalos de tempo pré-estabelecidos, o fato de o núcleo não

ser observado caracteriza um blastômero anucleado. Assim, o impacto deste critério no

desenvolvimento embrionário deve estar associado a uma assincronia do ciclo celular entre

blastômeros mononucleados e blastômeros anucleados. Desta forma, um maior comprometimento

do embrião por estes critério poderia agravar o efeito observado. De fato, os resultados do

presente estudo demonstraram uma menor chance de obtenção de blastocistos para embriões

portadores de blastômeros sem núcleos nos dias 2 e 3 do desenvolvimento, sendo este efeito

significativamente agravado com o maior comprometimento do embrião (núcleo ausente em

>25% dos blastômeros do embrião).

O presente trabalho demonstrou que os critérios de morfologia oocitária e de morfologia

embrionária avaliados isoladamente foram significativamente associados ao potencial de

formação e de implantação de blastocistos. O valor preditivo de critérios avaliados no início do

desenvolvimento embrionário em ciclos com transferência em estágio de blastocistos não foi

observado em estudo prévio (Guerif et al. 2010). Após avaliação de 2617 embriões de 511 casais

submetidos a tratamento de RHA que realizaram transferência de embrião único em dia 5 do

desenvolvimento, o autor concluiu que não houve nenhuma associação significativa entre os

critérios de morfologia dos dias 1 e 2 do desenvolvimento embrionário e o potencial de

implantação dos blastocistos. Conforme comentado previamente, a falta de consenso na forma de

avaliação dos critérios e na determinação da interdependência ou de seu peso relativo em

97

sistemas de avaliação, associada à subjetividade na avaliação, às variações inter e

intraobservadores, aos diferentes protocolos e meios de cultivo utilizados podem ser a causa da

obtenção de resultados controversos ressaltando a importância de realização de um maior número

de estudos.

Modelos preditivos

Faltam estudos na literatura sugerindo de que forma classificar e selecionar embriões

apresentando diferentes tipos e graus de variações do padrão ideal de morfologia. Desta forma,

podemos afirmar que não está claro, por exemplo, se um blastocisto que apresentou ritmo de

clivagem lenta ou rápida e ausência de fragmentação nos estágios iniciais de clivagem deve ser

selecionado para transferência em detrimento de outro que apresentou ritmo de clivagem normal

porém com presença de fragmentação moderada. Ou ainda, se uma variação no tamanho dos

blastômeros pode inferir um prognóstico pior do que a ausência de núcleo visível em determinada

proporção de blastômeros do embrião. Devemos ressaltar que algumas variáveis podem ser

caracterizadas como preditoras independentes do potencial de formação e implantação de

blastocistos, porém outras poderão apresentar significância apenas em uma avaliação univariada,

perdendo sua significância em modelos multifatoriais. Algumas variáveis sem significância

biológica podem demonstrar associação com outras variáveis de real importância resultando em

uma falsa impressão de seu valor preditivo. Um modelo baseado em análises estatísticas

multifatoriais nas quais as variáveis relevantes irão competir é apontado como a melhor maneira

de se evitar uma classificação subjetiva dos embriões. O modelo irá incluir apenas os fatores que

apresentarem de forma independente um impacto nas variáveis de sucesso, além de fornecer o

correto peso de cada critério. Conforme abordado, poucos estudos optam por uma estratégia de

avaliação multi-dimensional apesar da necessidade crescente de classificação de embriões

baseada em observações diárias pontuais (Scott 2003, Holte et al. 2007, Racowsky et al. 2009,

Sjöblom et al. 2006, Guerif et al. 2007, Rehman et al. 2007, Ahlström et al. 2011, Fauque et al.

2013).

