avaliação da capacidade de um modelo experimental para indução
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Eduardo Landini Lutaif Dolci
Avaliação da capacidade de um modelo experimental para indução de
rinossinusite bacteriana em coelhos
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Pesquisa em Cirurgia.
SÃO PAULO 2014
Eduardo Landini Lutaif Dolci
Avaliação da capacidade de um modelo experimental para indução de
rinossinusite bacteriana em coelhos
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Pesquisa em Cirurgia.
Área de concentração: Reparação Tecidual
Orientador: Prof. Dr. José Eduardo Lutaif Dolci
SÃO PAULO 2014
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Dolci, Eduardo Landini Lutaif Avaliação da capacidade de um modelo experimental para indução de rinossinusite aguda bacteriana em coelhos./ Eduardo Landini Lutaif Dolci. São Paulo, 2014.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Pesquisa em Cirurgia.
Área de Concentração: Reparação Tecidual Orientador: José Eduardo Lutaif Dolci 1. Sinusite 2. Sinusite/microbiologia 3. Modelos animais 4.
Modelos animais de doenças 5. Coelhos
BC-FCMSCSP/35-14
Dedicatória
À minha mãe Inês, por todo o apoio e colaboração em todas as etapas da minha vida pessoal e profissional, pelo exemplo profissional, inspiração de construção familiar e
dedicação aos filhos incomparável. Obrigado por tudo, ontem, hoje e sempre!
Aos meus irmãos Rick e Léo, por todos os momentos de convivência, amizade e cumplicidade ao longo de todas as nossas vidas.
À Karen, pelo carinho, amizade, companheirismo, apoio e pelo brilho em minha vida.
A todos os meus familiares, em especial meus avós presentes Antenor e Maria Luiza (e ausentes, Reneé e Lourenço) pelos exemplos de perseverança, honestidade, e por nos
ensinarem a importância vital e incomensurável da união familiar em nossas vidas.
Epígrafe
"Jamais algo grande demais será alcançado sem grandes homens, e os homens são
grandes apenas se eles estão determinados a assim ser. Dá-se glória apenas para aqueles
que sempre sonharam com ela."
Charles De Gaulle
“Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a vitória é o desejo de vencer.” Mahatma Gandhi
“As palavras de amizade e conforto podem ser curtas e sucintas, mas o seu eco é infindável.”
Madre Teresa de Calcutá
“Viver é acalentar sonhos e esperanças, fazendo da fé a nossa inspiração maior. É buscar
nas pequenas coisas, um grande motivo para ser feliz! ”
Mario Quintana
Epígrafe
“Não digam palavras que fazem mal aos outros, mas usem apenas palavras boas, que ajudam
os outros a crescer na fé e a conseguir o que necessitam, para que as coisas que vocês dizem
façam bem aos que ouvem.”
(Efésios 4.25)
“Seja forte e corajoso, não fique desanimado, nem tenha medo, porque Eu o Senhor seu
Deus, estarei com você em qualquer lugar por onde você passar.”
(Josué 1:9)
AGRADECIMENTO ESPECIAL Ao Prof. Dr. José Eduardo Lutaif Dolci, Professor Titular de Otorrinolaringologia e Diretor do Curso de Medicina da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela dedicação e amor irrepreensíveis nestes 33 anos, meu grande exemplo familiar, pessoal e profissional. Muito obrigado pelos ensinamentos diários, pela alegria, prazer e privilégio da eterna convivência;
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo por possibilitar o desenvolvimento deste trabalho;
À Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, pela grande contribuição em minha formação, pelo privilégio, prazer e oportunidade de trabalhar desde 2010 no Departamento de Otorrinolaringologia;
À Faculdade de Ciências Médicas de Santos, minha segunda casa, pela minha formação médica e crescimento pessoal;
Ao Prof. Dr. Ivo Bussoloti Filho, Professor Adjunto do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, por sua contribuição à minha formação desde meu ingresso no Departamento de Otorrinolaringologia da Santa Casa de São Paulo;
Ao Prof. Dr. Paulo Roberto Lazarini, Professor Adjunto e Diretor do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela grande ajuda na elaboração deste trabalho;
Ao Prof. Dr. Leonardo da Silva, Professor Assistente do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pelo inestimável apoio desde o início do projeto, pela atenção e dedicação sempre presentes;
Ao Prof. Dr. Osmar Mesquita de Souza Neto, Professor Adjunto do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pelo exemplo em minha formação e pelo auxílio na elaboração do projeto;
Ao Prof. Dr. Alessandro Murano Ferre Fernandes, Professor Instrutor do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela colaboração e sugestões pertinentes neste trabalho;
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Herrerias de Campos, Professor Adjunto do Departamento de Otorrinolaringologia da Santa Casa de São Paulo, pelo exemplo ético-profissional e pela grande contribuição em minha formação;
Ao Prof. Dr. Fernando de Andrade Quintanilha Ribeiro, Professor Adjunto do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela dedicação ao curso da Pós-Graduação;
Ao Dr. Carlos Augusto Correia de Campos, Professor Instrutor do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pelos ensinamentos desde meu ingresso nesta Instituição e amizade fiel de longa data;
Ao Dr. Rodolfo Alexander Scalia, Professor Instrutor do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela grande amizade, apoio neste projeto da pós-graduação e exemplo de dedicação ao Departamento;
Aos Profs. Drs. Lídio Granato e Carlos Kayoshi Takara, pelos ensinamentos inesgotáveis durante minha residência e atualmente no Ambulatório de Rinossinusopatias;
À Sr ͣ. Sônia Regina Alves e Sr. Daniel Gomes, da secretaria da Pós-Graduação da Santa Casa de São Paulo, pela constante ajuda e paciência no desenvolvimento deste trabalho;
À todos os funcionários do Departamento de Microbiologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, em especial à Prof. Dra. Suely Mitoy Ykko Ueda e a Sra Suzethe Matiko Sassagawa, por todo o apoio, atenção e disposição na realização deste trabalho;
Aos funcionários do ICAO, por todo o suporte necessário durante a realização do experimento, em especial, Solange;
À Fundação CAPES, pela contribuição ao projeto através de bolsa de estudos;
A todos os colegas, residentes, fellows e funcionários do Departamento de Otorrinolaringologia da Santa Casa de São Paulo, em especial às secretárias Sra. Maria Zélia Cirino Vieira e Srta. Telma Vieira Arlindo;
A todos os amigos que direta ou indiretamente participaram desta etapa em minha vida, dando o suporte essencial para a concretização deste projeto. Em especial aos meus amigos da XXXIX turma da FCMS e meu grande amigo Pedro Paulo Marinho Ayres. Obrigado por fazerem parte da minha vida e estarem sempre presentes.
Lista de Abreviaturas e Símbolos
µg .......... Micrograma
cel ......... Célula
Cm ........ Centímetro
COM ..... complexo óstio-meatal
ed. ......... Edição
EUA ...... Estados Unidos da América
Fig. ........ Figura
g ............ Grama
HE ......... hematoxilina-eosina
ICAO ..... Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia
kg .......... Kilograma
l ............. Litro
mg ......... Miligrama
ml .......... Mililitro
n ............ número de animais na amostra
p ............ Probabilidade
PMMA ... polimetil-metacrilato
RSA ...... rinossinusite aguda
RSC ...... rinossinusite crônica
SBCAL .. Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
sp .......... Espécie
Tab. ....... Tabela
TC ......... tomografia computadorizada
Lista de tabelas
Tabela 1. Descrição dos grupos de animais, número de coelhos e os dias de sacrifício e remoção dos tampões nasais ................................................. 18
Tabela 2. Descrição dos grupos de bactérias encontrados nas amostras de acordo com o lado dos 20 coelhos dos grupos de estudo.................................... 30
Tabela 3. Descrição da positividade do swab conforme o dia de sacrifício dos grupos e resultado dos testes estatísticos ................................................ 31
Tabela 4. Descrição do grau de inflamação e proliferação conjuntivo-fibrosa conforme o dia de sacrifício dos grupos e resultado dos testes estatísticos. .............................................................................................. 32
Tabela 5. Resultado das comparações múltiplas do grau de inflamação no lado induzido entre os grupos. ......................................................................... 32
Tabela 6. Descrição da concordância das bactérias do tampão e da microbiologia no lado induzido conforme os grupos e resultado dos testes estatísticos. ....................................................................................... 33
Lista de tabelas
Figura 1. Tampão nasal de Merocel® dividido em 3 fragmentos. Colocamos um fragmento em cada cavidade nasal direita dos coelhos dos grupos de estudo. ..................................................................................................... 19
Figura 2. Inserção do tampão nasal na cavidade nasal direita de coelho previamente anestesiado. ........................................................................ 19
Figura 3. Coelho do grupo A após a retirada do tampão no 10º dia, com quadro infeccioso à direita. ................................................................................... 21
Figura 4. Parede externa das cavidades nasossinusais abertas, com exposição dos seios maxilares e cavidade nasal. Processo infeccioso evidente à direita, caracterizado por edema mucoso e presença de secreção purulenta. Locais anatômicos representados por seio maxilar (M), septo nasal (S), concha inferior (C) e fossa nasal (N). ....................................................... 21
Figura 5. Mucosa de seio maxilar do lado direito do grupo de estudo sacrificado após 10 dias, demonstrando inflamação intensa caracterizada por agregados de células inflamatórias (grau 3), delimitada pelas setas - microscopia óptica, coloração HE, aumento de 100 vezes. ..................... 23
Figura 6. Mucosa sinusal do lado esquerdo do grupo de estudo sacrificado após 17 dias, com inflamação moderada caracterizada por infiltrado inflamatório difuso em lâmina própria, sem formação de agregados inflamatórios (grau 2) delimitada pelas setas - microscopia óptica, coloração HE, aumento de 100 vezes. ................................................................................................ 23
Figura 7. Mucosa sinusal do lado direito do grupo de estudo sacrificado após 10 dias, com inflamação moderada caracterizada por infiltrado inflamatório difuso em lâmina própria, sem formação de agregados inflamatórios (grau 2), delimitada pelas setas - microscopia óptica, coloração HE, aumento de 100 vezes. ................................................................................................ 24
Figura 8. Mucosa sinusal do lado direito do grupo de estudo sacrificado após 17 dias, com inflamação intensa (grau 3), demonstrando permeação do epitélio por neutrófilos (setas cheias) e fibroblastos (setas vazadas) no córion superficial. Microscopia óptica, coloração HE, aumento de 200 vezes. ....................................................................................................... 24
Figura 9. Recipiente com caldo suplementado à esquerda e laminocultivo à direita. Face do laminocultivo constituída por meio ágar Chocolate (H) e indicador de CO2 (i).................................................................................................. 25
15
Figura 10. Sistema conectado através da abertura superior do frasco com o laminocultivo. Face do laminocultivo composta por meios ágar Sabouraud (B) e ágar MacConkey (M). ...................................................................... 26
Figura 11. Sistema após o término do período de incubação. Tampão nasal (T) no interior do frasco com caldo suplementado, indicador de CO2 (i) com coloração rosa forte pela presença de microorganismos e meio ágar Chocolate (H) com presença de colônias bacterianas. ............................ 27
Sumário
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
1.1 Revisão da Literatura .......................................................................................... 5
1.1.1 Modelo experimental de rinossinusite em coelhos ..................................... 5
1.1.1.1 Indução de rinossinusite ......................................................................... 5
1.1.1.2 Cultura de secreção sinusal .................................................................. 10
1.1.1.3 Histologia da mucosa sinusal ................................................................ 12
1.1.1.4 Análise do tampão nasal ....................................................................... 15
2 OBJETIVO ............................................................................................................. 16
3 MATERIAL E MÉTODO ......................................................................................... 17
3.1 Locais ............................................................................................................... 17
3.2 Animais ............................................................................................................. 17
3.3 Grupos .............................................................................................................. 17
3.4 Procedimentos anestésicos e sacrifício ............................................................ 18
3.5 Confecção do modelo experimental de rinossinusite ........................................ 18
3.6 Cultura da secreção e exame bacterioscópico ................................................. 20
3.7 Avaliação histológica da mucosa sinusal .......................................................... 20
3.8 Cultura de material do tampão nasal ................................................................ 24
3.9 Análise estatística ............................................................................................. 28
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 29
4.1 Cultura de secreção e exame bacterioscópico ................................................. 29
4.2 Avaliação histológica da mucosa sinusal .......................................................... 31
4.3 Análise do tampão nasal ................................................................................... 33
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 34
5.1 Modelo experimental de rinossinusites ............................................................. 34
5.2 Cultura de secreção e exame bacterioscópico ................................................. 37
5.3 Avaliação histológica da mucosa sinusal .......................................................... 38
5.4 Análise do tampão nasal ................................................................................... 40
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 42
7 ANEXOS ................................................................................................................ 43
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 45
Resumo .................................................................................................................... 50
Abstract .................................................................................................................... 51
LISTAS E APÊNDICES ............................................................................................ 52
1
1 INTRODUÇÃO
Rinite e sinusite frequentemente coexistem e são doenças concomitantes na
maioria dos indivíduos. Devido ao envolvimento quase universal do nariz em
condições inflamatórias sinusais, o termo rinossinusite, ao invés de sinusite, foi
recomendado pelo 1997 Task Force of the Rhinology and Paranasal Sinus
Committee. A grande variedade de sinais e sintomas associados a esta afecção tem
dificultado o estabelecimento de uma definição clínica adequada, visto que as
rinossinusites são reconhecidas e tratadas por médicos de diferentes
especialidades, como generalistas, pediatras, alergologistas, médicos de família,
pneumologistas e otorrinolaringologistas. Portanto, uma definição padronizada foi
designada para facilitar a comunicação entre médicos e promover uma abordagem
mais uniforme para a doença.
