AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE PRÉ-CLÍNICA AGUDA DO EXTRATO DE Byrsonima crassifolia NO FÍGADO E BAÇO DE CAMUNDONGOS

Otávio Augusto Vendas Tanus1(otaviotanus@gmail.com); Adriana Cristina Vianna

Alvarenga1; Helena Berriel1; Maria Helena Fermiano1; Ana Tereza Gomes Guerrero2(anaguerrero@fiocruz.br); Jislaine de Fátima Guilhermino2(jislaine@far.fiocruz.br);

Maria Inês de Affonseca Jardim3(inesaffonseca@gmail.com); Rosemary Matias4(rosematias@uniderp.edu.br); Doroty Mesquita Dourado1(douradod@uol.com.br).

1Laboratório de Toxinologia e Plantas Medicinais, Medicina, Universidade ANHANGUERA-UNIDERP, Campo Grande-MS, Brasil. 2Fiocruz Mato Grosso do Sul, Campo Grande-MS, Brasil. 3Laboratório de Física, Universidade ANHANGUERA-UNIDERP, Campo Grande-MS, Brasil. 4Programa de Pós-Graduação em Meio Ambiente e Desenvolvimento Regional, Universidade ANHANGUERA-UNIDERP. RESUMO: Apesar da vasta utilização da Byrsonima crassifolia, com finalidades das mais diversas na medicina popular, seus possíveis efeitos tóxicos ainda são desconhecidos. Este trabalho teve como objetivo a pesquisa de alterações histopatológicas em fígado e baço de camundongos Swiss submetidos ao tratamento agudo com o extrato alcoólico da B. Crassifolia. Os animais foram tratados por via oral (gavagem) com doses únicas do extrato de 5 gr/kg e os parâmetros comportamentais de toxicidade aguda foram avaliados nos tempos de 30’, 60’, 90’, 120’, 240’ e 360’. O peso foi aferido antes da administração (P1) e antes da eutanásia (P24h). Após 24 horas, os animais foram eutanasiados por exsanguinação sob anestesia. O fígado e o baço foram seccionados por incisão sagital e fixados em solução de formol a 10%. As secções teciduais foram processadas conforme os métodos habituais, coradas pela hematoxilina-eosina. Não houve variação de peso significativa entre os grupos (p=0,05), evidenciando que a dose alcoólica administrada nos tratamentos não ocasionou desidratação. Não ocorreram mortes e as alterações comportamentais nos animais tratados com o produto foram semelhantes àquelas observadas nos demais grupos, sugerindo que os compostos do extrato não proporcionaram sinais específicos de intoxicação grave. Foram observadas alterações no fígado e baço compatíveis com resposta inflamatória e estimulação do sistema imunitário. Estes resultados indicam uma toxicidade aguda oral relativamente baixa; entretanto, corroboram a importância de estudos toxicológicos de longa duração com a espécie B. crassifolia. Palavras-chave: Murici, hepatotoxicidade, toxicologia, camundongos. INTRODUÇÃO

A utilização de remédios à base de plantas é relatada desde os tempos remotos das tribos primitivas, em que mulheres, isentas de prestígio e poder social, eram encarregadas de buscar nas ervas o cuidado a saúde daquele que adoecia (BADKE et al., 2012).

No século XIX o empirismo da alquimia deu lugar a química experimental que permitiu a síntese laboratorial de novas substâncias orgânicas, sendo determinante na revolução industrial e tecnológica que desencadeou a produção acelerada de novos medicamentos e, à medida que derivados mais puros e concentrados de plantas se tornaram disponíveis, os médicos priorizaram as drogas sintéticas e passaram a desconsiderar o papel importante da fitoterapia (FRANÇA, et al., 2008).

Entretanto, de acordo com a Organização Mundial da Saúde, nos dias de hoje, de 65% a 80% da população mundial que moram em países em desenvolvimento ainda fazem uso de plantas como primeiro tratamento, devido à pobreza e a falta de acesso à medicina moderna (MELO et al., 2007).