Tendo como base os resultados da análise bivariada de todos os critérios avaliados no

presente estudo, 43 potenciais fatores preditivos para obtenção de blastocisto no dia 5 do

desenvolvimento e 20 potenciais fatores preditivos de potencial de implantação embrionária

98

foram selecionados para obtenção de um modelo de predição utilizando regressão logística

binária múltipla. No modelo final de predição de formação de blastocisto foram incluídos 14

fatores: idade da mulher, taxa média de oócitos recuperados, presença de espaço perivitelineo

aumentado no oócito, ritmo de clivagem em dia 2 e 3, número de células em dia 3, simetria de

blastômeros em dia 2 e 3, ocorrência de fragmentação em dia 3, número de núcleos presentes nos

blastômeros multinucleados em dia 2, porcentagem de blastômeros comprometidos pela

multinucleação em dia 2, ocorrência de blastômeros anucleados em dia 2, número de blastômeros

multinucleados e número de blastômeros anucleados em dia 3. O modelo ajustado poderá ser

utilizado na rotina laboratorial para determinação da chance de formação de blastocistos para

embriões em dia 3 do desenvolvimento, com taxa de acerto de 71,1%. A determinação da

probabilidade de obtenção de embriões em estágio de blastocisto para cada um dos embriões de

uma paciente poderá auxiliar de forma significativa a troca de informações entre a equipe clínica

e laboratorial no que se refere à definição do momento mais indicado para realização da

transferência embrionária.

Para o modelo de predição de implantação destes embriões quando selecionados para

transferência 4 fatores foram incluídos: idade da mulher, simetria de blastômeros em dia 2,

ocorrência de multinucleação e/ou ausência de núcleo em blastômeros de embriões em dia 2. A

predição do modelo obteve uma taxa de acerto de 80,1%, porém alta probabilidade de acerto está

associada à baixa probabilidade de implantação embrionária pré-teste de aproximadamente 25%.

Ou seja, sendo a taxa de implantação embrionária baixa existe boa possibilidade de acerto

daqueles embriões que não irão implantar após a transferência. A capacidade do método em

identificar embriões com potencial de implantação foi de apenas 3,2% (sensibilidade). Dessa

forma, os critérios apontados poderão ser utilizados na seleção embrionária dadas as

significâncias estatísticas obtidas nas análises de associação, porém novos estudos com uma

maior casuística deverão ser realizados para determinação do modelo de implantação

embrionária.

Dois estudos recentes incluindo mais de 6000 embriões transferidos tiveram como

objetivo a obtenção de um modelo de classificação de embriões de acordo com seu potencial de

implantação (van Loendersloot et al. 2014, Rhenman et al. 2015). No entanto, apesar da grande

casuística algumas limitações podem ser apontadas. O estudo de Rhenman et al. (2015) incluiu

apenas transferências realizadas em dia 2 do desenvolvimento, sendo que o cultivo prolongado

99

até o estágio de blastocisto teria fornecido maior acurácia na seleção embrionária. Por outro lado,

o estudo de van Loendersloot et al. (2014) incluiu apenas parâmetros de morfologia embrionária

do dia 3 do desenvolvimento. No entanto, modelos de implantação que incluem variáveis de

ambos os dias 2 e 3 têm demonstrado melhor valor preditivo (Racowsky et al. 2009). Além disso,

o objetivo do estudo de van Loendersloot et al. (2014) foi classificar embriões obtidos no ciclo de

tratamento de um casal de acordo com seu potencial de implantação, e não determinar o potencial

de implantação de um embrião de modo individual. Desta forma, as características dos pacientes

seriam todas idênticas para estes embriões que eram provenientes de um mesmo casal, excluindo

a inclusão de parâmetros como idade no modelo.

Os resultados obtidos neste e em outros estudos devem ser de modo geral aplicados com

cautela principalmente pelo fato de serem obtidos e validados a partir de um mesmo banco de

dados. O poder estatístico do estudo parece não ser afetado se aplicados testes estatísticos

adequados, porém os modelos devem ser validados em populações independentes (Steyerberg,

Harrell, et al. 2001, Steyerberg, Eijkemans, et al. 2001, te Velde et al. 2014). A validação externa

resulta em um refinamento do modelo a partir de um reajuste do peso de cada variável.

As variáveis caracterizadas no presente estudo como tendo poder preditivo independente

poderão ser utilizadas por embriologistas como ferramenta para a classificação de embriões de

acordo com o potencial de formação de blastocisto, bem como de acordo com o potencial de

implantação do blastocisto obtido, auxiliando na seleção de embriões para transferência. A

otimização da seleção embrionária por meio da utilização dos algoritmos nos quais tais variáveis

foram incorporadas representa um grande potencial de aumento das taxas de sucesso do

tratamento, além de possibilitar a realização da transferência de um número reduzido de

embriões, minimizando os riscos derivados de gestações múltiplas. Além disso, o melhor

entendimento do valor preditivo dos critérios de avaliação embrionária poderá auxiliar no

estabelecimento de uma estratégia mais uniforme de seleção embrionária entre os diferentes

laboratórios.