A rinossinusite é uma das doenças mais prevalentes atualmente. É a quinta
doença mais comum que requer uso de antibióticos (Ramanathan et al., 2006).
Aproximadamente 25 milhões de pessoas são diagnosticadas com rinossinusite por
ano nos EUA, tornando esta uma das principais doenças que requer atendimento
médico com otorrinolaringologistas ou generalistas. Os custos diretos e indiretos
associados às rinossinusites são altos, incluindo métodos diagnósticos, terapêuticos,
procedimentos, medicações e diminuição da produtividade (Hamilos et al., 1995).
A prevalência das RSA (rinossinusite aguda) e RSC (rinossinusite crônica) na
população geral é bastante elevada, porém existe uma dificuldade de se estimar
exatamente este valor, principalmente porque boa parte dos episódios é autolimitada
e pouco sintomática, não levando o paciente a buscar assistência médica. As
rinossinusites são responsáveis por 9% do total de antibióticos prescritos para a
população pediátrica e 21% do total prescrito para a população adulta nos EUA,
gerando gastos de cerca de 5,8 bilhões de dólares anuais, sendo 150 milhões de
dólares em antibióticos (Bhattacharyya, 2003; Bhattacharyya et al., 2011).
As infecções das vias aéreas superiores são a terceira causa mais comum de
consultas primárias nos EUA. Estudo realizado entre 1997 e 2006 apontou a
prevalência durante um ano de RSA e/ou RSC em 15,2% (Bhattacharyya, 2009). Na
Ásia, a RSA foi responsável por 6-10% das consultas de pronto atendimento
2
otorrinolaringológicas (Wang et al., 2011). Na Europa, um estudo multicêntrico
calculou em 10,9% a prevalência de RSC, com forte associação entre asma e RSC
em todas as idades, e esta associação com asma é ainda mais forte em pacientes
com RSC e rinite alérgica (Hastan et al., 2011).
Além dos custos diretos, os custos indiretos contribuem consideravelmente
para elevar as despesas relacionadas às rinossinusites. Como 85% dos pacientes
com rinossinusite estão em idade produtiva (entre 18-65 anos), os custos indiretos
como faltas ao trabalho (absenteísmo) e diminuição da produtividade no trabalho
(presenteísmo) colaboram significativamente para o impacto econômico da doença
(Blackwell et al., 2002). Através do uso de um questionário composto por 36
questões que abrangem oito domínios da saúde, o SF-36, a RSC apresentou
impacto negativo em diversos aspectos da qualidade de vida, e apresenta impacto
pior na função social do que outras doenças crônicas como insuficiência cardíaca
congestiva, dor nas costas e angina (Fokkens et al., 2012). Desta forma, é
imperativo que continuemos a estudar a fisiopatologia da doença e a desenvolver
estratégias adequadas e com melhora no custo-benefício para prestar ajuda aos
pacientes (Murphy et al., 2002).
A rinossinusite é consequência de múltiplos fatores. Os principais fatores
etiológicos responsáveis pelo seu desenvolvimento são: ambientais (infecções virais,
bacterianas, fúngicas, alergia, atopia, asma e poluição), anatômicos/locais (concha
bolhosa, desvio septal e distúrbio mucociliar) e sistêmicos (desordens genéticas,
imunodeficiências e distúrbios endocrinológicos) (Chan, Kuhn, 2009). A incidência
da RSA varia de acordo com a estação do ano (maior nos meses de inverno) e
variações climáticas, além de ambientes úmidos e poluição ambiental. A grande
maioria dos casos infecciosos de rinossinusites são agudos, eventos virais auto-
limitados, também conhecidos como resfriado comum. Os adultos apresentam em
média 2 a 5 resfriados por ano, e as crianças 7 a 10 por ano (Bachert et al., 2003).
Existem, também, evidências que suportam as hipóteses de que inflamação
alérgica persistente e exposição à fumaça do tabaco predispõem pacientes a
quadros de rinossinusite aguda (RSA), possivelmente através de alterações na
motilidade e na função ciliar. Porém, ainda são necessários estudos para confirmar
estas relações (Fokkens et al., 2012).
3
Os agentes virais mais comuns são rinovírus (principal em adultos),
parainfluenzae, vírus sincicial respiratório e influenzae. Aproximadamente 0,5-2%
dos pacientes com quadro de resfriado comum irão desenvolver rinossinusite aguda
bacteriana (Wang et al., 2011).
A RSA é infecciosa por natureza, enquanto que a RSC é menos
frequentemente bacteriana, apresentando uma etiologia multifatorial. Existem
estudos que sugerem que a RSC representa uma resposta imunológica e
inflamatória do hospedeiro a uma infecção inicial, apresentando-se
caracteristicamente como um quadro inflamatório (Fokkens et al., 2012).
A região denominada de complexo óstio-meatal (COM) é formada pela
confluência da drenagem de alguns seios paranasais (maxilar, frontal e etmoide
anterior). Algumas alterações anatômicas podem ocasionar obstrução do COM,
predispondo indivíduos à maior frequência de infecções sinusais. Embora exista
uma lista de fatores causais das rinossinusites bacterianas, o fator comum é a
obstrução do óstio de drenagem do seio. Quando ocorre um fator desencadeante,
como uma infecção viral, a mucosa nasossinusal é alterada e danificada (Caughey
et al., 2005).
O óstio dos seios, que já é estreito por alterações anatômicas, torna-se ainda
mais reduzido pelo edema da mucosa. Esta obstrução sinusal favorece o acúmulo
de muco no interior do seio, que estimulada pela hipoxia e diminuição da pressão
intrasinusal, causa vasodilatação, liberação de fatores de crescimento endotelial,
ocasionando transudação de fluidos e espessamento da mucosa sinusal. As
bactérias que habitualmente colonizam a rinofaringe e a cavidade nasal serão
transportadas para dentro dos seios após assoar o nariz. A inflamação associada a
esta infecção danifica a mucosa sinusal, ocasionando comprometimento do sistema
mucociliar (Early et al., 2007).
A literatura mundial tem apresentado diversas tentativas de modelação em
animais, sendo os estudos com coelhos os mais frequentes. Estes animais
apresentam anatomia e fisiologia muito semelhantes aos humanos. São os mais
adequados para estudos que exijam manipulação cirúrgica, porém apresentam alto
grau de mortalidade quando mantidos em estresse. Outros animais utilizados para
estudos são os ratos Wistar e Sprague-Dawley, cobaias e ovelhas (Grullón, Suárez,
1996; Illum, 1996; Marks, 1997; Costa et al., 2007).
4
Os modelos experimentais de rinossinusite citados na literatura têm como
objetivo causar uma inflamação dos seios paranasais semelhante aos processos de
rinossinusite habituais. Estes modelos experimentais têm sido utilizados para estudo
da fisiopatogenia da inflamação e avaliação dos resultados de tratamento (Min et al.,
1995; Cable et al., 2000; Çetin et al., 2002; Cheng et al., 2009). Estudos sugerem
manobras de obliteração das fossas nasais, obliteração dos óstios de drenagem
sinusal, instilação de mediadores do processo inflamatório e até materiais que atuam
como meio de cultura nas fossas nasais (Bende et al., 1996; Marks et al., 1997; Uslu
et al., 2006; Kim et al., 2008; Bleier et al., 2010).
Não encontramos na literatura algum modelo experimental de rinossinusite
aguda bacteriana que houvesse sido realizado e descrito detalhadamente, através
das análises histológicas de ambos os seios maxilares (lado induzido e lado
contralateral) e as análises microbiológicas de ambos os lados dos seios maxilares,
em um quadro infeccioso bacteriano.
Também não encontramos na literatura algum estudo que tenha realizado a
análise do tampão nasal, quando este foi utilizado como método para indução do
quadro de rinossinusite bacteriana. Esta análise poderia ser realizada na tentativa de
correlacionar os achados microbiológicos da cavidade nasal com o seio maxilar.
Poucos estudos analisaram esta correlação, e não encontraram resultados
significativos (Kara et al., 2004).
Observamos ainda que muitos estudos realizados tinham como objetivos a
produção de um quadro infeccioso ou a avaliação da eficácia terapêutica de
medicamentos. Portanto, poucos estudos avaliaram as alterações histológicas e
microbiológicas no período subsequente ao diagnóstico do processo infeccioso
agudo sinusal sem a utilização de algum medicamento, após a retirada do tampão
nasal, ou seja, não analisaram o período de recuperação.
Desta forma, podemos identificar que a literatura carece de um modelo
experimental de rinossinusite aguda com metodologia detalhada, através da
avaliação de parâmetros microbiológicos e histopatológicos em ambos os lados dos
seios maxilares, análise do tampão nasal para pesquisa da relação entre as
bactérias encontradas nos seios e nas fossas nasais, e que seja de simples
execução, facilmente reprodutível e altamente eficaz na geração de um quadro
infeccioso agudo bacteriano.
5
Existem ainda algumas dúvidas na literatura com relação à fisiopatologia e ao
tratamento das rinossinusites agudas, como o período esperado após o diagnóstico
da afecção para o início da terapêutica com antibióticos, a avaliação de pacientes
com recidiva do quadro logo após o término do tratamento e porque alguns
pacientes desenvolvem quadros recorrentes e/ou crônicos após um episódio agudo
de rinossinusite.
Acreditamos que o presente estudo possa contribuir para a padronização
deste modelo experimental proposto, e solucionar algumas das dúvidas existentes
em trabalhos anteriores, que sugeriram novos experimentos para a complementação
das pesquisas realizadas até então, nesta área de modelos experimentais de
rinossinusite em coelhos. Costa et al. (2007) afirmaram que “estamos
desenvolvendo alguns estudos nesta área, na tentativa de padronizar um modelo
experimental de rinossinusite, com metodologia detalhada, para eliminar a
possibilidade de viés nessas pesquisas”. Kara et al. (2004) concluíram em seu
trabalho que “futuros estudos são necessários para padronizar este modelo e
examinar se as cepas de bactérias se propagam, ou não, da cavidade nasal para o
seio”.
1.1 Revisão da Literatura
1.1.1 Modelo experimental de rinossinusite em coelhos
1.1.1.1 Indução de rinossinusite
O primeiro modelo experimental em coelhos foi realizado e descrito por
Hilding (1941) apud Marks (1997) em 1941. Realizou antrostomias através de
acesso externo em quatro diferentes locais, incluindo a ampliação do óstio natural,
adjacente a este óstio natural, no assoalho do seio e o mais afastado possível do
óstio natural. Observou que as antrostomias realizadas através ou próximas ao óstio
natural causaram rinossinusite supurativa em cinco de seis coelhos, ao passo que
6
antrostomias realizadas em locais distantes causaram infecção em apenas um de
seis coelhos.