Hoje, enquanto a população dos países menos abastados usa as ervas medicinais por falta de recursos, aqueles mais desenvolvidos fazem maior uso de fitomedicamentos sob influência de modismos de consumo de produtos naturais. Essa tendência favoreceu a difusão de esperança de cura, muitas vezes depositada em um único extrato, para diversos males que assombram a humanidade, como a impotência sexual, a ansiedade e a obesidade. Na mesma época, foi estabelecido o conceito mais perigoso sobre as plantas

medicinais: o de que elas não representariam quaisquer riscos a saúde humana por serem naturais e terem sido testadas através da utilização ao longo dos séculos pela população de todo o mundo (VEIGA JUNIOR, 2008).

O objeto do presente trabalho ratifica justamente a importância da pesquisa na busca da segurança na utilização terapêutica de plantas medicinais. A Byrsonima crassifolia, popularmente conhecida como “muricizeiro” ou “murici”, é uma das 150 espécies do gênero Malpighiaceae. É vastamente encontrada no Brasil, principalmente nas regiões Centro-oeste, Norte e Nordeste, ocorrendo também na região Sudeste, em áreas de cerrado. A B. crassifolia é amplamente empregada como medicamento caseiro, sendo utilizada, de forma empírica com as seguintes finalidades: antiasmático, abortivo, antidiarreico (disenteria), antiinflamatório, antimalárico, digestivo, diurético, antitérmico, laxativo, tratamento de amenorréia, bronquite, cólicas, dor de dente, indigestão, infecções na pele e mucosas, leucorréia, parasitoses intestinais, perda de apetite, picadas de cobra, resfriados, tosses, para expelir placenta e “apertar dentes frouxos” (GUILHON-SIMPLICIO e PEREIRA, 2011).

Plantas medicinais são agentes xenobióticos (compostos estranho ao organismo humano), que apresentam produtos de biotransformação potencialmente tóxicos, assim não possuem somente efeitos imediatos e facilmente correlacionados com sua ingestão, mas também efeitos que se instalam em longo prazo e de forma assintomática, podendo levar a um quadro clínico severo, algumas vezes fatal. Comprometimento do fígado e danos hepáticos agudos como hepatites com plantas contendo alcalóides pirrolizidínicos tem sido largamente reportado. Em 2002 o FDA alertou sobre a existência de 25 casos de toxicidade hepática na Alemanha e Suíça, incluindo casos de cirrose, hepatite e falência renal relacionados ao consumo de plantas medicinais (SILVEIRA et al., 2008).

Com base nessas informações, esse estudo visa, através da análise morfológica do fígado e baço, avaliar o potencial do extrato alcoólico de B. crassifolia na indução de toxicidade aguda.

MATERIAL E

Sob aprovação do comitê d /AESA, com parecer no 2784/2012, as folhas de Byrsonima crassifolia foram coletadas no Pantanal de Aquidauana-MS, sendo posteriormente submetidas a secagem em estufa (40º C), trituradas, tamisadas e utilizadas para preparar o extrato etanólico.

Foram utilizados 17 camundongos Swiss, machos e fêmeas (pesando entre 25-30g), mantidos em condições controladas de luminosidade e temperatura, recebendo água e ração à vontade. O estudo da toxicidade aguda foi realizada em 3 grupos: controle hídrico (CH, n=6), controle álcool (CA, n=5) e tratados com extrato alcoólico de B. crassifolia (5gr/kg; via oral) (TB, n=6), todos eles administrados via gavagem. O nível de dose deve ser estabelecido para pelo menos três doses suficientemente espaçadas, mas para substâncias pouco tóxicas o nível de dose de 5.000mg/kg pode ser utilizado sem a avaliação dos três níveis de dose (BRITO, 1994).

A análise dos animais ocorreu durante 24hs. O peso foi aferido em 2 momentos: antes da administração (P1) e 24 horas após (P24h). No intuito de averiguar a possível relação entre a substância testada e efeitos neurotóxicos, os animais foram avaliados quanto a parâmetros comportamentais nos tempos de 30’, 60’, 90’, 120’, 240’ e 360’. Na análise estatística utilizou-se teste de Tukey. Para avaliação histopatológica, a coleta de vísceras (fígado e baço) ocorreu ao final das 24 horas após eutanásia por exsanguinação sob anestesia. Os referidos órgãos dos animais (machos e fêmeas) dos diferentes grupos experimentais foram fixados por 24 horas em formol 10% tamponado, onde as peças permaneceram até processamento de rotina para inclusão em Parafina. Os tecidos foram submetidos ao corte longitudinal e seccionados a 5 m e corados com hematoxilina e eosina para exame microscópico. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na avaliação dos parâmetros de toxicidade aguda: no grupo CH, em todos os tempos avaliados, não foram observadas alterações. O grupo CA, no parâmetro “Atividade