100

6) CONCLUSÕES

Considerando-se a análise do valor preditivo de critérios morfológicos na obtenção de

embriões em estágio de blastocisto podemos concluir que:

Variáveis do perfil populacional e da resposta do EOC estão associadas ao potencial de

formação de blastocistos;

O perfil dos casais submetidos ao tratamento que apresentam maior taxa de formação de

blastocistos é caracterizado por: menor média de idade da mulher, menor número médio

de UI de FSH administradas, menor número médio de oócitos recuperados, menor taxa

média de oócitos recuperados, maior taxa média de oócitos MII, maior taxa média de

oócitos injetados e maior taxa média de 2PN;

A presença de dismorfismos oocitários está associada com o potencial de formação de

blastocistos;

O aumento do EP está associado a uma chance significativamente menor de formação de

blastocisto para embriões derivados de oócitos portadores deste dismorfismo;

Critérios avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento estão associados com o potencial

de formação de blastocistos;

A alteração do tamanho dos PN, a detecção de PN periféricos ou mesmo a detecção de um

padrão anormal de morfologia pronuclear estão associados a uma chance

significativamente menor de formação de blastocisto;

Alteracões no ritmo de clivagem ou no padrão de simetria de blastômeros em embriões

em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento estão associadas a uma chance significativamente

menor de formação de blastocistos;

A ocorrência de fragmentos anucleados, blastômeros multinucleados ou anucleados em

embriões de dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento estão associadas a uma chance

significativamente menor de formação de blastocistos;

Embriões multinucleados em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento com até 2 núcleos

detectados em um mesmo blastômeros apresentam maior chance de formação de

blastocisto quando comparados àqueles nos quais mais de 2 núcleos forem detectados em

um mesmo blastômero;

101

Embriões em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento nos quais a ocorrência de multinucleação

compromete até 25% dos blastômeros apresentam maior chance de formação de

blastocisto quando comparados àqueles nos quais a multinucleação for detectada em mais

de 25% dos blastômeros;

Embriões em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento nos quais a não visualização de núcleo

compromete até 25% dos blastômeros apresentam maior chance de formação de

blastocisto quando comparados àqueles nos quais a ausência de núcleo for detectada em

mais de 25% dos blastômeros;

Os critérios independentes preditivos de formação de blastocisto são: idade da mulher,

taxa média de oócitos recuperados, presença de EP aumentado no oócito, ritmo de

clivagem em dia 2 e 3, número de células em dia 3, simetria de blastômeros em dia 2 e 3,

ocorrência de fragmentação em dia 3, número de núcleos presentes nos blastômeros

multinucleados em dia 2, porcentagem de blastômeros comprometidos pela

multinucleação em dia 2, ocorrência de blastômeros anucleados em dia 2, número de

blastômeros multinucleados e número de blastômeros anucleados em dia 3.

A aplicação dos critérios preditivos em modelo de regressão multifatorial resulta em uma

taxa de acerto de 71,7% na chance do embrião atingir o estágio de blastocisto quando

submetido ao cultivo prolongado.

Considerando-se a análise do valor preditivo de critérios morfológicos no potencial de

implantação dos blastocistos transferidos podemos concluir que:

Variáveis do perfil populacional e da resposta do EOC estão associadas ao potencial de

implantação de blastocistos;

O perfil dos casais submetidos ao tratamento que apresentam maior potencial de

implantação de blastocistos é caracterizado por: menor média de idade da mulher, menor

média de idade do homem; menor número médio de UI de FSH administradas;

A presença de dismorfismos oocitários está associada com o potencial de implantação de

blastocistos;

102

A presença de aglomerados de REL está associada a uma chance significativamente

menor de implantação para blastocistos derivados de oócitos portadores deste

dismorfismo;

Critérios avaliados no dia 1 do desenvolvimento não estão significativamente associados

com o potencial de implantação dos blastocistos derivados destes zigotos;