Kelemen (1955) apud Kara et al. (2004) em 1955, estudou a anatomia das
cavidades nasais e sinusais dos coelhos, microscopicamente e macroscopicamente,
descrevendo detalhadamente as estruturas e espaços como um guia para futuros
pesquisadores.
Em 1981, Maeyama publicou trabalho em que induziu um processo de
rinossinusite através de sucessivas inoculações transcutâneas de 1mL de cepas de
Staphylococcus aureus com o uso de uma seringa estéril, bilateralmente, nos seios
paranasais de coelhos previamente sensibilizados com albumina. Através de
microscopia óptica e microscopia eletrônica, observou alterações morfológicas nas
mucosas caracterizadas por inflamação após duas semanas, em alta incidência
nestes animais.
Nos anos subsequentes, Johansson et al. (1988) descreveram um modelo
experimental após indução de rinossinusite em 69 coelhos e estudaram os
diferentes aspectos da doença. A técnica básica deste modelo consistia na abertura
da parede anterior do seio maxilar, oclusão do óstio com cola e sutura das incisões.
No dia seguinte, injetaram 1 ml de solução de Streptococcus pneumoniae
diretamente no interior do seio maxilar do mesmo lado da realização da oclusão do
óstio. Observaram desenvolvimento de rinossinusite purulenta unilateral em todos os
animais.
Hinni et al. (1992) criticaram os modelos experimentais descritos até então,
afirmando que estes violavam cirurgicamente a cavidade sinusal com o objetivo de
obstruir o óstio sinusal. Desta forma, causavam alterações do seio anteriormente ao
início dos experimentos, caracterizadas por alterações inflamatórias, interrupção de
fluxo dos capilares sanguíneos e diminuição do fluxo mucociliar pré-existente.
Realizaram estudo experimental em 20 coelhos para avaliarem as alterações
precoces nas mucosas sinusais envolvidas em um processo agudo. Cinco dias após
o início, os animais foram sacrificados e as mucosas sinusais submetidas a análises
por microscopia óptica, para identificação de perda de células ciliadas e taxa de
batimento ciliar. Induziram o processo infeccioso através da oclusão do óstio sinusal,
realizado por via externa através do teto da cavidade nasal, associado à instilação
de toxoides de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenze e Pseudomonas
7
aerugionosa. Observaram alterações estatisticamente significativas nas taxas de
batimento ciliar e perdas severas de células ciliadas nas mucosas sinusais após
desenvolvimento de rinossinusite em 5 dias.
Marks (1997) descreveu um método diferente de indução de rinossinusite,
através de um modelo rinogênico. Utilizou 48 coelhos no trabalho, que foram
divididos de acordo com o período de sacrifício, sendo este realizado semanalmente
até a sexta semana. Realizou a indução do processo infeccioso através da inserção
de um pedaço de esponja sintética na cavidade nasal direita dos coelhos, embebida
em solução de Streptococcus pneumoniae. Não realizou a oclusão cirúrgica do óstio
sinusal. A esponja foi mantida nas fossas nasais até o sacrifício dos coelhos, sendo
que o último grupo foi sacrificado com 6 semanas. A avaliação histológica dos seios
foi realizada semanalmente após o sacrifício de cada grupo de animais. Observou a
morte de dois coelhos durante os primeiros seis dias após a indução do quadro
infeccioso. Apresentou indução de rinossinusite em 83% dos animais do estudo que
foram sacrificados nos primeiros 14 dias, com a presença de inflamação intensa
nestes animais. O quadro inflamatório foi regredindo no decorrer das semanas após
o início do experimento.
Kara et al. (2004) realizaram estudo utilizando o mesmo método de Marks
(1997) objetivando a determinação do período ideal para indução de rinossinusite
aguda e avaliação das alterações microbiológicas e histopatológicas neste modelo
experimental. Dividiram 39 coelhos em três grupos, com e sem embebição em
solução bacteriana de Streptococcus pneumoniae da esponja sintética, e um grupo
controle. Realizaram a indução do processo infeccioso através da inserção de
esponja sintética na fossa nasal direita dos animais, que foram removidas logo após
o diagnóstico de rinossinusite realizado através de TC (tomografia
computadorizada). Também utilizaram avaliações microbiológicas e histológicas das
mucosas das fossas nasais e dos seios maxilares após o sacrifício. Observaram
quadro de rinossinusite em todos os animais dos dois grupos de estudo até o 8º dia
do início do experimento. E após a remoção das esponjas, o quadro inflamatório na
mucosa sinusal persistiu até 30 dias após o inicio do trabalho.
Perloff e Palmer (2005) utilizaram um modelo experimental para a pesquisa
de biofilmes bacterianos em um quadro agudo sinusal. Realizaram indução de
rinossinusite em 22 coelhos, através de acesso externo com identificação do óstio
8
sinusal e oclusão do mesmo com o uso de polimetil-metacrilato (PMMA), associado
à instilação de 1 mL de toxoide de Pseudomonas aeruginosa no interior do seio. Os
animais foram sacrificados com 6, 10 e 20 dias. Relataram presença de secreção
purulenta em todos os coelhos do estudo. Identificaram também, através de cultura
da secreção nasal, a presença de Pseudomonas aeruginosa em 21 coelhos. E
através do uso de microscopia eletrônica e microscopia óptica, observaram a
presença de biofilmes bacterianos pela identificação de glicocálix, canais de água e
estruturas tridimensionais.
No Brasil, Costa et al. (2007) realizaram um trabalho comparativo de modelos
experimentais de rinossinusite em coelhos. Dividiram 20 animais em 4 grupos com
modelos diferentes, realizando os seguintes procedimentos: inserção de esponja de
banho em uma cavidade nasal, instilação unilateral de cianoacrilato para obstrução
do óstio, instilação unilateral de sangue periférico do próprio animal no seio maxilar
por punção percutânea e instilação unilateral de toxoide bacteriano (50%
estafilocócico e 50% estreptocócico) por punção percutânea. Acompanharam os
animais até 15 dias do início do estudo e após o sacrifício, fizeram a análise
histológica dos seios maxilares. Observaram que todos os animais do estudo
apresentaram rinorreia purulenta unilateral até 15 dias de acompanhamento
Liang et al. (2008) realizaram estudo experimental para a indução de
rinossinusite crônica em modelo experimental de coelhos. Dividiram os coelhos em
dois grupos, sendo que no final do estudo 10 coelhos pertenciam ao grupo A e 12
coelhos ao grupo B. Não incluíram e não quantificaram os animais que morreram
durante o experimento. Nos coelhos do grupo A, realizaram a indução de
rinossinusite através da inserção de esponja sintética em uma fossa nasal. Nos
coelhos do grupo B. a indução foi realizada com a injeção de polimetil-metacrilato
(PMMA) em ambas as fossas nasais e esponja sintética em apenas uma das fossas
nasais. Na segunda semana após a indução, realizaram a remoção da esponja
sintética de todos os animais e estes também foram submetidos a TC e
nasoendoscopia. Todos estes exames foram repetidos na 12ª semana. Obtiveram
59% de coelhos com rinossinusite crônica encontrada após 12 semanas da indução
do processo com esponja sintética isolada e/ou em associação com PMMA.
Concluíram também, que mais de 90% dos coelhos induzidos apenas com merocel,
sem embebição em solução bacteriana, desenvolveram rinossinusite aguda.
9
Campos (2010) realizou estudo experimental para avaliação da eficácia do
tratamento tópico com Luffa operculata em coelhos com rinossinusite. Utilizou
modelo experimental com introdução de esponja de polivinil em uma das fossas
nasais de 60 coelhos, associado à instilação percutânea de solução composta por
0,8 ml de sangue periférico do próprio animal e 0,2 ml de toxoide estreptocócico e
estafilocócico. Comparou os dois grupos de coelhos, tratados com Luffa operculata e
controle, através de parâmetros histológicos, microbiológicos e hematológicos
(leucograma). No momento da retirada das esponjas, no 10º dia, todos os 56
animais remanescentes apresentavam rinorreia purulenta unilateral. Relatou a morte
de 4 animais nos primeiros 10 dias após o início do estudo, e de 3 animais até o
período final do estudo. Não observou diferenças estatisticamente significativas
entre os dois grupos analisados pelos parâmetros histológicos e hematológicos. Na
microbiologia, observou maior incidência de patógenos oportunistas no grupo
controle, porém sem diferença na evolução da doença.
Casteleyn et al. (2010) realizaram estudo anatômico das cavidades
paranasais de coelhos, justificado pelo crescente uso destes animais em modelos
experimentais de rinossinusite. Avaliaram 20 coelhos adultos Nova Zelândia através
de tomografia computadorizada, cortes histológicos e reconstrução tridimensional.
Observaram que as cavidades paranasais dos coelhos são pareadas e formadas por
seio concho-dorsal, seio maxilar e seio esfenoidal. Descreveram também que os
seios maxilares apresentam um recesso dorsal e outro ventral, que se comunicam
através de uma grande abertura, e o seio maxilar se abre no seio concho-dorsal
através de um grande orifício. Desta maneira, formam uma cavidade concho-maxilar,
que é conectada à cavidade nasal através de um pequeno orifício em forma de
fenda. Diferem dos humanos por não apresentarem seios etmoidal e frontal.
Concluíram que o seio maxilar dos coelhos é realmente o mais apropriado para
realização de trabalhos experimentais.
10
1.1.1.2 Cultura de secreção sinusal
Westrin et al. (1992) realizaram estudo experimental com o objetivo de
comparar os achados histopatológicos e de cultura em animais submetidos à
indução de rinossinusite por Streptococcus pneumoniae e Bacteroides fragilis.
Dividiram 36 coelhos em 2 grupos, sendo realizado bloqueio do óstio do seio maxilar
por acesso externo e inoculação do agente no interior do seio. Os animais foram
sacrificados com 5 dias, 2, 3 e 4 semanas. No grupo em que o pneumococo foi
utilizado, ocorreu substituição deste nos exames de cultura por agentes
oportunistas, logo após cinco dias de seguimento. Por outro lado, no grupo de
coelhos submetidos à inoculação de Bacteroides fragilis, foi possível a identificação
deste agente, mesmo após quatro semanas de indução da rinossinusite. Os coelhos
submetidos à instilação de Bacteroides fragilis apresentaram processo infeccioso
mais severo e persistente.
Ozturk et al. (2003) estudaram os níveis de óxido nítrico séricos e na mucosa
sinusal de coelhos submetidos a um quadro de rinossinusite aguda, e avaliaram a
eficácia de nitroprussiato de sódio para o tratamento do quadro infeccioso.
Realizaram o experimento em 21 coelhos, através da inserção de esponja absorvível
em fossa nasal direita e inoculação de solução de Streptococcus pneumoniae no
seio maxilar direito, um dia após a introdução da esponja. Os animais do grupo de
estudo foram divididos em três grupos: com rinossinusite e sem tratamento; com
rinossinusite e tratados com nitroprussiato de sódio; com rinossinusite e tratados
com levofloxacino por via oral. Um animal de cada grupo foi sacrificado com 3, 5, 7,
14, 21 e 28 dias. Removeram o tampão no quarto dia de indução e observaram,
através da cultura dos seios maxilares, que o agente inoculado estava presente
apenas no terceiro e quinto dia no grupo que não recebeu tratamento. No grupo que
recebeu nitroprussiato, este agente foi isolado apenas no terceiro dia, e no grupo
tratado com levofloxacino, não foi detectado. Observaram que os níveis de óxido
nítrico séricos diminuem durante um quadro de rinossinusite aguda, e que a
administração de nitroprussiato sódico acelera a recuperação histológica e
bacteriológica.