Geral”, em 100% dos animais houve alteração nos primeiros 30’, reduzidos a 60% aos 60’ e 0% nos demais tempos; 40% apresentou ”Tremores“ aos 60’, sendo reduzido a 0% nos demais tempos; 20% demonstrou ”Hipnose” aos 90’ e 0% nos demais tempos; em 100% surgiu alteração na “Respiração” no tempo 60’, tendo 40% persistido aos 90’, caindo a 0% nos 120’ e 240’, voltando a apresentar alteração em 20% aos 360’, sem demais alterações em outros parâmetros. No grupo TB houve variação de “Atividade Geral” em 100% no tempo 30’ e 60’, caindo a 17% nos 90’ e 120’, voltando aos 83% nos 240’, reduzindo a 0% aos 360’; surgiram “Tremores” em 100% nos 30’, caindo a 33% nos 60’ e 17% nos 90’, evoluindo a 0% nos demais tempos; 100% demonstrou “Hipotermia” apenas aos 60’; surgiu “Ptose palpebral” em 17% apenas aos 30’; houve alteração de “Respiração” em 17% apenas aos 240’ e 17% apresentou “Piloereção” aos 120’. Nenhum animal foi a óbito e os resultados obtidos na avaliação dos efeitos neurotóxicos evidenciaram nos grupos CA e TB alterações heterogêneas características de intoxicação leve que diminuíram com o passar do tempo, compatíveis com intoxicação alcoólica leve. Isso ocorre porque o etanol permeia os canais de água das membranas celulares com extrema facilidade devido a seu baixo peso molecular, se difundindo rapidamente para todos os tecidos e compartimentos, incluindo o sistema nervosa central, exercendo inicialmente efeitos estimulantes como euforia e, com o passar do tempo, se inicia a ação depressora de modo não seletivo, o que pode gerar desorientação visual e mental, incoordenação motora, perda de consciência e, nos casos mais graves, de consumo exagerado, coma e morte (CARLINI et al., 2001).

As médias e desvios-padrão de peso em gramas: de CH, P1=23,78±4,788 e P24h=21,65±4,763; de CA, P1=26,16±6,633 e P24h=23,96±5,032; de TB, P1=22,583±2,598 e P24h=21,10±2,796. Ao avaliar a variação de peso entre os grupos CH, CA e TB, não houve diferença significativa (p=0,05). Dessa forma, a dose alcoólica administrada no grupo CA e no grupo TB não ocasionou grandes alterações ou desidratação quando os grupos são comparados. À macroscopia, não foi possível observar alterações sugestivas de intoxicação grave como mudanças na coloração e consistência das vísceras dos animais tratados quando comparados ao grupo controle (MARIZ, 2008).

O exame histopatológico do fígado e baço não detectou alterações relevantes nos animais do grupo CH. O fígado dos animais tratados com álcool (CA) apresentou dilatações irregulares nos sinusóides hepáticos, focos inflamatórios peri-sinusoidais pontuais, sem congestão venosa, degeneração gordurosa dos hepatócitos, evidenciada por focos de vacuolização coalescente e volumosa que, em estágios avançados, deslocam o núcleo celular para a periferia de limites nítidos, dando à célula um aspecto pálido e esponjoso. Os vacúolos têm limites muito nítidos porque a gordura neutra (triglicérides) não se mistura com o citoplasma aquoso. Estudos mostram que vacúolos pequenos são por doenças metabólicas agudas. Já os vacúolos grandes são por lesões tóxicas ou virais de desenvolvimento lento (CRAWFORD, 2005). Os Indivíduos tratados com B. crassifolia apresentaram focos inflamatórios no parênquima e na região peri-portal, associados a vacuolização de hepatócitos e maior número de células de Kupfer na luz dos sinusóides. Não foi observada congestão venosa. Devido a extrema vulnerabilidade do fígado a substâncias químicas e variações (FARRELL; LIDDLE, 2002), esses resultados sugerem toxicidade aguda oral relativamente baixa. O baço dos animais do grupo controle apresentou achados habituais. O grupo CA e TB apresentou aumento evidente dos megacariócitos e congestão da polpa vermelha com alargamento dos vasos sinusóides. Além disso, os achados do grupo TB incluíram hiperplasia da polpa branca, compatível com aumento do número de linfócitos dos centros germinativos por estimulação do sistema imunitário. Esses dados corroboram estudos prévios que sugerem que o consumo de álcool promova um aumento significativo da população megacariocítica residente na polpa vermelha, resultando em modificações hiperplásicas importantes no baço de roedores, afetando tanto os megacariócitos da região filtradora (polpa vermelha) como as áreas envolvidas na resposta imune (folículos linfóides da polpa branca) (MELO-JÚNIOR et al., 2001).