Critérios avaliados nos dias 2 e 3 do desenvolvimento estão associados com o potencial de

implantação de blastocistos;

Alteracões no ritmo de clivagem em embriões em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento estão

associadas a uma chance significativamente menor de implantação dos blastocistos

obtidos;

Alterações no padrão de simetria de blastômeros em embriões em dia 3 do

desenvolvimento estão associadas a uma chance significativamente menor de implantação

dos blastocistos obtidos;

A ocorrência de fragmentos anucleados em embriões em dia 2 do desenvolvimento está

associada a uma chance significativamente menor de implantação dos blastocistos

obtidos;

A ocorrência de blastômeros multinucleados ou anucleados em embriões de dia 2 do

desenvolvimento estão associadas a uma chance significativamente menor de implantação

dos blastocistos obtidos;

Os critérios independentes preditivos do potencial de implantação dos blastocistos obtidos

são: idade da mulher, simetria de blastômeros em dia 2, ocorrência de multinucleação

e/ou ausência de núcleo em blastômeros de embriões em dia 2, porém apresentando baixo

valor de sensibilidade.

103

7) ANEXO

Anexo 1 - Manual de Procedimentos Operacionais Padrão (POP) do Centro de Fertilização

Assistida - Fertility

AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA OOCITÁRIA

OBJETIVOS

Identificar as alterações morfológicas intracitoplasmáticas e extracitoplasmáticas de

oócitos submetidos à ICSI com o objetivo de selecionar os gametas que poderão originar

embriões com alto potencial de implantação.

AMOSTRAS

Oócitos maduros (MII) submetidos à ICSI obtidos após estímulo ovariano controlado e

punção folicular aspirativa.

PROCEDIMENTO

Avaliação da morfologia oocitária em microscópio de luz invertido e identificação de

alterações morfológicas intracitoplasmáticas e extracitoplasmáticas. Registrar a detecção de

cada uma das alterações no respectivo prontuário de classificação oocitária imediatamente

após o procedimento de ICSI, evitando a exposição prolongada dos gametas.

MORFOLOGIA OOCITÁRIA NORMAL

• Forma esférica

• Corpúsculo polar único e intacto

• Espaço perivitelínico pequeno e ausência de granulações

• Zona pelúcida clara e intacta

104

• Citoplasma translúcido de coloração homogênea, livre de inclusões

DISMORFISMOS OOCITÁRIOS

Os dismorfismos oocitários possíveis de serem detectados na avaliação morfológica em

microscópio de luz invertido estão descritos abaixo exemplificados através de

fotomicrografias.

EXTRACITOPLASMÁTICOS

AZ – Alteração de forma e/ou espessura e/ou coloração da zona pelúcida

AF – Alteração de forma do oócito

105

EP - Espaço perivitelineo aumentado e/ou

DP - Granulações no espaço perivitelineo

CF – 1º corpúsculo polar fragmentado e/ou de tamanho aumentado

106

INTRACITOPLASMÁTICOS

CG – Granulosidade citoplasmática excessiva

CL – Granulosidade citoplasmática em cluster

107

CE – Citoplasma enegrecido

IN – Inclusões citoplasmáticas

PV – Presença de vacúolos

108

RE - Retículo endoplasmático liso agregado

MR – Membrana resistente

Necessidade de aspiração para rompimento do oolema após formação do cone de

injeção.

MSR – Membrana sem resistência

Não formação do cone de injeção e rompimento imediato do oolema.

109

Esquema representativo da avaliação da morfologia oocitária. (a) Normal, (b) 1o CP

aumentado, (c) 1o CP fragmentado, (d) 1

o CP diminuído, (e) Granulação citoplasmática

homogênea, (f) Granulação citoplasmática centralizada, (g) VAC, (h) Corpo refrátil, (i) Agregado

de REL, (j) EPV aumentado, (k) EPV com granulações e (l) Alteração de forma.

110

REGISTRO DAS ALTERAÇÕES – PRONTUÁRIO DIA +1

Injeção CG CL CE PV RE IN CF DP EP AZ AF MR MSR OBSERVAÇÃO

INTRA

CLASSIFICAÇÃO OOCITÁRIA

EXTRA

Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos oócitos submetidos à ICSI.