Liu et al. (2003) apud Cheng et al. (2009) induziram rinossinusite aguda em
40 coelhos para observação da bacteriologia nestes animais. Induziram o processo
11
infeccioso de três maneiras diferentes: bloqueio do óstio de drenagem maxilar por
via externa, inoculação sinusal de agente infeccioso e bloqueio do óstio associado à
inoculação do agente. Realizaram sacrifício dos grupos e análise microbiológica da
secreção dos seios com 1, 2, 3 e 4 semanas. Obtiveram 100% de positividade na
indução de rinossinusite apenas no grupo em que utilizaram as duas técnicas. No
grupo submetido apenas ao bloqueio do óstio sinusal, obtiveram 84,6% de
positividade. Observaram também que os agentes inoculados foram identificados e
isolados até duas semanas após a indução e, após este período, foram substituídos
pela presença de agentes oportunistas.
Kara et al. (2004) observaram similaridade entre as bactérias predominantes
isoladas nos dois grupos de estudo, sendo que, em um dos grupos, o tampão nasal
foi embebido em solução de Streptococcus pneumoniae e, no outro grupo, foi
embebido em solução salina. Nos primeiros 15 dias do início da indução, as
bactérias isoladas eram predominantemente Gram negativas em ambos os grupos,
como Pseudomonas sp, Proteus sp e Escherichia coli. Após 15 dias, observaram
diminuição de bactérias Gram negativas, com crescimento de Gram positivas,
principalmente estreptococo alfa-hemolítico.
Cheng et al. (2009) avaliaram os efeitos de corticosteroides intranasais para o
tratamento da rinossinusite aguda maxilar experimental em coelhos. Utilizaram
também, como modelo de indução, a associação da inserção de esponja sintética
em uma das fossas nasais com inoculação de solução contendo cepas de
Streptococcus pneumoniae na mesma fossa nasal, em 48 coelhos. Os tampões
nasais foram removidos 10 dias após o início do estudo em todos os animais.
Realizaram exames de cultura 2 a 4 semanas após o período de indução, com
identificação apenas de bactérias oportunistas, como Pseudomonas sp, Moraxella
sp e Escherichia sp. Não observaram a presença do pneumococo em nenhum dos
exames, mesmo nos animais do grupo controle, que não receberam tratamento.
A Pasteurella multocida, cocobacilo Gram negativo, é o microorganismo
patogênico oportunista mais comum em coelhos (Sirois, 2005; Liang et al., 2008). É
geralmente habitante comensal do trato respiratório superior e digestivo dos coelhos.
Pode ocasionar uma doença conhecida como pasteurelose, que é uma enfermidade
muito frequente na cunicultura e contribui bastante para a mortalidade de coelhos
devido a problemas respiratórios, principalmente a pneumonia. A incidência da
12
doença aumenta em situações de estresse do animal, na diminuição da resistência
corpórea e na presença de alta densidade populacional por gaiola (Makino e
Nakagui, 2005). Liang et al. (2008) isolaram esta bactéria em um grande número de
coelhos, porém o swab foi colhido apenas das cavidades nasais dos animais. Já
Ozturk et al. (2003), isolaram esta bactéria em apenas um coelho do grupo de
estudo no 5º dia após a indução. Outros autores não isolaram esta bactéria em
animais do estudo (Kara et al., 2004; Cheng et al., 2009; Campos, 2010).
1.1.1.3 Histologia da mucosa sinusal
Marks (1998) realizou um trabalho para caracterizar a histologia sinusal do
modelo rinogênico de rinossinusite em coelhos. Iniciou a indução do processo
infeccioso em 28 coelhos através da inserção de esponja sintética na fossa nasal
direita dos animais, com instilação de solução com cepas de Streptococcus
pneumoniae na mesma fossa nasal logo após a colocação da esponja. Grupos de 4
a 6 animais foram sacrificados em intervalos programados (1, 2, 4, 6 e 10 semanas).
Os tampões nasais foram mantidos nas fossas nasais até o dia do sacrifício dos
coelhos. Utilizou análise qualitativa e semiquantitativa para a avaliação das mucosas
sinusais. Observou, nas fases mais agudas (1 a 2 semanas), exsudato inflamatório
intenso predominantemente polimorfonucleado no lúmen dos seios e infiltrado
predominantemente linfoplasmocitário na mucosa, além de áreas com degeneração
epitelial, perda ciliar e ulceração. Nos estágios mais tardios, a partir da sexta
semana, relatou modificações menos intensas, como fibrose leve, metaplasia
epitelial e aumento de células caliciformes. Em todos os períodos, mesmo nos seios
não infectados, observou a presença de folículos linfóides na mucosa sinusal,
ressaltando a possível função destes na resposta imune à infecção.
Jyonouchi et al. (1999) analisaram a relação dos efeitos locais e imunológicos
em um modelo experimental de rinossinusite aguda em coelhos. Utilizaram 16
coelhos e induziram o quadro infeccioso sinusal através de incisão externa, com
exposição do seio maxilar esquerdo, oclusão do óstio sinusal com cianoacrilato e
instilação de solução contendo Bacteroides fragilis no interior do seio. Os animais
foram sacrificados após 1, 2, 3 e 4 semanas do início do experimento. Após análise
13
histológica por microscopia óptica, relataram alterações inflamatórias significativas
nas mucosas dos seios maxilares esquerdos nos grupos de animais sacrificados
com 1 e 2 semanas. Na 3ª e 4ª semanas, a inflamação sinusal foi caracterizada por
espessamento do estroma com fibrose e áreas de epitélio desnudo. Nos seios
contralaterais, relataram aumento de células glandulares e caliciformes, além de
leve espessamento do estroma.
Hassab e Kennedy (2001) utilizaram um modelo experimental de rinossinusite
em coelhos para observarem os efeitos a longo prazo da obstrução do óstio do seio
maxilar. Através de incisão externa, realizaram a obliteração do óstio sinusal direito
em 8 coelhos com o uso de histoacryl. Não utilizaram nenhum tipo de toxoide
bacteriano. Após 24 semanas, observaram apenas 3 coelhos com obstrução do
óstio sinusal e alteração da pressão sinusal. Quatro coelhos apresentaram secreção
purulenta no interior do seio maxilar direito. As análises histológicas de todas as
mucosas dos seios maxilares à direita evidenciaram sinais inflamatórios crônicos,
com infiltrado celular de linfócitos, eosinófilos, além de áreas com sinais de reação
inflamatória aguda. Não identificaram sinais de inflamação na mucosa dos seios
contralaterais.
Kara et al. (2004) realizaram modelo experimental com a introdução de
esponja sintética em fossa nasal direita com e sem associação de cepas bacterianas
em 39 coelhos, e apresentaram resultados muito semelhantes. Na fase inflamatória
aguda (animais sacrificados no dia do diagnóstico da rinossinusite), observaram
exsudato denso, predominantemente de leucócitos polimorfonucleares, metaplasia
de células escamosas, hiperplasia de glândulas subepiteliais, folículos linfóides e
mucosa polipoide. No 15º dia de acompanhamento, a camada subepitelial estava
mais espessa e edemaciada, além de se apresentar atrófica e inflamatória algumas
vezes. Numerosas células caliciformes estavam presentes em todos os seios
infectados. No 30º dia de recuperação, atividade osteoblástica, folículos linfóides e
mínima atividade fibroblástica foram observados.
Shin e Heo (2005) avaliaram os efeitos da obstrução nasal unilateral nas
mucosas nasais e dos seios maxilares em coelhos. Realizaram oclusão das fossas
nasais à direita de 23 coelhos, através de sutura e cauterização do orifício narinário.
Os coelhos foram sacrificados após 4, 8 e 12 semanas do início do estudo. Na
avaliação histológica, observaram infiltrados de células inflamatórias bilateralmente
14
nas fossas nasais e seios maxilares, sendo esta infamação mais intensa
proporcionalmente ao maior período de experimento.
Genc et al. (2008) utilizaram um modelo experimental de sinusite para avaliar
o desenvolvimento de óstio acessório do seio maxilar após quadro infeccioso agudo
sinusal. Utilizaram 5 coelhos como controle e 5 coelhos no grupo de estudo.
Desenvolveram quadro infeccioso através da inserção de esponja sintética em fossa
nasal direita e instilação de 0,5 mL de solução contendo Streptococcus pneumoniae
na mesma fossa nasal. O tampão nasal foi mantido até o sacrifício de todos os
coelhos do grupo de estudo, após 21 dias do início do experimento. Observaram
secreção purulenta nas fossas nasais e seios maxilares direitos de todos esses
animais. A análise histológica da mucosa sinusal revelou a presença de infiltrado de
células inflamatórias, predominantemente de leucócitos polimorfonucleares;
presença de eosinófilos e linfócitos; e perda de células ciliadas, degeneração
epitelial, áreas de ulceração e hiperplasia de folículos linfóides.
Liang et al. (2008) realizaram estudo experimental com introdução de Merocel
e PMMA, sem embebição de solução com bactérias, analisando 22 coelhos ao
término do experimento. Com 2 semanas, retiraram o tampão nasal de todos os
coelhos e observaram inflamação na mucosa e infiltrado eosinofílico. Mantiveram o
processo infeccioso até 12 semanas, caracterizando a rinossinusite crônica, com
persistência dos achados anteriores. Sugerem não ter sido observada inflamação
mucosa caracterizada por infiltrado leucocitário polimorfonuclear pela ausência de
inoculação de bactérias no experimento.
Ozcan et al. (2011) realizaram estudo experimental para comparar os
achados histopatológicos e tomográficos em um quadro de rinossinusite aguda.
Utilizaram 5 coelhos e realizaram a indução do quadro infeccioso através da
introdução de esponja gelatinosa embebida em cepas bacterianas de
Staphylococcus aureus em ambas as fossas nasais dos coelhos. Estes tampões
foram mantidos até o dia do sacrifício dos animais. Todos os animais foram
sacrificados no 10º dia e submetidos à TC de seios da face e análise histológica
semiquantitativa das mucosas dos seios maxilares e das fossas nasais. Relataram
diversos graus de desorganização epitelial, foco de ruptura de células epiteliais,
aumento de linfócitos e células polimorfonucleares, sendo estes os parâmetros
15
utilizados para a classificação do quadro infeccioso através da avaliação histológica.
Observaram também, que a TC não reflete as alterações agudas da mucosa sinusal.
1.1.1.4 Análise do tampão nasal
Não encontramos na literatura nenhum trabalho que tivesse realizado a
análise microbiológica do tampão nasal. Esta poderia ser realizada com o objetivo
de correlacionar os agentes encontrados na fossa nasal e no seio maxilar.
Kara et al. (2004) realizaram a cultura das mucosas das fossas nasais e dos
seios maxilares do mesmo lado da indução do quadro de rinossinusite, nos dois
grupos de coelhos estudados (com e sem o uso de toxoide bacteriano associado ao
tampão nasal), e não encontraram correlação entre os microorganismos
identificados.
Liang et al. (2008) realizaram a confecção de modelo experimental de
rinossinusite através de dois métodos diferentes. Em um dos grupos, a indução do
processo infeccioso foi realizada apenas com o uso de tampão nasal de Merocel®, e
no outro grupo, foi utilizada uma associação de tampão nasal com injeção de PMMA
na mesma fossa nasal. Não fizeram uso de toxoide bacteriano, e justificaram que o
desenvolvimento do processo infeccioso foi obtido com o aumento do tamanho do
tampão nasal para assegurar a obstrução do óstio sinusal.
16
2 OBJETIVO
O presente estudo tem como objetivo propor e avaliar a capacidade de um
modelo experimental para indução de rinossinusite aguda bacteriana em coelhos,
avaliando-se parâmetros histopatológicos da mucosa sinusal, microbiológicos da
secreção sinusal e tampão nasal e análise da presença de secreção nasal.
17
3 MATERIAL E MÉTODO
3.1 Locais
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal
(CEEA) do Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia (ICAO) e
realizado neste mesmo instituto. Os animais foram confinados em gaiolas
individuais, adequadas para raça e peso. Os mesmos tiveram oferta livre de ração e
água durante todo o período em que estiveram confinados. Todos os animais foram
mantidos em condições uniformes, por um período de 8 dias antes do início do
estudo. Todos os procedimentos cirúrgicos e experimentais foram realizados no
mesmo instituto, de acordo com os princípios éticos na experimentação animal,
postulados pelo Código Brasileiro de Experimentação em Animais (COBEA).
As preparações e análises histológicas foram realizadas no laboratório Pathos
Diagnósticos Médicos. Os estudos microbiológicos foram feitos no Departamento de
Microbiologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo.