CONCLUSÃO O tratamento promoveu alterações comportamentais heterogêneas e pouco

significativas. Não existiu variação de peso significativa para categorizar toxicidade aguda. As alterações histopatológicas observadas não sugerem alto grau de letalidade ou toxicidade, sugerindo que o produto possui baixa toxicidade aguda. Entretanto, sugere-se a continuidade dos estudos mediante pesquisa da toxicidade crônica do produto. AGRADECIMENTOS Universidade Anhanguera-UNIDERP, CNPq, Fiocruz/MS e FUNDECT. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BADKE, Marcio Rossato et al . Saberes e práticas populares de cuidado em saúde com o uso de plantas medicinais. Texto & contexto - enfermagem, Florianópolis, v. 21, n. 2, p. 363-370, Jun. 2012. CARLINI EA, Nappo AS, Galduróz JCF, Noto AR. Drogas psicotrópicas: o que são e como agem. Revista do Instituto de medicina social e de criminologia de São Paulo. 2001; (3): p 9-35. BRITO, A. R. M. S. Toxicidade aguda (dose simples e doses repetidas), subcrônica e crônica. Em: BRITO, A.R.M.S. Manual de ensaios toxicológicos in vivo. Campinas: Ed. UNICAMP; Rio de Janeiro: Ed. Três, 1994. p. 15-50. FRANÇA, Inácia Sátiro Xavier de; SOUZA, Jeová Alves de; BAPTISTA, Rosilene Santos e BRITTO, Virgínia Rossana de Sousa. Medicina popular: benefícios e malefícios das plantas medicinais. Revista brasileira de enfermagem, Brasília, v. 61, n. 2, p. 201-208, Apr. 2008. MARIZ, Saulo R. et al . Avaliação histopatológica em ratos após tratamento agudo com o extrato etanólico de partes aéreas de Jatropha gossypiifolia L. Revista brasileira de farmacognosia, João Pessoa , v. 18, n. 2, p. 213-216, Jun. 2008. MELO, Sandra Soares et al. Efeito da erva-mate (Ilex paraguariensis A. St. Hil.) sobre o perfil metabólico em ratos alimentados com dietas hiperlipídicas. Alimentos e Nutrição, Araraquara, v. 18, n. 4, p. 439-447, Out. 2007. MELO-JÚNIOR, M. R.; LIMA, L.A.; CAVALCANTE, C.L.B.; PONTES FILHO, N. T. Alterações esplênicas na exposição pré e pós-natal ao álcool: Um estudo histomorfométrico. Anais da Faculdade de Medicina do Centro de Ciências da Saúde da UFPE, Recife, v. 46, n. 1, p. 8-13, Feb. 2001. SILVEIRA, Patrícia Fernandes da; BANDEIRA, Mary Anne Medeiros; ARRAIS, Paulo Sérgio Dourado. Farmacovigilância e reações adversas às plantas medicinais e fitoterápicos: uma realidade. Revista brasileira de farmacognosia, João Pessoa, v. 18, n. 4, p. 618-626, Dec. 2008. VEIGA JUNIOR, Valdir Florencio da. Estudo do consumo de plantas medicinais na Região Centro-Norte do Estado do Rio de Janeiro: aceitação pelos profissionais de saúde e modo de uso pela população. Revista brasileira de farmacognosia, João Pessoa, v. 18, n. 2, p. 308-313, June 2008.