Legenda:

CG DP

CE EP

PV AZ

RE AF

CL MSR

IN MR

CF

MORFOLOGIA OOCITÁRIA

Corpúsculo fragmentado

Debris no espaço perivitelinoCitoplasma Granular

Espaço perivitelíneo aumentado

Presença vacúolos

Alteração de Forma

Menbrana sem resistênciaGranulação em cluster

Alteração em zona pelúcida

Membrana resistente

Retículo endoplasmatico agregado

Citoplasma enegrecido

Inclusões citoplasmáticas

Observação:

O oócito classificado na linha de número 1 deve corresponder ao número 1 da placa de

cultivo na qual estes serão mantidos em cultivo após a ICSI e avaliados após intervalo de cerca de

17h para checagem da fertilização. Desta forma, as características oocitárias de cada um dos

embriões resultantes estarão disponíveis para utilização como parâmetro de seleção embrionária

para transferência.

111

CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA

OBJETIVOS

Avaliar parâmetros da morfologia embrionária durante cultivo in vitro com o objetivo de

selecionar embriões com alto potencial de implantação.

AMOSTRAS

Embriões humanos obtidos a partir da fertilização de oócitos maduros (MII) através das

técnicas de Fertilização in vitro clássica ou ICSI.

PROCEDIMENTO

Avaliação da morfologia embrionária em microscópio de luz invertido e registro de cada

uma das alterações no respectivo prontuário de classificação embrionária, evitando a

exposição prolongada dos embriões.

CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - DIA+ 1

Fase de pronúcleo (2PN, 2CP).

Avaliação realizada de16-18h após inseminação ou ICSI.

Parâmetros avaliados:

Número de pronúcleos visualizados (No PN)

Critério de normalidade = 2PN (fertilização normal)

Alterações observadas 1PN, >3PN (fertilização anormal)

Número de corpúsculos polares visualizados (No CP)

Critério de normalidade = 2

112

Morfologia dos pronúcleos

Tamanho

Critério de normalidade = diâmetro de 15-25µm

Identificar caso seja detectada alteração de tamanho de um ou ambos os pronúcleos.

Localização

Critério de normalidade = centralizados

Identificar caso seja detectada localização periférica em relação ao ooplasma.

Justaposição

Critério de normalidade = pronúcleos justapostos

Identificar caso seja detectada distância entre os centros dos pronúcleos maior que 25µm.

Morfologia dos nucléolos (corpos precursores de nucléolos)

Distribuição

Critério de normalidade = polarizados ou dispersos em ambos os pronúcleos (Z1, Z2 –

Scott, 2000).

Identificar caso seja detectada assincronia de posição dos corpos precursores de nucléolos

entre os pronúcleos.

Número

Critério de normalidade = de 4 a 11 corpos precursores de nucléolos em cada um dos

pronúcleos.

Identificar caso seja detectado número de corpos precursores de nucléolos fora do

intervalo de normalidade. Além disso, a diferença entre o número de corpos precursores

de nucléolos entre os pronúcleos deve ser menor que 3.

113

Halo citoplasmático periférico

Critério de normalidade = presente

Identificar caso não seja detectado.

Vacúolos

Critério de normalidade = ausência de vacúolos.

Prontuário para registro das abservações:

Nº PN Nº CP TAMANHO PERIFERICOS AFASTADOSNÚMERO (0,

1 e 2)TAMANHO POLARIZAÇÃO HALO VAC FORMA ZP OBSERVAÇÃO

PN

CLASSIFICAÇÃO DIA + 1

NUCLÉOLO

Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos embriões em estágio de pronúcleo.

Fotomicrografia exemplificando embrião de Dia 1 apresentando todos os critérios de

normalidade.

114


Avaliação realizada de 43-45h após inseminação ou ICSI.


Número de blastômeros detectados

Simetria entre os blastômeros

Classificação para embriões de 2, 4 ou 8 células:

A simetria é representada pela observação de blastômeros de tamanho idêntico.

Simétricos (Si) – blastômeros de tamanho idêntico;

Assimétricos (As) – diferença maior que 20% entre o blastômero de menor e o de maior

tamanho;

Semelhantes (Se) – existe diferença de tamanho entre os blastômeros, porém a diferença entre

o menor e o maior blastômero não excede 20%.