3.2 Animais
Foram utilizados 22 coelhos da raça Nova Zelândia, adultos, brancos, de
ambos os gêneros, com peso entre 2500 – 3000g no início do experimento.
3.3 Grupos
Os coelhos foram divididos em 4 grupos: grupo A (6 coelhos), grupo B (7
coelhos), grupo C (7 coelhos) e grupo D como controle (2 coelhos). Os coelhos do
grupo A foram sacrificados no dia da remoção do tampão, 10 dias após a indução do
experimento. Os coelhos do grupo B foram sacrificados 17 dias após a indução, e os
coelhos do grupo C foram sacrificados 30 dias após a indução. Os 2 coelhos do
18
grupo D foram mantidos em ambiente separado, em uma sala diferente dos animais
dos grupos de estudo, durante 30 dias, e sacrificados juntamente com os coelhos do
grupo C (Tab. 1). Nestes dois animais não foram introduzidos o tampão nasal e o
toxoide bacteriano.
Tabela 1. Descrição dos grupos de animais, número de coelhos e os dias de sacrifício e remoção dos tampões nasais
Grupo Coelhos (nº) Sacrifício (dia) Remoção tampão (dia)
A 6 10 10
B 7 17 10
C 7 30 10
D 2 30
3.4 Procedimentos anestésicos e sacrifício
Para realizar a anestesia dos animais no início do trabalho para colocação
dos tampões e no 10º dia para a retirada dos mesmos, foram utilizadas uma
associação de cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepan, na concentração de
25 mg/ml (Zoletil® - Laboratório Virbal) e uma associação de citrato de fentalina e
citrato de droperidol (0,0785 mg/ml e 2,5 mg/ml, Nilperidol® - Laboratório Cristália). A
primeira foi administrada por via intramuscular na dose de 0,4 ml/kg e a segunda na
dose de 0,3 ml/kg. Durante os procedimentos, os animais permaneceram em
ventilação espontânea.
Para o sacrifício foi realizada injeção intracardíaca de 1,0 ml de cloreto de
potássio 19,1% (Equiplex Indústria Farmacêutica) nos animais previamente
anestesiados com tiopental sódico (Thiopentox® - Laboratório Cristália), na dose de
12 mg/kg, por via intramuscular.
3.5 Confecção do modelo experimental de rinossinusite
Foi realizado experimento para obtenção de um processo inflamatório
nasossinusal, através da fossa nasal dos animais, simulando uma rinossinusite
infecciosa aguda.
19
Os coelhos foram submetidos à anestesia geral e realizada assepsia no dorso
nasal dos animais com clorexidina aquosa 2%. Inicialmente foi colocado tampão
nasal de Merocel® estéril medindo 0,3 x 0,5 x 2,5 cm em cavidade nasal direita com
o uso de uma pinça baioneta estéril, seguido pela instilação de 1 ml de toxoide
estreptocócico e estafilocócico (Toxoidepot®) em fossa nasal ipsilateral com o uso
de uma seringa e agulha de insulina estéreis (Figs. 1 e 2). Realizamos a instilação
do toxoide no interior da fossa nasal após a colocação do tampão nasal para que
pudéssemos padronizar a quantidade de toxoide em todos os animais.
Figura 1. Tampão nasal de Merocel® dividido em 3 fragmentos. Colocamos um fragmento em cada fossa nasal direita dos coelhos dos grupos de estudo.
Figura 2. Inserção do tampão nasal na cavidade nasal direita de coelho previamente anestesiado.
O tampão foi retirado no 10º dia após o início do experimento em todos os
animais dos três grupos de estudo.
20
3.6 Cultura da secreção e exame bacterioscópico
Foi realizada a abertura e exposição da parede anterior dos seios maxilares
bilateralmente em cada animal, inicialmente do lado esquerdo para evitar
contaminação do lado contralateral ao da indução do experimento, com coleta de
secreção do interior dos mesmos através de swab (Cuturet®). Os materiais foram
mantidos em local com temperatura ambiente, sem exposição solar e encaminhados
ao laboratório após 24 – 36 horas da coleta.
Todas as amostras de secreção foram preparadas em lâminas e coradas pela
técnica de Gram, para realização de exame bacterioscópico. Desta forma, as
lâminas foram coradas com violeta de metila, fixadas com lugol, descoradas com
álcool etílico e coradas novamente com safranina. Realizou-se leitura das lâminas
por meio de microscopia óptica, com objetiva de imersão (1000x).
Após o exame bacterioscópico, os materiais foram semeados em cultura ágar
sangue, ágar chocolate e ágar Sabouraud. As placas de ágar sangue e ágar
chocolate foram incubadas à temperatura de 35 ± 2ºC. Foram realizadas leituras
diárias das placas até completar 48 horas para os meios ágar Sangue e ágar
Chocolate, e 15 dias para ágar Sabouraud.
Todos os exames bacterioscópicos e de cultura das secreções sinusais foram
realizados por técnicos do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo.
3.7 Avaliação histológica da mucosa sinusal
Logo após o sacrifício, as estruturas que revestiam a face do coelho foram
dissecadas, e realizou-se a abertura da parede anterior dos seios maxilares e da
parede externa das cavidades nasais. Foi removida, então, a mucosa do interior dos
seios maxilares (Figs. 3 e 4).
21
Figura 3. Coelho do grupo A após a retirada do tampão no 10º dia.
Figura 4. Parede externa das cavidades nasossinusais aberta, com exposição dos seios maxilares e cavidade nasal. Processo infeccioso evidente à direita, caracterizado por edema mucoso e presença de secreção purulenta. Locais anatômicos representados por seio maxilar (M), septo nasal (S), concha inferior (C) e fossa nasal (N).
As amostras de mucosa foram obtidas dos coelhos com remoção de mucosa
do interior dos seios maxilares, sendo imediatamente fixadas em formol a 10%
tamponado, permanecendo nesta solução pelo período mínimo de 24 horas, para
22
adequada fixação. Permaneceram 24 – 48hs sob nossa responsabilidade e
posteriormente foram encaminhadas ao laboratório de Patologia. A seguir,
realizaram-se a clivagem das amostras, passando-se então ao processamento
histológico propriamente dito (desidratação em banhos sucessivos com
concentrações crescentes de álcool etílico, diafanização em xilol e inclusão em
parafina a 60 graus centígrados) e a microtomia, tendo cada corte histológico a
espessura máxima de 4 micrômetros. Finalizando, as lâminas foram coradas pela
técnica da hematoxilina-eosina (HE) e montadas em lamínulas para análise
microscópica pelo patologista.
Todas as lâminas foram analisadas por um único patologista, que
desconhecia o grupo ao qual a amostra pertencia. Foi feita uma avaliação
semiquantitativa das alterações presentes. Posteriormente, as amostras foram
classificadas pelos critérios de inflamação adotados, segundo Marks (Marks, 1998;
Perez et al., 2012): 0 = ausência de inflamação; 1 = inflamação leve (esparsas
células inflamatórias, sem lesão epitelial); 2 = inflamação moderada (infiltrado
inflamatório difuso em lâmina própria, sem formação de agregados inflamatórios,
com lesão focal de células epiteliais caracterizada por desorganização e ruptura de
células epiteliais); 3 = inflamação intensa (denso infiltrado inflamatório difuso com
formação de agregados de células inflamatórias, com lesão difusa de células epiteliais
caracterizada por desorganização e ruptura de células epiteliais); 4 = inflamação
severa com ulceração. Foi avaliada também a proliferação conjuntivo-fibrosa
existente, de acordo com a sua intensidade, classificada em ausente, presente e
intensa (Fig. 5, 6, 7 e 8).
A confecção de todos os preparados histológicos foi realizada no laboratório
Pathos Diagnósticos Médicos, pelo mesmo técnico.
23
Figura 5. Mucosa de seio maxilar do lado direito do grupo de estudo sacrificado após 10 dias, demonstrando inflamação intensa caracterizada por agregados de células inflamatórias (grau 3), delimitada pelas setas - microscopia óptica, coloração HE, aumento de 100 vezes.
Figura 6. Mucosa sinusal do lado esquerdo do grupo de estudo sacrificado após 17 dias, com inflamação moderada caracterizada por infiltrado inflamatório difuso em lâmina própria, sem formação de agregados inflamatórios (grau 2) delimitada pelas setas – microscopia óptica, coloração HE, aumento de 100 vezes.
24
Figura 7. Mucosa sinusal do lado direito do grupo de estudo sacrificado após 10 dias, com inflamação moderada caracterizada por infiltrado inflamatório difuso em lâmina própria, sem formação de agregados inflamatórios (grau 2), delimitada pelas setas - microscopia óptica, coloração HE, aumento de 100 vezes.
Figura 8. Mucosa sinusal do lado direito do grupo de estudo sacrificado após 17 dias, com inflamação intensa (grau 3), demonstrando permeação do epitélio por neutrófilos (setas cheias) e fibroblastos (setas vazadas) no córion superficial. Microscopia óptica, coloração HE, aumento de 200 vezes.
3.8 Cultura de material do tampão nasal
Os tampões nasais removidos das fossas nasais dos coelhos foram
analisados para cultura de microorganismos através do Hemobac®. O Sistema
25
Hemobac Trifásico® é um produto utilizado na realização de culturas de sangue e
seus componentes, stem cell (células tronco), líquidos corpóreos e nutrição
parenteral. Utilizamos o Hemobac Trifásico Pediátrico®. O sistema é composto por
dois elementos: recipiente plástico contendo 30 ml de um caldo suplementado com
extrato de levedura e polianetol-sulfonado de sódio (SPS) e um laminocultivo (Fis. 9
e 10). Este último apresenta duas faces, sendo uma Face larga, composta por ágar
Chocolate e indicador de CO2 para detectar crescimento bacteriano e/ou fúngico, e
outra Face dividida, formada por ágar Sabouraud e ágar MacConkey. O sistema
apresenta as fases descritas a seguir: Fase 1- Caldo suplementado (Triptona Soja
Caldo, Piridoxina, L-Cisteína, Extrato de levedura): promove o crescimento de
microorganismos, devido à riqueza de nutrientes; Fase 2- Meios de cultura sólidos
que permitem o crescimento de bactérias (ágar Chocolate, ágar MacConkey) e
fungos (ágar Sabouraud); Fase 3 – Indicador: a viragem de cor para rosa forte e
vermelho ocorre pela presença de CO2 produzido pelo microorganismo.
Figura 9. Recipiente com caldo suplementado à esquerda e laminocultivo à direita. Face do laminocultivo constituída por meio ágar Chocolate (H) e indicador de CO2 (i).
26
Figura 10. Sistema conectado através da abertura superior do frasco com o laminocultivo. Face do laminocultivo composta por meios ágar Sabouraud (B) e ágar MacConkey (M).
Iniciamos com a colocação do tampão nasal no interior do recipiente contendo
o caldo, logo após sua retirada da fossa nasal do coelho, com oclusão do frasco.
Para cada tampão nasal removido, utilizamos um Hemobac Trifásico Pediátrico®.
Este foi agitado levemente para que ocorresse a homogeneização da amostra com o
caldo. Mantivemos o material durante 72 horas a temperatura ambiente, sem
exposição solar e sem manipulação do material. A seguir, os materiais foram
encaminhados ao Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Médicas
da Santa Casa de São Paulo. O sistema foi completado com o encaixe do
laminocultivo ao frasco com o caldo, próximo ao bico de Bunsen, evitando, desta
forma, risco de contaminação. O sistema foi girado até que a Face dividida do
laminocultivo ficasse direcionada para a tampa de alumínio, sendo então agitado
27
levemente e realizada pré-incubação a 35ºC ± 2ºC durante 4 horas. A seguir, o
sistema foi invertido gradualmente para que fosse realizada a semeadura das faces
do laminocultivo. O mesmo foi reposicionado na posição original para que todo o
meio líquido voltasse para a porção inferior do frasco. Todos os materiais foram
novamente incubados a 35ºC ± 2ºC, e observados duas vezes ao dia para a
identificação de colônias e/ou mudança do indicador de CO2 (Fig. 11)
Figura 11. Sistema após o término do período de incubação. Tampão nasal (T) no interior do frasco com caldo suplementado, indicador de CO2 (i) com coloração rosa forte pela presença de microorganismos e meio ágar Chocolate (H) com presença de colônias bacterianas.
28
O período de incubação foi de 7 dias, procedendo-se, a seguir, com a
separação dos 2 recipientes e a identificação das colônias presentes em meio
sólido. Os meios ágar Chocolate e ágar MacConkey foram utilizados para a
identificação bacteriana. Os materiais foram mantidos incubados por mais 8 dias,
totalizando 15 dias, à temperatura ambiente, para a pesquisa de fungos no meio
ágar Sabouraud.
3.9 Análise estatística
Realizamos a análise estatística para avaliar o grau de inflamação na
mucosa, a proliferação conjuntivo-fibrosa e a presença ou não de bactérias, de
acordo com o dia de sacrifício dos animais.
Foram descritos todos os grupos de bactérias encontrados na amostra em
ambos os lados com uso de frequências absolutas e relativas. O grau de inflamação
da mucosa e a proliferação conjuntivo-fibrosa foram comparados entre os dias de
sacrifício com o uso de testes Kruskal-Wallis (Kirkwood, Sterne, 2006) seguidos de
comparações múltiplas não paramétricas de Dumm (Neter et al., 1996) para
comparação dos dias dois a dois, quando necessário. Para a presença ou não de
bactérias, foi verificada a existência de associação com uso de teste da razão de
verossimilhanças (Kirkwood, Sterne, 2006).
A concordância entre o swab e a cultura realizada no tampão foi descrita
conforme os dias de sacrifício e verificada a existência de associação da
concordância com os dias de sacrifício, com uso de teste da razão de
verossimilhanças.
Os testes foram realizados com nível de significância de 5% (p<0,05).
29
4 RESULTADOS
Utilizamos no estudo 22 coelhos, sendo 20 coelhos no grupo de estudo e 2
coelhos no grupo controle. Nenhum animal evoluiu a óbito durante o período do
experimento.
No momento da retirada do tampão, no 10º dia da indução do experimento,
todos os coelhos apresentavam rinorreia purulenta unilateral. Desta forma, todos os
coelhos sacrificados do grupo A apresentavam rinorreia purulenta neste momento.
Apenas três coelhos do grupo B apresentavam rinorreia evidente antes do sacrifício.
Nenhum coelho do grupo C apresentava rinorreia evidente pela fossa nasal no
momento do sacrifício. Porém, três coelhos do grupo B e dois coelhos do grupo C
apresentavam secreção purulenta no seio maxilar após o sacrifício dos animais e
exposição destas estruturas anatômicas.
4.1 Cultura de secreção e exame bacterioscópico
Realizamos coleta e análise das secreções dos seios maxilares direito e
esquerdo de todos os coelhos. Optamos pela classificação das bactérias
encontradas nos seguintes grupos: bacilo Gram negativo não fermentador
(Acinetobacter baumanii, Acinetobacter Iwoffii, Achromobacter sp e Pseudomonas
aeruginosa), bacilo Gram negativo enterobactéria (Escherichia Coli), bacilo Gram
positivo (Bacillus sp) e cocos Gram positivo (Micrococcus sp, Staphylococcus
coagulase negativo e Staphylococcus aureus). Os resultados encontram-se
descritos na tabela a seguir:
30
Tabela 2. Descrição dos grupos de bactérias encontrados nos seios maxilares nas amostras de acordo com o lado dos 20 coelhos dos grupos de estudo.
Variável Frequência %
Grupo bactéria direita
Negativo 2 7,4
Bacilo Gram negativo não fermentador 5 18,5
Bacilo Gram negativo enterobactéria 4 14,8
Bacilo Gram positivo 12 44,4
Coco Gram positivo 4 14,8
Total 27 100
Grupo bactéria esquerda
Negativo 6 27,3
Bacilo Gram negativo não fermentador 9 40,9
Bacilo Gram negativo enterobactéria 1 4,5
Bacilo Gram positivo 5 22,7
Coco Gram positivo 1 4,5
Total 22 100
Frequências absolutas e relativas
A Tabela 2 mostra que no lado submetido à indução de rinossinusite (lado
direito), o grupo de bactéria mais frequentemente encontrado foi de bacilo Gram
positivo (44,4%), já no lado contralateral, foi o grupo de bacilo Gram negativo não
fermentador (40,9%). Identificamos maior incidência de bactérias Gram negativas no
total dos coelhos avaliados. Estas foram identificadas em 15 animais (75%), sendo
que as bactérias Gram positivas em apenas 9 animais (45%).
O microorganismo mais encontrado nos exames de cultura do seio maxilar
direito dos coelhos foi o Bacillus sp, identificado em 11 coelhos. Também
observamos que 7 coelhos apresentaram dois microorganismos nos exames de
cultura do lado direito.
Avaliamos a positividade do swab bilateralmente nas amostras coletadas. Os
resultados encontram-se na tabela a seguir:
31
Tabela 3. Descrição da positividade da cultura bacteriana obtida por swab conforme o dia de sacrifício dos grupos e resultado dos testes estatísticos
Grupos
Variável A B C Total p
N % N % N % N %
Swab direito
0,468
Negativo 0 0,0 1 14,3 1 14,3 2 10,0
Positivo 6 100,0 6 85,7 6 85,7 18 90,0
Swab esquerdo
0,039
Negativo 0 0,0 2 28,6 4 57,1 6 30,0
Positivo 6 100,0 5 71,4 3 42,9 14 70,0
Total 6 100 7 100 7 100 20 100
Resultado do teste da razão de verossimilhanças
A Tabela 3 demonstra que não há associação estatisticamente significativa na
positividade do swab no lado direito (p = 0,468). Observamos apenas que a
positividade no swab do lado esquerdo está estatisticamente associada aos dias de
sacrifício, sendo que a positividade vai diminuindo com o passar dos dias (p =
0,039).
As culturas dos seios maxilares dos dois coelhos utilizados como controle não
apresentaram crescimento de nenhuma bactéria.
4.2 Avaliação histológica da mucosa sinusal
A análise histológica das mucosas dos seios maxilares direito e esquerdo
apresentaram grau de inflamação na maioria das amostras.
Os resultados da avaliação histológica semiquantitativa das amostras de
mucosa encontram-se na tabela a seguir:
32
Tabela 4. Descrição do grau de inflamação e proliferação conjuntivo-fibrosa na mucosa sinusal conforme o dia de sacrifício dos grupos e resultado dos testes estatísticos.
Grupos
Variável A B C Total p
N % N % N % N %
Proliferação Conjuntiva Fibrosa direita
0,420
Ausente 3 50,0 4 57,1 2 28,6 9 45,0
Presente 3 50,0 3 42,9 4 57,1 10 50,0
Muito presente 0 0,0 0 0,0 1 14,3 1 5,0
Proliferação Conjuntiva Fibrosa esquerda
0,786
Ausente 5 83,3 5 71,4 6 85,7 16 80,0
Presente 1 16,7 2 28,6 1 14,3 4 20,0
Grau de inflamação direito
0,009
0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1 0 0,0 1 14,3 2 28,6 3 15,0
2 1 16,7 3 42,9 5 71,4 9 45,0
3 2 33,3 3 42,9 0 0,0 5 25,0
4 3 50,0 0 0,0 0 0,0 3 15,0
Grau de inflamação esquerdo
0,267
0 1 16,7 4 57,1 4 57,1 9 45,0
1 5 83,3 3 42,9 3 42,9 11 55,0
Total 6 100 7 100 7 100 20 100
Resultado do teste Kruskal-Wallis
A Tabela 4 mostra que há diferença estatisticamente significativa entre os
grupos para o grau de inflamação no lado induzido (p = 0,009), não havendo
diferença estatisticamente significativa na proliferação conjuntivo-fibrosa entre os
grupos (p=0,420). No lado esquerdo não houve diferença estatisticamente
significativa em ambos os parâmetros. Com relação ao grau de inflamação da
mucosa do seio maxilar esquerdo, observamos apenas graus 0 e 1.
Na tabela abaixo, comparamos o grau de inflamação do lado direito em
relação aos três grupos do estudo:
Tabela 5. Resultado das comparações múltiplas do grau de inflamação no lado induzido entre os grupos.
Comparação Valor Z P
A - B 1,82 0,069
A - C 3,05 0,002
B - C 1,28 0,200
33
A Tabela 5 mostra que o grau de inflamação no grupo A (dia 10) é
estatisticamente maior que no grupo C (dia 30), com p = 0,002.
A análise histológica dos seios direito e esquerdo dos dois coelhos do grupo
controle apresentou grau 0 de inflamação e proliferação conjuntivo-fibrosa ausente.
4.3 Análise do tampão nasal
Analisamos a relação entre as bactérias encontradas no swab do lado direito
e as bactérias identificadas nos tampões de Merocel®.
Tabela 6. Descrição da concordância das bactérias do tampão e da microbiologia do seio maxilar no lado induzido conforme os grupos e resultado dos testes estatísticos.
Grupos
Variável A B C Total p
N % N % N % N %
Relação Hemobac® com swab direito
0,171
Bactérias diferentes 4 66,7 7 100,0 6 85,7 17 85,0
A mesma bactéria 2 33,3 0 0,0 1 14,3 3 15,0
Total 6 100 7 100 7 100 20 100
Resultado do teste da razão de verossimilhanças
Na tabela 6 não há associação estatisticamente significativa entre a
concordância das bactérias encontradas no swab e no tampão nasal conforme os
grupos (p = 0,171).
Realizamos a análise de um tampão de Merocel® utilizado como controle
através do sistema Hemobac® e não houve crescimento bacteriano.
34
5 DISCUSSÃO
5.1 Modelo experimental de rinossinusites
Diversos modelos experimentais para indução de rinossinusite foram
realizados e estão descritos na literatura (Marks, 1997). Os coelhos são os animais
mais utilizados neste tipo de trabalho, seguidos por ratos e ovelhas. Optamos pela
utilização dos primeiros, por apresentarem maior semelhança anatômica e
fisiológica com as cavidades nasossinusais dos humanos, conforme relatado por
Casteleyn et al. (2010).
Diferentes métodos foram utilizados para a indução de processo infeccioso
bacteriano sinusal nos coelhos. Os primeiros trabalhos realizavam a obstrução
definitiva dos óstios maxilares através de procedimentos cirúrgicos ou uso de cola
(Johansson et al., 1988; Grullón, Suárez, 1996; Jyonouchi et al., 1999; Hassab,
Kennedy, 2001). Embora este modelo de rinossinusite tenha provado ser
extremamente eficaz na formação de rinossinusite purulenta, a inflamação era
geralmente limitada ao seio maxilar, como um abscesso sinusal. Além disso, a
manipulação para promover a obstrução do óstio era realizada através da cavidade
sinusal para dentro da cavidade nasal.
Outros trabalhos foram realizados através da oclusão das fossas nasais com
diferentes tipos de materiais e retirados após determinado período (Marks, 1997;
Kara et al., 2004; Cheng et al., 2009; Ozcan et al.; 2011). A presença destes
materiais foi associada ou não ao uso de bactérias ou toxoides bacterianos para
auxiliar na indução de rinossinusite bacteriana.
Estes modelos experimentais vêm sendo descritos para avaliarem diversos
aspectos do processo infeccioso sinusal. Foram avaliadas alterações anatômicas,
fisiológicas e histopatológicas dos seios paranasais (Johansson et al., 1988; Marks,
1998; Hassab, Kennedy, 2001; Kim et al., 2008); e realizadas comparações da
eficácia de diferentes tratamentos para rinossinusite (Min et al., 1995; Bende et al.,
1996; Cable et al., 2000; Ozturk et al., 2003; Cheng et al., 2009). A pesquisa e
identificação da presença de biofilmes bacterianos também foram realizadas
(Perloff e Palmer, 2005).
35
Em nosso trabalho, optamos pela indução de rinossinusite através da
inserção de esponja sintética na fossa nasal direita dos animais, com retirada das
mesmas após 10 dias em todos os grupos. Este método apresenta simplicidade
técnica para sua confecção, causa pouca lesão em mucosa nasal e grande
facilidade na remoção do tampão dos coelhos que prosseguiram no estudo. Além
disso, este método não promove alterações permanentes na mucosa nasossinusal
dos animais, sendo reversível, o que nos permitiu avaliar a recuperação histológica
após a indução do quadro de rinossinusite aguda.