Classificação para embriões de 3, 5 6 ou 7células:

Diferença de tamanho entre os blastômeros é representativa de assincronia no processo de

clivagem.

115



1 CEL GDE

2 CEL MENORES =

3 CEL GDE

2 CEL MENORES =

2 CEL GDE

4 CEL MENORES =

1 CEL GDE

6 CEL MENORES =

3

2

8

4

7

6

5

2 CEL =

8 CEL =

4 CEL =

NO DE CÉLULAS

116

Fragmentação

Quantitativo

Estimar a porcentagem do volume do embrião comprometida pela fragmentação. A

porcentagem deve ser equivalente ao tamanho do blastômero. (Exemplo: embrião de 4

células, 25% de fragmentação deve equivaler ao volume de um blastômero).

Valores utilizados: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, >50%

Qualitativo

Classificar o tipo de fragmentação segundo Alikani, 1999.



perivitelínico







Presença de núcleo

Critério de normalidade = (1) núcleo / blastômero

Verificar a presença de núcleo em cada um dos blastômeros.

Identificar número de blastômeros nos quais o núcleo não foi visualizado.

Multinucleação


117


Identificar número de blastômeros comprometidos e número de núcleos visualizados em cada

um dos blastômeros comprometidos.

Outras alterações

Granulosidade citoplasmática excessiva.

Presença de vacúolo.

Alteração da zona pelúcida resultando em alteração do formato esférico do embrião.

Alteração de coloração e/ou espessura da zona pelúcida.


NºFrag

gdesCG VAC FORMA ZP BL s/ N MULTINUCLEAÇÃO OBSERVAÇÃO

CLASSIFICAÇÃO DIA+2

EMBRIÃO

Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos embriões no dia 2 do desenvolvimento.

Legenda:

EMBRIÃO: Descrever no de blastômeros e classificação quanto à simetria e fragmentação

embrionária.

Frag. gdes: Descrever no de fragmentos anucleados grandes (tipo IV) observados.

CG: Granulosidade excessiva no citoplasma.

VAC: Presença de vacúolos.

FORMA: Alteração da forma esférica do embrião.

ZP: Alteração de coloração e/ou espessura da zona pelúcida.

BL s/ N: Número de blastômeros sem núcleo.

MULTINUCLEAÇÃO: Descrever número de blastômeros que apresentam mais de um núcleo e

o número de núcleos detectados.

118

Fotomicrografia exemplificando embrião de Dia 2 de boa qualidade, apresentando 4

blastômeros semelhantes, ausência de fragmentos anucleados, presença de um núcleo visível em

cada um dos blastômeros e ausência de alterações citoplasmáticas.





Simetria entre os blastômeros

Classificação para embriões de 2, 4 ou 8 células:

A simetria é representada pela observação de blastômeros de tamanho idêntico.

Simétricos (Si) – blastômeros de tamanho idêntico;

119

Assimétricos (As) – diferença maior que 20% entre o blastômero de menor e o de maior

tamanho;

Semelhantes (Se) – existe diferença de tamanho entre os blastômeros, porém a diferença entre

o menor e o maior blastômero não excede 20%.

Classificação para embriões de 3, 5 6 ou 7células:

Diferença de tamanho entre os blastômeros é representativa de assincronia no processo de

clivagem.



1 CEL GDE

2 CEL MENORES =

3 CEL GDE

2 CEL MENORES =

2 CEL GDE

4 CEL MENORES =

1 CEL GDE

6 CEL MENORES =

3

2

8

4

7

6

5

2 CEL =

8 CEL =

4 CEL =

NO DE CÉLULAS

Fragmentação

Quantitativo

120

Estimar a porcentagem do volume do embrião comprometida pela fragmentação. A

porcentagem deve ser equivalente ao tamanho do blastômero. (Exemplo: embrião de 4

células, 25% de fragmentação deve equivaler ao volume de um blastômero).

Valores utilizados: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, >50%

Qualitativo

Classificar o tipo de fragmentação segundo Alikani, 1999.



perivitelínico







Presença de núcleo



Identificar número de blastômeros nos quais o núcleo não foi visualizado.