Alguns autores realizaram a inoculação do agente infeccioso dentro do seio
maxilar (Maeyama, 1981; Johansson et al., 1988; Osturk et al., 2003; Costa et al.,
2007; Cheng et al., 2009; Campos, 2010) e outros, dentro da cavidade nasal (Marks,
1997; Kara et al., 2004; Genc et al., 2008). Optamos por não utilizar a primeira
técnica, por ser mais invasiva e causar alterações iatrogênicas na mucosa sinusal.
Alguns trabalhos provaram que a simples obliteração das fossas nasais já seria
suficiente para desenvolver um quadro infeccioso bacteriano (Costa et al., 2007; Kim
et al., 2008; Liang et al., 2008).
Utilizamos a inoculação de toxoide estafilocócico e estreptocócico em
conjunto com a inserção de esponja sintética nas mesmas fossas nasais. Decidimos
pela inoculação do toxoide, com o objetivo de acelerar o tempo de indução da
rinossinusite. Este achado foi demonstrado por Kara et al. (2004), que evidenciaram
através da realização de tomografia computadorizada, a presença de infecção no
seio maxilar de coelhos a partir do 6º dia após a indução de rinossinusite com a
inoculação de toxoide, e no 8º dia sem a inoculação do mesmo.
Durante a realização do nosso estudo não observamos a morte de coelhos,
diferentemente de outros trabalhos. Campos (2010) referiu a morte de 7 coelhos
(11,67% do total), assim como Marks (1997) e Kara et al. (2004) também relataram
morte de animais (8,34% e 16,67% do total de coelhos, respectivamente). A
utilização da técnica com inoculação do toxoide no interior do seio por punção pode
favorecer a progressão do quadro para as vias aéreas inferiores dos animais, além
de ser um método mais invasivo. Acreditamos que a técnica utilizada diminui o risco
de complicações, principalmente a pneumonia, que foi a mais citada pelos autores
como causa de morte dos animais, pelo fato de ser menos invasiva e com regressão
do processo infeccioso após a retirada da esponja.
36
Com relação ao tempo de permanência do tampão nasal para a indução da
rinossinusite, os estudos apresentam algumas variações. Cheng et al. (2009),
Campos (2010) e Ozcan et al. (2011) mantiveram o tampão durante 10 dias, de
maneira semelhante ao nosso. Costa et al. (2007) e Liang et al. (2008) mantiveram o
tampão durante 14 dias. Kara et al. (2004) mantiveram o tampão até a confirmação
do diagnóstico de rinossinusite realizado por TC, tendo retirado o mesmo com 6 e 8
dias nos 2 grupos de estudos. Apenas Marks (1997) manteve o tampão nasal por
um período mais prolongado, durante 6 semanas.
Após a retirada da esponja no 10º dia, todos os animais apresentavam
rinorreia purulenta unilateral na cavidade nasal em que as mesmas foram inseridas.
Este resultado é compatível com outros autores que utilizaram método semelhante
através da via rinogênica (Kara et al., 2004; Cheng et al., 2009; Ozcan et al., 2011).
Marks (1997) apresentou 83% de sucesso com seu método e Liang et al. (2008)
obtiveram 91,7% na indução de quadro infeccioso agudo. Campos (2010) também
obteve 100% de eficácia com seu trabalho, porém utilizou a inoculação de toxoide
bacteriano diretamente dentro dos seios maxilares.
Utilizamos como critério principal para o diagnóstico de rinossinusite aguda a
presença de rinorreia purulenta na cavidade nasal dos animais. As avaliações
microbiológicas e histológicas dos animais pertencentes ao grupo A nos permitiu a
avaliação do processo infeccioso no momento do seu diagnóstico, ou seja, 10 dias
após o inicio do experimento. A partir de então, foi possível observar o período de
recuperação da rinossinusite aguda, sem nenhum tipo de tratamento. Desta forma,
alguns coelhos do grupo B (três) ainda apresentavam secreção nas fossas nasais e
nos seios maxilares após serem sacrificados, e alguns coelhos do grupo C ainda
apresentavam secreção nos seios maxilares no momento do sacrifício.
Nas análises microbiológicas e histológicas dos coelhos do grupo A, todos os
animais apresentavam swab positivo do seio maxilar para microorganismos e sinais
de inflamação na mucosa bilateralmente. Já os coelhos dos grupos B e C,
apresentaram alguns resultados de swab negativos do seio maxilar, enquanto na
avaliação histológica, todos estes animais ainda mantinham algum grau de
inflamação no seio maxilar direito. Com estes resultados, podemos sugerir que na
evolução de um quadro de rinossinusite aguda bacteriana, a persistência dos
37
achados inflamatórios na mucosa sinusal é mais prolongada do que a presença de
microorganismos causando um processo infeccioso.
5.2 Cultura de secreção e exame bacterioscópico
A Pasteurella multocida foi identificada por alguns autores em modelos
experimentais de rinossinusite em coelhos, após a realização de análises
microbiológicas. Liang et al. (2008) realizaram a coleta com swab das fossas nasais
dos animais após 2 e 12 semanas de início do experimento, e observaram esta
bactéria em um grande número de coelhos. Osturk et al. (2003) isolaram esta
bactéria em apenas 1 coelho sacrificado 5 dias após o início do estudo. Em nosso
trabalho, nós não isolamos este microorganismo em nenhum coelho dos grupos de
estudo e do grupo controle, assim como outros autores (Kara et al., 2004; Cheng et
al., 2009; Campos, 2010). Acreditamos que este microorganismo possa ser
substituído por outros agentes oportunistas mais patogênicos ou patogênicos não
oportunistas na vigência de um quadro infeccioso.
A grande maioria dos microorganismos isolados são oportunistas dos aparelhos
respiratório e digestório dos coelhos. O único microorganismo patogênico não
oportunista isolado em nossos exames foi o Staphylococcus aureus. A presença do
quadro sinusal infeccioso possibilita que estas bactérias oportunistas se multipliquem e
substituam os agentes inicialmente inoculados e precursores da infecção.
A maioria dos trabalhos que utilizou cepas de Streptococcus pneumoniae
para auxiliar na indução da rinossinusite apresentou a substituição deste patógeno
por outros agentes oportunistas. Westrin et al. (1992) utilizaram esta bactéria na
indução e observaram sua substituição após 5 dias em média. Marks (1997) e Kara
et al. (2004) isolaram o pneumococo em apenas 1 coelho nos estudos, na primeira
semana após a indução do quadro. Cheng et al. (2009) não isolaram este agente em
nenhum coelho após 10 dias do início da indução. Em nosso estudo, não
identificamos a presença do pneumococo em nenhum dos coelhos estudados.
Kara et al. (2004) relataram bactérias Gram negativas e Gram positivas nos
exames de cultura dos seios maxilares direitos, lado no qual ocorreu o quadro
infeccioso. Cheng et al. (2009) encontraram apenas bactérias Gram negativas nos
38
exames de cultura dos seios maxilares, no lado da indução do quadro infeccioso.
Observaram também, que a maioria das bactérias cresceu isoladamente. Em nosso
estudo, encontramos bactérias Gram positivas e Gram negativas nos exames de
cultura dos seios maxilares direitos, com maior incidência de Gram positivas. Estas
foram identificadas em 16 animais (80%), sendo que as bactérias Gram negativas
apenas em 9 animais (45%).
Cheng et al. (2009) analisaram a positividade do swab em relação aos dias de
sacrifício. O grupo de coelhos utilizado como controle, no qual ocorreu a indução do
quadro de rinossinusite bacteriana sem posterior tratamento, foi sacrificado após
duas e quatro semanas. Na segunda semana, a positividade do swab colhido da
cavidade sinusal do lado submetido à indução do experimento foi de 100%. Já na
quarta semana, esta positividade diminuiu para 83,3%. Encontramos resultados
muito semelhantes em nosso estudo. O grupo de coelhos sacrificado no 10º dia
apresentou positividade no swab do seio maxilar direito de 100%. Nos grupos
sacrificados no 17º e 30º dias, esta positividade foi de 85,7%.
A grande maioria dos modelos descritos na literatura não avaliou o seio
contralateral ao seio da indução do experimento. Poucos trabalhos relataram a
cultura do material do seio contralateral, e quando realizada, foi em pequeno número
do total de animais do estudo. Liang et al. (2008) relataram pouco crescimento
bacteriano em cavidades nasais sem a presença de rinossinusite. Em nosso
trabalho, obtivemos a presença de bactérias no seio contralateral em 14 coelhos
(70% do total). Acreditamos que a progressão do quadro inflamatório na mucosa
nasossinusal também favoreça o aparecimento de bactérias oportunistas no seio
contralateral ao lado de indução do experimento.
5.3 Avaliação histológica da mucosa sinusal
A histologia normal da mucosa sinusal de coelhos apresenta epitélio
pseudoestratificado ciliado sem a presença de células inflamatórias. (Cheng et al.,
2009; Ozcan et al., 2011). A análise histológica da mucosa sinusal em coelhos
submetidos a experimentos para indução de rinossinusite foi realizada na grande
maioria dos trabalhos, com diversos objetivos. Foi utilizada sua avaliação como
39
critério diagnóstico para presença de infecção sinusal (Marks et al., 1997; Kara et al.,
2004; Liang et al., 2008; Campos, 2010), na avaliação da intensidade da infecção
(Marks, 1998; Shin et al., 2005), na comparação da eficácia de diferentes
tratamentos para rinossinusite (Uslu et al., 2006; Ozturk et al., 2003; Bleier et al.,
2010) e nas alterações fisiopatológicas sinusais após indução de quadro infeccioso
agudo nasossinusal (Hassab, Kennedy, 2001; Genc et al., 2008; Kim et al., 2008).
A avaliação da intensidade da inflamação pode ser realizada de forma
qualitativa ou semiquantitativa. A maioria dos trabalhos realizou esta avaliação de
maneira qualitativa (Jyonouchi et al., 1999; Uslu et al., 2003; Kara et al., 2004; Costa
et al., 2007). Por outro lado, em alguns experimentos, foram utilizados parâmetros
semiquantitativos (Min et al., 1995; Bende et al., 1996; Marks et al., 1997; Campos,
2010). Cheng et al. (2009) utilizaram as duas análises em seu estudo.
Optamos em nosso trabalho pela análise semiquantitativa para que pudéssemos
graduar a intensidade da inflamação e comparar os três grupos experimentais (sacrifício
com 10, 17 e 30 dias). Obtivemos diferença estatisticamente significativa no grau de
inflamação entre os coelhos do grupo sacrificado com 10 dias e o grupo sacrificado com
30 dias. Demonstramos desta forma, que o processo inflamatório vai regredindo após a
retirada do tampão. Porém, mesmo após 30 dias do início do experimento (20 dias após
a retirada do tampão), muitos coelhos ainda apresentavam inflamação na mucosa
sinusal. Este achado denota que o quadro de rinossinusite aguda causa alterações
histológicas mais prolongadas do que os achados macroscópicos, e que persistem por
algumas semanas até sua regressão completa.
Poucos estudos realizados fizeram a análise histológica da mucosa do seio
maxilar contralateral ao seio acometido. Jyonouchi et al. (1999) observaram nos seios
contralaterais aumento de células glandulares e caliciformes, além de leve
espessamento do estroma. Porém, utilizaram como método de indução, a obliteração
permanente do óstio sinusal com cianoacrilato. Kara et al. (2004) relataram mucosa
sinusal macroscopicamente normal do lado esquerdo, contralateral ao lado acometido
pelo processo infeccioso. Genc et al. (2008) não observaram alterações na cavidade
nasal contralateral à estudada. Liang et al. (2008) avaliaram apenas alguns lados
controle e não observaram alterações histológicas. Alguns experimentos tiveram o
desenvolvimento de sinusite bilateral devido à presença de perfuração septal, que
permitiu a progressão da infecção para o lado contralateral (Kara et al., 2004).