Multinucleação



Identificar número de blastômeros comprometidos e número de núcleos visualizados em cada

um dos blastômeros comprometidos.

121

Outras alterações

Granulosidade citoplasmática excessiva.

Presença de vacúolo.

Alteração da zona pelúcida resultando em alteração do formato esférico do embrião.

Alteração de coloração e/ou espessura da zona pelúcida.

Blastômero dominante, presença de blastômero de maior tamanho que apresenta diferença

maior que 50% em relação ao menor blastômero do embrião.


Frag

gdesCG VAC FORMA ZP BL s/ N MULTINUCLEAÇÃO BD

CLASSIFICAÇÃO DIA + 3

EMBRIÃO


Legenda:

EMBRIÃO: Descrever no de blastômeros e classificação quanto à simetria e fragmentação

embrionária.

Frag. gdes: Descrever no de fragmentos anucleados grandes (tipo IV) observados.

CG: Granulosidade excessiva no citoplasma

VAC: Presença de vacúolos






BD: Blastômero dominante.

122

Fotomicrografia exemplificando embrião de Dia 3 de boa qualidade, apresentando 8

blastômeros semelhantes, ausência de fragmentos anucleados, presença de um núcleo visível em

cada um dos blastômeros e ausência de alterações citoplasmáticas.





Critério de normalidade = 4º ciclo de clivagem

Evidência de compactação

Morfologia

Regular

Difícil identificação dos limites celulares.

123

Irregular

Possível distinção de limites celulares.

Compromete apenas parte dos blastômeros do embrião.


Nº CG VAC FORMA ZP BL s/ N MULTINUCLEAÇÃO DESTINO AH Nº

1 1

EMBRIÃO



Legenda:

EMBRIÃO: Descrever evidência de compactação e/ou no de blastômeros e classificação quanto

à simetria e fragmentação embrionária.

CG: Granulosidade excessiva no citoplasma

VAC: Presença de vacúolos






124

Fotomicrografia exemplificando embrião de Dia 4 de boa qualidade, apresentando evidência de

compactação regular e ausência de alterações citoplasmáticas.

CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - DIA+ 5 E DIA +6

Parâmetros avaliados (Gardner & Schoolcraft, 1999):

Grau de expansão da blastocele

BLASTOCISTO JOVEM Início de cavitação. Cavidade ocupando menos de 50% do volume.

BLASTOCISTO Cavidade ocupando mais de 50% do volume do embrião.

BLASTOCISTO COMPLETO Cavidade ocupa 100% do volume do embrião.

BLASTOCISTO EXPANDIDOAumento significativo do volume embrionário. Diminuição da espessura da

zona pelúcida.

BLASTOCISTO EM HATCHING Início da saída do trofoectodema através da zona pelúcida.

BLASTOCISTO COM HATCHING COMPLETO Blastocisto completamente fora da zona pelúcida.

125

Massa celular interna (MCI)

Critério de normalidade: proeminente, facilmente discernível, consistindo de muitas células

compactadas e fortemente aderidas.

Identificar caso esteja ausente, não compacta e/ou presença de células degeneradas.

Trofoectoderma (TRF)

Critério de normalidade: muitas células formando um epitélio coesivo.

Identificar presença de poucas células, irregularidade na formação do epitélio coesivo e/ou

presença de células degeneradas.


AUSENTENÃO

COMPACTACG

CEL

DEGIRREG

POUCAS

CELCG

CEL

DEGEMBRIÃO

MCI TRF


Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos embriões no dia 5 ou 6 do

desenvolvimento.

Legenda:

EMBRIÃO: Descrever o grau de expansão da blastocele.

MCI: Massa celular interna.

TRF: Trofoectoderma.

126

Fotomicrografias exemplificando blastocistos de dia 5 apresentando diferentes grau de expansão

da cavidade e critérios de normalidade para MCI e TRF.

127

Anexo 2 - Prontuários laboratoriais do Centro de Fertilização Assistida - Fertility

128

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FONTES CONSULTADAS

Normatização para apresentação de dissertações e teses – Pós-graduação –

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, São Paulo, 2013.

146

RESUMO

Com o objetivo de aumentar as taxas de sucesso das pacientes que são submetidas a técnicas de

RHA, numerosos estudos apresentam como foco a identificação do embrião com maior potencial

de implantação. Apesar dos avanços tecnológicos significativos da medicina reprodutiva

baseados no advento da era da genômica, proteômica e metabolômica (OMICS), técnicas

rotineiramente aplicáveis ainda não estão disponíveis. Desta forma, laboratórios de Fertilização in

vitro de todo o mundo selecionam para transferência embriões humanos cultivados in vitro

baseados em parâmetros morfológicos avaliados em microscopia de luz. Diversos parâmetros

morfológicos podem ser avaliados desde o estágio pronuclear até o estágio de blastocisto para

embriões humanos cultivados in vitro. De modo geral, independente do dia da transferência, tais

critérios parecem apresentar valor preditivo de viabilidade embrionária quando avaliados

individualmente ou coletivamente. No entanto, a subjetividade da avaliação morfológica, bem

como a ampla diversidade de sistemas de classificação embrionária aplicados por diferentes

clínicas, implica em resultados contraditórios tornando extremamente difícil a implementação de

um consenso do valor preditivo dos diferentes parâmetros morfológicos avaliados. O presente

estudo teve como objetivo a determinação do valor preditivo dos critérios morfológicos utilizados

para seleção de embriões humanos cultivados in vitro de pacientes submetidas a procedimentos

de RHA no Centro de Fertilização Assistida - Fertility no período de Julho 2011 a Junho de 2014.

Tendo como base os resultados da análise bivariada de todos os critérios avaliados, 43 potenciais

fatores preditivos para obtenção de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento e 20 potenciais

fatores preditivos de potencial de implantação embrionária foram selecionados para obtenção de

um modelo de predição utilizando regressão logística binária múltipla. No modelo final de

predição de formação de blastocisto foram incluídos 14 fatores, sendo 4 o número de fatores

incluídos no modelo de predição de implantação destes embriões quando selecionados para

transferência. O modelo poderá ser utilizado por embriologistas como ferramenta para a

classificação de embriões de acordo com o potencial de formação de blastocisto, bem como de

acordo com o potencial de implantação do blastocisto obtido, auxiliando na seleção de embriões

para transferência. A otimização da seleção embrionária representa um grande potencial de

aumento das taxas de sucesso do tratamento além de possibilitar a realização da transferência de

um número reduzido de embriões, minimizando os riscos derivados de gestações múltiplas.

147

ABSTRACT

In order to increase the success rate of in vitro Fertilization cycles, several studies have focused

on the identification of the embryo with higher implantation potential. Despite recent advances in

the reproductive medicine, based on the OMICs technology, routinely applicable methodologies

are still needed. Thus, in most Fertilization Centers embryo selection for transfer is still based on

morphological parameters evaluated under light microscopy. Several morphological parameters

may be evaluated, ranging from the pronuclear to blastocyst stage. In general, despite the day of

transfer, some criteria are suggested to present a predictive value for embryo viability when

analyzed independently or combined. However, the subjectivity of morphological evaluation, as

well as the wide diversity of embryo classification systems used by different fertilization centers

show contrasting results, making the implementation of a consensus regarding different

morphological criteria and their predictive value a difficult task. The present study aimed to

determine the predictive value of morphological criteria used for selection of embryos derived

from patients submitted to infertility treatment in the Fertility - Assisted Fertilization Center from

July 2011 to June 2014. Based on the bivariate analysis of all selected criteria, 43 potential

predictive factors for the achievement of blastocyst (day 5) and 20 potential predictive factors for

blastocyst implantation potential were selected for the establishment of a prediction model using

binary multiple logistic regression. The final model of blastocyst rate included 14 factors,

whereas the final prediction model for implantation included 4. This model provides a helpful

tool for embryologists in order to classify embryos according with their potential to develop into

blastocyst, as well as according with the potential of implantation of the resulting blastocyst,

improving embryo selection for transfer. The optimization of embryo selection represents a large

potential to increase treatment success rates, allowing the transfer of a reduced number of

embryos and minimizing the risks of multiple pregnancy.

148

LISTAS E APÊNDICE

- Documento de aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa

avaliação da viabilidade embrionária na reprodução humana

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