40
Shin e Heo (2005) observaram alterações nasossinusais nas cavidades
obstruídas e também nas cavidades contralaterais, nas quais não haviam realizado
nenhuma manipulação. Concluíram que os achados inflamatórios no lado ocluído
podem ter sido produzidos por ausência de aeração e ventilação sinusal. No lado
não ocluído, estas alterações inflamatórias podem ter sido ocasionadas por lesões
diretas nas células epiteliais nasais, causadas por aumento do fluxo de ar ou
aumento da carga bacteriana.
Acreditamos ser este um achado muito significativo e que possa ser justificada
a progressão da inflamação como uma resposta de todo epitélio respiratório a um foco
local, que desencadearia uma maior resposta mesmo em áreas sem agressão direta.
Fato este que também é evidenciado em pacientes asmáticos e portadores de rinite
alérgica e/ou rinossinusite, que pioram do quadro pulmonar em consequência da piora
do quadro nasal, na relação conhecida como “via aérea unificada”. Esta apresenta
algumas outras hipóteses para sua ocorrência, como reflexo neural nasobronquial,
contaminação das vias aéreas inferiores com células inflamatórias e mediadores
através de secreção nasal posterior, ou absorção de células inflamatórias do epitélio
nasal para a circulação sistêmica e consequentemente para mucosa bronquial
(Bousquet et al., 2003; Bousquet et al., 2008). Futuros estudos serão necessários
para avaliar a relação desta resposta em quadros de rinossinusite.
A avaliação da proliferação conjuntivo-fibrosa não apresentou diferença
estatisticamente significativa entre os grupos. Não foi possível, portanto, utilizar este
parâmetro como marcador de cronificação do processo infeccioso. O número de
coelhos pode não ter sido suficiente para reproduzir alteração estatística neste
parâmetro avaliado.
5.4 Análise do tampão nasal
Nas últimas décadas, a grande maioria dos estudos experimentais em
coelhos utilizou como método de indução de rinossinusite a inserção de tampão
nasal. O material utilizado foi esponja sintética de Merocel® (Marks, 1997; Kara et
al., 2004; Liang et al., 2008; Cheng et al., 2009), esponja gelatinosa (Ozcan et al.,
2011) ou esponja de polivinil (Costa et al., 2007; Campos, 2010). O objetivo foi
41
promover um processo inflamatório e infeccioso através da obstrução do óstio
sinusal. Outra hipótese aventada para o início deste processo seria a reação
inflamatória da mucosa nasal a um corpo estranho, causando uma desorganização
da fisiologia ostiomeatal (Çetin et al., 2002).
Porém, não encontramos na literatura algum estudo que houvesse realizado a
análise do tampão nasal para cultura de microorganismos, ou com algum outro objetivo.
Kara et al. (2004) realizaram em seu estudo a cultura do seio maxilar direito
(lado de indução da infecção) e da fossa nasal direita de todos os coelhos, com a
coleta de swab. Este foi realizado em apenas uma região da fossa nasal. Afirmaram
que a propagação de bactérias da fossa nasal para o interior do seio era esperada,
porém não foi observada esta relação.
Liang et al. (2008) realizaram em seu estudo a análise dos microorganismos
presentes nas fossas nasais dos coelhos submetidos ao experimento, não tendo
realizado cultura de secreção no interior dos seios em nenhum dos animais. Através
da avaliação com TC para diagnóstico de infecção sinusal, observaram que poucos
patógenos cresceram nas fossas nasais de coelhos sem rinossinusite,
comparativamente com a presença destes microorganismos em fossas nasais de
coelhos com rinossinusite.
A avaliação do tampão nasal foi realizada para que pudéssemos analisar de
maneira precisa os microorganismos presentes nas fossas nasais, nas quais
realizamos a indução do quadro infeccioso. Utilizamos este método para correlacionar
as bactérias presentes no interior da cavidade nasal com as bactérias presentes no
interior do seio maxilar. Não encontramos associação significativa entre as bactérias
presentes nestes dois locais anatômicos distintos. Esta associação não foi
demonstrada inclusive no primeiro grupo de coelhos sacrificados, nos quais a retirada
do tampão foi realizada neste mesmo dia, 10 dias após o início do estudo.
42
6 CONCLUSÃO
O modelo experimental realizado e avaliado por meio de parâmetros
histopatológicos da mucosa sinusal, por cultura da secreção sinusal e do tampão
nasal e por avaliação da presença de secreção nasal, mostrou-se capaz de induzir
quadro de rinossinusite aguda bacteriana em 100% dos animais utilizados no
estudo.
43
7 ANEXOS
Anexo 1. Tabela demonstrando as bactérias encontradas em cada tampão nasal através da análise microbiológica do sistema Hemobac®.
Coelho Hemobac
1 Citrobacter diversus/ Achromobacter sp
2 Staphylococcus coagulase negativo/Micrococcus sp/ Achromobacter sp
3 Achromobacter sp
4 Staphylococcus aureus/ Achromobacter sp
5 Escherichia coli
6 Bacillus sp/ Neisseria sp
7 Pseudomonas aeruginosa
8 Morganella morganii
9 Pseudomonas aeruginosa/ Neisseria sp
10 Escherichia coli
11 Pseudomonas sp
12 Pseudomonas aeruginosa
13 Escherichia coli/ Stenotrophomonas maltophilia
14 Pseudomonas aeruginosa
15 Staphylococcus coagulase negativo/Acinetobacter lwoffii
16 Pseudomonas aeruginosa
17 Staphylococcus coagulase negativo/Pseudomonas aeruginosa
18 Pseudomonas aeruginosa
19 Staphylococcus aureus
20 Citrobacter diversus
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Anexo 2. Tabela demonstrando os resultados dos swabs realizados em ambos os seios maxilares.
Coelho Swab lado direito Swab lado esquerdo
1 Acinetobacter baumanii Acinetobacter baumanii
2 Bacillus sp Acinetobacter baumanii
3 Acinetobacter baumanii Acinetobacter baumanii
4 Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulase negativo/Micrococcus sp
5 Staphylococcus aureus Bacillus sp
6 Escherichia coli/ Bacillus sp Escherichia coli
7 Bacillus sp Acinetobacter lwoffii
8 Escherichia coli/ Staphylococcus aureus Bacillus sp
9 Bacillus sp Negativo após 48 hs
10 Negativo após 48 hs Negativo após 48 hs
11 Acinetobacter lwoffii/ Bacillus sp Acinetobacter lwoffii
12 Achromobacter sp/ Bacillus sp Achromobacter sp
13 Bacillus sp Acinetobacter lwoffii
14 Negativo após 48 hs Negativo após 48 hs
15 Escherichia coli/ Bacillus sp Negativo após 48 hs
16 Pseudomonas aeruginosa/Bacillus sp Negativo após 48 hs
17 Bacillus sp Acinetobacter baumanii/Bacillus sp
18 Staphylococcus coagulase negativo/ Bacillus sp Bacillus sp
19 Bacillus sp Acinetobacter lwoffii
20 Escherichia coli Negativo após 48 hs
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Dolci ELL. Avaliação da capacidade de um modelo experimental para indução de rinossinusite bacteriana em coelhos. Tese (Doutorado). São Paulo: Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo; 2014. Resumo Introdução: A rinossinusite é uma das doenças mais prevalentes nos dias atuais, sendo responsável por diversas consultas médicas, cirurgias, impacto na qualidade de vida da população e enorme impacto econômico gerado por custos diretos e indiretos envolvidos com a afecção. É uma das doenças que mais requer atendimento em pronto-socorro, uma das mais responsáveis pelo uso de antibiótico e responsável por piores índices de qualidade de vida comparada com doenças como dor nas costas, insuficiência cardíaca congestiva e doença pulmonar crônica. A realização de modelos experimentais em animais vem sendo realizada há décadas, com substancial aumento nos últimos anos. Têm como principais objetivos identificar as alterações fisiopatológicas ocasionadas pelo processo infeccioso sinusal e avaliar a eficácia de medicamentos no tratamento da rinossinusite. Objetivo: Avaliar a eficácia do modelo experimental proposto para a indução de um processo infeccioso nasossinusal agudo bacteriano, utilizando parâmetros histopatológicos e cultura da secreção sinusal. Material e Método: Foram utilizados 22 coelhos da raça Nova Zelândia, de ambos os sexos, com peso entre 2500-3000g. Foram divididos em 4 grupos: grupo A (6 coelhos), grupo B (7 coelhos), grupo C (7 coelhos) e grupo D (controle com 2 coelhos). Foi induzido quadro de rinossinusite através da inserção de esponja sintética nas fossas nasais direita dos 20 coelhos dos grupos de estudo, seguido por instilação de toxoide bacteriano (50% estreptocócico e 50% estafilocócico) nas mesmas fossas nasais. Os grupos foram sacrificados com 10 dias (grupo A), 17 dias (grupo B), 30 dias (grupos C e D). No 10º dia, todos os animais tiveram os tampões removidos e colocados em material para posterior cultura de microorganismos. Após o sacrifício, procedeu-se com a avaliação histológica semiquantitativa da mucosa sinusal bilateral, exame de cultura das secreções dos seios maxilares bilateralmente e análise com cultura do tampão nasal. Resultados: Todos os coelhos do grupo de estudo apresentaram quadro de rinossinusite aguda bacteriana, através da identificação macroscópica, análise histológica e cultura das secreções. Conclusão: O modelo proposto apresenta simplicidade técnica para sua execução, similaridade ao quadro rinogênico que acomete os humanos e é altamente eficaz na produção de um quadro infeccioso bacteriano agudo sinusal.
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Dolci ELL. Evaluation of an experimental model capacity to induce bacterial rhinosinusitis in rabbits. Tese (Doutorado). São Paulo: Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo; 2014. Abstract Introduction: Rhinosinusitis is one of the most prevalent diseases nowadays, responsible for quality of life impact and tremendous economic impact associated with direct and indirect costs. It’s one of the top reasons for presentation to a primary care physician, one of most common reasons for the prescription of antibiotics and it’s responsible for worst quality of life compared to back pain, congestive heart failure or chronic obstructive pulmonary disease. Animals have been used in experimental models in the last decades, with substantial increase in the last few years. The main targets are to study the pathogenesis of the infectious process and the efficiency of the medications to treat the rhinosinusitis. Objective: Evaluate the efficiency of the proposed experimental model to induce an acute bacterial sinonasal infectious process by using histological analysis and sinus secretion cultures. Material and Methods: Twenty two New Zealand rabbits were used, of both sexes with body weight between 2500 to 3000g. They were divided into 4 groups: group A (6 rabbits), group B (7 rabbits), group C (7 rabbits) and group D (control group with 2 rabbits). Rhinosinusitis was induced with the insertion of a synthetic sponge into the right-side nasal cavities of the 20 animals in the study groups followed by bacterial strains instillation (composed of 50% Staphylococcus sp and 50%Streptococcus sp). The groups were sacrificed within 10 days (group A), 17 days (group B) and 30 days (groups C and D). At the 10th day, all the sponges were removed from the nasal cavities and placed at a solution for posterior microbiological culture. After the rabbits were sacrificed, semi-quantitative histological analysis of bilateral sinus mucosa, bilateral sinus secretions bacterial culture and culture analysis of the nasal packing were performed. Results: All the rabbits of the study group developed acute bacterial rhinosinusitis, which was diagnosed by using macroscopic evaluation, histological analysis and sinus secretion culture. Conclusion: The proposed model has a simple method for execution, it is similar to the rhinogenic model that occurs in human beings and it is highly efficient to reproduce an acute bacterial sinus infection.
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LISTAS E APÊNDICES
APÊNDICE 1. Carta de aprovação do comitê de ética do ICAO
São Paulo, 10 de outubro de 2012. Ilmo. Sr. Prof.Dr. José Eduardo Lutaif Dolci protocolo 008-12 O Comitê de Ética em experimentação animal (CEEA) do Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia (ICAO) em reunião ordinária, e no cumprimento de suas atribuições, após avaliação do seu projeto de pesquisa: "Avaliação da capacidade de um modelo experimental para indução de rinossinusite bacteriana em coelhos", emitiu parecer considerando-o:
Aprovado
Prof. Dr. Leonardo da Silva Presidente do CEEA do ICAO